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BREVET D'INVENTION. procédé pour l'obtention d'ampicilline pure sous forme d'ampicilline trihydrato.
La présente invention se réfère il la préparation d'un composa semi-aynthétique ayant une notable activité enti biotique et dont l'emploi s'est révélé très utile dans la pratique clinique et vétérinaire pour le traitement d'infections causées par des germes gram-positifs et gram-négatifs. Co composé s'est également révélé utile comme supplément alimentaire dans la zootechnie. Sa formule est la suivante:
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Ce composa est connu 130US diverses dénomina t1onB, telles que 1 Amp101111ne, Aoide 6.(D(-)-alpha.am1noPhényl.aoétarn1da)pénioillanique, D-(-) alpha-aininobenzyle-p4niailline, Acide D-(-)-alpha-aminobenzyle pénioillanique..
La littérature technique et de brevets oite et décrit de nombreuses synthèses de ce composé qui sont toutes basées sur la réaction fondamentale de l'acylation du groupe amino de l'acide 6-aminopdnioillanique au moyen d'un ddrivb acylant de
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l' mo1de. D- (..) ..,alpha-a.m1noPh rlylao t1que. La rdaQt10n d'aoy- lation est généralement provoquée dans un solvant ayant un degré d'hydratation variant dans de larges limites.
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La aa1-aotéris%ique ,ooRimune à ces différentes synthèses est la grande difficulté rencontrée pour séparer l'antibio- tique des mélanges de réaction et pour le purifier.
Les mélanges de réaction contiennent en effet, avec la péicil lino désirée, des quantités variables, toujours Importantes,
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de produits polymoï'iBoSt de produits do décomposition et n'ayant pas Qomp14boment réagi, dont certains possèdent dea caractéristiques brbo aimilairaa a celles do .'Amp,o,,4ne et sont, par conséquent, difficilement l'3Pa'rableB de cette dernière.
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D'autre part, l'Amp101111ne obtenue par la synthèse ci- tée est séparée du mélange de réaction dans sa forme monohy drate qui est soluble dans l'eau dans la proportion de 20..25
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1n!:
'/mJ." à 20...?oC" et son point isoéleotrique a un psi de 4p850 Cette solubilité est relativement élevée par rapport. celle de .' ampioillino bi,-hyd1-ato, et l'est encore plus par raP port à ltamploilline trihydrate, laquelle est à peine de 6 mg/
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ml clans les mÙ?ies conditions de température et de pH. A noter ia,c4nt que 1,rA Btabilit chimique et l'activité miQ1:'ob:l.oJ.o.. gique aont notablement supérieures dans la forme tri-hydrate
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do l'aio111ine. Dans ces synthèses, les caractéristiques décrites plus haut donnent des rendements notablement infé- rieurs en antibiotique pur à ceux que l'on devrait prévoir des dosages analytiques des mélanges de réaction initiaux.
Conformément à la présente invention, on a mis au point un
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prooédé qui élimine tous les inconvénients des extraotionx, qui permet d'arriver directement à la séparation d'ampicilline noue la forme tri-hydrate et permet donc d'obtenir des rendements très élevés en antibiotique pur par rapport aux examens
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analytiques et microbiologiques de départe
Ce procédé a l'avantage d'être simple et pratique oar il peut être employé comme moyen d'extraction et de purification dans les synthèses ainsi que comme moyen efficace de purifi-
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cation de l'amp1oil1ine brute obtenues Le procédé selon l'invention part du oongept que l'amp1o1111ne extraire ou , purifier o1 complètement dissout?, à un pH suffisamment aoide pour pouvoir garantir la aalifioa- tion complète du groupe amino,
dans un mélange forme en majeu re partie d'un solvant de haute conductibilité spécifique,
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complètement misaible l'eau, et ayant un degré d'hydratation compris dans de larges limites mais ne dépassant pas 20% en volume total, Ce mélange, Convenablement filtré de façon à
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8tre parfaitement limpide, est aloalinimé 4 un pH variant entre 4,0 et 7.0 au moyen d'une base organique ou inorganique de oonoentration adéquate..
Le précipité volumineux qui se forme, visiblement impre gné de solvant, est filtrée lavé d'abord avec le mélange sol vant jusqu'à élimination des impuretés organiques, puis il est lavé avec de l'cau jusqu'à disparition des cèle inorganiques,
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enfin il est séché à l'air à 40-50"C.ron obtient de cette façon un produit très blanc qui correspond h l'ampicilline tri-hydrate chimiquement pure, très stable dans le tempe et ayant une grande activité miorobiologique.
Les rendements, exprimes en ampioilline acide anhydre, varient entre 80 et 90%, oaloulés sur les dosages analytiques
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du mélange acide avant lialcalinisation,
Il est intéressant de noter que le préoipité qui se forme dans le solvant retient dans ses propres cristaux une quan" tité du solvant organique qui oonstitue le mélange de réac tion, atteignant jusqu'à 12 fois le poids de la substanoe
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sèche } et qu'en poursuivant la dessioation du produit, l'on obtient un antibiotique ayant une aotivité non supérieure à 7o% en tant qu'acide anhydre, mais tr&s .instable a la tempe" rature ambiante.
Ce produit, dont l'analyse correspond grue.
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oibrement à un mélange de monohydrates et de bi-hydrates de 1'ampioilline, présente, dans les conditions spécifiques de la présente invention, les caractéristiques suivantes @ d'absorber l'eau jusqu'à la formation du composa tri-hydrate
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et d'atteindre ses oaraobéristiques particulières de etabiliw té et de puissance chimiques et miorobîologiquene si l'on essaie en effet; la stabilité de l'Ampicilline tr1-hYdro.tct1 la comparant a plusieurs échantillons du pré- cipité en question, opportunément séché sous vide poussé à des températures non supérieures à la température ambiante;
l'on notera que le produit tri-hydrate obtenu aveo le procéd dé selon l'invention ne subit aucune variation du titre chi
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mique et de puissance microblologique même s'il est oonser- vé à 40 c pendant plus de 15 jours à la lumière.
Le précipité sec subit, par oontre, des modifioations
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visibles dans ses caractéristiques morphologiques (jaunisse- ment, concentration et émanation d'odeur sulfureuse) et une
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dégradation du tttre ohimique et mierobiologique d'environ 13% par ,jour à 37 c à l'obscurité. Toujours 4 l'obscurité, mais à la température ambiante, la dégradation atteint environ 5% La lumière, à elle seule, dégrade également de 5% le précipite seo, lequel à 0*0 et à l'obscurité perd environ 1% par jour,
L'action combinée de la température do 40 c et de la lumière provoque une dégradation irréversible qui peut attein-
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dre 25% par jour de l'activité chimico-miorobiologique de dé- part.
D'autre part, l'examen ohromatographique sur oouohe mince avec plaque au gel de silice, effectué comme décrit dans l'exemple 1, ci-après démontre le caractère irréversible des mo- difications provoquées par la lumière et la chaleur dans la structure ohimique la plus intime du précipité mme s'il est séché avec toutes les précautions désirées.
L'on constate la formation de taches ayant un Rf inférieur
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à celui de 1'ampioilline pure, directement oomparablos 1 la 1. tache produite par un échantillon de D-(-)-alpha-aminoph6nyitl- .acétique, et à une série de taohes à Rf plus élevé, directement comparables à celles que l'on obtient en déposant dos é-
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ohantillons d'acide pénieilloïque obtenus de faor"" , ..- .....",-, La présente invention est décrîeu,ee 1-1u fa90n non limitative, dans les exemples suivants EXEMPLE 1.
Ajouter, à un mélange de réaction provenant de l'acylation
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de l'acièe 6-amin&p4nioillaniquc avoo un dérivé ,ayxarat N-protp; de l'acide D.(.)-alphn.am1noph6nylaoétiqUe, de 3.'ao<one
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jusqu'à atteindre 80% du volume initial ou, en tout état de cause, de façon que le degré final d'hydratation desoende à environ 6%.
Le mélange ainsi obtenu donne un titrage iodométriqua
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d'environ 26 gr/lt de D..-)-alphaaminobenzy.pénioi.l,ine calculée comme acide anhydre. D'autres dosages analytiques et chromato graphiques indiquent la présence d'environ 2g/lt d'acide 6
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aminopénioillanique, 6g/lt de D-(.)-lphA.phdnylglyo1na, et des quantitde variables d'autrsimpuroté8 (acide pd6îoillorquop chlorures et acétates organiques et Inorganiques)$ Refroidir le mélange à 0"0. l t ao1d1!'1et> à pH 1 aveo de l'acide ohlorhydr1quEI concentré, puis filtrer les rési* dus solides éventuels sur filtre obstrué aveo du oharbon animal.
Le filtrat parfaitement limpide est aloalinisé à un
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pti 5,8 par l'adjonction prudente de tridth5.mine, L'on ' obtient une séparation immédiate d'un produit cristallin volumineux, très blanc,, que l'on filtre par aspiration et puis avec de l'acétone oontenant 6 % d'eau jusqu'à obtenir des eaux de lavage incolores. Laver à plusieurs reprises le filtre bien essoré aveo des petites quantités d'eau glacée jusqu'à ce que le filtrat ne précipite plus avec le nitrate d'argent.
Sécher le produit ainsi obtenu par oourant d'air ayant une température non supérieure à 50 L'on obtient ainsi une poudre cristalline très blanche qui, analysée chimique-
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ment par la méthode iadoméi.rique, révèle un titrage de 86,6% en D-(-)-alpha-am1nobonzylpén1oil11ne aoide anhydre, et un pourcentage d'eau de 13,4% dosé par la méthode de Karl Fisoher.
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L'analyse élernenta1rfl de la formule C16H19NOliS '9HgO
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est s C 47,6, H 6p3s N10,4, s 7t9x H80 l,4% ; pour le produit obtenu selon l'invention elle cet, C 47e3o H 6,'1, lOt2i 794$ OP601ficlue > j D 21 N 10,2, 7,4, Hg li,'ji± 1A rotation spécifique alpha D est de +2400 (0 0.'52 dans l'eau).
L'activité mlorobiologique. dos4e selon la méthode de l'Agar-diffusion en utilisant Baoïiiuo substilio comme or ganiame d'essai, a donné un titrage de 85% comme D-('-j!alpha-am1nobenzylpÓn101l1ino acide anhydre,
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La chromatographie sur couche mince avec plaquée au
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gel de silice d'épaisseur 0,5 mmo développateur acide aoëtique, butanol, eau (10tllots0), révélateur nirihydrino filooolique, donne une tache unique dans le Rf (environ 0,1) est
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parfaitement égal à celui d'un échantillon de comparaison
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certainement pur d'ampioil1ino tri-hydrate.
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Le rendement,calculé sur le dosage analytique du mé. lange acide est de 91%.
EXEMPLE 2.
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100 gr, d'auipioilline brute, ayant un titrage iodotnt5" trique de 41% calcule comme D-(-)lphu-am1nobenzylPÓnic1111no acide anhydre, et contenant 57 d'eau (Karl Fisohor), ainsi que des produite do dégradation ohr'or:nD.togr'lp!)'1.qUQn1fmt tn'ol'J EJv1den\in sont m1.8 on suspension rlanfi ma, <à'ao4tonù contenant 5 li,J, d'eau. On aoîdîtifi 4 pH 1 avec de ',' l'I,oj,(10 ahlorhydt'irW' aqu'2UK 4 "57 % et après avoir agite pendant' heures. 000p on filtre plusieurs fois à travers du charbon adoolorant jusqu'à 1'9b.
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tention d'une solution parfaitement: limpide.
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On neutralise h un pu de 6 avec de la tr16thylam1no et
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puis l'on filtre par aspiration l'abondant précipite, en le
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lavant avec de l'acétone à 5 el t I.M.. ,1\wQU'à obtenir dNJ eaux
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de lavage incolores.
Bien essorer le filtre et laver aveo 5 portions d'eau glaode jusqu'à disparition de la réaction carac tériatique des ions chlore du filtrat. Sécher par courant d'air à 45 c et l'on obtient 34 gr, d'ampioilline tri-hydrate très blanchepar analyse chimique, activité microbiologique, rota- tien spécifique et chromatographie sur couche mince de gel 09 silice, correspondants aux valeurs du produit obtenu dans l'exemple 1
REVENDICATINS
1 Procède pour l'obtention d'ampioilline purifiée sous forme d'ampicilline tri-hydrate, caractérisé en ce que l'ampioilline à purifier est dissoute dans un mélange forme en majeure partie d'un solvant complétement miscible à l'eau,
de conductibilité spécifique élevés ayant un pH compris entre 1 et 4,, et dont l'hydratation totale ne dépasse pas 20 % du volume.
2 Procédé tel que revendiqué sous 1, selon lequel l'ampioilline est précipitée sous forme cristalline par neutra lisation de la solution basique limpide à un pH compris entre 4 et 7 au moyen d'une base organique ou inorganique suffisamment forte pour neutraliser l'acidité minérale pré sente et à une concentration telle qu'elle n'amené pas l'hydratation totale finale au-dessus de 20 %
3 Procédé tel que revendiqué noue 1 ou 2,
selon lequel le précipité séparé par filtration est lavé pour éliminer les impuretés organiques au moyen du marne mélange solvant que celui défini sous 1" au m3me degré d'hydratation,
4 Procédé tel que revendiqué sous 1,2 ou 3 selon lequel le précipitée séparé par filtration Et débarrassé par lavage des impureté)!! organique, a le pouvoir, au moyen
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de lavages répétés de déplacement sur filtre avec de l'eau glacée, de s'hydrater et de se transformer en ampicillne tri-hydrate cédant en même temps aux eaux de filtrations les impuretés inorganiques et salines qu'elles contenaient.
5 Tous procédés dans lesquels l'ampioilline se présente à l'état solide brut à titre iodométrique basd autrement dit est contenue dans des mélangue do réaction .et pour cette raison en présence do toutes les impuretés dérivant de la réaction de synthèse et est transformée en ampicilline tri-hydrate pure par application du procé dé revendique dans les revendications 1 2 3 ot 4,
6 produits obtenus par le procédé selon n'importe laquelle des revendications 1 à 5