CH361886A

CH361886A - Procédé de préparation de la vitamine B12 cristallisée

Info

Publication number: CH361886A
Authority: CH
Inventors: Barthelemy Pierre; Penasse Lucien; Nomine Gerard
Original assignee: Roussel Uclaf
Priority date: 1956-05-05
Filing date: 1957-05-04
Publication date: 1962-05-15

Description

<Desc/Clms Page number 1>
Procédé de préparation de la vitamine Bl2 cristallisée L'objet de la présente invention est un nouveau procédé de préparation de la vitamine Bl. sous forme cristallisée (ou cyanocobalamine de formule CssH9oNl4O'l4PCo dont la constitution a été élucidée par TORD et coll., Nature, 1955 176, 328),à partir de solutions aqueuses diluées de celle-ci, comme par exemple les bouillons de culture de microorganismes qui la se- crètent.

Le procédé peut également s'appliquer à l'isolement de la vitamine Bl, à partir d'autres sources naturelles comme les boues des eaux d'égout ou les extraits de foie ou de solutions très diluées de produit pur.

On sait que la teneur en vitamine 1312 des bouillons de culture des microorganismes qui la secrètent (et qui sont des fongi appartenant aux classes des Schizomycètes, Eumycètes et Myxomycètes, notamment des Streptomycès) est extrêmement faible. Elle est généralement de l'ordre du millionième.

Les méthodes. connues d'isolement procèdent par étapes, successives, en commençant généralement par une adsorption préliminaire sur charbon actif, une terre ou résine échangeuse d'ions d'où l'on élue la vitamine 1312 accompagnée d'impuretés de solubilités voisines. On effectue ensuite des purifications intermédiaires par extraction à contrecourant à l'alcool benzylique, ou par passage alternatif de la vitamine BI, dans un solvant non miscible à l'eau et dans l'eau.

Pour cela, on épuise les solutions aqueuses avec un solvant ou mélange de solvants insolubles dans l'eau, ajoute généralement un tiers. solvant dans lequel la vitamine Bl, est insoluble et épuise à l'eau. Des solutions de vitamine 131.2 dans des phénols substitués ou non peuvent être épuisées par la pyridine aqueuse. Finalement, en répétant les passages. en phase aqueuse et phase organique, on arrive à une purification plus complète du produit et procède pour terminer à une chromatographie sur alumine ou sur résine échangeuse d'ions qui donne une solution de vitamine B,, dont le degré de pureté est de l'ordre de 90 %. Une précipitation par l'acétone, suivie d'une ou plusieurs recristallisations, conduit généralement au produit pur.

Comme on le voit, l'extrême dilution du produit de départ et le peu de sélectivité de l'agent d'adsorption utilisé, fait que l'agent d'adsorption ayant servi au premier traitement, renferme rarement plus de 50 y de vitamine Bit par gramme, soit 5/ioo ooo ce qui conduit à des opérations multiples et diverses, néces- sitant l'emploi de différents, solvants et agents. d'adsorption sur une grande échelle et à la manipulation de gros volumes comportant parfois des récupérations onéreuses de solvants.

Il est donc intéressant de pouvoir disposer dans l'industrie d'un procédé sélectif permettant d'éviter ces opérations multiples portant sur des volumes importants.

La présente invention qui se rapporte donc à un procédé de préparation de la vitamine 1312 sous forme cristallisée à partir de solutions aqueuses diluées de celle-ci, est caractérisé en ce qu'on forme au sein de ladite solution du cuprocyanure de zinc qui se combine à la vitamine B12 en donnant un composé insoluble dans l'eau, sépare ledit composé de vitamine Bh, libère la vitamine Bl2 par l'action d'un agent susceptible de former avec le zinc un dérivé hydrosoluble,

extrait la vitamine Bl2 par au moins un solvant pour la débarrasser des impuretés minérales, la fait repasser en solution aqueuse et la précipite de sa solution aqueuse par addition d'un solvant dans lequel elle est insoluble.

Selon une forme particulière du procédé selon l'invention, on forme au sein d'un bouillon de culture dont les cellules du mycelium ont été soumises à une lyse préalable, du cuprocyanure de zinc, sel complexe, qui se combine à la vitamine B12 avec formation d'un dérivé insoluble de celle-ci. Après une simple filtration ou centrifugation, on se trouve en présence d'un précipité de poids et de volume très restreints d'où il est possible de régénérer aisément la vitamine B,, en redissolvant le précipité formé, dans l'eau par action d'un agent de chelatation qui complexe le zinc.

Il suffit alors d'extraire de cette solution riche en produits minéraux la vitamine B1n par un solvant ou mélange de solvants d'où on la fait repasser dans l'eau, en répétant, au besoin, ces deux dernières opérations. On la précipite de cette solution par addition de dioxane et vérifie le degré de pureté sur une partie aliquote de la cyanocobalamine obtenue.

Si ce degré est insuffisant pour permettre la recristallisation directe, on redissout dans l'eau et effectue une deuxième fois le traitement par le cupro- cya.nure de zinc et traite le précipité obtenu comme précédemment. On évite à la fois les chromatographies et les opérations portant sur de gros volumes.

La littérature technique ou scientifique mentionne déjà certains procédés de précipitation de la vitamine B12 en faisant réagir sur des concentrais de ce produit un cyanure alcalin et un sel soluble de zinc, en utilisant, par conséquent, du cyanure de zinc et en partant d'un produit préalablement concentré par un autre traitement.

A l'opposé de ce procédé, on utilise ici le cupro- cyanure de zinc qui donne avec la vitamine B12 au sein de solutions très diluées ou d'un bouillon de culture lysé une combinaison insoluble. Ce réactif peut être formé en introduisant d'abord dans la solution renfermant la vitamine B1,2 du cuprocyanure tri- potassique [Cu(CN)4]K3 et ensuite un sel soluble de zinc comme le sulfate ou l'acétate de zinc.

Comme le montrent les exemples, le cuprocyanure de zinc permet non seulement l'isolement de la vitamine B12 à partir des bouillons de culture, mais également sa récupération quantitative à partir d'une solution diluée de vitamine B,, cristallisée. Par contre, si en présence d'une telle solution on fait réagir du cyanure de potassium et un sel de zinc, on n'isole que des quantités faibles de vitamine B,.,.

Le cuprocyanure tripotassique utilisé pour le faire réagir au sein du bouillon de culture sur un sel soluble de zinc, se trouve dans le commerce ou est facile à préparer selon les. méthodes de la littérature. Sa formule est aisément vérifiable par analyse chimique ou par les méthodes physiques. On l'introduit en général dans le bouillon lysé en quantité telle qu'après addition de la quantité stoechiométrique ou d'un léger excès d'un sel soluble de zinc, on dépasse les limites de solubilité du cuprocyanure de zinc formé dans l'eau.

On emploie donc de préférence un large excès de ce réactif par rapport à la vitamine B12, la solubilité du cuprocyanure de zinc étant de l'ordre de 0,5 %. Bien entendu, au lieu d'introduire d'abord dans le bouillon de culture ou dans une autre solution diluée de vitamine B,., la solution de cuprocya- nure tripotassique et ensuite le sel de zinc, on peut aussi procéder inversement.

A l'encontre de l'adsor- bat qu'on obtient lorsqu'on essaie de précipiter la vitamine B,,, par l'action d'un cyanure alcalin sur un sel de zinc et d'où elle est extractible par les solvants, on obtient ici une combinaison chimique. En effet, l'action des solvants n'extrait pas de vitamine B1_ et mieux encore, on peut, par action du diméthyl- form.amide, extraire la combinaison cuprocyanure de zinc-vitamine B,= et la séparer du cuprocyanure de zinc coprécipité. Par addition d'acétone à cette solution, la combinaison. précipite inchangée.

Pour l'isolement industriel de la vitamine B,_,, on se contente généralement du précipité brut obtenu comme on vient de l'indiquer. Après filtration ou centrifugation on peut le traiter par la solution aqueuse d'un agent de chelatation comme le sel sodique de l'acide éthylène-diamino-tétracétique qui complexe le zinc et procède ensuite par extraction et redissolution dans l'eau d'où l'on précipite la vitamine B,_, par le dioxane comme il a été indiqué au début de la description.

Dans les exemples qui suivent, on peut employer pour la réaction avec le cuprocyanure tripotassique, d'autres. sels de zinc solubles dans l'eau que ceux mentionnés ou, employer le cuprocyanure trisodique, ou bien, utiliser d'autres agents de lyse du bouillon que ceux indiqués s'ils n'influent pas sur la solubilité de la combinaison. De même, s'il est plus commode de travailler à la température ambiante et sans changer le pH du bouillon, on peut encore chauffer celui-ci vers 800 ou refroidir à -F- 5,1 ou l'alcaliniser légèrement. De même peut-on changer d'adjuvant de filtration en utilisant d'autres produits que ceux mentionnés.

Finalement, on. peut employer d'autres agents de chelatation du zinc que ceux indiqués, notamment le sel trisodique de l'acide nitrilo-triacétique ou le sel trisodique de l'acide N-hydroxyéthyl-éthy- lène-diamine-triacétique ou d'autres agents susceptibles de complexer le zinc sous forme de dérivés hydrosolubles. Exemple a) A partir d'une solution diluée du produit pur, on prépare 11 de solution aqueuse à laquelle on ajoute 2,110 mg de vitamine B,_, pure. On ajoute 2 g de cuprocyanure tripotassique [Cu(CN)4]K., puis 3 g de sulfate de zinc dissous dans 30 cm3 d'eau distillée.

On laisse décanter, puis filtre en s'aidant d'une petite quantité de terre filtrante. Le filtrat est incolore et ne contient pas de vitamine B,_, décelable par titrage biologique. On redissout le précipité dans 25 cm3 d'une solution aqueuse de sel tétrasodique de l'acide éthylène-diamino-tétracétique. On filtre pour éliminer la terre filtrante, lave par 3 fois 5 em3 d'eau distillée que l'on joint au filtrat rouge et ajoute 20 g de sulfate d'ammonium et extrait la vitamine B, , par épui-

sements répétés à l'alcool amylique pour obtenir la cyanocobalamine exempte d'impuretés minérales.

La solution amylique est ensuite épuisée par l'eau.

Le titrage de la vitamine B12, dans cette solution, montre qu'on a récupéré 2,104 mg de produit cris- tallisable directement par addition de 10 volumes de dioxane, soit un rendement de 99 %. b) La solution diluée est une matière naturelle A 101 de bouillon de culture de S. Olivaceus titrant 1500,( de vitamine B1. au litre, on ajoute 260 g de chlorure de calcium et agite pendant trois heures à 500 C pour provoquer la lyse du mycelium. Après filtration, on laisse refroidir à 1a température ambiante et ajoute 20 g de cuprocyanure tripotassi- que [Cu(CN4)]K;

j, agite jusqu'à dissolution et introduit, sous agitation, 30 g de sulfate de zinc dissous dans 300 cmf; d'eau distillée. On arrête l'agitation, laisse décanter une nuit et sépare le précipité sur filtre presse après addition d'un adjuvant de filtration (10 g de Hyflo-Super Cel) puis on lave sur filtre avec 31 d'eau distillée. Le filtrat, ainsi que les eaux de lavage, ne renferment plus de vitamine 131.2 décelable par titrage biologique.

Le précipité essoré est mis en suspension dans 250 crW d'eau distillée et on ajoute 100 g de sel tétrasodique de l'acide éthylène-diamino-tétracétique. Le filtrat, d'un volume de 300 cm3 environ renferme les 15 mg de vitamine Bic précédemment contenus dans 101 de bouillon. On ajoute de l'acide chlorhydrique jusqu'à pH 8,5 et extrait avec un mélange phénol-dichloréthane à plusieurs reprises. Les extraits, organiques réunis sont lavés à l'eau et les eaux de lavage sont jetées. On ajoute alors à l'extrait un volume égal de dichloréthane pour insolubiliser la vitamine 1312 et épuise à l'eau.

La solution aqueuse renferme, d'après le titrage spectrophotométrique, 14,5 mg de vitamine B1, soit un rendement quantitatif et se trouve ramenée à quelques dizaines de cm3. On la soumet à un traitement identique au précédent en utilisant 40 mg de cuprocyanure tripotassique et 60 mg de sulfate de zinc, et sépare la combinaison du complexe zincique. Le filtrat de celle-ci ne titre que 0,264 mg de vitamine B1=. On libère la vitamine B1 , comme il a été indiqué plus haut et la fait passer en phase organique puis en phase aqueuse comme indiqué plus haut.

On ajoute 10 volumes de dioxane et obtient 8 mg de vitamine Bit cristallisée en belles aiguilles rouges. Les eaux-mères renfermant le reste de la vitamine B1c peuvent être concentrées, précipitées et recristallisées à nouveau ce qui procure un deuxième jet important, ou plus simplement être ajoutées après élimination du solvant et détermination de leur titre (6 mg) à une nouvelle venue de vitamine B1= provenant de la deuxième précipitation par le cuprocyanure de zinc.

Claims

REVENDICATION Procédé de préparation de la vitamine B12 sous forme cristallisée à partir de solutions aqueuses diluées de celle-ci, caractérisé en ce qu'on forme au sein de ladite solution du cuprocyanure de zinc qui se combine à la vitamine 1312 en donnant un composé insoluble dans l'eau, sépare ledit composé de vitamine B12, libère la vitamine 1312 par l'action d'un agent susceptible de former avec le zinc un dérivé hydrosoluble, extrait la vitamine B12 par au moins un solvant pour la débarrasser des impuretés minérales,

la fait repasser en solution aqueuse et la précipite de sa solution aqueuse par addition, d'un solvant dans lequel elle est insoluble. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on forme le cuprocyanure de zinc par action d'un sel soluble de zinc sur du cuprocyanure tri- potassique [Cu(CN)4]K3, le sel de zinc étant ajouté en une quantité au moins stoechiométrique par rapport au cuprocyanure tripotassique. 2.

Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise, comme sel de zinc, le sulfate de zinc. 3. Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise, comme sel de zinc, l'acétate de zinc. 4.

Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit d'abord le cuprocyanure tripotassique et ensuite le sel de zinc dans la solution diluée de vitamine B12. 5. Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit d'abord le sel de zinc et ensuite le cuprocyanure tri- potassique dans la solution diluée de vitamine B12. 6.

Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare ledit composé insoluble dans l'eau de la vitamine B12 par filtration. 7. Procédé suivant la revendication et les sous- revendications 1 et 6, caractérisé en ce qu'on utilise un adjuvant de filtration. 8. Procédé suivant la revendication et les sousrevendications 1, 6 et 7, caractérisé en ce qu'on utilise, comme adjuvant de filtration du kieselgur. 9.

Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que l'agent susceptible de former avec le zinc un dérivé hydrosoluble est un agent de chélatation. 10. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que l'agent susceptible de former avec le zinc un dérivé hydrosoluble est un agent complexant. 11. Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 9, caractérisé en ce que l'agent de ché- latation est le sel tétrasodique de l'acide éthylène- diamino-t6tracétique. 12.

Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 9, caractérisé en ce que l'agent de ché- latation est le sel trisodique de l'acide N-hydroxy- éthylène-diamino-triacétique. 13. Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 9, caractérisé en ce que l'agent de ché- latation est le sel trisodique de l'acide nitrilo-triacé- tique. <Desc/Clms Page number 4> 14.

Procédé suivant la- revendication, caractérisé en ce que le solvant d'extraction de la vitamine B12 est l'alcool amylique. 15. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le solvant d'extraction de la vitamine B12 est un mélange phénol-dichloréthane. 16. Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 14, caractérisé en ce qu'on fait repasser la vitamine Bl, de sa solution organique dans l'eau par lavage à l'eau. 17.

Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 15, caractérisé en ce qu'on fait repas- ser la vitamine Bl, de sa solution organique dans l'eau par insolubilisation. 18. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on précipite la vitamine Bl, purifiée de sa solution aqueuse par addition de dioxane. 19. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise, comme solution aqueuse diluée de vitamine Bl, de départ, un bouillon de culture de microorganismes producteurs de vitamine B,, .