Procédé de préparation d'une substance ayant une activité bactériostatique. Cette invention concerne un procédé de préparation d'une substance bactériostatique.
Généralisant les travaux de Fleming, 13rit. J. exp. Path 1929, 10, 226, Maclean Rogers and Fleming, Lancet 1939, 1, 562, et d'autres, Chain, Florey, Gardner, Heatley, Jennings, Orr-Ewing et Sanders, Lancet 1940, 2, 226, et à nouveau, Abraham, Gardner, Chain Reatley, Fletcher, Jennings et Florey, Lancet, 1941, 2, 177, ont décrit une méthode par laquelle on peut isoler,
lors de la crois sance du Penicillium notatum dans un bouil lon de culture de Czapek-Dox contenant 4% de glucose, une substance antibactérienne qui a été appelée penicilline.
Pendant la fermentation effectuée selon la méthode décrite dans la littérature citée, la concentration des ions hydrogènes du bouil lon de culture, après avoir eu une tendance initiale de courte durée à rendre le milieu acide, diminue jusqu'à la neutralité ou même au delà. Lorsque la fermentation est com plète, la penicilline, qui est soluble d'ans les solvants organiques, est extraite du bouillon neutre ou alcalin avec de l'acétate d'amyle, avec un rendement d'environ 0,013 g de penicilline par litre de bouillon de culture.
On a trouvé que si l'on utilise une espèce de Penicillium notatum sélectionnée selon ce qu'on expliquera plus complètement ci-des sous, la concentration en ions hydrogène reste telle que le milieu est maintenu acide pendant un temps plus long, en fait 14 jours ou plus encore, pendant le développement de la culture de penicillium et une substance peut être isolée du milieu acide, ayant une puissante action bactériologique, c'est-à-dire qui inhibe la croissance des bactéries,
mais qui est à d'autres points de vue fondamen talement .différente de la penicilline sus- indiquée, puisqu'elle est, par exemple, inso luble ou faiblement soluble dans les solvants organiques ordinaires; la substance est en outre obtenue avec de meilleurs rendements que la penieilline.
La présente invention concerne donc un procédé pour préparer une substance ayant une action bactériostatique. Il est caractérisé par le fait qu'avec une espèce sélectionnée de Penicillium notatum, qui a la propriété, lors qu'il croît dans un milieu légèrement acide de Czapek-Dox contenant 4 Jo de glucose, de maintenir le pH de ce milieu en dessous de 7 pendant le développement du ferment, on en semence un milieu de culture approximative ment neutre et dont le pH diminue sous l'ac tion du ferment, en laissant se développer le ferment en milieu acide,
et qu'on isole du filtrat de culture acide un principe bactério statique insoluble ou seulement peu soluble dans les solvants organiques ordinaires tels que l'acétone et l'acétate d'amyle, et qui est une flavoprotéine.
La sélection d'une espèce convenable de ferment joue un rôle important; si elle n'est pas faite, la substance cherchée ne se forme pas. Une espèce convenable de Penicillium notatum peut être obtenue en sélectionnant, dans une culture de ferments, les colonies qui produisent une substance ayant une puissante action inhibitrice sur les bactéries Gra.m- positives en présence de glucose. Les bactéries Gram-positives sont celles qui se colorent lorsqu'elles sont traitées par du violet de méthyle, puis par une solution d'iode-iodure de potassium et enfin par de l'acétone ou par de l'alcool éthylique.
Les colonies sélection nées sont ensuite cultivées dans un milieu de Czapek-Dox contenant 4 ro de glucose et l'on examine l'activité bactériostatique et la, solu bilité des principes actifs dans les solvants organiques des filtrats de la culture. On sé lectionne alors pour les utiliser les espèces dont les filtrats de culture ont montré avoir la plus grande action bactériostatique et dont le principe actif du filtrat ne peut pas être extrait par des solvants organiques.
Dans la préparation du produit bactério statique selon l'invention, un milieu de culture approprié, par exemple un Czapek- Dox contenant 4/11ô' de glucose, est stérilisé puis ensemencé de l'espèce sélectionnée, que l'on laisse se développer de préférence à 20 C environ de la manière ordinaire jus qu'à ce qu'il ne reste que peu de glucose, en général 8 à 14 jours approximativement. Pen dant le développement, le pH du milieu di minue, jusqu'à ce qu'il atteigne environ 3,5 après 3 ou 4 jours, et demeure à cette valeur pour le reste du temps du développement.
Si toutefois le temps de développement était exagérément prolongé, le milieu deviendrait alcalin et la substance bactériostatique cher chée serait finalement perdue.
Le principe bactériostatique est alors isolé du filtrat de la culture, par exemple, en concentrant ce filtrat par évaporation sous pression réduite ou par élimination par con gélation d'une partie de l'eau, puis en préci pitant ledit principe de la solution concentrée par un solvant organique.
Le procédé peut être mis en oeuvre, par exemple, de la façon suivante: On prépare un bouillon de culture de Czapek-Dox; celui-ci a la composition sui vante:
EMI0002.0020
Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Phosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> cristallisé <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> fer <SEP> cristallisé <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1000 <SEP> cm' Ce milieu a un pH approximatif de 6,5; on le stérilise, par exemple, en le passant à la vapeur pendant 11/2 h. ou en le mettant 30 minutes à l'autoclave à 115 .
Les cultures de Penicillium notatum sont faites sur de l'agar nutritif ordinaire et on sélectionne dans celles-ci les colonies produi sant une substance qui inhibe puissamment les bactéries Gram-positives en présence de glucose. On élève alors dans les bouillons de culture indiqués ci-dessus les colonies qui ont le plus grand pouvoir inhibiteur et on examine le pouvoir bactériostatique des fil trats de ces cultures, puis on vérifie l'insolu bilité du principe actif des filtrats dans les solvants organiques.
On choisit pour la pratique les cultures dont les filtrats ont le plus fort pouvoir bac tériostatique et dont le principe actif est le plus insoluble dans les solvants organiques. Les cultures réussies ont en général une teinte gris-vert pâle sur la surface du haut et blanche ou jaune à la surface inférieure.
Des prises de 450 à 500 cm' d'un milieu de culture ayant la composition ci-dessus indiquée sont introduites dans des bouteilles de flint glass blanc de<B>1250</B> g qui sont alors bouchées avec de l'ouate et stérilisées dans la vapeur 11/2 h.; on ensemence ensuite ces prises d'une culture de l'espèce de penicillium qui a été sélectionnée de la manière décrite et qui s'est développée pendant environ 14 jours sur une couche peu épaisse du même milieu de culture.
On laisse la culture se dé velopper à, environ 20 en couches peu pro fondes dans des bouteilles qui sont placées sur leurs côtés, jusqu'à ce que, par des essais bactériologiques, on décèle la présence du principe bactériostatique à une forte concen tration et qu'il ne reste que peu de glucose.
Le pH du milieu est d'environ 6,5 % au début; après 3 ou 4 jours, il tombe à environ 3,5 et reste à cette valeur pendant tout le temps du développement, qui dure de 8 à 14 jours. Une même croissance des ferments apparaît à la surface du milieu en, 3 ou 4 jours, ceux-ci se développant graduellement et sont de couleur blanche au début puis virent souvent au gris-vert pâle.
Lorsque la liqueur a une action bacté riostatique convenable et contient peu de glucose, elle est décantée du mélange et fil trée. Le filtrat peut être conservé à basse température en y ajoutant de préférence une substance protectrice, par exemple 1 cm@ par litre de chloroforme.
On isole le principe actif de préférence en concentrant le filtrat soit par évaporation en le réduisant au-dessous du cinquième de son volume, autant que possible à une tempéra ture inférieure à 26 et sous pression réduite, soit par congélation et élimination de l'eau dans le filtrat de la culture, puis en précipi tant le principe actif de la solution concen trée par un solvant organique, de préférence par l'acétone.
Ainsi, par exemple, l'isolement de la substance active du filtrat de la culture obtenue par fermentation, comme indiqué ci- dessus, dans un milieu acide, peut être fait en refroidissant le filtrat de la culture dans un mélange réfrigérant en agitant et en sé parant l'eau congelée sous forme d'une molle pâte de cristaux de glace qui est éliminée par filtration sur un filtre convenablement re froidi.
Le filtrat est à nouveau congelé et toutes les opérations sont répétées en tout cinq fois, en sorte que le volume du filtrat final représente environ le cinquième du vo lume du filtrat de la culture employée. Le filtrat final est alors précipité par l'adjonc tion de son triple volume d'un solvant misci ble dans l'eau, par exemple l'acétone. Le principe actif brut se sépare alors sous forme d'un solide volumineux et amorphe.
On peut obtenir ultérieurement encore une certaine quantité de substance en fondant les cristaux de glace et en opérant par précipitation frac tionnée avec un solvant selon la manière dé crite ci-dessus.
Les données quantitatives fournies dans les exemples ci-dessus ont uniquement pour but de montrer un mode de réalisation du procédé, et il est bien entendu que des modi fications peuvent y être apportées lorsqu'on l'exécute, par exemple, en éliminant une quantité d'eau variable et en ajoutant di verses quantités de solvant à un filtrat de culture d'une activité différente; d'autres milieux de culture peuvent être utilisés ayant une composition autre que celle indiquée dans l'exemple cité.
La substance active brute peut être puri fiée par dissolution dans l'eau et reprécipita- tion avec l'acétone et par trituration - avec l'acétone, l'alcool, l'éther ou d'autres solvants organiques convenables.
La substance ainsi obtenue est un solide amorphe, hygroscopique, jaunâtre ou brun clair, qui a une action antibactérienne au moins aussi grande que la penicilline, quoi que ses autres propriétés soient très diffé rentes de celles de ce produit, que l'on trouve dans la littérature citée plus haut. Ainsi, la substance ne peut pas être extraite par l'acétate d'amyle d'une solution aqueuse acide, elle est insoluble ou seulement peu soluble dans les solvants organiques tels que l'acétone et l'acétate d'amyle, mais est solu= ble dans l'eau, y formant une solution légère ment trouble à réaction acide. Le rendement est d'au moins 0,5 g du produit par litre de filtrat de culture; il est d'une très grande efficacité bactériostatique.