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.BREV}!1T...,'Q!.tW.N:r.;rMOli .
' Procédé pour 14 production do pÓniCJU1inQ \mi..synthÓt:iquea,
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Inventeurs# 11. BONFANl'i Giovanni, CAPUTO 7. Lc>, !'Jt N:'.N1 nnK<?, La. présente invention a pour objet la proQt\!tiotl (le pénicillines semi-synthétiques au moyen 11>un 1>roc(t,16 't?idp' base sur la réaction chimique entre chlorures d,d5 ';
acide amino-6 pl.U1icUlanique absorbé sur résines nniontçeucn* Le procédé selon l'invention est caractéI,'i,(,(\ ossont- tiellement en ce que l'on procède à l'absorption de l'acide amino-6 pénicillanique présent dans un bouillon enzymatique sur résines anioniques et qu'on le fait réagir directement avec
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les chlorures d'acides nécessaires à l'obtention des p6ntcillines désirées, l'acide amino-6 pénioillaniquo nàcessairq étant obtenu par voie biologique en utilisant des micro-organismes producteurs de complexes enzymatiques capables de scinder les
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pénicillines el1aoiQa amino-6 pnicilJ.an:Ll1ue et radical acide.
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Ce procède permet d'obtenir ces pénicillines oana passer par les phases intermédiaires ndoesaatrez dans les
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autres procédés connus jusqu'à ce jour,
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Ce procède présente, en plus do sa rapidité el.-, de la simplicité de son applioat.on divers avantages! '" séparation qua.nt,t tait:!. va de l'acide Amino-6 Flén1" (1l1an1 que des bouillons onzâ,matiques, On évite do oe1;te façon les portas duos h la ddLradt4tlon de l'acide amino-6 pé. nicillanique durant lea opc.4r !tj:!,Qt1S de séparation et de conm contration;
- possibilité d'obtention de oonoentra Uane' t1"lus élevées d'aoide amino'<6 pdniu111an1Que en mettant les l'daines
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absorbantes en suspension dans une quantité d'eau aussi petite
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que possible, ce qui favorie.8 tant la réaction que les opérations successives dlextraobion - de plus, l'absorption mur daines de l'ao1de'am1no- 6 p±nioiiInnique permet d' él1mit1al la plus grande partie des substancos protéiquoa présentée dans les bouillons enzmna.t:
1quos# ce qui permet d'obtenir des produits assez pure 13ana prooéder à des cristallisations aucoeomiveze Le procédé selon l'invention est base sur le !'J.1t que le groupe -COOH de l'acide amino-6 pdnioillanique vient s'attacher à la résine basique en laissant ainsi libre le groupe ...Nlde l'acide amino"6 pdnioillanique lequel réagit avec le chlorure d'acide déairé, Lorsque la réaction aleet
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pr'()du1to.. l'on a une variation dans le potentiel d'échange,
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ce qui perinet h la pénicilline qui s'est formée de me 11êtA" cher de la résine et de passer ainsi dans la solution aqueuse, De plus, l'adjonction de NaC*l aux bouillons de réAot1o!:
\, non
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seulement empêche partiellement l'hydrolyse du chlorure d'acide, mais favorise, à la fin de la réaction, la séparation complète des pénicillines de la résine, permettant d'obtenir des rendements presque quantitatifs de réaction, Ce procédé permet, en outre, en utilisant des résines anioniques, d'obtenir les pénicillines semi-synthétiques désirées à partir de bouillons enzymatiques contenant une quantité d'acide amino-6 pénioillanique vraiment minime.
Il est connu que, pour obtenir une extraction oonvenable d'acide amino-6 pénioillanique -la quantité d'acide amino- 6 pénioillanique présente dans les bouillons doit dépasser le degré de solubilité du produit même ,
Pour oela, on emploie généralement deux méthodes 1)- soit concentrer les quantités d'enzymes produites par les micro-organismes de façon à avoir une quantité de oomplexe enzymatique suffisante pour transformer des quantités importantes de pénicilline en aoide amino-6 pénicillantique 2)- soit utiliser des bouillons de culture capa.bles de trans.. former des petites quantités de pénicilline en acide amino-7 pénioillanique et concentrer ensuite la solution d'acide amino-6 pénioillanique.
Ces deux méthodes comportent de notables inconvénients dus aux pertes normales qui se produisent durant les différentes phases de l'opération, le procédé selon l'invention permet d'éviter ces inconvénients car il permet de supprimer les différentes étapes de concentration du complexe enzymatique ou de l'aoide amino-6 pénicillanique après transformation. Les résines qui peuvent être utilisées dans l'application de ce procédé sont du type anionique, telles que Amberlite IRA-401 401-8 402, 410 45 400 Nalcite SBS-Sar, Dowex 50, etc,,, sur lesquelles
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vient se fixer l'acide amino-6 pénicillanque présent dans le bouillon à traiter.
Les résines sont ensuite lavées à fond avec de l'eau distillée jusqu'à complète élimination du bouil lon puis sont recueillies dans un réacteur et mises en sus pension dans de l'eau distillée à laquelle on ajoute de l'acé tone, du ohlorure de sodium., du bioarbonato de sodium. On laisse' à une température de 0 c et, tout en maintenant l'agitation, on ajoute très lentement une solution acétonique de chlorure d' aoide, On agite le tout pendant plusieurs heures et à la tin de l'agitation on filtre les résines en maintenant toujours la température aux environs de 0 c
On porte alors à pH 2 aveo un acide minéral et on extrait avec un solvant non soluble dans l'eau (éther, méthylisobutyl-oétone acétate d'éthyle, acétate de butyle, etc..).
On lave le solvant avec de l'eau désionisée et on extrait avec une solution de bicarbonate à 5 %, on décolore avec du charbon, filtre et enfin lyophilise,
On trouvera ci-après des exemples particuliers mais non limitatifs de l'application du procédé selon l'invention, Exemple 1
Une culture de E coli Ankerfarm sp 27/14, adaptée à 10,000 mog/ml d'acide phénylacétique est ensemencée sur un milieu contenant comme unique composant une source d'azote protéique, On laisse incuber à 28 c en aérant et agitant jusqu'à obtention d'un bon degré de croissance (6..7 milliards , de oellules/ml). Oe bouillon de culture est centrifugé et la masse cellulaire ainsi obtenue est lavée,
remise en suspen sion dans de l'eau de façon à obtenir une concentration de 60 milliards de cellules/ml, A cette suspension cellulaire, on ajoute le bactériophage spécifique du micro-organisme, lequel,
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en 15-30 minutes doit lyser complètement toute la masse cellu- laire et libérer ainsi le complexe enzymatique contenu dans les cellules marnes. Lorsque la lyse s'est produite, on sépare les cellules par centrifugation et on porto à 37 C le bouillon
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limpide que l'on ajusto à pH 7#8 avec NaOH.
On ajoute à ce bouillon 70 % de benzylpénïoilline$ on porte sous agitation continue en maintenant, au moyen d'adjonction de NaOH le pH
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constant entre 7,5 ot 8#0, Après 15-18 heures l'on obtiont une transformation de benzylpéniaillïne en aoide amino-6 pénicillanique à une concentration de 86%,
840 ml de ce bouillon sont portds à 0 c, acidifiés aveo de l'aoide ohlorhydrique 5 % jusqu'. pH 2,8 et extraits à l'aide de 200 ml d'éther éthylique, après séparation des deux phases, la phase aqueuse contenant l'acide amino-6
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p6nioilianique e&t portée à pH 6 aveo de la acude à 5 %.
On passe cette solution lentement au percolateur sur 200 ml de
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résine Amberlite IRA 4oui< régénérée avec NACI, Lo bouillon ainsi traité a un titre de 0,?7% en acide amino-6-pàfiioilianim que.
On lave la résine aveo de l'eau déa10n1aée juaqu'à obtention d'une solution limpide et dépourvue d'ions dans l'affluent. On met la résine en suspension dans 500 ml d'eau
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déBlon1ao et on ajoute 20 g de Nazi, 0 de NaHCO et 250 ml d'acétone. On porte 4 000 et ajoute lentement à la suspension 25,5 g de ohlorure do 3.'éilid> T,')hénY)Fu211;.ol1e dissous dans 300 ml d'acétone. Après deux heures d' a.gi 'ê11.1,....VH vi ii.4bi-o et extrait la solution avec tr01e fois 300 ml d'éther éthy11ue. On recueille l'éther éthylique qui est lavé deux fols avec
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H20 déalonisée et extrait avec deux fois 115 ml de solution de bicarbonate de soude 6%. On déoolore sur charbon la solution aqueuse de bioarbonate de soude que l'on filtre et
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tt ' ...* .......
L'on alJtint ailFii ;que 1:Y1Ph111so. L'on obtient ainsi 7,9 g, de benzylp4niailline titrant 96% équivalent à un rendement de 93 % sur le rendement théorique, .
EXEMPLE2.
On fait pousser sur un milieu de culture ayant comme
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unique composant une source d'azote protéique# une culture de B. Coli Ankerfarm ap, 27/14 rendue résistante à 10.000 mog/ml d'acide phénylaoétique. On laisse inouber cette oulture At. 2"Ce en l'aérant et l'agitant jusque obtention d'un bon degré de croissance 6-7 milliards de oelluiea/ml). On ajoute à ce
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bouillon de la benzylpén1ulll1ne concentrée à 5 %. On ohauffe à 37 C et on ajuste à pH 7,8 avec Na OH tout en le maintenant sous agitation. En 6-9 heures on a une transformation de 90%
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de la benzylpénioilline en acide amino-6 pénioillanique.
On s6pare le bouillon par centrifugation et on porte 11 litres du bouillon ainsi bbtenu 0 c on acidifie avec de l'acide chlorhydrique 5% jusqu'à. PH 2,5 et on extrait avec 2,61
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d'éther éthylique, Après séparation des deux phases, la phase aqueuso contenant l'acide amino-6 pénioillanique est portée à pH 6 avec de la xoude k 5 9s. On passe lentement cette a0.u tion au percolateur dur 200 ml de résine Ambarlite InA i0., régénérée avec Na C1., Le bouillon ainsi traité a un titre en acide amino-6 pén10111anj,que de 0020 %, On lave la résine aveo de l'eau désionisée junqit'à obtention d'une solution limpide dépourvue d'ions do l'affluent, On mot la résine en suspension dans 500 ml d'eau désioniaée, on ajoute 20 g de NaCl, 30 g de NaHC07 et 250 ml d'acétone.
On porte à 000 et ajoute lentement à cette suspension '.?5,5 g de chlorure de l'acide phénylaw ce tique dissous dans 300 ml d'acétone, on agite pendant trois heures,puis on filtre et extrait la solution aveo trois foie 300 ml d'éther éthylique. On lave l'éther éthylique recueilli
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':'1."Îô "". '- ,:,:: '.''3 l g, '.J" .l0:J.onisé0 et on excrait avec d0U:; ""c :.:; .;J. -";.2 .''"?,os de bicarhoP.E'.t0 de soude 6 ;50 On :1:é...;<".n,- <;. i.<..zol,1.F i;u i .=uS de bicarbonate de soude sur charbon j 'i' fiJ:1;:i.'û f'i lyophilise. L'on obtient ainsi 165 g de b611Z;;IU\i.hÜf21.l1:Lne c.yu.në un titre de 95 8j correspondant a un rendement de 90,2 %.
..,2.t.
On fait POUOAOV sur un milieu (le culture ayant somme unique oomposa.nt une source d'azote protéiqiàe, ,,;ne aaaltuve de . 9cali 'nltor',rdr sp. 27/14 rendue résistance à 10.000 mOYlIIl d'acide phënylasëtique. Cette culture est Incubée 4 28*0$ aêrêe et agitée usau' obtention d'un bon degré de C\x'o1ssanco (6-7 milliards de cellul-oo/inl), On ecntri'i'uge le bouillon de culture, lave la tnasse cellulaire ainsi obtenue et la met en suspension dans H20 jusque concentration do 60 milliards ric. ael1ulon/ml. On o,jnu';<: 4 nutt0 nunp0"nlon ClclJ.ulc,1.!'(\ la bD.oi;(Íriopht.J.G0 dp ci.f'1eF'.s; du moI'o"'or.'g!1.nj [\m! qui, on 15 ?0 minutes ymr.v1ent \ lysoy o(1m;lbt8mnn+; toute;:> 18. rr'},;:;e eiellulatre, libérant ainsi le orrp:e enzymatique contenu dano les cellulen.
Quand la lyse est oompltt'3, on empare 1',' '''1lj.u.. les par oontrifugation et on porte le bouillon ainsi obtenu à pH 7,8 avec Naos. On chauffe à '$7" C. On ajoute à ce bouillon de la benzylpénioilline aorrespondant h 70%, On porto sous agitation continuelle en maintenant le pli constant entre ,5 - 8,0 par adjonction de NaOH. Au bout de 15-18 heures, on a une transformation de 85 % de bonzylpdnioil.ine en acide amino-6 pénioillanique, On porte à OOC 8'in ml do ce bouillon, on acidifie aveo de l'acide chlorhydrique 5% jusqu'à Pli 2,F3 z et on extrait avec 200 ml d'éthcr éthylique, Aprèa séparation des deux phases, la phase aqueut3t,,
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contenant l'acide amino-6 pénio111an1que est portée à pH 6 aveo de la soude 5 %.
On passe lentement cette solution au percolateur sur 200 ml de résine Amberlîte à 401, :1'égêné:rêe avec NaCl Le bouillon passé au percolateur a un titre de
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0,'37% en acide amino-6 pénioillanique, On lave la résine aveo de 'l'eau ddsionisée jusque obtention d'une solution limpide dépourvue d'ions dans l'e,rfluent. On met la résine en sua pen.. sion dans 500 ml d'eau dCriania6e, on ajoute 20 g de NaCl, 30 g de NaHCO- et 200 ml d'acétone. On porte à 0 c On ajoute lentement à la suspension 28 g de chlorure de l'acide phénoxy aoétique dissous dans 300 ml d'acétone. On agite pendant deux heures, puis filtre et extrait la solution avec trois fois 300 ml d'éther éthylique.
On lave deux fois l'éther dthylique
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recueilli aveo de l'eau déeion1sée et on extrait aveo deux fois 115 ml d'une solution de bicarbonate de potassium à 5 z, On ddoolore la uolut1on aQuoul3o de bloarbonate de potassium ou l'on obtient ainsi 51+, de phénoxyméthylp6n:l.o1l1:
Lne ayant un titre de 9,5,5 aorroaponclant à un rendement de travail de 911% sur le rendement théorique,
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x(\mpl0 '1
On fait pousser sur un milieu de oulture possédant comme unique composant une source d'azote protéique, une oul turo de E. coli Ankerl'arin sp 27/14 rendue résistante à
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10,000 mom,!. d'acide phénylaoétique, On laisse incuber cette culture à 26*C, en l'aérant et l'agitant jusqu'à obten" tion d'un bon degré de croissance (6'*7 milliards de cellules/mi), On ajoute 4 ce bouillon de la benzylpénioilline oonoontrae h 5 %, on chauffe 1" 0 et ajuste à pH 7,8 aveo NaOH tout en le maintenant sous agitation.
Au bout de z8 heures+< l'on a une transformation de 90 % de benzylpénioilline en acide
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aminâp3nlilarique, On sdpare le bouillon par oe:ztzifu;a litres tion et on porte 11 : de ce bouillon limpide à 0' C, on acidifie avec de l'acide chlorhydrique 5% à pH 2, et extrait avec 2#6 1. d'éther éthylique. Après séparation des deux phases, la phase aqueuse oontenant l'acide arni,no-6 pénicillanique est por- tée à pH 6 aveo de la soude à 5%.-On passe lentement cett solution au percolateur sur 200 ml de résine Amberlite IRA 401, régénérée aveo NaCl. Le bouillon a un titre de 0,20% en acide amino-6 pénioillanique.
On lave la résine aveo de l'eau désionisée jusqu'à obtention d'une solution limpide et dépourvue d'ions de l'effluent, On met la résine en suspension dans
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500 ml d'eau désîonisde, On ajoute 20 g de NaCl, 30 g de NAHCO3 et 250 ml d'aoétone. On porte à 0 0 et on ajoute lentement 28 g de chlorure de l'aoide ph6noxyaetique dissous dans 300 ml d'aoétone. On porte sous agitation pendant deux heures, puis filtre et extrait la solution avec trois fois 300 ml d'éther éthylique. On rejette les eaux-mères. On lave l'éther
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éthylique deux fois aveo de l'eau ddsionïcde et extrait avec 2 fois 115 ml d'une solution de bicarbonate de potassium à 5% On décolore sur charbon la solution aqueuse de bicarbonate de potassium, filtre et lyophilise.
On obtient ainsi 50 g do
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phénoxymèthylpênieilline ayant un titre de gl+,F3 correspond- dant à un rendement de travail de 98 %. Exemple 5
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PaQ4cte selon la description de l'exemple 3 on utab 11±1Elnt '90.,5 s de ohloruî'o de l'aoido phénoxyproPir.m1QtJo au lie de ehloT'ure da l'acide ph6tioxyuoétîquee L'on obtient ainsi 50/3 g do ph6néticilline ayant un titre do 95,,5 'i'J' Or'* respondant à un rendement de 87 % sur le rendement théorique, Exemple 6,
Procéder selon la description de l'exemple 4, en uti
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lisant 0,5 Cs, de chlorure de l'acide phénoxypropionique au
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lieu de chlorure de l'acide Phn kYà t!qu:
' dd.obt1ent ainsi 50,2 g de phénétioilline ayant un titre de 95 % correspondant à un rendement de travail de 86,5% sur le rendement théorique.
Exemple?.
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Procéder selon la description de l'exemple z, en uti lisant 32,7 g de chlorure de l'acide phénoxybutyrique au lieu du chlorure de l'acide phdnoxyacétique, On obtient ainsi 54 g de propioilline ayant un titre de 96,2% correspondant à un rendement de travail de 90 % sur le rendement théorique, Exemple 8.
Prooéder selon la description de l'exemple 4, en utilisant 32,7 g de chlorure de l'acide phénoxybutyrique au lieu
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du chlorure do l'acide phdnoxyao6ticuc. On obtient ainsi 52,5 g de propioilline ayant un titre de 94,5 ut correspondant à un rendement de travail de 86 % sur le rendement théorique, Exemple 9*,
Procéder selon la description de l'exemple 1, en utili-
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sant 36,5 g de chlorure de l'acide -môthyl-5-phenyl-''5-isoxazo'" lique-4 au lieu du chlorure de l'acide phénylaoétique. On
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obtient ainsi 5+,.3 g d'oxaoil11ne ayant un titre de 97 % oor- respondant à un rendement.de travail de 86 % sur le rendement, théorique.
Exemple 10.
Procéder selon la description de l'exemple 2, en uti-
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liciant â,5 g de chlorure de ;1. t Bo:l,de .. mthyi5phdnyl.' iooxazoliqua-4 au lieu Ju chlorure do l'acide phÓnyl"aÓt:1l1ue, On obtient ainsi 52,9 Ë d'oxacilliua t3.y8.nt un titre de 95aB 'j correspondant à un rendement de travail de 82,7 % sur le ren dement théorique, Exemple 11.
Procéder selon la description de l'exemple 1 en uti
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lisant 42p5'o de chlorure de l'acide -orthoohloropheny'1 -''5-' !nëthyl-5-iaoxazolique-4 au lieu du chlorure de l'acide phènylacd4îque, On obtient ainsi 61 g de cloxaôîlline ayant un titre de 95,3 % correspondant à un rendement de travail de 88 % sur le rendement théorique, Exemple 12
Procéder selon la description de l'exemple 2, en uti
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lisant 42" g de chlorure de l'acide -.orthoohloroph<3nyl-.
méthyl-5 iaoxaKolique-4 au lieu du chlorure de l'acide Phdnylacètiquet L'on obtient ainsi 801 s de oloxacilline ayant un titre do 94s6 % oorrespon<lant ?i un rrmdomont do travail de 86 % sur le rendement théorique, Exemple 13
Procéder selon la description do l'exemple 1, en uti
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lisant 48,2 g de chlorure de l'acide -(..diohloro-2.6 ph6nyl)-'M tnéthyl-5-isoxazolique-4 au lieu du chlorure de l'acide Phdnylacétique. On obtient ainsi 5i) ± de dicl....l.oxt\o1l11no ayant un titre de 93o5 -, oorreapondan% ,'1 un rendement de travail de 78% sur le rendement théorique.
Exemple 14
Procéder selon la description de l'exemple 2 on uti-
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lisant 48,2 g de chlorure de l'acide -(-d" "1 t'Ô-'?>f" phenyï).. méthyl-5 iooxazolique - 4 au lieu du chlorure de l'acide phdnylacétique. On obtient 56,' 9 do d10101o1111no ayant un titre de 93 % correspondant à un rendoment de travail de 74 % sur le rendant théorique Exemple 15
Procéder selon la description de 1'exemple 1 en uti-
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lisant 'o,,4 g de chlorure de i'aoià -<iimJth xY-?>6 nhényl1Q.ue au lieu du chlorure de l'acide PhénylékO4tiqUO* On obtient
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ainsi 48,1 g de môth1Qill1ne aIElUhl rl't3r% ooX'X'eo- pondant à un rendement de travail de 80 % sur le rendement. théorique.
Exemple 16 Procéder selon la description de l'exemple 2, un uit
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lisant 30,4 g de chlorure de l'aoide-dimàthoxy-2,6 phénolique au lieu du chlorure de l'acide phénylacdtique, On obtient ainsi 47.5 z de méth1oUl1ne ayant un titre de 84,8 % oorren. pondant 4 un rendement de travail de 77,a% sur le rendement théorique.
REVENDICATIONS.
@
1.- Procédé de production de pénicillines
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aom1..aynthét1quel3, caractérisé en ce que l'on procède à l'abaorption sur résines anioniques d'acide amino-6 pén1oillan1Q"ftf quu l'on fait réagir sur ces résines un chlorure d'acide
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correspondant a la pénicilline désirée, que l'on les lave et ctua l'on extrait la pÓnlo1111no tormde à l'aide d'un solvant insoluble dans l'eau ot que l'on purifie le produit obtenu par les )noyons usuels.
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2>, Procède selon la revendication 10 oractér1ed en ce que l'acide ±\11I1no-6 pén101l1a.nique eat obtenu par voie onzymatique ot est traité à partir de son milieu d'obtention,
3 Procède selon la revendication 1, caractérisé on
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oe que les résines anicmiquef3 ayant fixé l'acide amino-6 p3. n:l<,nlunique oont ;
!.avÓEII3 à l'eau déaion1aée, traitées par de l'eau contenant du chlorure de sodium, un bicarbonate alcalin et de l'acétone.
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4," Procède selon lea!l'evend 101\ t 10\1al à ." caractérise un oo que le chlorure d'acide ohoiej est mis en solution dans do l'acétone, est mis en oontaot avec la rdaine à une tempé-
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oompri%e entre -50 À5 él'<iÙ àrééltelle 0 Pâture comprise entre -5 C et 5 e préforenco Ol'C et pendant un temps variant de 2h à 4h, S.- Procède selon les revendîoationn 1, 3 ou 4, oaraotéried en ce que l'on aoidifie la rduino obtenu selon 4" à l'aide d'un acide minéral juaqu'h un pil voisin ùo 1,
que l'on extrait avec un solvant organique non soluble dans l'eau que l'on lave l'extraotum organique, que l'on traito avec une solution,
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b:1ol.\1"bonatée, que l'on dèoolorop filtre et recueille la pénicilline recherchée par lyophilisation,