FR2476128A1 - Procede microbiologique de production de narasine et cultures contenant le microorganisme producteur streptomyces lydicus deboer et al- - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LA PRODUCTION DE LA NARASINE PAR CULTURE DE STREPTOMYCES LYDICUS DEBOER ET AL NRRL 12034, OU UN DE SES MUTANTS OU VARIANTS PRODUCTEURS DE NARASINE, DANS UN MILIEU DE CULTURE CONTENANT DES SOURCES ASSIMILABLES DE CARBONE, D'AZOTE ET DE SELS MINERAUX DANS DES CONDITIONS DE FERMENTATION AEROBIES EN IMMERSION. L'INVENTION DECRIT EGALEMENT LE NOUVEAU MICRO-ORGANISME ET LES MILIEUX DE CULTURE LE CONTENANT.

Description

Cette invention concerne un nouveau procédé

microbiologique de préparation de l'antibiotique dit narasine.

La narasine est un antibiotique de type polyéther connu, actif contre les bactéries gram-positives les bactéries anaérobies, les champignons et utilisable comme agent anti- coccidien et comme agent permettant d'augmenter l'utilisation des aliments chez les ruminants. Sa préparation par fermentation de Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 ou Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 a préalablement été O10 décrite dans le brevet des E.U.A. N 4.038.384, voir également

Berg et al. dans Journal of Antibiotics, 31, 1-6 (1978).

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de l'antibiotique dit narasine par culture d'une nouvelle souche récemment découverte, appelée ici Streptomyces lydicus DeBoer et al., NRRL 12034, ou un de ses mutants ou variants producteurs de narasine, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle de narasine par ledit organisme dans ledit milieu de culture, et, éventuellement, isolement de ladite narasine à partir du

milieu de culture.

L'invention concerne en outre le nouveau micro-

organisme Streptomyces lzdicus DeBoer et al, NRRL 12034, et des milieux de culture contenant ce micro-organisme sous forme

biologiquement pure.

Le nouveau micro-organisme de cette invention utilisable pour la production de l'antibiotique dit narasine est une culture biologiquement pure obtenue à partir d'un échantillon de sol recueilli près du fleuve Surinam, au Surinam, et le numéro A-39861.3 a été attribué à la culture

dans un but d'identification.

La culture A-39861.3 est classée comme une souche de Streptomyces lydicus DeBoer et al., en se basant sur une culture simultanée de Streptomyces hyqroscopicus, Streptomyces endus, Streptomyces platensis et Streptomyces lydicus en utilisant les procédés et les milieux recommandés par Shirling et Gottlieb ["Methods of Characterization of Streptomyces species," Intern. Bull. of Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966)], ainsi que certains essais supplémentaires. D'après les caractéristiques obtenues, Streptomyces lydicus a été choisi comme étant l'espèce la plus apparentée. Les principales différences entre la culture A-39861.3 et la culture type de S. lyaicus se trouvent dans le diagramme d'utilisation du carbone, un niveau plus élevé de tolérance à NaCl que présente S. lydicus, et la production d'un mycélium aérien blanc par la

culture A-39861.3 sur plusieurs milieux.

Les noms des couleurs ont été attribués selon la méthode ISCC-NBS (K.L. Kelly et D.B. Judd, "The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names"

U.S. Department of Commerce Circ. 553, 1955, Washington, D.C.).

Les chiffres entre parenthèses se réfèrent à la série de couleurs de Tresner et Backus [H.D. Tresner and E.J. Backus,

"System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy, "Appl.

Microbiol. 11, 335-338 (1956)]. Les désignations tab des couleurs sont soulignées. Les indications de couleur selon Maerz et Paul (A. Maerz and M.R. Paul, "Dictionary of Color" McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N. Y., (1950) sont

indiquées entre crochets.

Les sucres des parois cellullaires ont été déterminés en utilisant une modification du mode opératoire de M.P. Lechavalier ["Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes Into Genera". Travail financé par le Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology. (Dr. Thomas G. Pridham, Convenor.) et effectué à l'Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, N.J., (1971)]. Les isomères de l'acide diaminopimélique ont été

déterminés en utilisant le procédé de Becker et al., Appl.

Microbiol. 11, 421-423 (1964). Toutes les plaques sont lues

après 13 jours à 30 C, à moins d'indication contraire.

CARACTERISATION DE LA SOUCHE PRODUCTRICE DE NARASINE

Morphologie Un examen au microscope électronique montre que les spores sont lisses. Les sporophores sont spiralés, les spirales étant ouvertes et pas très serrées. Des spirales de deux à trois tours sont courantes. On observe parfois une boucle ou un crochet. Les spores sont ovales à légèrement cylindriques et mesurent en moyenne 1,365 vm x 1,69 pm, avec

un intervalle de 1,3 pm à 1,95 pm x 1,3 um à 2,6 im.

Milieu

TABLEAU 1

Caractéristiques de culture sur divers milieux Caractéristiques Gélose de farine d'avoine et de pâte de tomate Gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt (milieu ISP N 2) Gélose de farine d'avoine (Milieu ISP N 3) Gélose d'amidon et de sels minéraux (milieu

ISP N 4)

Gélose de glycérol et d'asparagine (milieu

ISP N 5)

Gélose d'Emerson Gélose modifiée de Bennett Gélose de solution de Czapek Gélose nutritive Croissance abondante, envers du milieu jaune-brun [14F6] à noir [8C8] vers le centre de l'inoculum. Mycélium aérien abondant. Gris (GY) 3fe gris-brunâtre clair à 4ig brun-grisâtre clair. Pas

de pigment soluble. Hygroscopique.

Culture abondante, envers brun clair [13F8]. Bon mycélium aérien. Blanc

(W) b blanc; pas de pigment soluble.

Culture abondante, envers olive grisâtre clair [13H4]. Mycélium aérien

abondant (GY) 3fe gris brunâtre clair.

Pigment soluble verdâtre. Zones hygroscopiques noires près de la bordure

de l'inoculum.

Culture abondante, envers dans la

culture plus jeune de brun à brun-

jaune (7 jours) devenant gris foncé [8A91 à noir [8A8] en 14 jours. Bon

mycélium aérien (GY) d gris clair.

Hygroscopique. Croissance abondante, envers brun jaune moyen [14J7]. Bon mycélium aérien et spores (W) b blanc. Pigment soluble

brun léger.

Croissance abondante, envers brun-

jaune fort [1318]. Mycélium aérien abondant et spores (W) b blanc. Pas

de pigment soluble.

Bonne croissance, envers orange-

brunatre [12B9]; mycélium aérien rare ou absent; quand il est présent (GY) 2dc gris-jaunâtre. Pas de pigment soluble. Croissance très médiocre, pas de mycélium aérien ni de spores. Pas

d'attribution de couleur.

Bonne croissance, envers jaune pâle [11C2]. Ni mycélium aérien ni spores;

pas de pigment soluble.

Gélose de malate de

calcium -

Gélose de glycérol et de glycine Gélose d'extrait de levure et de tryptone Gélose de tyrosine Gélose de glucose et d'asparagine Bonne croissance; envers olive grisâtre clair [14B2]; pas de mycélium aérien ni de spores. Pigment soluble brun léger. Bonne croissance, envers olive [15L6i. Bon mycélium aérien et (GY) 2dc gris-jaunâtre. Pas de soluble. moyen spores pigment Croissance médiocre, ni mycélium aérien ni spores. Pas d'attribution de couleur. Bonne croissance, envers brun-jaunâtre clair [13H7]. Bon mycélium aérien et spores (Y) 2db à 2fb jaune pâle. Pigment

soluble brun léger.

Bonne croissance, envers brun jaunâtre clair [13H7]. Bon mycélium aérien et spores (GY) 2dc jaune-grisâtre. Pas

de pigment soluble.

On étudie des propriétés physiologiques sélectionnées de l'organisme selon des modes opératoires classiques. Les propriétés observées et les caractéristiques trouvées sont données dans le Tableau II:

TABLEAU II

PROPRIETES PHYSIOLOGIQUES DE A-39861.3

Production de pigments de type mélanoide sur: 1. Cultures inclinées de fer-extrait de levure-peptone 2. Cultures inclinées sur gélose de tyrosine 3. Bouillon d'extrait de levure et de tryptone Réduction des nitrates Liquéfaction de la gélatine Morceaux de pomme de terre Pas de pigment de type mélanoide Pas de pigment de type mélanoide Pas de pigment de type mélanoide Positive La gélatine est liquéfiée à 60 % en 14 jours Bonne croissance végétative jaune-brun; pas de mycélium aérien; la couleur du morceau de pomme de terre n'est pas changée. Pas de croissance Amidon hydrolysé Lait peptonisé N. Co Morceaux de carotte Hydrolyse de l'amidon Lait écrémé TABLEAU II (suite) Exigences en température On utilise des cultures inclinées sur gélose de milieu ISP N 2, et gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt On fait incuber les cultures inclinées à 20 , 25 , 30 , 37 , 43 et 49 C

Pas de croissance à 20 ou 49 C.

Croissance optimale 25 - 37 C

Une certaine croissance à 43 C.

Tolérance à NaCl On utilise de la gélose de milieu ISP N 2, de la

gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt.

On ajoute NaCI à des taux de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 8 %, 10 % et 12 %. Une gélose de milieu ISP N 2

sans NaCl ajouté sert de témoin.

Le micro-organisme tolère des

niveaux de 1 % à 3 %. A des taux.

supérieurs à 3 %, on-n'observe

pas de croissance.

Réaction à des changements du pH On utilise une gélose de milieu ISP N 2 et une

gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt.

On ajuste le pH de la gélose à des taux de 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 10,0 et 11, 5 après passage à l'autoclave pour la stérilisation. Croissance et sporulation abondantes de pH 5,0 à pH 8,0. A pH 10,0, la

culture se fait sous forme de colo-

nies isolées avec un mycélium aérierN

rare. A pH 11,5, pas de croissance -

Co co

24 76128

On détermine l'utilisation du carbone en utilisant le milieu de base de Pridham et Gottlieb auquel on ajoute les sources de carbone jusqu'à une concentration finale de

1,0 %, selon la description de Shirlinq and Gottlieb, supra.

Les sources de carbone sont stérilisées avant d'être ajoutées au milieu de base. On lit les plaques après cinq, neuf et seize jours d'incubation à 300C, les lectures finales étant

seules indiquées.

Les résultats des essais d'utilisation du carbone effectués avec la culture A-39861.3 sont indiqués dans le

Tableau III.

TABLEAU III

UTILISATION DU CARBONE

Substrat: Sources de carbone Réaction de A-39861.3 ajoutées au milieu de base de au bout de 16 jours Pridham et Gottlieb D-Glucose:: ++ DXylose:::: + L-Arabinose:: ++ L-Rhamnose:: ++ D-Fructose:: ++ D-Galactose ++ Raffinose:: D-Mannitol:: i-Inositol + Salicine + Saccharose:: + Cellobiose ++ D-Maltose ++ Mélibiose Mélézitose + Amidon soluble ++ Tréhalose ++ Turanose + :: Sources de carbone du International Streptomyces Project (Shirling et Gottlieb, supra.) Résultats: ++ = utilisation positive forte + = utilisation positive + = utilisation douteuse - = utilisation négative Etudes des parois cellulaires En utilisant des parois entières hydrolysées de l'organisme, on détermine la présence de certains sucres importants pour des raisons de diagnostic. On utilise les parois cellulaires isolées pour déterminer les isomères de l'acide diaminopimélique. Les résultats de ces études sur

parois cellulaires sont indiqués ci-dessous.

Essai Isomères de l'acide diaminopim6lique Sucres de diagnostic détectés RCsultat observé isomère LL glucose, ribose Une comparaison du diagramme d'utilisation du carbone de la souche A-39861.3 et de Streptomyces lydicus

est donnée dans le Tableau IV suivant.

TABLEAU IV

Schéma d'utilisation du carbone. par A-39861.3 et Streptomyces lydicus Source de carbone A-39861.3 S. lydicus D-Glucose ++ ++ L-Arabinose ++ ++ D-Xylose ++ + i-Inositol ++ ++ D-Mannitol - ++ L-Rhamnose ++ o Raffinose ++ D-Mannitol - ++ Salicine + + oe "C TABLEAU IV (suite) Source de carbone A-39861.3 S. lydicus Saccharose + ++ Cellobiose ++ + D-Maltose ++ ++ Mélézitose + ++ Amidon soluble ++ ++ Trehalose ++ ++ ++ = utilisation positive forte + = utilisation positive + = utilisation douteuse - = utilisation négative o Les similitudes et les différences entre A-39861.3 et Streptomyces lydicus sont données dans le Tableau V.

TABLEAU V

SIMILITUDES ET DIFFERENCES ENTRE

A-39861.3 et S. lydicus Essai, caractéristique, etc. Morphologie des sporophores Ornementation des spores Pigment de type mélanoide ::Mlycélium aérien Liquéfaction de la gélatine ::Lait écrémé ::Réduction des nitrates ::Tolérance à NaCl Isomère de l'acide diaminopimélique ::Dénote des différences

A-39861.3

Spiralés lisse négatif

principalement gris-

blanc sur certains milieux + peptonisé + 3 % isomère LL S. lydicus Spiralés lisse négatif gris + hydrolysé 8 % isomère LL F1- J r4 % on Les propriétés morphologiques et physiologiques de

ces deux souches sont en bon accord, sauf pour les différen-

ces de réduction des nitrates indiquées dans le Tableau V. Les autres espèces apparentées diffèrent de la culture A-39861.3 comme suit 1. Streptomyces hygroscopicus et Streptomyces endus produisent des spores grumeleuses alors que l'ornementation des spores de la culture

A-39861.3 est lisse.

2. Streptomyces platensis diffère de A-39861.3 par la production d'un mycélium végétatif brun orange à brun rouge sur certains milieux. En outre, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces endus et Streptomyces platensis sont extrêmement hygroscopiques alors que le caractère hygroscopique de Streptomyces lydicus n'est pas

aussi prononcé.

L'organisme Streptomyces lydicus DeBoer et al., producteur de narasine a été déposé et fait partie de la collection de culture de Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 o il est disponible au public sous

le numéro NRRL 12034. (Dépôt du 17 Septembre 1979.).

Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les caractéristiques de la culture productrice de narasine de Streptomyces lydicus DeBoer et al NRRL 12034, sont sujettes à variation. Par exemple, des mutants (spontanés ou induits), des transconjuguants et des recombinants (comprenant de l'ADN recombinant sur des plasmides) de la souche NRRL 12034, ou dérivés de cette souche, qui produisent l'antibiotique

narasine, peuvent être utilisés dans cette invention.

Un certain nombre de milieux différents peuvent être utilisés pour produire la narasine avec Streptomyces lydicus DeBoer et al NRRL 12034. Ces milieux doivent contenir des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux. Les sources de carbone appropriées comprennent le glucose, l'amidon et la dextrine. Des sources d'azote appropriées comprennent la peptone, la caséine hydrolysée par une enzyme, la farine de graine de coton et la peptone de viande. Les oligo-éléments nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme peuvent se trouver comme impuretés dans d'autres constituants des milieux, en quantités suffisantes pour satisfaire les besoins de croissance et les besoins biosynthétiques de l'organisme. Cependant, il peut être intéressant d'incorporer dans le milieu de culture d'autres sels minéraux nutritifs solubles pouvant fournir les ions sodium, potassium, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, phosphate, sulfate, nitrate, etc. Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (c'est-à-dire 0,2 ml/litre) d'un agent antimoussant comme du propylèneglycol dans les milieux de fermentation à

grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes.

Pour la production de quantités substantielles de narasine en utilisant NRRL 12034, on utilise la fermentation aérobie en immersion dans des réservoirs. On peut cependant obtenir de petites quantités de narasine par culture sur flacon agité. Pour la fermentation en réservoir, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume de milieu de-culture par la forme spore, des fragments mycéliens ou une pastille lyophilisée de l'organisme pour obtenir une culture fraîche en croissance active de l'organisme. On transfère ensuite l'inoculum végétatif dans un réservoir plus grand o après un temps d'incubation approprié la narasine antibiotique

est obtenue avec un rendement optimal.

Le pH du milieu de fermentation non inoculé varie avec le milieu utilisé pour la production, mais le pH de tous les milieux de fermentation est compris entre environ 6,5

et environ 7,5.

L'organisme producteur de narasine peut être cultivé sur un large intervalle de température d'environ 25 à environ 370C. Il semble que la production optimale de narasine avec

NRRL 12034 se produise à une température d'environ 300C.

Comme il est courant dans les procédés de culture en immersion aérobie, de l'air stérile est dispersé dans le milieu de culture. Pour une croissance efficace de l'organisme, le volume d'air utilisé dans la production en réservoir est compris entre environ 0,25 et environ 1,0 volume d'air par volume de milieu de culture par minute (v/v/mn>.-Un débit optimal dans un récipient de 10 litres est d'environ 0,5 v/v/mn, l'agitation étant fournie par des appareils d'agitation classiques tournant à environ 600 tours

par minute.

La production de la narasine peut être contrôlée pendant la fermentation soit par diffusion sur gélose soit par des procédés turbidimétriques. Les organismes d'essai que l'on peut utiliser comprennent Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis et Micrococcus luteus.

Une activité antibiotique est généralement présente après environ 40 heures et reste présente pendant au moins deux jours ou plus pendant la période de fermentation. La production antibiotique maximale se produit à un temps de

fermentation d'environ deux à environ quatre jours.

La narasine peut être recueillie du milieu de fermentation par des procédés connus dans le domaine et

décrits dans le brevet des E.U.A. No 4.038.384.

Le nouvel organisme producteur de narasine Streptomyces lydicus DeBoer et al NRRL 12034, produit de bonnes quantités du facteur A de la narasine ainsi que de faibles quantités du facteur D de la narasine. Les composés peuvent être obtenus, si on le désire, comme antibiotiques séparés par purification plus poussée du complexe, par

exemple par des techniques de chromatographie sur colonne.

Elles sont décrites dans le brevet des E.U.A. N0 4.038.384

dont la description est incorporée ici par voie de référence

et fait partie de la présente demande de brevet.

Pour illustrer plus complètement le fonctionnement de l'invention, en utilisant divers milieux de fermentation, on donne les exemples suivants. Cependant, le domaine de

l'invention n'est pas limité par les exemples.

EXEMPLE I

On prépare un milieu que l'on utilise pour la culture sur gélose inclinée de Streptomyces lydicus DeBoer et al NRRL 12034 Ingredient Quantité (g/l) Dextrine de pomme de terre 10,0 Caséine hydrolysée par une enzyme1 2,0 Extrait de boeuf 1,0 Extrait de levure 1,0 Gélose 2,0 Solution minérale de Czapek 2,0 ml/l Eau désionisée q.s.p. 1 litre N-Z-Amine A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tennessee,

U.S.A.)

On prépare la solution minérale de Czapek à partir des ingrédients suivants: Ingrédient Quantité (g/100 ml) KCl 10,0 MgSO4.7H20 10,0 FeSO4. 7H2O 0,2 tau désionisée q.s.p. 100 ml On inocule des spores de Streptomyces lydicus DeBoer et al NRRL 12034 sur une gélose inclinée nutritive préparée à partir des ingrédients précédents et l'on fait incuber la culture ainsi inoculée pendant environ sept jours à une température d'environ 30 C. Puis on recouvre la culture mûre d'eau et on la gratte avec un instrument stérile pour libérer les spores et le mycélium. On utilise l ml de la suspension de spore résultante pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité (g/l) Dextrose 15,0 Farine de soja 15,0 Liqueur de macération de mais 5,0 CaCO3 2,0 NaCl 5,0 Solution minérale de Czapek 2,0 ml/1 Eau désionisée q.s.p. 1,0 1 On fait incuber l'inoculum végétatif dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à large embouchure à environ 30 C pendant environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute. On utilise ce milieu incubé pour inoculer de petits appareils de fermentation (l'inoculum représentant environ 1 % du volume du milieu) ou pour inoculer des flacons de second stade pour la production d'un plus grand volume de mycélium. On place des parties aliquotes de 200 ml du milieu de production dans des flacons Erlenmeyer de 1,0 litre et on les stérilise à 121 C pendant environ 30 minutes. Apres refroidissement, on inocule les flacons avec un inoculum à 5 % de l'inoculum végétatif. On fait incuber la culture sur un agitateur alternatif à 108 coups par minute avec une course de 5 cm. Le pH du milieu de fermentation au bout de 72 heures

est environ 8,0. On effectue la fermentation à 30 C.

EXEMPLE 2

On produit de la narasine en utilisant un milieu de production stérile ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité (g/l) Agent antimoussant siliconél 0,2 Glucose 10,0 Mélasse 20,0 Peptone 5,0 CaCO3 2, 0 Eau désionisée q.s.p. 9,0 litre 1Dow-Corning Antifoam A On inocule ce milieu de production ayant un pH de 6,7 avec 2,0 % d'inoculum provenant du milieu de second stade obtenu comme décrit dans l'Exemple 1. On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 10 litres pendant environ trois jours à une température d'environ 30 C. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à un taux de 0,5 v/v/mn et on l'agite avec des

agitateurs classiques à environ 400 tours par minute.

EXEMPLE 3

On produit de la narasine selon le mode opératoire de l'Exemple 2 mais en utilisant un milieu de production stérile ayant la composition suivante: Ingrédient Agent antimoussant siliconé1 Glucose Amidon de mais Peptone de viande liquide Caséine hydrolysée par une enzyme2 Mélasse noire MgSO47H20 CaCO3 Solution minérale de Czapek Eau désionisée 1Dow-Corning Antifoam A 2N-Z-Amine A (Humko Sheffield Chemical Tennessee, U.S.A.) Quantité (</l) 0,2 ,0 ,0 ,0 4,0 ,0 0,5 2,0 2,0 ml q.s.p. 9 litres Co., Memphis, On inocule ce milieu de production ayant un pH de 6,5 avec 2,0 % d'inoculum et on laisse fermenter dans un réservoir de fermentation de 10 litres pendant environ 4 jours à une température d'environ 30 C. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à raison de 0,5 v/v/mn et on l'agite avec un agitateur classique à environ 600 tours

par minute.

EXEMPLE 4

On produit de la narasine selon le mode opératoire de l'Exemple 2 mais en utilisant un milieu de production stérile ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité (q/l) Agent antimoussant siliconé1 0,2 Dextrine de tapioca 30,0 Caséine hydrolysée par une enzyme2 10,0 Solution minérale de Czapek 2,0 ml Eau désionisée q.s.p. 9 litres 1Dow-Corning Antifoam A 2N-ZAmine A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tennessee, U.S.A.) On ajuste le pH du milieu de production, qui est initialement de 6,4, à 7,1 avec environ 3 ml d'hydroxyde de potassium aqueux 10 N avant stérilisation, puis on l'inocule avec 2 % d'inoculum. On laisse le milieu fermenter dans un réservoir de fermentation de 10 l pendant environ 3 jours à une température d'environ 30 C. On-aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à un taux de 0,5 v/v/mn et on l'agite avec un agitateur classique à environ 600 tours

par minute.

EXEMPLE 5

Isolement et purification On filtre dix litres de bouillon de fermentation en utilisant un adjuvant de filtration (adjuvant de filtration Hyflo Supercel, terre de diatomées produite par Johns-Manville Corp.) et on lave le gâteau de filtration avec de l'eau. On combine le filtrat de bouillon avec l'eau de lavage et on extrait deux fois avec'des portions de 4,5 litres d'acétate d'éthyle. On réunit les extraits d'acétate d'éthyle et on les concentre sous vide pour obtenir un résidu huileux. On dissout

le résidu dans 100 ml d'acétone et on ajoute 100 ml d'eau.

On ajuste le pH de la solution à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique aqueux 1 N et on agite la solution pendant environ une heure à la température ambiante. On filtre les

cristaux qui se forment et on les lave avec de l'eau froide.

On recristallise les cristaux en les dissolvant dans 50 ml d'acétone, en ajoutant 50 ml d'eau et en laissant le mélange reposer pendant une nuit à la température ambiante. On filtre les cristaux qui se forment, on les lave avec de l'eau froide et on les sèche sous vide et l'on obtient 100 mg de cristaux blancs. On montre que les cristaux sont identiques à la narasine par RMN, IR, UV et spectre de masse et par

chromatographie sur couche mince combinée à un bioautographe.

2 1

Claims (5)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production de la narasine antibiotique, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Streptomyces lydicus DeBoer et al NRRL 12034 ou un de ses mutants ou variants producteurs de narasine, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobies en immersion jusqu'à production d'un quantité substantielle d'activité antibiotique par ledit organisme dans

ledit milieu de culture.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'organisme est Streptomyces lydicus DeBoer et al

NRRL 12034.

3. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications

I et 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire

de séparation de la narasine du milieu de culture.

4. Narasine quand elle est préparée par un procédé

selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3.

5. Milieu de culture contenant Streptomyces lydicus DeBoer et al NRRL 12034, sous forme biologiquement pure et des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux.