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La présente invention concerne un procédé de préparation de nouveaux composés antibiotiques de la série de la ristocétine et l'emploi de ces composés en vue de la récupération et de la purification de la ristpcétine.
La ristocétine est un produit'antibiotique, présentant une activité bactéricide envers les organismes à réaction de Gram positive et produit par 1' actinomycete Nocardia lurida. On sépare le produit antibiotique résultant du procédé ci-dessus en deux antibiotiques très semblables,qui ont été décrits en détail dans la littérature et désignés par ristocétine A et ristocétine B.
On a considéré nécessaire jusqu'ici, pour la récupération et la pu- rification de la ristocétine, d'adsorber l'antibiotique sur une colonne d'échan- ge d'ions, puis d'éluer l'antibiotique obtenu sous une forme plus purifiée. L' emploi des colonnes d'échange d'ions n'est pas toujours commode cependant parce que les résines ne sont pas facilement disponibles. Il est par suite-fortement désirable de simplifier le procédé de purification de la ristocétine, en élimi- nant si on le désire la nécessité de l'emploi d'une colonne de résine d'échange d'ions.
Les buts de la présente invention sont donc les suivants: fournir un procédé de préparation d'un composé de ristocétine à peine soluble dans l'eau, conservant son activité antibiotique et facilitant considérablement la récupé- ration de la ristocétine à partir des bières de'fermentation filtrées aussi bien que de ces solutions plus purifiées.
D'autres buts apparaitront de la description détaillée ci-après.
On a trouvé que la ristocétine et ses constituants, la ristocétine A et la ristocétine B, sous forme d'une base ou d'un sel soluble dans l'eau, ré- agissent avec une aldéhyde aromatique telle que la salicylaldéhyde et la cinna- maldéhyde pour donner un composé défini qui ressemble à une base de Schiff et qui est excessivement peu soluble dans l'eau. On prépare les comppsés en ques- tion selon la présente invention en ajustant une solution aqueuse d'un sel de ristocétine, tel que le sulfate, à un pH d'environ 7 à 8 et de préférence 7,5 - 8,1 avec du bicarbonate de sodium pulvérisé, de la soude ou autre réactif alca- lin. On ajoute une aldéhyde aromatique telle que la salycylaldéhyde et le pro- duit se sépare de la solution après agitation pendant un court moment à la tem- pérature ambiante.
On filtre le produit, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 40-60 .
Dans les exemples suivants, sont illustrées plusieurs réalisations de la présente invention, étant bien entendu que celles-ci n'est limitée, ni aux réactions particulières décrites, ni aux conditions précises énumérées dans les exemples, ceux-ci n'étant donnés qu'en vue d'illustrer les principes de l'inven- tion.
EXEMPLE 1.
On dissout 1 g de ristocétine A dans de l'eau jusqu'à un volume de 100cc. On conserve 10cc de cette solution en vue de soumettre aux essais et on leur trouve une puissance de 902 U/mg. On ajuste 90cc de cette solution à pH 7,6 avec du bicarbonate de sodium pulvérisé. On ajoute 0,5 ce de salicylaldéhy- de et on agite pendant 1 heure. On filtre le solide jaune qui se sépare, on le lave à l'eau, et on le sèche sous vide à 40 C. Le rendement est de 0,88 g d'un produit donnant à l'essai 887 U/mg et contenant 8,0% d'humidité et 0,05% de cen- dres. Ceci représente une récupération de 99,5%. Le produit se décompose à une température d'environ 250 C.
A l'analyse chimique du produit, qui contient théo- riquement 3 groupes salicylaldéhyde par molécule de ristocétine, on'obtient les résultats, suivants;
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<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> 0
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Théorie 57 5,90% 4, 5 z Trouvé 57el9% 5, 78 4,2 32,54% On trouve que le produit est soluble dans le polyéthylène-glycol,
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le propylèneglycol, l'acétone aqueuse, le méthanol aqueux, l'élhanol aqueux, la pyridine, la formamide, et l'eau saturée de butanol, et insoluble dans.- l'acéta4- te d'amyle, l'acétate d'éthyle, l'acétone, le benzène, -la diéthyloétone, le car- bone de diéthyle, le chloroforme, le chlorure de méthylène et le butanol.
Les essais biologiques sur le produit sont 'obtenus en dissolvant le composé dans du méthanol à 50% et on prouve que le.produit a un faible effet irritant sur les tissus.
EXEMPLE 2.
On dissout 1 g de ristocétine B dans de l'eau jusqu'à un volume de
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100co. On conserve 10ec de. cette solution pour des essais qui indiquent une puis- sance de 920 U/mg. On ajuste 90cc de la solution restante à pH 7,6 avec du bi- carbonate de sodium pulvérisé, on ajoute 0,5cc de salicylaldéhyde et on agite pendant 1 heure à température ambiante. On filtre le solide jaune qui se sépa- re, on le lave à l'eau, et on le sèche sous vide à 40 . Le rendement est de ,'
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0,84 g de produit, donnant un essai de 753 U/mg contenant 1,66% d'humidité et 0,11% de cendres. Le produit fond avec décomposition à une*température d'envi- ron 250 .
A l'analyse chimique du produit, qui contient théoriquement 3 groupes salicylaldéhyde par molécule, de ristocétine, on obtient les résultats suivants:
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C If 0 Théorie 58% 5,,7% 5, 31, 3 Trouvé 58,59% 5,60% 5,1% z EXEMPLE 3.
On ajuste 9 litres d'une bière filtrée de ristocétine, donnant à 1' essai 219 U/cc, à bH 7,7 par du bicarbonate de sodium, et on agite soigneusement tout en ajoutant 90cc de salicylaldéhyde. On poursuit l'agitation pendant 1-1/2 heure, on ajoute 400 g de chlorure de sodium et on agite pendant 1 heure. On filtre le produit jaune' à l'aide de l'adjuvant Hyflo et la bière usée donne à
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l'essai 46 1Jlaa, On lave le gâteau d'Hyflo If3.veo une petite quantité d'eau, puis on le délaie dans l'eau, on l'ajuste à pH 3 avec H2SO4 6 N. On filtre la suspension et on la lave à l'eau. Des essais sur le filtrat indiquent un produit ayant une puissance de 407 U/mg.
EXEMPLE 4 On ajuste à pH 7,6 avec du bicarbonate de sodium pulvérisé 14 litres d'une solu- tion limpide et presque incolore de sulfate de ristocétine donnant un essai de 3. 900 U/cc avec une puissance de 455 U/mg. On ajoute 57 g de salicylaldéhyde et on agite pendant 1-1/2 heure. On filtre le solide jaune clair qui se sépare, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 40 . Le rendement est de 50 g d' un produit donnant un essai de 732 U/mg.
EXEMPLES
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On met en suspension dans 10ec d'eau 3 g du composé rîstqQétineàlà4=, licylaldéhyde donnant un essai de 630 U/mg et on l'acidifie avec 1 cc d'H2S0 .
6 N. On ajoute la solution à 190co d'acétone et on agite. On filtre le produit granuleux, on le lavq à l'acétone et on le sèche sous vide à température ambian- te. Le rendement en sulfate de ristocétine est de 3,12 g et l'essai donne 673 U/mg.
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EXEMPLE 6.
On met en suspension dans 50cc d'eau, 5 g du composé ristocétine- , salicylaldéhyde donnant un essai de 732 U/mg et on ajuste à pH 2,0 par H2SO4 6 N. On ajoute du chloroforme et on extrait la salicylaldéhyde dans la phase inférieure. On réalise deux extractions additionnelles au chloroforme et on réunit les extraits au chloroforme pour donner un volume de 24cc. On détermine la quantité de salicylaldéhyde par absorption d'ultra-violet et elle est de 17 mg/cc, ce qui donne une quantité totale de 408 mg. La valeur calculée pour la combinaison de 3 moles de salicylaldéhyde avec la ristocétine est de 428 mg.
EXEMPLE 7
On ajuste à pH 8,1, avec une solution de soude, 3 litres d'une solu- tion de sulfate de ristocétine donnant un essai de 3900 U/cc et une puissance de 455 U/mg. On ajoute 10 cc de salicylaldéhyde et on agite pendant 1-1/2 heure.
On filtre le produit, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 60 . Le ren- dement en produit est de 12g donnant un essai de 795 U/mg. La récupération est de 80,5%.
EXEMPLE 8.
On ajuste à pH 7,7, avec du bicarbonate de sodium pulvérisé, 1 litre d'une solution aqueuse de sulfate de ristocétine donnant un essai de 3900 U/cc.
On ajoute 10 cc de cinnamaldéhyde et on agite la solution pendant 1-1/2 heure.
On filtre le produit qui se sépare, on le lave avec une petite quantité d'eau, et on le sèche à 40 . L'essai biologique sur le composé jaune clair donne 474 U/mg. Le produit contient 2,75% d'humidité, et 0,06% de cendres. On obtient une récupération de 92% de l'activité de la ristocétine.
Par le terme "antibiotique de la série de la ristocétine", on désig- ne un produit à activité microbiologique tel qu'il s'en forme par fermentation en culture profonde de l'organisme Nocardia lùrida dans un milieu nutritif. Ce terme couvre la ristocétine A et la ristocétine B.
On pourra facilement adapter l'invention aux diverses- conditions d' emploi sans s'écarter de son cadre.