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r.roo4d' 4'oM<MtioM t "14.. awoxyrtboMtcKj.o tMtut<M)M&t po3.?myiwe, es ïMyttoultey à pal'1;1J" dao laitance. et procéa4 de consmet4on de oae c1ern1J)r..
La présente invention a pour objet un procède d'obier
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tien de l'acide désoxyribonuoléique CI. D 1), en particulier à partir de laitances* Le procédé selon l'invention se caractérise e @M2,CT lement en ce que les laitances, préalablement mines suspension dans une solution de chlorure de sodium sitrsté de concentration environ molaire, sont soumises, en pressée
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d'acide cholique, à l'action enzymatique de la papa3:
ne la solution résultant de ce traitement étant ensuite - après filtrage sur une terre de diatomées du type de celle comme
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commercialement nous le nom de ''Cëlite" ¯ additionnée 4" nol afin de précipiter les fibres d'ADN qui, après avoir été
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progressivement et partiellement déshydratées par traitâssat par l'alcool et l'eau distillée, sont finalement d'ch114Q et desséchées.
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Un autre objet de invention est un procédé de OOM.l'- ; vation des laitances en vue de leur utilisation ultérieur* aux fins d'extraction de l'ADN; ce procédé se caractérisant essentiellement en ce que les laitances fraîches sont soumi-
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ogo k TNB '0 wn1blGm.nt équivalent k celui qui . -: 4f- ' ¯ 2l''ï',> &JrlQi! du procédé d'extraction de VÀBB "'1é''t! - - -, 31'. t#W(?G#I" à savoir une mine en suapenalon fias dans solution de chlorure de sodium citrate, saturée en Cilla.
1- ##ir. :; caractéristiques des procédés selon l'inven. tion ressortiront de la description détaillée de ceux-ci qui va être donnée ci-après.
Les disoyrïbom alioprotéines sont, comme on le saie, les éléments constitutifs des laitances dont est extrait, par d1180t1on, l'acide dénox7ribonueldique,, 1-ïï \4'tarées sont grossièrement pulvérisées et sont aises en suspeasion fine dans une quantité convena*blo de Olta à concentraica' sensiblement déclmolaire, additionné de citrate de 80dium A une concentration environ trois fois plue faible 1G l#'w -" A .1 obtenue est ajusté de telle sorte vl!4 sa ^. y,., 5 .,xç,lx finals ea ADN soit comprise entre 0,2 r 9 ag/J1 - c-""¯0)tBo P% '9N& solide est ensuite a jouté en tiRit1t G'1.tk,';fr;;{:m\Î;G pour obtenir une concentration sensible. sont !iô!!@)1f';;
1I""1 r./ 1 aï ti >ffl est alors convenablement agitée afin de t6@udr et dOhQmogn'18er le Cj0!a< La solution obtenue, après avoir été ajustée à un pH c@ 18 cs# 7oû ont additionnée d'acide cholique s q\U1Jrl;t..II,,I.; ''2 ''"1' il et à8ime quantité de papaïne comprise ë's'E'6' 4 " '5 de 2 quantité de laitance traitée. Cette gapaîae Gn w4G m deug apports successifs espacée d'en.
'i7m @ 1o""'Jr"':),, ± ;,,6;}.nl1{'p Gnt agit' pendant appraumativement 4 1"R'n ";," f1C::-"77\ r6; 2;y'1J.\ ;Îl. utC!i1U" m@M1qu..
@seien de la papaïne peut âtre variable et dépend de la nature de la protéine liée à l'ADN et formant avec ce dernier la déeoxyribonueléo-prmîne.
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L'action enzymatique de la papaïne est stoppée lorsque la nucléoprotéine est complètement dissociée, ce qui est facilement reconnaissable & l'observation* On notera que 7 e api1t' d'astiea do le $t0 sst f:..vl:5 y 'll.u3¯.2' '3U W .=.tJ..inlt,ç., peut être dia1ya contre au . îiaia.a 1 $ µ±"±$ 10 ê au-ù¯o¯ enzymatique. lorsque cette aet4@is oùt t.tr,.", ;.;J@11@w Obst filtrée lentement à la dnamb1!:'@ izol-Ae - :"'Q#a3@ mur M GJ:.-:S0ôlk. de terre de diatomées du tygu v:0ti604 c¯.o--s4 Bte2i6s'fe les protéines de pdda moldaul:,.a-c a6±.1$ Le filtrat visqueux obtenu, qui s'est conIJ1d$1i:'#.1±>lG.l:.,Ufi éclairci et n'est plus que légèrement (J3'tüe@;nt est %mo solution d'ADN contenant ensssr dag is;,..tüa Si ce filtrat est très t;rlJ:t,blc .nè,- j@Jux:..e tjiLt.s,\';6:!;? peut tiré effectuée, i&m 2.c-L ;1Jtk': 5 ¯ ¯., ¯ ;:"#'" '"'C'- - -' neuve.
LU$ 'Uir'" tent R1 ëCMtr':,y y" , ",. i ..W Jo...... M 15;'dj.e Ük.C.rV de ods et les liquides de lavage sont joint au filtrat* De ce filtrat, les fibres d'Am! ment précipitée par action de I#éthanol, Cette préoip1tat1 est réalisme dans la chambre froide à une température @.!J@ftY1ron 2*0, seorço ! feotue de /la manière suivante t un volume aetbanol doul au i volume de filtrat à traiter est ajouté à ce dernier* Le:* fibres d'ADN et forment alors lentement à l'interface. La solution est agitée lentement, d'un mouvement 4Imple et régulier, jusque ce que les deux phases se soient mélangées et que les fibres d'ADN aient envahi tout le bac de prêt,.
Le mélange est transvasé plusieurs fois d'un bao t.., j 211 autre* lien fibres d'ADN se rassemblent alors à la surface Ces fibres, prélevées sur m '.... -,.' ,:tJ.1> ocat tratdrb dans un bac contenant 2 volumes da. ¯ ,p:"'1Í! -').:lR' 1 YOl.WI1@ ;
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d'eau distillée et l'ensemble est agité pendant environ 15 minutes d'un mouvementample et régulier.
Les fibres, à nouveau prélevées, sont transférées dans un bac contenant 3 volumes d'alcool pour 1 volume d'eau distil- lés et agitées à nouveau pendant environ 15 minutée.
Le même traitement est repris en employant une solution à 4 volumes d'alcool et 1 volume d'eau, et est enfin réitéré à deux reprises avec de l'alcool pur.
Les fibres ainsi partiellement déshydratées sont ..eG- rées convenablement sur un agitateur*
Le manchon d'ADN est déchiqueté et dissocié en libres fines et est enfin abandonné quelques heures dans un lieu sec à température ordinaire.
L'ADN en libres est redissous dans une solution de
CENa de concentration sensiblement centimolaire, par addition lente de cette solution aux fibres. Apres agitation lente, la concentration finale de la solution obtenu* doit être environ '' de 1 mg/ml
Sur cette solution, un dosage de protéines *et alors effectué. Si le taux de protéine est trop élevé @ la solution est à nouveau traitée pendant 12 heures à une tempé- rature de 37 c par la papains (en concentration variable selon le taux de protéines de 1'ADN
La solution est filtrée à la chambre froide et les fibres sont précipitées nalon la méthode indiquée plus haut.
Sur l'ADN ainsi obtenu, les dosages suivante sont effectuée :
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Suivant une variante du procède la) l'invention,
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la tr,rp81M est utilité ,au 11811 de la pap4,é comme agent d<f dgxtt.nisaxrt..
Dans ce cas l'a1J';aque eJ1ÇJ1a't1que 8' . une température de z", 1< un pH compris entre 1 {f 8 at 8 et en présence de fluorure de sodium comme antiseptique.
Le procédé qui vient d"'tre décrit patte sa sortir du cadre de la présente invention, ''t}::- tnix en oeuvre pour l"obteRiieN da 1'JM à partir du ,thymus de nau.
Dans ce cas toutefois, les temps d'action enzymati que sont plus longs en raison de la nature plus complexe des protéines, qui sont liées à l'ADN.
Par ailleurs, la solution qui cet obtenue après cette action enzymatique contient, outre l'ADN, de l'acide ribonucléique (ARN) qui n'existe qu'à faible concentration dans les laitances-
Il est donc nécessaire, après que la filtration
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sur .0.l1t.- ait été effectuée, d'éliminer l'ARN pas' pa# sur une colonne de charbon, ce dernier adsorbant 1'ARN et non l'ADN.
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L'ARN peut, le cals échéant, tire élue de la. sclea- ne de charbon par une solution d'alcool ammoniacal.
La solution d'ADN est ensuite traitée conformément au procédé appliqué aux laitances de poissons*
Un autre objet de la présente invention ont un procédé de conservation des laitances en vue de leur utilisa tion ultérieure aux fins d'extractions de l'ADN lorsque la durée de conservation recherchée n'est que de quelques jours, les laitances, dont le prélèvement est effectué sur le champ au moment de la pèche, sont
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placées 1mmé41aent dans des récipients du type DiW4ft,
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@'-'F;lteRI.1)5} . 1(. .!,-;; <1ôtl'l?oolao..
#ùi que possible, les laitances ainsi conservées z incisa '"# fi #"# r-ii-ays son$ broyée@ grossièrement ,dans de la @@0rr' maintenues à des températures Intérieures à ..2G C. 1.:'\ Q 'lnt de traiter les laitances pour en extraire 1'" il suffît J!I/j 1,,tu décongeler et d'en effectuer la mine en
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suspension dans une solution de chlorure de sodium citrate, ainsi que cela a été décrit ci-dessus. lorsqu'une conservation de plus longue durée, pouvant aller jusqu'à une année, est recherchée, les laitances
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.0-:1t bro1Ù finement dans une quantité convenable d'une solution eç3 .ioese de sodium à concentration sensiblement décimola.r et de citrate de sodium à une concentration
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environ trois fois plus faible.
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r -^ ";:
T asti9Ba en ADN des laitances étant varia- bleu ("- ,'- "" "3fs& poissons , et, pour une même espèce, CcJ10D 1"" ?':.o -'qC" le si a'!.1enBions. obtenues ainsi qu'il vient (JGiV8 ##"'-- (!1;ont 1!."t'érablement ajustées à un volume adéquat de façra 4 bzz que la solution ait une concentration en ADN
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comprise entre 0,2 et 3 mg/ml, environ.
Ces suspensions sont alors amenées à saturation en
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C., il )1 ry f>l:f,lJ1,1) ,.., #Tir G11de. et sont convenanblement agitées, par des -#vo-'o 8t de façon à dissoudre le Ctifa..
0 71- î,w*4n8 atténuas, très visqueuses, se conservent ou ch 4pj fs=9S.oi# à don températures variant de 0* à 3009 fsaia * \5\'Í\' :îlc'-V;-) "{\." '1)A't atteindre une année* 7un ,-,/\00 '-'\1 -,tout 1 Q atre ddcrite, non seulement yoîTEai 'qi'fcainx5? w* oet.on parfaitement satisfaisante des laitances, sans que l'ADN s'en trouve dépqlymér1stS. mâle
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encore réalise une déprotéinisation partielle des
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désoxyribonucléoproté1ne. (DNP).
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On voit en effet que cette méthode de conservation constitue en quelque aorte la première phone du procédé d'extraction ci-dessus décrit*
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Pour pCld1"fJUin'CI la .w7f?,! W!!1J (\\IlA'l'&1:'i:-J '.!... 19c\J!0tÓ 1.%-(Jti:F..C..i tion à partir douna Molt1@ ê&ùwo wv0 la Lisâo décrite, il suffit par oxs,,t' éo 1>(,,j@S' ladi te 'olti05o saturée de CINes à une conc*net1ol1! Llit, Ceci s'opère en d1al1#ant la @ cemc@mtï'o contre un volume de Odla ceK.tîfoa3.eSÒ- las procédés de conaervut1on formant un du. objets de la présente invention sont évidemment applicable à d'autre. matières premières que les 11@ t0 m c±"M oulier, aux thyms de veau.