BG105363A - Методи за секвениране и амплифициране на нуклеинова киселина - Google Patents
Методи за секвениране и амплифициране на нуклеинова киселина Download PDFInfo
- Publication number
- BG105363A BG105363A BG105363A BG10536301A BG105363A BG 105363 A BG105363 A BG 105363A BG 105363 A BG105363 A BG 105363A BG 10536301 A BG10536301 A BG 10536301A BG 105363 A BG105363 A BG 105363A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- nucleic acid
- solid support
- sequence
- specific primers
- matrix
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 417
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 368
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 368
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 142
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 78
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 72
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 173
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 102
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 139
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 56
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- -1 dimethoxytrityl Chemical group 0.000 claims description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 17
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 13
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 6
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 6
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 claims description 6
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 5
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 262
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 98
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 62
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 62
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 61
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 57
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 31
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 24
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 23
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 23
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 20
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 20
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 16
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 13
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 9
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 8
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 7
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 5
- 102100031476 Cytochrome P450 1A1 Human genes 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 4
- 101000941690 Homo sapiens Cytochrome P450 1A1 Proteins 0.000 description 4
- 101000982628 Homo sapiens Prolyl 3-hydroxylase OGFOD1 Proteins 0.000 description 4
- 102100026942 Prolyl 3-hydroxylase OGFOD1 Human genes 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 4
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229940064734 aminobenzoate Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate group Chemical group C(C=C)(=O)[O-] NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000012177 large-scale sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 2
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N succinic anhydride Chemical compound O=C1CCC(=O)O1 RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrimidin-4-amine Chemical group N=C1NCNC=C1 WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYNVSZMFFVWFQA-NOMGDLSISA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(1-hydroxyethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(O)C)O[C@H]1N1C(NC(N)=NC2=O)=C2N=C1 PYNVSZMFFVWFQA-NOMGDLSISA-N 0.000 description 1
- QNIZHKITBISILC-RPKMEZRRSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methyloxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=NC(C(NC(N)=N2)=O)=C2N1[C@]1(C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O QNIZHKITBISILC-RPKMEZRRSA-N 0.000 description 1
- LXBGSDVWAMZHDD-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1h-imidazole Chemical compound CC1=NC=CN1 LXBGSDVWAMZHDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGHACVGYBTXHRR-UHFFFAOYSA-N 3-(2-iodoacetyl)pyrrolidine-2,5-dione Chemical group ICC(=O)C1CC(=O)NC1=O KGHACVGYBTXHRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJMIISFFKMKOIV-UHFFFAOYSA-N 4-benzoyl-4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)-1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1N(O)C(=O)C(S(O)(=O)=O)C1(C(=O)C=1C=CC=CC=1)N1C(=O)C=CC1=O JJMIISFFKMKOIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWDDLRSGGCWDPH-UHFFFAOYSA-N 4-triethoxysilylbutan-1-amine Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCCN SWDDLRSGGCWDPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033658 Alpha-globin transcription factor CP2 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Chemical group 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101800000398 Nsp2 cysteine proteinase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000013201 Stress fracture Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 108010016828 adenylyl sulfate-ammonia adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N hydron;methanediimine;chloride Chemical compound Cl.N=C=N DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- XLSZMDLNRCVEIJ-UHFFFAOYSA-N methylimidazole Natural products CC1=CNC=N1 XLSZMDLNRCVEIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IFIJJMKUTOBNME-UHFFFAOYSA-N pyrrole-2,5-dione;pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1.O=C1NC(=O)C=C1 IFIJJMKUTOBNME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Методите са предназначени за амплификация и секвениране най-малко на една нуклеинова киселина, катосе осъществяват следните етапи. Създава се поне една матрица нуклеинова киселина, включваща нуклеиновата киселина(и) за амплифициране или секвениране, съдържаща в 5' края си олигонуклеотидна секвенция Y и средство за прикрепването си към твърда подложка, а в 3' края - олигонуклеотидна секвенция Z. Матрицата(ите) нуклеинова киселина се смесва с един или повече специфични праймери Х, които могат дахибридизират с олигонуклеотидната секвенция Z и носят в 5' края си средство за прикрепване, чрез което 5' краищата на матрицата нуклеинова киселина ина специфичните праймери се свързват с твърдата подложка. Осъществяват се една или повече реакции за амплификация на нуклеинова киселина върху свързаната матрица(и), докато се образуват колонии от нуклеинови киселини, и по избор се провежда поне един етап за определяне на секвенция на една или повече от образувалите се колонии нуклеинови киселини.Изобретението се отнася и до твърди подложки, китове и апаратура за осъществяване на посочените методи.
Description
ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Това изобретение се отнася до областта амплификация и секвениране на нуклеинова киселина. По-специално, това изобретение се отнася до методи за амплификация и секвениране на ® нуклеинова киселина и апаратура и китове, удачни за широкомащабно амплифициране и секвениране на нуклеинови киселини.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Анализът на секвенщ ите на нуклеинови киселини е важен момент в много области на биологията, биотехнологията и медицината. Непрекъснато нарастват възможностите за определяне на секвенции в нуклеиновите киселини, със започване на опитите за определяне на секвенции на големите геноми на човек и други i висши организми, а също така например и за определяне наi ί полиморфизма на отделни нуклеотиди и скриниране и контрол на| генната експресия. Генетичната информация получена от| секвенирането на нуклеинова киселина има много приложения,j например в области за разкриване и действие на лекарства, мишениί за диагностика на заболявания и предвиждане на риска, както и за идентификация и характеристика на организма.
Първият етап в тези приложения е определянето на конкретния химичен състав на интересуващите ни нуклеинови киселини, по-
точно определянето на срещащата се последователност на четирите бази, аденин (А), цитозин (С), гуанин (G) и тимин (Т) или урацил (U), които изграждат нуклеиновите киселини. Тези приложения обаче изискват широкомащабно секвениране на нуклеинови киселини и правят изключително желани високопроизводителните методи за секвениране на нуклеинови киселини.
Методите за севениране на нуклеинова киселина са документирани в областта. Два от най-широко използваните, са техниката на Махат и Gilbert за химично разграждане, която се базира на химичната специфичност на базите и по-популярната днес техника за секвениране на Sanger, която се базира на принципа ензимно верижна терминация и която днес се използва като рутинна за секвениране на нуклеинови киселини.
При секвениране по Sanger, всяка нуклеинова киселина за да се секвенира, се реплицира в реакция включваща ДНК полимераза, дезоксинуклеотид трифосфати (dNTPs) и дидезоксинуклеотид трифосфати (ddNTPs). ДНК полимеразата може да включва както dNTPs, така и ddNTPs в растящата ДНК верига. Обаче, след като веднъж вече се е включил ddNTP, 3’ краят на растящата ДНК верига губи хидроксилна група и вече не е субстрат за удължаване на веригата, което води до завършване на веригата от нуклеинова киселина. Следователно, в отделна реакция включваща един вид ddNTP, се получава смес от нуклеинови киселини с различни дължини, всички завършващи със същия ddNTP. Обикновено се провеждат отделни реакции за всеки от четирите вида ddNTP и се анализира разпределението на получените фрагменти от нуклеинови киселини с различни дължини, чрез електрофореза в денатуриращ гел (който разделя фрагментите от нуклеинови киселини, според техния размер), или съвсем отскоро чрез мас-спектроскопия. Обикновено, един или повече от дезоксинуклеотид трифосфатите в
реакционната смес се бележат, което позволява откриване на фрагментите с различни дължини.
По-горе описаните методи имат недостатък, защото всяка нуклеинова киселина, за да се секвенира трябва да се обработи индивидуално по време на биохимичната реакция. Гел електрофорезата е един по-тежък метод, изискващ доста усилия и протича бавно, дори когато се използва капилярна електрофореза и не е подходящ за широкомащабно секвениране. В допълнение, последващото определяне на секвенцията е затруднено. Масспектроскопията все още е в един начален етап, изискващ много скъпо струваща апаратура и всяка проба трябва да се анализира индивидуално.
Един от пътищата за увеличаване на производителността е да се обработват успоредно много проби. Прилагат се методи използващи ДНК хибридизация на сонди от нуклеинови киселини, които позволяват мултиплициране на процеса, по време на биохимичните и електрофоретични процеси, но за сметка на допълнително удължени манипулации.
Съвсем наскоро се появиха надеждни методи, базиращи се на ДНК чипове и ДНК хибридизация (Thomas and Burke Exp. Opin. Ther. Патенти 8: 503-508 (1998)). Тези методи обаче имат недостатък, защото при вегко приложение ДНК чипът трябва найнапред да се конструира и да се произведе: това е дълга операция и цената на отделния чип спада само тогава, когато е необхидимо да се произведат голям брой чипове. Освен това, чиповете не могат да се използват повторно и за всеки чип се използва само една проба от нуклеинови киселини, например за да се диагностицира един пациент, това е един непрекъснат процес. Най-накрая, размерът на секвенцията, която може да бъде анализирана чрез такъв чип, е лимитиран до по-малко от 100 000 бази и има ограничени
приложения, такива като генотипиране на ДНК и профилиране на генна експресия.
При най-известните техники за анализ на секвенции на нуклеинови киселини, необходимо условие за получаване на достатъчно количество нуклеинови киселини за анализ, е амплификацията на интересуващите ни нуклеинови киселини.
Добре известни и описани в областта са няколко метода за амплификация на нуклеинови киселини. Например, нуклеиновите киселини могат да се амплифицират чрез вмъкване на интересуващата ни нуклеинова киселина в експресионен векторен конструкт. След това, такива вектори могат да бъдат включени в клетки на подходящ биологичен гостоприемник и векторната ДНК, включваща интересуващата ни нуклеинова киселина се амплифицира, чрез култивиране на биологичния гостоприемник, като се използват установени протоколи.
Амплифицираните чрез тези методи нуклеинови киселини могат да се изолират от клетките гостоприемник, чрез методи добре познати и описани в областта. Недостатък на тези методи обаче е, че те обикновено изискват много време, интензивна работа и са трудни за автоматизиране.
Техниката за амплифициране на ДНК чрез полимеразно верижна реакция (PCR) беше открита през 1985 г. (Saiki et al. Science 230, 1350-1354) и днес е един много известен и широко използван метод. Интересуващият ни фрагмент нуклеинова киселина може да се амплифицира като се използват две къси олигонуклеотидни секвенции (обикновено означени като праймери), които са специфични за известни последователности, фланкиращи ДНК сенквенцията, която ще се амплифицира. Праймерите хибридизират с противоположните вериги на двойноверижния ДНК фрагмент, след като той се денатурира и се ориентират така, че ДНК синтезата
от ДНК полимеразата се извършва в областта между двата праймера, като праймерните секвенции се удължават чрез постепенното включване на нуклеотиди от полимеразата. Продължителността на реакцията води до получаването на два двойно верижни участъка, всеки един от които може веднага да бъде денатуриран за втори цикъл на хибридизация и удължаване. Третият цикъл води до получаване на две двойноверижни молекули, които включват точно интересуващия ни участък в двойноверижна форма. Като се повтарят тези цикли на топлинна денатурация, хибридизация на праймерите и удължаване, следва бързо експоненциално натрупване на специфичния прицелен ДНК фрагмент. Обикновено този метод се провежда в разтвор и ам ллифицираният прицелен фрагмент от нуклеинова киселина се пречиства от разтвора, чрез методи добре познати на специалистите в областта, например чрез гел електрофореза.
Обаче неотдавна бяха открити методи, които използват един праймер прикрепен към повърхност, конюгиран със свободни праймери в разтвор. Тези методи позволяват едновременно амплифициране и прикрепване на PCR продукта върху повърхността (Oroskar, A. A. et al., Clinical Chemistry 42: 1547 (1996)).
W096/04404 и WO98 /36094 (Mosaic Technologies, Inc. et al) описват метод за откриване на прицелна нуклеинова киселина в проба, която вероятно съдържа тази нуклеинова киселина. Методът включва индукция на PCR, на базата на амплификация на прицелната нуклеинова киселина само тогава, когато прицелната нуклеинова киселина присъства в пробата за анализ. За амплификацията на прицелната секвенция, двата праймера се прикрепват към твърда подложка, което води до амплифициране на прицелните секвенции от нуклеинова киселина, които се прикрепват също към твърдата подложка. Описаната в този документ техника за
амплификация се означава като “мостова амплификация”. При тази техника двата праймера са конструирани специфично, както при конвенционалния PCR така, че те фланкират специфичната прицелна ДНК секвенция, която ще се амплифицира. Следователно, ако в пробата присъства специфичната прицелна нуклеинова киселина, то тази нуклеинова киселина може да хибридизира с праймерите и да се амплифицира чрез PCR. Първият етап в този процес на PCR амплификация, е хибридизация на прицелната нуклеинова киселина с първия специфичен праймер, прикрепен към подложката (“праймер 1”). След това, чрез удължаване на праймер 1 секвенцията, се формира първият амплификационен продукт, който е комплиментарен на прицелната нуклеинова киселина. Когато подложката се постави при денатуриращи условия, прицелната нуклеинова киселина се освобождава и може да участва по-нататък в следващите реакции на хибридизация с други праймерни 1 секвенции, които могат да бъдат прикрепени към подложката. След това, първият амплификационен продукт, който е прикрепен към подложката може да хибридизира с втори специфичен праймер (“праймер 2”), прикрепен към подложката и чрез удължаване на праймер 2 секвенцията, може да се получи втори амплификационен продукт, включващ секвенция от нуклеинова киселина комплиментарна на първия амплификационен продукт, който също така е прикрепен къ^т подложката. Така прицелната нуклеинова киселина и първият и вторият амплификационен продукт са способни да участват в многократни процеси на хибридизация и удължаване, лимитирани само от първоначалното присъствие на прицелната нуклеинова киселина и от броя на първоначално присъстващите праймер 1 и праймер 2 секвенции, като резултатът е голям брой копия от търсената секвенция, прикрепени към повърхността.
Тъй като при провеждането на този метод, амплификационни продукти се образуват само, ако присъства прицелната нуклеинова киселина, то контрола на годложката за присъствие или отсъствие на един или повече амплификационни продукти е показателен за присъствието или отсъствието на специфичната прицелна секвенция.
Може да се използва мозаичната техника, за да се получи многократно количество, при което могат едновременно да се амплифицират няколко различни прицелни секвенции от
нуклеинови киселини, чрез подреждане на различни групи от първи или втори праймер, специфични за всяка различна прицелна секвенция от нуклеинова киселина, върху различни области от твърдата подложка.
Недостатъкът на мозаичният метод е, че той може да се използва за амплифициране само на познати секвенции, тъй като секвенциите на първия и втория праймер, трябва да са специфични за всяка прицелна нуклеинова киселина, която ще се амплифицира. В допълнение, производителността е ограничена от броя на различните групи специфични праймери и последващото амплифициране на прицелните молекули от нуклеинови киселини, които могат да се натрупват в отделни участъци на дадена твърда подложка и времето необходимо за натрупване на нуклеиновите киселини в отделните участъци. Мозаичният метод изисква също така 2 различни праймера да са прикрепени хомогенно чрез 5’ края към подложката в различен участък, където се образува амплификационния продукт. За сега това не може да се постигне с наличната ДНК чип производствена технология, а трябва да се постигне чрез други средства за разпределяне на пробата. Следователно, плътността която може да се постигне чрез този подход също е ограничена, както и при редица други класически
MHi
.u.—
технологии. Друг лимитиращ фактор е скоростта за контрол на отделните различни области от подложката, за присъствие или отсъствие на амплифицираните прицелни нуклеинови киселини.
Класическото подреждане на ДНК проби е върху мембрани (например, найлонови или нитро-целулозни мембрани). Използването на подходящи роботи (например, Q-bot™, Genetix Ltd, Dorset BH23 3TG UK) означава, че е възможно да се получи плътност до 10 проби/mm . При тези методи ДНК е свързана ковалентно с мембрана по физикохимичен път (например, UV лъчи) и е възможно подреждането на големи ДНК молекули (например молекули дълги над 100 нуклеотида) както и на по-малки ДНК молекули, такива като олигонуклеотидни праймери.
Известни са и други техники, при които може да се получи повисока плътност при подреждане на олигонуклеотиди. Например, подходи базиращи се на предварително подредени предметни стъкла, върху които се получават участъци от реактивни области чрез инжекционна технология (Blanchard, А. Р. and L. Hood, Microbial and Comparative Genomics, 1:225 (1996)) или серии от реактивни полиакриламидни гелове (Yershov, G. et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 93:4913-4918 (1996)) позволяващи на теория подреждането до 100 проби/mm2.
Чрез използване на ДНК чипове все още могат да се получават проби с по-високи плътности (Fodor, S. Р. A. et al., Science, 251:767 (1991)). Наскоро в молекулярно-биологичните технологии са използвани чипове с 625 олигонуклеотидни сонди/mm2 (Lockhard, D. J. et al., Nature Biotechnology, 14:1675 (1996)). Твърди се, че е възможно да се постигне плътност на сондите до 250 000 проби/ст2 (2500/тт2) (Chee, М. et al., Science, 274:610 (1996)). Обаче понастоящем могат да се подреждат до 132 000 различни олигонуклеотиди върху отделни чипове, с размери приблизително
2.5 cm2. Особено важно е, че тези чипове се произвеждат по такъв начин, че 3’ ОН края на олигонуклеотида е прикрепен към твърдата повърхност. Това означава, че олигонуклеотидите прикрепени по този начин към чиповете не могат да се използват като праймери за амплификация в PCR реакцията.
Особено важно е, че когато PCR продуктите са свързани със съда в който става PCR амьлификацията, плътността на полученото количество PCR продукти зависи от големината на съда. Понастоящем такива налични съдове са само микротитърните плата с формат 96 ямки. Това позволява да се получат само около 0.02 проби от PCR продукти/mm по повърхността.
Например, чрез използване на наличната в търговската мрежа Nucleolink™ система (Nunc A/S, Roskilde, Denmark) е възможно да стане едновременно амплификация и натрупване на проби с плътност от 0.02 проби/mm в ямките, по повърхността на които са прикрепени олигонуклеотидни праймери. Обаче технически проблеми означава, че е малко вероятно с този подход да се получи значително увеличаване на плътността в тази проба.
Следователно ясно е, че за да се увеличи производителността, в областта са необходими нови методи за амплификация на нуклеинови киселини, които ще позволят едновременното амплифициране и натрупване на проби от нуклеинови киселини с по-висока плътност, а това ще осигури по-бърз контрол на пробите, при това паралелен.
В допълнение, очевидно е, че в областта са необходими нови методи за секвениране, които ще позволят да се произвеждат и секвенират паралелно голям брой проби, т.е. необходими са методи за секвениране, които ще позволят до голяма степен многократна възпроизводимост на процеса. От друга страна, значителната степен на възпроизводимост на процеса секвениране, ще доведе до по10 широкомащабно производство, отколкото това е постигнато с методите за секвениране, познати на специалистите в областта. Тези нови методи ще бъдат дори по предпочитани, ако чрез тях може да се постигне широкомащабно секвениране при разумни разходи и с по-малко усилия, отколкото конвенционалните техники за секвениране.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящото изобретение описва нови методи за твърдо-фазова амплификация на нуклеинова киселина, които позволяват да се натрупват и амплифицират едновременно голям брой различин секвенции от нуклеинови киселини с висока плътност. Изобретението описва също така методи, чрез които могат да се контролират бързо и по желание паралелно, голям брой различни секвенции от амплифицирани нуклеинови киселини. Изобретението описва също така методи, чрез които могат да се определят едновременно секвенциите на голям брой различни нуклеинови киселини и то за кратък период от време. По-специално методите са особено полезни за, без да се ограничават до, секвениране на цял геном, или случаи при които трябва да се секвенират едновременно много гени (например 500) от много индивиди (например 500), или за едновременна оценка на голям брой (например милиони) полиморфизми, или за контрол на едновременно експресиращи се голям брой гени (например, 100, 000).
Следователно, настоящото изобретение осигурява метод за амплификация поне на една нуклеинова киселина, включващ следните етапи:
(1) създаване поне на една матрица нуклеинова киселина, включваща нуклеиновата киселина(и), която ще се амплифицира, където споменатата нуклеинова киселина(и) съдържа в 5’ края си олигонуклеотидна секвенция Y, а в 3’ края си олигонуклеотидна секвенция Z и в допълнение, нуклеиновата киселина(и) носи в 5 'края си средство, за прикрепване на нуклеиновата киселина(и) към твърда подложка;
(2) смесване на споменатата матрица(и) нуклеинова киселина с един или повече специфични праймери X, които могат да хибридизират с олигонуклеотидната секвенция Z и носеща в 5’ края си средство за прикрепване на специфичните праймери към твърда подложка, в присъствието на твърда подложка така, че 5’ краищата и на матрицата нуклеинова киселина и на специфичните праймери се свързват с твърдата подложка;
(3) провеждане на една или повече реакции за амплификация на нуклеинова киселина върху свързаната матрица(и) така, че да се образуват колонии от нуклеинови киселини.
В друг вариант от изобретението, два различни специфични праймера X се смесват с матрицата(те) нуклеинова киселина в етап (2) от метода. За предпочитане е секвенциите на специфичните праймери X да са такива, че олигонуклеотидната секвенция Z да може да хибридизира с един от специфичните праймери X, а олигонуклеотидната секвенция Y да е същата, като на един от специфичните праймери X.
В алтернативен вариант от изобретението, олигонуклеотидната секвенция Z е комплиментарна на олигонуклеотидна секвенция Y, която се означава като Y’, а специфичният праймер X е със същата секвенция, като тази на олигонуклеотидна секвенция Y.
В друг вариант от изобретението, специфичният праймер X може да включва дегенеративна праймерна секвенция, а матрицата(те) нуклеинова киселина включва нуклеиновата
киселина(и), за амплифициране и не съдържа олигонуклеотидни секвенции Y или Z, съответно в 5’ и 3’ краищата си.
В друг вариант от изобретението, методът включва допълнителен етап на провеждане, поне един етап, за определяне на секвенция в една или повече от образувалите се в етап (3) колонии от нуклеинови киселини.
Следователно, изобретението осигурява също така метод за секвениране поне на една нуклеинова киселина, включващ следните етапи:
(1) създаване поне на една матрица нуклеинова киселина, включваща нуклеиновата киселина(и), която ще се секвенира, където споменатата нуклеинова киселина(и) съдържа в 5’ края си олигонуклеотидна секвенция Y, а в 3’ края си олигонуклеотидна секвенция Z и в допълнение, нуклеиновата киселина(и) носи в 5 'края си средство за прикр зпване на нуклеиновата киселина(и) към твърда подложка;
(2) смесване на споменатата матрица(и) нуклеинова киселина с един или повече специфични праймери X, които могат да хибридизират с олигонуклеотидната секвенция Z и носеща в 5’ края си средство за прикрепване на специфичните праймери към твърда подложка, в присъствието на твърда подложка така, че 5’ краищата и на матрицата нуклеинова киселина и на специфичните праймери се свързват с твърдата подложка;
(3) провеждане на една или повече реакции за амплификация на нуклеинова киселина върху свързаната матрица(и) така, че да се образуват колонии от нуклеинови киселини; и (4) провеждане поне на един етап за определяне на секвенция, поне на една от образувалите се колонии нуклеинови киселини.
В друг вариант от изобретението, 5’ краищата и на матрицата(те) нуклеинова киселина и на специфичните праймери
притежават средство за ковалентно прикрепване на секвенциите от нуклеинови киселини към твърдата подложка. За предпочитане е това средство за ковалентно прикрепване да е химически модифицирана функционална група, например такава като, фосфатна група, карбоксилна или алдехидна група, тиолова, хидроксилна, диметоксилтритил (DMT), или амино група, за предпочитане амино група.
Нуклеиновите киселини, които могат да се амплифицират съгласно методите от изобретението включват ДНК, например, геномна ДНК, кДНК, рекомбинантна ДНК или каквато и да е синтетична или модифицирана форма на ДНК, РНК, иРНК или каквато и да е синтетична или модифицирана форма на РНК. Споменатите нуклеинови киселини могат да варират по дължина и могат да бъдат фрагменти или малки части от големи молекули нуклеинови киселини. За предпочитане е нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира, да е с дължина поне 50 нуклеотидни двойки, а още по-добре да е с дължина от 150 до 4000 нуклеотидни двойки. Нуклеиновите киселини, които ще се амплифицират могат да имат известна или неизвестна секвенция и могат да бъдат едноверижни или двойноверижни. Нуклеиновите киселини, които ще се амплифицират могат да са получени от всеки източник.
Използваният тук термин “матрица нуклеинова киселина”, се отнася до единица, която включва нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира или секв?нира в едноверижна форма. Както се подчертава по-долу, нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира или секвенира може да бъде и в двойноверижна форма. Следователно, “матрици нуклеинови киселини” от изобретението могат да бъдат едноверижни или двойноверижни нуклеинови киселини. Матриците нуклеинови киселини използвани в метода от изобретението, могат да имат различна дължина. За предпочитане е те да са с дължина поне 50 нуклеотидни двойки, а още по-добре е, да са с дължина от 150 до 4000 нуклеотидни двойки. Нуклеотидите изграждащи матриците нуклеинови киселини могат да са естествени или да нг са естествено срещащи се в природата нуклеотиди. Матриците нуклеинови киселини от изобретението включват не само нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира, но в допълнение могат да включват в 5’ и 3’ края си къси олигонуклеотидни секвенции. Олигонуклеотидната секвенция съдържаща се в 5’ края се означава тук като Y. Олигонуклеотидната секвенция Y е с известна последователност и може да е с различна дължина. Предимно олигонуклеотидната секвенция Y, която се използва в методите от настоящото изобретение, е с дължина поне пет нуклеотида, за предпочитане е да е с дължина между 5 и 100 нуклеотида, а още по-добре, с дължина приблизително 20 нуклеотида. В олигонуклеотидната секвенция Y могат да присъстват естествено и не-естествено срещащи се нуклеотиди. Както е посочено по-горе, за предпочитане е олигонуклеотидната секвенция Y да е същата, като секвенцията на специфичния праймер X. Олигонуклеотидната секвегция съдържаща се в 3’ края на матриците нуклеинови киселини от изобретението, се означава тук като Z. Олигонуклеотидната секвенция Zee известна последователност и може да е с различна дължина. Предимно олигонуклеотидната секвенция Z, която се използва в методите от настоящото изобретение, е с дължина поне пет нуклеотида, за предпочитане е да е с дължина между 5 и 100 нуклеотида, а още подобре е, да е с дължина приблизително 20 нуклеотида. В олигонуклеотидната секвенция Z могат да присъстват естествено и не-естествено срещащи се нуклеотиди. Олигонуклеотидната секвенция Z е конструирана така, че да хибридизира с един от специфичните праймери X, но тя е конструирана предимно така, че да е комплиментарна на олигонуклеотидната секвенция Y, обозначена тук като Y’. Не е необходимо олигонуклеотидните секвенции Y и Z, съдържащи се респективно в 5’ и 3’ края на матрицата нуклеинова киселина, да са локализирани в най-крайните точки на матрицата. Например, въпреки че олигонуклеотидните секвенции Y и Z са разположени предимно в, или близо до 5’ и 3’ краищата (или крайните точки) респективно на матриците нуклеинови киселини (например, от 0 до 100 нуклеотида в 5’ и 3’ крайните точки), те moi ат да бъдат локализирани по-далеч (например повече от 100 нуклеотида) от 5’ или 3’ крайните точки на матрицата нуклеинова киселина. Следователно олигонуклеотидните секвенции Y и Z могат да бъдат разположени в която и да е позиция на матрицата нуклеинова киселина, което позволява секвенциите Y и Z да са от двете страни, т.е. да фланкират секвенцията от нуклеинова киселина, коятс ще се амплифицира.
Използваният тук термин “матрица нуклеинова киселина”, се отнася също така до единица, която включва нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира или секвенира в двойноверижна форма. Когато матрицата нуклеинова киселина е двойноверижна, тя съдържа в 5’ и 3’ краищата си в една от веригите респективно олигонуклеотидните секвенции Y и Z. Другата верига, поради правилото за допълнителност на базите в ДНК, е комплиментарна на веригата, съдържаща олигонуклеотидните секвенции Y и Z и следователно съдържа олигонуклеотидна секвенция Z’ в 5’ края и олигонуклеотидна секвенция Y’ в 3’ края.
Използваният тук термин “специфичен праймер”, се отнася до единица, която включва олигонуклеотидна секвенция, способна да хибридизира с комплиментарна секвенция и да инициира специфична полимеразна реакция. Секвенцията включваща специфичният праймер се избира така, че да има максимална
хибридизационна активност с нейната комплиментарна последователност и много ниска, неспецифична хибридизационна активност с която и да е друга последователност. Секвенцията която ще се използва като специфичен праймер, може да включва която и да е последователност, но включва предимно 5’- AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG или
5’ - САССААСССАААССААСССАААСС . Специфичният праймер може да е с дължина от 5 до 100 бази, но за предпочитане е, да е с дължина от 15 до 25 бази. В праймера могат да присъстват естествено срещащи се нуклеотиди и такива, които не се срещат в природата. В методите от настоящото изобретение могат да се използват един или два различни специфични праймера, за да се получат колонии от нуклеинови киселини. Специфичните праймери, които се използват в настоящото изобретение, могат да съдържат също така дегенеративни праймерни секвенции.
Използваният тук термин “дегенеративни праймерни секвенции”, се отнасят до къса олигонуклеотидна последователност, която е способна да хибридизира с който и да е фрагмент нуклеинова киселина, независимо от секвенцията на споменатия фрагмент нуклеинова киселина. Следователно, такива дегенеративни праймери не изискват присъствието на олигонуклеотидни секвенции Y или Z в матрицата(те) нуклеинова киселина, за да хибридизират с матрицата, въпреки че не се изключва използването на дегенеративни праймери за хибридизация с матрица, съдържаща олигонуклеотидните секвенции X или Y. Ясно е обаче, че за да се използват в методите за амплификация от настоящото изобретение, дегенеративните праймери трябва да хибридизират със секвенциите от матрицата нуклеинова киселина в в места или място, или флянкирайки секвенцията от нуклеинова киселина, която ще се амплифицира.
Използваният тук термлн “твърда подложка”, се отнася до всяка твърда повърхност, към която нуклеиновите киселини могат да бъдат прикрепени ковалентно, например такава като латексни гранули, декстранови гранули, полистирен, полипропиленова повърхност, полиакриламиден гел, златни повърхности, стъклени повърхности и силиконови лепенки. Предпочитана твърда подложка е стъклената повърхност.
Използваният тук термин “средство за прикрепване на нуклеинови киселини към твърда подложка”, се отнася до всеки химичен или не-химичен метод за прикрепване, включващ химически модифицирани функционални групи. “Прикрепване”, се отнася до имобилизиране на нуклеинова киселина върху твърди подложки или чрез ковалентно прикрепване или чрез необратима пасивна адсорбция, или чрез афинитет между молекули (например, имобилизиране върху покрита с авидин повърхност чрез биотинилирани молекули). Прикрепването трябва да е достатъчно силно, така че то да не се променя при промиване с вода или воден буфер при ДНК-денатуриращите условия.
Използваният тук термин “химически модифицирана функционална група”, се отнася до група, например такава като, фосфатна група, карбоксилна или алдехидна група, тиолова или амино група.
Използваният тук термин “колония нуклеинова киселина”, се отнася до дискретна област, включваща многократни копия от веригата на нуклеиновата киселина. В същата колония могат да присъстват също така многократни копия от комплиментарната на нуклеиновата киселина верига. Обикновено, многократните копия от веригите на нуклеиновите киселини, които изграждат колониите, са имобилизирани върху твърда подложка и могат да са в едноверижна или двуверижна форма. Образуваните колонии от нуклеинови киселини от изобретението, могат да имат различни размери и плътности, в зависимост от условията, които се използват. За предпочитане е размерът на колониите да е от 0.2 μτη до 6 μιη, а още по-добре от 0.3 μιη до 4 μιη. Типичната плътност на колониите от нуклеинови киселини използвана в метода от изобретението, е от 10, 000/mm до 100, 000/mm . Счита се, че могат да се получат и повисоки плътности, например от 100, 000/mm до 1, 000, 000/mm и от 1, 000, 000/mm2 до 10, 000, 000/mm2.
Методите от изобретението могат да се използват за получаване на колонии от нуклеинови киселини. Следователно друг вариант от настоящото изобретение, осигурява една или повече колонии от нуклеинови киселини. Съгласно изобретението, колония от нуклеинова киселина може да се получи от една единствена имобилизирана матрица нуклеинова киселина от изобретението. Методът от изобретението позволява едновременно получаване на голям брой такива колонии от нуклеинови киселини, всяка от които може да съдържа различни имобилизирани вериги от нуклеинова киселина.
Следователно един друг вариант от изобретението, осигурява множество матрици нуклеинова киселина, включващи нуклеиновите киселини за амплифициране, където споменатите нуклеинови киселини съдържат в техните 5’ краища олигонуклеотидна секвенция Y, а в 3’ края олигонуклеотидна секвенция Z и в допълнение, нуклеиновата киселина(и) носи в 5’ края си средство за прикрепване на нуклеиновата киселина(и) към твърда подложка. Този голям брой от матрици нуклеинови киселини се смесват предимно с голям брой специфични праймери X, които могат да хибридизират с олигонуклеотидната секвенция Z и носят в 5’ края си средство за прикрепване на специфичните праймери към твърда подложка. За предпочитане е споменатото множество от матрици
Ml нуклеинови киселини и специфични праймери да са ковалентно свързани с твърдата подложка.
В друг вариант от изобретението, множество от два различни специфични праймера X се смесват с множество матрици нуклеинови киселини. За предпочитане е секвенциите на специфичните праймери X да са такива, че олигонуклеотидната секвенция Z да може да хибридизира с един от специфичните праймери X, а олигонуклеотидната секвенция Y да е същата, като секвенцията на един от специфичните праймери X.
В алтернативен вариант, олигонуклеотидната секвенция Z е комплиментарна на олигонуклеотидната секвенция Υ, (Y’), а поголемият брой специфични праймери X са със същата секвенция като олигонуклеотидната секвенция Y.
В друг вариант, по-голяма част от специфичните праймери X могат да включват дегенеративна праймерна секвенция, а по-голяма част от матриците нуклеинова киселина включват нуклеиновите киселини за амплифициране и не съдържат олигонуклеотидни секвенции Y или Z, респективно в 5’ и 3’ краищата си.
Матриците нуклеинови киселини от изобретението могат да се приготвят като се използват стандартни или конвенционални техники, познати в областта. Обикновено те се базират на генетично инженерните техники.
Нуклеиновите киселини, които ще се амплифицират, могат да се получат като се използва^ методи добре познати и документирани в областта. Например, за получаване на проба нуклеинова киселина, като тотална ДНК, геномна ДНК, кДНК, тотална РНК, иРНК и т.н., чрез методи известни и документирани в областта и за получаване на техни фрагменти, например чрез разграждане с рестриктазен ензим или чрез механични средства.
Обикновено, нуклеиновите киселини, които ще се амплифицират трябва да бъдат най-напред в двойноверижна форма. Когато се използва нуклеинова киселина в едноверижна форма, например иРНК, тя се превръща най-напред в двойноверижна форма, чрез добре известни и документирани в областта методи, например, като се използват олиго-dT праймери и обратна транскриптаза и ДНК полимераза. След като вече нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира е получена в двойно верижна форма с подходяща дължина, олигонуклеотидните секвенции, отговарящи на олигонуклестидните секвенции Y и Z се свързват с всеки край, т.е. с двата 5’ и 3’ края от последователността на нуклеиновата киселина, за да се образува матрица нуклеинова киселина. Това може да стане, като се използват методи, които са добре познати и документирани в областта, например чрез лигиране, или чрез вмъкване на нуклеиновата киселина, която трябва да се амплифицира в биологичен вектор, в място, което е фланкирано с подходящите олигонуклеотидни секвенции. Съответно, ако е известна поне част от секвенцията на нуклеиновата киселина, която е за амплифициране, то тогава може да се получи матрица нуклеинова киселина, съдържаща олигонуклеотидни секвенции Y и Z, респективно в 5’ и 3’ краищата си чрез PCR, като се използват подходящи PCR праймери, които включват секвенции, специфични за нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира. Преди прикрепване на матрицата нуклеинова киселина към твърдата подложка, тя може да бъде превърната в едноверижна форма, като се използват методи, които са добре познати и документирани в областта, например чрез нагряване приблизително до 94° С и бързо охлаждане до 0° С върху лед.
Олигонуклеотидната секвенция съдържаща се в 5’ края на нуклеиновата киселина, може да бъде всяка секвенция, с каквато и да е дължина и тук се означава като Y секвенция. Като се използват добре познати и документирани в областта методи, могат да се подбират подходящи дължини и секвенции от оликонуклеотиди. Например, олигонуклеотидните секвенции прикрепени към всеки край на нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира, обикновено са относително къси нуклеотидни секвенции, с дължина между 5 и 100 нуклеотида. Олигонуклеотидната секвенция съдържаща се в 3’ края на нуклеиновата киселина, може да бъде всяка секвенция, с каквато и да е дължина и тук се означава като Z секвенция. Като се използват добре познати и документирани в областта методи, могат да се подбират подходящи дължини и секвенции от олигонуклеотиди. Например, олигонуклеотидните секвенции съдържащи се във всеки край на нуклеиновата киселина, която ще се амплифицира, обикновено са относително къси нуклеотидни секвенции, с дължина между 5 и 100 нуклеотида.
Последователността на олигонуклеотидната секвенция Z е такава, че тя може да хибридизира с един от специфичните праймери X. За предпочитане е последователността на олигонуклеотидната секвенция Y да е такава, че тя да е същата като на един от специфичните праймери X. Още по-добре е олигонуклеотидната секвенция Z да е комплиментарна на олигонуклеотидната секвенция Υ (Y’), а специфичните праймери X да са със същата секвенция, като тази на олигонуклеотидната секвенция Y.
Олигонуклеотидните секвенции Y и Z от изобретението могат да се приготвят, като се използват стандартните или конвенционални техники в областта, или могат да бъдат закупени от търговски източници.
Когато се получават матрици нуклеинови киселини от изобретението, по желание могат да се включват допълнителни секвенции, чрез методи добре познати и документирани в областта. Такива допълнителни секвенции включват например, рестриктазни ензимни места или някои краища от нуклеинова киселина, позволяващи да се идентифицират амплифицираните продукти на дадена последователност от матрицата нуклеинова киселина. Други желани секвенции включват обратно-обърнати ДНК секвенции (които образуват фуркетни примки или други вторични структури, когато са представени в едноверижни форми), “контролни” ДНК секвенции, които управляват белтък/ДНК взаимодействията, например такива като промоторна ДНК секвенция, която се разпознава от полимераза на нуклеинова киселина или ДНК секвенция-оператор, която се разпознава от свързващ се с ДНК белтък.
Ако има множество секвенции от нуклеинови киселини за амплифициране, тогава в същата или в различна реакция може да се проведе прикрепване на олигонуклеотидите Y и Z.
След като веднъж вече е приготвена матрицата нуклеинова киселина, тя може да бъде амплифицирана преди да бъде използвана в методите от настоящото изобретение. Амплификацията може да се проведе, като се използват методи добре познати и документирани в областта, например чрез вмъкване на матрицата нуклеинова киселина в експресионен вектор и амплифицирането и в подходящ биологичен гостоприемник, или амплификация чрез PCR. Това амплификационно стъпало не е съществено обаче, тъй като методът от изобретението позволява да се получат много копия от матрицата нуклеинова киселина, като *:олония нуклеинови киселини, получени от единично копие на матрицата нуклеинова киселина.
Предимно 5’ края на матрицата нуклеинова киселина, приготвен както е описано по-горе, е модифициран да носи средство за ковалентно прикрепване на матриците нуклеинова киселина към твърда подложка. Такова средство може да бъде например, химически модифицирана функционална група, такава като фосфатна група, карбоксилна или алдехидна група, тиолова или амино група. Най-добре е за модифициране на 5’ края на нуклеиновата киселина да се използват тиолова, фосфатна или амино група.
Специфичните праймери от изобретението могат да се приготвят, като се използват стандартните или конвенционални техники в областта. Обикновено, специфичните праймери от изобретението могат да бъдат синтетични олигонуклеотиди, получени чрез методи добре познати и документирани в областта, или могат да бъдат закупени от търговски източници.
Съгласно метода от изобретението, за амплификация за всяка секвенция нуклеинова киселина, могат да се използват един или два различни специфични праймера X. По-този начин методът се различава и има предимства в сравнение с много известни в областта методи за амплифициране, например като тези описани в WO 96/04404, където за всяка отделна секвенция нуклеинова киселина, която ще се амплифицира трябва да се конструират различни специфични праймери.
Предимно 5’ краищата на специфичните праймери X от изобретението са модифицирани да носят средство за ковалентно прикрепване на специфичните праймери към твърда подложка. За предпочитане е това средство за ковалентно прикрепване да е
I химически модифицирана функционална група, както е описано погоре. Ако е необходимо, специфичните праймери могат да бъдат конструирани да включват по желание допълнителни секвенции, например такива като рестриктазни ендонуклеазни места или други видове места за късане, като места за късане от рибозими.
Други желани секвенции включват обратно-обърнати ДНК секвенции (които образуват фуркетни примки или други вторични структури, когато са представени в едноверижни форми), “контролни” ДНК секвенции, които управляват белтък/ДНК взаимодействието, например такива като промоторна ДНК секвенция, която се разпознава от полимераза на нуклеинова киселина или ДНК секвенция-оператор, която се разпознава от свързващ се с ДНК белтък.
Имобилизирането на специфичен праймер X към подложка чрез 5’ края остава неговия 3’ край свободен от подложката, така че специфичният праймер е способен да удължава веригата чрез полимераза, след като вече е станала хибридизацията с комплиментарната олигонуклеотидна секвенция, съдържаща се в 3’ края на матрицата нуклеинова киселина.
След като вече са синтезирани матриците нуклеинови киселини и специфичните праймери от изобретението, те се смесват заедно в подходящи пропорции така, че когато се прикрепят към твърдата подложка, се получават прикрепени матрици нуклеинови киселини и специфични праймери с подходяща плътност. За предпочитане е пропорцията на специфичните праймери в сместа да е по-висока, отколкото пропорцията на матриците нуклеинови киселини. Съотношението специфични праймери към матрици нуклеинови киселини предимно е такова, че когато специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини се имобилизират към твърдата подложка, се образува “площ” от специфични праймери, включваща множество специфични праймери, локализирани с приблизително еднаква плътност върху цялата или определена област от твърдата подложка, с една или повече матрици нуклеинова киселина, имобилизирани поотделно, на интервали в площта от специфични праймери.
Матриците нуклеинова киселина могат да се доставят в едно верижна форма. Обаче, те могат да бъдат доставени изцяло или отчасти в двойноверижна форма, модифицирани или в единия 5’ край или в двата 5’ края така, че да стане възможно прикрепването им към твърдата подложка. В този случай, след завършване на процеса прикрепване, веригите могат да се разделят чрез средства известни в областта, например чрез загряване до 94° С, преди да се промият освободените вериги. Ясно е, че в случая когато двете вериги от двойноверижните молекули реагират с повърхността, и са прикрепени към нея, резултатът ще е същия, както и в случая, когато само едната верига е прикрепена и е проведено едно амплификационно стъпало. С други думи, в случая когато двете вериги от двойноверижната матрица нуклеинова киселина са прикрепени, необходимо е двете вериги да са прикрепени близо една до друга и резултатът да не се различават от този, при прикрепване само на едната верига и провеждането на едно амплификационно стъпало. Следователно, могат да се използват едноверижни и двойноверижни матрици нуклеинови киселини, за да се осигурят матрици нуклеинови киселини, прикрепени към повърхността и подходящи за получаване на колония.
Разстоянието между отделните специфични праймери и отделните матрици нуклеинови киселини (а следователно плътността на специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини) може да се контролира като се променя концентрацията на специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини, които са имобилизирани към подложката. Предпочитана плътност за специфичните праймери е поне 1 fmol/mm , по-добре поне 10 fmol/mm2, а още по-добре между 30 до 60 fmol/mm2. Типичната плътност на матриците нуклеинови киселини, които се използват в метода от изобретението е 10, 000 /тт2 до 100, 000/тт2. Счита се, че е възможно да се получат по-високи плътности, например от 100, 000/mm2 до 1, 000, 000/mm2 и от 1, 000, 000/mm2 до 10, 000, 000/mm2.
От друга страна, .сато се контролира плътността на прикрепените матрици нуклеинови киселини и специфичните праймери, може да се контролира крайната плътност на колониите от нуклеинови киселини по повърхността на подложката. Това се дължи на факта, че съгласно метода от изобретението от прикрепването на една матрица нуклеинова киселина, може да се получи една колония ю клеинова киселина при условие, че специфичните праймери от изобретението присъстват в подходящо място върху твърдата подложка (за по-големи подробности виж подолу). Плътността на молекулите от нуклеинова киселина в отделна колония може да се контролира също така, чрез контролиране на плътността на прикрепените специфични праймери.
След като вече специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини от изобретението са имобилизирани върху твърдата подложка с подходяща плътност, могат да се образуват колонии от нуклеинови киселини от изобретението, чрез провеждане на подходящ брой цикли на амплификация, върху
ковалентно свързаната матрица нуклеинова киселина, така че всяка колония включва голям брой копия от първоначално имобилизираната матрица нуклеинова киселина и нейната комплиментарна секвенция. Един цикъл на амплификация се състои от етапите на хибридизация, удължаване и денатурация и тези етапи обикновено се провеждат, като се използват реагенти и условия добре познати в областта за PCR.
Типичната амплификационна реакция включва поставяне на твърдата подложка и прикрепената към нея матрица нуклеинова киселина и специфични праймери в условия, които индуцират хибридизация на праймера, например поставянето им при
температура от около 65° С. При тези условия, олигонуклеотидната секвенция Z в 3’ края на матрицата нуклеинова киселина, ще хибридизира с имобилизираният специфичен праймер X и при наличие на условия и реагенти поддържащи удължаването на праймера, например температура от около 72° С, присъствието на полимераза за нуклеиновата киселина, например ДНК зависима ДНК полимераза или молекула обратна транкриптаза (т.е. РНК зависима ДНК полимераза^, или РНК полимераза, плюс наличието на нуклеозид трифосфатни молекули или каквито и да са други нуклеотидни предшественици, например модифицирани нуклеозид трифосфатни молекули, специфичният праймер ще се удължава чрез добавяне на нуклеотиди, комплиментарни на последователността в матрицата нуклеинова киселина..
Примери за полимера зи на нуклеинови киселини, които могат да бъдат използвани в настоящото изобретение са ДНК полимераза (Кленов фрагмент, Т4 ДНК полимераза), температурно стабилни ДНК полимерази от различни термостабилни бактерии (такива като Taq, VENT, Pfu, ТП ДНК полимерази), както и техни генетично модифицирани производни (TaqGold, VENTexo, Pfu ехо). За да стане амплификация на ДНК колония, може да се използва също така и комбинация от РНК полимераза и обратна транскриптаза. Полимеразата за нуклеиновата киселина, използвана за удължаване на специфичен праймер, предимно е стабилна при условия на PCR реакция, т.е. при повтарящите се цикли на нагряване и охлаждане и е стабилна при температурата използвана за денатурация, обикновено около 94° С. Предпочитана ДНК полимераза за използване е Taq ДНК полимеразата.
Предпочитани нуклеозид трифосфатни молекули за използване са дезоксирибонуклеотид тркфосфати, например dATP, dTTP, dCTP, dGTP или рибонуклеозид трифосфати, например dATP, dUTP, dCTP, dGTP. Нуклеозид трифосфатните молекули могат да бъдат естествено срещащи се или не-естествени.
След етапите на хибридизация и удължаване, подлагайки подложката и прикрепените нуклеинови киселини на денатуриращи условия, ще са налице две имобилизирани нуклеинови киселини, първата е първоначално имобилизираната матрица нуклеинова киселина, а втората е комплиментарната на нея нуклеинова киселина, удължена от един от имобилизираните специфични праймери X. След това, първоначално имобилизирана матрица нуклеинова киселина, и имобилизираният удължен специфичен праймер са способни да инициират следващи цикли на амплификация, ако подложката участва в следващи цикли на хибридизация, удължаване и денатурация. Тези следващи цикли на амплификация ще доведат до колония нуклеинова киселина, включваща много на брой имобилизирани копия от матрицата нуклеинова киселина и нейната комплиментарна секвенция.
Първоначалното имобилизиране на матрицата нуклеинова киселина означава, че матрицата нуклеинова киселина може да хибридизира само със сгецифични праймери, разположени на разстояние по цялата дължина на матрицата нуклеинова киселина. Следователно пределът за образуване на колония нуклеинова киселина, зависи от локалната област, по отношение на областта в която е била имобилизирана началната матрица нуклеинова киселина. Ясно е, че след като се синтезират повече комплиментарни копия от молекулата матрица, чрез провеждане на следващи цикли на амплификация, т.е. следващи цикли на хибридизация, удължаване и денатурация, тогава границата на образувалата се колония от нуклеинови киселини, ще даде възможност за по-нататъшно удължаване, въпреки че границата на образуваната колония все още е ограничена до относително локална
област, по отношение на областта в която е била имобилизирана изходната матрица нуклеинова киселина.
Схематично представяне на метода за възникване на колония от нуклеинова киселина, съгласно един вариант от настоящото изобретение е показан на Фигура 1. Фигура 1 (а) показва специфичен праймер X от изобретението (показан като притежаващ секвенцията АТТ) и матрица нуклеинова киселина от изобретението, съдържаща в 5’ края си олигонуклеотидна секвенция Y, означена тук като АТТ и в 3’ края си олигонуклеотидна секвенция Z, означена тук като ААТ, която може да хибридизира със секвенцията на специфичния праймер X. ha схемата е показано, че специфичната праймерна секвенция X и олигонуклеотидните секвенции Y и Z са с дължина само от три нуклеотида. Очевидно е обаче, че на практика могат да се използват обикновено по-дълги секвенции. 5’ краищата и на специфичния праймер и на матрицата нуклеинова киселина носят средство за прикрепване на нуклеиновата киселина към твърдата подложка. Това .редство е означено на Фигура 1 като черно квадратче. Това средство за прикрепване може да доведе до ковалентно или не-ковалентно прикрепване.
За да е по-ясно, на Фигура 1 (а) са показани само един специфичен праймер X и една матрица нуклеинова киселина. Обаче на практика, ще са налице множество специфични праймери X и множество матрици нуклеинови киселини. По-голяма част от специфичните праймери X могат да включват два различни специфични праймера X. Обаче за простота, на Фигура 1 е представен схематично само един вид специфичен праймер X, със секвенция АТТ. По-голяма част от матриците нуклеинови киселини могат да включват нуклеинови киселини с различни секвенции в централната част между олигонуклеотидите Y и Z, но съдържат същите олигонуклеотидни секвенции Y и Z, респективно в 5’ и 3’
краищата си. За да е по-ясно на Фигура 1 е представен само един вид матрица нуклеинова киселина, в която част от секвенцията в централната част е означена като CGG.
В присъствието на твърда подложка, 5’ краищата и на матрицата нуклеинова киселина и на специфичния праймер X са свързани с подложката. Това е означено на Фигура 1 (Ь). След това подложката и прикрепената към нея матрица нуклеинова киселина и специфични праймери се поставят в условия, при които се индуцира хибридизация с праймера. Фигура 1 (с) показва матрица нуклеинова киселина, която е хибридизирала със специфичен праймер. Тази хибридизация е възможна поради факта, че олигонуклеотидната секвенция Z в 3’ края на матрицата нуклеинова киселина, може да хибридизира със специфичния праймер. От схемата се вижда, че представената олигонуклеотидна секвенция Z е комплиментарна на специфичния праймер, въпреки че на практика точната комплиментарна секвенция не е от съществено значение, като по този начин се осигуряват условия за провеждане на хибридизацията между матриците нуклеинови киселини и специфичните праймери.
Фигура 1 (d) показва фазата на удължаване на праймера. Тук, при подходящи условия на температура и в присъствие на ДНК полимераза и наличие на нуклеотиди предшественици, например dATP, dTTP, dCTP и dGTP, ДНК полимеразата удължава специфичния праймер от неговия 3’ край, като използва матрицата нуклеинова киселина като матрица. Вижда се, че когато завърши удължаването на праймера, виж Фигура 1 (е), се е образувала втора имобилизирана верига от нуклеинова киселина, която е комплиментарна на изходната матрица нуклеинова киселина. Чрез разделяне на двете вериги нуклеинови киселини, например чрез нагряване, ще са налице две имобилизирани нуклеинови киселини, първата е изходната имобилизирана матрица нуклеинова киселина, а втората е комплиментарната на нея нуклеинова киселина, синтезирана от един от имобилизираните специфични праймери X, виж Фигура 1 (f).
След това, както първоначално имобилизираната матрица нуклеинова киселина, така и образувалия се удължен имобилизиран специфичен праймер, могат да хибридизират с други присъстващи специфични праймери (обозначени като специфични праймери 2 и 3 на Фигура 1 (g) и след следващ цикъл на удължаване на праймера (Фигура 1 (h)) и разделяне на веригите (Фигура 1 (i)), се осигуряват четири едноверижни имобилизирани вериги. Две от тях съдържат последователности, отговарящи на изходната матрица нуклеинова киселина и две, съдържащи техни комплиментарни последователности.
Могат да се проведат следващи цикли на амплификация, освен тези показани на Фигура 1, които ще доведат до получаване на колония от нуклеинови киселини, включваща много имобилизирани копия от матрицата нуклеинова киселина и от нейната комплиментарна последователност.
Следователно ясно е, че методът от настоящото изобретение дава възможност да се образува колония от нуклеинови киселини от една имобилизирана матрица нуклеинова киселина, а размерът на тези колонии може да се контролира, като се променя броят на циклите на амплификация на които е подложена матрицата нуклеинова киселина. Така, броят на колониите от нуклеинови киселини образувани по повърхността на твърдата подложка, ще зависи от броя на Maipi ците нуклеинови киселини, които са имобилизирани първоначално към подложката, като се осигурява наличие на достатъчен брой от имобилизирани специфични праймери в мястото на всяка имобилизирана матрица нуклеинова киселина. Поради тази причина се предпочита, твърдата подложка ам· към която са имобилизирани специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини, да включва площ от имобилизирани специфични праймери с подходяща плътност, като в площта на праймерите са имобилизирани на интервали матрици нуклеинови киселини.
Така наречените “автообразци” от колонии нуклеинови киселини имат предимство пред много други методи от предшестващата област на техниката, поради това, че могат да се получат колонии от нуклеинови киселини с по-голяма плътност, защото плътността може да се контролира, като се регулира плътността, чрез която са имобилизирани изходните матрици нуклеинови киселини. По този начин например, методът не се ограничава до необходимостта да се подредят специфичните праймери върху отделни локални области от подложката и след това да се инициира образуване на колонии, като се разпознава специфичната проба, съдържаща матрица нуклеинова киселина върху същата локална област на праймера. Следователно, броят на колониите, които могат да се подредят като се използват методи от предшестващата област на техниката, например тези, описани в WO 96/04404 (Mosaic Technologies, Inc.) е ограничен от плътност/пространство, при които могат да бъдат подредени областите от специфични праймери в началния етап.
След като е възможно да се контролира изходната плътност на матриците нуклеинови киселини, а от тук и плътността на колониите от нуклеинови киселини, получени от матриците нуклеинови киселини, заедно с възможността да се контролира размера на образуваните колонии от нуклеинови киселини и в допълнение, плътността на матриците нуклеинови киселини в отделните колонии, то може да се постигне оптималния случай, при който върху твърдата подложка може да се получи висока плътност от отделни колонии нуклеинови
киселини с достатъчно голям размер и съдържащи достатъчно голям брой амплифицирани секвенции, позволяващ да се проведе последващ анализ или контрол върху колониите от нуклеинови киселини.
След като веднъж вече са се образували колонии от нуклеинови киселини, по желание може да се проведе допълнителен етап, например такъв, като визуализиране на колонията или определяне на секвенцията (виж по-нататък). Например, може да се наложи визуализиране на колония, ако е необходимо да се скринират образуваните колонии, за наличието или отсъствието например, на целия или на част от специфичен фрагмент от нуклеинова киселина. В този случай колонията или колониите, които съдържат специфичния фрагмент нуклеинова киселина, могат да се открият като се конструира сонда нуклеинова киселина, която хибридизира специфично с интересуващия ни фрагмент от нуклеинова киселина.
За предпочитане е тази сонда нуклеинова киселина да е белязана с нещо, което след това може да се детектира, например като флуоресцентна група, съдържаща биотин (която може да се докаже, например чрез инкубиране на белязана със стрептавидин флуоресцентна група), радиоизотопен белег (който може да се включи в сонда нуклеинова киселина, чрез методи добре познати и документирани в областта и който може да се докаже чрез откриване на радиоактивност, например чрез инкубиране със сцинтилационна течност), или боя или друг оцветяващ агент.
Съответно, тази сонда нуклеинова киселина може да не е белязана, а да е конструирана така, че да действа като праймер за включване на известен брой белязани нуклеотиди с полимераза за нуклеиновата киселина. След това включеният белега може да се открие, а следователно и колониите от нуклеинови киселини.
След това, колониите от нуклеинови киселини от изобретението се подготвят за хибридизация. Тази подготовка включва третиране на колониите така, че всички или част от матриците нуклеинови киселини изграждащи колониите да са в едноверижна форма. Това може да се постигне например чрез топлинна денатурация на всяка двойноверижна ДНК в колониите. Колониите могат да бъдат третирани съответно с рестрикционни ендонуклеази, специфични за двойноверижната форма на секвенцията в матрицата нуклеинова киселина. Следователно, ендонуклеазата може да е специфична или за последователност, съдържаща се в олигонуклеотидните секвенции Y или Z, или за друга последователност, присъстваща в матрицата нуклеинова киселина. След разграждане, колониите се нагряват така, че двойноверижните ДНК молекули се разделят, а колониите се промиват, за да се отстранят не-имобилизираните вериги, като по този начин в колониите остават прикрепени само едноверижни ДНК.
След като се приготвят колониите за хибридизация, към тях се добавя белязаната или не-белязана сонда, при условия подходящи за хибридизация на сондата с нейната специфична ДНК секвенция. Тези условия могат да се определят от специалистите в областта, като се използват известни методи и те ще зависят например от секвенцията на сондата.
След това сондата може да се отстрани чрез топлинна денатурация и по желание може да хибридизира и да се детектира сонда специфична за втора нуклеинова киселина. Тези етапи могат да се повтарят толкова пъти, колкото е желателно.
След това белязаните сонди, които са хибридизирали с колониите от нуклеинови киселини могат да се докажат, като се използва апаратура, притежаваща подходящо устройство за детекция. Предпочитана система за детекция на флуоресцентни маркери е камера свързана със зареждащо устройство (CCD), която може да бъде свързана по избор с устройство за увеличаване на образа, например микроскоп. Като се използва такава техника е възможно да се контролират паралелно много колонии. Например, ако се използва микроскоп със CCD камера и 10х или 20х обектив е възможно да се наблюдават колонии върху повърхност от 1 mm2 до 4 mm2, което отговаря на паралелен контрол на около 10, 000 до 200, 000 колонии. Счита се освен това, че този брой ще се увеличава с усъвършенстване на оптиката и големите чипове.
Един алтернативен метод за контрол на образуваните колонии е да се сканира повърхността, покрита с колонии. Например, могат да се използват системи в които могат да се подредят и да се контролират едновременно до 100, 000, 000 колонии върху цялата повърхност, като се снимат със CCD камера. Ясно е, че по този начин могат да се контролират до 100, 000, 000 колонии за кратко време.
За контрол на колонии се нуклеинови киселини от изобретението могат да се използват и други средства позволяващи детекция, а за предпочитане и количествено определяне на флуоресценцията по повърхността. Например, може да се използва флуоресцентен или конфокален микроскоп.
Ако маркерите са радиоактивни, тогава е необходима система за радиоактивна детекция.
В методите от настоящото изобретение, когато се провежда допълнително стъпало, поне едно стъпало за определяне на секвенция, поне на една от образуваните колонии нуклеинови киселини, споменатото определяне на секвенция може да се извърши, чрез използване на всяка подходяща твърдо фазова техника за секвениране. Например, една техника която може да се използва за определяне на секвенция в настоящото изобретение, включва хибридизиране на подходящ праймер, понякога използван тук с термина “секвениращ праймер”, с матрицата нуклеинова киселина за секвениране, удължаване на праймера и детекция на нуклеотидите, използвани за удължаване на праймера. За предпочитане е нуклеиновата киселина, използвана за удължаване на праймера да се детектира преди добавянето на следващия нуклеотид към растящата верига на нуклеиновата киселина, като по този начин може да се секвенира база по база чрез in situ секвениране на нуклеинова киселина.
Детекцията на включените нуклеотиди се улеснява чрез включване на един или повече белязани нуклеотида в реакцията на праймерното удължаване. Може да се използва всеки подходящ за детекция маркер, например флуорофор, радиоизотопен маркер и др. Използва се предимно флуоресцентен маркер. Могат да се използват едни и същи или различни маркери за всеки различен вид нуклеотид. Когато маркерът е флуорофор и същите маркери се използват за всеки различен вид нуклеотид, всеки включен нуклеотид осигурява кумулативно увеличаване на сигнала, отчитан при определена дължина на вълната. Ако се използват различни маркери, тогава тези сигнали могат да се детектират при различна дължина на вълната. По желание може да се достави смес от белязани и небелязани нуклеотиди.
За да се осъществи хибридизация на съответния секвениращ праймер с матрицата нуклеинова киселина за секвениране, матрицата нуклеинова киселина трябва да бъде обикновено в едноверижна форма. Ако матриците нуклеинови киселини, образуващи колониите от нуклеинови киселини са в двойноверижна форма, те трябва да се превърнат в едноверижни матрици нуклеинови киселини, като се използват добре познати методи в областта, например чрез денатурация, разграждане и други.
Секвениращите праймери, които хибридизират с матрицата нуклеинова киселина и се използват за удължаване на праймера, са предимно къси олигонуклеотиди, например с дължина от 15 до 25 нуклеотида. Секвенцията на праймерите се конструира така, че те хибридизират с част от матрицата нуклеинова киселина, която е за секвениране, предимно при специални условия. Секвенцията на праймерите използвани за секвениране може да е същата или сходна на секвенциите на специфичните праймери, използвани за образуване на колонии нуклеинови киселини от изобретението. Секвениращите праймери могат да се доставят в разтвор или в имобилизирана форма.
След като вече секвениращият праймер се е свързал комплиментарно с матрицата нуклеинова киселина, която е за секвениране, чрез поставяне на матрицата нуклеинова киселина и секвениращия праймер в подходящи условия, определени чрез методи добре познати в областта, удължаването на праймера се провежда като се използва например пол име раза за нуклеинова киселина и наличие на нуклеотиди, като поне част от тях са белязани, и подходящи условия за удължаване на праймера, при наличие на подходящ нуклеотид. По-горе са дадени примери за полимерази на нуклеинови киселини и нуклеотиди, които могат да се използват.
За предпочитане е след всеки етап на удължаване на праймера да се включи етап на промиване, за да се отстранят невключените нуклеотиди, които могат да попречат на следващите етапи. След като се проведе етапа на удължаване на праймера, колонията от нуклеинова киселина се подлага на контрол, за да се определи дали белязаният нуклеотид се е включил в удължения праймер. След това етапът на удължаване на праймера може да се повтори, за да се определят следващите и по-следващите нуклеотиди, включени в удължения праймер.
Може да се използва всяко средство осигуряващо детекция, а за предпочитане и количествено определяне на съответния белег, например флуоресценция или радиоактивност, за определяне на секвенцията. Ако белегът е флуоресцентен, може да се използва CCD камера, свързана по избор с устройство за увеличаване (както е описано по-горе). Всъщност приборите използвани за определяне на секвенция във вариантите от настоящото изобретение, могат да са същите, като тези описани по-горе за контрол на амплифицираните колонии от нуклеинови киселини.
Системата за детекция се използва предимно в комбинация със система за анализ, за да се определи броя и природата на включените нуклеотиди във всяка колония, след всеки етап от удължаване на праймера. Този анализ, който може да се провежда веднага след всеки етап от удължаване на праймера или по-късно, чрез записване на данни, позволява да се определи секвенцията на матрицата нуклеинова киселина в дадена колония.
Ако секвенцията, която се определя е непозната, то нуклеотидите, които се използват за дадена колония се подават в избран ред, който след това се повтаря през време на целия анализ, например dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Ако обаче секвенцията която се определя е известна и се ре-секвенира, например за да се анализира дали има или не малки различия в последователността от известната секвенция, процесът за определяне на секвенция може да се ускори чрез добавяне на нуклеотидите на всеки етап в подходящ ред, избран според известната последователност. По този начин, ако липсва включване на някои нуклеотиди в отделните етапи от удължаване на праймера, се откриват разликите в дадената секвенция.
Следователно ясно е, че ако се използват методите от настоящото изобретение може да се определи пълната или частична секвенция на амплифицираните матрици нуклеинови киселини, изграждащи отделните колонии нуклеинови киселини.
В друг вариант от настоящото изобретение, може да се определи пълната или частична последователност на повече от една нуклеинова киселина, чрез определяне на пълната или частична секвенция на амплифицираните матрици нуклеинови киселини, присъстващи в
повече от една колония нуклеинова киселина. За предпочитане е поголемият брой секвенции да се определят едновременно.
Определянето на секвенциите на нуклеиновите киселини, чрез метода от настоящото изобретение има предимството за твърде надежден, поради факта, че чрез него се осигурява голям брой от всяка една нуклеинова киселина за секвениране, във всяка колония нуклеинови киселини от изобретението. По желание, надеждността може да се повиши и да се получат и други подобрения като се осигуряват множество колонии от нуклеинови киселини, включващи същата матрица от нуклеинова киселина за секвениране, а след това се определят и сравняват секвенциите във всяка от колониите.
За предпочитане е, прикрепването на специфичния праймер и матрицата нуклеинова киселина към твърдата подложка да е термостабилно при температурата, при която подложката се използва по време на реакцията на амплификация на нуклеиновата киселина, например при температури приблизително до 100° С, например около 94° С. Природата на прикрепване предимно е ковалентна.
В друг вариант от настоящото изобретение ковалентното свързване на специфичните праймери и матрица(и) нуклеинова киселина за твърдата подло: жа се инициира от крос-свързващ агент, например като 1-етил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид хидрохлорид (EDC), анхидрид на янтарната киселина, фенилдиизотиоцианат или малеинов анхидрид, или хетеробифункционален крос-свързващ агент, например като тмалеимидобензоил-М-хидроксисукцинимид естер (MBS), Nсукцинимидил [4-йодоацетил] аминобензоат (SIAB), Сукцинимидил 4[N-малеимидометил] циклохексан-1-карбоксилат (SMCC), N-yмалеимидобутирилокси-сукцинимид естер (GMBS), Сукцинимидил-4[р-малеимидофенил] бутират (SMPB) и съответните сулфо (водо40
разтворими) съединения. Предпочитани крос-свързващи реагенти за използване в настоящото изобретение са, s-SIAB, s-MBS и EDC.
В друг вариант от изобретението, твърдата подложка има дериватизирана повърхност. В по-друг вариант, дериватизираната повърхност на твърдата подложка впоследствие се модифицира с бифункционални крос-свързващи групи, за да се осигури функционализирана повърхност, за предпочитане с реактивни кроссвързващи групи.
Използваният тук термин “дериватизирана повърхност”, се отнася до повърхност, която е модифицирана с химически реактивни групи, например амино, тиолови или акрилатни групи.
Използваният тук термин “функционализирана повърхност”, се отнася до дериватизирана повърхност, която е модифицирана със специфични функционални групи, например на малеиновата или янтарна киселина.
За да се използва методът от настоящото изобретение за някои приложения, прикрепването на специфичните праймери и матрици нуклеинови киселини към твърдата подложка, трябва да отговаря на няколко изисквания. Идеалното прикрепване не трябва да се влияе нито от излагането на високи температури, нито от повтарящите се цикли на нагряване/охлаждане, които се използват по време на амплификацията на нуклеиновата киселина. Освен това, подложката трябва да осигурява получаването на плътност от прикрепени
А специфични праймери поне 1 fmol/mm , за предпочитане поне 10 fmol/mm , а още по-добре между 30 до 60 fmol/mm . Идеалната подложка трябва да има равномерна плоска повърхност с нисък флуоресцентен фон и трябва да бъде също така температурно стабилна (да не се деформира). Не са подходящи твърди подложки, които дават възможност за пасивна адсорбция на ДНК, като някои видове пластични и синтетични нитроцелулозни мембрани. Най-накрая,
МММЙ ма твърдите подложки трябва да са достъпни и следователно да не са скъпи.
Поради тези причини, въпреки че твърда подложка може да бъде всяка твърда повърхност, към която могат да се прикрепват нуклеинови киселини, например такава като латексни гранули, декстранови гранули, полистирен, полипропиленова повърхност, полиакриламиден гел, златни повърхности, стъклени повърхности и силиконови лепенки, за предпочитане е твърдата подложка да е стъклена повърхност, а нуклеиновата киселина да е прикрепена към нея ковалентно.
Ковалентното свързване на специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини към твърдата подложка може да се осъществи, като се използват добре познати и документирани в областта техники. Например, епоксисилан-амино ковалентно свързване на олигонуклеотиди върху твърди подложки, например като порозни стъклени гранули, се използва широко за твърдо фазов in situ синтез на олигонуклеотиди (чрез закрепване на 3’ края) и е адаптиран също така за прикрепване на олигонуклеотиди чрез 5’ края. Олигонуклеотиди модифицирани в 5’ края с карбоксилни или алдехидни групи се свързват ковалентно с хидразин-дериватизирани латексни гранули (Kremsky et al., 1987).
Други подходи за прикрепване на олигонуклеотиди към твърди повърхности използват крос-свързващи агенти, такива като анхидрид на янтарната киселина, фенилдиизотиоцианат (Guo et al., 1994), или анхидрид на малеиновата кгселина (Yang et al., 1998). Друг широко използван крос-свързващ агент е 1-етил-3-(3-диметиламонипропил)карбодиимид хидрохлорид (EDC). Химичната природа на EDC за първи път е описана от Gilham et al., (1968), който прикрепва ДНК матрици към към хартия (целулозна) чрез 5’ крайната фосфатна група. Чрез прилагане на химичния способ за EDC, са използвани други подложки, такива като латексни гранули (Wolf et al., 1987, Lund et al., №
1988) , полистиренови микроямки (Rasmussen et al., 1991), стъкла c определен размер на порите (Ghosh et al., 1987) и декстранови молекули (Gingeras et al., 1987). Кондензацията на 5’ аминомодифицирани олигонуклео^иди с карбодиимид медииращ реагент е описана от Chu et al., (1983) и от Egan et al., (1982) за 5’ крайната фосфатно модифицирана група.
Добивът от прикрепване на олигонуклеотиди чрез 5’ краищата, като се използват карбодиимиди, може да достигне 60%, но основният недостатък е неспецифично прикрепване, чрез вътрешните нуклеотиди от олигонуклеотида. Rasmussen et al., (1991) увеличават специфичното прикрепване до 85% чрез 5’ края, като дериватизират повърхността чрез използване на вторични амино групи.
Съвсем скорошни публикации съобщават предимствата на хетеро-бифункционалните крос-свързващи агенти. Хетеро- или монобифункционални крос-свързващи агенти се използват широко за получаване на молекули, конюгирани с пептиден носител (пептидбелтък), за да се повиши имуногенността в животните (Peeters et al.,
1989) . Показано е, че повечето от тези реагенти за прикрепване, образуват стабилни ковалентни връзки във воден разтвор. Тези кроссвързващи реагенти се използват, за да свързват ДНК с твърда повърхност във всяка точка от молекулата.
Chrisey et al., (1996) изследват ефикасността и стабилността на твърдо фазовото ДНК прикрепване, като използват 6 различни хетеробифункционални крос-свързващи агенти. В този пример, прикрепване става само в 5’края на ДНК олигомери, модифицирани с тиолова група. Такъв тип прикрепване е описан също така от O’Donnell-Maloney et al., (1996), за прикрепване на прицелната ДНК за MALDI-TOF секвенционен анализ и от Hamamatsu Photonics F. К. company (ЕР-А665293), за определяне на базова секвенция в нуклеинова киселина върху твърда повърхност.
Проведени са много малък брой изследвания, отнасящи се до температурната стабилност при прикрепване на олигонуклеотидите към твърдата подложка. Chrisey et al., (1996) съобщават, че ако се използва като крос-свързващ агент Сукцинимидил-4-[рмалеимидофенил] бутират (SMPB), почти 60 % от молекулите се освобождават от стъклената повърхност, по време на топлинната обработка. Но не е описана температурната стабилност на други реагенти.
За да се създадат колонии нуклеинови киселини чрез реакция на твърдо фазова амплификация, както е описано в настоящата заявка, необходимо е специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини да са прикрепени специфично с техните 5’ краища към твърдата повърхност, за предпочитане стъклена. Накратко, стъклената повърхност може да бъде дериватизирана с реактивни аминогрупи чрез силанизиране, като се използват амино-алкокси силани. Подходящи силанови реагенти включват аминопропилтриметоксисилан, аминопропилтриетоксисилан и 4-аминобутилтриетоксисилан. Стъклените повърхности могат да бъдат също така дериватизирани с други реактивни групи, като акрилатни или епокси, като се използват епоксисилан, акрилатсилан и акриламидсилан. След етапа на дериватизация, молекулите нуклеинови киселини (специфичните праймери или матриците нуклеинови киселини), притежаващи химически модифицирана функционална група в техния 5’ край, например фосфатна, тиолова или амино група, се прикрепват ковалентно към дериватизираната повърхност чрез крос-свързващ реагент, като тези описани по-горе.
Съответно, етапът на дериватизация може да бъде последван от прикрепване на бифункционален крос-свързващ реагент към повърхностните амино групи, като по този начин се осигурява модифицирана функционализирана повърхност. След това молекулите нуклеинови киселини (специфичните праймери или матрици нуклеинови киселини), притежаващи 5’-фосфатна, тиолова или амино група, взаимодействат с функционализираната повърхност, като се образува ковалентна връзка между нуклеиновата киселина и стъклото.
Потенциални крос-свързващи и прикрепващи реагенти, които могат да се използват за ковалентно ДНК/олигонуклеотидно прикрепване върху твърдата подложка включват, анхидрид на янтарната киселина, (1-етил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид хидрохлорид (EDC), ш-малеимидобензоил-М-хидроксисукцинимид естер (MBS), N-сукцинимидип [4-йодоацетил] аминобензоат (SIAB), Сукцинимидил 4- [N-малеимидометил] циклохексан-1-карбоксилат (SMCC), N-у-малеимидобутирилокси-сукцинимид естер (GMBS), Сукцинимидил-4- [р-малеимидофенил] бутират (SMPB) и съответните сулфо (водо-разтворими) съединения. Предпочитани крос-свързващи реагенти съгласно настоящото изобретение са s-SIAB, s-MBS и EDC. sMBS е малеимид-сукцинимид хетеро-бифункционален крос-свързващ реагент, a s-SIAB е йодоацетил-сукцинимид хетеро-бифункционален крос-свързващ реагент. И двата са способни да образуват ковалентна връзка, респективно със SH групи и първични амино групи. EDC е карбодиимид-реагент, който медиира ковалентното прикрепване на фосфатни и амино групи.
Специфичните праймери и матриците нуклеинови киселини обикновено са модифицирани в 5’ края с фосфатна група или с първична амино група (за EDC прикрепващ реагент) или с тиолова група (за s-SIAB или s-MBS крос-свързващите агенти).
Следователно, друг вариант от настоящото изобретение осигурява твърда подложка, към която са прикрепени множество специфични праймери X, както е описано по-горе и поне една матрица нуклеинова киселина, както е описано по-горе, където споменатите матрици нуклеинови киселини съдържат в 5’ края си олигонуклеотидна секвенция Y, както е описано по-горе, а в 3’ края си олигонуклеотидна секвенция Ζ, както е описано по-горе. За предпочитане е по-големият брой матрици нуклеинови киселини да са прикрепени към споменатата твърда подложка, която предимно е стъклена. За предпочитане е матриците нуклеинови киселини и специфичните праймери да са прикрепени ковалентно към твърдата подложка. Чрез провеждане на един или повече цикли на амплификация на нуклеинова киселина върху имобилизираната матрица(и) нуклеинова киселина, чрез използване на методите описани по-горе, могат да се образуват колонии от нуклеинови киселини от изобретението. Следователно, друг вариант от изобретението е подложка, включваща една или повече колонии от нуклеинови киселини от изобретението. Друг вариант от изобретението осигурява използването на твърди подложки от изобретението, в методите за амплификация или секвениране на нуклеинови киселини. Тези методи за амплификация или секвениране на нуклеинови киселини включват методите от настоящото изобретение.
Един друг вариант от изобретението осигурява използването на дериватизирана или функционализирана подложка, приготвена както е описано по-горе в методите за амплификация и секвениране на нуклеинови киселини. Тези методи за амплификация или секвениране на нуклеинови киселини включват методите от настоящото изобретение.
Друг вариант от настоящото изобретение осигурява прибор за прилагане на методите от изобретението или прибор за получаване на твърда подложка, включваща колонии нуклеинови киселини от изобретението. Такъв прибор може да включва например множество матрици от нуклеинови киселини и специфични праймери от изобретението, свързани предимно ковалентно за твърда подложка, както е подчертано по-горг, заедно с полимераза за нуклеинова киселина, множество нуклеотиди предшественици, като тези описани по-горе, като част от тях могат да бъдат белязани и средство за контролиране на температурата. Съответно, приборът може да включва например подложка, включваща една или повече колонии от нуклеинови киселини от изобретението. За предпочитане е приборът да включва също така средство за детекция, за откриване и разграничаване на сигнали от отделните колонии нуклеинови киселини, подредени върху твърдата подложка, съгласно методите от настоящото изобретение. Например, такова детектиращо средство може да включва зареждащо устройство, оперативно свързано с прибор за увеличаване, например като микроскоп, както е описано по-горе.
За предпочитане е всички прибори от изобретението да са автоматични.
Настоящата заявка дава възможност да се решат настоящите и бъдещите нужди, които учените и биотехнологичната индустрия се опитват да разрешат, отнасящи се до геноми, фармакогеноми, откриване на лекарствени препарати, характеризиране на хранителни съставки и генотипиране. Следователно, методът от настоящото изобретение може да се прилага например и за: секвениране на нуклеинови киселини и ре-секвениране, диагностики и скриниране, контрол на генната експресия, профилиране на генетично разнообразие, разкриване на целия геномен полиморфизъм и оценка, създаване на геномни препарати (целият геном на пациент върху микроскопски препарат) и секвениране на цял геном.
Следователно, настоящото изобретение може да се използва за секвениране и ре-секвениране на нуклеинова киселина, като например избран брой ог гени се амплифицират специфично в колонии за цялостното секвениране на ДНК. Генното ре-секвениране позволява идентифицирането на всички известни или нови генетични
полиморфизми на изследваните гени. Приложенията са в медицината за диагностика и генетично идентифициране на живи организми.
При използване на настоящото изобретение за диагностика и скриниране, могат да се амплифицират цели геноми или фракции от геноми в колонии, за секвениране на ДНК с известен полиморфизъм по отделни нуклеотиди (SNP). SNP идентифицирането има приложение в медицински генетични изследвания за идентифициране на генетични рискови фактори, свързани с болестни състояния. SNP генотипирането ще има също така приложение във фармако-геномната диагностиката за идентифициране и лечение на пациенти със специфични лекарствени средства.
При използване на настоящото изобретение за профилиране на генетично разнообразие, могат да бъдат идентифицирани например популации от организми или клетки, или тъкани, чрез амплификация на ДНК пробата в колонии, последвана от секвениране на ДНК на специфичните “краища”, за всеки отделен генетичен обект. По този начин, чрез преброяване на броя краища от всеки отделен обект, може да се определи генетичното разнообразие на пробата.
При използване на настоящото изобретение за контрол на генната експресия, експресираните иРНК молекули от тъкан или организъм по време на изследването се превръщат в кДНК молекули, които се амплифицират в серии от колонии за секвениране на ДНК. Честотата на колониите кодиращи дадена иРНК е пропорционална на честотата на присъстващите иРНК молекули в изходната тъкан. Приложенията за контрол на генната експресия са в био-медицински изследвания.
Като се използват методите от изобретението, може да се направи препарат на цял геном, в който целият геном на жив организъм е представен като голям брой ДНК колонии, достатъчни за да включват всички секвенции на този геном. Геномният препарат е генетичната карта на всеки жив организъм. Генетичните карти имат приложение в медицинските изследвания и за генетична идентификация на живи организми с индустриална стойност.
Настоящото изобретение може да се използва също така за секвениране на целия геном, като целият геном на жив организъм се амплифицира в серии от колонии за интензивно секвениране на ДНК. Например, секвенирането е а целия геном позволява: 1) прецизно идентифициране на генетичната верига на всеки жив организъм; 2) разкриване на нови кодиращи гени в генома и 3) разкриване на нови генетични полиморфизми.
Приложенията на настоящото изобретение не се ограничават само до анализ на проби от нуклеинови киселини от един организъм/пациент. Например, краищата от нуклеинови киселини могат да бъдат включени в матриците нуклеинови киселини и да се амплифицират, като за всеки отделен организъм/пациент могат да се използват различни краища от нуклеинови киселини. Следователно, когато се определи последователността на амплифицираната нуклеинова киселина, може да се определи също така и последователността на края и произхода на идентифицираната проба.
По този начин, един друг вариант от изобретението осигурява използването на методите от изобретението, или колониите от нуклеинови киселини от изобретението, или множеството от матриците нуклеинови киселини от изобретението, или твърдите подложки от изобретението, осигуряващи секвениране и ре-секвениране на молекули от нуклеинови киселини, контрол на генна експресия, профилиране на генетично разнообразие, диагностика, скриниране, секвениране на цял геном, разкриване на целия геномен полиморфизъм и оценка, и получаване на препарати от цял геном (т.е. целият геном на един индивид върху една подложка), или каквито и да се други приложения, включващи амплификация на нуклеинови киселини или тяхното секвениране.
Един друг вариант от настоящото изобретение осигурява кит, необходим за секвениране, ре-секвениране, контрол на генна експресия, профилиране нг генетично разнообразие, диагностика, скриниране, секвениране на цял геном, разкриване на целия геномен полиморфизъм и оценка, или каквито и да се други приложения, включващи амплификация на нуклеинови киселини или тяхното секвениране. Този кит включва множество матрици от нуклеинови киселини и специфични праймери от изобретението, свързани с твърда подложка, както е подчертано по-горе.
Сега изобретението ще бъде описано по-подробно със следните не-ограничаващи Примери, отнасящи се до следните графики, в които:
Фигура 1: показва схематично представяне на метод за получаване на колония от нуклеинови киселини, съгласно вариант от изобретението.
Фигура 2: представя схематично приготвяне на матрица и последващо прикрепване към твърдата повърхност. На Фигура 2а е показано приготвянето на Матрици А, В и В’, съдържащи специфични праймерни секвенции. Чрез използване на PCR праймери ТР1 и ТР2 се образува 3.2 кЬ матрица от геномна ДНК. Матрици А (854 Ьр) и В (927 Ьр) се образуват като се използват респективно PCR праймери ТРА1/ ТРА2 или ТРВ1/ТРВ2. Олигонуклеотидите ТРА1 и ТРВ1 са модифицирани в техните 5’ краища или с фосфатна или с тиолова група за последващото химично прикрепване (φ). Забележете, че получените матрици съдържат секвенции, съответстващи на специфичните праймери СР1 и/или СР2. 11-те екзона на гена са представени като “Е1 до Е11”. На Фигура 2Ь е показано химичното прикрепване на специфични праймери и матрици към стъклена
повърхност. Като илюстративен пример е показана дериватицазия чрез ATS (аминопропилтриетоксисилан).
Фигура 3: ДНК колонии образувани от специфичен праймер. Тя показва броя на колониите, наблюдавани при 20х увеличение като функция от концентрацията на матрици, свързани с ямката. Найниската детектирана концентрация от матрица съответства на 10’13 М.
Фигура 4: Показва разграничаване на колонии, получени от две различни матрици. Фигура 4а показва как изглеждат колониите, получени от две матрици и негативни контроли. Фигура 4Ь показва колониите от две матрици, l едно и също място в една и съща ямка, визуализирани с два различни цвята и негативни контроли. Фигура 4с показва координатите на двата типа колонии в подсекция на микроскопското поле. Фигура 4с показва, че колониите от различни матрици не съвпадат.
Фигура 5: Схеми за реакция на матрицата или олигонуклеотида при прикрепване върху стъкло. Етап А е дериватизация на повърхността: предметното стъкло се третира с разтвор на киселина, за да се увеличат свободните хидроксилни групи по повърхността. Предварително приготвените стъкла се потапят в разтвор от аминосилан. ATS: Аминопропил триетоксисилан. Етап В: В1 или В2 е функционализиране на стъклена повърхност с крос-свързващи агенти, последвано от олигонуклеотидно прикрепване. Амино групата реагира с крос-свързващия агент чрез амидна връзка: етап Bl; s-MBS (сулфо-mмалеимидобензоил-М-хидроксисукцинимид естер) етап В2; s-SIAB (сулфо-Ь1-сукцинимидил [4-йодоацетил] аминобензоат). Олигонуклеотидите (модифициран в 5’ края с тиол олигонуклеотид) се прикрепват към повърхността чрез образуване на ковалентна връзка между тиола и двойната връзка на малеимида. Солеви фосфатен буфер: (PBS, 0.1 М NaH2PO4, pH: 6.5, 0.15 М NaCI). ВЗ: Прикрепване на олигонуклеотиди, като се използва EDC и Имидазол. 5’ крайният
фосфат на модифицираните олигонуклеотиди взаимодейства с имидазола в присъствие н? EDC, за да се получат 5’ - фосфоримидазолид производни (не е показано). Производните образуват фосфорамидатна връзка с амино групите от дериватизираната стъклена повърхност. EDC: 1-етил-3-(3-диметиламонипропил)-карбодиимид хидрохлорид.
Фигура 6: Тя показва броят на колониите, наблюдавани при 20х увеличение, като функция от концентрацията на матрицата свързана с ямката. ДНК матрицата е свързана с различна концентрация или чрез медииращия свързващ реагент (EDC) върху амино дериватизирана стъклена повърхност (А), кли върху s-MBS функционализирана стъклена повърхност (В). Двойноверижните ДНК колонии се подлагат на действието на рестриктазен ензим и получените единични вериги хибридизират с комплиментарен, су5 флуоресцентно белязан олигонуклеотид.
Фигура 7: Тя показва един пример за in situ секвениране на ДНК колонии, образувани върху стъклена повърхност. Фигура 7А показва резултата след инкубиране на проба със Су5 ™ - dCTP, която не е била инкубирана с праймер pl81. Вижда се, че се наблюдават само 5 неясно очертани петна, което показва, че това не е някакъв недостоверен ефект (като Су5 ™ - dCTP агрегатна преципитация, адсорбция или просто неспецифично включване в ДНК колониите или по повърхността). Фигура 7В показва резултата след инкубиране на проба със Су5 ™ dUTP, която е била инкубирана с праймер р181. Вижда се, че не се наблюдава флуоресцентно петно, което показва, че не става включване на флуоресцентната база в количества, които могат да се детектират, когато необходимият за вигючване нуклеотид не съответства на секвенцията от матрицата, следвайки хибридизиралия праймер. Фигура 7С показва резултата след инкубиране на проба със Су5 ™ - dCTP, която е била инкубирана с праймер р181. Вижда се, че могат да се наблюдават много флуоресцентни петна, което показва, че наистина става включване на флуоресцентна база в количества, които могат да се детектират, когато необходимият за включване нуклеотид съответства на секвенцията на матрицата, следвайки хибридизиралия праймер.
Фигура 8: Тя показва хибридизация на сонди с олигонуклеотиди, прикрепени към Nucleolink, преди и след PCR реакция. Фигурата показва хибридизация на R58 с СР2 (5’TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG^
(фосфат) запълнени кръгчета,
СР8 (5’(амино-хексаметилен) TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) запълнени
триъгълничета,
СР9 (5’ (хидроксид) TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) ромбчета,
СР10 (5’ (диметокситритил) TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) празни кръгчета и
СР11 (5’(биотин)TTTTTTTTTTAGAAGGAGA AGGAAAGGGAAAGGG) празни триъгълничета.
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Пример 1: Приготвяне на ДНК матрици, подходящи за образуване на ДНК колонии
ДНК колонии се образуват от ДНК матрици и специфични праймери. Използваният тук термин “специфична праймерна секвенция”, се отнася до секвенция, съответстваща на последователността на специфичен праймер и понякога се означава
като “олигонуклеотидна секвенция Y” или “олигонуклеотидна секвенция Z’ ”.
Свойствата на специфичните праймери се избират въз основа на селекция на олигонуклеотидни праймери, които показват ниско неспецифично нуклеотидно включване в присъствие на температурностабилни ДНК полимерази. Специфичните праймери, СРа (5’ - р САССААСССАААССААСССАААСС) и ΟΡβ (5’ - р AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) са избрани, поради тяхното слабо включване на радиоактивно белязан [a- P-dCTP], в присъствие на стабилна ДНК полимераза (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, СА), в стандартен буфер и при условия за амплификация (94° С за 30 секунди, 65° С за 1 минута, 72° С за 2 минути, 50 цикъла).
Използва се 3.2 кЬ ДНК фрагмент като моделна система, за да се покаже възможността за образуване на колония, като се използват специфични праймери и ДНК матрици. Избраната матрица включва човешки ген, за рецептора на крайните силно гликолизирани продукти (HUMOXRAGE, GenBank Acc. No. D28769). RAGE-специфичните праймери са обозначени в Таблица 1. 3.2 кЬ матрица се образува чрез PCR амплификация от 0.1 μg човешка геномна ДНК, с 1 μΜ праймери ТР1 и ТР2, и 1 единица ДНК полимераза (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, СА) в стандартен буфер, при условия за амплификация (94° С за 30 секунди, 65° С за 1 минута, 72° С за 5 минути, 40 цикъла). Този
3.2 kb ДНК фрагмент се използва като матрица за втори PCR, за да се образуват две по-къси матрици, за получаване на колония (Матрици А и В). Праймерите, използвани за получаване на по-късите матрици съдържат както секвенции специфични за матрицата, така и секвенции за специфичните праймери СР1 и СР2, за да амплифицират ДНК върху твърдата повърхност. Обикновено PCR праймерът, използван за образуване на ДНК матрица, з модифициран в 5’ - края с фосфатна или тиолова група. Така, след PCR амплификация се образуват ДНК
фрагменти, които съдържат специфични праймерни секвенции в единия или и в двата края, свързвайки желаният RAGE ДНК фрагмент (виж Фигура 2а).
Матрица А (двойноверижна матрица, съдържаща специфична праймерна секвенция, ΟΡβ в двата края) се получава с 0.1 ng от 3.2 kb матрица с 1 μΜ праймери ТРА1 и 1 μΜ ТРА2 и 1 единица ДНК полимераза (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, СА) в стандартен буфер, при условия за амплификация (94° С за 30 секунди, 65° С за 1 минута, 72° С за 1 минута, 30 цикъла). След това продуктите се пречистват върху Qiagen Qia-quick колони (Qiagen GmbH, Hilden, Germany).
Матрица В (двойноверижна матрица, съдържаща специфични праймерни секвенции, съответстващи на CPβ) се получава с 0.1 ng от
3.2 kb матрица с 1 μΜ праймери ТРВ1 и 1 μΜ ТРВ2 и 1 единица ДНК полимераза (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, СА) в стандартен буфер, при условия за амплификация (94° С за 30 секунди, 65° С за 1 минута, 72° С за 1 минута, 30 цикъла). След това продуктите се пречистват върху Qiagen Qia-quick колони (Qiagen GmbH, Hilden, Germany).
Матрица В’ (двойноверижна матрица, съдържаща специфични праймерни секвенции, съответстващи на СРа и CPβ в двата края) се получава с 0.1 ng от 3.2 kb матрица, с 1 μΜ праймери ТРВЗ и 1 μΜ ТРВ4 и 1 единица ДНК полимераза (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, СА) в стандартен буфер, при условия за амплификация (94° С за 30 секунди, 65° С за 1 минута, 72° С за 1 минута, 30 цикъла). След това продуктите се пречистват върху Qiagen Qia-quick колони (Qiagen GmbH, Hilden, Germany).
Всичките специфични олигонуклеотиди използвани за приготвяне на ДНК матрици и за получаване на ДНК колония, са представени в Таблица 1, заедно с всички химически модификации.
На Фигура 2b е представена обща схема, показваща прикрепването на специфични праймери и матрици по химичен път към стъклената повърхност, като е посочено дериватизирането с ATS (аминопропилтриетоксисилан) като не-ограничаващ пример.
ТАБЛИЦА 1
Списък на олигонуклеотиди, използвани за приготвяне на матрици и
образуване на колонии:
| Име | ДНК секвенция | Координати (ориентация) | Олигонуклеотидна Модификация | Използване |
| ТР1 | GAGGCCAGAACAGT TCAAGG | 9810 (R) | Матрица 3.2 kb | |
| ТР2 | CCTGTGACAAGACG ACTGAA | 6550 (F) | Матрица 3.2 kb | |
| СР1 | ТТТТТТТТТТСАСС ААСССАААССААСС САААСС | Няма | 5’Р | Образува колонии |
| СР2 | GGAGAAGGAAAGGG AAAGGG | Няма | 5’Р | Образува колонии |
| СРЗ | ТТТТТТТТТТСАСС ААСССАААССААСС САААСС | Няма | 5’SH | Образува колонии |
| СР4 | GGAGAAGGAAAGGG AAAGGG | Няма | 5’SH | Образува колонии |
| СР5 | AGAAGGAGAAGGAA AGGGAAAGGGTTTT | Няма | 5’Р | Образува колонии |
| СР6 | AGAAGGAGAAGGAA AGGGAAAGGGGG | Няма | 5’Р | Образува колонии |
| СР7 | AACCCAAACCAACC CAAACC | Няма | 5’ (NH2) | Образува Колонии |
| СР8 | GGAGAAGGAAAGGG AAAGGG | Няма | 5’ (NH2) | Образува колонии |
| СР9 | GGAGAAGGAAAGGG AAAGGG | Няма | 5’ (OH) | Контролен Олиго |
| СР10 | GGAGAAGGAAAGGG AAAGGG | Няма | 5’ (DMT) | Контролен Олиго |
| СРИ | GGAGAAGGAAAGGG AAAGGG | Няма | 5’(биотин) | Контролен Олиго |
| TPA1 | AGAAGGAGAAGGAA AGGGAAAGGGCCTG TGACAAGACGACTG AA | 6550 (F) | 5’Р | Матрица А |
| TPA2 | GGAGAAGGAAAGGG AAAGGGGCGGCCGC TGAGGCCAGTGGAA GTCAGA | 7403 (R) | 5’Р | Матрица А |
| ТРВЗ | ТТТТТТТТТТСАСС ААСССАААССААСС CAAACCGAGCTCAG GCTGAGGCAGGAGA ATTG | 9049 (F) | Няма | Матрица B’ |
| ТРВ1 | AGAAGGAGAAGGAA AGGGAAAGGGGAGC TGAGGAGGAAGAGA GG | 9265 (F) | Няма | Матрица B |
| ТРВ2 | AGAAGGAGAAGGAA AGGGAAAGGGGCGG CCGCTCGCCTGGTTCT GGAAGACA | 8411 (R) | 5’P | Матрица B |
| ТРВ4 | AGAAGGAGAAGGAA AGGGAAAGGGGCGG CCGCTCGCCTGGTTCT GGAAGACA | 9265 (R) | 5’SH | Матрица B’ |
Координати от HUMOXRAGE ген Депозиран под номер D28769
(R) означава “обратен”, a (F) означава “преден”
Пример 1а: Приготвяне на случайна ДНК матрица фланкирана от дегенеративен праймер
Използва се 3.2 кЬ ДНК фрагмент като моделна система, за да се покаже възможността за образуване на колония чрез PCR амплификация със случаен праймер. Тази стратегия може да се приложи за секвениране на ДНК фрагменти с приблизителна дължина 100 kb и чрез комбиниране на фрагменти с целия геном. Получава се
3.2 kb ДНК фрагмент чрез PCR от човешка геномна ДНК, като се
използват PCR праймери; ТР1 5’ - pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG и TP2 5’ - pCCTGTGACAAGACGACTGAA както е описано в Пример 1. Фрагментът от 3.2 kb се срязва на малки фрагменти чрез комбинация от рестриктазни ензими (EcoRl и Hhal, което води до получаване на 4 фрагмента с дължина около 800 Ьр). След това срязаните и несрязани ДНК фрагменти се смесват с дегенеративен праймер, р252 (5’-Р TTTTTTTTTTISISISISISIS), където I означава инозин (който се свързва с А, Т и С), a S е за (G или С) и се свързват ковалентно с Nucleolink ямки (Nunc, Denmark). След това епруветките се подлагат на случайна твърдо фазова PCR амплификация и се визуализират чрез хибридизация с белязани ДНК сонди, което ще бъде описано в Пример 2а.
Пример 2: Ковалентно свързване на ДНК матрици и специфични праймери върху твърда подложка (пластмасова) и образуване на колония със специфичен праймер
Ковалентно свързване на матрица и специфичен праймер с твърдата подложка (пластмасова)
Специфичен праймер, фосфорилиран в 5’ края си (СР2, 5’ TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG^ (Microsynth GmBH, Switzerland) се прикрепва върху Nucleolink пластмасови микротитърни ямки (Nunc, Denmark), в присъствие на вариращи дози от Матрица А (приготвена, както е описано в Пример 1). Използват се 8 двойни реда със седем 1/10-ни разреждания от матрицата с СР2, като се започва от най-високата концентрация от 1пМ.
Микротитърните ямки, към които са свързани ковалентно СР2 специфичния праймер и матрицата, се приготвят по следния начин. Във всяка Nucleolink ямка се добавят по 30 μΐ от 1 μΜ разтвор на специфичния праймер с вариращи концентрации от матрицата,
разредена до 1 пМ в 10 тМ 1-метил-имидазол (pH 7.0) (Sigma Chemicals). Във всяка ямка, към разтвора от специфичен праймер и матрица, се добавят 10 μΐ от 40 тМ 1-етил-3-{3-диметиламинопропил}карбодиимид (pH 7.0)) (Sigma Chemicals) в 10 mM 1-метил-имидазол. След това ямките се запечатват и се инкубират при 50° С за една нощ. След инкубацията, ямките се промиват два пъти с 200 μΐ от RS (0.4 N NaOH, 0.25 % Tween 20), инкубират се 15 минути с 200 μΐ RS, измиват се два пъти с 200 μΐ RS и два пъти с 200 μΐ TNT (100 mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 % Tween 20). Епруветките се изсушават при 500 С и се съхраняват в запечатан пластмасов съд при 4° С.
Образуване на колония
Във всяка ямка се инициира растеж на колония с 20 μΐ от PCR сместа: четирите dNTPs (0.2 mM), 0.1 % BSA (говежди серумен албумин), 0.1 % Tween 20, 8 % DMSO (диметилсулфоксид, Fluka, Switzerland), 1 х PCR буфер и 0.025 единици/μΙ от AmpliTaq ДНК полимераза (Perkin Elmer, Foster City, СА). След това ямките се
поставят в амплификатор и се инициира растеж, чрез инкубиране на запечатаните ямки 5 минути при 94° С и чрез провеждане на 50 повтарящи се цикъла при следните условия: 94° С за 30 секунди, 65° С за 2 минути, 72° С за 2 минути. След завършване на тази програма, ямките се съхраняват при 8° С до използването им. Преди хибридизацията, ямките се запълват с 50 μΐ ТЕ (10 mM Tris, 1 тМ EDTA, pH 7.4), нагряват се при 94° С за 5 минути и се охлаждат върху лед, преди добавяне на сондата при 45° С.
Визуализиране на колониите
Сонда: Сондата е ДНК фрагмент от 1405 нуклеотидни двойки, включващи секвенцията от матрицата в техния 3’ край (нуклеотидни позиции 8405 до 9259). ДНК сондата се синтезира чрез PCR, като се
използват два праймера: р47 (5’ - GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA), амплифициращ от база 8*?05 и ТР2, биотинилиран в 5’ края, амплифициращ от база 9876 от антисенс веригата.
Хибридизация и детекция
Сондата се разрежда до 1 пМ в “easyhyb” (Boehringer-Mannheim, Germany) и към всяка ямка се добавят 20 μΐ. Сондата и колониите се денатурират при 94° С за 5 минути и след това се инкубират за 6 часа при 50° С. Излишъкът от сонди се измива при 50° С в 2 х SSC с 0.1 % Tween. ДНК сондите се свързват с авидин покрити зелени флуоресцентни флуоросфери, с диаметър от 0.04 μ (Molecular Probes) в TNT, за 1 час на стайна температура. Излишъкът от гранули се измива с TNT. Колониите се визуализират чрез микроскоп и образът се анализира както е описано в Пример 2а. Фигура 3 показва броят на колониите, наблюдавани при 20 х увеличение, като функция от концентрацията на матрица свързана с ямката. Най-ниската концентрация от детектирана матрица съответства на 10'13 М.
Пример 2а: Ковалентно свързване на ДНК матрици и специфични праймери с твърда подложка (пластмасова) и образуване на колония с дегенеративен праймер
Ковалентно свързване на матрица и специфичен праймер към твърда подложка (пластмасова)
Микротитърни ямки с р252 и ДНК фрагменти матрици се приготвят както следва:
Във всяка Nucleolink ямка се добавят по 30 μΐ от 1 μΜ разтвор на специфичния праймер р252 с вариращи концентрации от матрицата, разредена до 0.5 пМ в 10 тМ 1-метил-имидазол (pH 7.0) (Sigma Chemicals). Във всяка ямка, към разтвора от специфичен праймер и
матрица, се добавят 10 μΐ от 40 тМ 1-етил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (pH 7.0) ) (Sigma Chemicals) в 10 mM 1-метил-имидазол. След това ямките се запечатват и се инкубират при 50° С за една нощ. След инкубацията, ямките се промиват два пъти с 200 μΐ от RS (0.4 N NaOH, 0.25 % Tween 20), инкубират се 15 минути с 200 μΐ RS, измиват се два пъти с 200 μΐ RS и два пъти с 200 μΐ TNT (100 mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 % Tween 20). Епруветките се изсушават при 50 0 С и се съхраняват в запечатан пластмасов съд при 4° С.
Образуване на колония
За образуване на ДНК колония се използва модифициран протокол, осигуряващ случае я прайминг във всяка ямка с 20 μΐ от PCR сместа: четирите dNTPs (0.2 mM всеки), 0.1 % BSA, 0.1 % Tween 20, 8 % DMSO (диметилсулфоксид, Fluka, Switzerland), 1 х PCR буфер и 0.025 единици/μΙ от AmpliTaq ДНК полимераза (Perkin Elmer, Foster City, СА). След това ямките се поставят в амплификатор и се провежда амплификация, чрез инкубиране на запечатаните ямки 5 минути при 94° С и чрез провеждане нп 50 повтарящи се цикъла при следните условия: 94° С за 30 секунди, 65° С за 2 минути, 72° С за 2 минути. След завършване на тази програма, ямките се съхраняват при 8° С до използването им. Преди хибридизация, ямките се запълват с 50 μΐ ТЕ (10 mM Tris, 1 тМ EDTA, pH 7.4), нагряват се при 94° С за 5 минути и се охлаждат върху лед, преди добавяне на сондата при 45° С.
Визуализиране на колонии
Сонди: Два ДНК фрагмента от 546 и 1405 нуклеотидни двойки, включващи секвенциите от двгта външни края на изходната матрица се амплифицират чрез PCR. Антисенс веригата на сондата се бележи с биотин, чрез използване на 5’ биотинилиран PCR праймер.
Координатите на нуклеотидните двойки от сондите са 6550 до 7113 и 6734 до 9805.
Хибридизация и детекция
Сондите се разреждат до 1 пМ в “easyhyb” (Boehringer-Mannheim, Germany) и към всяка ямка се добавят 20 μΐ. Сондата и колониите се денатурират при 94° С за 5 минути и след това се инкубират за 6 часа при 50° С. Излишъкът от сонди се измива при 50° С в 2 х SSC с 0.1 % Tween. ДНК сондите се свързват с покрити с авидин зелени флуоресцентни флуоросфери, с диаметър от 40 нанометра (Molecular Probes, Portland OR) в TNT, за 1 час на стайна температура. Излишъкът от гранули се измива с TNT. Флуоресценцията се детектира чрез инвертен микроскоп (като се използва 20х/0.400 LD Achroplan обектив върху Axiovet S100TV, с дъгова живачна лампа НВО 100W/2, (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), свързан c 768 (Η) x 512 (V) пиксел-CCD камера (Princeton Instruments Inc. Trenton, NJ, USA). Експонацията e 20 секунди, през филтърен набор XF22 (Ex: 485DF22, Dichroic: 505DRLPO2 Em: 530DF30) и XF47 (Ex: 640DF20, Dichroic: 670DRLPO2 Em: 682DF22) от Omega Optical (Brattleboro VT) за FITC и Cy5 респективно. Данните се анализират чрез използване на Winwiew software (Princeton Instruments Inc., Trenton, NJ, USA). Изброяват се брой колонии на поле в удвоените ямки със софтуерен анализ за образа, разработен от нас.
Пример 3: Секвенционни различия в различни колонии, получени от вариращи съотношения на 2 различни ковалентно свързани матрици и специфичен праймер
Ковалентно свързване на матрици и специфичен праймер към твърдата подложка (пластмасова)
Специфичен праймер фосфорилиран в 5’ краищата си (СР2: 5’ pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG^ (Microsynth GmbH, Switzerland) се прикрепва върху Nucleolink пластмасови микротитърни ямки (Nunc, Denmark), в присъствие на вариращи дози от двете Матрица А и В (приготвени, както е описано в Пример 1). Подреждат се серии от 8 ямки в три реда със седем 1/10-ни разреждания от двете матрици, като се започва с най-високата концентрация от 1пМ. Разреждането на матриците се извършва в противоположни посоки, така че най-високата концентрация от една матрица да съвпада с най ниската от другата.
Микротитърните ямки, към които се свързват ковалентно СР2 праймера и двете матрици, се приготвят по следния начин. Във всяка Nucleolink ямка се добавят по 30 μΐ от 1 μΜ разтвор на СР2 праймера с вариращи концентрации от двете матрици, разредени до 1 пМ в 10 шМ 1-метил-имидазол (pH 7.0) vSigma Chemicals). Във всяка ямка, към разтвора от специфичен праймер и матрици, се добавят 10 μΐ от 40 тМ 1-етил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (pH 7.0) (Sigma Chemicals) в 10 mM 1-метил-имидазол (pH 7.0). След това ямките се запечатват и се инкубират при 50° С за 4 часа. След инкубацията, ямките се промиват три пъти с 50 μΐ от RS (0.4 N NaOH, 0.25 % Tween 20), инкубират се 15 минути ? 50 μΐ RS, измиват се три пъти с 50 μΐ RS и три пъти с 50 μΐ TNT (100 mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 % Tween 20). Епруветките се съхраняват в TNT при 4° С.
Образуване на колонии
Във всяка ямка се инициира растеж на колония с 20 μΐ от PCR сместа: четирите dNTPs (0.2 mM), 0.1 % BSA, 0.1 % Tween 20, 8 % DMSO (диметилсулфоксид, Fluka, Switzerland), 1 х PCR буфер и 0.025 единици/μΙ от AmpliTaq ДНК полимераза (Perkin Elmer, Foster City, СА).
След това ямките се поставят в амплификатор и се инициира растеж, чрез инкубиране на запечатаните ямки 5 минути при 94° С и чрез провеждане на 50 повтарящи се цикъла при следните условия: 94° С за 30 секунди, 65° С за 5 минути, 72° С за 5 минути. След завършване на тази програма, ямките се съхраняват при 8° С до използването им. Преди хибридизация, ямките се запълват с 50 μΐ ТЕ (10 mM Tris, 1 шМ EDTA, pH 7.4), нагряват се при 94° С за 5 минути и се охлаждат върху лед, преди добавяне на сондага при 50° С.
Визуализиране на колонии
Сонда: Двата ДНК фрагмента от 546 и 1405 нуклеотидни двойки, съответстващи на секвенциите на 3.2 kb ДНК фрагмент в 5’ и 3’ краищата, се амплифицират чрез PCR, като се използва един биотинилиран праймер (виж Пример 2). Двете сонди се денатурират чрез нагряване при 94° С за 5 минути, охлаждат се бързо в 1 М NaCl, 10 mM Tris, pH 7.4 и се свързват с покрити със стрептавидин флуоросфери с диаметър 0.04 pm, белязани с различни цветове, за 2 часа при 4° С. Свързаните с гранулите сонди се разреждат 20 пъти в “easyhyb” разтвор, предварително нагрят до 50° С. По 20 μΐ от сондите се добавя към всяка ямка, съдържаща денатурирани колонии.
Хибридизация и детекция
Хибридизацията се провежда при 50° С за 5 часа. Излишъкът от сонди се измива при 50° С в 2 х SSC с 0.1 % SDS. Колониите се визуализират чрез микроскоп с 20 х обектив, експонация 20 секунди и анализиране на образа, както е описано в Пример 2а. На Фигура 4а са показани колониите, създадени от двете матрици и негативни контроли. Фигура 4Ь показва колониите от две матрици, на едно и също място в една и съща ямка, визуализирани с два различни цвята и негативни контроли. Фигура 4с показва координатите на двата типа колонии в под-секцията на микроскопското поле. Фигура 4с показва, че колониите от различни матрици не съвпадат.
Пример4: Ковалентно свързване на ДНК матрици и олигонуклеотиди със стъклени твърди подложки
Като твърда подло? жа се използват предметни стъкла,
дериватизирани с аминосилан, за ковалентно прикрепване на олигонуклеотидни сонди модифицирани с тиол, чрез хетеробифункционални крос-свързващи агенти. Избраните реагенти имат тиол-реактивни (малеимид) и амино-реактивни групи (сукцинимидил естер). Резултатите от олигонуклеотидното прикрепване и стабилността на имобилизираните молекули ще зависи силно от стабилността на крос-свързващите агенти, по отншение на условията, при които се провеждат различните третирания. На Фигура 5 са показани схематично реакциите за прикрепване на ДНК матриците или олигонуклеотидите върху стъкло. Изчислена е стабилността за съхраняване на приготвените предметни стъкла с крос-свързващите агенти s-MBS и s-SIAB и температурната стабилност. Един важен фактор, влияещ върху степента на хибридизация на имобилизираните олигонуклеотидни сонди, е плътността на прикрепените сонди (Beattie et al., 1995; Joss et al., 1997). Нле изследвахме този ефект чрез вариране на концентрацията на олигонуклеотиди по време на имобилизирането и чрез оценка на плътността на прикрепените олигонуклеотиди при хибридизация.
Материали и методи
Предварително третиране на микроскопски предметни стъкла с киселина
Микроскопски предметни стъкла (Knittel, Merck ABS), се поставят в основен разтвор на Хематоксилин за 1 час (HelmanexIIR 0.25 %, 1 N NaOH). Стъклата се изплакват с вода, поставят се за една нощ в 1 N НС1, отново се изплакват с вода и се третират за 1 час в разтвор на сярна киселина (H2SO4/H2O, 1/1, v/v, като се прибавя малко количество свеж амониев персулфат). Предметните стъкла се промиват с вода, с етанол и накрая с чист ацетон. Стъклата се изсушават и се съхраняват под вакуум за по-нататъшна употреба.
Силанизация на повърхността
Предварително третираните стъкла се потапят в 5 % разтвор на ATS (аминопропилтриетоксисилан, Aldrich) в ацетон. Силанизирането се провежда при стайна температура, за 2 часа. След три измивания с ацетон (5 минутно/измиване), стъклата се изплакват един път с етанол, изсушават се и се съхраняват под вакуум.
Прикрепване чрез крос-свързващи реагенти
Крос-свързващите агенти, s-MBS и s-SIAB (респективно, сулфо т-малеимидобензоил-М-хидроксисукцинимид естер, сулфо Nсукцинимидил [4-йодоацетил] аминобензоат, Pierce, Rockford IL), се приготвят като 20 тМ разтвор в PBS (солеви фосфатен буфер, 0.1 М NaH2PO4, pH 7.2, 0.15 М NaCI). Силанизираните предметни стъкла, върху които са нанесени 80μ1 от разтвора на крос-свързващия агент, се покриват с чисти микро покривни стъкла и се оставят да реагират за 5 часа, при 20° С. Предметните стъкла се промиват с етанол. След това, стъклата се подсушават и се съхраняват под вакуум на тъмно до употреба.
Олигонуклеотидно прикрепване
Синтезират се олигонуклеотиди, като 5’ края се модифицира с тиолова (СРЗ и СР4, Eurogentec, Brussels) или с фосфатна група (СР1 и
СР2, Eurogentec, Brussels), като се използват стандартни химични методи за фосфорамидати.
- 5’- тиоловите олигонуклеотидни праймери (СРЗ и СР4) се приготвят като 100 μΜ разтвори в солеви фосфатен буфер (NaPi: 0.1 М NaH2PO4, pH 6.6, 0.15 М NaCI) и капки от Ιμΐ се поставят върху функционализираното предметно стъкло (функционализирано с кроссвързващ агент), за 5 часа при стайна температура. Предметните стъкла се съхраняват във влажна атмосфера, за да се предотврати изпарението. Предметните стъкла се промиват с NaPi буфер върху клатачка. За да са температурно стабилни, предметните стъкла се потапят 2 пъти в Tris буфер (10 mM, pH 8) за 5 минути, при 100° С и после се поставят директно в 5 х SSC (0.75 М NaCI, 0.075 М Na-цитрат, pH 7), при 4° С за 5 минути. Предметните стъкла се съхраняват в 5 х SSC при 4° С до употреба.
- 5’- фосфатните олигонуклеотидни праймери (СР1 и СР2) се нанасят (Ιμΐ капки) върху амино-дериватизирани стъкла, за 5 часа при стайна температура, koto 1 μΜ разтвор в 10 тМ 1-метил-имидазол (pH 7.0) (Sigma Chemicals), съдържащ 40 mM от 1-етил-3~(3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC, Pierce, Rockford IL). Предметните стъкла се промиват 2 пъти в Tris буфер (10 mM, pH 8) при 100° С и после се потапят директно в 5 х SSC, при 4° С за 5 минути. Предметните стъкла се съхраняват в 5 х SSC при /0 С до употреба.
Прикрепване на олигонуклеотид и ДНК матрица
5’ - тиоловите нуклеотидни праймери (СРЗ и СР4) и 5’тиоловата матрица В’ се смесват в солеви фосфатен буфер (NaPi: 0.1 М
NaH2PO4, pH 6.6, 0.15 М NaCI). Концентрацията на ДНК матрицата варира от 0.001 до 1 μΜ, а на праймерите от 0.1 до 100 μΜ, но те се оптимизират до 1 μΜ и 100 μΜ, респективно за матрицата и праймерите. След това следва описаната по-горе процедура за прикрепване на СРЗ и СР4 върху функционализирана стъклена
повърхност.
- 5’- фосфатните олигонуклеотидни праймери (СР1 и СР2) и 5’ фосфатната матрица В се смесват в 10 тМ 1-метил-имидазол (pH 7.0) (Sigma Chemicals) разтвор, съдържащ 40 тМ от 1-етил-3-(3диметиламино-пропил) карбодиимид (EDC, Pierce, Rockford IL). Концентрацията на ДНК матрицата варира от 0.001 до 10 пМ, а на праймерите от 0.1 до 1 μΜ, но те се оптимизират до 10 пМ и 1 μΜ, респективно за матрицата и праймерите. След това следва описаната по-горе процедура за прикрепване на СР1 и СР2 върху амино дериватизирана стъклена повърхност.
Хибридизация с флуоресцентни сонди
Олигонуклеотидните сонди, флуоресцентно белязани в техния 5’ край с Су5 или FITC са синтезирани от Eurogentec (Brussels). За да се предотврати неспецифична хибридизация, предметните стъкла се инкубират с блокиращ разтвор (5 х SSC, Tween 0.1 %, BSA 0.1 %) за 1 час и се промиват върху клатачка в 5 х SSC (2 пъти, по 5 минути). Олигонуклеотидните сонди се разреждат до 0.5 μΜ в 5 х SSC, Tween 0.1 % и се нанасят върху стъклената повърхност за 2 часа, при стайна температура. Предметните с^кла се промиват върху клатачка при 37° С, един път в 5 х SSC за 5 минути и два пъти в 2 х SSC, съдържащ 0.1 % SDS за 5 минути.
Хибридизация с радиоактивно белязани сонди
Като хибридизационни сонди се използват радиоактивно белязани олигонуклеотиди, комплиментарни на ковалентно свързаните олигонуклеотиди, за да се определи количеството на хибридизиралите проби. 5’ краищата на олигонуклеотидите се бележат по ензимен път с [γ-32Ρ] dATP (Amersham, UK), като се използва полинуклеотид киназа от бактериофаг Т4 (New England, Biolabs, Beverly, МА). Излишъкът от [γ-32Ρ] dATP се отстранява чрез Chroma Spin колона ТЕ-10 (Clontech, Palo Alto, СА). След това, радиоактивно белязаните олигонуклеотиди (0.5 μΜ в 5 х SSC, Tween 0.1 %) се нанасят върху дериватизираните предметни стъкла, за 2 часа на стайна температура. След това, стъклата се изплакват върху клатачка едни път в 5 х SSC за 5 минути и два пъти в 2 х SSC, SDS 0.1 % за 5 минути, при 37° С. След хибридизация, специфичната активност се определя чрез сцинтилатор.
Микроскопско наблюдение
Предметните стъкла се покриват с 5 х SSC разтвор и се поставят покривни стъкла. Флуоресценцията се детектора чрез инвертен микроскоп, модел Axiovert S100TV, с дъгова живачна лампа НВО 100W/2, (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), свързан със CCD камера, снабдена със CCD Kodak, с формат 768 (Н) х 512 (V) пиксела; с външен размер 6.91 х 4.6 mm, пиксел размер 9x9 рш2 (Princeton Instruments Inc. Trenton, NJ, USA). Времето на експонация е между 1 и 50 секунди, като се използва обектив LD Achroplan 20х/0.400 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) и набор от филтри XF22 (Ex: 485DF22, Dichroic: 505DRLPO2 Em: 530DF30) и XF47 (Ex: 640DF20, Dichroic: 670DRLPO2 Em: 682DF22) от Omega Optical (Brattleboro VT), респективно за FITC и Cy5 флуорофори. Данните се анализират чрез използване на Winwiew software (Princeton Instruments Inc., Trenton, NJ, USA).
Резултати
Оценка за съхраняване на стабилността при прикрепване и температурна стабилност
Ние отчетохме съхраняване на стабилността на стъклените плата, приготвени с s-MBS и s-SIAB. Тъй като тези реагенти са чуствителни на хидролиза, резултатът от олигонуклеотидното прикрепване ще зависи от тяхната стабилност. Амино-дериватизираните стъклени плата са функционализирани със свежо приготвени крос-свързващи реагенти, s-MBS и s-SIAB. Функционализираните предметни стъкла се съхраняват след крос-свързващото прикрепване за 10 дни, в изсушител под вакуум, на тъмно при стайна температура. След изтичане на това време, се анализират съхраняваните предметни стъкла (t = 10 дни) и свежо приготвени предметни стъкла (t = 0). Сравняват се резултатите получени след реакция на тиолов-олигонуклеотид и хибридизация на комплиментарна флуоресцентна сонда, както за t = 0, така и за времето 1=10дни.
Веднъж имобилизирани, функционализираните със s-SIAB предметни стъкла са напълно стабилни след 10 дневно съхраняване, както се вижда от хибридизацията, получена при t = 0 и при t = 10 дни. За разлика от това е показано, че свързването на s-MBS със стъкло е помалко стабилно, с 30 % загуба при олигонуклеотидно прикрепване и хибридизация след 10 дневно съхраняване. В заключение, за предпочитане са функционализираните със s-SIAB стъкла, тъй като те могат да се приготвят предварително и да се съхраняват сухи под вакуум, на тъмно, поне в рамките на 10 дни, без да се намалява степента на прикрепване на сондата.
За определяне на температурната стабилност на олигонуклеотиди прикрепени към стъкло, предметните стъкла се подлагат на две 5
ΜΜΝ минутни третирания, при 100° С в 10 mM Tris-HCl, pH 8. Останалите след промиването все още имобилизирани олигонуклеотиди, се анализират чрез хибридизация с флуоресцентно белязан, комплиментарен олигонуклеотид. Около 14 % от прикрепените молекули се освобождават при s-SIAB обработените стъкла и 17 % при тези със s-MBS, след първото 5 минутно промиване, но след това, при второто промиване не се наблюдава повече освобождаване и при двата вида третирани стъкла (ТАБЛИЦА 1А). Тези резултати са доста окуражаващи в сравнение с тези, получени от Chrisey et al., 1996, където се освобождават повече от 62 % от олигонуклеотидите прикрепени върху кварцови стъкла, чрез крос-свързващия агент SMPB (Сукцинимидил 4-[р-малеимидофенил] бутират), отчетени след 10 минутно третиране в PBS при 80° С.
ТАБЛИЦА 1А
| Резултати от хибридизацията (условни единици, приведени към 100 %) | |||
| Свежо прикрепени | След 5 мин Измиване при 100° С | След 2x5 мин Измиване при 100° С | |
| s-MBS | 80 ±6 | 69 ±4 | 73 ±4 |
| s-SIAB | 100 ±9 | 84 ±8 | 87 ±3 |
Таблица 1 А: Изследване на температурна стабилност
Олигонуклеотиди се прикрепват към предметни стъкла, функционализирани или със s-MBS, или със s-SIAB. Прикрепените олигонуклеотиди се анализират чрез хибридизация с флуоресцентно белязан комплиментарен олигонуклеотид. Флуоресцентният сигнал се приравнява към 100, за най-високо получения сигнал. Съобщени са средните стойности от трикратно проведен анализ.
Хибридизацията като функция от прикрепване на сондата
Ние изследвахме степента на хибридизация на ковалентно свързани олигонуклеотидни сонди, като функция от покритата с прикрепени олигонуклеотиди повърхност, чрез използване на s-MBS, s-SIAB крос-свързващи агенти и EDC медиирани реакции. Концентрацията на нанесените за имобилизация олигонуклеотиди е 1 μΜ за EDC, като тя варираше за крос-свързващите реагенти между 1 и 800 μΜ, повърхностната плътност се анализира чрез хибридизация с 32Р-белязани сонди. Оптималната концентрация за прикрепване на праймер, чрез използване на хетеробифункционални крос-свързващи реагенти е 500 μΜ, което се равнява на повърхностна плътност от хибридизирали молекули на 60 fmol/mm за s-MBS и на 270 fmol/mm за s-SIAB. Сходна покриваща плътност като тази на s-MBS е получена, като се използва EDC/имидазол-медиирано прикрепане на 5’ фосфатни олигонуклеотиди към аминосиланизирани стъкла. Необходими са обаче само 1 μΜ разтвори от олигонуклеотиди, за да се получи същото прикрепване, което означава към s-MBS да се прикрепи 500 пъти излишък от олигонуклеотиди, в сравнение с комбинираната EDC/имидазол стратегия (Таблица 1В).
ТАБЛИЦА IB
| Хибридизирали олигонуклеотиди ι | fmol/mm2) | ||
| Концентрация на Олигонуклеотиди, използвани За прикрепване (μΜ) | s-MBS | s-SIAB | EDC |
| 1 | NT | NT | 50 |
| 100 | 10 | 100 | NT |
| 500 | 60 | 270 | NT |
Таблица IB: Хибридизацията като функция от прикрепване на сонда
Олигонуклеотидите се прикрепват към предметни стъкла, функционализирани или със s-MBS, или със s-SIAB, или чрез медииращия активиращ агент EDC. Прикрепените олигонуклеотиди се анализират чрез хибридизация с радиоактивно белязан комплиментарен олигонуклеотид. Специфичната активност, а следователно и плътността на хибридизиралите молекули се определя чрез сцинтилационна течност. NT: не е тестуван.
Повърхностната плътност 60 fmol/cm2 отговаря на средно молекулно пространство между свързаните олигонуклеотиди, от 8 nm. Според нашите резултати, плътностният обхват от 30 fmol/mm2 (пространство от 20 nm) е достатъчен за получаване на ДНК колонии. Този добив може да се получи чрез имобилизиране на праймери от 100 μΜ, като се използва хетеробифункционален крос-свързващ реагент sSIAB или 1 μΜ сонди, чрез използване на EDC-медииращият подход. Хибридизационните плътности, които получихме са в обхвата на найвисоките плътности получени върху предметни стъкла, в сравнение със съобщенията от други предишни протоколи за прикрепване (Guo et al., 1994, Jose et al., 1997, Beattie et al., 1995).
Образуване на ДНК колония върху стъкло: формирането на колонии зависи от дължината, концен рацията на матрицата и концентрацията на праймерите
Теоретично, образуването на ДНК колония изисква подходяща плътност от праймери прикрепени върху повърхността, отговарящи на подходяща дължина от ДНК матрицата. За образуване на оптимална ДНК колония е важно да се определи плътностния обхват на свързаните праймери и матрици, както и стехиометричното отношение между матрица и праймер.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Приготвяне на предметни стъкла
Предметните стъкла се дериватизират и функционализират както е описано по-горе (Материали и методи). Специфичните праймери за ДНК са СР1 и СР2. Матриците за колонии се приготвят както е описано в Пример 1 за матрица В’, но като се използват праймери ТРВЗ и ТРВ2. Модифицираните специфични праймери и матрици се нанасят върху стъклената повърхност с различни концентрации на специфичния праймер и на матрицата.
Образуване на колонии
Предметните стъкла съхранявани в 5 х SSC се промиват с филтрувана вода, за да се отстранят солите. Върху стъклената повърхност се инициира растеж на колонии с PCR смес; четирите dNTP (0.2 mM), 0.1 % BSA, 0.1 % Tween 20, 1 х PCR буфер и 0.05 U/μΙ от AmpliTaq ДНК полимераза (Perkin Elmer, Foster City, СА). PCR сместа се поставя в затворена камера (MJ Research, Watertown, МА). Предметните стъкла се поставят в амплификатора (The DNA Engine, MJ Research, Watertown, МА) и амплификацията се провежда както следва: етап 1 при 94° С за 1 минута, етап 2 при 65° С за 3 минути, етап 3 при 74° С за 6 минути и тази програма се повтаря 50 пъти. След завършване на тази програма, препаратите се съхраняват при 6° С до използването им.
Разграждане на двойноверижни ДНК колонии
Съдържащата се на повърхността на стъклото ДНК, се разгражда с рестриктазна нуклеаза, чрез нанасяне на рестриктазния ензим в 1 х буфер за разграждане. Реакцията се провежда 2 пъти за 1 час и половина при 37° С. Двойноверижните ДНК колонии се денатурират чрез потапяне на стъклата 2 пъти в трие буфер (10 mM, pH 8), при 100° С за 5 минути, последвано от изплакване в 5 х SSC, при 4° С. Препаратите се съхраняват в 5 х SSC до използването им.
Хибридизация на едноверижни ДНК колонии
За да се предотврати неспецифична хибридизация, предметните стъкла се инкубират в блокиращ разтвор (5 х SSC, 0.1 % Tween, 0.1 В SA) за 1 час и стъклата се изплакват в 5 х SSC (2 пъти по 5 минути). Флуоресцентно белязаните Су5 в 5’ края олигонуклеотиди (Eurogentec, Brussels) се разреждат до 0.5 μΜ в 5 х SSC, Tween 0.1 % и се нанасят върху стъклената повърхност поне за 2 часа. Предметните стъкла се промиват върху клатачка един път с 5 х SSC за 5 минути и два пъти с 5 х SSC, SDS 0.1 % по 5 минути, при 37° С.
Предметните стъкла се визуализират както беше описано преди това.
Ние наблюдавахме преди това, че степента на хибридизацията е функция от плътността на олигонуклеотидното прикрепване. Сходно изследване със свързани ДНК матрици показва, че образуването на колония е също така функция от концентрацията на прикрепената за предметното стъкло матрица. В зависимост от химичния подход използван за прикрепване на олигонуклеотид и матрица, оптималната концентрация за матрица е 1 μΜ, за би-функционалните кроссвързващи реагенти, s-MBS (Фигура 6В) и 1 пМ за EDC карбодиимид (Фигура 6А). Интересното е, че използването на по-висока концентрация от матрица, не увеличава броя на колонии при използване на EDC като химичен подход, а по-скоро се достига плато, съответстващо на максимален брой колонии.
Ние изследвахме образуване на колония (брой), като функция от концентрацията на праймерите, концентрацията на ДНК матрицата, нанесена върху повърхността и дължината на ДНК матрицата.
Ние отчетохме също така броят от копия матрици във всяка колония. Количественото определяне се базираше на флуоресцентна детекция с Су5-, СуЗ- или флуоресцеин белязани флуорофори, подадени с анти-обезцветя; .ащ реагент (Prolong, Molecular Probes, Portland OR). Проверката се извършва чрез хибридизационни експерименти върху праймери, прикрепени към повърхността, тъй като съответстващата точна плътност се определя чрез радиоактивност.
Пример 5: in situ секвениране на ДНК колония
Най-напред предметни стъкла (5 mm диаметър Verrerie de Carouge, Switzerland) се поставят в баня от Helmanex 0.2 % (в Н2О), 1 N NaOH за 1 час при стайна температура, изплакват се в дестилирана вода, изплакват се в чист Hexane, изплакват се отново два пъти с дестилирана вода и се третират с 1 N НС1 за една нощ, на стайна температура. След това, те се изплакват два пъти с дестилирана вода, и се третират със H2SO4 (50 %) + K2S20g за 1 час на стайна температура.
Те се изплакват с дестилирана вода, а след това два пъти с етанол. Предметните стъкла се дериватизират с ATS (както е описано в Пример 4).
Специфични праймери СР1 (5’ - рТТТТТТТТТТСАССААСССАААССААСССАААСС) и СР2 (5’- pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), които са фосфорилирани в 5’ края си (Microsynth GmbH, Switzerland) и ДНК матрица В (приготвена кактс е описано в Пример 1) се прикрепват 5’ ковалентно върху предметните стъкла с диаметър 5 mm (Verrerie de Carouge, Switzerland) до крайни концентрации от 1 μΜ и 10 пМ респективно, както следва: 2 наномола от всеки праймер се добавят към 0.2 наномола матрица в 1 ml разтвор А (41 μΐ Метилимидазол (Sigma, &М-8878) в 50 ml Н2О, pH се коригира до 7 със НС1) и след това се смесва 1:1 с разтвор D (0 2 mM EDC в 10 ml разтвор А). От двете страни на предметното стъкло се нанасят по 3.5 μΐ от сместа и се инкубират за една нощ на стайна температура. След това предметните стъкла се изплакват за кратко време в 5 х SSC буфер и се поставят 2 пъти по 5 минути при 100°С в 10 mM Tris буфер, pH 8.0.
Неспецифичните места върху стъклената повърхност се блокират с Говежди Серумен Албумин (BSA, Boehringer Mannheim GmbH, Germany, #238040) c lmg/ml в 5 x SSC буфер, за 1 час на стайна температура и след това се изплакват с дестилирана вода.
След това стъклата се поставят поотделно в Microamp™ реакционна епруветка (Perkin Elmer), съдържаща 170 μΐ от PCR сместа, след което следва образуване на ДНК колонии, чрез използване на Taq полимераза (AmpliTaq, PE-Applied Biosystems Inc., Foster City, СА) за 50 цикъла (94 C/60”, 60 C/3', 72 C/6’) в MTC 200 амплификатор (MJ Research, Watertown, МА). След това, всяко предметно стъкло се обработва два пъти с 1.3 единици от Pvu II (Stratagene) в NEB 2 буфер (New England Biolabs) за 45 минути, при 37° С. След разграждането, епруветките се поставят при 100° С в 10 mM Tris буфер, pH 8.0, 2 пъти по 5 минути, след това се блокират с филтруван (Millex GV4, Millipore) BSA 1 mg/ml в 2 x SSC буфер, за 30 минути на стайна температура и се изплакват най-напред в 2 х SSC 0.1 % SDS буфер, а след това в 5 х SSC буфер. Всяко предметно стъкло се инкубира за една нощ на стайна температура в буфер 5 х SSC/0.1 % Tween 20, съдържащ 1 μΜ секвениращ праймер р181 (CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC) за една нощ на стайна температура. Контролите без праймер се съхраняват в буфер 5 х SSC, 0.1 % Tween 20. Предметните стъкла се изплакват 2 пъти в 5 х SSC, 0.1 % SDS при 37° С за 5 минути и се промиват в 5 х SSC. Праймер pl81 може да хибридизира с матрица В’ и последователността следваща р181 е CAGCT.......... За да се улесни фокусирането, на дъното на ямките се адсорбират зелени флуоресцентни гранули, катс всяка ямка се инкубира с 20 μΐ от 1/2000 разредени 200 nm жълто/зелено флуоресциращи, покрити със стрептавидин FluoSpheres(R) (Molecular Probes, Eugene, OR) в 5 x SSC, за 20 секунди на стайна температура.
След хибридизация с праймера, към всяко предметно стъкло се добавят по 2 μΐ разтвор, съдържащ 0.1 % BSA, 6 тМ дитиотреитол (Sigma Chemicals), 5 μΜ Cy5™-dCTP или 5 μΜ Cy5™-dUTP (Amersham, UK) и 1 x Секвеназен буфер. Добавянето на Су5™ нуклеотида се инициира от добавянето на 1.3 единици от Т7 Sequenase™ ДНК полимераза (Amersham, UK), за две минути, на стайна температура. Ямките се измиват два пъти с разтвор от 5 х SSC/0.1 % SDS за 15 минути и се изплакват с 5 х SSC буфер.
Пробите се наблюдават с инвертен микроскоп (Axiovert S100TV,
Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany), снабден c Micromax 512 x 768
CCD камера и Winview software (Princeton Instruments, Trenton, NJ). 3a фокусиране се използва 20 x обектив и набор от филтри XF22 (Omega
Optical, Brattleboro VT), а за наблюдаване на включения в пробите
Су5™, се използва 20 х обектив и набор от филтри XF47 (Omega Optical), с експонация 50 секунди, като се използва 2x2 пиксел binning. Не се открива сигнал с жълто/зелените FluoSpheres(R) (при прегледа на около 100 полета) като се използва набор от филтри XF47 и експонация от 50 секунди (данните не са показани). Фотосите са направени чрез програма Winview (Princeton Instruments).
Фигура 7А показва резултата след инкубиране на пробата със 'Т'» д ___
Су5 -dCTP, която не е била инкубирана с праймер pl81. Вижда се, че се наблюдават само 5 неясно очертани петна, което показва, че това не е някакъв недостоверен ефект (например като Су5 ™ - dCTP агрегатна преципитация, адсорбция или просто неспецифично включване в ДНК колониите или по повърхността). Фигура 7В показва резултата след инкубиране на проба с Су5 ™ - dUTP, която е била инкубирана с праймер р181. Вижда се, чс не се наблюдава флуоресцентно петно, което показва, че не става включване на флуоресцентна база в количества, които могат да се детектират, когато необходимият за включване нуклеотид не съответства на секвенцията от матрицата, следвайки хибридизиралия праймер. Фигура 7С показва резултата след инкубиране на проба със Су5 ™ - dCTP, която е била инкубирана с праймер р181. Вижда се, че могат да се наблюдават много флуоресцентни петна, което показва, че наистина става включване на флуоресцентна база в количества, които се детектират, когато необходимият за включване нуклеотид, съответства на секвенцията от матрицата, следвайки хибридизиралия праймер. Като обобщение, ние показваме, че е възможно да се включат по специфичен за секвенцията начин флуоресцентни нуклеотиди в ДНК, съдържаща се в колониите и да проследим това включване чрез описания метод и апаратура . Обаче това е само един пример. Ясно е, че при желание включването на флуоресцентна база може да сс повтори няколко пъти. Тъй като това се прави по специфичен за секвенцията начин, то е възможно да се проследи част от секвенцията на ДНК, съдържаща се в колониите.
Пример 6: Анализ на секвенцията на 5’ края в иРНК
Най-прецизният начин да се проследи генната експресия в клетки или тъкани е да се редуцира броят на етапите между събирането на пробата и оценката на иРНК. В търговската мрежа са налични нови методи за бързо изолиране на иРНК. Най-ефективните методи включват бързо изолиране на пробата и незабавно разрушаване на клетките в разтовр от гуанидинов хидрохлорид, който напълно разрушава белтъците и инактивира RNA-азите. След този етап, следва пречистване на иРНК от супернатантата на разрушените клетки, чрез олиго-dT афинитетна хроматография. Най-накрая 5’-шапкуваната иРНК може да се трансформира в кДНК, като се използва семпла стратегия (SMART cDNA synthesis, Clontech, Palo Alto).
Този метод позволява синтез на кДНК копия, само от транслационно активна 5’- шапкувана иРНК. Чрез комбиниране на горните методи за бързо изолиране на иРНК и приготвяне на кДНК, като се използва метода за образуване на колония от прикрепена ДНК матрица, описан в настоящата заявка, ние имаме подход за широкомащабно идентифициране на голям брой 5’ краища в иРНК. Предимството на нашето изобретение е във възможността да се секвенират голям брой кДНК, чрез директно прикрепване на продукта от кДНК синтезата, амплифициране на кДНК в хиляди копия, последвано от едновременно in situ секвениране на кДНК-и.
Материали и методи
Синтетични олигонуклеотиди и плазмиди
Синтезират се олигонуклеотиди с 5’ - фосфати чрез Eurogentec или Microsynth. Чрез стандартни методи се създават плазмиди, съдържащи частично кодиращи и 3’ - нетранслиращи се секвенции от миши ген за калиев канал, mSlo, следвайки ТЗ РНК полимеразен промотор.
Синтез на иРНК mSlo плазмидите се линеализират в едно място със Sal I или със Sac I рестриктазна нуклеаза, следвайки поли А+ секвенцията в плазмида. След третиране на скъсания плазмид с протеиназа К, линейната плазмидна ДНК се екстрахира еднократно с фенол/СНзС1/изоамилов алкохол и се утаява с етанол. Преципитиралата ДНК се разтваря отново в Н?О, с концентрация 10 gg/ml. Синтезира се синтетична иРНК, шапкувана в 5’ края с метилгуанозин чрез mMessage mMachine in vitro mRNA кит за синтезиране, според инструкциите на производителя (Ambion, Austin ТХ). Синтетичната иРНК се съхранява при 80° С.
Ензими
Рестриктазните ензими са получени от New England, Biolabs (Beverly, МА).
Синтез на кДНК
Синтетична иРНК се смесва с миша полиА+ иРНК от черен дроб, в различни моларни съотношения (1:1, 1:10, 1:100) и се извършва синтез на кДНК върху сместа от синтетична и миша чернодробна иРНК, като се използва “SMART PCR cDNA synthesis kit” (Clontech, Palo Alto СА) c някои малки модификации. За реакцията на кДНК се смесват 1 gg от иРНК сместа с праймера СР5, съдържащ в 5’ края си секвенцията на СРр, (5’ р 82
AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTNN).
Този праймер се използва за да се направи синтез на първата кДНК верига. За синтез на втората верига се използва “SMART” техниката. Същността на SMART синтезата е свойството на вирусната миша обратна транскриптаза Moloney да добавя от три до пет дезоксицитозинови остатъка в 3’ - краищата на първата кДНК верига, когато иРНК съдържа 5’-метилгуанозинова шапка (SMART user manual, Clontech, Palo Alto, СА). CP6 праймера, който съдържа секвенцията на СРР плюс AAAGGGGG в 3’ края, (5’ рAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG ) се използва за синтез на втората кДНК верига. Използва се буфер и SUPERSCRIPT™ II RNase Н-обратна транскриптаза от Moloney миши левкемичен вирус (Life Technologies, Ltd.), както е описано в инструкциите и реакцията се провежда за 1 час, при 42° С. кДНК се подлага на PCR, като се използва праймер р251, който съдържа фрагмент от секвенцията СРР, (5’GAGAAGGAAAGGGAAAGG) с Taq ДНК полимераза (Platinum Taq, Life Technologies, Ltd.).
Приготвяне на ДНК колонии
5’ p-кДНК се смесва с различни концентрации от твърдо фазовия специфичен праймер СР2 (5’ р TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) и се свързва по химичен път с Nucleolink PCR епруветки (NUNC), като се спазват инструкциите на производителя. След това се образуват ДНК колонии, като се използва Taq полимераза (AmpliTaq Gold, PE-Applied Biosystems Inc., Foster City CA), c 30 цикъла (94 C/30”, 65 C/1’, 72 C/1.5’) в MTC 200 амплификатор (MJ Research, Watertown, MA).
ДНК сонди и хибридизация
32
Синтезират се биотинилирани и Р-радиоактивно белязани ДНК сонди, специфични за mSlo ДНК секвенцията с 5’ - биотинилиран праймер и нормален краен праймер чрез PCR, върху матрицата (mSlo плазмидна ДНК). Сондата включва a [32P]-dCTP (Amersham, Amersham UK) в съотношение 300:1 (a [32P]-dCTP към dCTP) в PCR реакцията, c крайна концентрация от четирите дезоксинуклеозид трифосфати от 50 μΜ. Получената биотинилирана и радиоактивно белязана сонда се обезсолява в Chromaspin-1000 колона (Clontech, Palo Alto, СА). ДНК сондите хибридизират с матриците в “easyhyb” буфер (BoehringerMannheim, Germany), като се използва следната температурна схема (в МТС 200 амплификатор): 94° С за 5 минути, последвано от 68 етапа, с намаляване на температурата с 0.5° С всеки 30 секунди (с други думи, температурата спада до 60° С за 34 минути), като се използват запечатани ямки. След това пробите се измиват 3 пъти с 200 μΐ TNT, на стайна температура. След това ямките се инкубират за 30 минути с 50 μΐ TNT, съдържащ 0.1 mg/ml BSA (New England Biolabs, Beverly, MA). След това ямките се инкубират 5 минути с 15 μΐ разтвор от флуоресциращи в червено, покрити със стрептавидин, 40 нанометрови микросфери (Molecular Probes, Portland, OR). Разтворът от микросфери се приготвя от 2 μΐ сток-разтвор от микросфери, които се озвучават за 5 минути във 50 W ultra-sound водна баня (Elgasonic, Bienne, Switzerland), разреден в 1 ml TNT разтвор, съдържащ 0.1 mg/ml BSA и се филтрува с Millex GV4, като размера на порите на филтъра е 0.22 pm (Millipore, Bedford, МА).
Визуализиране на ДНК колония
Оцветените проби се наблюдават чрез инвертен Axiovert 10 микроскоп, като се използва обектив 20 х (Carl Zeiss AG, Oberkochen,
Germany), снабден със Micromax 512 x 768 CCD камера (Princeton
Instruments, Trenton, NJ), като се използва набор от филтри
PB546/FT580/LP590 и светлина за активиране 10 секунди. Файловете се превръщат във TIFF формат и се подлагат на подходящ software (PhotoPaint, Corel Corp. Ltd, Dublin, Ireland). Преработката включва инверсия и линейно контрастно увеличаване, за да се осигури подходяща картина за черно и бяло принтиране с лазарен принтер.
РЕЗУЛТАТИ
Синтетична иРНК и синтез на кДНК
Следвайки синтеза на кДНК, кДНК се проверява чрез PCR, като се използва праймера р251 (конструиран на всеки край от първата кДНК верига), за коректните дължини на продуктите, анализирани чрез агарозна гел електрофореза. Синтетичната mSlo иРНК се разрежда с чернодробната иРНК, което се доказва чрез намаляване на интензитета на mSlo-специфичната ивица и увеличаване на не-специфичен емир от чернодробна кДНК.
Детектиране и количествено определяне на ДНК колонии
ДНК колониите се анализират чрез използване на флуоресцентен CCD микроскоп или чрез сцинтилационно броене. Броят на наблюдаваните флуоресцентни колонии се увеличава като функция от количеството на свързаната матрица, както е показано на Фигура 6. Увеличението се отчита чрез измерване на количеството от радиоактивен 32Р.
С радиоактивно белязаните сонди е възможно да се открият иРНК копия до около 1:100. Но с флуоресцентната микроскопска CCD техника могат да се открият hFHK разредени до 1:10000.
Пример7: Ковалентно свързване на праймер към твърдата подложка (пластмасова)
Олигонуклеотидни праймери се прикрепват върху Nucleolink пластмасови микротитърни ямки (Nunc, Denmark), за да се определи оптималния химичен подход и време на свързване.
Олигонуклеотиди; СР2 (5’ - (фосфат) - TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), СР8 (5’ - (аминохексаметилен) - ТТТТТТТTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), СР9 (5’- (хидроксил)TTTTTTTTTTAGAAGGrAGAAGGrAAAGGGAAACrGG), СР10 (5’ (диметокситритил) - TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) и СР11 (5’ (биотин) - TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), (Microsynth GmbH, Switzerland) се прикрепват към микротитърни Nucleolink ямки както следва: (8 ямки за всеки); към всяка ямка се добавят по 20 μΐ от разтвор, съдържащ 0.1 μΜ олигонуклеотид, 10 тМ 1-метил-имидазол (pH 7.0) (Sigma Chemicals) и 10 тМ 1-етил-3-(3-диметиламинопропил) - карбодиимид (pH 7.0) (Sigma Chemicals) в 10 тМ 1-метил-имидазол. След това ямките се запечатват и се инкубират при 50° С за различен период от време. Реакцията на свързване се спира в определено време, чрез двукратно промиване с 200 μΐ RS (0.4 N NaOH, 0.25 % Tween 20) и два пъти с 200 μΐ TNT (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 % Tween 20). Епруветките се изсушават при 50° С за 30 минути и се съхраняват в затворени пластмасови кутии при 4° С.
Стабилност на свързаните олигонуклеотиди в условия на PCR за образуване на колония
Стабилността се анали: ,ира в условия на растеж на колония, чрез добавяне на PCR смес (20 μΐ от четирите dNTPs (0.2 mM), 0.1 % BSA,
0.1 % Tween 20, 8 % DMSO (диметилсулфоксид, Fluka, Switzerland), 1 x PCR буфер). След това ямките се поставят в амплификатора за 33 повторения, при следните условия: 94° С за 45 секунди, 60° С за 4 минути, 72° С за 4 минути. След завършване на тази програма, ямките се изплакват с 5 х SSC, 0.1 % Tween 20 и се съхраняват при 8° С до използването им. Преди хибридизацията, ямките се запълват с 50 μΐ 5 х SSC, 0.1 % Tween 20, нагряват се до 94° С за 5 минути и се съхраняват на стайна температура.
Сонда
Олигонуклеотидните сонди, R57 (5’(фосфат) GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG, контролна сонда) и R58 (5’ (фосфат) - СССТТТСССТТТССТТСТССТТСТ, която е комплиментарна на СР2, СР8, СР9, СР10 и СР11), се бележат чрез ензими в техните 5’ краища с [γ-32Ρ] dATP (Amersham, UK), като се използва полинуклеотид киназа от бактериофаг Т4 (New England Biolabs, Beverly, МА). Излишъкът от 32Р dATP се отстранява с Chroma Spin колона ТЕ-10 (Clontech, Palo Alto СА). След това радиоактивно белязаните олигонуклеотиди (0.5 μΜ в 5 х SSC, 0.1 % Tween 20) хибридизират с олигонуклеотид дериватизираните Nucleolink ямки, при 37° С за два часа. Ямките се измиват 4 пъти с 5 х SSC, 0.1 % Tween 20 на стайна температура, последвано от измиване с 0.5 х SSC, 0.1 % Tween 20 за 15 минути, при 37° С. След това ямките се анализират за свързана сонда чрез сцинтилационно броене.
Резултати
Наблюдава се значителна разлика в степента и специфичността на олигонуклеотидното свързване, в зависимост от природата на 5’ функционалната група в олигонуклеотида.
Олигонуклеотидите притежаващи 5’ - амино група, се свързват приблизително два пъти по-здраво, отколкото олигонуклеотидите, функционализирани с 5’ - фосфатна група (виж Таблица 2 и Фигура 8). В допълнение, контролните олигонуклеотиди, функционализирани с 5’ хидроксил, 5’ - DMT или 5’ - биотин, се свързват по начин сходен на този за 5’ - фосфатите, което поставя под въпрос 5’ специфичната природа на химичното прикрепване, чрез използване на 5’ - фосфатна група.
Таблица 2
| 5’фосфат | 5’- амино | 5’хидроксил | 5’ -DMT | 5’- биотин | |
| Ka(min-1) | 0.0068 | 0.0135 | 0.0063 | 0.0070 | 0.0068 |
| Прикрепени Олигонуклеотиди Fmol/ямка | 608 | 1344 | 542 | 602 | 650 |
| PCR стабилност (останал %) | 56 | 69 | 66 | 66 | 62 |
Claims (34)
- (1) създаване поне на една матрица нуклеинова киселина, включваща нуклеиновата киселина(и) за амплифициране, където споменатата нуклеинова киселина(и) съдържа в 5’ края си средство за прикрепване на нуклеиновата киселина(и) към твърда подложка;(1) създаване поне на една матрица нуклеинова киселина, включваща нуклеиновата киселина(и) за амплифициране, където споменатата нуклеинова киселина(и) съдържа в 5’ края олигонуклеотидна секвенция Y, а в 3 ’ края олигонуклеотидна секвенция Z и в допълнение, нуклеиновата киселина(и) носи в 5’ края си средство за прикрепване на нуклеиновата киселина(и) към твърда подложка;1. Метод за амплификация поне на една нуклеинова киселина, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:
- (2) смесване на споменатите матрици нуклеинови киселини с един или повече дегенеративни специфични праймера X, които могат да хибридизират с олигонуклеотидна секвенция в споменатата матрица(и) в място, фланкиращо секвенцията на нуклеиновата киселина, която е за амплифициране и носещи в 5’ края си средство за прикрепване на специфичните праймери към твърда подложка, в присъствие на твърда подложка така, че 5’ краищата и на матрицата нуклеинова киселина и на специфичните праймери, се свързват с твърдата подложка;2. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидната секвенция Z е комплиментарна на олигонуклеотидната секвенция Y, а специфичният праймер X е със същата секвенция, като олигонуклеотидна секвенция Y.(2) смесване на споменатата матрица(и) нуклеинова киселина с един или повече специфични праймера X, които могат да хибридизират с олигонуклеотидната секвенция Z и носеща в 5’ края си средство за прикрепване на специфичните праймери към твърда подложка, в присъствие на твърда подложка така, че 5’ краищата и на матрицата нуклеинова киселина и на специфичните праймери, се свързват с твърдата подложка;
- (3) провеждане на едш или повече реакции за амплификация на нуклеинова киселина върху свързаната матрица(и) така, че да се образуват колонии от нуклеинови киселини.3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че два различни специфични праймера X се смесват със споменатата матрица(и) в етап (2) и секвенциите на специфичните праймери X са такива, че олигонуклеотидната секвенция Z може да хибридизира с един от специфичните праймери X, а олигонуклеотидната секвенция Y е същата, като на един от специфичните праймери X.(3) провеждане на една или повече реакции за амплификация на нуклеинова киселина върх) свързаната матрица(и), така че да се образуват колонии от нуклеинови киселини.
- 4. Метод за амплификация поне на една нуклеинова киселина, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:
- 5. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че включва допълнителен етап за провеждане поне на едно стъпало, за определяне на секвенция на една или повече от образувалите с~ колонии нуклеинови киселини.
- 6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че определянето на секвенция в етап (5) обхваща включване и детекция на белязани олигонуклеотиди.
- 7. Метод съгласно претенция 5 или 6, характеризиращ се с това, че се определя едновременно пълната или частична секвенция на амплифицираните матрици нуклеинови киселини, присъстващи в повече от една колония нуклеинови киселини.
- 8. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 7, характеризиращ се с това, че включва допълнителен етап за визуализиране на образуваните колонии.
- 9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че споменатият етап за визуализиране включва използването на белязана или небелязяна сонда нуклеинова киселина.
- 10. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 9, характеризиращ се с това, че средството за прикрепване на матрицата(те) нуклеинова киселина и специфичните праймери към твърдата подложка, включва средство за ковалентно прикрепване на секвенциите от нуклеинова киселина към споменатата подложка.
- 11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че споменатото средство за ковалентно прикрепване на секвенциите от нуклеинова киселина към твърдата подложка е химически модифицирана функционална група.
- 12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че споменатата химически модифицирана функционална група е фосфатна група, карбоксилна или алдехидна група, тиолова, хидроксилна, диметокситритил (DMT), или амино група.
- 13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че споменатата химически мод зфицирана функционална група е амино група.
- 14. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 13, характеризиращ се с това, че споменатата твърда подложка е избрана от групата, включваща латексни гранули, декстранови гранули, полистирен, полипропиленова повърхност, полиакриламиден гел, златни повърхности, стъклени повърхности и силиконови лепенки.
- 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че споменатата твърда подложка е стъкло.
- 16. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 15, характеризиращ се с това, че плътността на образуваните колонии от нуклеинови киселини е от 10, 000/mm до 100, 000/mm .
- 17. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 16, характеризиращ се с това, че плътността на специфичните праймери X, прикрепени към споменатата твърда подложка е поне 1 fmol/mm .
- 18. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 17, характеризиращ се с това, че плътността на матриците нуклеинови киселини е от 10, 000/mm2 до 100, 000/mm2.
- 19. Множество различни матрици от нуклеинови киселини, включващо нуклеиновите киселини за амплифициране, където всяка от споменатите нуклеинови киселини съдържа в 5 ‘ краищата си известна олигонуклеотидна секвенция Y, а в 3’ края известна олигонуклеотидна секвенция Z и в допълнение, нуклеиновата киселина(и) носи в 5’ края си средство за прикрепване на нуклеиновата киселина(и) към твърда подложка.
- 20. Множеството матрици от нуклеинови киселини, съгласно претенция 19, където олигонуклеотидната секвенция Z е комплиментарна на олигонуклеотидната секвенция Y.
- 21. Множеството матрици от нуклеинови киселини, съгласно претенция 19, когато се смесят с множество специфични праймери X, които могат да хибридизират с олигонуклеотидната секвенция Z, носят в 5’ краищата си средство за прикрепване на специфичните праймери към твърда подложка.
- 22. Множеството матрици от нуклеинови киселини, съгласно претенция 21, където олигонуклеотидната секвенция Z е комплиментарна на олигонуклеотидна секвенция Y, а специфичният праймер X има същата секвенция като олигонуклеотидна секвенция Y.
- 23. Множество матрици от нуклеинови киселини, съгласно претенция 19, когато се смесят с два различни специфични праймера X и където секвенциите на спецефичните праймери X са такива, че олигонуклеотидната секвенция Z може да хибридизира с един от специфичните праймери X, а олигонуклеотидната секвенция Y е със същата секвенция, като на един от специфичните праймери X.
- 24. Множество матрици от нуклеинови киселини, съгласно претенция 21, където специфичните праймери X включват дегенеративна праймерна секвенция, а матириците нуклеинови киселини не съдържат олигонуклеотидни секвенции Y или Z.
- 25. Твърда подложка към която са прикрепени множество специфични праймери X, съгласно всяка една от предишните претенции и множество матрици от нуклеинови киселини, съгласно която и да е претенция от 19 до 24.
- 26. Твърда подложка, съгласно претенция 25, където твърдата подложка е определена съгласно претенции 14 и 15.
- 27. Твърда подложка, съгласно която и да е претенция 25 или 26, където прикрепването на матоици нуклеинови киселини и специфични праймери към твърдата подложка е ковалентно.
- 28. Твърда подложка, включваща една или повече колонии нуклеинови киселини, образувани чрез метод съгласно която и да е претенция от 1 до 18.
- 29. Приложение на твърдата подложка съгласно която и да е претенция от 25 до 28, в методи за амплификация или секвениране на нуклеинова киселина.
- 30. Приложение съгласно претенция 29, където споменатият метод е метод, съгласно която и да е претенция от 1 до 18.
- 31. Приложение на метод за амплификация или секвениране на нуклеинова киселина, съгласно която и да е претенция от 1 до 18.
- 32. Приложение на метод, съгласно която и да е претенция от 1 до 18 или колониите от нуклеинови киселини, образувани чрез споменатите методи, или множеството матрици от нуклеинови киселини съгласно претенции 19 до 24, или твърдите подложки, съгласно претенции 25 до 28, осигуряващи молекули нуклеинови киселини за секвениране и ре-секвениране, контрол на генна експресия, профилиране на генетично разнообразие, диагноза, скрининг, секвениране на цял геном, разкриване на целия геномен полиморфизъм и оценка и приготвяне на препарати от цял геном или каквито и да са други приложения, включващи амплификация на нуклеинови киселини или секвенирането им.
- 33. Кит за приложение при амплификация на нуклеинова киселина или секвениране, включващ множество матрици от нуклеинови киселини, съгласно която и да е претенция от 19 до 24 и специфични праймери свързани с твърда подложка, съгласно която и да е от предишните претенции.
- 34. Кит, съгласно претенция 33 за приложение при секвениране, ре-секвениране, контрол на генна експресия, профилиране на генетично разнообразие, диа1 ноза, скрининг, секвениране на цял геном, разкриване на целия геномен полиморфизъм и оценка, или каквито и да са други приложения, включващи амплификация на нуклеинови киселини или секвенирането им.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98307985 | 1998-09-30 | ||
| PCT/GB1999/003248 WO2000018957A1 (en) | 1998-09-30 | 1999-09-30 | Methods of nucleic acid amplification and sequencing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG105363A true BG105363A (bg) | 2001-12-31 |
Family
ID=8235083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG105363A BG105363A (bg) | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Методи за секвениране и амплифициране на нуклеинова киселина |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7115400B1 (bg) |
| EP (2) | EP1634963B1 (bg) |
| JP (1) | JP2002525125A (bg) |
| KR (1) | KR20010085860A (bg) |
| CN (1) | CN1325458A (bg) |
| AR (1) | AR021833A1 (bg) |
| AT (1) | ATE311474T1 (bg) |
| AU (1) | AU771073B2 (bg) |
| BG (1) | BG105363A (bg) |
| BR (1) | BR9914159A (bg) |
| CA (1) | CA2344575A1 (bg) |
| CZ (1) | CZ20011183A3 (bg) |
| DE (1) | DE69928683T2 (bg) |
| EA (1) | EA004271B1 (bg) |
| EE (1) | EE200100195A (bg) |
| HK (1) | HK1042525A1 (bg) |
| HU (1) | HUP0105052A3 (bg) |
| IL (1) | IL142178A0 (bg) |
| NO (1) | NO20011303L (bg) |
| NZ (1) | NZ510599A (bg) |
| PL (1) | PL347125A1 (bg) |
| SK (1) | SK4292001A3 (bg) |
| TR (1) | TR200100911T2 (bg) |
| WO (1) | WO2000018957A1 (bg) |
| ZA (1) | ZA200102420B (bg) |
Families Citing this family (940)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002503954A (ja) * | 1997-04-01 | 2002-02-05 | グラクソ、グループ、リミテッド | 核酸増幅法 |
| US20100130368A1 (en) * | 1998-07-30 | 2010-05-27 | Shankar Balasubramanian | Method and system for sequencing polynucleotides |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| DE10027040A1 (de) * | 2000-06-02 | 2001-12-06 | Basf Lynx Bioscience Ag | Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| CA2444649C (en) | 2001-04-20 | 2012-10-02 | The Penn State Research Foundation | Methods for nucleic acid manipulation |
| US7195908B2 (en) * | 2002-10-31 | 2007-03-27 | Corning Incorporated | Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules |
| JP4395133B2 (ja) * | 2002-12-20 | 2010-01-06 | カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． | Ｄｎａの単一分子増幅および検出 |
| CA2513899C (en) | 2003-01-29 | 2013-03-26 | 454 Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
| EP1701785A1 (en) | 2004-01-07 | 2006-09-20 | Solexa Ltd. | Modified molecular arrays |
| WO2005118773A2 (en) | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Wafergen, Inc. | Apparatus and methods for multiplex analyses |
| GB0427236D0 (en) | 2004-12-13 | 2005-01-12 | Solexa Ltd | Improved method of nucleotide detection |
| WO2006064199A1 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | Solexa Limited | Improved method of nucleotide detection |
| EP2241637A1 (en) | 2005-02-01 | 2010-10-20 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension |
| EP2230316A1 (en) | 2005-02-01 | 2010-09-22 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension |
| EP3257949A1 (en) | 2005-06-15 | 2017-12-20 | Complete Genomics Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514936D0 (en) * | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Preparation of templates for nucleic acid sequencing |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| GB0524069D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| WO2007075987A2 (en) | 2005-12-22 | 2007-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Active surface coupled polymerases |
| SG169356A1 (en) | 2006-02-08 | 2011-03-30 | Illumina Cambridge Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2007107710A1 (en) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Solexa Limited | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| WO2007111937A1 (en) | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Applera Corporation | Directed enrichment of genomic dna for high-throughput sequencing |
| EP2032686B1 (en) | 2006-06-23 | 2022-01-12 | Illumina, Inc. | System and method for creation of dna cluster arrays |
| US9328378B2 (en) * | 2006-07-31 | 2016-05-03 | Illumina Cambridge Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
| CN106566855B (zh) * | 2006-07-31 | 2021-11-09 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸 |
| WO2008018355A1 (fr) * | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Sharp Kabushiki Kaisha | biodétecteur, son procédé de fabrication et procédé de détection utilisant le biodétecteur |
| AU2007284651B2 (en) | 2006-08-09 | 2014-03-20 | Institute For Systems Biology | Organ-specific proteins and methods of their use |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| WO2008045158A1 (en) | 2006-10-10 | 2008-04-17 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization |
| WO2008069906A2 (en) * | 2006-11-14 | 2008-06-12 | The Regents Of The University Of California | Digital expression of gene analysis |
| US8315817B2 (en) | 2007-01-26 | 2012-11-20 | Illumina, Inc. | Independently removable nucleic acid sequencing system and method |
| EP2126766A2 (en) | 2007-01-26 | 2009-12-02 | Illumina Inc. | Image data efficient genetic sequencing method and system |
| US12497656B2 (en) | 2007-01-26 | 2025-12-16 | Illumina, Inc. | Independently removable nucleic acid sequencing system and method |
| WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2008096146A1 (en) | 2007-02-07 | 2008-08-14 | Solexa Limited | Preparation of templates for methylation analysis |
| WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| JP2010529862A (ja) * | 2007-06-16 | 2010-09-02 | スカラブ ゲノミクス， エルエルシー | 核酸パッケージングシステム |
| US20110105366A1 (en) | 2007-06-18 | 2011-05-05 | Illumina, Inc. | Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates |
| JP2009000070A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Hitachi Ltd | 大規模並列核酸分析方法 |
| US8759077B2 (en) * | 2007-08-28 | 2014-06-24 | Lightspeed Genomics, Inc. | Apparatus for selective excitation of microparticles |
| US8222040B2 (en) * | 2007-08-28 | 2012-07-17 | Lightspeed Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles |
| JP2010537643A (ja) | 2007-08-29 | 2010-12-09 | アプライド バイオシステムズ， エルエルシー | 代替的な核酸配列決定法 |
| US20090093378A1 (en) * | 2007-08-29 | 2009-04-09 | Helen Bignell | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US8716190B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-05-06 | Affymetrix, Inc. | Amplification and analysis of selected targets on solid supports |
| US9388457B2 (en) | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
| US7767441B2 (en) * | 2007-10-25 | 2010-08-03 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
| US7811810B2 (en) | 2007-10-25 | 2010-10-12 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
| JP2009178159A (ja) | 2007-11-05 | 2009-08-13 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板 |
| US8202691B2 (en) * | 2008-01-25 | 2012-06-19 | Illumina, Inc. | Uniform fragmentation of DNA using binding proteins |
| US12060554B2 (en) | 2008-03-10 | 2024-08-13 | Illumina, Inc. | Method for selecting and amplifying polynucleotides |
| US8039817B2 (en) | 2008-05-05 | 2011-10-18 | Illumina, Inc. | Compensator for multiple surface imaging |
| EP2294214A2 (en) * | 2008-05-07 | 2011-03-16 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for providing substances to and from an array |
| US8407012B2 (en) * | 2008-07-03 | 2013-03-26 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods and systems of DNA sequencing |
| EP2653530B1 (en) | 2008-07-09 | 2015-10-14 | Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. | Sensor |
| US20100069250A1 (en) * | 2008-08-16 | 2010-03-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Digital PCR Calibration for High Throughput Sequencing |
| WO2010028288A2 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| WO2010038042A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Illumina Cambridge Ltd. | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| US20100087325A1 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-08 | Illumina, Inc. | Biological sample temperature control system and method |
| US8486865B2 (en) | 2008-11-03 | 2013-07-16 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting modification resistant nucleic acids |
| US8748103B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-06-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US9506119B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-11-29 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of sequence determination using sequence tags |
| US8628927B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-14 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| EP2364368B1 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-15 | Sequenta, Inc. | Methods of monitoring conditions by sequence analysis |
| US9528160B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-12-27 | Adaptive Biotechnolgies Corp. | Rare clonotypes and uses thereof |
| US9394567B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis |
| US9365901B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-06-14 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia |
| US8691510B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-04-08 | Sequenta, Inc. | Sequence analysis of complex amplicons |
| WO2010068702A2 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for hybridizing nucleic acids |
| EP2607496B1 (en) * | 2008-12-23 | 2014-07-16 | Illumina, Inc. | Methods useful in nucleic acid sequencing protocols |
| ES2726702T3 (es) | 2009-01-15 | 2019-10-08 | Adaptive Biotechnologies Corp | Perfilado de la inmunidad adaptativa y métodos para la generación de anticuerpos monoclonales |
| EP2398915B1 (en) | 2009-02-20 | 2016-08-24 | Synthetic Genomics, Inc. | Synthesis of sequence-verified nucleic acids |
| JP5600880B2 (ja) * | 2009-03-03 | 2014-10-08 | 東洋紡株式会社 | 改良された増幅試薬 |
| JP5239978B2 (ja) * | 2009-03-23 | 2013-07-17 | パナソニック株式会社 | センサおよびシーケンサー |
| US20100285970A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-11-11 | Rose Floyd D | Methods of sequencing nucleic acids |
| CN102625850B (zh) * | 2009-04-03 | 2014-11-26 | 蒂莫西·Z·刘 | 多重核酸检测方法和系统 |
| US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
| US12129514B2 (en) | 2009-04-30 | 2024-10-29 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
| EP2425240A4 (en) | 2009-04-30 | 2012-12-12 | Good Start Genetics Inc | METHOD AND COMPOSITION FOR EVALUATING GENETIC MARKERS |
| EP2248914A1 (en) | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
| US9309557B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| US20120156728A1 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Life Technologies Corporation | Clonal amplification of nucleic acid on solid surface with template walking |
| US9309566B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification |
| US9334531B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-05-10 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| WO2010151416A1 (en) | 2009-06-25 | 2010-12-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
| EP2456892B1 (en) | 2009-07-24 | 2014-10-01 | Illumina, Inc. | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
| WO2011019993A2 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Epicentre Technologies Corporation | METHODS, COMPOSITIONS, AND KITS FOR GENERATING rRNA-DEPLETED SAMPLES OR ISOLATING rRNA FROM SAMPLES |
| PT2669387T (pt) | 2009-08-25 | 2016-09-20 | Illumina Inc | Métodos para selecção e amplificação de polinucleótidos |
| US8182994B2 (en) | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| US10385391B2 (en) * | 2009-09-22 | 2019-08-20 | President And Fellows Of Harvard College | Entangled mate sequencing |
| EP2488656B1 (en) | 2009-10-15 | 2015-06-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| US8524450B2 (en) | 2009-10-30 | 2013-09-03 | Illumina, Inc. | Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same |
| CN102648295B (zh) | 2009-12-07 | 2017-08-08 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于多重基因分型的多样品索引 |
| US9323888B2 (en) | 2010-01-19 | 2016-04-26 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| US20120100548A1 (en) | 2010-10-26 | 2012-04-26 | Verinata Health, Inc. | Method for determining copy number variations |
| EP2513341B1 (en) | 2010-01-19 | 2017-04-12 | Verinata Health, Inc | Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing |
| US10388403B2 (en) | 2010-01-19 | 2019-08-20 | Verinata Health, Inc. | Analyzing copy number variation in the detection of cancer |
| US20120010085A1 (en) | 2010-01-19 | 2012-01-12 | Rava Richard P | Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples |
| EP2370599B1 (en) | 2010-01-19 | 2015-01-21 | Verinata Health, Inc | Method for determining copy number variations |
| US9260745B2 (en) | 2010-01-19 | 2016-02-16 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| WO2011091063A1 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Verinata Health, Inc. | Partition defined detection methods |
| EP2526207A4 (en) * | 2010-01-22 | 2013-10-09 | Univ California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR CHEMICAL SCREENING AT SIGNATURE BASE |
| US20110312503A1 (en) | 2010-01-23 | 2011-12-22 | Artemis Health, Inc. | Methods of fetal abnormality detection |
| WO2011106368A2 (en) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Illumina, Inc. | Amplification methods to minimise sequence specific bias |
| CN202281746U (zh) | 2010-03-06 | 2012-06-20 | 伊鲁米那股份有限公司 | 检测来自样品光信号的测定设备及其光学组件和光学系统 |
| US9465228B2 (en) | 2010-03-19 | 2016-10-11 | Optical Biosystems, Inc. | Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns |
| US8502867B2 (en) | 2010-03-19 | 2013-08-06 | Lightspeed Genomics, Inc. | Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| WO2011127099A1 (en) | 2010-04-05 | 2011-10-13 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| EP2567226B1 (en) | 2010-05-06 | 2016-08-10 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| SG10201503540QA (en) | 2010-05-06 | 2015-06-29 | Ibis Biosciences Inc | Integrated sample preparation systems and stabilized enzyme mixtures |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| WO2011146632A1 (en) | 2010-05-18 | 2011-11-24 | Gene Security Network Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US12152275B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-11-26 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US12221653B2 (en) | 2010-05-18 | 2025-02-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| JP2013528061A (ja) | 2010-06-07 | 2013-07-08 | エソテリックス ジェネティック ラボラトリーズ， エルエルシー | 核酸の数え上げ |
| WO2011159942A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
| WO2012012703A2 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof |
| US9029103B2 (en) | 2010-08-27 | 2015-05-12 | Illumina Cambridge Limited | Methods for sequencing polynucleotides |
| EP2426214A1 (en) | 2010-09-01 | 2012-03-07 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Method for amplifying nucleic acids |
| WO2012037394A1 (en) | 2010-09-16 | 2012-03-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Stabilization of ozone-labile fluorescent dyes by thiourea |
| EP2619329B1 (en) | 2010-09-24 | 2019-05-22 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers |
| WO2012050920A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-19 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
| US10093981B2 (en) | 2010-10-19 | 2018-10-09 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| EA022475B1 (ru) * | 2010-10-19 | 2016-01-29 | Ооо "Центр Инновационных Технологий-Нано" | Способ секвенирования днк |
| US20150218639A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-06 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| US20150225792A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-13 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| US10233501B2 (en) | 2010-10-19 | 2019-03-19 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| EP2633069B1 (en) | 2010-10-26 | 2015-07-01 | Illumina, Inc. | Sequencing methods |
| EP2632593B1 (en) | 2010-10-27 | 2021-09-29 | Illumina, Inc. | Flow cells for biological or chemical analysis |
| US8575071B2 (en) | 2010-11-03 | 2013-11-05 | Illumina, Inc. | Reducing adapter dimer formation |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| WO2012074855A2 (en) | 2010-11-22 | 2012-06-07 | The Regents Of The University Of California | Methods of identifying a cellular nascent rna transcript |
| US20120152743A1 (en) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | General Electric Company | Method for electroeluting genetic material from dried samples |
| JP5616773B2 (ja) | 2010-12-21 | 2014-10-29 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置 |
| CN103608466B (zh) | 2010-12-22 | 2020-09-18 | 纳特拉公司 | 非侵入性产前亲子鉴定方法 |
| US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
| CN103502463B (zh) | 2010-12-27 | 2016-03-16 | 艾比斯生物科学公司 | 核酸样品的制备方法及组合物 |
| US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
| WO2012100194A1 (en) | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Microfluidic transducer |
| CN103443338B (zh) | 2011-02-02 | 2017-09-22 | 华盛顿大学商业化中心 | 大规模平行邻接作图 |
| US20130344540A1 (en) * | 2011-02-03 | 2013-12-26 | Mark T. Reed | Methods for minimizing sequence specific bias |
| RU2671980C2 (ru) | 2011-02-09 | 2018-11-08 | Натера, Инк. | Способы неинвазивного пренатального установления плоидности |
| JP6211931B2 (ja) | 2011-03-09 | 2017-10-11 | セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド | モノクローナル抗体を作製するための方法および試薬 |
| RS57837B1 (sr) | 2011-04-12 | 2018-12-31 | Verinata Health Inc | Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| GB2484764B (en) | 2011-04-14 | 2012-09-05 | Verinata Health Inc | Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies |
| ES2986436T3 (es) | 2011-04-15 | 2024-11-11 | Univ Johns Hopkins | Sistema de secuenciación segura |
| US9411937B2 (en) | 2011-04-15 | 2016-08-09 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| EP2718465B1 (en) | 2011-06-09 | 2022-04-13 | Illumina, Inc. | Method of making an analyte array |
| EP2732423A4 (en) | 2011-07-13 | 2014-11-26 | Multiple Myeloma Res Foundation Inc | METHOD FOR DETECTING AND DISTRIBUTING DATA |
| US9670538B2 (en) | 2011-08-05 | 2017-06-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing by electrochemical detection |
| US10385475B2 (en) | 2011-09-12 | 2019-08-20 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Random array sequencing of low-complexity libraries |
| CA2859660C (en) | 2011-09-23 | 2021-02-09 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| AU2012316218B2 (en) | 2011-09-26 | 2016-03-17 | Gen-Probe Incorporated | Algorithms for sequence determinations |
| CA2852665A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Good Start Genetics, Inc. | Analysis methods |
| WO2013059746A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
| EP2768982A4 (en) | 2011-10-21 | 2015-06-03 | Adaptive Biotechnologies Corp | QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS |
| WO2013063308A1 (en) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | University Of Massachusetts | An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom |
| EP3305400A3 (en) | 2011-10-28 | 2018-06-06 | Illumina, Inc. | Microarray fabrication system and method |
| JP5899234B2 (ja) | 2011-10-31 | 2016-04-06 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸増幅法、核酸基板、核酸分析方法及び核酸分析装置 |
| US9824179B2 (en) | 2011-12-09 | 2017-11-21 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection |
| US9499865B2 (en) | 2011-12-13 | 2016-11-22 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| EP2795333A4 (en) | 2011-12-20 | 2016-02-17 | Univ Michigan | PSEUDOGENS AND USES THEREOF |
| US9803188B2 (en) | 2011-12-22 | 2017-10-31 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids |
| US9334491B2 (en) | 2011-12-22 | 2016-05-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples |
| WO2013096802A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplification primers and methods |
| WO2013096819A2 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule positioning by electrical potential |
| ES2645418T3 (es) | 2011-12-22 | 2017-12-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplificación de una secuencia de un ácido ribonucleico |
| WO2013102091A1 (en) | 2011-12-28 | 2013-07-04 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid ligation systems and methods |
| US9823246B2 (en) | 2011-12-28 | 2017-11-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon |
| US9803231B2 (en) | 2011-12-29 | 2017-10-31 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule delivery to nanowells |
| WO2013101741A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular, Inc. | Channels with cross-sectional thermal gradients |
| US9822417B2 (en) | 2012-01-09 | 2017-11-21 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| EP2802666B1 (en) | 2012-01-13 | 2018-09-19 | Data2Bio | Genotyping by next-generation sequencing |
| EP2807292B1 (en) | 2012-01-26 | 2019-05-22 | Tecan Genomics, Inc. | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
| WO2013117595A2 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Illumina Cambridge Limited | Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support |
| WO2013123442A1 (en) | 2012-02-17 | 2013-08-22 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for accurately identifying mutations |
| WO2013124738A2 (en) | 2012-02-21 | 2013-08-29 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| EP3372694A1 (en) | 2012-03-05 | 2018-09-12 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| NO2694769T3 (bg) | 2012-03-06 | 2018-03-03 | ||
| WO2013132354A2 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer |
| US9803239B2 (en) | 2012-03-29 | 2017-10-31 | Complete Genomics, Inc. | Flow cells for high density array chips |
| US20130261984A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Illumina, Inc. | Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities |
| CN204832037U (zh) | 2012-04-03 | 2015-12-02 | 伊鲁米那股份有限公司 | 检测设备 |
| WO2013152114A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Biomarker associated with irritable bowel syndrome and crohn's disease |
| US8209130B1 (en) | 2012-04-04 | 2012-06-26 | Good Start Genetics, Inc. | Sequence assembly |
| US8812422B2 (en) | 2012-04-09 | 2014-08-19 | Good Start Genetics, Inc. | Variant database |
| US20130274148A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Illumina, Inc. | Portable genetic detection and analysis system and method |
| US10227635B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-12 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Capture reactions |
| US10202642B2 (en) | 2012-05-02 | 2019-02-12 | Ibis Biosciences, Inc. | DNA sequencing |
| EP2844774B1 (en) | 2012-05-02 | 2018-07-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequencing |
| EP2844767A4 (en) | 2012-05-02 | 2015-11-18 | Ibis Biosciences Inc | SYSTEMS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING |
| EP3783111A1 (en) | 2012-05-02 | 2021-02-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequencing |
| HUE029357T2 (en) | 2012-05-08 | 2017-02-28 | Adaptive Biotechnologies Corp | Preparations and devices for measuring and calibrating amplification distortion in multiplex PCR reactions |
| US9012022B2 (en) | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
| US8895249B2 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-25 | Illumina, Inc. | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| CA2877094A1 (en) | 2012-06-18 | 2013-12-27 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
| WO2014005076A2 (en) | 2012-06-29 | 2014-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and biomarkers for detection of kidney disorders |
| US20150167084A1 (en) | 2012-07-03 | 2015-06-18 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Quantitative Assessment of Human T-Cell Repertoire Recovery After Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation |
| US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
| US9092401B2 (en) | 2012-10-31 | 2015-07-28 | Counsyl, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
| CA2876505A1 (en) | 2012-07-17 | 2014-01-23 | Counsyl, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
| US9977861B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes |
| US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| AU2013302756C1 (en) | 2012-08-14 | 2018-05-17 | 10X Genomics, Inc. | Microcapsule compositions and methods |
| US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9422602B2 (en) | 2012-08-15 | 2016-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for determining nucleic acid degradation |
| NL2017959B1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-19 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| US20140100126A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-04-10 | Natera, Inc. | Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data |
| WO2014031157A1 (en) | 2012-08-20 | 2014-02-27 | Illumina, Inc. | Method and system for fluorescence lifetime based sequencing |
| KR20150056788A (ko) | 2012-09-19 | 2015-05-27 | 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. | 면역원성이 감소된 항체의 동정 방법 |
| EP3330384B1 (en) | 2012-10-01 | 2019-09-25 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
| EP2909343B1 (en) | 2012-10-16 | 2018-10-10 | Abbott Molecular Inc. | Methods to sequence a nucleic acid |
| EP4592400A3 (en) | 2012-10-17 | 2025-10-29 | 10x Genomics Sweden AB | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| WO2015160439A2 (en) | 2014-04-17 | 2015-10-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| US9365896B2 (en) | 2012-10-19 | 2016-06-14 | Agilent Technologies, Inc. | Addition of an adaptor by invasive cleavage |
| JP6338221B2 (ja) | 2012-10-24 | 2018-06-06 | タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド | 核酸生成物を生成するための、テンプレートスイッチに基づく方法 |
| ES2886507T5 (es) | 2012-10-29 | 2024-11-15 | Univ Johns Hopkins | Prueba de Papanicolaou para cánceres de ovario y de endometrio |
| WO2014081511A1 (en) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Courtagen Life Sciences Inc. | Method for preventing carry-over contamination in nucleic acid amplification reactions |
| CA2894694C (en) | 2012-12-14 | 2023-04-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| EP4414990A3 (en) | 2013-01-17 | 2024-11-06 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
| KR20200140929A (ko) | 2013-02-08 | 2020-12-16 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 폴리뉴클레오티드 바코드 생성 |
| US9512422B2 (en) | 2013-02-26 | 2016-12-06 | Illumina, Inc. | Gel patterned surfaces |
| DK2964624T3 (en) | 2013-03-08 | 2017-04-03 | Illumina Cambridge Ltd | RHODAMINE COMPOUNDS AND USE AS FLUORESCING LABELS |
| ES2620423T3 (es) | 2013-03-08 | 2017-06-28 | Illumina Cambridge Limited | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes |
| CN105378108A (zh) | 2013-03-13 | 2016-03-02 | 雅培分子公司 | 用于分离核酸的系统和方法 |
| DK2970951T3 (da) | 2013-03-13 | 2019-05-13 | Illumina Inc | Fremgangsmåder til nukleinsyresekventering |
| DK2969479T3 (da) | 2013-03-13 | 2021-08-02 | Illumina Inc | Væskeanordninger i flere lag og fremgangsmåder til deres fremstilling |
| US20140287946A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid control panels |
| EP2971159B1 (en) | 2013-03-14 | 2019-05-08 | Molecular Loop Biosolutions, LLC | Methods for analyzing nucleic acids |
| EP2971171A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-02 | Abbott Molecular Inc | SYSTEMS AND METHODS FOR MULTIPLEX AMPLIFICATION SPECIFIC TO METHYLATION |
| CA2905429A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbott Molecular Inc. | Minimizing errors using uracil-dna-n-glycosylase |
| WO2014142981A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Enzyme-linked nucleotides |
| US10428379B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleotide analogs for sequencing |
| WO2014151511A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Abbott Molecular Inc. | Systems and methods for detection of genomic copy number changes |
| WO2014150910A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequences to assess contamination in dna sequencing |
| US9255265B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-09 | Illumina, Inc. | Methods for producing stranded cDNA libraries |
| US9822408B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-21 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
| EP3597772A1 (en) | 2013-04-17 | 2020-01-22 | Agency For Science, Technology And Research | Method for generating extended sequence reads |
| WO2014172288A2 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| WO2014197377A2 (en) | 2013-06-03 | 2014-12-11 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and systems for storing sequence read data |
| CA2916662C (en) | 2013-06-25 | 2022-03-08 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| DK3017065T3 (en) | 2013-07-01 | 2018-11-26 | Illumina Inc | Catalyst-free Surface functionalization and polymer grafting |
| US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
| CN105358715B (zh) | 2013-07-03 | 2018-09-18 | 伊鲁米那股份有限公司 | 正交合成测序 |
| WO2015013465A2 (en) | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Dch Molecular Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for detecting bacterial contamination |
| SG11201600853UA (en) | 2013-08-05 | 2016-03-30 | Twist Bioscience Corp | De novo synthesized gene libraries |
| ES2939140T3 (es) | 2013-08-08 | 2023-04-19 | Illumina Inc | Sistema de fluido para el suministro de reactivos a una celda de flujo |
| ES2764096T3 (es) | 2013-08-19 | 2020-06-02 | Abbott Molecular Inc | Bibliotecas de secuenciación de próxima generación |
| US10395758B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Sequencing methods |
| KR20160081896A (ko) | 2013-08-30 | 2016-07-08 | 일루미나, 인코포레이티드 | 친수성 또는 다양한-친수성 표면 상에서의 액적의 조작 |
| WO2015031689A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genomic analysis |
| US9352315B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-05-31 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure |
| WO2015051275A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Personalis, Inc. | Methods for analyzing genotypes |
| EP3875601A1 (en) | 2013-10-17 | 2021-09-08 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries |
| JP6602294B2 (ja) * | 2013-10-17 | 2019-11-06 | タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド | アダプタを核酸に追加する方法、及びこの方法を実行するための組成物 |
| US10851414B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-12-01 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for determining carrier status |
| EP3058096A1 (en) | 2013-10-18 | 2016-08-24 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for assessing a genomic region of a subject |
| US10174381B2 (en) | 2013-10-18 | 2019-01-08 | The Regents Of The University Of Michigan | Systems and methods for determining a treatment course of action |
| US10415083B2 (en) | 2013-10-28 | 2019-09-17 | The Translational Genomics Research Institute | Long insert-based whole genome sequencing |
| WO2015073711A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
| CA2931533C (en) | 2013-12-09 | 2023-08-08 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
| CA2932916C (en) | 2013-12-10 | 2021-12-07 | Illumina, Inc. | Biosensors for biological or chemical analysis and methods of manufacturing the same |
| US9909181B2 (en) | 2013-12-13 | 2018-03-06 | Northwestern University | Biomarkers for post-traumatic stress states |
| WO2015094861A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same |
| US10768181B2 (en) | 2013-12-17 | 2020-09-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Detection of an antibody against a pathogen |
| CN114089597B (zh) | 2013-12-19 | 2025-03-14 | Illumina公司 | 包括纳米图案化表面的基底及其制备方法 |
| EP3957750B1 (en) | 2013-12-20 | 2025-01-29 | Illumina, Inc. | Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic dna samples |
| US10537889B2 (en) | 2013-12-31 | 2020-01-21 | Illumina, Inc. | Addressable flow cell using patterned electrodes |
| WO2015107430A2 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| US9677132B2 (en) | 2014-01-16 | 2017-06-13 | Illumina, Inc. | Polynucleotide modification on solid support |
| KR102001554B1 (ko) | 2014-01-16 | 2019-07-18 | 일루미나, 인코포레이티드 | 고형 지지체 상에서의 앰플리콘 제조 방법 및 시퀀싱 |
| HRP20210953T1 (hr) | 2014-02-18 | 2021-09-03 | Illumina, Inc. | Postupci i pripravci za određivanje dnk profila |
| US9745614B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-08-29 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
| WO2015134787A2 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods using randomer-containing synthetic molecules |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| US11390921B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs) |
| BR112016023625A2 (pt) | 2014-04-10 | 2018-06-26 | 10X Genomics, Inc. | dispositivos fluídicos, sistemas e métodos para encapsular e particionar reagentes, e aplicações dos mesmos |
| CA2945962C (en) | 2014-04-21 | 2023-08-29 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US11053548B2 (en) | 2014-05-12 | 2021-07-06 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for detecting aneuploidy |
| CA3219413A1 (en) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Illumina, Inc. | Nucleic acid synthesis techniques |
| AU2015267189B2 (en) | 2014-05-27 | 2019-12-05 | Illumina, Inc. | Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge |
| GB201410022D0 (en) * | 2014-06-05 | 2014-07-16 | Orion Diagnostica Oy | Method |
| US20180173846A1 (en) | 2014-06-05 | 2018-06-21 | Natera, Inc. | Systems and Methods for Detection of Aneuploidy |
| PT3669985T (pt) | 2014-06-05 | 2022-05-06 | Illumina Inc | Sistemas incluindo uma válvula rotativa para pelo menos uma de preparação de amostra ou análise de amostras |
| EP3151733B1 (en) | 2014-06-06 | 2020-04-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease |
| US20150353989A1 (en) | 2014-06-09 | 2015-12-10 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation for nucleic acid amplification |
| GB201410420D0 (en) | 2014-06-11 | 2014-07-23 | Illumina Cambridge Ltd | Methods for estimating cluster numbers |
| CN106715693A (zh) | 2014-06-13 | 2017-05-24 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 用于制备序列文库的方法和组合物 |
| GB201410646D0 (en) | 2014-06-14 | 2014-07-30 | Illumina Cambridge Ltd | Methods of increasing sequencing accuracy |
| CN106604994B (zh) | 2014-06-23 | 2021-12-14 | 通用医疗公司 | 通过测序评估的DSBs的全基因组无偏鉴定(GUIDE-Seq) |
| WO2015200541A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital pcr barcoding |
| WO2015200893A2 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations |
| US10017759B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-07-10 | Illumina, Inc. | Library preparation of tagged nucleic acid |
| CA2953469A1 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| US12312640B2 (en) | 2014-06-26 | 2025-05-27 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| KR20170023979A (ko) | 2014-06-26 | 2017-03-06 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 핵산 서열 조립을 위한 프로세스 및 시스템 |
| ES2753573T3 (es) | 2014-06-27 | 2020-04-13 | Abbott Lab | Composiciones y métodos para detectar pegivirus humano 2 (HPGV-2) |
| CN112430641A (zh) | 2014-06-30 | 2021-03-02 | 亿明达股份有限公司 | 使用单侧转座的方法和组合物 |
| AP2017009731A0 (en) | 2014-07-24 | 2017-02-28 | Abbott Molecular Inc | Compositions and methods for the detection and analysis of mycobacterium tuberculosis |
| US10526641B2 (en) | 2014-08-01 | 2020-01-07 | Dovetail Genomics, Llc | Tagging nucleic acids for sequence assembly |
| CA2957633A1 (en) | 2014-08-06 | 2016-02-11 | Nugen Technologies, Inc. | Digital measurements from targeted sequencing |
| GB2543728B (en) | 2014-08-12 | 2019-04-17 | Nextgen Jane Inc | Medical kit and method for processing a biological sample |
| US10174383B2 (en) | 2014-08-13 | 2019-01-08 | Vanadis Diagnostics | Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample |
| WO2016025818A1 (en) | 2014-08-15 | 2016-02-18 | Good Start Genetics, Inc. | Systems and methods for genetic analysis |
| US9982250B2 (en) | 2014-08-21 | 2018-05-29 | Illumina Cambridge Limited | Reversible surface functionalization |
| WO2016040446A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
| WO2016040602A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Epicentre Technologies Corporation | Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv |
| CN107002293B (zh) | 2014-09-17 | 2020-12-08 | 艾比斯生物科学公司 | 使用脉冲读数光学的通过合成测序 |
| WO2016044233A1 (en) | 2014-09-18 | 2016-03-24 | Illumina, Inc. | Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data |
| JP2017536087A (ja) | 2014-09-24 | 2017-12-07 | グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド | 遺伝子アッセイのロバストネスを増大させるためのプロセス制御 |
| US10040048B1 (en) | 2014-09-25 | 2018-08-07 | Synthego Corporation | Automated modular system and method for production of biopolymers |
| CN106999850B (zh) | 2014-10-09 | 2020-04-07 | 亿明达股份有限公司 | 用于分离不混溶的液体以有效地隔离至少一种液体的方法和装置 |
| RU2736728C2 (ru) | 2014-10-17 | 2020-11-19 | Иллумина Кембридж Лимитед | Транспозиция с сохранением сцепления генов |
| BR112017008877A2 (pt) | 2014-10-29 | 2018-07-03 | 10X Genomics Inc | métodos e composições para sequenciamento de ácido nucleico-alvo |
| CA2966201A1 (en) | 2014-10-29 | 2016-05-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples |
| US10125399B2 (en) | 2014-10-30 | 2018-11-13 | Personalis, Inc. | Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin |
| WO2016066586A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Illumina Cambridge Limited | Novel polymers and dna copolymer coatings |
| US20160146799A1 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-26 | Nirmidas Biotech, Inc. | Metal composites for enhanced imaging |
| GB201419731D0 (en) | 2014-11-05 | 2014-12-17 | Illumina Cambridge Ltd | Sequencing from multiple primers to increase data rate and density |
| US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
| CN114438174B (zh) | 2014-11-11 | 2025-07-15 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
| JP2017533733A (ja) | 2014-11-11 | 2017-11-16 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| WO2016081712A1 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Bigdatabio, Llc | Systems and methods for genomic manipulations and analysis |
| US10233490B2 (en) | 2014-11-21 | 2019-03-19 | Metabiotech Corporation | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
| AU2015353581A1 (en) | 2014-11-25 | 2017-06-15 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing |
| WO2016090266A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Amyris, Inc. | High-throughput sequencing of polynucleotides |
| WO2016112073A1 (en) | 2015-01-06 | 2016-07-14 | Good Start Genetics, Inc. | Screening for structural variants |
| JP6769969B2 (ja) | 2015-01-12 | 2020-10-14 | １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド | 核酸配列決定ライブラリーを作製するためのプロセス及びシステム、並びにこれらを使用して作製したライブラリー |
| WO2016115273A1 (en) | 2015-01-13 | 2016-07-21 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information |
| CA2975855C (en) | 2015-02-04 | 2025-09-23 | Twist Bioscience Corporation | SYNTHETIC GENE COMPOSITIONS AND ASSEMBLY METHODS |
| US10669304B2 (en) | 2015-02-04 | 2020-06-02 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
| WO2016130578A1 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-18 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data |
| JP6773687B2 (ja) | 2015-02-17 | 2020-10-21 | エムジーアイ テック カンパニー リミテッドＭＧＩ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． | 制御された鎖置換を用いてのｄｎａ配列決定 |
| US10208339B2 (en) | 2015-02-19 | 2019-02-19 | Takara Bio Usa, Inc. | Systems and methods for whole genome amplification |
| US10641772B2 (en) | 2015-02-20 | 2020-05-05 | Takara Bio Usa, Inc. | Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells |
| EP3262407B1 (en) | 2015-02-24 | 2023-08-30 | 10X Genomics, Inc. | Partition processing methods and systems |
| CA2976580A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing |
| MX2017010857A (es) | 2015-02-24 | 2017-12-11 | 10X Genomics Inc | Metodos para la cobertura de secuencia de acidos nucleicos seleccionados como diana. |
| CA3225867A1 (en) | 2015-03-24 | 2016-09-29 | Illumina, Inc. | Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis |
| WO2016156845A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Illumina Cambridge Limited | Surface concatamerization of templates |
| EP3277294B1 (en) | 2015-04-01 | 2024-05-15 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
| EP3901282B1 (en) | 2015-04-10 | 2023-06-28 | Spatial Transcriptomics AB | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| CA2982363A1 (en) | 2015-04-15 | 2016-10-20 | The General Hospital Corporation | Lna-based mutant enrichment next-generation sequencing assays |
| US9981239B2 (en) | 2015-04-21 | 2018-05-29 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
| WO2016170179A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support |
| US11085073B2 (en) | 2015-04-24 | 2021-08-10 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support |
| CA2983819A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Atila Biosystems Incorporated | Amplification with primers of limited nucleotide composition |
| US10844428B2 (en) | 2015-04-28 | 2020-11-24 | Illumina, Inc. | Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS) |
| RU2724998C2 (ru) | 2015-05-11 | 2020-06-29 | Иллюмина, Инк. | Платформа для обнаружения и анализа терапевтических агентов |
| US11479812B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| CN107532218A (zh) * | 2015-05-18 | 2018-01-02 | 10X基因组学有限公司 | 稳定化还原剂及其使用方法 |
| US10395759B2 (en) * | 2015-05-18 | 2019-08-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for copy number variant detection |
| GB201508858D0 (en) | 2015-05-22 | 2015-07-01 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels |
| AU2016269785B2 (en) | 2015-05-29 | 2019-02-28 | Illumina Cambridge Limited | Enhanced utilization of surface primers in clusters |
| US11274333B2 (en) | 2015-05-29 | 2022-03-15 | Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) LLC | Compositions and methods for preparing sequencing libraries |
| KR102134953B1 (ko) | 2015-05-29 | 2020-07-16 | 일루미나, 인코포레이티드 | 지정된 반응을 수행하기 위한 샘플 캐리어 및 검정 시스템 |
| US10808282B2 (en) | 2015-07-07 | 2020-10-20 | Illumina, Inc. | Selective surface patterning via nanoimprinting |
| EP3322483A4 (en) | 2015-07-14 | 2019-01-02 | Abbott Molecular Inc. | Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis |
| ES2902125T3 (es) | 2015-07-14 | 2022-03-25 | Abbott Molecular Inc | Purificación de ácidos nucleicos utilizando óxidos de cobre-titanio u óxidos de magnesio-titanio |
| EP3325648B1 (en) | 2015-07-17 | 2023-03-29 | Illumina, Inc. | Polymer sheets for sequencing applications |
| AU2016297631B2 (en) | 2015-07-23 | 2022-08-04 | Asuragen, Inc. | Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating A/T-rich segments |
| WO2017019278A1 (en) | 2015-07-30 | 2017-02-02 | Illumina, Inc. | Orthogonal deblocking of nucleotides |
| EP3332034B1 (en) | 2015-08-06 | 2024-09-25 | Arc Bio, LLC | Systems and methods for genomic analysis |
| US11286531B2 (en) | 2015-08-11 | 2022-03-29 | The Johns Hopkins University | Assaying ovarian cyst fluid |
| EP3338096B1 (en) | 2015-08-24 | 2024-03-06 | Illumina, Inc. | In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays |
| HK1253910A1 (zh) | 2015-09-02 | 2019-07-05 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 改善流控系统中的液滴操作的系统和方法 |
| US20200231947A1 (en) | 2015-09-09 | 2020-07-23 | Qiagen Gmbh | Polymerase enzyme |
| WO2017044843A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | The General Hospital Corporation | Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq) |
| EP3350314A4 (en) | 2015-09-18 | 2019-02-06 | Twist Bioscience Corporation | OLIGONUCLEIC ACID VARIANT LIBRARIES VARIANT AND SYNTHESIS THEREOF |
| KR102794025B1 (ko) | 2015-09-22 | 2025-04-09 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 합성을 위한 가요성 기판 |
| GB201516987D0 (en) | 2015-09-25 | 2015-11-11 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| JP2018529353A (ja) | 2015-09-30 | 2018-10-11 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ） |
| US10253352B2 (en) | 2015-11-17 | 2019-04-09 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
| US11371094B2 (en) | 2015-11-19 | 2022-06-28 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides |
| CN115920796A (zh) | 2015-12-01 | 2023-04-07 | 特韦斯特生物科学公司 | 功能化表面及其制备 |
| JP6954899B2 (ja) | 2015-12-04 | 2021-10-27 | １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド | 核酸の解析のための方法及び組成物 |
| US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
| US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
| KR20190090081A (ko) | 2015-12-07 | 2019-07-31 | 지머젠 인코포레이티드 | Htp 게놈 공학 플랫폼에 의한 미생물 균주 개량 |
| BR112018011503A2 (pt) | 2015-12-07 | 2018-12-04 | Zymergen Inc | promotores da corynebacterium glutamicum |
| CN108431223A (zh) | 2016-01-08 | 2018-08-21 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 每液滴分辨率下的多个珠 |
| KR20180108578A (ko) | 2016-01-11 | 2018-10-04 | 일루미나, 인코포레이티드 | 마이크로 형광 측정기, 유체 시스템, 및 플로우 셀 래치 클램프 모듈을 구비하는 검출 장치 |
| AU2017218431B2 (en) | 2016-02-08 | 2022-08-04 | RGENE, Inc. | Multiple ligase compositions, systems, and methods |
| WO2017138984A1 (en) | 2016-02-11 | 2017-08-17 | 10X Genomics, Inc. | Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data |
| EP3430154B1 (en) | 2016-03-14 | 2020-11-11 | Rgene, Inc. | Hyper-thermostable lysine-mutant ssdna/rna ligases |
| CA3016077A1 (en) | 2016-03-22 | 2017-09-28 | Counsyl, Inc. | Combinatorial dna screening |
| PL3377226T3 (pl) | 2016-03-28 | 2021-07-26 | Illumina, Inc. | Wielopłaszczyznowe mikromacierze |
| WO2017180909A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Nextgen Jane, Inc. | Sample collection and preservation devices, systems and methods |
| RU2760913C2 (ru) | 2016-04-15 | 2021-12-01 | Натера, Инк. | Способы выявления рака легкого |
| DK3455372T3 (da) | 2016-05-11 | 2020-01-06 | Illumina Inc | Polynukleotidberigelse og -amplifikation ved anvendelse af argonautsystemer |
| WO2017197343A2 (en) | 2016-05-12 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic on-chip filters |
| WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
| US11118233B2 (en) | 2016-05-18 | 2021-09-14 | The University Of Chicago | BTK mutation and ibrutinib resistance |
| WO2017201198A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Illumina, Inc. | Self assembled patterning using patterned hydrophobic surfaces |
| US11299783B2 (en) | 2016-05-27 | 2022-04-12 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
| EP3464628B1 (en) | 2016-06-06 | 2024-01-31 | RedVault Biosciences, LP | Target reporter constructs and uses thereof |
| US11708574B2 (en) | 2016-06-10 | 2023-07-25 | Myriad Women's Health, Inc. | Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof |
| US10066263B2 (en) | 2016-06-17 | 2018-09-04 | California Institute Of Technology | Nucleic acid reactions and related methods and compositions |
| EP3478845A4 (en) | 2016-06-30 | 2019-07-31 | Zymergen, Inc. | METHOD OF GENERATING A GLUCOSE PERMEASE LIBRARY AND USES THEREOF |
| US10544390B2 (en) | 2016-06-30 | 2020-01-28 | Zymergen Inc. | Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof |
| WO2018013509A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias |
| EP3485032B1 (en) | 2016-07-12 | 2021-02-17 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for detecting nucleic acid regions |
| CN106086203A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-11-09 | 深圳绿倍生态科技有限公司 | 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用 |
| JP7075394B2 (ja) | 2016-07-21 | 2022-05-25 | タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド | マルチウェルデバイスを用いたマルチｚ撮像及び分注 |
| EP3904514A1 (en) | 2016-07-22 | 2021-11-03 | Oregon Health & Science University | Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof |
| EP3500672A4 (en) | 2016-08-22 | 2020-05-20 | Twist Bioscience Corporation | DE NOVO SYNTHETIZED NUCLEIC ACID LIBRARIES |
| WO2018037281A1 (en) | 2016-08-22 | 2018-03-01 | Biolumic Limited | System, device and methods of seed treatment |
| US11543417B2 (en) | 2016-08-29 | 2023-01-03 | Oslo Universitetssykehus Hf | ChIP-seq assays |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| US10417457B2 (en) | 2016-09-21 | 2019-09-17 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
| WO2018064116A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems for data compression |
| US10385214B2 (en) | 2016-09-30 | 2019-08-20 | Illumina Cambridge Limited | Fluorescent dyes and their uses as biomarkers |
| FI3522713T3 (fi) | 2016-10-03 | 2023-01-13 | Amiinien ja hydratsiinien fluoresoiva tunnistus ja niiden määritysmenetelmiä | |
| WO2018067517A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| MY194951A (en) | 2016-10-14 | 2022-12-28 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| GB201618485D0 (en) | 2016-11-02 | 2016-12-14 | Ucl Business Plc | Method of detecting tumour recurrence |
| BR112019009949A2 (pt) | 2016-11-16 | 2019-08-20 | Illumina, Inc. | método implantado por computador para validar chamadas de variante e sistema para validar chamadas de variante |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| GB2573069A (en) | 2016-12-16 | 2019-10-23 | Twist Bioscience Corp | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| CN110139932B (zh) | 2016-12-19 | 2024-05-17 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 液滴加标的相邻性保留的标签化dna |
| US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| SG11201810611YA (en) | 2016-12-22 | 2018-12-28 | Illumina Cambridge Ltd | Coumarin compounds and their uses as fluorescent labels |
| US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| ES3026859T3 (en) | 2017-01-04 | 2025-06-12 | Mgi Tech Co Ltd | Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides |
| GB201704754D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| SG11201906428SA (en) | 2017-01-18 | 2019-08-27 | Illumina Inc | Methods and systems for generation and error-correction of unique molecular index sets with heterogeneous molecular lengths |
| EP3354746B1 (en) | 2017-01-30 | 2019-05-29 | Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology GmbH | Novel spike-in oligonucleotides for normalization of sequence data |
| US12264411B2 (en) | 2017-01-30 | 2025-04-01 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for analysis |
| EP4029939B1 (en) | 2017-01-30 | 2023-06-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for droplet-based single cell barcoding |
| WO2018144217A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Counsyl, Inc. | Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides |
| US10968447B2 (en) | 2017-01-31 | 2021-04-06 | Myriad Women's Health, Inc. | Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides |
| US10995333B2 (en) | 2017-02-06 | 2021-05-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation |
| WO2018148727A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from 9°n |
| WO2018148726A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from phage t4 |
| WO2018148723A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi |
| WO2018148724A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus |
| EP3580351A1 (en) | 2017-02-13 | 2019-12-18 | Qiagen Sciences, LLC | Polymerase enzyme from 9°n |
| US11492666B2 (en) | 2017-02-15 | 2022-11-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation |
| EP4556433A3 (en) | 2017-02-22 | 2025-08-06 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
| WO2018170169A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| EP3601593B1 (en) | 2017-03-24 | 2021-12-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Universal hairpin primers |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2018187013A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Omniome, Inc. | Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions |
| US12492430B2 (en) | 2017-04-11 | 2025-12-09 | Tecan Genomics, Inc. | Library quantitation and qualification |
| AU2018259206B2 (en) | 2017-04-23 | 2024-07-11 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| AU2018260627B2 (en) * | 2017-04-23 | 2024-08-22 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| EP3913053A1 (en) | 2017-04-23 | 2021-11-24 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| CN110770353B (zh) | 2017-04-23 | 2024-11-26 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法 |
| US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| AU2018261332B2 (en) | 2017-05-01 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing |
| EP3622089B1 (en) | 2017-05-08 | 2024-07-17 | Illumina, Inc. | Method for sequencing using universal short adapters for indexing of polynucleotide samples |
| CA3061731A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Zymergen Inc. | Genomic engineering of biosynthetic pathways leading to increased nadph |
| EP3625715A4 (en) | 2017-05-19 | 2021-03-17 | 10X Genomics, Inc. | DATA SET ANALYSIS SYSTEMS AND METHODS |
| WO2018213803A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Neon Therapeutics, Inc. | Immunogenic neoantigen identification |
| EP3445876B1 (en) | 2017-05-26 | 2023-07-05 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
| US10400235B2 (en) | 2017-05-26 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
| WO2018226900A2 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Zymergen Inc. | A htp genomic engineering platform for improving fungal strains |
| WO2018226880A1 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Zymergen Inc. | A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli |
| WO2018226810A1 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Zymergen Inc. | High throughput transposon mutagenesis |
| WO2018226893A2 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Zymergen Inc. | A high-throughput (htp) genomic engineering platform for improving saccharopolyspora spinosa |
| DK3635136T3 (da) | 2017-06-07 | 2022-01-10 | Univ Oregon Health & Science | Enkeltcelle-helgenombiblioteker til methyleringssekvensering |
| EP3634992B1 (en) | 2017-06-08 | 2024-03-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for identifying epitopes |
| WO2018231872A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| US11186862B2 (en) | 2017-06-20 | 2021-11-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | MDA using bead oligonucleotide |
| CN111356774B (zh) | 2017-06-26 | 2024-01-26 | 维也纳自然资源与生命科学大学 | 用于检测衰老细胞的新型生物标记物 |
| AU2018293468A1 (en) | 2017-06-29 | 2020-01-30 | Biolumic Limited | Method to improve crop yield and/or quality |
| GB201711219D0 (en) | 2017-07-12 | 2017-08-23 | Illumina Cambridge Ltd | Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications |
| AU2018302034B2 (en) | 2017-07-18 | 2021-05-20 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Method of chemically modifying plastic surfaces |
| EP3662482A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-06-10 | Illumina Inc. | Sequencing system with multiplexed biological sample aggregation |
| SG11201911869XA (en) | 2017-08-01 | 2020-01-30 | Illumina Inc | Spatial indexing of genetic material and library preparation using hydrogel beads and flow cells |
| EP3662084B1 (en) | 2017-08-01 | 2024-10-30 | Illumina, Inc. | Hydrogel beads for nucleotide sequencing |
| EP4553172A3 (en) | 2017-08-01 | 2025-06-25 | MGI Tech Co., Ltd. | Nucleic acid sequencing method |
| CN111868260B (zh) | 2017-08-07 | 2025-02-21 | 约翰斯霍普金斯大学 | 用于评估和治疗癌症的方法和材料 |
| WO2019033065A1 (en) | 2017-08-11 | 2019-02-14 | Atila Biosystems, Inc. | DIGITAL AMPLIFICATION WITH LIMITED NUCLEOTIDE COMPOSITION PRIMERS |
| WO2019035897A1 (en) | 2017-08-15 | 2019-02-21 | Omniome, Inc. | SCANNING APPARATUS AND METHODS USEFUL FOR DETECTION OF CHEMICAL OR BIOLOGICAL ANALYTES |
| WO2019038594A2 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Biolumic Limited | TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY |
| US11407837B2 (en) | 2017-09-11 | 2022-08-09 | Twist Bioscience Corporation | GPCR binding proteins and synthesis thereof |
| US20190076814A1 (en) | 2017-09-11 | 2019-03-14 | Synthego Corporation | Biopolymer synthesis system and method |
| US11447818B2 (en) | 2017-09-15 | 2022-09-20 | Illumina, Inc. | Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers |
| CA3075932A1 (en) | 2017-09-20 | 2019-03-28 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for differentiating somatic and germline variants |
| US10837047B2 (en) | 2017-10-04 | 2020-11-17 | 10X Genomics, Inc. | Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers |
| EP3691662A4 (en) | 2017-10-06 | 2021-05-12 | The University of Chicago | SCREENING OF T LYMPHOCYTE FOR CANCER SPECIFIC ANTIGENS |
| GB201716931D0 (en) | 2017-10-16 | 2017-11-29 | Illumina Cambridge Ltd | New fluorescent compounds and their use as biomarkers |
| CN110832596B (zh) | 2017-10-16 | 2021-03-26 | 因美纳有限公司 | 基于深度学习的深度卷积神经网络训练方法 |
| WO2019079202A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Illumina, Inc. | ABERRANT CONNECTION DETECTION USING CONVOLUTION NEURAL NETWORKS (CNN) |
| EP3697932A1 (en) | 2017-10-19 | 2020-08-26 | Omniome, Inc. | Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows |
| CN111565834B (zh) | 2017-10-20 | 2022-08-26 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于多核苷酸合成的加热的纳米孔 |
| US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
| WO2019084043A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 10X Genomics, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS |
| EP3700672B1 (en) | 2017-10-27 | 2022-12-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for sample preparation and analysis |
| WO2019089959A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
| EP3513280A4 (en) | 2017-11-13 | 2020-07-22 | The Multiple Myeloma Research Foundation, Inc. | INTEGRATED, MOLECULAR, OMIC, IMMUNOTHERAPY, METABOLIC, EPIGENETIC AND CLINICAL DATABASE |
| SG11201913654QA (en) | 2017-11-15 | 2020-01-30 | 10X Genomics Inc | Functionalized gel beads |
| US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
| US10815484B2 (en) | 2017-11-22 | 2020-10-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating cancer |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
| WO2019108851A1 (en) | 2017-11-30 | 2019-06-06 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis |
| EP3724658A1 (en) | 2017-12-12 | 2020-10-21 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for single cell processing |
| US12084720B2 (en) | 2017-12-14 | 2024-09-10 | Natera, Inc. | Assessing graft suitability for transplantation |
| CN111712579B (zh) | 2017-12-22 | 2024-10-15 | 10X基因组学有限公司 | 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法 |
| WO2019136058A1 (en) | 2018-01-02 | 2019-07-11 | The Regents Of The University Of Michigan | Multi-droplet capture |
| KR102804057B1 (ko) | 2018-01-04 | 2025-05-07 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | Dna 기반 디지털 정보 저장 |
| US11378544B2 (en) | 2018-01-08 | 2022-07-05 | Illumina, Inc. | High-throughput sequencing with semiconductor-based detection |
| KR102239487B1 (ko) | 2018-01-08 | 2021-04-14 | 일루미나, 인코포레이티드 | 반도체-기반 검출을 사용한 고-처리율 서열분석 |
| CA3065939A1 (en) | 2018-01-15 | 2019-07-18 | Illumina, Inc. | Deep learning-based variant classifier |
| US11366303B2 (en) | 2018-01-30 | 2022-06-21 | Rebus Biosystems, Inc. | Method for detecting particles using structured illumination |
| EP3746566A1 (en) | 2018-01-31 | 2020-12-09 | Dovetail Genomics, LLC | Sample prep for dna linkage recovery |
| WO2019152395A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for deconvoluting partition barcodes |
| SG11202007686VA (en) | 2018-02-12 | 2020-09-29 | 10X Genomics Inc | Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations |
| CA3067140C (en) | 2018-02-13 | 2023-03-21 | Illumina, Inc. | Dna sequencing using hydrogel beads |
| US11639928B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations |
| KR102933367B1 (ko) | 2018-02-27 | 2026-03-03 | 코넬 유니버시티 | 게놈-와이드 통합을 통한 순환 종양 dna의 초민감 검출 |
| WO2019169028A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | 10X Genomics, Inc. | Transcriptome sequencing through random ligation |
| WO2019183183A1 (en) | 2018-03-20 | 2019-09-26 | Zymergen Inc. | A htp platform for the genetic engineering of chinese hamster ovary cells |
| AU2019240046B2 (en) | 2018-03-22 | 2022-04-14 | Illumina, Inc. | Preparation of nucleic acid libraries from RNA and DNA |
| CN110832086A (zh) | 2018-04-02 | 2020-02-21 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于制造用于基于序列的遗传检验的对照的组合物和方法 |
| CN120905352A (zh) | 2018-04-02 | 2025-11-07 | 埃努梅拉分子股份有限公司 | 用于对核酸分子进行计数的方法、系统和组合物 |
| CN112262218B (zh) | 2018-04-06 | 2024-11-08 | 10X基因组学有限公司 | 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法 |
| EP3553182A1 (en) | 2018-04-11 | 2019-10-16 | Université de Bourgogne | Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection |
| US20190318806A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Illumina, Inc. | Variant Classifier Based on Deep Neural Networks |
| NL2020861B1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-22 | Illumina Inc | Variant classifier based on deep neural networks |
| US11746151B2 (en) | 2018-04-13 | 2023-09-05 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating cancer |
| US12024738B2 (en) | 2018-04-14 | 2024-07-02 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring |
| US11512002B2 (en) | 2018-04-18 | 2022-11-29 | University Of Virginia Patent Foundation | Silica materials and methods of making thereof |
| WO2019203986A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Omniome, Inc. | Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods |
| SG11201911961RA (en) | 2018-04-20 | 2020-01-30 | Illumina Inc | Methods of encapsulating single cells, the encapsulated cells and uses thereof |
| EP4234718A3 (en) | 2018-04-26 | 2023-11-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes |
| WO2019213619A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Abbott Laboratories | Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products |
| WO2019217758A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for molecular library generation |
| KR20240027158A (ko) | 2018-05-15 | 2024-02-29 | 일루미나, 인코포레이티드 | 표면-결합 올리고뉴클레오타이드의 화학적 절단 및 탈보호를 위한 조성물 및 방법 |
| IL271454B2 (en) | 2018-05-17 | 2025-04-01 | Illumina Inc | Rapid single-cell genetic sequencing with low Aggregation bias |
| CA3100739A1 (en) | 2018-05-18 | 2019-11-21 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
| JP2021525078A (ja) | 2018-05-31 | 2021-09-24 | オムニオム インコーポレイテッドＯｍｎｉｏｍｅ， Ｉｎｃ． | 核酸配列決定におけるシグナル対ノイズの増加 |
| US11814750B2 (en) | 2018-05-31 | 2023-11-14 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
| US10801064B2 (en) | 2018-05-31 | 2020-10-13 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
| WO2019236478A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free nucleic acids |
| DK3810774T3 (da) | 2018-06-04 | 2023-12-11 | Illumina Inc | Enkeltcelletransskriptom-biblioteker med højt throughput og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse |
| US11932899B2 (en) | 2018-06-07 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules |
| US11703427B2 (en) | 2018-06-25 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for cell and bead processing |
| US12234509B2 (en) | 2018-07-03 | 2025-02-25 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| NL2021377B1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-08 | Illumina Inc | Interposer with first and second adhesive layers |
| CN110684829A (zh) * | 2018-07-05 | 2020-01-14 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒 |
| US12073922B2 (en) | 2018-07-11 | 2024-08-27 | Illumina, Inc. | Deep learning-based framework for identifying sequence patterns that cause sequence-specific errors (SSEs) |
| WO2020023420A2 (en) | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for adjusting tumor mutational burden by tumor fraction and coverage |
| WO2020023362A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Omniome, Inc. | Serial formation of ternary complex species |
| US12188014B1 (en) | 2018-07-25 | 2025-01-07 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid processing using blocking agents |
| US20200032335A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for metabolome analysis |
| SG11202101164TA (en) | 2018-08-03 | 2021-03-30 | 10X Genomics Inc | Methods and systems to minimize barcode exchange |
| SG11202100765UA (en) | 2018-08-15 | 2021-03-30 | Illumina Inc | Compositions and methods for improving library enrichment |
| EP4249651B1 (en) | 2018-08-20 | 2025-01-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions |
| WO2020041148A1 (en) | 2018-08-20 | 2020-02-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for detection of protein-dna interactions using proximity ligation |
| US12065688B2 (en) | 2018-08-20 | 2024-08-20 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for cellular processing |
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| US20210332424A1 (en) | 2018-08-28 | 2021-10-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods of generating an array |
| KR20210052501A (ko) | 2018-08-30 | 2021-05-10 | 가던트 헬쓰, 인크. | 샘플 사이의 오염을 검출하기 위한 방법 및 시스템 |
| CN121354685A (zh) | 2018-08-31 | 2026-01-16 | 夸登特健康公司 | 无细胞dna中的微卫星不稳定性检测 |
| JP7637615B2 (ja) | 2018-09-04 | 2025-02-28 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 無細胞核酸試料におけるアレル不均衡を検出するための方法およびシステム |
| JP7045527B2 (ja) | 2018-09-20 | 2022-03-31 | ティーエイエムアイアールエヌエイ・ゲーエムベーハー | 肝機能障害の予測のためのマイクロｒｎａシグネチャ |
| JP6888123B2 (ja) | 2018-10-15 | 2021-06-16 | イルミナ インコーポレイテッド | 深層畳み込みニューラルネットワークを事前訓練するための深層学習ベースの技術 |
| EP3870704A4 (en) | 2018-10-25 | 2023-01-11 | Illumina, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFICATION OF LIGANDS ON ARRAYS WITH INDEXES AND BARCODES |
| WO2020086843A1 (en) | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Illumina, Inc. | Modulating polymer beads for dna processing |
| WO2020092807A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Guardant Health, Inc. | Methods, compositions and systems for calibrating epigenetic partitioning assays |
| US10876148B2 (en) | 2018-11-14 | 2020-12-29 | Element Biosciences, Inc. | De novo surface preparation and uses thereof |
| US12139764B2 (en) | 2018-11-14 | 2024-11-12 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Systems and methods for characterizing and treating breast cancer |
| US10768173B1 (en) * | 2019-09-06 | 2020-09-08 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US10704094B1 (en) | 2018-11-14 | 2020-07-07 | Element Biosciences, Inc. | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding |
| WO2020101795A1 (en) | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Omniome, Inc. | Electronic detection of nucleic acid structure |
| CN112867801B (zh) | 2018-11-30 | 2024-07-12 | Illumina公司 | 使用单一测定分析多种分析物 |
| EP3891304A1 (en) | 2018-12-04 | 2021-10-13 | Omniome, Inc. | Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays |
| SG11202012762WA (en) | 2018-12-05 | 2021-01-28 | Illumina Cambridge Ltd | Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification |
| US12398421B2 (en) | 2018-12-07 | 2025-08-26 | Bgi Shenzhen | Nanopore sequencing method |
| US11459607B1 (en) | 2018-12-10 | 2022-10-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes |
| WO2020123316A2 (en) | 2018-12-10 | 2020-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample |
| SG11202012748TA (en) | 2018-12-14 | 2021-01-28 | Illumina Cambridge Ltd | Decreasing phasing with unlabeled nucleotides during sequencing |
| SG11202012746XA (en) | 2018-12-17 | 2021-01-28 | Illumina Cambridge Ltd | Compositions for use in polyunucleotide sequencing |
| CN112654714B (zh) | 2018-12-17 | 2024-10-11 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 用于测序的引物寡核苷酸 |
| JP7587425B2 (ja) | 2018-12-18 | 2024-11-20 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 単一表面プライマーを使用したペアエンドシーケンシングのための方法および組成物 |
| DK3899037T3 (da) | 2018-12-19 | 2023-11-06 | Illumina Inc | Fremgangsmåder til forbedring af polynukleotidklyngeklonalitetsprioritet |
| US20200232010A1 (en) | 2018-12-20 | 2020-07-23 | Guardant Health, Inc. | Methods, compositions, and systems for improving recovery of nucleic acid molecules |
| EP3899032A2 (en) | 2018-12-20 | 2021-10-27 | Omniome, Inc. | Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes |
| US11293061B2 (en) | 2018-12-26 | 2022-04-05 | Illumina Cambridge Limited | Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group |
| WO2020139871A1 (en) | 2018-12-26 | 2020-07-02 | Twist Bioscience Corporation | Highly accurate de novo polynucleotide synthesis |
| WO2020142768A1 (en) | 2019-01-04 | 2020-07-09 | Northwestern University | Storing temporal data into dna |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US12169198B2 (en) | 2019-01-08 | 2024-12-17 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for sample analysis |
| US11845983B1 (en) | 2019-01-09 | 2023-12-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for multiplexing of droplet based assays |
| WO2020146740A1 (en) | 2019-01-10 | 2020-07-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence |
| WO2020160414A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Guardant Health, Inc. | Compositions and methods for isolating cell-free dna |
| WO2020167866A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-20 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for transposon loading |
| US12275993B2 (en) | 2019-02-12 | 2025-04-15 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| US12305239B2 (en) | 2019-02-12 | 2025-05-20 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| US11467153B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-10-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| WO2020167862A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-20 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for transfer of reagents between droplets |
| US11851683B1 (en) | 2019-02-12 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for selective analysis of cellular samples |
| EP3924505B1 (en) | 2019-02-12 | 2025-12-17 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| WO2020167574A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Omniome, Inc. | Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes |
| US11680950B2 (en) | 2019-02-20 | 2023-06-20 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes |
| US11655499B1 (en) | 2019-02-25 | 2023-05-23 | 10X Genomics, Inc. | Detection of sequence elements in nucleic acid molecules |
| CN113766930B (zh) | 2019-02-26 | 2025-07-22 | 特韦斯特生物科学公司 | Glp1受体的变异核酸文库 |
| JP2022522668A (ja) | 2019-02-26 | 2022-04-20 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | 抗体を最適化するための変異体核酸ライブラリ |
| WO2020176659A1 (en) | 2019-02-27 | 2020-09-03 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free dna |
| NL2023327B1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-17 | Illumina Inc | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| CA3103636A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina Cambridge Limited | Tertiary amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels |
| BR112021006234A2 (pt) | 2019-03-01 | 2021-09-28 | Illumina, Inc. | Bibliotecas de células únicas e núcleos únicos de alto rendimento e métodos de preparo e uso |
| BR112020026528B1 (pt) | 2019-03-01 | 2024-02-15 | Illumina Cambridge Limited | Composto de cumarina substituído com amina exocíclica, nucleotídeo ou oligonucleotídeo, kit, método de sequenciamento e método para sintetizar o referido composto |
| WO2020178231A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina, Inc. | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| SG11202111242PA (en) | 2019-03-11 | 2021-11-29 | 10X Genomics Inc | Systems and methods for processing optically tagged beads |
| NL2023311B9 (en) | 2019-03-21 | 2021-03-12 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| US11210554B2 (en) | 2019-03-21 | 2021-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| US11783917B2 (en) | 2019-03-21 | 2023-10-10 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based base calling |
| NL2023310B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| WO2020191389A1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Illumina, Inc. | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| NL2023316B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based sequencing |
| EP3947722A1 (en) | 2019-03-27 | 2022-02-09 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing rna from cells |
| US11421271B2 (en) | 2019-03-28 | 2022-08-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels |
| EP3947718A4 (en) | 2019-04-02 | 2022-12-21 | Enumera Molecular, Inc. | METHODS, SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR COUNTING NUCLEIC ACID MOLECULES |
| WO2020210370A1 (en) | 2019-04-12 | 2020-10-15 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Nucleic acid sequencing by synthesis using magnetic sensor arrays |
| US11112468B2 (en) | 2019-04-12 | 2021-09-07 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11327073B2 (en) | 2019-04-12 | 2022-05-10 | Western Digital Technologies, Inc. | Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11609208B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-03-21 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles |
| US11579217B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-02-14 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors |
| US11738336B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-08-29 | Western Digital Technologies, Inc. | Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing |
| US12313627B2 (en) | 2019-05-01 | 2025-05-27 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US11423306B2 (en) | 2019-05-16 | 2022-08-23 | Illumina, Inc. | Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing |
| CN112313750B (zh) | 2019-05-16 | 2023-11-17 | 因美纳有限公司 | 使用卷积的碱基识别 |
| US11593649B2 (en) | 2019-05-16 | 2023-02-28 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| WO2020243579A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| EP3976822A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for improving patient monitoring after surgery |
| US12305235B2 (en) | 2019-06-06 | 2025-05-20 | Natera, Inc. | Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system |
| US11644406B2 (en) | 2019-06-11 | 2023-05-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Calibrated focus sensing |
| US11332738B2 (en) | 2019-06-21 | 2022-05-17 | Twist Bioscience Corporation | Barcode-based nucleic acid sequence assembly |
| MX2021007803A (es) | 2019-07-12 | 2021-08-11 | Illumina Cambridge Ltd | Composiciones y metodos para preparar genotecas de secuenciacion de acido nucleico usando crispr/cas9 inmovilizadas en un soporte solido. |
| US11377655B2 (en) | 2019-07-16 | 2022-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Synthetic nucleic acids having non-natural structures |
| US10656368B1 (en) | 2019-07-24 | 2020-05-19 | Omniome, Inc. | Method and system for biological imaging using a wide field objective lens |
| US12496305B2 (en) | 2019-07-30 | 2025-12-16 | The Cleveland Clinic Foundation | Detection for determining corticosteroid responsiveness |
| US20220282326A1 (en) | 2019-08-05 | 2022-09-08 | Mission Bio, Inc. | Method and Apparatus for Single-Cell Analysis for Determining a Cell Trajectory |
| EP3999651B1 (en) | 2019-08-26 | 2026-03-18 | Adoc Ssf, Llc | Methods of performing guide-seq on primary human t cells |
| US12235262B1 (en) | 2019-09-09 | 2025-02-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for single cell protein analysis |
| CN114728996B (zh) | 2019-09-10 | 2022-11-29 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 核苷酸的可逆修饰 |
| US11208682B2 (en) | 2019-09-13 | 2021-12-28 | Western Digital Technologies, Inc. | Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags |
| SG11202113372WA (en) | 2019-09-20 | 2021-12-30 | Illumina Inc | Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes |
| WO2021061694A1 (en) | 2019-09-23 | 2021-04-01 | Zymergen Inc. | Method for counterselection in microorganisms |
| EP4034566A4 (en) | 2019-09-23 | 2024-01-24 | Twist Bioscience Corporation | VARIANT NUCLEIC ACID BANKS FOR CRTH2 |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| JP2022548783A (ja) | 2019-09-23 | 2022-11-21 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | 単一ドメイン抗体のバリアント核酸ライブラリー |
| US11788137B2 (en) | 2019-09-30 | 2023-10-17 | Diagenode S.A. | Diagnostic and/or sequencing method and kit |
| EP4041888A4 (en) | 2019-10-11 | 2023-11-01 | Guardant Health, Inc. | USE OF CELLULAR BACTERIAL NUCLEIC ACIDS FOR CANCER DETECTION |
| EP4045683B1 (en) | 2019-10-18 | 2025-02-19 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Methods for capping nucleic acids |
| DK3812472T3 (da) | 2019-10-21 | 2023-02-20 | Univ Freiburg Albert Ludwigs | Virkelig uvildig in vitro-undersøgelse til profilering af off-target-aktivitet af en eller flere målspecifikke programmerbare nukleaser i celler (abnoba-seq) |
| JP7470787B2 (ja) | 2019-11-05 | 2024-04-18 | パーソナリス，インコーポレイティド | 単一試料からの腫瘍純度の推定 |
| WO2021091611A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
| WO2021092433A2 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| US11747329B2 (en) | 2019-11-22 | 2023-09-05 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection |
| EP4617375A3 (en) | 2019-11-26 | 2025-10-29 | Guardant Health, Inc. | Methods, compositions and systems for improving the binding of methylated polynucleotides |
| JP2023510454A (ja) | 2019-11-27 | 2023-03-14 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | シクロオクタテトラエンを含有する色素及び組成物 |
| BR112022011235A2 (pt) | 2019-12-09 | 2022-12-13 | Twist Bioscience Corp | Bibliotecas de variantes de ácido nucleico para receptores de adenosina |
| JP2023508792A (ja) | 2019-12-19 | 2023-03-06 | イルミナ インコーポレイテッド | ハイスループット単一細胞ライブラリー、並びに製造方法及び使用方法 |
| EP4081656A1 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-02 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays |
| US11498078B2 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell receiver and methods of use |
| US12448648B2 (en) | 2019-12-23 | 2025-10-21 | Mgi Tech Co., Ltd. | Controlled strand-displacement for paired end sequencing |
| CN115135984B (zh) | 2019-12-23 | 2025-12-23 | 10X基因组学有限公司 | 可逆固定试剂及其使用方法 |
| ES2982420T3 (es) | 2019-12-23 | 2024-10-16 | 10X Genomics Inc | Métodos para el análisis espacial mediante el uso de la ligazón con plantilla de ARN |
| US11747262B2 (en) | 2019-12-23 | 2023-09-05 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell carrier and methods of use |
| AU2020416718A1 (en) | 2019-12-31 | 2022-07-07 | Singular Genomics Systems, Inc. | Polynucleotide barcodes for long read sequencing |
| US12365942B2 (en) | 2020-01-13 | 2025-07-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods of decreasing background on a spatial array |
| US12405264B2 (en) | 2020-01-17 | 2025-09-02 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic system and method for analyte capture |
| EP3851542A1 (en) | 2020-01-20 | 2021-07-21 | Tecan Genomics, Inc. | Depletion of abundant uninformative sequences |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US20210230681A1 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using proximity ligation |
| US11821035B1 (en) | 2020-01-29 | 2023-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods of making gene expression libraries |
| WO2021152586A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state |
| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
| US12059674B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-08-13 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent storage system |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US12110541B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing high-resolution spatial arrays |
| EP4100161B1 (en) | 2020-02-04 | 2024-07-10 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Flow cells and methods for their use |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| WO2021158925A1 (en) | 2020-02-07 | 2021-08-12 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
| US11835462B2 (en) | 2020-02-11 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for partitioning a biological sample |
| US12449419B1 (en) | 2020-02-12 | 2025-10-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods for detecting binding of peptide-MHC monomers to T cells |
| CN115428088A (zh) | 2020-02-13 | 2022-12-02 | 10X基因组学有限公司 | 用于基因表达和dna染色质可及性的联合交互式可视化的系统和方法 |
| JP2023513314A (ja) | 2020-02-13 | 2023-03-30 | ザイマージェン インコーポレイテッド | メタゲノムライブラリーおよび天然物発見プラットフォーム |
| US12399123B1 (en) | 2020-02-14 | 2025-08-26 | 10X Genomics, Inc. | Spatial targeting of analytes |
| US12281357B1 (en) | 2020-02-14 | 2025-04-22 | 10X Genomics, Inc. | In situ spatial barcoding |
| EP4103748A4 (en) | 2020-02-14 | 2024-03-13 | The Johns Hopkins University | METHOD AND MATERIALS FOR ASSESSING NUCLEIC ACIDS |
| JP7706698B2 (ja) * | 2020-02-14 | 2025-07-14 | 東レ株式会社 | バイオチップの製造方法 |
| CN121034400A (zh) | 2020-02-20 | 2025-11-28 | 因美纳有限公司 | 基于人工智能的多对多碱基判读 |
| US12591780B2 (en) | 2020-02-20 | 2026-03-31 | Illumina, Inc. | Data compression for artificial intelligence-based base calling |
| US12592298B2 (en) * | 2020-02-20 | 2026-03-31 | Illumina, Inc. | Hardware execution and acceleration of artificial intelligence-based base caller |
| US12354008B2 (en) | 2020-02-20 | 2025-07-08 | Illumina, Inc. | Knowledge distillation and gradient pruning-based compression of artificial intelligence-based base caller |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| US11926863B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells |
| US11768175B1 (en) | 2020-03-04 | 2023-09-26 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic methods for spatial analysis |
| PL3969618T3 (pl) | 2020-03-09 | 2024-01-03 | Illumina, Inc. | Sposoby sekwencjonowania polinukleotydów |
| JP7795919B2 (ja) | 2020-03-09 | 2026-01-08 | イルミナ，インコーポレイテッド | 核酸配列決定における改善 |
| CN115427586B (zh) | 2020-03-18 | 2025-03-28 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 大规模平行测序中的恢复阶段 |
| AU2021240092A1 (en) | 2020-03-20 | 2022-10-27 | Mission Bio, Inc. | Single cell workflow for whole genome amplification |
| WO2021214766A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto |
| EP4139485B1 (en) | 2020-04-22 | 2023-09-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using targeted rna depletion |
| EP4143338A1 (en) | 2020-04-30 | 2023-03-08 | Guardant Health, Inc. | Methods for sequence determination using partitioned nucleic acids |
| WO2021224677A1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-11 | Akershus Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing bowel cancer |
| US11188778B1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-30 | Illumina, Inc. | Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator |
| US20230183798A1 (en) | 2020-05-05 | 2023-06-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for modifying polymerase-nucleic acid complexes |
| EP4150065A2 (en) | 2020-05-12 | 2023-03-22 | Illumina Inc | Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase |
| US11851700B1 (en) | 2020-05-13 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules |
| JP7842700B2 (ja) | 2020-05-14 | 2026-04-08 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 相同組換え修復欠損の検出 |
| US12416603B2 (en) | 2020-05-19 | 2025-09-16 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoresis cassettes and instrumentation |
| EP4414459B1 (en) | 2020-05-22 | 2025-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| EP4153776B1 (en) | 2020-05-22 | 2025-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
| EP4600376A3 (en) | 2020-06-02 | 2025-10-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial transcriptomics for antigen-receptors |
| US12265079B1 (en) | 2020-06-02 | 2025-04-01 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for detecting analytes from captured single biological particles |
| AU2021283174A1 (en) | 2020-06-02 | 2023-01-05 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid library methods |
| US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
| WO2021252375A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | The Broad Institute, Inc. | Single cell combinatorial indexing from amplified nucleic acids |
| EP4421186B1 (en) | 2020-06-08 | 2025-08-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| WO2021252617A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Illumina, Inc. | Methods for increasing yield of sequencing libraries |
| EP4165207B1 (en) | 2020-06-10 | 2024-09-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| US12435363B1 (en) | 2020-06-10 | 2025-10-07 | 10X Genomics, Inc. | Materials and methods for spatial transcriptomics |
| WO2021252747A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 1Ox Genomics, Inc. | Fluid delivery methods |
| US11787831B2 (en) | 2020-06-22 | 2023-10-17 | Illumina Cambridge Limited | Nucleosides and nucleotides with 3′ acetal blocking group |
| ES2994976T3 (en) | 2020-06-25 | 2025-02-05 | 10X Genomics Inc | Spatial analysis of dna methylation |
| US20210403993A1 (en) | 2020-06-30 | 2021-12-30 | Illumina, Inc. | Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless dna |
| IL299052A (en) | 2020-07-02 | 2023-02-01 | Illumina Inc | A method for calibrating the seeding efficiency of a nucleic acid library in flow cells |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US12209280B1 (en) | 2020-07-06 | 2025-01-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis |
| CN116018412A (zh) | 2020-07-08 | 2023-04-25 | Illumina公司 | 作为转座体载体的小珠 |
| WO2023282916A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Guardant Health, Inc. | Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids |
| EP4179111B1 (en) | 2020-07-10 | 2024-04-03 | Guardant Health, Inc. | Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids |
| WO2022015600A2 (en) | 2020-07-13 | 2022-01-20 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods of sequencing complementary polynucleotides |
| WO2022020359A1 (en) | 2020-07-24 | 2022-01-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for detecting and treating high grade subtypes of uterine cancer |
| US11981964B2 (en) | 2020-07-28 | 2024-05-14 | Illumina Cambridge Limited | Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels |
| EP4585697A3 (en) | 2020-07-30 | 2025-08-06 | Guardant Health, Inc. | Methods for isolating cell-free dna |
| CN116171330A (zh) | 2020-08-06 | 2023-05-26 | Illumina公司 | 使用小珠连接的转座体制备rna和dna测序文库 |
| EP4193363A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-06-14 | Oxford Nanopore Technologies plc | Methods of identifying nucleic acid barcodes |
| US12553898B1 (en) | 2020-08-10 | 2026-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Fluorescent hybridization of antibody-oligonucleotide for multiplexing and signal amplification |
| EP4200416A1 (en) | 2020-08-18 | 2023-06-28 | Illumina, Inc. | Sequence-specific targeted transposition and selection and sorting of nucleic acids |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| EP4205126A1 (en) | 2020-08-25 | 2023-07-05 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for predicting an origin of a variant |
| MX2023001400A (es) | 2020-09-11 | 2023-04-25 | Illumina Cambridge Ltd | Metodos para enriquecer una secuencia diana a partir de una genoteca de secuenciación usando adaptadores de horquilla. |
| WO2022061150A2 (en) | 2020-09-18 | 2022-03-24 | 10X Geonomics, Inc. | Sample handling apparatus and image registration methods |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| EP4222278A1 (en) | 2020-09-30 | 2023-08-09 | Guardant Health, Inc. | Compositions and methods for analyzing dna using partitioning and a methylation-dependent nuclease |
| KR20230091116A (ko) | 2020-10-21 | 2023-06-22 | 일루미나, 인코포레이티드 | 다수의 삽입체를 포함하는 시퀀싱 주형, 및 시퀀싱 처리량을 개선하기 위한 조성물 및 방법 |
| WO2022087485A1 (en) | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid circularization and amplification on a surface |
| JP2023547620A (ja) | 2020-10-23 | 2023-11-13 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 分配および塩基変換を使用してｄｎａを解析するための組成物および方法 |
| US12480158B1 (en) | 2020-11-05 | 2025-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US12084715B1 (en) | 2020-11-05 | 2024-09-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for reducing artifactual antisense products |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| US20220195516A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing |
| EP4729631A2 (en) | 2020-12-21 | 2026-04-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| AU2021409643A1 (en) * | 2020-12-21 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for capturing and amplifying target polynucleotides using modified capture primers |
| US20220195518A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| WO2022140629A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for analyzing methylated polynucleotides |
| US12576400B2 (en) | 2021-01-08 | 2026-03-17 | Cellanome, Inc. | Methods for incubating and analyzing a cell in a compartment of a fluidic device |
| AU2022205377A1 (en) | 2021-01-08 | 2023-07-20 | Cellanome, Inc. | Devices and methods for analyzing biological samples |
| US12398262B1 (en) | 2021-01-22 | 2025-08-26 | 10X Genomics, Inc. | Triblock copolymer-based cell stabilization and fixation system and methods of use thereof |
| EP4284944A1 (en) | 2021-01-29 | 2023-12-06 | Illumina, Inc. | Methods, compositions and kits to improve seeding efficiency of flow cells with polynucleotides |
| MX2023009046A (es) | 2021-02-04 | 2023-08-10 | Illumina Inc | Generacion de lectura unida indexada prolongada en globulos unidos con transposomas. |
| EP4251770A4 (en) | 2021-02-08 | 2024-05-29 | Singular Genomics Systems, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCING COMPLEMENTARY POLYNUCLEOTIDES |
| US20240043915A1 (en) | 2021-02-13 | 2024-02-08 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof |
| EP4421491A3 (en) | 2021-02-19 | 2024-11-27 | 10X Genomics, Inc. | Method of using a modular assay support device |
| CN117015617B (zh) | 2021-02-23 | 2025-04-04 | 10X基因组学有限公司 | 基于探针的核酸和蛋白质分析 |
| JP2024513668A (ja) | 2021-03-05 | 2024-03-27 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 分子応答を分析するための方法および関連する態様 |
| EP4305200A1 (en) | 2021-03-09 | 2024-01-17 | Guardant Health, Inc. | Detecting the presence of a tumor based on off-target polynucleotide sequencing data |
| US12525320B2 (en) | 2021-03-16 | 2026-01-13 | Illumina, Inc. | Neural network parameter quantization for base calling |
| WO2022197752A1 (en) | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Illumina, Inc. | Tile location and/or cycle based weight set selection for base calling |
| AU2022238446A1 (en) | 2021-03-18 | 2023-09-07 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
| WO2022204032A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | Illumina Cambridge Limited | Methods for improving nucleic acid cluster clonality |
| WO2022212269A1 (en) | 2021-03-29 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Improved methods of library preparation |
| JP2024513187A (ja) | 2021-03-29 | 2024-03-22 | イルミナ インコーポレイテッド | ライブラリー中のｄｎａ損傷を評価し、アンプリコンサイズバイアスを正規化するための組成物及び方法 |
| MX2023010495A (es) | 2021-03-30 | 2023-09-18 | Illumina Inc | Metodos mejorados de preparacion de genoteca y adn complementarios isotermicos. |
| CA3211172A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction |
| EP4305196B1 (en) | 2021-04-14 | 2025-04-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods of measuring mislocalization of an analyte |
| US12217829B2 (en) | 2021-04-15 | 2025-02-04 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based analysis of protein three-dimensional (3D) structures |
| US12444482B2 (en) | 2021-04-15 | 2025-10-14 | Illumina, Inc. | Multi-channel protein voxelization to predict variant pathogenicity using deep convolutional neural networks |
| JP2024516191A (ja) | 2021-05-05 | 2024-04-12 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | ビス－ホウ素縮合複素環を含有する蛍光色素及び配列決定における使用 |
| EP4320271B1 (en) | 2021-05-06 | 2025-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for increasing resolution of spatial analysis |
| AU2022274750A1 (en) | 2021-05-14 | 2023-11-16 | Pluton Biosciences, Inc. | Chryseobacterium insect inhibitory microbial compositions and methods of making and using |
| KR20240009435A (ko) | 2021-05-20 | 2024-01-22 | 일루미나, 인코포레이티드 | 합성에 의한 시퀀싱을 위한 조성물 및 방법 |
| WO2022256503A1 (en) | 2021-06-03 | 2022-12-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| EP4355476A1 (en) | 2021-06-15 | 2024-04-24 | Illumina, Inc. | Hydrogel-free surface functionalization for sequencing |
| US11427855B1 (en) | 2021-06-17 | 2022-08-30 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
| US11859241B2 (en) | 2021-06-17 | 2024-01-02 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
| CN117597453A (zh) | 2021-06-23 | 2024-02-23 | 伊鲁米纳公司 | 用于测序试剂的组合物、方法、试剂盒、料筒和系统 |
| US20240287505A1 (en) | 2021-06-24 | 2024-08-29 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for combinatorial indexing of bead-based nucleic acids |
| WO2023278184A1 (en) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| EP4364155B1 (en) | 2021-06-29 | 2025-07-30 | Illumina, Inc. | Self-learned base caller, trained using oligo sequences |
| US12530882B2 (en) | 2021-07-01 | 2026-01-20 | Illumina, Inc. | Efficient artificial intelligence-based base calling of index sequences |
| WO2023287617A1 (en) | 2021-07-13 | 2023-01-19 | Illumina, Inc. | Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| EP4374343B1 (en) | 2021-07-19 | 2025-12-03 | Illumina, Inc. | Intensity extraction with interpolation and adaptation for base calling |
| US11455487B1 (en) | 2021-10-26 | 2022-09-27 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling |
| GB202110485D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| GB202110479D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| AU2022316142A1 (en) | 2021-07-21 | 2024-02-22 | Element Biosciences, Inc. | Optical systems for nucleic acid sequencing and methods thereof |
| US20250269368A1 (en) | 2021-07-21 | 2025-08-28 | Dnae Group Holdings Limited | Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides |
| WO2023004357A1 (en) | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Illumina, Inc. | Methods for preparing substrate surface for dna sequencing |
| AU2022319125A1 (en) | 2021-07-28 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Quality score calibration of basecalling systems |
| US12553805B2 (en) | 2021-08-02 | 2026-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Methods of preserving a biological sample |
| WO2023014741A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-09 | Illumina Software, Inc. | Base calling using multiple base caller models |
| US11795500B2 (en) | 2021-08-19 | 2023-10-24 | Eclipse Bioinnovations, Inc. | Methods for detecting RNA binding protein complexes |
| WO2023023638A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Singular Genomics Systems, Inc. | Chemical and thermal assisted nucleic acid amplification methods |
| CN118103750A (zh) | 2021-08-31 | 2024-05-28 | 伊鲁米纳公司 | 具有增强的孔成像分辨率的流动池 |
| WO2023034489A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| US20240299945A1 (en) | 2021-09-03 | 2024-09-12 | Elegen Corporation | Multi-way bead-sorting devices, systems, and methods of use thereof using pressure sources |
| US12480157B2 (en) | 2021-09-30 | 2025-11-25 | Illumina, Inc. | Polynucleotide sequencing |
| WO2023056328A2 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Illumina, Inc. | Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples |
| WO2023059654A1 (en) | 2021-10-05 | 2023-04-13 | Personalis, Inc. | Customized assays for personalized cancer monitoring |
| US20250236865A1 (en) | 2021-10-20 | 2025-07-24 | Illumina, Inc. | Methods for capturing library dna for sequencing |
| EP4422792A4 (en) | 2021-10-26 | 2025-12-17 | Singular Genomics Systems Inc | TARGETED MULTIPLEX AMPLIFICATION OF POLYNUCLEOTIDS |
| EP4430206A1 (en) | 2021-11-10 | 2024-09-18 | Encodia, Inc. | Methods for barcoding macromolecules in individual cells |
| WO2023086880A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample |
| WO2023086635A1 (en) | 2021-11-15 | 2023-05-19 | Vir Biotechnology, Inc. | Virological and molecular surrogates of response to sars-cov-2 neutralizing antibody sotrovimab |
| WO2023102118A2 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis |
| EP4448792A1 (en) | 2021-12-16 | 2024-10-23 | Illumina, Inc. | Hybrid clustering |
| EP4448786B1 (en) | 2021-12-16 | 2026-02-04 | Illumina, Inc. | Methods for metal directed cleavage of surface-bound polynucleotides |
| AU2022413263A1 (en) | 2021-12-17 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Orthogonal hybridization |
| WO2023122033A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | 10X Genomics, Inc. | Self-test for pathology/histology slide imaging device |
| AU2022421156A1 (en) | 2021-12-20 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| EP4453243B1 (en) | 2021-12-20 | 2026-02-11 | Illumina, Inc. | Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| WO2023126457A1 (en) | 2021-12-29 | 2023-07-06 | Illumina Cambridge Ltd. | Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers |
| US20250109442A1 (en) | 2022-01-13 | 2025-04-03 | Oslo Universitetssykehus Hf | Prostate cancer markers and uses thereof |
| CA3223362A1 (en) | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Xiaolin Wu | Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing |
| WO2023152568A2 (en) | 2022-02-10 | 2023-08-17 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing lung cancer |
| AU2023236924A1 (en) | 2022-03-15 | 2024-10-24 | Illumina, Inc. | Paired-end sequencing |
| AU2023234670A1 (en) | 2022-03-15 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on separate polynucleotides for methylation detection |
| US20230304086A1 (en) | 2022-03-28 | 2023-09-28 | Illumina Cambridge Limited | Labeled avidin and methods for sequencing |
| AU2023246772A1 (en) | 2022-03-29 | 2024-01-18 | Illumina Inc. | Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing |
| CA3223037A1 (en) | 2022-03-30 | 2023-10-05 | Oliver MILLER | Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| US20230357845A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-11-09 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving sequencing signals |
| US20230348973A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-11-02 | Illumina Cambridge Limited | Paired-end re-synthesis using blocked p5 primers |
| WO2023192900A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Illumina Singapore Pte. Ltd. | Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis |
| AU2023248405A1 (en) | 2022-04-07 | 2024-01-04 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2023209606A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres |
| US20230360725A1 (en) | 2022-05-09 | 2023-11-09 | Guardant Health, Inc. | Detecting degradation based on strand bias |
| CN119301275A (zh) | 2022-05-31 | 2025-01-10 | 伊路米纳有限公司 | 用于核酸测序的组合物和方法 |
| US20230392201A1 (en) | 2022-06-06 | 2023-12-07 | Element Biosciences, Inc. | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
| CN119604513A (zh) | 2022-06-28 | 2025-03-11 | 因美纳公司 | 含有稠合四环双硼杂环的荧光染料及其在测序中的用途 |
| EP4573213A1 (en) | 2022-08-15 | 2025-06-25 | Element Biosciences, Inc. | Spatially resolved surface capture of nucleic acids |
| WO2024039516A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Illumina, Inc. | Third dna base pair site-specific dna detection |
| US20240124916A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-04-18 | Illumina Cambridge Limited | Nanoparticle with polynucleotide binding site and method of making thereof |
| KR20250075532A (ko) | 2022-09-19 | 2025-05-28 | 일루미나, 인코포레이티드 | 고정된 프라이머를 포함하는 변형가능한 중합체 |
| US20240102067A1 (en) | 2022-09-26 | 2024-03-28 | Illumina, Inc. | Resynthesis Kits and Methods |
| US20240124929A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Mesophilic compositions for nucleic acid amplification |
| WO2024069581A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina Singapore Pte. Ltd. | Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use |
| EP4594482A1 (en) | 2022-09-30 | 2025-08-06 | Illumina, Inc. | Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides |
| US20240110234A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Amplification Compositions and Methods |
| US20240140939A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-05-02 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing |
| US20240124914A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Thermophilic compositions for nucleic acid amplification |
| US20240110221A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of modulating clustering kinetics |
| WO2024073043A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides |
| GB202215624D0 (en) | 2022-10-21 | 2022-12-07 | Dnae Diagnostics Ltd | Clonal amplification |
| EP4482979B1 (en) | 2022-11-09 | 2025-10-01 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of multiple analytes in a biological sample |
| CN120188220A (zh) | 2022-11-15 | 2025-06-20 | 夸登特健康公司 | 用来自基线循环肿瘤DNA(ctDNA)水平和ctDNA水平随时间纵向变化的信号从ctDNA预测非小细胞肺癌(NSCLC)患者药物响应或直至死亡或癌症进展的时间的方法 |
| EP4627113A1 (en) | 2022-11-30 | 2025-10-08 | Illumina, Inc. | Chemoenzymatic correction of false positive uracil transformations |
| US20240209429A1 (en) | 2022-12-07 | 2024-06-27 | Illumina, Inc. | Monoclonal clustering using double stranded dna size exclusion with patterned seeding |
| WO2024123866A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Illumina, Inc. | Nucleosides and nucleotides with 3´ blocking groups and cleavable linkers |
| WO2024129672A1 (en) | 2022-12-12 | 2024-06-20 | The Broad Institute, Inc. | Trafficked rnas for assessment of cell-cell connectivity and neuroanatomy |
| EP4634400A1 (en) | 2022-12-14 | 2025-10-22 | Illumina, Inc. | Systems and methods for capture and enrichment of clustered beads on flow cell substrates |
| AU2023409008A1 (en) | 2022-12-21 | 2025-06-26 | Guardant Health, Inc. | Detecting homologous recombination deficiences based on methylation status of cell-free nucleic acid molecules |
| WO2024137765A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Illumina, Inc. | Transition-metal catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis |
| CN119095982A (zh) | 2022-12-22 | 2024-12-06 | 伊路米纳有限公司 | 用于边合成边测序的钯催化剂组合物和方法 |
| CN119095984A (zh) | 2022-12-27 | 2024-12-06 | 伊路米纳有限公司 | 使用3'烯丙基封端的核苷酸的测序方法 |
| CA3246669A1 (en) | 2023-01-06 | 2024-07-11 | Illumina, Inc. | URACIL REDUCTION BY POLYMERASE |
| AU2024228388A1 (en) | 2023-02-27 | 2025-10-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Therapeutic t cell receptors targeting kras g12d |
| WO2024206407A2 (en) | 2023-03-29 | 2024-10-03 | Illumina, Inc. | Naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing |
| EP4689181A1 (en) | 2023-03-30 | 2026-02-11 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2024233502A1 (en) | 2023-05-05 | 2024-11-14 | Guardant Health, Inc. | Cell-free dna blood-based test for cancer screening |
| EP4720334A1 (en) | 2023-05-26 | 2026-04-08 | Illumina, Inc. | Methods for preserving methylation status during clustering |
| EP4720331A1 (en) | 2023-05-31 | 2026-04-08 | Illumina, Inc. | False positive reduction by translesion polymerase repair |
| WO2024249591A1 (en) | 2023-05-31 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Methods for double-stranded sequencing by synthesis |
| WO2024249061A1 (en) | 2023-05-31 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Detecting a methylated nucleotide using a quencher |
| EP4720341A1 (en) | 2023-06-05 | 2026-04-08 | Illumina, Inc. | Identification and mapping of methylation sites |
| WO2024256580A1 (en) | 2023-06-14 | 2024-12-19 | Illumina, Inc. | Concurrent sequencing with spatially separated rings |
| EP4728092A1 (en) | 2023-06-14 | 2026-04-22 | Illumina, Inc. | Determination of modified cytosines |
| CN121420358A (zh) | 2023-06-15 | 2026-01-27 | 夸登特健康公司 | 使用从头突变特征用于靶向cfDNA样品中HRD检测的方法 |
| WO2025049700A1 (en) | 2023-08-31 | 2025-03-06 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2025062001A1 (en) | 2023-09-20 | 2025-03-27 | Illumina, Inc. | Optimised nucleic acid sequencing |
| WO2025062002A1 (en) | 2023-09-20 | 2025-03-27 | Illumina, Inc. | Concurrent sequencing using nick translation |
| WO2025072783A1 (en) | 2023-09-28 | 2025-04-03 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2025072683A1 (en) | 2023-09-29 | 2025-04-03 | Illumina, Inc. | Solid supports and methods for strand invasion-based amplification |
| US20250246266A1 (en) | 2023-09-29 | 2025-07-31 | Guardant Health, Inc. | Genotyping cyp2d6 |
| WO2025081064A2 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Illumina, Inc. | Thermophilic deaminase and methods for identifying modified cytosine |
| WO2025090596A1 (en) | 2023-10-26 | 2025-05-01 | Illumina, Inc. | 4,5-substituted naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing |
| US20250285708A1 (en) | 2023-10-27 | 2025-09-11 | Guardant Health, Inc. | Monitoring molecular response by allelic imbalance |
| WO2025104619A1 (en) | 2023-11-13 | 2025-05-22 | Oslo Universitetssykehus Hf | Breast cancer markers and uses thereof |
| US20250163505A1 (en) | 2023-11-17 | 2025-05-22 | Illumina, Inc. | Conjugated polymers or polymer dots as fluorescent labels |
| WO2025117738A1 (en) | 2023-11-28 | 2025-06-05 | Illumina, Inc. | Methods of improving unique molecular index ligation efficiency |
| US20250197933A1 (en) | 2023-12-18 | 2025-06-19 | Illumina, Inc. | Hydrogel nanoparticles as labeling scaffold in sequencing |
| WO2025137222A1 (en) | 2023-12-19 | 2025-06-26 | Illumina, Inc. | Methylation detection assay |
| US20250207193A1 (en) | 2023-12-22 | 2025-06-26 | Illumina, Inc. | Reusable flow cells and methods of using them for nucleic acid sequencing |
| WO2025144716A1 (en) | 2023-12-28 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Nucleotides with enzymatically cleavable 3'-o-glycoside blocking groups for sequencing |
| US20250215491A1 (en) | 2023-12-28 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Sequencing with single-stranded binding proteins |
| US20250215494A1 (en) | 2023-12-29 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Tricyclic polymethine dyes for nucleic acid sequencing |
| WO2025184226A1 (en) | 2024-02-28 | 2025-09-04 | Illumina, Inc. | Nucleotides with terminal phosphate capping |
| WO2025188906A1 (en) | 2024-03-08 | 2025-09-12 | Illumina, Inc. | Modified adenosine nucleotides |
| WO2025207535A1 (en) | 2024-03-26 | 2025-10-02 | Illumina, Inc. | Photo-switchable surfaces |
| US20250320550A1 (en) | 2024-04-12 | 2025-10-16 | Robert Bosch Gmbh | Sequencing by synthesis using electroactively labeled 3-oh-modified nucleotides |
| WO2025221895A1 (en) | 2024-04-19 | 2025-10-23 | Illumina, Inc. | Water soluble polymer scaffolds for dye labeling |
| WO2025230914A1 (en) | 2024-04-29 | 2025-11-06 | Illumina, Inc. | Nucleotides with enzyme-triggered self-immolative linkers for sequencing by synthesis |
| WO2025240905A1 (en) | 2024-05-17 | 2025-11-20 | The Broad Institute, Inc. | Imaging-free high-resolution spatial macromolecule abundance reconstruction |
| WO2025264836A1 (en) | 2024-06-18 | 2025-12-26 | Illumina, Inc. | Methods for increasing sequencing quality of gc-rich regions |
| WO2025264831A1 (en) | 2024-06-18 | 2025-12-26 | Illumina, Inc. | Methods for increasing sequencing quality of gc-rich regions |
| WO2026006314A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Tagging target regions prior to nucleotide sequencing |
| WO2026006774A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2026006746A2 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Nucleic acid preparation and analysis techniques |
| WO2026035914A1 (en) | 2024-08-09 | 2026-02-12 | Illumina, Inc. | Nucleotides having 3'-hydroxy blocking groups |
Family Cites Families (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4957858A (en) | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| EP0224126A3 (en) | 1985-11-25 | 1989-02-01 | The University of Calgary | Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| WO1989001050A1 (en) | 1987-07-31 | 1989-02-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| SE8801070D0 (sv) | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
| US6107023A (en) | 1988-06-17 | 2000-08-22 | Genelabs Technologies, Inc. | DNA amplification and subtraction techniques |
| GB8818020D0 (en) | 1988-07-28 | 1988-09-01 | Ici Plc | Method for amplification of nucleotide sequences |
| CA2004326A1 (en) | 1988-12-23 | 1990-06-23 | Nanibushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
| US5629158A (en) * | 1989-03-22 | 1997-05-13 | Cemu Bitecknik Ab | Solid phase diagnosis of medical conditions |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| WO1991006678A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-05-16 | Sri International | Dna sequencing |
| CA2036946C (en) | 1990-04-06 | 2001-10-16 | Kenneth V. Deugau | Indexing linkers |
| US5326692B1 (en) | 1992-05-13 | 1996-04-30 | Molecular Probes Inc | Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift |
| US5645994A (en) * | 1990-07-05 | 1997-07-08 | University Of Utah Research Foundation | Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences |
| DE69228247T2 (de) | 1991-08-10 | 1999-07-08 | Medical Research Council, London | Behandlung von Zellpopulationen |
| WO1993004199A2 (en) | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Scientific Generics Limited | Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids |
| EP0543484B1 (en) | 1991-08-30 | 2001-01-31 | Research Development Corporation of Japan | A method of DNA amplification |
| EP0675966B1 (en) | 1992-02-19 | 2004-10-06 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids |
| US5849544A (en) * | 1992-07-24 | 1998-12-15 | University Of Australia | Amplification and detection process |
| RU2048522C1 (ru) | 1992-10-14 | 1995-11-20 | Институт белка РАН | Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления |
| US5436142A (en) * | 1992-11-12 | 1995-07-25 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1995-08-08 | Hamamatsu Photonics Kk | 核酸塩基配列決定方法 |
| ATE220424T1 (de) * | 1994-05-28 | 2002-07-15 | Tepnel Medical Ltd | Herstellung von nukleinsaeurekopien |
| US6060288A (en) * | 1994-08-03 | 2000-05-09 | Mosaic Technologies | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
| US5641658A (en) * | 1994-08-03 | 1997-06-24 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support |
| AU5544696A (en) | 1995-04-11 | 1996-10-30 | Trustees Of Boston University | Solid phase sequencing of biopolymers |
| US5753439A (en) * | 1995-05-19 | 1998-05-19 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid detection methods |
| DK0862656T3 (da) | 1995-11-21 | 2001-04-09 | Univ Yale | Unimolekylær segmentamplifikation og -detektering |
| US5939291A (en) | 1996-06-14 | 1999-08-17 | Sarnoff Corporation | Microfluidic method for nucleic acid amplification |
| US6218142B1 (en) * | 1997-03-05 | 2001-04-17 | Michael Wassenegger | Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP) |
| JP2001517948A (ja) * | 1997-04-01 | 2001-10-09 | グラクソ、グループ、リミテッド | 核酸配列決定法 |
| JP2002503954A (ja) * | 1997-04-01 | 2002-02-05 | グラクソ、グループ、リミテッド | 核酸増幅法 |
| US6235471B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
| WO1998045474A1 (en) | 1997-04-04 | 1998-10-15 | Innogenetics N.V. | Isothermal polymerase chain reaction by cycling the concentration of divalent metal ions |
| ES2230701T3 (es) | 1997-07-07 | 2005-05-01 | Medical Research Council | Procedimiento de seleccion in vitro. |
| US6326489B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-12-04 | Howard Hughes Medical Institute | Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays |
| US6124120A (en) | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
| US6511803B1 (en) | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6248558B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity |
| WO2000004193A1 (en) | 1998-07-20 | 2000-01-27 | Yale University | Method for detecting nucleic acids using target-mediated ligation of bipartite primers |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| WO2000041524A2 (en) | 1999-01-11 | 2000-07-20 | President And Fellows Of Harvard College | Isothermal amplification of dna |
| US6300070B1 (en) * | 1999-06-04 | 2001-10-09 | Mosaic Technologies, Inc. | Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids |
| JP6049051B2 (ja) | 2011-07-29 | 2016-12-21 | 日東電工株式会社 | 両面真空成膜方法 |
-
1999
- 1999-09-28 AR ARP990104889A patent/AR021833A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 HK HK02104254.1A patent/HK1042525A1/zh unknown
- 1999-09-30 EP EP05016082.9A patent/EP1634963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 AU AU61088/99A patent/AU771073B2/en not_active Ceased
- 1999-09-30 IL IL14217899A patent/IL142178A0/xx unknown
- 1999-09-30 AT AT99947713T patent/ATE311474T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 TR TR2001/00911T patent/TR200100911T2/xx unknown
- 1999-09-30 US US09/806,531 patent/US7115400B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 BR BR9914159-0A patent/BR9914159A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 EA EA200100402A patent/EA004271B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 NZ NZ510599A patent/NZ510599A/xx unknown
- 1999-09-30 HU HU0105052A patent/HUP0105052A3/hu unknown
- 1999-09-30 JP JP2000572404A patent/JP2002525125A/ja active Pending
- 1999-09-30 CZ CZ20011183A patent/CZ20011183A3/cs unknown
- 1999-09-30 WO PCT/GB1999/003248 patent/WO2000018957A1/en not_active Ceased
- 1999-09-30 KR KR1020017003997A patent/KR20010085860A/ko not_active Ceased
- 1999-09-30 CA CA002344575A patent/CA2344575A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-30 EE EEP200100195A patent/EE200100195A/xx unknown
- 1999-09-30 PL PL99347125A patent/PL347125A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 CN CN99813058A patent/CN1325458A/zh active Pending
- 1999-09-30 DE DE69928683T patent/DE69928683T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 ZA ZA200102420A patent/ZA200102420B/en unknown
- 1999-09-30 SK SK429-2001A patent/SK4292001A3/sk unknown
- 1999-09-30 EP EP99947713A patent/EP1117827B8/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-14 NO NO20011303A patent/NO20011303L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-03-20 BG BG105363A patent/BG105363A/bg unknown
-
2006
- 2006-08-17 US US11/506,146 patent/US8652810B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-01-08 US US14/150,607 patent/US9297006B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-02-22 US US15/050,345 patent/US10370652B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG105363A (bg) | Методи за секвениране и амплифициране на нуклеинова киселина | |
| JP7100680B2 (ja) | ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法 | |
| JP5806213B2 (ja) | 核酸の特異的解析のためのプローブ | |
| US8168388B2 (en) | Preparation of nucleic acid templates for solid phase amplification | |
| EP3077545B1 (en) | Methods for sequencing nucleic acids | |
| CZ20031582A3 (cs) | Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu | |
| CN110997932A (zh) | 用于甲基化测序的单细胞全基因组文库 | |
| JP2001517948A (ja) | 核酸配列決定法 | |
| US20230175047A1 (en) | Array and method for detecting spatial information of nucleic acids | |
| WO2011034690A2 (en) | Centroid markers for image analysis of high density clusters in complex polynucleotide sequencing | |
| JPH07203998A (ja) | 核酸塩基配列決定方法 | |
| KR20210023948A (ko) | 고순도 뉴클레오타이드 획득 방법 및 장치 | |
| JP2019514371A (ja) | 細胞成分をマトリックスに結合させるための方法 | |
| US20050153290A1 (en) | Normalisation of microarray data based on hybridisation with an internal reference | |
| US20100285970A1 (en) | Methods of sequencing nucleic acids | |
| HK40063948A (en) | Systems and methods for clonal replication and amplification of nucleic acid molecules for genomic and therapeutic applications | |
| MXPA01003266A (en) | Methods of nucleic acid amplification and sequencing | |
| HK40066267A (zh) | 用於检测核酸空间信息的阵列及检测方法 | |
| HK40066267B (zh) | 用於检测核酸空间信息的阵列及检测方法 | |
| HK40027672B (zh) | 用於甲基化测序的单细胞全基因组文库 |