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" PROCEDE DE PREPARATION D'UNE SUBSTANCE BIOLOGIQUEMENT
ACTIVE DENOMEE FACTEUR COSYNTHETIQUE - 1.
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La présente invention a pour objet une nouvelle . substance possédant une activité biologique qui est élabo- rée-par diverses espèces du genre Streptomyces. La nouvelle substance que l'on appellera Cosynthetic Factor-1 (Facteur
EMI2.1
"côsqnthétiiué-1) ou Caf-1 possède la propriété de stimuler .,la production de la chlorotétracycline à des concentrations élevées lorsqu'elle est ajoutée à des milieux de fermenta- tion contenant des souches de S. aureofaciens qui produi- - sent seulement de très faibles quantités de chlorotétra- cycline.
Dans le brevet belge n 566.455 de la demanderesse, pour "Procédé de préparation des 5a(lla)déhydrotétracycli- no@, on a décrit quelques nouveaux composés apparentés aux
EMI2.2
tétracyclines, les 5a(lla)-déhydrotétracycline±.Les 5a(lla)- déhydrotétracyclines sont produites par certaines souches de S.auréofaci en s telles que la souche S1308 par exemple dont les caractéristiques de morphologie et de culture sont décrites, de façon adéquate dans la demande de bre- vet précitée. De plus, les cultures viables de S.auréofa- ciens, souche S1308, ainsi que plusieurs variantes ont été déposées à l'American Type Culture Collection 4 Washington, D.C. et connues sous les numéros matricules
EMI2.3
ATCC de 12748 à 12751 inclus.
Les 5.{lla)-dihydrotétracy- clines sont biologiquement inactives mais elles peuvent être converties par un procédé de réduction catalytique approprié en tétracycline antibiotique à large spectre, bien connu.
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On a découvert selon l'invention que lorsqu'on ajoute la nouvelle substance de la présente invention à un milieu de fermentation inoculé de S.aureofaciens de la souche S1308 (ATCC n 12748), par exemple, et que la culture'croit dans des conditions aérobies.standards, la quantité de chlorotétracycline produite crott de 100-400 microgrammes par cm3 environ à plus de 5000 microgrammes par cm3. Dans ce cas, il ne se produit pas de 5a(lla)- déhydrotétracycline. La raison pour laquelle l'addition du
CF-1 au milieu de fermentation produit une concentration si élevée en chlorotétracycline alors que la 'fermentation ne produit ordinairement que de très faibles quantités de chlorotétracycline n'est pas connue avec certitude et aucune théorie n'est avancée à cet effet.
Toutefois, on pense que le CF-1 n'est pas un précurseur du fait que pour un microgramme de CF-1 ajouté à une quantité suffisante de S-aureofaciens ATCC n 12748, on réalise la biosynthèse d'une quantité de chlorotétracycline supérieure à celle produite dans les mêmes conditions de 57 microgrammès.
La nouvelle substance de la présente invention est composée d'éléments carbone, hydrogène, azote et oxy- gène. L'analyse élémentaire des échantillons purifiés indi- que des proportions élémentaires en poids suivantes : carbone 50,33%; hydrogène 5%; azote 12,18%; oxygène (direct) 32,58%; Le composé a un poids moléculaire relativement fai- ble de 340-360. La formule empirique basée sur les valeurs analytiques précitées correspond étroitement à
C14-15H17N3O7. Le produit est soluble dans l'eau à pH 6 et est soluble dans le phénol. Il est insoluble dans le n-butanol, l'acétone l'éther et dans l'eau à pH 1-2.
Le CF-1 a une valeur Rf de 0,007 sur un chroma- togramme sur-papier développé par un système n-butanol- eau à 1 :1 une valeur Rf de 0,28-0,35 dans un système n-butanol-acide acétique-eau à 3:1:4 et une valeur Rf de 0,30-0,40 dans un système ammoniaque-eau à pH 10. LE?.?
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chromatogrammes sont obtenus à 25 C, avec utilisation d'u@ papier Whatman n 1 et la présence du CF-1 est déterminée par une fluorescence jaune verdâtre caractéristique à la lumière ultra violette.
Dans une opération de distribution à contre cou- rant dans un dispositif de Craig à 50 tubes, utilisant un mélange à 1 :1 phénol-chloroforme comme phase organi- que et du HCl à 0,1N comme phase aqueuse, le CF-1 apparaît comme un composant simple avec une concentration maximum dans le tube 31.
Un spectre d'absorption dans 1'infra-rouge d'un échantillon du composé obtenu à partir d'une solution d'a- cide chlorhydrique diluée (forme acide) est préparé de manière standard en mélangeant cet échantillon avec des cristaux de bromure de potassium et en le pressant en un disque. La forme acide du composé exhibe des bandes d'ab- sorption caractéristiques dans la région infra-rouge du spectre à des longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns : 2,84; 3,18; 3,35; 3,55; 5,91; 6,02; 6,27; 6,35; 6,49; 6,64; 6,72; 7,02; 7,18; 7,35; 7,49; 7,93 ; 8,16; 8,36; 8,69; 9,15; 9,30; 9,59 ; 9,77; 9,90; 10,11; 10,47; 11,40; 11,62; 11,81; 12,55; 12,83; 13,30; 14,48. La courbe d'ab- sorption dans 1'infra-rouge est représentée à la figure 1 du dessin.
Le composé obtenu à partir d'une solution d'ammoniaque à pH 7 (fofme neutre) et mis en suspension dans une pastille de bromure de potassium exhibe des bandes d'absorption caractéristiques dans la région infra-rouge du spectre à des longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns : 3,12; 3,37; 3,55 ; 6,07; 6,33; 6,63; 7,00 ; 7,25 ; 7,44; 7,88; 8,13; 8,35; 8,73; 9,25; 9,55; 9,63; 9,84; 10,28; 10,42; 11,57; 11,75; 12,60; 12,96; 14,50. Cette cour. be dans l'infra-rouge est représentée à la figure 2 du des- sin ci-joint.
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Un spectre d'absorption dans l'ultra-violet dé- terminé sur un échantillon du composé à une concentration de 10,7 microgrammes par cm3 dans du HCl à 0,01 N, présen- te des bandes d'absorption caractéristiques maxima 230 m , 250 m , 267 m , et 377 m , correspondant à des va- leurs de coefficient d'extinction (E1cm1%) de 1010, 580, 600, et 693, respectivement. Cette courbe d'absorption dans l'ultra-violet est représentée à la figure 3 du dessin.
Un spectre d'absorption dans l'ultra-violet dé- terminé sur un échantillon du composé à une concentration de 10,7 microgrammes par cm3 dans du NH40H à 0,01N, montre des bandes d'absorption caractéristiques maxima à 248 m , 268 m , 295 m , et 419 m correspondant aux valeurs de coef- ficient d'extinction (E1cm1%) de 972, 684, 349 et 1215 res- pectivement. Cette courbe est représentée à la figure 4 du dessin.
Comme on le verra dans les exemples particuliers qui suivent, le CF-1 de la présente invention est produit par une variété d'organismes du genre Streptomyces comme il est prouvé par l'accroissement de la production de chlorotétracycline lorsque des mélanges de fermentation de ce type sont ajoutés à un milieu de fermentation inocu- lé par une culture de S.aureofaciens productrices de 5a(lla)-déhydrotétracycline, telle que la souche ATCC n 12748. Ces organismes sont tous des espèces du genre Streptomyces.
Ainsi, on a utilisé avec succès les espèces suivantes de microorganismes pour produire du CF-1 : S.albus producteur de la vitamine B12; S.rimosus; S.Platen- sis et S.hygroscopicus, tous producteurs de l'oxytétra- cycline; l'espèce soi-disant nouvelle S.viridifaciens pro- ductrice de chlorotétracycline et de tétracycline : S.au- reofaciens producteur de chlorotétracyline et de tétracy- cline; S.griseus producteur de streptomycine ; et S.albo-
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niger producteur de puromycine.
L'organisme préféré pour la production du CF-1, en raison de sa capacité de produire de grandes quantités de cette substance est une nouvelle souche de S.aureofa- ciens, désignée par W-5.
La nouvelle souche est un membre de l'espèce S. aureofaciens car elle est un descendant direct de la sou- che de S.aureofaciens A377 productrice de chlorotétracycli - ne, qui a été isolée du sol et décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2.482.055 du 13 septembre 1949 et dont la culture est déposée à la Northest Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois sous le n NRRL 2209. Des agents mutagènes et des agents sélectifs utilisés pour l'obtention de cette nouvelle souche compren- nent les traitements par irradiation ultra-violette, par la nicotine et par la moutarde à l'azote et par exposition phage. Le CF-1 peut être produit pratiquement par toutes les souches de S.aureofaciens, par d'autres souches de Streptomyces et par d'autres microorganismes et par des mutantes de ces souches.
La méthode utilisée pour tester les nouvelles souches en vue de la production du CF-1 sera décrite, d ans les exemples qui suivent.
La nouvelle souche préférée pour la production de la nouvelle substance de la présente invention possède les mêmes caractéristiques générales que les souches pro- ductrices de tétracycline et diffère de la même manière générale que les souches de S.aureofaciens productrices de tétracycline diffèrent des souches productrices de chloro- tétracycline, comme décrit dans la littérature. Les données qui suivent servent à illustrer la différence entre la souche W-5 et la souche d'origine A377 connue sous le n NRRL 2209.
On différencie les Streptomyces aureofaciens
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appartenant à la souche W-5, des Streptomyces aureofaciens appartenant à la souche A377 (NRRL 2209) par l'observation des caractéristiques de croissance sur divers milieux in- cubés à 26,5 C.
EMI7.1
1.- Glycero1-Asparaine-Extrait de viande de boeuf Agar-Agar
EMI7.2
<tb> Glycérol <SEP> ................... <SEP> 1,0%
<tb>
EMI7.3
L.Asparagin e ................. 0,05 %
EMI7.4
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> .................... <SEP> 0,05%
<tb>
<tb> Agar-Agar <SEP> Bacto <SEP> ............... <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s.............. <SEP> 100,0%
<tb>
<tb> Ajustement <SEP> avec <SEP> KOH <SEP> à <SEP> 50% <SEP> à <SEP> pH <SEP> ....... <SEP> 7,0
<tb>
<tb> Post <SEP> stérilisation <SEP> , <SEP> pH <SEP> ...........
<SEP> 7,2
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Streptomyces aureofaciens
EMI7.5
<tb> Souche <SEP> W-5 <SEP> Souche <SEP> A <SEP> 377
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<tb> croissance <SEP> moyenne <SEP> à <SEP> bonne, <SEP> bonne
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<tb> hyaline <SEP> à <SEP> semi-
<tb>
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<tb> opaque, <SEP> blanche
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<tb> hyphe <SEP> aérien <SEP> rare <SEP> à <SEP> modéré, <SEP> blanc <SEP> léger <SEP> à <SEP> moyen,
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<tb> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> claii
<tb>
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<tb> Sporulation <SEP> rare, <SEP> gris <SEP> sombre <SEP> gris <SEP> clair
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<tb> Pigment <SEP> diffusi-
<tb>
<tb>
<tb> ble <SEP> néant <SEP> jaune <SEP> clair
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Envers <SEP> blanc, <SEP> semi-opaque <SEP> jaune <SEP> à
<tb>
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<tb> jaune <SEP> orangé
<tb>
<tb>
<tb> clair
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2.
- Dextrine Agar-Agar Czapek-Dox
EMI7.6
<tb> Dextrine <SEP> .................. <SEP> 1,0%
<tb>
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NaN03 ................... o, bzz
EMI7.8
<tb> KHPO, <SEP> ................... <SEP> 0,1%
<tb>
EMI7.9
MgSO.THO ................. 0,05% XC1 .................... 0,05% FeS0.7HZ0 ................. 0, OOl%
EMI7.10
<tb> Agar-Agar <SEP> Bacto <SEP> .............. <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s............. <SEP> 100,0%
<tb>
<tb> Post <SEP> stérilisation, <SEP> pH........... <SEP> 7,2
<tb>
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EMI8.1
:..} ;- - - '......
.r¯-. ¯ 1 ' ' , Streptomyces aureofaciens
EMI8.2
- - ,1¯ Souche If-5 Souche A37
EMI8.3
<tb> .'croissance <SEP> trèsfine, <SEP> hyaline <SEP> bonne
<tb>
<tb> claire <SEP> à <SEP> blanc
<tb>
<tb> translucide
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<tb> .-hyphe <SEP> aérien <SEP> néant <SEP> Globules <SEP> en <SEP> sur-
<tb>
<tb> face <SEP> limpides,
<tb>
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.. ' ¯ '- ;
abondants, gris
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<tb> souris <SEP> à <SEP> gris <SEP> de
<tb>
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<tb> plomb
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<tb>
<tb> Sporulation <SEP> néant <SEP> abondante
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<tb> Pigment <SEP> diffusi-
<tb>
EMI8.6
ble ... néant trace,j4une pale envers hyalin clair à non pigmenté, tra- ' < ¯ ¯ ? , . ¯ ¯ blanc translucide ce de rose
EMI8.7
Color Harmony Manual, 3ème Edition, Container Corporation a - of Americà 3.- Liqueor de macération de mais - Agar-Agar AP4
EMI8.8
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> ...... <SEP> 0,4%
<tb> Saccharose <SEP> 1,0%
<tb>
EMI8.9
MgS lr .. 7HZO / 'MgSO,.7HO................ 0,025% ' KHjQO, :
................ 0,2% (NH) 2HP0 ............... 0,2% àgqr-%ar Bacto - - ........... 2,0% Eau du robinet, q. s ............ 100,0%
EMI8.10
<tb> .Post-stérilisation, <SEP> pH <SEP> .......... <SEP> 6,5
<tb>
Streptomyces aureofaciens
EMI8.11
Souche W.-5 Souche A377
EMI8.12
<tb> Croissance <SEP> excellent, <SEP> blanc <SEP> Excellent
<tb>
<tb>
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> abondant <SEP> abandonant,fauve <SEP> 1 <SEP>
<tb>
<tb>
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<tb> Sporulation <SEP> abondant, <SEP> gris <SEP> ar- <SEP> abondant, <SEP> uni-
<tb>
<tb>
<tb> gent <SEP> 1 <SEP> à <SEP> gris <SEP> beige <SEP> forme
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> néant <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> à
<tb>
<tb> ambre
<tb>
<tb>
<tb> Envers <SEP> blanc <SEP> à <SEP> castor <SEP> à <SEP> tan <SEP> clairl
<tb>
<tb>
<tb> chocolat
<tb>
EMI8.13
lColor Harmony Manuel,
3ème Edition, Container Corporation of America
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EMI9.1
. - T - '4.-'Autres'mil! eux¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ -
Streptomyces aureofaciens
EMI9.2
<tb> .Milieu <SEP> Souche <SEP> W-5 <SEP> Souche <SEP> A <SEP> 377
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<tb> . <SEP> Agar-agar <SEP> nutritif <SEP> -Centres <SEP> de <SEP> croissance <SEP> Croissance <SEP> bonne.
<tb>
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<tb> blancs, <SEP> semi <SEP> opaques <SEP> Pas <SEP> de <SEP> hyphe <SEP> aé-
<tb>
<tb>
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<tb> sur <SEP> croissance <SEP> maigre, <SEP> rien. <SEP> Envers <SEP> : <SEP>
<tb>
<tb>
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<tb> hyaline <SEP> incolore.Pas <SEP> jaune <SEP> pale. <SEP> Pig-
<tb>
<tb>
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<tb> de <SEP> mycélium <SEP> aérien. <SEP> ment <SEP> soluble
<tb>
<tb>
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<tb> .' <SEP> Envers:
<SEP> hyalin <SEP> clair <SEP> jaune <SEP> pale
<tb>
<tb>
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<tb> à <SEP> blanc.pas <SEP> de <SEP> pig-
<tb>
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<tb> ments <SEP> solubles.
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Glucose-Asparagine- <SEP> Croissance <SEP> moyenne <SEP> : <SEP> Croissance <SEP> bonne.
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<tb> viande <SEP> - <SEP> hyaline <SEP> clair <SEP> à <SEP> blanc <SEP> Hyphe <SEP> aérien <SEP> blanc
<tb>
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<tb> translucide, <SEP> mycélium <SEP> virant <SEP> progressive-
<tb>
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<tb> aérien <SEP> rare <SEP> ou <SEP> absent: <SEP> ment <SEP> au <SEP> gris <SEP> avec
<tb>
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<tb> blanc <SEP> à <SEP> castor-'' <SEP> . <SEP> Sporu- <SEP> formation <SEP> crois-
<tb>
<tb>
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<tb> lation <SEP> rare. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> santé <SEP> de <SEP> spores.
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<tb> incolore <SEP> à <SEP> blanc. <SEP> Pas <SEP> Envers:jaune <SEP> clair
<tb>
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<tb> de <SEP> pigment <SEP> soluble. <SEP> à <SEP> rose <SEP> orangé. <SEP> Tra-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ce <SEP> ;
<SEP> pigment <SEP> solu-
<tb>
<tb>
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<tb> ble <SEP> jaune-orangé.
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EMI9.3
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Liqueur <SEP> de <SEP> mais <SEP> Croissance <SEP> excellente <SEP> : <SEP> excel-
<tb>
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<tb> Agar-agar2 <SEP> AP6 <SEP> blanche <SEP> :mycélium <SEP> lente. <SEP> Mycélium
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<tb> rien; <SEP> modéré <SEP> à <SEP> abon- <SEP> aérien <SEP> abondant.
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<tb> dant, <SEP> gris <SEP> argent <SEP> . <SEP> Sporulation <SEP> abon-
<tb>
<tb>
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<tb> Sporulation <SEP> modérée <SEP> à <SEP> dante <SEP> : <SEP> fauvel.
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<tb> abondant$. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> blanc <SEP> Envers <SEP> :
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<tb> à <SEP> castor.1.. <SEP> Pas <SEP> de <SEP> eau. <SEP> Pigment
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<tb> pigment <SEP> soluble. <SEP> soluble, <SEP> ambre
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Agar-agar <SEP> Waksman <SEP> Croissance <SEP> bonne; <SEP> Croissance <SEP> bonne.
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<tb> blanche <SEP> à <SEP> jaune <SEP> clair-. <SEP> Hyphe <SEP> aérien <SEP> moy-
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<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> :moyen <SEP> à <SEP> en <SEP> devant <SEP> abon-
<tb>
<tb>
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<tb> bon,blanc,virant <SEP> au <SEP> dant <SEP> : <SEP> blanc <SEP> à
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<tb> castorl <SEP> au <SEP> cendré..\.. <SEP> brun <SEP> taupel.
<tb>
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<tb>
Sporulation <SEP> moyenne... <SEP> Envers <SEP> chapeau1.
<tb>
EMI9.4
Envers : jaune clair à:grun-adobe- à rosé tauper- à brun Pigment;soluble taupe-à-.Pigment solu- jaune clair ble= javne à ambre.
EMI9.5
<tb>
Pomme <SEP> de <SEP> terre, <SEP> en <SEP> Croissance <SEP> excellente, <SEP> Croissance <SEP> abon-
<tb>
<tb> culture <SEP> inclinée <SEP> unie <SEP> moite, <SEP> nodulée: <SEP> dante, <SEP> unie, <SEP> moi-
<tb>
<tb> fauve <SEP> clair, <SEP> à <SEP> tan <SEP> te, <SEP> nodulée <SEP> : <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> cuivré <SEP> à <SEP> rouge <SEP> brique. <SEP> jaune <SEP> brun <SEP> clair
<tb>
<tb>
<tb> Pas <SEP> de <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> . <SEP> à <SEP> beigelà <SEP> cèdre <SEP> . <SEP>
<tb>
<tb>
Pigment <SEP> soluble <SEP> fauve-'- <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment
<tb> clair. <SEP> soluble
<tb>
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EMI10.1
' ' " ' ' ' " ' " ' '-4*- Autres' milieux (suite)¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ Streptomyces aureofaciens
EMI10.2
<tb> .Milieu <SEP> Souche <SEP> W-5 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>
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<tb> lait <SEP> pourpre <SEP> collier <SEP> de <SEP> crois- <SEP> Collier <SEP> de <SEP> crois-
<tb>
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<tb> sance <SEP> blanc, <SEP> léger <SEP> sanie, <SEP> léger, <SEP> blanc
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> .. <SEP> ¯ <SEP> mais <SEP> défini, <SEP> léger <SEP> à <SEP> jaune <SEP> pâle.
<SEP> Léger
<tb>
<tb>
<tb> changement <SEP> du <SEP> pH, <SEP> changement <SEP> du <SEP> pH, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> aucune <SEP> peptonisa- <SEP> aucune <SEP> peptonisa-
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> apparente <SEP> au <SEP> tion <SEP> apparente
<tb>
<tb>
<tb> ' <SEP> bout <SEP> de <SEP> 14 <SEP> jours, <SEP> au <SEP> bout <SEP> de <SEP> 14
<tb>
<tb>
<tb> jours.
<tb>
EMI10.3
Color Harmony-,Manual, 3ème Edition, Container Corporation ouf America, - . - . Agar-Atar 2AP6. ¯ -- =Saccharose 110% MgSO.?H20 .............. 0125% xlf2roL ................ 0, 2 (NH2)3P0 ............... 0,2% Liqueur de macération du mais 0,6% Agar-agar Bacto (raffiné) ....... z H20 q.s ................ 100,93ré
EMI10.4
<tb> 5.
<SEP> - <SEP> Observations <SEP> au <SEP> microscope
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb>
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<tb> Souche <SEP> W-5 <SEP> Souche <SEP> A-377
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<tb> Milieu <SEP> Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glycérol- <SEP> Flexueux, <SEP> Sphérol- <SEP> Flexueux, <SEP> Sphéroides
<tb>
<tb> Asparagine- <SEP> continu, <SEP> des <SEP> à <SEP> o- <SEP> continu, <SEP> à <SEP> ovoïdes, <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> ramifié, <SEP> voides <SEP> ramifié <SEP> Diam.
<SEP> 1,2-
<tb>
EMI10.5
viande- Diamo0, - Diam.0,5- D3am.1 J 1,5 Agar agar ls 0/.U - 1,0 1,2 u
EMI10.6
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> Flexueux, <SEP> Sphéroïdes <SEP> Flexueux, <SEP> Sphéroides
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> maïs-Agar <SEP> continu, <SEP> à <SEP> ovoïdes <SEP> continu, <SEP> à <SEP> ovoïdes
<tb>
EMI10.7
agar ÏW ramifié. Diam.0,5- ramifié. Diam.1,2- .
Diam. 0,5- 190 Diam.0,8- 135 190 Po l,0u
EMI10.8
<tb> Agar <SEP> agar <SEP> Flexueux, <SEP> Sphéroïdes <SEP> Flexueux, <SEP> Sphéroides
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Waksman <SEP> continu, <SEP> à <SEP> ovoïdes <SEP> continu, <SEP> à <SEP> ovoïdes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ramifié. <SEP> Diam. <SEP> 0,5- <SEP> ramifié. <SEP> Diam <SEP> 0,5-
<tb>
<tb>
<tb> Diam.0,5- <SEP> 1,0 <SEP> Diam.0,5- <SEP> 1,0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1,0 <SEP> <SEP> 1,0 <SEP> la <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
La morphologie du mycélium et des pores des Streptomyces aureofaciens de la, souche W-5 est apparemment similaire à celle de la couche d'origine A 377.
Les cultures viables de S. aureofaciens de la souche W-5 qui produisent'la nouvelle substance de la pré- cente invention ont été déposées à l'American Type Culture Collection à Washington, D.C. sous le n matricule ATCC 13.190.
Les conditions de fermentation avec la nouvelle souche de S. aureofaciens de la présente invention sont généralement les mêmes que celles utilisées actuellement pour la culture des autres souches de S. aureofaciens. Ceci veut dire que le milieu de fermentation contient des matiè- res nutritives courantes et les éléments minéraux essentiels courants. Les substances appropriées qui peuvent fournir les matières nutritives nécessaires comprennent l'amidon, la dextrine, le sucre de canne, le glucose, la mélasse, la farine de soja, la farine d'arachide, la levure, les ex- traits de viande, les peptones, le sulfate d'ammonium, l'u- rée, la liqueur de macération de mais, les matières solubles de distillation, la chair de poisson, et autres substances conventionnelles.
Les sels inorganiques que l'on peut uti- liser comprennent le carbonate de calcium, le sulfate d'am- monium, le chlorure d'ammonium, et divers éléments à l'état de trace, tels que le manganèse, le cobalt, le zinc, le cui- vre, le fer, etc...
A la différence des fermentations par le S1308 et ses variantes producteurs de 5a(lla)-déhydrotétracycline qui produisent de faibles quantités dé chlorotétracycline, on n'a observé aucune production de tétracycline ou de chlorotétracycline lorsqu'on fait croître les nouveaux ' S. aureofaciens de la souche W-5 dans les conditions aéro- bies standards. L'absence de production de chlorotétracy-
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cline et de tétracycline par la souche W-5 est toutefois une caractéristique qui n'est pas nécessairement commune aux autres souches de S. aureofaciens productrices de CF-1 avec de bons rendements .
La culture productrice de CF-1, telle que la nouvelle souche décrite précédemment, croit de façon aérobie dans un milieu d'inoculum approprié. L'inoculum est ensuite transféré et cultivé dans un milieu de fermentation appro- prié et la fermentation est conduite à une température d'en- viron 22 C à 32 C, pendant 48 à 168 heures sur une secoueu- se rotative. Pendant la fermentation, le pH est habituelle- ment maintenu entre 5,5 et 7,5 environA la fin de la fermentation, le pH du mélange se situe habituellement aux environs de 6-7. Le mélange est ensuite filtré sans ajuste- ment de pH. Le CF-1 peut alors être extrait , isolé et pu- rifié de manière appropriée.
Un procédé d'extraction préféré, comporte le filtrage du mélange à pH dominant (6-7). Le filtrat est ensuite ajusté à pH 8-9 par de l'ammoniaque et saturé par du sulfate d'ammonium. Un véhicule approprié tel que l'Ar- quad 16 qui est un chlorure d'alkyltriméthylammonium à lon- gue chaîne dans lequel les groupes alkyle comprennent 90% de groupes hexadécyle, 6% d'octadécyle et 4% d'octadécény- le, est ajouté au mélange et ce dernier est ensuite ex- trait par un alkanol inférieur, c'est-à-dire du n-butanol.
L'extrait au n-butanol est ensuite ajusté à pH 1,5-2 par de l'acide chlorhydrique concentré et est contre-extrait par de l'eau et les deux phases sont séparées. La phase aqueuse qui contient du CF-1 est ensuite concentrée sous pression réduite. Le concentrat aqueux est ensuite soumis à une chromatographie sur une colonne de terre de diatomées de manière usuélle, la colonne étant développée par une solu- tion de n-butanol tamponnée. Les portions riches en CF-1
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sont ensuite extraites à l'eau et le contre-extrait à l'eau est concentré sous vide, l'extrait aqueux est ensuite soumis à une chromatographie sur une colonne de Florisil. Le Flo- risil est un silicate de magnésium activé ayant la composi-
EMI13.1
tion approximative suivante: Mg0-15,5# 1 0,5%; S102 -84% 0,5%; et Na SO - OJ5 .
On élue le CF-1 de la colonne de Florisil au moyen d'alcool méthylique contenant une faible quantité d'eau. Les portions riches en CF-1 sont concentrées ajustées à pH 1 par de l'acide chlorhydrique et filtrées.
Le filtrat est refroidi et ensemencé. Les cristaux résul- tants de CF-1 sont recueillis par filtration, lavés et sé- chés sous vide. Le produit brut peut être purifié de maniè- re standard par recristallisation dans du HCl à 0,1 N.
L'invention sera décrite en détail dans les exemples particuliers suivants.
EXEMPLE 1.-
EMI13.2
..E!!!2¯2¯!:2±!=
Un milieu type utilisé pour la culture de l'ino- culum primaire est préparé conformément à la formule sui- vante:
EMI13.3
<tb> Saccharose <SEP> 30g
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 16,5 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> d'ammonium <SEP> 2g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 7g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> q.s. <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
On place des portions aliqnotes de 8 cm3 de ce milieu dans une série de tubes à essai de 20,3 cm et on les stérilise dans l'autoclave pendant.20 mn sous une pression de 1,05 kg/cm2.
Les spores des souehes de S.aureo- faciens W-5 lavées à partir d'une culture inclinée sur agar agar par de l'eau distillée stérile formant une sus- pension contenant approximativement 60 x 106 spores par cm3. Une portion de 0,33 cm3 de cette suspension est uti-
<Desc/Clms Page number 14>
Usée pour inoculer chacun des tubes contenant une portion de 8 car du dilieu d'inoculum décrit précédemment. Le tube inocule est ensuite incubé pendant 24 heures à 28 C sur une secoueuse alternative opérant à 116 oscillations/minute.
EXEMPLE 2.-
Fermentation.-
On prépare un milieu de fermentation conformément à la formule suivantes
EMI14.1
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 5,0 <SEP> grammes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> grammes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NHC4Cl <SEP> 1,5 <SEP> grammes
<tb>
EMI14.2
NgClz,6N20 2,0 grammes FOS04$7H20 0, 06 grammes MnS04,4.H20 0,05 grammes CoClz,6HZ0 0,005 grammes
EMI14.3
<tb> ZnSO4,7H2O <SEP> 0,1 <SEP> grammes
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 25,0 <SEP> grammes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> 2,0 <SEP> grammes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 55,0 <SEP> grammes
<tb>
eau q.s.
1000 cm3 On place des portions de 25 cm3 du milieu dans des flacons Erlenmeyer de 250 cm3 et l'on ajoute 0,5 cm3 d'huile de sain. doux dans chaque flacon. Les flacons contenant le milieu de fermentation et l'huile de saindoux sont stérilisés dans un autoclave pendant 20 mn sous une pression de 1,05 kg/cm2.
Après la;stérilisation et le refroidissement, 1 cm3de ltino- culum préparé comme à l'exemple 1 est ajouté à chaque fla- con et la fermentation est conduite à 25 C pendant 120 heu- a res sur une secoueuse rotative opérant/-180 tours/minute.
On titre le mélange et on trouve qu'il contient un micro- gramme/cm3 de CF-1.
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EXEMPLE 3 . - Extraction du mélange-.-
Une portion de 200 litres de mélange de fermen- tation'préparé dans une cuve de fermentation avec une souche de S. aureofaciens W-5 productrice de CF-1 cultivé dans le milieu décrit à l'exemple 2 et titrant un microgramme/cm3 de CF-1, est filtrée'à pH 6-7 , en utilisant de la terre de diatomées en quantité voisine de 15% du volume du mélange.
Le gâteau-filtre est lavé avec une quantité suffisante d'eau pour donner un volume total de filtrat neutre combiné égal au volume du mélange de départ. Le potentiel en CF-1 du filtrat neutre combiné est de 1 microgramme/cm3 environ.
Le filtrat neutre combiné est concentré à un quart du vo- lume du mélange de départ, sous vide, à 60 C. Ainsi, le volume final du filtrat neutre combiné concentré est de 50 litres.
Le concentrat de filtrat neutre combiné est ajusté à pH 8-9 au moyen d'ammoniaque concentré, puis sa- turé, par du sulfate d'ammonium. On ajoute de l'Arquad 16 (chlorure de cétyltriméthylammonium) à cette solution dans la proportion de 10 cm3 d'une solution d'Arquad 16 à 50% . dans l'isopropanol par litre de concentrat de filtrat neutre combiné, et le mélange est agité pendant heure. Le mélan- ge est ensuite combiné avec un volume égal de n-butanol et agité pendant une autre demi-heure. Le mélange résultant est centrifugé en vue de séparer les phases. On répète cette extraction en utilisant 10 cm3 d'Arquad 16 à 50% par li- tre de concentrat de filtrat neutre combiné et un autre volume égal de n-butanol.
Les extraits au n-butanol sont alors combinés pour former un volume final de 100 litres.
Les extraits au n-butanol combinés sont concentrés à 1/4 du volume de départ, sous vide, à < 60 C. Ainsi, le volume
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EMI16.1
'\..."'r....'t-i"'f af¯ .. ':-:h:.",,;,i........... ;>" ¯ fil(a) desextraits au pLbutàno1 combinés, concentrés, est des 25.litres.
. Les 25 litres d'extraits au n-butanol combinés et concentrés sont ajustés à pH 1,5-2 par de l'acide chlorhy- drique concentré. On y ajoute 5'litres d'eau et 100 litres de chlorure de méthylène et l'on agite le mélange pendant )heure, La couche aqueuse de 5 litres est séparée de la pha- se organique. Le pH du contre-extrait à l'eau, d'un volume de'5 litres, est ajusté à 7 par une solution d'ammoniaque avant la concentration sous vide à 60 C, à 0,5-1% du vo- lume initial du mélange de fermentation. On obtient ainsi 1 litre de concentrât de contre-extrait à l'eau.
ISOLEMENT.-
On mélange intimement la portion de 1 litre de concentrat de contre-extrait à l'eau avec de la silice de diatomées "Celite 545" non tamponnée, sur la base de 2 g de "Celite 545" par cm3 de concentrat. On prépare une colon- ne, de "Celite 545" de la façon suivante: .On prépare une so- lution tampon de phosphate avec 10,75 g de K2HPO4 par litre
EMI16.2
d'eau et on l'ajuste à pH 9 par du H3P0. On mélange intime- ment la "Celite 545" avec la solution tampon à pH 8 dans les proportions de 2 g de "Celite 545" par cm3 de solution tam- pon. On garnit une colonne de 22,8 cm de diamètre jusqu'à une hauteur de 60 cm avec de la "Celite 545" tamponnée.
La "Celite 545" contenant la solution de CF-1 brut(concentrat de contre-extrait à l'eau) est empilée-en tête de la colon- ne de "Célite 545" tamponnée. La colonne est développée par du n-butanol tamponné à pH 8 de façon décrite précédemment.
Les portions combinées riches en CF-1 sont mélangées avec un volume égal d'eau et deux volumes de chloru-e de méthylène.
Le mélange est agité dans un entonnoir à décantation. La phase organique est extraite à nouveau par un autre demi-vo- lume d'eau. Le contre-extrait à l'eau a un volume de 8 litres
<Desc/Clms Page number 17>
et est concentré, sous-vide à < 40 C à 200 cm3.
PURIFICATION.-
On prépare une colonne de "Florisil" de la façon suivante: On empile le Florisil dans une colonne de 7,6 cm -de diamètre jusqu'à une hauteur de 45,7 cm. Cette colonne
EMI17.1
est -lavée par une -solution, &queuse de NH OH à 0,01 n, puis par de l'alcool méthylique contenant lu d'eau et finalement par une solution.oqueuae; de NH49:H à 0,01 N, à nouveau.
Les 200 carde côncentrat combiné de contre-extrait à l'eau sont;placés à la partie supérieure de la colonne de Florisil tassée et lavée pour.traverser ladite colonne ; on y ajoute successivement un volume de 1 litre de NH4OH aqueux à 0,01 N et 500 CM3 d'eau. On élue ensuite le CF-1 de cette colonne au moyen d'alcool méthylique contenant 10% d'eau.
.les portions combinées riches en CF-1 sont ajustées à pH 7 par de l'anhydride carbonique puis concentrées à une tem- pérature inférieure à 40 C et sous vide pour donner approxi- mativement 100 car d'une solution aqueuse de CF-1.
Le concentrât combiné riche en CF-1 est ajusté à pH 1 par de l'acide.chlorhydrique, chauffé à 90 C, et fil- tré à travers un papier filtre de Whatman n 4. Le filtrat est refroidi, ensemencé et laissé au repos une nuit à 15 C .
EMI17.2
Les cristaux résultants .ont recueillis par filtration, la- vés d'abord par une solution d'acide chlorhydrique à 0,1 N puis par de l'eau et finalement par de l'acétone puis par de l'éther et séchés sous vide, à 40 C, une nuit, pour don- ner 92 mg de produit brut .
Le= cristaux bruts sont dissous dans une solution d'acide chlorhydrique à 0,1 N, chauffés 4 90 et refroidis dans un bain d'eau et de glace à environ 5 C pour provoquer la cristallisation. Les cristaux nouvellement formés sont d'abord lavés par une solution d'acide chlorhydrique à 0,1N froide (10 C) , puis par de l'eau froide, puis séchés sous
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
.widé ' ; ,.Nètè¯mpérâtüië:iif¯'f'ériëûr 1 C, pendant 3 heures, flji[¯sfjjµg"llpk]%"iÎ? ±,h +' ' , ; i" # %f"1>' ' '-pôür-dôniiér62¯mg de -CF-1 sous .forme acide, fondant en se décomposant à 280-285 *'C.
La forme neutre du produit est yabtenûé en>dissolvant 5 mg de la forme acide de CF-1 dans 3. cm3> dt eâ.û chaude et 'en a joutant de l'ammoniaque jusqu'à , pH 7,5: 'La-fozme neutre cristalline précipite de la solution '-'" *T.-: '.- - ¯ ., :,..¯ pàp4refroidissement. Les cristaux sont lavés à l'eau froide ¯ pûis ,séchés.soïis'rviâé à 10 C.- L'analyse chimique du CF-1 et :'---',.'.. ':.'-';t'.-:.'' ' "ses propriétês.biol&giqaès, physiques et chimiques ont déjà été: d(éÉëà" µF4céflemment .
..i" - .),l;. ' " , ¯fi ,$.¯, ... - EXEMPLE 4.- "On prépare comme suit un titrage standard de CF-1; On prépare un inoculum. de S. aureofaciens S-1309 (ATCC 12740) conformément au procédé décrit à l'exemple 1. Des incréments de CF-1 cristallin obtenus de façon décrite à l'exemple 3
EMI18.2
sont ajoutés à.un milieu de fermentation comme décrit à l'ex- emple'2,, sauf que.l'on y ajoute 0,1 microgramme/cm3 de ribo- flavine. Le milieu est ensuite stérilisé, inoculé avec l'ino- culum végétatif de S. aureofaciens S-1309 de 24 heures, incu- bé'pendant 120 heures à 250C et titré en vue de déterminer la quantité de.chlorotétracycline présante.
EMI18.3
.OE-1 ajouté mcgjcmj Chlorotétracycline pro-
EMI18.4
<tb> duite <SEP> (Titrage <SEP> turbidi-
<tb>
<tb>
<tb> métrique) <SEP> ., <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 360
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,01 <SEP> 925
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0, <SEP> 02 <SEP> 1500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,04 <SEP> 2550
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,08 <SEP> 4270
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,16 <SEP> 5600
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,32 <SEP> 6200
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
EXEMPLE 5. - On conduit une fermentation de 120 heures avec des
S. aureofaciens W-5 suivant le procédé décrit à l'exemple 2.
Le mélange résultant est filtré sans ajustement de pH pour obtenir un filtrat de W-5.
On prépare une fermentation par des S. aureofa- ciens S-1308 et on.la conduit comme à l'exemple 4, mais en substituant 0,08 cm3 du filtrat neutre de W-5 au CF-1 cris- tallin utilisé à l'exemple 4. Les titres du mélange mois- - sonné sont les suivants :
EMI19.1
<tb> cm3 <SEP> de <SEP> filtrat.neutre <SEP> de <SEP> W-5 <SEP> Chlorotétracycline <SEP> produite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> par <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> mélange <SEP> S-1308 <SEP> .(titrage <SEP> turbidimétrique)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,00 <SEP> 150
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,08 <SEP> 3410
<tb>
En comparant ces résultats avec ceux obtenus avec du CD-1 pur à l'exemple 4, en voit que le mélange de W-5 contient 0,85 microgramme/cm3 de CF-1.
EXEMPLE 6.-
On cultive toutes les souches de Streptomyces ci- tées ci-après dans des milieux de fermentation primaires séparés, et après la croissance, on ajoute des portions ali- qùotes des mélanges moissonnés aux flacons Erlenmeyer conte- nant le milieu décrit à l'exemple 2 de façon que le volume total final du mélange de fermentation primaire: plus le milieu contenu dans chaque flacon soit de 25 cm3. Les fla- cons et leurs contenus sont ensuite stérilisés pendant 20 minutes sous une pression de 1,05 kg/cm2 et refroidis ulté- rieurement à 25¯5 C.
Un inoculum de S. aureofaciens S-1308 (ATCC 12748) est préparé conformément à la technique décrite à l'exemple
1. A la fin de la période d'incubation de 24 heures, les flacons contenant les 25 cm3 de mélange de fermentation com- biné préparé précédemment sont inoculés chacun par 1 cm3 de l'inoculum de S. aureofaciens S-1308. Ces flacons inocu- lés sont incubés à 25 C pendant 120 heures sur une secoueu- ,
<Desc/Clms Page number 20>
se rbtative opérant à 180 t/mn.
A la fin de la période de fermentation chaque flacon est titré fluorométriquement pour déterminer la teneur en chlorotétracycline, la t eneur en CF-1 de chaque mélange de fermentation primaire est calculée et les résultats obtenus sont les suivants:
EMI20.1
Cultures utilisées dans la rücrogrammes de CF-1 par cmj
EMI20.2
<tb> fermentation <SEP> primaire <SEP> de <SEP> mélange <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> pri-
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯maire.¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
EMI20.3
Streptomyces aureofaciens W-5 1,3 7
EMI20.4
<tb> Streptomyces <SEP> albus <SEP> 0,38
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> platensis <SEP> 0,37
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> hygroscopicus <SEP> 0,35
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> griseus <SEP> 0,
52
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> albo-niger <SEP> 0,7
<tb>
EXEMPLE 7.-
On prépare un filtrat neutre de S. aureofaciens W-5 de façon décrite à l'exemple 5. Une fermentation par les S. aureofaciens E-504 (ATCC 13 191) est préparée et conduite comme à l'exemple 4. mais en substituant diffé- rents volumes de filtrats neutres de S. aureofaciens W-5 au CF-1 cristallin utilisé.
Les titres du mélange men- tionné sont les suivants:
EMI20.5
<tb> cm3 <SEP> de <SEP> filtrat <SEP> neutre <SEP> de <SEP> W-5 <SEP> 7-chloro-6-déméthyltétracycli-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> par <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> mélange <SEP> de <SEP> E-504 <SEP> ne <SEP> produite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> titrage <SEP> turbi- <SEP> titrage <SEP> spec-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dimétrique <SEP> trophtotomé-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> imétriq <SEP> trique
<tb>
EMI20.6
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ mcg/cm
EMI20.7
<tb> 0,00 <SEP> < <SEP> 0,5 <SEP> < <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb> 0,04 <SEP> 105 <SEP> 85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,12 <SEP> 180 <SEP> 170
<tb>
L'addition deu CF-1 à la fermentation précédente par les S.auréofaciens augmente la production de 7-chloro- 6-déméthyltétracycline.
<Desc/Clms Page number 21>
EXEMPLE 8. -
On prépare un filtrat neutre de S. aureofaciens W-5 de façon décrite à l'exemple 5. Des portions aliquotes de 25 cm3 du milieu de fermentation décrit à l'exemple 2 sont placées dans 6 flacons Erlenmeyer de 250 cm3. On ajoute un inhibiteur de chloruration fermentative, le 2,5-dimercapto-
EMI21.1
1,3,1-thiadiazole (DMTD), à 2 des 6 flacons dans la propor- tion de 0,1 mg de DMTD par cm3 de milieu de fermentation.
Tous les six flacons sont ensuite stérilisés et refroidis.
On prépare une fermentation par les S. aureofaciens S-1308 et on la conduit comme à l'exemple 4. mais en substituant 0,08 cm3 du filtrat neutre de S. aureofaciens W-5 au CF-1 cristallin utilisé. Les titres du mélange mentionné sont les suivants:
EMI21.2
<tb> cm3de <SEP> filtrat <SEP> titrage <SEP> fluo- <SEP> titrage <SEP> spectro-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> neutre <SEP> de <SEP> W-5 <SEP> DMTD <SEP> rométrique <SEP> de <SEP> photométrique <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> par <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> mélan <SEP> mg/cm3 <SEP> la <SEP> chlorotétra- <SEP> la <SEP> tétracycline
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ge <SEP> de <SEP> S-1308 <SEP> cycline <SEP> mcg/cm3
<tb>
EMI21.3
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ - - mc/cm3
EMI21.4
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 220 <SEP> 0
<tb>
<tb> 0,08 <SEP> 0 <SEP> 1420 <SEP> 130
<tb>
<tb> 0,08 <SEP> 0,
10 <SEP> 110 <SEP> 3410
<tb>
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 280 <SEP> 0
<tb>
<tb> 0,08 <SEP> 0 <SEP> 3300 <SEP> 295
<tb>
<tb> 0,08 <SEP> 0,10 <SEP> 160 <SEP> 3140
<tb>
Les données précédentes montrent que l'addition du CF-1 a une fermentation par les S. aureofaciens S-1308 contenant un inhibiteur de chloruration engendre la produc- tion de la tétracycline .
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.