CZ20011183A3 - Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny - Google Patents
Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20011183A3 CZ20011183A3 CZ20011183A CZ20011183A CZ20011183A3 CZ 20011183 A3 CZ20011183 A3 CZ 20011183A3 CZ 20011183 A CZ20011183 A CZ 20011183A CZ 20011183 A CZ20011183 A CZ 20011183A CZ 20011183 A3 CZ20011183 A3 CZ 20011183A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- colony
- primers
- templates
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 414
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 372
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 372
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 185
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 136
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 97
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 40
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 28
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- -1 dimethoxytrityl Chemical group 0.000 claims description 18
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 11
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 5
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 5
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 3
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 claims description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 275
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 107
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 62
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 58
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 58
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 36
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 27
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 23
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 19
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 19
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 16
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 12
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 11
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 10
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 9
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 8
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 8
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 7
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 7
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 6
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 6
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 239000007976 Tris-NaCl-Tween buffer Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101000982628 Homo sapiens Prolyl 3-hydroxylase OGFOD1 Proteins 0.000 description 4
- 102100026942 Prolyl 3-hydroxylase OGFOD1 Human genes 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 4
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- HDMYKJVSQIHZLM-UHFFFAOYSA-N 1-[3,5-di(pyren-1-yl)phenyl]pyrene Chemical compound C1=CC(C=2C=C(C=C(C=2)C=2C3=CC=C4C=CC=C5C=CC(C3=C54)=CC=2)C=2C3=CC=C4C=CC=C5C=CC(C3=C54)=CC=2)=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 HDMYKJVSQIHZLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001128634 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 102100032194 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 3
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SYGQYQGDQAUORG-UHFFFAOYSA-N 3-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]-1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1(S(O)(=O)=O)C(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 SYGQYQGDQAUORG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical group [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003303 reheating Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrimidin-4-amine Chemical group N=C1NCNC=C1 WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYNVSZMFFVWFQA-NOMGDLSISA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(1-hydroxyethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(O)C)O[C@H]1N1C(NC(N)=NC2=O)=C2N=C1 PYNVSZMFFVWFQA-NOMGDLSISA-N 0.000 description 1
- LXBGSDVWAMZHDD-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1h-imidazole Chemical compound CC1=NC=CN1 LXBGSDVWAMZHDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGHACVGYBTXHRR-UHFFFAOYSA-N 3-(2-iodoacetyl)pyrrolidine-2,5-dione Chemical group ICC(=O)C1CC(=O)NC1=O KGHACVGYBTXHRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWDDLRSGGCWDPH-UHFFFAOYSA-N 4-triethoxysilylbutan-1-amine Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCCN SWDDLRSGGCWDPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100031476 Cytochrome P450 1A1 Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000941690 Homo sapiens Cytochrome P450 1A1 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKWSVTLNFBGMKR-UHFFFAOYSA-N [4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl] butanoate Chemical compound C1=CC(OC(=O)CCC)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O CKWSVTLNFBGMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940064734 aminobenzoate Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 108010032819 exoribonuclease II Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N hydron;methanediimine;chloride Chemical compound Cl.N=C=N DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012177 large-scale sequencing Methods 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- XLSZMDLNRCVEIJ-UHFFFAOYSA-N methylimidazole Natural products CC1=CNC=N1 XLSZMDLNRCVEIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006855 networking Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IFIJJMKUTOBNME-UHFFFAOYSA-N pyrrole-2,5-dione;pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1.O=C1NC(=O)C=C1 IFIJJMKUTOBNME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Způsoby amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny
Oblast techniky
Vynález popisuje amplifikaci nukleové kyseliny a její sekvenování. Specificky se vynález vztahuje k metodám amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny a k přístrojům a sadám, které jsou použitelné při amplifikaci a sekvenování ve velkém měřítku s velkým množstvím zpracovávaného materiálu.
Dosavadní stav techniky
Analýza sekvence nukleové kyseliny je základem při mnoha aktivitách v biologii, biotechnologii a v medicíně. Schopnost stanovit sekvenci nukleové kyseliny se stává důležitějším se vzrůstajícími potřebami stanovit sekvence velkých genomů u lidí a jiných vyšších organizmů a také při detekci polymorfizmu jediného nukleotidu a testování a monitorování exprese genu. Genetické informace získané sekvenováním se mohou použít v mnoha oblastech, jako je například objev cílených léků a diagnóza onemocnění a posouzení nebezpečí a identifikace organizmu a jeho charakterizace.
Prvním krokem takového použití je stanovení aktuálního chemického prostředku nukleových kyselin, přesněji stanovení výskytu čtyř bází, které obsahuje nukleová kyselina. Jsou to adenin (A) , cytosin (C) , guanin (G) a thymin (T) nebo uráčil (U). Takové použiti však vyžaduje sekvenování nukleových kyselin ve velkém měřítku, což činí metody sekvenování vhodné pro zpracování velkého množství materiálu velmi žádané.
Metody sekvenování nukleové kyseliny se popisují v dosavadním stavu techniky. Dvě metody nejčastěji používané jsou metody chemického štěpení podle Maxama a Gilberta, které vznikají na základě specifické chemie baží a v současné době je velmi populární metoda sekvenování podle Sangera, která je založena na principu zakončení enzymatického řetězce a používá se jako rutinní metoda při sekvenaci nukleové kyseliny.
Při sekvenování podle Sangera se každá sekvenovaná nukleové kyselina replikuje v reakci, která obsahuje polymerázu DNA, deoxynukleotidové trifosfáty (dNTP) a dideoxynukleotidové trifosfáty (ddNTP). DNA polymeráza může začlenit dNTP a ddNTP do rostoucího řetězce DNA. V případě, že se ddNTP začlení, 3'konec rostoucího řetězce DNA nevykazuje hydroxylovou skupinu a neexistuje substrát pro prodloužení řetězce, tak se zakončí řetězec nukleové kyseliny. Protože jedna určitá reakce zahrnuje jeden typ ddNTP, vzniká směs nukleových kyselin s různou délkou, přičemž všechny nukleové kyseliny jsou zakončeny ddNTP. Obvykle se vytvoří oddělené reakce v případě každého ze čtyř typů ddNTP a vzniklá distribuce délek fragmentů nukleových kyselin se analyzuje elektroforézou na denaturačním gelu (kde se fragmenty nukleové kyseliny rozdělí podle své velikosti) nebo hmotnostní spektroskopií. Je obvyklé, aby se jeden nebo více deoxynukleotidtrifosfátů obsažený v reakční směsi značil, což umožňuje detekci fragmentů různých délek.
S hora popsané metody jsou nevýhodné, protože každá sekvenovaná nukleová kyselina se musí zpracovat jednotlivě během biochemické reakce. Gelová elektroforéza je nepohodlná, pracná a pomalá, dokonce, když se použije kapilární elektroforéza, není úplně vhodná pro sekvenování ve velkém měřítku, kdy se zpracovává velké množství materiálu. Navíc následné stanovení sekvence je obtížné. Hmotnostní spektroskopie je stále na úrovni prototypu a vyžaduje velmi drahé zařízení a každý vzorek se musí analyzovat jednotlivě.
Jeden způsob zvýšení množství zpracovávaného materiálu je paralelní způsob zpracování vzorků. Metody použití hybridizace
DNA sond nukleové kyseliny umožňují sdružování procesu během • · • 44 · · · »··· Λ ···· ····· ·· · · · · · · ......
· ········ ······ · · · · · · ··· biochemických a elektroforetických procesů, přičemž ale rostou náklady a délka trvajících manipulací.
Dále jsou dostupné metody založené na čipech DNA a DNA hybridizaci (popisuje se v publikaci Thomas and Burke Exp. Opin. Ther. Patents 8: 503-508 (1998)). Tyto metody nejsou výhodné, protože v případě každé aplikace se musí navrhnout a vyro čip DNA. Je to dlouho trvající operace a cena jednoho čipu klesne pouze tehdy, jestliže je nutné vyrobit velké množství čipů. Čipy nelze použít více jak jednou a pro jeden vzorek nukleové kyseliny je určen jeden čip. To je nevýhodné, protože, má-li se diagnostikovat pacient, měly by se jeho vzorky dát zpracovat v každém okamžiku. Nakonec rozsah sekvence, která se má analyzovat za použití takového čipu, je omezen na méně než 100 000 baží a je také omezen druhem použití, jako je například genotypování DNA a profily exprese genů.
Během nejznámějších metod analýzy sekvence nukleové kyseliny, amplifikace nukleových kyselin je nutný krok za účelem získání nukleové kyseliny v množství, které je dostatečné pro analýzu.
Několik metod amplifikace nukleových kyselin je dobře známých v oboru a jsou dokumentovány v dosavadním stavu techniky. Nukleové kyseliny se například amplifikují začleněním nukleové kyseliny do konstrukce expresívního vektoru. Takové vektory se pak mohou začlenit do vhodné biologické hostitelské buňky a vektor DNA zahrnující nukleovou kyselinu se pomnoží kultivací biologického hostitele za použití dobře zavedeného protokolu.
Nukleové kyseliny amplifikované za použití uvedených metod se mohou izolovat z hostitelských buněk za použití metod, které jsou dobře známy v oboru. Takové metody jsou však • · časově náročné, pracné a těžko nevýhodné, protože jsou automatizovatelné.
Metoda amplifikace DNA pomocí PCR se popisuje od roku 1985 (v popisuje se v publikaci Saiki et al., Science 230, 13501354) a je nyní metodou velmi známou a dobře zdokumentovanou. Cílový fragment nukleové kyseliny se může amplifikovat za použití dvou krátkých oligonukleotidových sekvencí (obvykle se nazývají primery), které jsou specifické pro známé sekvence, které lemují sekvenci DNA, jenž se amplifikuje. Primery hybridizují s opačnými řetězci dvouřetězcového fragmentu DNA po té, co se denaturovaly a jsou orientovány tak, že dochází k syntéze DNA v oblasti mezi dvěma primery pomocí DNA polymerázy, přičemž sekvence primerů se prodlužují začleněním nukleotidů do sekvence pomocí polymerázy. Extenzní reakce vytvářejí dvě dvouřetězcové cílové oblasti, kdy každá se opět denaturuje a je tak připravena pro další cyklus hybridizace a extenze. Třetí cyklus produkuje dvě dvouřetězcové molekuly, které obsahují cílovou oblast ve dvouřetězcové formě. Pomocí opakovaných cyklů teplotní denaturace, hybridizace primerů a extenze dochází k rychlé exponenciální akumulaci specifického cílového fragmentu DNA. Tato metoda probíhá v roztoku a amplifikovaný fragment cílové nukleové kyseliny se izoluje z roztoku metodami, které jsou dobře známy v oboru. Je to například gelová elektroforéza.
Popisují se metody, které používají jeden primer zachycený na povrchu podkladu ve spojení s volnými primery obsaženými v roztoku. Tyto metody umožňují současnou amplifikaci a zachycení produktu PCR na povrchu podkladu (popisuje se v publikaci Oroskar, A.A. et al., Clinical Chemistry 42: 1547 (1996)) .
Dokumenty WO 96/04404 a WO 98/36094 (Mosaic Technologies, lne. et al.) popisuji způsob detekce cílové nukleové kyseliny ve vzorku, který obsahuje cílovou nukleovou kyselinu. Metoda zahrnuje vyvolání amplifikace cílové nukleové kyseliny založené na PCR, pouze když cílová nukleová kyselina je přítomna v testovaném vzorku. V případě amplifikace cílové sekvence jsou oba primery připojeny na pevný povrch, což zaručuje, že amplifikované sekvence cílové nukleové kyseliny jsou také zachyceny na pevném podkladu. Amplifikační postup popsaný v tomto dokumentu se také někdy nazývá metoda „bridge amplification. V případě uvedené metody se specificky navrhnou dva primery, jako pro běžné PCR, přičemž primery lemují určitou cílovou sekvenci DNA, která se amplifikuje. Tak v případě, že určitá cílová nukleová kyselina je přítomna ve vzorku, pak se cílová nukleová kyselina může hybridizovat s primery postupu a amplifikovat se pomocí PCR. První krok při tomto amplifikace PCR je hybridizace cílové nukleové kyseliny s prvním specifickým primerem zachyceným na podpoře
První amplifikační produkt, který je komplementární s cílovou nukleovou kyselinou se Při vystavení cílová nukleová extenzí sekvence primeru 1.
denaturačním podmínkám se uvolní může se pak účastnit dalších hybridizačních pak tvoří podkladu kyselina a reakcí se sekvencemi primeru 1, které jsou zachyceny na podkladu. První amplifikační produkt, který je zachycen na podkladu se pak může hybridizovat s druhým specifickým primerem („primer 2) zachyceným na podkladu a druhý amplifikační produkt obsahující sekvenci nukleové kyseliny komplementární s prvním amplifikačním produktem se může tvořit extenzí sekvence primeru 2 a je také zachycený na podkladu. Tak cílová nukleová kyselina prvního a druhého amplifikovaného produktu je schopna se podílet na pluralitě hybridizačního procesu a procesu prodloužení, která je limitována pouze přítomností cílové nukleové kyseliny a počtem sekvencí primeru 1 a primeru 2 a výsledek je počet kopii cílové sekvence připojené na povrchu.
• ·
Protože při tomto procesu se tvoři amplifikační produkty pouze, když je přítomna cílová nukleové kyselina, podklad se monitoruje za účelem zjištění, zda je přítomen jeden nebo více amplifikačních produktů, což indikuje přítomnost nebo nepřítomnost specifické cílové sekvence.
Mozaiková metoda se může použít k dosažení množství multiplexování tak, že několik různých cílových sekvencí nukleové kyseliny se může amplifikovat současně sestavením různých sad pro první a druhý primer, které jsou specifické pro každou odlišnou sekvenci cílové nukleové kyseliny v různých oblastech pevného povrchu.
Nevýhodou mozaikového postupu je to, že jak sekvence prvního tak druhého primeru jsou specifické pro každou amplifikovanou cílovou nukleovou kyselinu. To je možné použití pouze při amplifikaci známé sekvence. Navíc množství materiálu je omezeno počtem různých sad specifických primerů a následně amplifikované molekuly cílové nukleové kyseliny, které se mohou sestavit do odlišných oblastí daného pevného podkladu a uspořádání nukleových kyselin do vzdálených oblastí je časové náročné. Mozaikový proces vyžaduje, aby se dva různé primery homologicky zachytily svými 5'konci k podkladu ve vzdálených oblastech, kde se tvoří amplifikovaný produkt. Toho se nedá dosáhnout současně dostupnou technologií výroby čipů DNA a je nutné použít některé způsoby dispenzace vzorků. Tak hustota, které lze dosáhnout tímto přístupem vykazuje některá omezení jako jiné klasické technologie uspořádání. Další omezení je rychlost monitorování jednotlivých vzdálených oblastí na podkladu za účelem zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti amplifikovaných cílových nukleových kyselin.
Uspořádání vzorků DNA se v klasickém případě provede na membránách (například nylonové nebo nitrocelulózové membrány). Použití vhodné robotiky (například Q-bot™, Genetix Ltd, Dorset • ···· · · ·· ·· • · · · · · · ···· · ···· ·
BH23 3TG UK) umožňuje získat hustotu až 10 vzorků/mm2. Při takových metodách se DNA kovalentně váže na membránu fyzikálněchemickým způsobem (například UV radiací) a je tak možné uspořádat velké molekuly DNA (například molekuly, které jsou tvořeny více jak 100 nukleotidy), stejně jako menší molekuly DNA, jako jsou oligonukleotidové primery.
Jsou známy také jiné postupy, které umožňují získat uspořádání s vyšší přístupy založené na s klíčkách, kde se hustotou oligonukleotidů. Například předem uspořádaných skleněných podložních uspořádání reaktivních použitím technologie „ink-jet (popisuje ploch získalo v publikaci se
Blanchard,
A.
P. and L. Hood,
Microbial and
Comparative
Genomics,
1:
225 (1996) nebo uspořádání reaktivních polyakrylových gelů (popisuje se v publikaci Yershov, G et al., Proceedengs of the National Academy of Science, USA, 93:
4913-4918 (1996)) umožňuje teoreticky uspořádat až 100 vzorků na jednom mm2.
Vyšší hustota vzorků je stále dosažitelná použitím čipů DNA (popisuje se v publikaci Fodor, S. P. A. et al., Science 251: 767 (1991)) . V současné době se v oboru molekulární biologie používají čipy s 625 oligonukleotidovými sondami na 1 mm2 (popisuje se v publikaci Lockhart, D. J. et al., Nátuře Biotechnology 14: 1675 (1996)). Udává se, že je možné dosáhnout hustoty sond až 250 000 vzorků na 1 cm2 (2 500/mm2) (popisuje se v publikaci Chee, M. et al., Science 274: 610 (1996) ) . Avšak na jediný čip je možné uspořádat až 132 000 různých nukleotidu, jehož plocha je přibližně 2,5 cm . Je důležité poznamenat, že tyto čipy se vyrábějí takovým způsobem, že 3 ΌΗ konec oligonukleotidů je zachycen na pevném povrchu. To znamená, že oligonukleotidy zachycené na čipech takovým způsobem se nemohou použít jako primery při amplifikaci PCR.
φ φ
Je důležité poznamenat, že v případě, kdy produkty PCR se mohou zachytit na zařízení, kde probíhá amplifikace, hustota výsledného uspořádání produktů PCR je omezena dostupným zařízením. Současně dostupné zařízení jsou pouze mikrotitrační destičky, které obsahují 96 prohlubní. Tyto destičky umožňují získat pouze přibližně 0,02 vzorků produktů PCR na 1 mm2 povrchu.
Například za použití komerčně dostupného systému Nucleolink™ (Nunc A/S, Roskilde, Dánsko) je možné dosáhnout současné amplifikace a uspořádání vzorků při hustotě 0,02 vzorků na 1 mm2 povrchu prohlubní, kde byly zachyceny oligonukleotidové primery. Technické problémy však způsobují, že není pravděpodobné, že tento přístup umožní podstatné zvýšení hustoty vzorků.
Z toho plyne, že- jestliže chceme zvýšit množství zpracovávaného materiálu, je nutné vytvořit několik metod amplifikace nukleové kyseliny, které umožňují současnou amplifikaci a uspořádání vzorků nukleové kyseliny při vyšší hustotě a dále umožňuje monitorování vzorků vyšší rychlostí, přičemž se upřednostňuje paralelní způsob.
Navíc je zřejmé, že existuje potřeba vytvořit novou metodu sekvenování, která umožní zpracovat a paralelně sekvenovat velké množství vzorků. To znamená, že je nutné vytvořit metody sekvenování, které umožňují podstatné multiplexování postupu. Podstatné multiplexování sekvenačního postupu povede na druhou stranu k vyššímu množství zpracovaných vzorků, než je možné dosáhnout metodami sekvenování, které jsou dobře známy v oboru. Takové nové metody budou dokonce více požadovány, jestliže umožní sekvenovat větší množství vzorků při rozumných nákladech a s menší vynaloženou prací než běžné způsoby sekvenování.
• ·
Podstata vynálezu
Vynález popisuje nové metody amplifikace nukleové kyseliny na pevné fázi, které umožní uspořádat a současně amplifikovat velké množství rozdílných sekvencí nukleových kyselin při velké hustotě. Vynález také popisuje metody, které umožní velkou rychlostí paralelně monitorovat velké množství odlišných amplifikovaných sekvencí nukleových kyselin. Vynález dále popisuje metody, kterými se mohou současně a v krátkém časovém úseku stanovit sekvence 'velkého počtu rozdílných nukleových kyselin. Metody jsou zvláště použitelné při sekvenování celého genomu nebo při situacích, kde se musí současně sekvenovat velké množství genů (například 500) z mnoha jednotlivců (například 500) nebo se musí současně vyhodnotit velké množství (například milión) polymorfizmů nebo se současně monitoruje exprese velkého množství genů (například 100 000).
Vynález popisuje způsob amplifikace alespoň jedné nukleové kyseliny, který zahrnuje následující kroky:
| vytvoření alespoň | jednoho templátu | nukleové | kyseliny | |
| obsahující amplif | ikovanou nukleovou kyselinu, kde | |||
| uvedená nukleové | kyselina | obsahuje na | 5'konci | |
| oligonukleotidovou | sekvenci | Y | a na | 3'konci |
| oligonukleotidovou | sekvenci | Z a | navíc | nukleové |
| kyselina nese n | a svém 5' | konci | prostředek pro |
zachycení nukleové kyseliny na pevném povrchu, (2) smíchání uvedeného templátu nukleové kyseliny s jedním nebo více primery X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na svém 5'konci prostředek pro zachycení na pevném povrchu tak, že 5'konec templátu nukleové kyseliny a primerů se váže na pevný podklad, (3) provedení jedné nebo více amplifikačních reakcí nukleové kyseliny vázané na templátu tak, že se tvoří kolonie nukleové kyseliny.
• ·
V dalším provedení vynálezu se ve druhém kroku metody dva různé primery kolonií X smíchají s templátem nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby sekvence primeru kolonií X byly takové, že oligonukleotidová sekvence Z může hybridizovat s jedním koloniovým primerem X a oligonukleotidová sekvence Y je stejná jako sekvence koloniových primerů X.
V jiném provedení vynálezu oligonukleotidová sekvence Z je komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y, přičemž se označuje jako Y'a koloniový primer X je stejná sekvence jako oligonukleotidová sekvence Y.
V dalším provedení vynálezu koloniový primer X může obsahovat degenerovanou průměrovou sekvenci a templát nukleové kyseliny, který obsahuje nukleovou kyselinu, jenž se amplifikuje a neobsahuje oligonukleotidovou sekvenci 5' a 3' konce.
V jiném provedení vynálezu metoda zahrnuje další který umožňuje alespoň jeden krok stanovení sekvence krok, j edné nebo více kolonií nukleotidové kyseliny vytvořené v kroku
3.
Vynález dále popisuj e způsob sekvenování alespoň j edné nukleové kyseliny obsahuj icl následující kroky:
(1) vytvoření alespoň jednoho templátu nukleové kyseliny obsahuj icí uvedená nukleová sekvenovanou nukleovou kyselinu, kde obsahuje na kyselina
5'konci oligonukleotidovou sekvenci a na
3'konci oligonukleotidovou sekvenci navíc nukleová kyselina nese na svém 5konci prostředek pro zachycení smíchání nukleové kyseliny na pevném povrchu, uvedeného templátu nukleové kyseliny s jedním nebo více koloniovými primery X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na svém 5konci prostředek pro zachycení na pevném *
templářů nukleové kyseliny a povrchu tak, že 5'konec primerů se váže na (3) provedení jedné nukleové kyseliny pevný nebo na tvoří kolonie nukleové podklad, více amplifikačnich reakcí vázaném templátu tak, že se kyseliny, (4) provedení alespoň jednoho kroku alespoň jedné z vytvořených stanovení sekvence kolonií nukleové kyseliny.
V dalším provedení vynálezu 5' konce templátu nukleové kyseliny a koloniové primery nesou prostředek pro zachycení sekvencí nukleové kyseliny kovalentní vazbou na pevném povrchu.
zachycení skupina,
Upřednostňuje se, aby tento prostředek vhodný pro kovalentní vazbou byla chemicky upravitelná funkční karboxylová skupina jako je například fosfátová skupina, nebo aldehydová skupina, thiol, hydroxyl dimethoxyltrityl (DMT) nebo aminoskupina, přičemž se upřednostňuje aminoskupina.
Nukleové skupiny, které se mohou amplifikovat podle vynálezu zahrnují způsobů podle cDNA, rekombinantní DNA modifikované DNA,
RNA,
DNA, například genomovou DNA, nebo libovolnou formu syntetické nebo libovolnou formu syntetické mRNA nebo nebo modifikované
RNA.
Uvedené lišit v délce a mohou to být nukleové kyseliny se fragmenty nebo menší mohou části větších molekul nukleové kyselina, párů baží a více
Nukleové kyselina, nebo neznámé kyseliny. Upřednostňuje se, bude amplifikovat, měla alespoň 50 se upřednostňuje 150 až 4 000 párů amplifikovat může mít být v jednořetězcové nukleové která se která se bude sekvence a může aby baží.
známé nebo dvouřetězcové formě. Nukleová bude amplifikovat se může získat z libovolného zdroje.
Termín „templář nukleové kyseliny zahrnuje entitu, která obsahuje nukleovou kyselinu, jenž se amplifikuje nebo ♦ · · ···· ·· sekvenuje v jednořetězcové formě. Jak se uvádí dále v textu nukleová kyselina, která se amplifikuje a sekvenuje, se může také vyskytovat ve dvouřetězcové formě. Termín „templát nukleové kyseliny podle vynálezu může zahrnovat jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou nukleovou kyselinu.
Templáty nukleové kyseliny se mohou použít při metodě podle vynálezu a mohou se vyskytovat v různých délkách. Upřednostňuje se, aby templáty obsahovaly alespoň 50 párů baží a více se upřednostňuje 150 až 4 000 párů baží. Nukleotidy, kyseliny mohou být se které tvoří templát nukleové vyskytující nebo nepřirozeně Templáty nukleové kyseliny podle nukleovou kyselinu, ale mohou 3'konci krátké oligonukleotidové sekvence obsažená na 5'konci Oligonukleotidová sekvence Y je vyskytovat ve variabilní délce.
přirozeně se vyskytující nukleotidy.
vynálezu obsahují ne pouze také dále obsahovat na 5'a sekvence. Oligonukleotidová se nazývá sekvencí Y.
známou sekvencí a může se Oligonukleotidová sekvence Y vhodná pro použití podle vynálezu obsahuje přednostně alespoň pět nukleotidů, přičemž se upřednostňuje 5 až 100 nukleotidů a více se upřednostňuje přibližně 20 nukleotidů. Přirozeně a nepřirozeně se vyskytující nukleotidy mohou být přítomny v nukleotidové sekvenci Y. Jak se uvádí shora v textu, upřednostňuje se, aby sekvence oligonukleotidu Y byla stejná jako sekvence koloniového primeru X. Oligonukletidová sekvence obsažená na 3'konci templátu nukleové kyseliny podle vynálezu se zde označuje jako Z. Oligonukleotidová sekvence Z je známou sekvencí a může mít variabilní délku. Oligonukleotidová sekvence Z vhodná pro použití v metodách podle vynálezu obsahuje přednostně alespoň pět nukleotidů, přičemž se upřednostňuje 5 a 100 nukleotidů a více se upřednostňuje přibližně 20 nukleotidů. Přirozeně nebo nepřirozeně se vyskytující nukleotidy se mohou vyskytovat v oligonukleotidové sekvenci Z. Oligonukleotidová sekvence Z se navrhla tak, že hybridizuje s jedním koloniovým primerem X a upřednostňuje se, ···· ·· · · < · * · • · · · ···· • · · · · • · · · · · · • · · aby se navrhla tak, že je komplementární s oligonukleotidovou sekvenci
Y, která se nazývá sekvenci Y' .
Oligonukleotidové sekvence a Z obsažené na
5'a 3'konci templátu nukleové kyseliny se nemusí nacházet na extrémních koncích templátu.
Ačkoli nukleotidové sekvence
Y a Z se přednostně nacházej i blízko 5' a 3' konců templátu respektive templátu nukleových kyselin (například s 0 až
100 nukleotidy
5' a 3'
Oligonukleotidové sekvence
Y a Z se mohou proto nacházet v libovolné poloze templátu nukleové kyseliny, která zahrnuj e sekvence Y a Z, a vyskytuj i se na obou stranách. To znamená, že lemují sekvenci nukleové kyseliny, která se amplifikuj e.
Termín „templát nukleové kyseliny také zahrnuje entitu, která obsahuje nukleovou kyselinu, která se amplifikuje nebo sekvenuje ve dvouřetězcové formě. V případě, že templát nukleové kyseliny se vyskytuje ve dvouřetězcové formě, oligonukleotidové sekvence Y a Z jsou obsaženy na 5' a
3'koncích j ednoho z řetězců. Druhý řetězec, což je způsobeno pravidly párování
DNA, je komplementární se řetězcem, který obsahuj e oligonukleotidové sekvence Y a Z a tak obsahuje oligonukleotidovou sekvenci
Z'na 5'konci a oligonukleotidovou sekvenci Y'na 3'konci.
Termín „koloniový primer znamená entitu, která obsahuje oligonukleotidovou sekvenci, která je schopná hybridizovat s komplementární sekvencí iniciovat specifickou polymerázouvou reakci. Sekvence obsahující koloniový primer se vybrala tak, že vykazuje maximální hybridizační aktivitu se svou komplementární sekvenci a velmi nízkou nespecifickou hybridizační aktivitu s kterou je možné použít libovolnou jinou sekvencí. Sekvence, jako koloniový primer může zahrnovat libovolnou sekvenci, ale přednostně zahrnuj e
AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG nebo 5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC.
Koloniový primer může obsahovat 5 až 100 baží, ale upřednostňuje se 15 až baží. Primer může zahrnovat • · · · ·· ·· « · « · přirozeně i nepřirozeně se vyskytující nukleotidy. Jeden nebo dva různé koloniové primery se mohou použít při vytvoření kolonií nukleových kyselin za použití metod podle vynálezu. Koloniové primery vhodné pro použití v přítomnosti vynálezu mohou také zahrnovat degenerované primerové sekvence.
Termín „degenerované primerové sekvence zahrnuje krátkou oligonukleotidovou sekvenci, která je schopna hybridizovat s libovolným fragmentem nukleové kyseliny nezávislé na sekvenci uvedeného fragmentu nukleové kyseliny. Takové degenerované primery nevyžadují přítomnost oligonukleotidové sekvence Y nebo Z v templátu nukleotidové sekvence, aby došlo k hybridizaci, ačkoli použití degenerovaných primerů při hybridizaci s templářem obsahujícím oligonukleotidové sekvence X nebo Y není vyloučeno. Při použití při amplifikaci podle vynálezu, degenerativní primery musí hybridizovat se sekvencemi nukleové kyseliny v templátu v místech, které jsou vedle nebo lemují sekvenci nukleové kyseliny, která se amplifikuj e.
Termín „pevný podklad znamená libovolný pevný podklad, na který se může kovalentně zachytit nukleová kyselina, jako jsou například latexové částice, dextranové částice, polystyren, polypropylenový povrch, polyakrylamidový gel, povrch tvořený zlatém, skleněný povrch a silikonové plátky. Upřednostňuje se, aby pevným povrchem byl skleněný povrch.
Termín „prostředky vhodné pro zachycení nukleových kyselin na pevný podklad zahrnuje chemické a nechemické zachycení zahrnující chemicky modifikovatelné funkční skupiny. Termín „zachycení znamená imobilizaci nukleové kyseliny na pevných površích buď kovalentním zachycením nebo prostřednictvím nevratné pasivní adsorpce nebo prostřednictvím afinity mezi molekulami, imobilizaci na povrchu potaženém avidinem. Zachycení musí být dostatečně silné, aby se molekuly nedaly • · · · · · ·· ·· · * ··♦ ···· ··· · ···· · · « ··· · · · · · · · • · · · · · · · ··· ·· · · ·· ··· odstranit vymytím vodou nebo vodným pufrem za podmínek denaturujících DNA.
Termín „chemicky upravitelné funkční skupiny zahrnuje skupinu, jako je třeba fosfátová skupina, karboxylové nebo aldehydová část, thiol nebo aminoskupina.
Termín „kolonie nukleové kyseliny znamená diskrétní oblast obsahující více kopií řetězce nukleové kyseliny. Ve stejné kolonii může být přítomno více kopií řetězce komplementárního s řetězcem nukleové kyseliny. Velké množství kopií řetězců nukleové kyseliny, které tvoří kolonie jsou v obecném případě imobilizovány na pevném povrchu a mohou být v jednořetězcové nebo ve dvouřetězcové formě. Kolonie nukleových kyselin podle vynálezu se mohou vytvořit v různých velikostech a hustotách v závislosti na použitých podmínkách. Upřednostňovaná velikost kolonií je od 0,2 μπι do β μπι, více se upřednostňuje od 0,3 pm do 4 pm. Hustota kolonií nukleové kyseliny vhodné pro použití při metodě podle vynálezu je v typickém případě 10 000/mm2 až 100 000/mm2. Věří se, že je možné dosáhnout vyšší hustoty a to 100 000/mm2 až 1 000 000/mm2 a 1 000 000/mm2 až 10 000 000/mm2.
Metody podle vynálezu se mohou použít k vytvoření kolonií nukleové kyseliny. Vynález tak poskytuje jednu nebo více kolonií nukleotidové kyseliny. Kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou vytvořit z jediného imobilizovaného templátu nukleové kyseliny podle vynálezu. Metoda podle vynálezu umožňuje současnou produkci řady takových kolonií nukleových kyselin, kdy každá může obsahovat odlišné imobilizované řetězce nukleové kyseliny.
Vynález dále popisuje velké množství templátů nukleové kyseliny, které obsahují nukleové kyseliny, které se budou amplifikovat, kde uvedené nukleové kyseliny obsahují na svém •··· ·· ·· * · · · • · · · ····
5'konci oligonukleotidovou oligonukleotidovou sekvenci nesou na svém 5'konci pr
| 16 | • ··· · · ··· · · • ·······» | |
| • · · · · | ||
| sekvenci | Y a na | 3' konci |
| Z a navíc | nukleotidové | kyseliny |
| středek pro zachycení | nukleové |
kyseliny na pevný povrch. Upřednostňuje se, když se velké množství templátů nukleových kyselin smíchá s velkým množstvím koloniových primerů X, které se mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na 5'konci prostředek pro zachycení koloniových primerů na pevném povrchu. Upřednostňuje se, aby se velké množství templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů kovalentně vázalo na pevný povrch.
V dalším provedení podle vynálezu se velké množství dvou různých koloniových primerů X smíchalo s velkým množstvím templátů nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby sekvence koloniových primerů X byla taková, že oligonukleotidová sekvence Z se může hybridizovat s jedním koloniovým primerem X a oligonukleotidová sekvence Y je stejná jako sekvence jednoho koloniového primeru X.
V jiném provedení podle vynálezu je oligonukleotidová sekvence Z komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y, (Y') a velké množství koloniových primerů X je stejnou sekvencí jako oligonukleotidová sekvence Y.
Další provedení vynálezu se popisuje velké množství koloniových primerů X obsahujících degenerované primerové sekvence a velké množství templátů nukleové kyseliny obsahujících nukleové kyseliny, které se amplifikují, a tyto templáty neobsahují oligonukleotidovou sekvenci Y nebo Z na 5 ' a 3'konci.
Templáty nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou připravit za použití metod, které jsou standardní nebo běžné v oboru. V obecném případě se tyto metody zakládají na metodách genetického inženýrství.
• · · ·
• · • · • · · ·
Nukleové kyseliny, které se budou amplifikovat, se mohou zdokumentovány v oboru. Například získáním vzorku získat za použití metod, které jsou dobře známy a jsou dobře nukleové kyseliny, jako je celková
DNA, genomová DNA, cDNA, celková
RNA, mRNA atd., metodou, která je dobře známa a dobře zdokumentována v oboru a vytvořením nukleových kyselin například omezeným fragmentů z uvedených štěpením restrikčními enzymy nebo mechanickými způsoby.
V typickém případě se nukleová kyselina, která se má amplifikovat, získala jako dvouřetězcová forma. V případě, že se nukleová kyselina vyskytuje v jednořetězcové formě, se například mRNA nejdříve připraví jako dvouřetězcová forma způsobem, který je dobře znám v oboru, například za použiti oligo-dT primerů a reverzní transkriptázy a DNA polymerázy. Po té, co se získá amplifikovaná nukleová kyselina v dvouřetězcová formě s vhodnou délkou, spojí se svými konci oligonukleotidové sekvence Y a Z. To znamená, že se spojí s oběma konci sekvence nukleové kyseliny a vytvoří se tak templát. To je možné provést za použití metod, které jsou dobře známy v oboru, jako je například ligace nebo začlenění nukleové kyseliny, která se bude amplifikovat, do biologického vektoru do místa, které je lemováno vhodnou oligonukleotidovou sekvencí. V jiném případě, když je alespoň část sekvence nukleové kyseliny, která se ampíifikuje, je známa, může se pomocí PCR vytvořit templát nukleové kyseliny obsahující oligonukleotidové sekvence Y a Z na 5' a 3' konci. Při PCR se používají vhodné primery PCR, které zahrnují sekvence specifické pro amplifikovanou nukleovou kyselinu. Před zachycením templátu nukleové kyseliny na pevný povrch, se může připravit jednořetězcová forma za použití metod, které jsou dobře známy v oboru, například zahřáním na teplotu 94 °C a rychlým ochlazením na teplotu 0°C na ledu.
• « • · · ·
Oligonukleotidová sekvence obsažená na 5konci nukleové kyseliny může být libovolnou sekvencí libovolné délky a je zde označena jako sekvence Y. Vhodné délky a sekvence oligonukleotidů se vybraly za použití dobře známých metod. Například oligonukleotidové sekvence zachycené každým koncem nukleové kyseliny, která se bude amplifikovat, jsou v normálním případě relativně krátké nukleotidové sekvence obsahující 5 až 100 nukleotidů. Oligonukleotidová sekvence obsažená na 3'konci nukleové kyseliny může být libovolnou sekvencí libovolné délky a je zde označena jako sekvence Z.
Vhodné délky a sekvence použití metod dobře oligonukleotidu se známých v mohou vybrat za oboru.
Oligonukleotidové sekvence obsahovaly na každém konci nukleové kyseliny, která případě jde o relativně krátké nukleotidové sekvence obsahující 5 až 100 nukleotidů.
se mají amplifikovat, v normálním
Tyto sekvence mohou hybridizovat s jedním z koloniových primerů X. Upřednostňuje se, aby sekvence oligonukleotidové sekvence Y byla stejná jako jeden z koloniových primerů X. Více se upřednostňuje, aby oligonukleotidová sekvence Z byla komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y(Y) a koloniové primery X vykazují stejnou sekvenci jako oligonukleotidová sekvence Y.
Oligonukleotidové sekvence Y a Z podle vynálezu se mohou připravit za použití metod, které jsou standardní nebo běžné v oboru nebo se mohou získat z běžných zdrojů.
V případě produkce templátů nukleové kyseliny podle vynálezu se může zavést další požadovaná nukleová kyselina pomocí metody, která je dobře známa v oboru. Takové další sekvence zahrnují například místa, která rozeznávají restrikční enzymy nebo jisté značky nukleových kyselin, které umožňují amplifikaci produktů dané sekvence templátů nukleové kyseliny. Jiné požadované sekvence zahrnují sekvence zpětně balené DNA, která tvoří smyčku nebo jinou sekundární strukturu, když se vyskytuje v jednořetězcové formě, „řídící sekvence DNA, které řídí interakce protein/DNA, jako je například sekvence promotorové DNA, kterou rozeznává polymeráza nukleové kyseliny nebo sekvenci operátoru, kterou rozeznává protein vázající DNA.
Jestliže existuje velké množství sekvencí nukleové kyseliny, která se amplifikuje, a pak zachycení oligonukleotidů Y a Z může proběhnout ve stejné nebo odlišné reakci.
Když se připraví templát nukleové kyseliny, může se amplifikovat, před tím než se použije v metodách podle vynálezu. Taková amplifikace může proběhnout za použití metod, které jsou dobře známy v oboru, například začleněním templářové nukleové kyseliny do expresívního vektoru a amplifikaci ve vhodném biologickém hostiteli nebo amplifikaci pomocí PCR. Tento amplifikační krok není však podstatný, protože metoda podle vynálezu umožňuje, aby se v kolonii nukleové kyseliny produkovalo velké množství kopií templátu nukleové kyseliny vytvořené z jedné kopie templátu nukleové kyseliny.
Upřednostňuje se, aby 5'konec templátu nukleové kyseliny, jak se popisuje shora v textu, se upravil tak, aby nesl prostředek pro kovalentní zachycení templářů nukleové kyseliny na pevný povrch. Takové prostředky mohou chemicky fosfátová upravitelná funkční skupina, jako karboxylová nebo aldehydová skupina, být například je například thiol skupina, nebo aminoskupina.
Nejvíce se upřednostňuje, když se k úpravě
5'konce nukleové kyseliny použij e fosfát nebo aminoskupina.
Koloniové primery podle vynálezu se mohou použití metod, které jsou v oboru standardní připravit za nebo běžné.
V obecném případě koloniové primery podle vynálezu budou • · syntetické oligonukleotidy vytvořené způsoby, které jsou dobře známy v oboru nebo se mohou získat z běžných zdrojů.
Při amplifikaci libovolné sekvence nukleové kyseliny se mohou použít jeden nebo více odlišných koloniových primerů. Tím se tato metoda liší a je výhodnější ve srovnání s řadou jiných amplifikačních metod známých v oboru, které se například popisují v dokumentu WO 96/04404, kde se různé specifické primery musí navrhnout pro každou určitou sekvenci nukleové kyseliny, která se bude amplifikovat.
Upřednostňuje se, aby se 5'konce koloniových primerů podle vynálezu upravily tak, aby nesly prostředek pro jejich kovalentní zachycení na pevném povrchu. Upřednostňuje se, aby tento prostředek pro kovalentní zachycení byla chemicky upravitelná funkční skupina, jak se popisuje shora v textu. Je-li to nutné koloniové primery se mohou navrhnout tak, aby zahrnovaly další požadované sekvence taková, jako jsou místa rozeznávaná restrikční endonukleázou nebo jiné typy míst štěpení, jako je například štěpitelná místa na rybozómu. Jiné požadované sekvence zahrnují sekvence zpětně balené DNA (která tvoři smyčky nebo jiné sekundární struktury, když se vyskytuje v jednořetězcové formě), „řídící sekvence DNA, které řídí interakce protein/DNA, jako je například sekvence promotorové DNA, kterou rozeznává polymeráza nukleové kyseliny nebo sekvenci operátoru, kterou rozeznává protein vázající DNA.
Imobilizace koloniového primerů X na podklad pomocí 5'konce vede k odstranění 3'konce z podkladu tak, že koloniový primer je dostupný pro extenzi polymerázou, pak probíhá hybridizace komplementární oligonukleotidové sekvence obsažené na 3'konci templátu nukleové kyseliny.
Po té, co se syntetizují templáty nukleové kyseliny a koloniové primery podle vynálezu, smíchají se ve vhodném poměru tak, že když jsou zachyceny na pevném povrchu získá se • · • · • · • · · · * · • · · · • · · vhodná hustota zachycených templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů. Upřednostňuje se, aby část koloniových primerů ve směsi byla vyšší než část templátů nukleové aby poměr množství koloniových kyseliny byl takový, že nukleové kyseliny se se vrstva koloniových které kyseliny. Upřednostňuje se, primerů k množství templátů když koloniové primery a imobilizují na primerů obsahující velké se nacházejí v přibližně nukleové templáty pevném povrchu tvoři množství koloniových primerů, celé v jednotné hustotě po nebo podpory, přičemž jeden definované ploše pevné templátů nukleové kyseliny se imobilizuje v intervalech ve vrstvě koloniových primerů.
nebo více j ednotlivě
Templáty nukleové kyseliny se mohou v jednořetězcové formě.· Mohou se také vyskytovat vyskytovat úplně nebo částečně ve dvouřetězcové formě, buď upravenými 5'konci tak, jak to umožňuje V tomto případě po ukončení procesu separovat řetězce způsoby zahřáním na teplotu 94 °C a s jedním nebo s oběma zachycení na povrchu.
zachyceni dobře známými v oboru, je možné například pak se řetězce odstraní
Je vhodné, aby v případě, že oba promytím.
řetězce dvouřetězcových molekul reagovaly s výsledek bude stejný se zachytil a provedl zachyceny na povrchu, kdy pouze jeden řetězec se jeden amplifikační krok. Jinými slovy zachytily oba řetězce dvouřetězcového povrchem a j sou jako v případě, v případě, že se templátů nukleové kyseliny a oba řetězce se zachytily vzájemně blízko sebe a je tuto situaci možné rozlišit od výsledku, kdy dojde k zachycení pouze jednoho řetězce a uskutečnění amplifikace. Tak je možné použít jednořetězcové i dvouřetězcové templáty nukleových kyselin za účelem získat templát nukleových kyselin zachycený na povrchu a vhodný pro vytvoření kolonii.
Vzdálenost mezi jednotlivými koloniovými primery a jednotlivými templáty nukleové kyseliny (a vzhledem k hustotě
koloniových primerů a templářů nukleových kyselin) je možné řídit změnou koncentrace koloniových primerů a templářů nukleové kyseliny, které se imobilizují na povrchu. Preferovaná hustota koloniových primerů je alespoň 1 fmol/mm2, upřednostňuje se alespoň 10 fmol/mm2, více se upřednostňuje 30 až 60 fmol/mm2. Hustota templářů nukleové kyseliny pro použití v metodě podle vynálezu je v typickém případě 10 000/mm2 až 100 000/mm2. Věří se, že je možné dosáhnout vyšší hustoty například 100 000/mm2 až 1 000 000/mm2 a 1 000 000/mm2 až 10 000 000/mm2 .
Naopak řízení hustoty zachycených templářů nukleové kyseliny a koloniových primerů umožňuje řídit konečný vznik kolonií nukleové kyseliny na povrchu podpory. To je způsobeno skutečnosti, že jedna kolonie nukleové kyseliny může vzniknout následkem zachycení jednoho templářů nukleové kyseliny, což zaručuje, že koloniové primery podle vynálezu jsou přítomny ve vhodné poloze na pevném povrchu (popisuje se dále v textu). Hustota molekul nukleové kyseliny v jedné kolonii se může také řídit řízením hustoty zachycených koloniových primerů.
Po té, co se koloniové primery a templáty nukleové kyseliny podle vynálezu imobilizují na pevném povrchu ve vhodné hustotě, mohou se pak vytvořit kolonie nukleové kyseliny tím, že se provede vhodný počet cyklů amplifikace na kovalentně vázaném templářů nukleové kyseliny tak, že každá kolonie obsahuje více kopií původního imobilizovaného templářů nukleové kyseliny a její komplementární sekvenci. Jeden cyklus amplifikace zahrnuje kroky hybridizace, extenze a denaturace a ' -i tyto kroky se v obecném případě uskutečňují za použití činidel nebo podmínek dobře známých v oboru vhodných pro PCR.
Typická amplifikační reakce zahrnuje vystavení pevného povrchu a zachyceného templářů nukleové kyseliny a koloniových primerů podmínkám, které vyvolávají hybridizaci primerů. Například působeni teploty okolo 65 °C. Za uvedených podmínek ···· ·· ·· ·· · • ··· · · · · •·· · ···· · · · ··· · · ··· · · • · · · · · · · ··· ·· ·· ·· · · * oligonukleotidová sekvence Z na 3'konci templátu nukleové kyseliny hybridizuje s imobilizovaným koloniovým primerem X a v přítomnosti podmínek a činidel, které podporují extenzi primeru, což je například teplota okolo 72 °C, přítomnost polymerázy nukleové kyseliny, například DNA polymerázy závislé na DNA nebo molekuly reverzní transkriptázy (to je DNA polymeráza závislá na RNA) nebo RNA polymerázy plus přítomnosti molekul nukleozidtrifosf átů nebo libovolných jiných nukleotidových prekurzorů, například upravených molekul nukleozidtrifosfátu, se prodlouží koloniový primer adicí nukleotidů komplementárních se sekvencí templátové nukleové kyseliny.
Příklady polymeráz nukleové kyseliny, které se mohou použít podle vynálezu, jsou DNA polymeráza (Klenow fragment, T4 DNA polymeráza), tepelně stabilní DNA polymeráza pocházející z různých termostabilních bakterií (jako jsou DNA polymerázy Taq, VENT, Pfu, Tfll), stejně jako jejich geneticky upravené deriváty (TaqGold, VENTexo, Pfu exo) . Může se také použít kombinace RNA polymerázy a reverzní transkriptázy, přičemž vzniká amplifikace kolonie DNA. Upřednostňuje se, aby polymeráza nukleové kyseliny užívaná pro extenzi koloniových primerů byla stabilní za podmínek vhodných pro reakci PCR, to znamená při opakovaných cyklech zahřívaní a chlazení při používané denaturační teplotě, jejíž hodnota je přibližně 94 °C. Upřednostňuje se, aby používaná
DNA polymeráza byla Taq
DNA polymeráza.
Upřednostňuj e se, aby používané molekuly nukleozidtrifosfátu byly deoxyribonukleotidt rif osf áty, jako jsou například dATP, dTTP, dCTP, dGTP, nebo ribonuklezidtrifosfáty, jako jsou například dATP, dUTP, dCTP, dGTP. Molekuly nukleozidtrifosfátu se mohou vyskytovat přirozeně nebo se mohou syntetizovat.
• · • · • · · • * · · ·
Po krocích hybridizace a extenze se podpora a zachycená nukleová kyselina vystaví působení denaturačních podmínek v přítomnosti dvou imobilizovaných nukleových kyselin. První kyselinou je počáteční imobilizovaný templář nukleovou nukleové kyseliny a druhou je nukleová kyselina, která je k němu komplementární.
Extenze j ednoho imobilizovaného koloniového primeru probíhá od
X. Původní imobilizovaný imobilizovaný vytvořený templář nukleové kyseliny a prodloužený koloniový primer jsou pak schopny iniciovat další kola amplifikace, přičemž se podklad vystaví dalším cyklům hybridizace, extenze a denaturace. Výsledkem takových dalších kol amplifikace povede ke vzniku kolonie nukleové kyseliny obsahující velké množství imobilizovaných kopií templářové nukleové kyseliny a její komplementární sekvence.
Počáteční znamená, že imobilizace templátové nukleové kyseliny templátová nukleová kyselina může pouze hybridizovat s koloniovými primery lokalizovanými ve vzdálenosti rovnající se celkové délce templářové nukleové kyseliny. Pak hranice kolonie vytvořené omezena na relativně malou oblast, ve nukleové kyseliny je které se imobilizuje počáteční templátová kola amplifikace,
Když probíhají další to znamená hybridizace, extenze a nukleová kyselina.
denaturace, vzniká jednou tolik kopií templátové molekuly a komplement. Pak vytvořená hranice kolonie kyseliny se bude schopna dále prodlužovat, ačkoli tato hranice je stále omezena na relativně lokální oblast, ve které se imobilizoval počáteční templář nukleové kyseliny.
Schéma metody vytvoření kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu je zobrazeno na obrázku č. 1. Obrázek č. 1(a) zobrazue koloniový primer X podle vynálezu (ukazuje se, že má sekvenci ATT) a templát nukleové kyseliny podle vynálezu, který obsahuje na 5'konci oligonukleotidovou sekvenci Y, zde je zobrazena jako ATT a 3'konci oligonukleotidovou sekvenci Z, ··«· ·« ·« * · · · zde zobrazenou jako
AAt, koloniového primeru
X.
která hybridizuje jako sekvence
Při schematické reprezentaci se koloniový primer X oligonukleotidové sekvence Y
Z zobrazují tak, že obsahují pouze tři nukleotidy. V praxi je však vhodné, aby se použila delší sekvence. 5'konce obou koloniových primerů a pro zachycení templátu nukleové prostředek kyseliny nesou pevném povrchu.
To je na obrázku č. 1 prostředek zachycení nukleové kyseliny na plné kovalentnímu zobrazeno může vést nekovalentnímu zachycení.
Pro jednoduchost je na obrázku j ako ke čtverce.
Tento nebo zobrazen pouze j eden koloniový primer X a
V praxi velké množství jedna templátová nukleová kyselina.
koloniových primerů X bude s velkým množstvím templátů nukleové kyseliny. Velké primerů X může obsahovat dva odlišné koloniových primery X.
přítomno množství koloniové
Pro jednoduchost však schématická reprezentace obrázku č. 1 pouze jeden typ koloniového primeru sekvencí ATT. Velké množství templátů nukleové kyseliny zobrazuje na
X se může obsahovat různé sekvence nukleové kyseliny v centrální části mezi oligonukleotidy Y a
Z, oligonukleotidové sekvence Y a Z na znázorněn
č. 1 je pro jednoduchost nukleové kyseliny, kde 'a ale obsahuje stejné
3'koncích. Na obrázku pouze jeden druh část sekvence v centrální templátu části je zobrazena jako CGG.
V přítomnosti pevné nukleové kyseliny podpory 5' koloniového primeru konce obou se vážou na templátů
To je znázorněno na obrázku č. 1 (b) .
Podklad podklad.
zachycený templát nukleové kyseliny a koloniové primery se pak vystaví působení obrázku podmínek, které vyvolávají č. l(c) je zobrazen templát hybridizaci nukleové hybridizuje s koloniovým primerem.
Taková primeru. Na kyseliny, který hybridizace je umožněna skutečností, že oligonukleotidová sekvence Z na
3'konci templátu nukleové kyseliny může hybridizovat
s koloniovým primerem.
Při schématické reprezentaci oligonukleotidové sekvence Z se ukázalo, že je komplementární s koloniovým primerem, ačkoli v praxi skutečná komplementární sekvence není podstatná. Hybridizace se může objevit za podmínek, kterým jsou vystaveny templáty nukleové kyseliny a koloniové primery.
Na obrázku č. 1 (d) je zobrazeno stádium extenze primerů. Za vhodných teplotních podmínek a v přítomnosti DNA polymerázy a doplnění nukleotidových prekurzorů, jako je například dATP, dTTP, dCTP a dGTP, DNA polymeráza prodloužila koloniový primer na jeho 3'konci za použití templátu nukleové kyseliny. V případě, že prodloužení primerů je úplné, zobrazeno na obrázku č. l(e), je pak možné vidět, že se vytvořil druhý mobilizovaný řetězec nukleové kyseliny, který je komplementární s počátečním templátem nukleové kyseliny. Při oddělení dvou řetězců nukleové kyseliny, například zahřáním, budou přítomny dvě imobilizované nukleové kyseliny. První je počáteční imobilizovaný templát nukleové kyseliny a druhou je jeho komplementární nukleová kyselina, která se prodloužila z jednoho imobilizovaného koloniového primerů X, jak je možné vidět na obrázku č. l(f).
Původní imobilizovaný templát nukleové kyseliny a imobilizovaný prodloužený vytvořený koloniový primer je pak schopen hybridizovat s jinými přítomnými koloniovými primery (které jsou označeny jako koloniové primery 2 a 3 na obrázku č. l(g)) a po dalším kole prodloužení primerů (obrázek č. 1 (h) ) a po separaci řetězce (obrázek 1 (i)) vznikají čtyři jednoduché imobilizované řetězce. Dva z nich obsahují sekvence, které odpovídají templátu počáteční nukleové kyseliny, a dva obsahuji řetězce s nimi komplementární.
Další cykly amplifikace jsou zobrazeny na obrázku č. 1 a po provedení vzniká kolonie nukleové kyseliny obsahující velké • · množství zmobilizovaných kopií templátové nukleové kyseliny a její komplementární sekvence.
Je tak možné vidět, že metoda podle vynálezu umožňuje vytvoření kolonie nukleové kyseliny z jednoho templátu imobilizované nukleové kyseliny a že velikost těchto kolonií se může řídit změnou počtu cyklů amplifikace, které je templát nukleové kyseliny vystaven. Tak počet nukleových kyselin vytvořených na povrchu pevného podkladu závisí na počtu templátů nukleové kyseliny, která se na začátku imobilizuje na podkladu, přičemž vzniká dostatečný počet imobilizovaných koloniových primerů v lokalitě každého zmobilizovaného templátu nukleové kyseliny. Z tohoto důvodu se upřednostňuje, aby pevný povrch, na který se koloniové primery a templáty nukleové kyseliny zmobilizují, obsahoval vrstvu imobilizovaných koloniových primerů při vhodné hustotě s templáty nukleové kyseliny imobilizované v intervalech s vrstvou primerů.
Tak zvané autopaternování kolonií nukleové kyseliny je výhodné ve srovnání s řadou metod, které jsou známy v oboru. Je možné získat vyšší hustotu kolonií nukleových kyselin, což je způsobeno skutečností, že hustotu je možné řídit regulací hustoty, při které se templáty nukleové kyseliny původně zmobilizují. Taková metoda není pak omezena například tím, že vykazuje specifické uspořádání primerů na určité lokální ploše podkladu a pak iniciuje tvorbu kolonií nanesením určitého vzorku, který obsahuje templát nukleové kyseliny na stejné ploše primeru. Počet kolonií, které se mohou uspořádat za použití metod dobře známých v oboru, (popisuje se například v publikaci WO 96/04404, Mosaic Technologies, lne.) je pak omezen hustotou/mezerami, při kterých se plochy specifických primerů mohou uspořádat v počátečním kroku.
• · ♦ · * ·· · · · · ··* · * ··· « · • ·♦·· ·· » ··· ·· ·· · · ··«
Tím, že je možné řídit počáteční hustotu templátu nukleové kyseliny a proto také je možné řídit hustotu kolonií nukleové kyseliny vytvořené z templátu nukleové kyseliny, je možné také řídit velikost vytvořených kolonií nukleové kyseliny a navíc hustotu templátu nukleové kyseliny v jednotlivých koloniích, přičemž optimální situace je možné dosáhnout na pevném podkladu dostatečně velké velikosti, který obsahuje velký počet amplifikovaných sekvencí, což umožňuje následnou analýzu nebo monitorování kolonií nukleové kyseliny.
Když se vytvoří provést další krok, kolonie nukleových kyselin, může být nutné jako je například vizualizace kolonií nebo stanovení sekvence kolonií může být (popisuje se dále v textu) . například nutná, jestliže
Vizualizace je nezbytné testovat kolonie vytvořené v přítomnosti nebo v nepřítomnosti například celé nebo části určitého fragmentu nukleové kyseliny. V tomto případě kolonie, které obsahují určitý fragment nukleové kyseliny by se mohl detekovat navržením sondy nukleové kyseliny, která se specificky hybridizuje s fragmentem nukleové kyseliny.
Taková sonda nukleové kyseliny se přednostně značí detekovatelnou entitou, jako je fluorescenční skupina, entita obsahující biotin (která se může například detekovat inkubací streptavidinem značeným fluorescenční skupinou), radioaktivní značku (která se může začlenit do sondy nukleové kyseliny způsoby, které jsou dobře známy v oboru a mohou se detekovat na základě jejich radioaktivity například inkubací se scintilační kapalinou) nebo barvivém nebo jiným barvícím činidlem.
V jiném případě taková sonda nukleové kyseliny se nemusí značit a navrhne se tak, aby působila jako primer vhodný pro začlenění množství značených nukleotidů s polymerázou nukleové ··♦· ·· ·· ·· · * · · · ···· ··· · · · ·· · · · ··· » t ♦ · · · · • ···· ·· · ·♦· ·· ·· ·· ··· kyseliny. Může se tak provést detekce začleněné značky a tak se detekují kolonie nukleové kyseliny.
Kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu se pak připravují hybridizací. Taková příprava zahrnuje ošetření kolonii tak, že celý nebo část templátu nukleové kyseliny tvořící kolonie je přítomen v jednořetězcové formě. Toho je možné dosáhnout například teplotní denaturací libovolné dvouřetězcové DNA v koloniích. V jiném případě se kolonie mohou ošetřit restrikčnimi endonukleázami, které jsou specifické pro dvouřetězcovou formu sekvence v templátové nukleové kyselině. Tak endonukleáza může být specifická vůči sekvenci obsažené v oligonukleotidové sekvenci Y nebo Z nebo vůči jiné sekvenci, která je přítomna v templátové nukleové kyselině. Po štěpení se kolonie zahřejí tak, že dvouřetězcové molekuly DNA se oddělí a kolonie se promyjí, aby se odstranily nemobilizované řetězce tak, že v koloniích zůstává zachycena jednořetězcová DNA.
Po přípravě kolonii vhodných pro hybridizací se pak přidá ke koloniím značená nebo neznačená sonda za podmínek vhodných pro hybridizací sondy s jejich specifickou sekvencí DNA. Takové podmínky může stanovit odborník za použití metod známých v oboru a budou záležet na příkladu sekvence sondy.
Sonda se pak může odstranit teplotní denaturací, jestliže je to nutné, a pak se může hybridizovat a detekovat sonda specifická pro druhou nukleovou kyselinu. Tyto kroky se mohou opakovat tolikrát, kolikrát je to nutné.
Značené sondy, které hybridizuj! s koloniemi nukleové kyseliny se pak mohou detekovat za použití zařízení, které zahrnuje vhodné detekční zařízení. Preferovaný detekční systém pro fluorescenční značky je kamera s nábojovou vazbou (CCD), která se v optimálním případě spojí se zvětšovacím zařízením, jako je například mikroskop. Za použití takové technologie je • · · · • · možné současně paralelně monitorovat velké množství kolonii. Například za použití mikroskopu s CCD kamerou a s objektivem se 10-ti násobným nebo s 20-ti násobným zvětšením, je možné pozorovat kolonie na povrchu mezi 1 mm2 a 4 mm2, které odpovídají monitorování 10 000 až 200 000 kolonii. Je jasné, že tento počet poroste s vylepšením optiky a s velikostí čipů.
Alternativní metodou monitorování vzniklých kolonií je skenování povrchu pokrytého koloniemi. Je možné například použít systémy, kde je možné současně uspořádat až 100 000 000 kolonii a zachytí se monitorovací obrázek celého povrchu kamerou CCD. Tímto způsobem je možné vidět až 100 000 000 kolonií během krátkého času.
Dále se může použit za účelem monitorování kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu libovolné jiné zařízení umožňující detekci a přednostně kvantifikaci fluorescence na povrchu. Také je možné použít fluorescenční zobrazovače nebo konfokální mikroskopy.
V případě, že značky jsou radioaktivní, pak je možné použít systém detekující radioaktivitu.
Při metodách podle vynálezu se provede další krok umožňující alespoň jeden krok stanovení sekvence alespoň jedné z vytvořených kolonií nukleové kyseliny, což je možné provést za použití sekvenační techniky za použití libovolné vhodné pevné fáze. Například jednou metodou stanovení sekvence, která se může použít při stanovení sekvence podle vynálezu, zahrnuje hybridizaci vhodného primeru, který se zde nazývá „sekvenační primer, s templátem sekvenované nukleové kyseliny, extenzi primeru a detekci nukleotidů používaných při prodloužení primeru. Upřednostňuje se, aby nukleová kyselina užívaná pro prodloužení primeru se detekovala před přidáním dalšího nukleotidu, což umožňuje postupné sekvenování in šitu jednotlivých po sobě jdoucích baží nukleové kyseliny.
• ♦
Detekce začleněných nukleotidů se provádí tak, že se do primeru extenzní reakce začlení jeden nebo více značených nukleotidů. Mohou se použít libovolné vhodné detekovatelná značky, jako je například fluorofor, radioaktivní značení atd. . Upřednostňuje se použití fluorescenční značky. Stejné nebo odlišné značky se mohou použít v každém odlišném typu nukleotidu. V případě, že značka je fluorofor pro každý odlišný typ nukleotidu se použije stejné značky, pak každé začlenění nukleotidu může dojit ke kumulativnímu zvýšení signálu detekovatelného při určité vlnové délce. Jestliže se používají odlišné značky, pak tyto signály se mohou detekovat při různých vlnových délkách.
sekvenčního primeru
Aby se umožnila hybridizace vhodného se sekvenovaným templátem nukleové kyseliny, pak templát se v jednořetězcové formě. V případě, že kyseliny umožňující vytvořit kolonie vyskytuj e nukleové templáty nukleové kyseliny jsou přítomny ve dvouřetězcové formě, mohou se zpracovat kyseliny tak, aby za použití vznikly metod, templáty jednořetězcové které jsou dobře známy nukleové v oboru, například denaturací nebo štěpením atd..
Sekvenační primery, které hybridizují s templátem nukleové kyseliny a používají se při extenzi primeru, jsou přednostně krátké oligonukleotidy, které přibližně obsahují 15 až 25 nukleotidů. Sekvence primerů se navrhla tak, že hybridizují s částí templátu sekvenované nukleové kyseliny, přičemž se upřednostňuje, aby k tomu došlo za přísných hybridizačních podmínek. Sekvence primerů užívaných při sekvenování může mít stejné nebo podobné sekvence těm, které jsou obsaženy v koloniových primerech a které se používají při vzniku kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu. Sekvenační primery se mohou vyskytovat v roztoku nebo v imobilizované formě.
• 9 • ♦· · 9 99 9 * · · · · ·· « • · · · » - · · · · ··· * »- ··· «ρ • · · · · 99 ··* ·· ·· · · ···
Po té, co se sekvenačni primer navázal na templát nukleové kyseliny, který se sekvenuje tak, že se vystaví vhodným podmínkám stanoveným metodami dobře známými v oboru, provede se prodloužení primerů, například za použití polymerázy nukleové kyseliny a dodaných nukleotidů, přičemž, alespoň některé se vyskytují ve značené formě a nastolí se podmínky, které jsou vhodné pro extenzi primerů. Mohou se použit příklady polymeráz nukleové kyseliny a nukleotidů, jak se popisuje shora v textu.
Aby se odstranily nezačleněné nukleotidy, které mohou interferovat s následnými kroky, je třeba po každém kroku prodloužení primerů zahrnout promytí. Po té, co se provedlo prodloužení primerů, monitoruje se kolonie nukleové kyseliny za účelem stanovení, zda značený nukleotid se začlenil do prodlouženého primerů. Krok extenze primerů se pak opakuje za účelem stanovení dalších a následných nukleotidů začleněných do prodlouženého primerů.
Libovolné zařízení, které umožňuje detekci a přednostně kvantifikaci vhodného značení, jako je například fluorescence nebo radioaktivita, je možné využít při stanovení
V případě, že značka je fluorescenční molekula, sekvence.
je možné použít kameru CCD, která je spojena se zvětšovacím přístroj em (jak se popisuje shora
Ve skutečnosti zařízení používané při stanovení sekvence podle vynálezu může být stejné jako ta zařízení, která se popisují shora v textu a jsou vhodná pro monitorování kolonií amplifikované nukleové kyseliny.
Detekční systém se přednostně používá v kombinaci s analytickým systémem za účelem stanovit počet nebo podstatu nukleotidů začleněných v každé kolonii po každém kroku extenze primerů. Tato analýza, která se může provést bezprostředně po každém kroku prodloužení primerů nebo později za použití • · •·· · »«·· · · · •·· * · · · · · · • ···· «· ··· ·· ·· ·· · · · zaznamenaných dat umožňuje, aby se stanovila sekvence templátů nukleové kyseliny v dané kolonii.
Jestliže stanovovaná sekvence není známa, pak nukleotidy aplikované v případě dané kolonie se aplikují obvykle v určeném pořadí, který se pak opakuje po celou analýzu. Je to například dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Jestliže stanovovaná sekvence je známa a znovu se sekvenuje, například pro účely analýzy, zda existují malé rozdíly, kterými se sekvence liší od známé sekvence, pak sekvenační proces je rychlejší, když se v každém kroku sekvenace přidají nukleotidy ve vhodném pořadí, které se zvolí podle známé sekvence. Rozdíly od dané sekvence se pak detekují tak, že nedojde k začlenění jistých nukleotidů při určitém stádiu extenze primerů.
Tak je možné vidět, že celá nebo část sekvence amplifikovaného templátů nukleové kyseliny tvořící určité kolonie nukleové kyseliny se může stanovit za použití metod podle vynálezu.
V jiném provedení vynálezu se celá nebo částečná sekvence více jak jedné nukleové kyseliny stanoví určením celé nebo části sekvence amplifikovaného templátů nukleové kyseliny, která je přítomna ve více jak jedné kolonii nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby se současně mohlo stanovit velké množství sekvencí.
Provedení stanovení sekvence nukleových kyselin za použití metody podle vynálezu je výhodné, protože je pravděpodobné, že je způsobeno skutečností, že velké množství každé sekvenované nukleové kyseliny se vyskytuje v každé kolonii nukleové kyseliny podle vynálezu. Jestliže je to nutné, je možné zvýšit spolehlivost tím, že se použije velké množství kolonií nukleové kyseliny obsahující stejný templát sekvenované nukleové kyseliny a pak stanovení sekvence pro každé množství kolonií a porovnání takto stanovených sekvencí.
Upřednostňuje se, aby zachyceni koloniového primerů a templátu nukleové kyseliny na pevný povrch bylo termostabilní při teplotě, které se podklad vystaví během amplifikační reakce nukleové kyseliny. Je to například teplota až přibližně 100 °C, například přibližně 94 °C. Upřednostňuje se, aby zachycení bylo kovalentní.
V jiném provedení vynálezu kovalentní navázání koloniových primerů a templátu nukleové kyseliny na pevný podklad se vyvolává síťovacím činidlem, jako je například l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydrochlorid (EDC), sukcinanhydrid, fenyldiizothiokyanát nebo maleinanhydrid nebo heterobifunkční síťovací činidlo, jako je například mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester (MBS), Nsukcinimidyl-[4-j odoacetyl]aminobenzoát (SIAB), sukcinimidyl-4[N-maleimidometyl]cyklohexan-l-karboxylát (SMCC), N-ymaleimidobutyryloxy-sukcinimidester (GMBS) , sukcinimidyl-4-[pmaleimidofenyljbutyrát (SMPB) a odpovídající sulfosloučeniny (ve vodě rozpustné). Preferovaná síťovací činidla vhodná pro použití podle vynálezu jsou s-SIAB, s-MBS a EDC.
V dalším provedení vynálezu pevný podklad má derivatizovaný povrch.
V jiném provedení vynálezu derivatizovaný bifunkčními povrch síťovacími se následně upravuje přednostně reaktivními pevného podkladu skupinami, aby vznikl funkční povrch, síťovacími skupinami.
Termín „derivatizovaný povrch znamená povrch, který se upravil chemickými reaktivními skupinami, jako je například aminoskupina, thíolová nebo akrylátová skupina.
Termín „funkční povrch znamená derivatizovaný povrch, který se upravil specifickými funkčními skupinami, jako jsou například maleinové nebo sukcinové funkční části.
• ♦ · · * • · · · ·«··
V metodě podle vynálezu, kterou je možné použit při jistých aplikacích, zachycení koloniových primerů a templářů nukleové kyseliny na pevný podklad splnilo řadu požadavků. Ideální zachycení by nemělo být ovlivněno vystavení vysoké teplotě a opakovanému procházení cykly zahřátí/ochlazení, což se používá při během amplifikace nukleové kyseliny. Podklad by měl umožnit získání hustoty zachycených koloniových primerů alespoň 1 fmol/mm2, upřednostňuje se hustota 10 fmol/mm2, více se upřednostňuje 30 až 60 fmol/mm2. Ideální podklad by měl vykazovat jednotný rovný povrch s nízkou hodnotou fluorescence pozadí a měl by být také teplotně stabilní (neměl by se deformovat). Pevné podklady, které umožňují pasivní adsorpci DNA na jistých typech plastických a syntetických nitrocelulózových membrán, nejsou vhodné. Pevný podklad by se měl použít pouze jedenkrát a neměl by být nákladný.
Z těchto důvodů pevný podklad může být libovolný pevný podklad, na který se může zachytit nukleová kyselina. Může to být například latexové částice, částice dextranu, polystyrénový a polypropylenový povrch, polyakrylamidový gel, povrchy tvořené zlatém, skleněné povrchy a plátky silikonu. Upřednostňuje se, aby pevný podklad byl skleněný povrch a zachycení nukleových kyselin na tento povrch je proveden kovalentní vazbou.
Kovalentní navázání koloniových primerů a templátů nukleové kyseliny na pevný podklad se může provést za použití metod, které jsou známy v oboru. Například epoxysilan-amino kovalentní navázání oligonukleotidů na pevné podklady, jako jsou porézní skleněné částice, které se používají při in šitu syntéze oligonukleotidů (prostřednictvím připojení 3'konce) a také se upravily pro zachycení oligonukleotidů 5'konce. Oligonukleotidy upravené na 5'konci pomocí karboxylové a • ···· ·» ,. ,, , *· ... · » · · · ·· • · · · · « · · · · · « * ··*....:
• · · ·. » , t „ ·*· ··« ·» .. .. ...
aldehydové skupiny se kovalentně zachytily na latexových částicích upravených hydrazinem (Kremsky et al. , 1987).
Jiné přístupy vhodné pro zachycení oligonukleotidů na pevných površích je použití síťovaciho činidla, jako je sukcinanhydrid, fenylizothiokyanát (Guo et al. , 1994) nebo maleinanhydrid (Yang et al., 1998). Jiným velmi používaným síťovacím činidlem je l-etyl-3-(3-dimetylamonipropyl)karbodiimidhydrochlorid (EDC). Chemie EDC se poprvé popisuje v publikaci Gilham et al., (1986). Uvádí se, že templáty DNA se zachytí na papír (celulózu) prostřednictvím terminální fosfátové skupiny na 5'konci. Za použití chemie EDC se použily jiné podklady. Jsou to například latexové částice v publikaci Wolf et al., 1987 a Lund (popisují se al., 1988), et polystyrénové mikroprohlubně (popisuje se
Rasmussen et al., 1991), sklo s určenou v publikaci velikostí pórů
Ghosh et al., 1987) a molekuly 1987). Kondenzace oligonukleotidů s upraveným 5'-koncem s činidlem zprostředkovaná karbodiimidem (popisuj e dextranu se v publikaci (Gangeras et al., se popisuje v publikaci Chu et al., (1983) a Egan et al., (1982) v případě fosfátové skupiny, kterou se upravil 5'konec.
Výsledkem zachycení oligonukleotidů prostřednictvím
5'konce za použití karbodiimidů se může dosáhnout
o, 0 r ale nespecifického zachycení prostřednictvím vnitřních nukleotidů oligonukleotidů.
V publikaci Rasmussen et (1991) se popisuje zvýšení až 85 % specifické zachycení prostřednictvím 5'konce derivatizací povrchu za použití sekundárních aminoskupin.
V publikacích se popisují výhody hetero-bifunkčních síťovacích činidel. Hetero nebo monobifunkční síťovací činidla se široce používají při přípravě konjugátových molekul peptidových nosičů (peptid-protein) za účelem zesílit imunogenitu u zvířat (Peeters et al., 1989). U většiny těchto • · · činidel se popisuje, že tvoří stabilní kovalentni vazby ve vodném roztoku. Tato síťovací činidla se použila při navázání DNA na pevný podklad pouze v jednom bodě molekuly.
V publikaci Chrisey et al., (1996) se popisuje studie účinnosti a stability zachycení DNA na pevné fázi za použití šesti různých heterobifunkčních síťovacích činidel. V tomto příkladu se zachycení projeví pouze na 5'konci oligomerů DNA upraveného thiolovou skupinou. Tento typ zachycení se také popisuje v publikaci 0'Donnell-Maloney et al., (1996). Popisuje se zachycení cílů DNA v sekvenční analýze MALDI-TOF a v dokumentu EP-A-665293 Hamamatsu Photonics F.K. company se popisuje stanovení sekvence baží nukleové kyseliny na pevném povrchu.
Provedlo se několik studií, které hodnotí termální stabilitu zachycení oligonukleotidů na pevném podkladu. Chrisey et al. , (1996) popisuje, že v případě sukcinimidyl-4 [p-maleimidofenyl]butyrátové síťovacího činidla (SMPB) se uvolnilo ze skleněného povrchu skoro 60 % molekul během ošetření teplem. V tomto případě se však nepopisuje termální stabilita jiných činidel.
Za účelem vytvořit kolonie nukleové kyseliny prostřednictvím amplifikační reakce na pevné fázi, jak se popisuje v této přihlášce, templáty
5'konci na primery a nukleových kyselin se specificky zachytí svými pevném povrchu, přičemž se upřednostňuje sklo. Skleněný povrch se může derivatizovat reaktivními aminoskupinami silanizaci za koloniové použití aminoalkoxysilanů.
Vhodná silanová činidla zahrnuj i aminopropyltrimetoxysilan, aminopropyltrietoxysilan a 4aminobutyltrietoxysilan. Skleněné povrchy se mohou také derivatizovat jinými reaktivními skupinami, jako je například • ···· ·· ·· ·· ··« · · · ··· • ··· · ···· · · akrylátová skupina nebo epoxyskupina za použití epoxysilanu, akrylátsilanu a akrylamidsilanu. Následuje derivatizační krok, přičemž molekuly nukleové kyseliny (koloniové primery nebo templáty nukleové kyseliny) vykazují na svém 5konci chemicky upravitelnou funkční skupinu. Je to například fosfátová, thiolová nebo aminoskupina, které- jsou kovalentně zachyceny na derivatizovaném povrchu, síťovacím činidlem, jak se popisuje shora v textu. V jiném případě krok derivatizace je následován zachycením bifunkčního síťovaciho činidla na povrchových aminoskupinách, přičemž vznikají upravené funkční povrchy. Molekuly nukleových kyselin (koloniový primer nebo templáty nukleové kyseliny), které vykazují na 5-konci fosfátovou, thiolovou skupinu nebo aminoskupinu pak reagují s funkčním povrchem za vzniku kovalentní vazby mezi nukleovou kyselinou a sklem.
Potencionální síťovací činidla a činidla vhodná pro zavedení se mohou použít při kovalentním zachycení DNA/oligonukleotidu na pevném povrchu a zahrnují l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydrochlorid (EDC), sukcinanhydrid, fenyldiizothiokyanát nebo maleinanhydrid nebo heterobifunkční síťovací činidlo, jako je například mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester (MBS), N-sukcinimidyl-[4-jodoacetyljaminobenzoát (SIAB) , sukcinimidyl-4-[Nmaleimidometyl]cyklohexan-l-karboxylát (SMCC) , N-y-maleimidobutyryloxy-sukcinimidester (GMBS), sukcinimidyl-4-[p-maleimidofenyl]butyrát (SMPB) a odpovídající sulfosloučeniny, které jsou rozpustné ve vodě. Preferovaná síťovací činidla podle vynálezu jsou s-SIAB, s-MBS a EDC. s-MBS je maleimidsukcinimidový heterobifunkční síťovací činidlo a s-SIAB je jodoacetylsukcinimidové heterobifunkční síťovací činidlo. Obě tyto činidla jsou schopny tvořit kovalentní vazbu se skupinami SH a primárními aminoskupinami. EDC je karbodiimidové činidlo, • · • · · které zprostředkovává kovalentni zachycení fosfátové skupiny a aminoskupiny.
Koloniové primery a templáty nukleových kyselin se v obecném případě modifikují na svém 5'konci fosfátovou skupinou nebo primární aminoskupinou (například síťovacím činidlem EDC) nebo thiolovou skupinou (v případě linkerů sSIAB nebo s-MBS).
Vynález dále poskytuje pevný podklad, na který se připojí velké množství koloniových primerů X, jak se popisuje shora v textu a alespoň jeden templát nukleové kyseliny, jak se popisuje shora v textu, kde uvedené templáty nukleové kyseliny obsahují na svých 5'koncích oligonukleotidovou sekvenci Y, jak se popisuje shora v textu, a na svých 3'koncích obsahují oligonukleotidovou sekvenci pevný podklad, kterým je množství templátů zachycení templátů nukleové nukleové pevném povrchu byla
Z. Upřednostňuje s výhodou se, aby se na sklo, zachytilo velké kyseliny.
Upřednostňuje se, aby koloniových primerů na kyseliny kovalentni. Uskutečněním jednoho nebo více cyklů amplifikace nukleové kyseliny na imobilizovaném templátů nukleové kyseliny za použití metod, jak se popisuje shora v textu, se mohou vytvořit kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu. Vynález dále popisuje podklad obsahující jednu nebo více kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu. Vynález dále popisuje použití pevných podkladů podle vynálezu v metodách amplifikace nukleové kyseliny nebo sekvenování. Takové metody amplifikace nebo sekvenace nukleové kyseliny zahrnuje metody podle vynálezu.
Vynález dále popisuje použití derivatizovaného nebo funkčního podkladu, připraveného způsobem, jak se popisuje shora v textu při metodách amplifikace a sekvenování. Takové metody amplifikace a sekvenování nukleových kyselin zahrnují metody podle vynálezu.
Vynález dále popisuje přistroj pro provedení metod podle vynálezu nebo přístroj pro produkci pevného podkladu, který obsahuje kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu. Takový přístroj může například obsahovat velké množství templátu nukleové kyseliny a koloniových primerů podle vynálezu vázaných přednostně kovalentní vazbou na pevný podklad, jak se popisuje shora v textu, spolu s polymerázou nukleové kyseliny, s velkým množstvím nukleotidových prekurzorů, jak se popisuje shora v textu, přičemž část z nich se může značit a může obsahovat prostředek pro řízení teploty. V jiném případě může přístroj obsahovat například podklad obsahující jeden nebo více kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu. Upřednostňuje se, aby přístroj také obsahoval detekční prostředky pro detekci a rozlišeni signálů z jednotlivých kolonií nukleových kyselin uspořádaných na pevném povrchu za použití metod podle vynálezu. Takové detekční prostředky mohou zahrnovat zařízení s vázaným nábojem, které je operativně spojeno se zvětšovacím zařízením, jako je mikroskop, jak se popisuje shora v textu.
Upřednostňuje se, aby libovolný přístroj podle vynálezu byl automatický.
Vynález popisuje řešení a potřeby vědců v oboru biotechnologií, které jsou směrovány do odvětví genomu, farmakologie, vývoje drog, charakterizace potravin a typováni genů. Taková metod se může aplikovat například při sekvenování a opětném sekvenování, diagnostikování a testování, monitorování genové exprese, při profilech genové diversity, zkoumání a hodnocení polymorfizmu celého genomu, při vytvoření genomových sklíček (celý genom pacienta se nanese na mikroskopické sklíčko) a sekvenování celého genomu.
Vynález se může použít při sekvenování a opětném sekvenování nukleové kyseliny, kde jsou například geny specificky amplifikovány do kolonií za účelem úplného ···· ·· · · ·· · • · · · ···· •·· · ···· · · · ··· ·· · · · · · • · · · · · · · • ·· ·· · · ·· ··· sekvenování DNA. Opětná sekvenace genu umožňuje identifikaci všech známých a nových genetických polymorfizmů zkoumaných genů. Amplifikace se používá při diagnóze onemocnění a genetické identifikaci živých organizmů.
Při použití vynálezu při diagnostikování a testování se mohou amplifikovat celé genomy nebo frakce do kolonií za účelem sekvenování DNA známých polymorfizmů jediného nukleotidu (SNP). Identifikace SNP nachází použití ve výzkumu v oboru medicíny za účelem identifikovat faktory genetických poruch spojených s onemocněním. Typování genů pomocí SNP také nachází uplatnění při diagnostikování v oboru farmacie, což se využívá při identifikaci a léčbě pacientů pomocí specifických léků.
Použití vynálezu při tvoření profilů genetické diversity se mohou identifikovat amplifikaci vzorku DNA do kolonií a následným sekvenováním DNA specifických značek v případě každé jednotlivé genetické entity populace například organizmů nebo buněk nebo tkáně. Tímto způsobem se může definovat genetická diverzita vzorku stanovením počtu značek pro jednotlivou entitu.
Použití podle vynálezu při monitorování exprese genu, se exprimované molekuly mRNA tkáně nebo zkoumaného organizmu přemění na molekuly cDNA, které se amplifikují do sady kolonií za účelem sekvenování DNA. Frekvence kolonií, které kódují danou mRNA je úměrná frekvenci molekul mRNA přítomných v počáteční tkáni. Aplikace monitorování genové exprese se zahrnuje do bio-medicínského výzkumu.
Mikroskopická sklíčka nesoucí celý genom (genomová sklíčka), kde celý genom živého organizmu je přítomen v počtu kolonií DNA, který je dostatečný, aby obsahoval všechny sekvence uvedeného genomu. Tyto sklíčka se mohou připravit za použití metod podle vynálezu a mohou představovat genetické • ···· ·· ·· ·· • · · · · · ··· karty libovolného živého organizmu. Genetické karty nacházejí uplatnění ve výzkumu oboru medicíny a genetické identifikaci živých organizmů, které se využívají v průmyslu.
Vynález se také může použít k provedení sekvenace celého genomu, kde celý genom živého organizmu se amplifikuje jako sada kolonií pro sekvenování rozsáhlé DNA. Sekvenování celého genomu umožňuje například 1) přesnou identifikaci genetických kmenů libovolného živého organizmu, 2) zkoumání nových genů kódovaných v genomu a 3) zkoumání nových genetických polymorfizmů.
nejsou omezeny
Aplikace vynálezu z jednotlivého kyselin se na analýzu vzorků nukleové kyseliny
Značky nukleových organizmu mohou začlenit nebo pacienta.
do templátů a mohou se tak amplifikovat, přičemž pro je možné použít odlišné značky že se stanoví sekvence nukleových kyselin každý organizmus nebo pacienta nukleových kyselin. Tak v případě, amplifikované nukleové kyseliny, může se také stanovit sekvence značky a původ identifikovaného vzorku.
Vynález dále popisuje použití metod podle vynálezu nebo kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu nebo velkého množství templátů nukleových kyselin podle vynálezu nebo pevných podkladů podle vynálezu, které se používají při přípravě molekul nukleové kyseliny za účelem sekvenování, monitorování genové exprese, stanovení profilů genetické diversity, diagnostikování, testování, sekvenování celého genomu, zkoumání polymorfizmu celého genomu a hodnocení a přípravy sklíček s celým genomem (to znamená celý genom jednotlivce na jednom podkladu) nebo se mohou použít při libovolné jiné aplikace, která zahrnuje amplifikaci nebo sekvenování nukleových kyselin.
Vynález dále poskytuje sadu vhodnou pro použití při sekvenování, opětném sekvenování, monitorování exprese genu, • · · · · ·· ·· ·« • · · ··· «·· stanovení profilu genetické diversity, testování, sekvenování celého genomu, zkoumání a hodnocení celého genomu nebo libovolnou jinou aplikaci zahrnující amplifikaci nebo sekvenování nukleových kyselin. Tento kit obsahuje velké množství templátů nukleové kyseliny a koloniových primeru podle vynálezu vázaných na pevném podkladu.
Přehled obrázků na výkrese
Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma metody vhodné pro vytvoření kolonie nukleové kyseliny, jak se popisuje v jednom provedení vynálezu.
Na obrázku č. 2 je zobrazeno schéma přípravy templátů a následné zachycení na pevný povrch.
Na obrázku č. 2a je znázorněna příprava templátů A, B a B' obsahující sekvence koloniových primeru. Za použití PCR primeru TP1 a TP2 se z genomové DNA vytvořil templát o velikosti 3,2 Kb. Templáty A . (obsahující 854 bp) a B (obsahující 927 bp) se vytvořily za použití PCR primerů TPA1/TPA2 nebo TPB1/TPB2. Oligonukleotidy TPA1 a TPB1 se mají upravený 5' konec a to buď fosfátovou nebo thiolovou skupinou, které slouží k následnému zachycení (*) . Získané templáty obsahují sekvence odpovídající koloniovým primerům CPI a/nebo CP2. 11 exonů genu se zde nazývá jako El až Ell.
Na obrázku č. 2b je zobrazeno chemické zachycení koloniových primerů a templátů na skleněný povrch. Je zde zobrazena derivatizace pomocí ATS (aminopropyltrietoxysilan) .
Na obrázku č. 3 jsou zobrazeny kolonie DNA vytvořené z koloniového primerů. Obrázek zobrazuje počet kolonií pozorovaných v poli pod 20-ti násobným zvětšením, jako funkci koncentrace templátu vázaného na stěnu. Nejnižší koncentrace detekovatelného templátu je 10’13 M.
Na obrázku č. 4 je zobrazena diskriminace mezi koloniemi, které pochází z dvou různých templátu.
Na obrázku č. 4a se nachází zobrazení kolonií vytvořených z obou templátu a negativních kontrol.
Na obrázku č. 4b jsou zobrazeny kolonie pocházející z obou templátů ve stejné poloze ve stejné prohlubni, které se zviditelnily dvěma různými barvivý, a negativní kontroly.
Na obrázku č. 4c jsou zobrazeny souřadnice obou typů kolonií v pod-sekci pole viditelného v mikroskopu. Jsou zde také zobrazeny kolonie z různých templátů, které se neshodují.
Na obrázku č. 5 jsou zobrazeny schémata templátu nebo zachycení oligonukleotidů na sklo. Krok A je pak derivatizace povrchu, přičemž povrch skleněného sklíčka se ošetří kyselým roztokem, aby se zvýšil počet volných hydroxylových skupina na povrchu skla. Připravená sklíčka se ponoří do roztoku aminosilanu. Zkratka ATS představuje aminopropyltrietoxysilan. Krok B: BI nebo B2 pak znamená funkcionalizaci skleněného povrchu se síťovacími činidly a pak následuje zachycení oligonukleotidů. Aminoskupina reaguje se síťovacím činidlem prostřednictvím amidové vazby, což odpovídá kroku Bl. Zkratka s-MBS znamená sulfo-m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysukcinimidester a zkratka s-SIAB znamená sulfo-Nsukcinimidyl[4-jodoacetyl]aminobenzoát. Krok B2 : oligonukleotidy (oligonukleotidy s modifikovaným 5'koncem, kde se vyskytuje thiolová skupina) se zachytí na povrchu prostřednictvím vytvoření kovalentní vazby mezi thiolem a dvojnou vazbou maleimidu. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok obsahuje PBS, 0,1 M NaH2PO4, pH6,5, 0,15 M NaCl) . Krok • · · · · · · · · · · ··· ··· «·· • ··· · ···· · · • ··· · β ··· ·
Β3 zahrnuje zachyceni oligonukleotidů za použití EDC a imidazolu. 5'konec fosfátem upravených oligonukleotidů reaguje s imidazolem v přítomnosti EDC za vzniku 5'fosforimidazolidových derivátů (není zobrazeno) . Deriváty tvoří fosforamidát vázaný s aminoskupinami derivatizovaného skleněného povrchu. Zkratka EDC znamená l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydro-chlorid.
Na obrázku č. 6: je zobrazen graf, kde počet kolonií pozorovaný v poli mikroskopu při zvětšení 20 x je funkci koncentrace templátu vázaného na stěnu. Templát DNA se vázal v různých koncentracích buď prostřednictvím spojovacího prostředku (EDC) na povrch skla derivatizovaného aminoskupinou (A) nebo na skleněný povrch funkcionalizovaný s-MBS (B). Kolonie s dvouřetězcovou DNA se podrobily štěpení restrikčními enzymy a získaly se jednotlivé řetězce hybridizované s komplementárním oligonukleotidem značené fluorescentní molekulou cy5.
Na obrázku č. 7 je zobrazen příklad sekvenováni in šitu kolonií DNA vytvořených na skle.
Na obrázku č. 7a je zobrazen výsledek po inkubaci s Cy5™ -dCTP se vzorkem, který se neinkuboval s primerem pl81. Je možné vidět pět rozmazaných bodů, což ukazuje, že dochází k ne příliš dramatickému rušivému účinku (jako je srážení agregátů Cy5™ -dCTP, adsorpce nebo jednoduše nespecifické začlenění do DNA v koloniích nebo na povrchu).
Na obrázku č. 7b je zobrazen výsledek inkubace Cy5™ -dUTP se vzorkem, který se neinkuboval s primerem pl81. Neobjevil se žádný bod, což indikuje, že neproběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množstvím, kdy nukleotid určený pro začleněni neodpovídá sekvenci templátu následující hybridizovaný primer.
• · · · ♦ · · ·· ·· ··* · · · · · · • · · · · ···· 9 9
Na obrázku č. 7c je zobrazen výsledek inkubace Cy5™ -dCTP se vzorkem, který se inkuboval s primerem pl81. Objevila se řada fluorescenčních bodů, což indikuje, že proběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množství, přičemž nukleotid určený pro začlenění odpovídá sekvenci templátů následujícím po hybridizovaném primeru.
Obrázek č. 8 zobrazuje hybridizaci sond s oligonukleotidy zachycenými na Nucleolink před a po proběhnutí cyklů PCR. Obrázek ukazuje hybridizaci R58 s CP2 (5'-(fosfát)TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno plnými kruhy), CP8 (5' (aminohexametylen)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno plnými trojúhelníky), CP9 (5' (hydroxyl)TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno kosočtvercem), CP10 (5' (dimetoxytrityl)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno prázdnými kruhy) a CPU (5'(biotin)~ TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno prázdnými trojúhelníky).
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1: Příprava templátů DNA vhodných pro vytvoření kolonií DNA
Kolonie DNA se vytvořily z templátů DNA a koloniových primerů. Termín „sekvence koloniového primeru znamená sekvenci odpovídající sekvenci koloniového primeru a nazývá se „oligonukleotidovou sekvencí Y nebo „oligonukleotidovou sekvencí Z'.
Vlastnosti koloniových primerů se vybraly na základě výběru oligonukleotidových primerů, které vykazují slabé nespecifické začlenění nukleotidu v přítomnosti tepelně stabilní DNA polymerázy. Koloniové primery CPa (5' -.p CACCAACCCAAACCAACCCAAACC) a CPp (5'-p AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) se vybraly na základě jejich malé schopnosti začlenit • ···♦ · · ·· ·· • · · · · · · · * • · · · · · · · ♦ · · • ··· * fc ··· · radioaktivně značeného nukleotidu [a32P-dCTP] v přítomnosti stabilní DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) ve standardním pufru za podmínek teplotních cyklů (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 1 minuty, teplota 72 °C po dobu 2 minut, 50 cyklů).
modelový
DNA o velikosti 3,2 Kb se vybral jako demonstruje možnost vytvoření kolonií za použití koloniových primerů
Fragment systém, který lidský gen kódující produktů (HUOXRAGE, a templátů DNA. Vybraný templát obsahuje receptor pro další glykozylaci konečných
GenBank číslo uložení D28769). RAGE specifické primery jsou uvedeny v tabulce
1. Templát o velikosti 3,2 kb pomocí PCR se amplifikoval
0,1 μς lidské genomové DNA s 1 μΜ primery TP1 a TP2 s j ednotkou
DNA polymerázy
City, CA) standardním °C po dobu °C po (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster pufru a za podmínek teplotních cyklů (teplota 30 vteřin, teplota 65 °C po minut, 40 cyklů).
dobu velikosti 3,2 Kb účelem vytvoření se použil jako templát dvou kratších templátů ve dobu 1 minuty, teplota
Tento fragment DNA o kolonie (templát A a B). kratších templátů obsahují obě
Primery sekvence, pro templát a sekvence účelem amplifikace DNA pro sekundární PCR, za vhodných pro vytvoření používané k vytvoření které koloniových primerů jsou specifické
CP2, za
CPI a obecném na pevném povrchu. V vzniku templátů DNA se upraví případě na jeho
PCR primer používaný ke
5'konci buď fosfátovou nebo thiolovou skupinou. Po amplifikaci
PCR se vytvořily fragmenty DNA, které obsahují sekvence koloniových primerů na jednom nebo na obou koncích, které sousedí s DNA fragmentem RAGE (popisuje se na obrázku č. 2a).
Templát A (dvouřetězcový templát, který obsahuje sekvenci koloniového primerů CPP na obou koncích) se vytvořil s 0,1 ng templátů o velikosti 3,2 Kb s 1 μΜ primery TPA1 a 1 μΜ TPA2 s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, «
CA) ve standardním pufru a za podmínek teplotních cyklů (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 60 vteřin, teplota 72 °C po dobu 60 vteřin, 30 cyklů) . Produkty se pak čistily na Qia-quick koloně od firmy Qiagen (Qiagen
GmbH, Hilden, Německo).
Templát B (dvouřetězcový templát, který obsahuje sekvence koloniových primerů odpovídající ΟΡβ) se vytvořil s 0,1 ng templátu o velikosti 3,2 kb s 1 μΜ primery TPB1 a 1 μΜ TPB2 s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) ve standardním pufru a za podmínek teplotních cyklů (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 1 minuty, teplota 72 °C po dobu 1 minuty, 30 cyklů) . Produkty se pak čistily na koloně Qia-quick od firmy Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Německo).
Templát B' (dvouřetězcový templát obsahující sekvence koloniových primerů odpovídající CPa a ΟΡβ na obou koncích) se vytvořil 0,1 ng templátu o velikosti 3,2 kb s 1 μΜ primery TPB3 a 1 μΜ TPB4 s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) ve standardním pufru a za podmínek teplotního cyklu (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 1 minuty, teplota 72 °C po dobu 1 minuty, 30 cyklů). Produkty se pak čistily na kolonách Qia-quick od firmy Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Německo).
Všechny použité specifické oligonukleotidy při přípravě templářů DNA a pro vytvoření kolonií se uvádějí v tabulce č. 1 spolu s libovolnou chemickou modifikací.
Obecné schéma vykazující chemické začlenění koloniových primerů a templářů na skleněném povrchu je zobrazeno na obrázku č. 2b, kde se provedla derivatizace pomocí ATS (aminopropyltrietoxysilan).
Tabulka č. 1: Seznam oligonukleotidů používaných při přípravě templátů a vytvoření kolonií
| název | sekvence DNA | souřadnice (orientace) | úprava oligonukleotidů | použití |
| TP1 | 9810 (R) | templát o velikosti 3,2 kb | ||
| TP2 | 6550 (F) | templát o velikosti 3,2 kb | ||
| CPI | žádné | 5'P | vytvoření kolonií | |
| CP2 | žádné | 5'P | vytvoření kolonií | |
| CP3 | žádné | 5'SH | vytvoření kolonií | |
| CP4 | žádné | 5'SH | vytvoření kolonií | |
| CP5 | žádné | 5'P | vytvoření kolonií | |
| CP6 | žádné | 5'P | vytvoření kolonií | |
| CP7 | žádné | 5' (NH2) | vytvoření kolonií | |
| CP8 | žádné | 5' (NH2) | vytvoření kolonií | |
| CP9 | žádné | 5'(OH) | kontrolní |
···· ·· ·· e- · · · ··· · · ··♦
| oligo | ||||
| CP10 | žádné | 5'(DMT) | kontrolní oligo | |
| CPU | žádné | 5' (biotin) | kontrolní oligo | |
| TPA1 | 6550 (F) | 5'P | templát A | |
| TPA2 | 7403 (R) | 5'P | templát A | |
| TPB3 | 9049 (F) | žádné | templát B' | |
| TPB1 | 9265 (F) | žádné | templát B | |
| TPB2 | 8411 (R) | 5'P | templát B | |
| TPB4 | 9265 (R) | 5'SH | templát B' |
Souřadnice pocházejí z „HUMOXRAGE gene, přístupové číslo je
D28769, symbol (R) znamená „reverzní a symbol (F) znamená „dopředný.
Příklad la: Příprava náhodného templátů DNA lemovaného degenerativním primerem
Fragment DNA o velikosti 3,2 kb se vybral jako modelový systém pro demonstraci možnosti vytvořit kolonie za použití amplifikace PCR s náhodnými primery. Tato strategie se může aplikovat sekvenováním fragmentů DNA přibližné velikosti 100 kb a kombinací fragmentů s celými genomy. Fragment DNA o velikosti 3,2 kb se vytvořil pomocí PCR z lidské genomové DNA za použití primerů PCR TP1 5'-pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG a TP2 5'pCCTGTGACAAGACGACTGAA, jak se popisuje v příkladu 1. Fragment o velikosti 3,2 kb se pak štěpil na menší fragmenty kombinací restrikčních enzymů (EcoRI a Hhal za vzniku čtyř fragmentů o velikosti 800 bp). Štěpené nebo neštěpené fragmenty DNA se pak smíchaly s degenerovaným primerem p252 (5'-P TTTTTTTTTTISISISISISIS, kde symbol I znamená inosin (který tvoří pár s A, T a C) a symbol S znamená G nebo C a kovalentně se váže na prohlubně „Nucleolink (Nunc, Německo). Ve zkumavkách pak proběhla náhodná PCR amplifikace na pevné fázi a vizualizace se provedla hybridizací se značenými sondami DNA, jak se popisuje v příkladu 2a.
Příklad 2: Kovalentní navázání templátů DNA a koloniových primerů na pevný podklad (plast) a tvorba kolonií s koloniovým primerem
Kovalentní navázání templátů a koloniového primeru na pevný podklad (plast)
Koloniový primer (CP2, ' _ TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAG
GAAAGGGAAAGGG s fosforylovaným
5'koncem (Microsynth GmBH,
Švýcarsko) se zachytil v prohlubních plastových mikrotitračních destiček „Nucleolink (Nunk,
Dánsko) • ···· ·· ·· ·· ··· ··· ··· • ··· « ···· · · • · · · · · · · ·· ·· · · · · · v přítomnosti různých dávek templátu A (připraveno způsobem popsaným v příkladu 1) . 8 prohlubní se provedlo ve dvou provedeních se sedmi ředěními templátu 1/10 s primerem CP2. Nejvyšší počáteční koncentrace je 1 nM.
Prohlubně mikrotitračních destiček, na které se kovalentně navázaly koloniový primer CP2 a templát se připravily následujícím způsobem. Do každé prohlubně mikrotitrační destičky „Nucleolink se přidalo 30 μΐ 1 μΜ roztoku koloniového primeru s různou koncentrací templátu ředěného z 1 nM v 10 mM 1-metylimidazol (pH7,0) (Sigma Chemicals). Do každé prohlubně se přidalo k roztoku koloniového primeru a templátu 10 μΐ 40 mM l-etyl-3-{3-dimetylaminopropyl}-karbodimidu (hodnota pH je 7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metyl-imidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se při teplotě 50 °C přes noc. Inkubační prohlubně se pak dvakrát vypláchly 200 μΐ RS (0,4 Ά NaOH, 0,25 % Tween 20) , inkubovaly se 15 minut s 200 μΐ RS, dvakrát se promyly 200 μΐ RS a dvakrát s 200 μΐ TNT (TNT tvoří 100 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20). Zkumavky se nechaly vyschnout při teplotě 50 °C a uchovávaly se v zataveném plastovém sáčku při teplotě 4 °C.
Tvorba kolonií
V každé prohlubni se vyvolal růst kolonií přidáním 20 μΐ směsi PCR, čtyř dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA (bovinní sérový albumin), 0,1 % Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švýcarsko), 1 x koncentrovaného pufru PCR a 0,025 jednotek/μΙ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA). Destičky s prohlubněmi se pak umístily do teplotního cyklovače a růst kolonií se uskutečnil inkubací zatavených prohlubní po dobu 5 minut při teplotě 94 °C a proběhlo 50 cyklů při následujících podmínkách: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 2 minut, teplota 72 °C po dobu 2 minut.
• · * · · · · · · ···· · ···· · ·
Po ukončeni uvedeného programu se prohlubně uchovávaly při teplotě 8 °C do dalšího použití. Dříve než se provede hybridizace se prohlubně naplnily 50 μΐ pufru TE (pufr TE obsahuje 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,4) a zahřály se na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a ochladily se na ledu. Sonda se přidala po opětném zahřátí na teplotu 45 °C.
Zviditelnění kolonií
Sonda:
Sondu tvoří fragment DNA obsahující 1 405 párů baží, který zahrnuje na svém 3'konci sekvenci templátu (polohy nukleotidů 8 405 až 9 259) . Sonda DNA se syntetizovala pomocí PCR za použití primeru p47 (5 ' -GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA) amplif ikuj ícího od báze 8 405 a TP2 biotinylovaného na 5' konci amplifikuj ícího od báze 9 876 kódujícího DNA-řetězce.
Hybridizace a detekce:
Sonda se naředila na koncentraci 1 nM v pufru „easyhyb (Boehringer Mannheim, Německo) a do každé prohlubně se přidalo 20 μΐ. Sonda a kolonie se denaturovaly při teplotě 94 °C po dobu 5 minut a pak se inkubovaly po dobu 6 hodin při teplotě 50 °C. Nadbytek sondy se odstranil promytím při teplotě 50 °C v 2x koncentrovaném SSC 0,1 % roztokem Tween. Sondy DNA se navázaly na zeleně fluorescenční fluorosféry potažené avidinem o průměru 0,04 μ (Molecular Probes) v pufru TNT po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Nadbytek kuliček se odstranil promytím pufrem TNT. Kolonie se zviditelnily mikroskopicky a provedla se analýza zobrazení, jak se popisuje v příkladu 2a. Na obrázku č. 3 je zobrazen počet kolonií pozorovaných v poli mikroskopu při 20-ti násobném zvětšení, jako funkce koncentrace templátu vázaného na prohlubeň. Nejnižší —13 koncentrace detekovatelného templátu odpovídá koncentraci 10
M.
Přiklad 2a: Kovalentní navázáni templářů DNA a koloniových primerů na pevný podklad (plast) a tvorba kolonií s degenerovaným primerem.
Kovalentní navázání templátu a koloniového primeru na pevný podklad (plast)
Mikrotitrační prohlubně s p252 s fragmenty templářové DNA se připravily následujícím způsobem: do každé prohlubně „Nucleolink se přidalo 30 μΐ 1 μΜ roztoku koloniového primeru p252 s různou koncentrací templátu ředěného z koncentrace 0,5 nM v 10 mM 1-metylimidazolu (pH 7,0) (Sigma Chemicals). Do každé prohlubně se k roztoku koloniového primeru a templátu přidalo 10 μΐ 40 mM l-etyl-3-(dimetylaminopropyl)karbodiimidu (pH 7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metylimidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se přes noc při teplotě 50 °C. Po inkubaci se prohlubně promyly dvakrát 200 μΐ RS (0,4 A NaOH, 0,25 % Tween 20), vše se pak inkubovalo po dobu 15 minut s 200 μΐ RS, pak následují dvě promytí 200 μΐ RS a dvě promytí 200 μΐ TNT (pufr TNT zahrnuje 100 mM TrisHCl pH7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20). Zkumavky se sušily při teplotě 50 °C a uchovávaly se v zataveném plastovém sáčku při teplotě 4 °C.
Tvorba kolonii
Tvorba kolonií proběhla podle upraveného protokolu, který umožňuje náhodnou iniciaci v každé prohlubni s 20 μΐ směsi PCR, která obsahuje čtyři dNTP (0,2 mM každého dNTP), 0,1 % BSA, 0,1 % Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švýcarsko), lx koncentrovaný pufr a 0,025 jednotek/μΙ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA) . Destičky s prohlubněmi se pak umístily do teplotního cyklovače a proběhla amplifikace inkubací zatavených prohlubní po dobu 5 minut při teplotě 94 °C a proběhlo 50 cyklů za následujících podmínek: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po
dobu 2 minut, teplota 72 °C po dobu 2 minut. Po dokončeni tohoto programu se prohlubně udržovaly při teplotě 8 °C do dalšího použití. Před hybridizací se prohlubně naplnily 50 μΐ pufru TE (pufr TE obsahuje 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,4) a obsah se zahřál na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a ochladil se na ledu. Sonda se přidala po ohřátí na teplotu 45 °C.
Zviditelnění kolonií
Sondy:
Dva fragmenty DNA o velikosti 546 a 1 405 párů baží obsahující sekvence původního templátu se amplifikovaly pomoci PCR. Kódující DNA-řetězec se značil biotinem za použití PCR primerů značeným biotinem na jeho 5'konci. Souřadnice párů baží sondy jsou 6 550 až 7 113 a 6 734 až 9 805.
Hybridizace a detekce:
Sonda se ředila na koncentraci 1 nM v pufru „easyhyb (Boehringer.Mannheim, Německo) a do každé prohlubně se přidalo 20 μΐ. Sonda a kolonie se denaturovaly při teplotě 94 °C po dobu 5 minut a pak se inkubovaly po dobu 6 hodin při teplotě 50 °C. Nadbytek sondy se odstranil promytím při teplotě 50 °C v 2x koncentrovaném SSC s 0, 1 % roztokem Tween. Sondy DNA se navázaly na zeleně fluorescenční fluorosféry potažené avidinem o průměru 40 nanometrů (Molecular Probes, Portland, OR) v pufru TNT po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Nadbytek částic se odstranil promytím pufrem TNT. Fluorescence se detekovala za použití inverzního mikroskopu (za použití objektivu 20x/0,4 LD Achroplan na Axiovert S100TV s are rtuťovou lampou HBO 100W/2, Caři Zeiss, Oberkochen, Německo) spojeného s kamerou 768 (Η)x512(V)pixel-CCD (Princeton Instruments lne. Trenton, NJ, USA). Expozice trvala 20 vteřin přes sadu filtrů XF22 (Ex. filtr: 485DF22, dichroický filtr: 505DRLPO2 Em: 530DF30) a XF47 (Ex. filtr: 640DF20, dichroický filtr: 670DRLPO2 Em: 682DF22) od firmy Omega Optical ····· ·· ·· ·· · ··« ··· · · · · ···· · ···· · · · • ·«······· · • ········ ······ · · ·· ·· ··· (Brattleboro Vt) v případě značení FITC a Cy5. Data se analyzovala za použiti software WinWiew (Princeton Instruments lne., Trenton NJ, USA). Počet kolonií v poli mikroskopu se spočítal ve dvou provedení prohlubní za použití softwaru pro analýzu zobrazení.
Příklad 3: Sekvenační diskriminace ve různých koloniích, která pochází z různých poměrů dvou různých kovalentně vázaných templátů a koloniového primerů
Kovalentní navázání templátů a koloniového primerů na pevný podklad (plast)
Koloniový primer (CP2, 5'-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGG
GAAAGGG s fosforylovaným 5'koncem (Microsynth GmBH, Švýcarsko) se zachytil v prohlubních plastových mikrotitračních destiček „Nucleolink (Nunk, Dánsko) v přítomnosti různých dávek templátů A (připraveno způsobem popsaným v příkladu 1) . Série 8 prohlubní se provedla ve třech provedeních se sedmi ředěními obou templátů 1/10. Ředění templátů jsou upraveny opačným směrem tak, že nejvyšší koncentrace templátů se shoduje s nejnižší.
Prohlubně mikrotitračních destiček, na které se kovalentně navázaly koloniový primer CP2 a oba templáty se připravily následujícím způsobem. Do každé prohlubně mikrotitrační destičky „Nucleolink se přidalo 30 μΐ 1 μΜ roztoku koloniového primerů CP2 s různou koncentrací obou templátů ředěného z 1 nM v 10 mM 1-metylimidazolu (pH7,0). (Sigma Chemicals). Do každé prohlubně se přidalo k roztoku koloniového primerů a templátů 10 μΐ 40 mM l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodimidu (hodnota pH je 7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metylimidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se při teplotě 50 °C přes noc. Inkubační prohlubně se pak dvakrát vypláchly 200 μΐ RS (0,4 N NaOH, 0,25 % Tween 20), inkubovaly • ·
se 15 minut s 50 μΐ RS, třikrát se promyly 50 μΐ RS a třikrát s 50 μΐ TNT (TNT tvoři 100 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20). Zkumavky se uchovávaly v TNT při teplotě 4 °C.
Tvorba kolonií
V každé prohlubni se vyvolal růst kolonií přidáním 20 μΐ směsi PCR, kterou tvoří čtyři dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA (bovinní sérový albumin), 0,1 % Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švýcarsko), 1 x koncentrovaný pufr
PCR a 0,025 jednotek/μΐ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA).
Destičky s prohlubněmi se pak umístily do teplotního cyklovače a růst kolonií se uskutečnil inkubaci zatavených prohlubni po dobu 5 minut při teplotě 94 °C a proběhlo 50 cyklů při následujících podmínkách: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 2 minut, teplota 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení uvedeného programu se prohlubně uchovávaly při teplotě 8 °C do dalšího použití. Dříve než se provede hybridizace se prohlubně naplnily 50 μΐ pufru TE (pufr TE obsahuje 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,4) a zahřály se na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a ochladily se na ledu. Sonda se přidala po opětném zahřátí na teplotu 50 °C.
Zviditelnění kolonií
Sondy:
Dva fragmenty DNA o velikosti 546 a 1 405 párů baží odpovídající sekvencím fragmentu DNA o velikosti 3,2 kb na svém 5'a 3'konci se amplifikovaly pomocí PCR. Kódující DNAřetězec se značil bíotínem za použití PCR primerů značeného biotinem (popisuje se v příkladu 2). Dvě sondy se denaturovaly zahřáním na teplotu 94 °C po dobu 5 minut, pak se rychle ochladily v 1 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 a nechaly se navázat na fluorosféry potažené streptavidinem o průměru 0,04 μιη, které
se značily různými barvivý po dobu 2 hodin při teplotě 4 °C. Sondy vázané na částicích se ředily 20 krát v pufru „easyhyb předehřátém na teplotu 50 °C. Do každé prohlubně, která obsahuje denaturované kolonie se přidalo 20 μΐ sond.
Hybridizace a detekce:
Hybridizace se provedla při teplotě 50
Nadbytek sondy se odstranil promytím při °C po dobu 5 hodin.
°C v 2x teplotě koncentrovaném
SSC s 0,1 roztokem
SDS.
Kolonie se zviditelnily mikroskopem objektivem umožňuj ící zvětšení s expozicí analýza zobrazení způsobem popsaným č. 4a je uvedeno zobrazení kolonií dvacetinásobné vteřin provedla se
2a. Na obrázku v příkladu vytvořených z templátů a negativních kontrol. Na obrázku č.
4b jsou zobrazeny kolonie vytvořené z templátů ve stejné poloze ve stejné prohlubni zviditelněné dvěmi rozdílnými barvami a
Obrázek č. 4c zobrazuje souřadnice obou sekci mikroskopického pole. Obrázek č. kolonie z různých templátů nejsou shodné.
negativní kontroly, typů kolonií v pod4c demonstruje, že
Příklad 4: Kovalentní navázání templátů DNA a oligonukletidů na skleněné pevné podklady
Skleněná sklíčka derivatizovaná aminosilanem se použila jako pevný podklad pro kovalentní zachycení oligonukleotidových sond upravených thiolovou skupinou za použití heterobifunkčních síťovacích činidel. Vybraná činidla vykazují skupiny reaktivní s thiolovou skupinou (maleimid) a aminoskupinou (sukcinimidylester) . Zachycení oligonukleotidu a stabilita imobilizovaných molekul silně závisí na stabilitě síťovacího činidla za daných podmínek. Reakční schéma templátů DNA nebo zachycení oligonukleotidů na skle se popisuje na obrázku č. 5.
• ···· · · · • * *- ··· · · • · · · · · « • · ·· ·· · · ·
Hodnotila se stabilita při uchovávání připravených skleněných sklíček se síťovacími činidly s-MBS a s-SIAB a jejich teplotní stabilita. Důležitým faktorem, který ovlivňuje rozsah hybridizace imobilizovaných oligonukleotidových sond je hustota zachycených sond (popisuje se v publikaci Beattie et al., 1995 a Joss et al., 1997). Tento účinek se studoval při různých koncentracích oligonukleotidů během imobilizace a testování hustoty zachycených oligonukleotidů hybridizací.
Materiály a metody
Ošetření mikroskopických skleněných sklíček kyselinou
Mikroskopická skleněná sklíčka (Knittel, Měrek ABS) se namočily do (HelmanexIIR základního roztoku Helmanex během jedné hodiny
0,25 %,
IN NaOH). Sklíčka se promyla vodou, ponořily se přes noc do 1M HC1, promyly se opět vodou a ošetřily se po dobu jedné hodiny roztokem kyseliny sírové (H2SO4/H2O poměru objemů 1/1 a přidalo se malé množství čerstvého sulfátu amonného). Sklíčka se promyla vodou etanolem a nakonec čistým acetonem. Sklíčka se sušila uchovávala ve vakuu až do doby dalšího použití.
Silanizace povrchu
Předem ošetřená sklíčka se ponořila do 5 % roztoku ATS (aminopropyltriethoxysilan, Aldrich) v acetonu. Silanizace se provedla při teplotě místnosti po dobu dvou hodin. Po třech promytích v acetonu (jedno promytí trvá 5 minut) se sklíčka promyla etanolem, sušily se a uchovávaly se vakuu.
Zachycení síťovacího činidla
Síťovací činidla s-MBS a s-SIAB (sulfo-m-maleimidobenzoylN-hydroxysukcinimidester a zkratka s-SIAB znamená sulfo-Nsukcinimidyl[4-jodoacetyljaminobenzoát, Pierce, Rockford IL) se připravily jako 20 mM roztoky v PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, 0,1 M NaH2PO4, pH7,2, 0,15 M NaCl) .
Sklíčka upravená sílaném, na která se naneslo 80 μΐ roztoku
siťovacího činidla se přikryly krycími mikroskopickými sklíčky a nechaly se reagovat po dobu 5 hodin při teplotě 20 °C. Sklíčka se promyla PBS, krátce se ponořila do vody a opláchla se etanolem. Sklíčka se pak sušila a uchovávala se ve vakuu ve tmě do doby dalšího použití.
Zachycení oligonukleotidu
Oligonukleotidy se syntetizovaly tak, že se jejich 5' konec upravil thiolovou skupinou (CP3 a CP4 Eurogentec, Brussels) nebo fosforečnanovou částí (CPI a CP2, Eurogentec, Brussels) za použití standardní chemie fosforamiditu.
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci thiolovou skupinu (CP3 a CP4) se připravily jako 100 μΜ roztoky ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (NaPi obsahuje 0,1 M NaH2PO4 pH6,6, 0,15 M NaCl) a na sklíčka se nanesly kapky o objemu 1 μΐ, přičemž sklíčka se funkcionalizovala siťovacím činidlem. Sklíčka se nechala kultivovat po dobu 5 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka se uchovávala v saturované vlhké atmosféře, aby se předešlo odpaření. Sklíčka se promyla za stálého míchání pufrem NaPi. V případě studia teplotní stability se sklíčka dvakrát ponořila do pufru Tris (10 mM, pH8) po dobu 5 minut při teplotě 100 °C a přímo se ponořily do roztoku 5x koncentrovaný SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrát sodný, pH 7) při teplotě 4 °C po dobu 5 minut. Sklíčka se až do dalšího použiti uchovávala v 5x koncentrovaném roztoku SSC při teplotě 4 °C.
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci fosfátovou skupinu (CPI a C2), se aplikovaly (v kapkách o celkovém objemu 1 μΐ) po dobu 5 hodin při teplotě místnosti na aminoderivatizované skla, jako 1 μΜ roztoku v 10 mM 1metylimidazolu (pH 7,0) (Sigma Chemicals), který obsahuje 40 mM l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC, Pierce, • ·
Rockford, IL) . Sklíčka se promyla dvakrát při teplotě 100 °C v pufru Tris (tento pufr obsahuje 10 mM Tris pH 8) a přímo se ponořily do 5x koncentrovaného roztoku SSC při teplotě 4 °C po dobu 5 minut. Sklíčka se uchovávala v 5x koncentrovaným roztoku SSC při teplotě 4 °C až do doby dalšího použití.
Zachycení oligonukleotidu a templátové DNA
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci thiolovou skupinu, (CP3 a CP4) a templát B's thiolovou skupinou na svém 5'konci se smíchaly ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (roztok NAPi obsahuje 0,1 M Nal^PCU pH6,6, 0,15 M NaCl). Koncentrace templářů DNA kolísá od 0,001 do 1 μΜ a koncentrace primeru se pohybuje v rozmezí od 0,1 do 100 μΜ, přičemž optimální koncentrace templátu je 1 μΜ a v případě primeru to je hodnota 100 μΜ. Dále se postupuje podle způsobu zachycení primerů CP3 a CP4 na funkční povrch sklíčka popsaného shora v textu.
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci fosfátovou skupinu, (CPI a CP2) a templát B s fosfátovou skupinou na svém 5' konci se smíchaly ve 10 mM roztoku 1metylimidazolu (pH 7,0) (Sigma Chemicals), který obsahuje 40 mM l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbcdiimid (EDC, Pierce, RockFord, IL) . Koncentrace templátu DNA kolísá od 0,001 do 10 nM a koncentrace primeru se pohybuje v rozmezí od 0,1 do 1 μΜ, přičemž optimální koncentrace templátu je 10 nM a v případě primeru to je hodnota 1 μΜ. Dále se postupuje podle způsobu zachycení primerů CPI a CP2 na aminoderivatizovaný povrch sklíčka popsaného shora v textu.
Hybridizace s fluorescenčně značenými sondami
Oligonukleotidové sondy, které jsou fluorescenčně značené molekulami Cy5 nebo FITC na jejich 5'konci, se syntetizovaly Eurogentec (Brussels). Aby se zabránilo nespecifické • ·
hybridizaci, sklíčka se inkubovala s blokačním roztokem (tento roztok obsahuje 5 x koncentrovaný roztok SSC, Tween 0,1 %, BSA 0,1 %) po dobu jedné hodiny a promyly se za stálého míchání v 5x koncentrovaném roztoku SSC (promývání proběhlo dvakrát a trvalo 5 minut). Oligonukleotidové sondy se ředily na koncentraci 0,5 μΜ v 5 x koncentrovaném roztoku SSC, Tween 0,1 % a nanesly se na skleněný povrch po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka se propláchla za stálého míchání při teplotě 37 °C 5x koncentrovaným roztokem SSC po dobu 5 minut a dvakrát 2 x koncentrovaným roztokem SSC, který obsahuje 0,1 % SDS, po dobu 5 minut.
Hybridizace s radioaktivně značenými sondami
Jako hybridizační sondy za účelem kvantifikovat výtěžek hybridizace se použily radioaktivně značené oligonukleotidy komplementární s kovalentně vázanými oligonukleotidy.
Za použití polynukleotidové kinázy bakteriofága T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) se enzymaticky značily 5'konce oligonukleotidů pomocí [y-32P]dATP (Amersham, UK) . Nadbytek [y32P]dATP se odstranil kolonou „Chromá Spin TE-10 (Clontech, Palo Alto, CA). Radioaktivně značené oligonukleotidy (0,5 μΜ oligonukleotidů v 5x koncentrovaném roztoku SSC, Tween 0,1 %) se nanesly na derivatizovaná sklíčka po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka se jednou promyla za stálého míchání v 5x koncentrovaném roztoku SSC po dobu 5 minut a dvakrát v 2x koncentrovaném roztoku SSC, SDS 0,1 % po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Po hybridizaci se stanovila specifická aktivita za použití scintilačniho počítače.
Pozorování mikroskopem
Sklíčka se přelila 5x koncentrovaným roztokem a překryla se mikroskopickým krycím sklíčkem. Fluorescence se detekovala za použití inverzního mikroskopu model Axiovert S100TV, který
má are rtuťovou lampu HBO 100W/2 (Carl Zeiss, Oberkochen, Německo) spojený s kamerou CCD vybavenou CCD Kodak s formátem 768(H) x 512 (V) pixelů, 6,91 x 4,6 mm, velikost pixelu je 9 x 9 μιπ2 (Princeton Instruments lne. Trenton, NJ, USA) . Doba expozice je 1 až 50 vteřin a použil se objektiv LD Achroplan 20x/0,400 (Crl Zeiss, Oberkochen, Německo) a sada filtrů XF22 (ex. 485DF22, dichroický filtr 505DRLPO2 Em: 530DF30) a XF47 (Ex: 640DF20, dichroický filtr 670DRLPO2 Em: 682DF22) od Omega Optical (Brattleboro VT) v případě FITC a Cy5 fluoroforů. Data se analyzovaly za použití software Winwiew (Princeton Instruments lne., Trenton NJ, USA).
Výsledky
Hodnocení stability zachycení při uchovávání a teplotní stability.
Hodnotila se stabilita při uchovávání sklíček připravených s s-MBS a s-SIAB. Protože tato činidla jsou citlivá vůči hydrolýze, výsledky zachycení oligonukleotidů budou záviset na jejich stabilitě. Aminoderivatizovaná sklíčka se funkcionalizovaly čerstvě připravenými síťovacími činidly, jako je s-MBS a s-SIAB. Funkcionalizovaná sklíčka se uchovávala po zachycení pomocí síťovacího činidla po dobu 10 dni v desikátoru ve vakuu ve tmě a při teplotě místnosti. Po této době se testovaly skladovaná sklíčka (t= 10 dní) a sklíčka, která bezprostředně reagovaly se síťovacími činidly (t= 0) . Výsledky získané po reakci oligonukleotidem upraveným thiolovou skupinou a hybridizaci s komplementární fluorescenční sondou se porovnaly pro oba časy t= 0 a t= 10 dní.
Po imobilizaci sklíčka funkcionalizovaná s-SIAB jsou po deseti dnech skladování zcela stabilní, jak je zřejmé ze stejných výsledků hybridizace pro t= 0 a t= 10 dní. Naopak spojení s-MBS se skleněným povrchem je méně stabilní a vede k
% ztrátě výtěžku zachyceni oligonukleotidů a hybridizace při deseti dnech skladování. Preferují se sklíčka funkcionalizovaná pomocí s-SIAB a mohou se připravovat s předstihem a mohou se uchovávat suchá ve vakuu, ve tmě a po dobu alespoň deseti dní, aniž dojde k žádnému snížení výtěžku zachycení sondy.
Za účelem hodnocení teplotní stability oligonukleotidů zachycených na skleněném povrchu se sklíčka vystavila ošetření při teplotě 100 °C po dobu 5 minut v 10 mM Tris-HCl, pH 8. Zbývající oligonukleotid, který zůstává po promytí stále imobilizovaný, se testoval hybridizací s fluorescenčně značeným komplementárním oligonukleotidem. Přibližně 14 % zachycených molekul se uvolnilo ze sklíček upravených pomocí s-SIAB a 17 % zachycených molekul se uvolnilo ze sklíček upravených pomocí s-MBS po prvních 5 minutách promývání, ale
| další uvolnění | se | detekovalo | |
| případy (tabulka | č. | 1A) . | Tyto |
| srovnání s | výsledky | získanými | |
| 1996, kde | se | uvolnilo | více |
| připoj ených | na | fúzované | silik |
| síťovacího | činidla |
při druhém promytí pro oba výsledky jsou povzbudivé ve v publikaci Chrisey et al·., jak 62 % oligonukleotidů ?nová sklíčka prostřednictvím SMPB (sukcinimidyl-4-[pmaleimidofenyljbutyrát) . Tyto výsledky se naměřily po deseti minutách ošetření v PBS při teplotě 80 °C.
Tabulka č. 1A: Studie teplotní stability
| výsledky hybridizace (jednotky normalizované na 100 %) | |||
| čerstvě zachyceno | po 5 min promytí při teplotě 100 °C | po 2 x 5 minutách promytí při teplotě 100 °C | |
| s-MBS | 80±6 . | 69±4 | 7 3±4 |
| s-SIAB | 100±9 | 84±8 | 87±3 |
• ·
Oligonukleotidy se zachytily na sklíčka funkcionalizovaná buď s-MBS nebo s-SIAB. Zachycené oligonukleotidy se testovaly hybridizaci s fluorescenčně značeným komplementárním oligonukleotidem. Fluorescenční signál je normalizovaný na hodnotu 110 v případě nejsilnějšího získaného signálu. Uvádějí se průměrné hodnoty tří provedení analýzy.
Hybridizace jako funkce zachycení sondy
Studovaly jsme rozsah hybridizace kovalentně vázaných oligonukleotidových sond jako funkci povrchového pokrytí zachycených oligonukleotidů za použití síťovacích činidel sMBS a s-SIAB a reakcí zprostředkovaných EDC. Koncentrace oligonukleotidů aplikovaných za účelem imobilizace byla 1 μΜ EDC a v případě síťovacího činidla kolísá v rozmezí 1 až 800 μΜ. Hustota na povrchu se testovala hybridizaci se sondami značenými 32P. Optimální koncentrace zachycení primerů za použití heterobifunkčních síťovacích činidel je 500 μΜ, které souhlasí s povrchovou hustotou hybridizovaných molekul 60 fmol/mm2 v případě s-MBS a v případě s-SIAB 270 fmol/mm2.
Podobné hustoty se dosáhlo v případě s-MBS za použití zachycení oligonukleotidů s fosfátovou skupinou na svém
5'konci na aminosilanizovaném skle zprostředkovaného
EDC/imidazolem. Pouze 1 μΜ roztoky oligonukleotidů jsou nezbytné pro dosažení stejného výsledku zachycení.
Tabulka č. 1B: Hybridizace jako funkce zachycení sondy
| Hybridizované oligo (fmol/mm ) | |||
| koncentrace oligonukleotidů používaného při zachycení (μΜ) | s-MBS | s-SIAB | EDC |
| 1 | NT | NT | 50 |
| 100 | 10 | 100 | NT |
| 500 | 60 | 270 | NT |
« *f«* V* ·· ·· 0 • « * · · · * · · ·»·· · * · · · * · · · ··»····.
··*··· ·* ·· · · ···
Oligonukleotidy se zachytily na sklíčka funkcionalizované buď s-MBS nebo s-SIAB nebo prostřednictvím aktivačního činidla EDC. Zachycené oligonukleotidy se testovaly hybridizací s radioaktivně značeným komplementárním oligonukleotidem. Specifická aktivita a proto také hustota hybridizovaných molekul se stanovila scintilačni kapalinou. Zkratka NT znamená netestovalo se.
Povrchová hustota 60 fmol/cm2 odpovídá průměrnému molekulovému prostoru mezi vázanými oligonukleotidy, což je 8 nm. Podle našich výsledků hustota pokrytí 30 fmol/mm2 (prostor mezi molekulami 20 nm) je dostatečná pro získání kolonií DNA. Tento výtěžek je možné získat imobilizací primerů v koncentraci 100 μΜ za použití heterobifunkčního síťovaciho činidla s-SIAB nebo 1 μΜ sond za použití přístupu sprostředkovaného EDC. Hustota hybridizace je v rozmezí hodnoty nejvyšší hustoty získané na sklíčkách )jak se popisuje v publikaci Guo et al., 1994, Joss et al., 1997, Beattie et al., 1995).
Tvorba kolonií DNA na skle: tvorba kolonií závisí na délce, koncentraci templátu a koncentraci primerů.
Teoreticky tvorba kolonií DNA vyžaduje vhodnou hustotu primerů zachycených na povrchu odpovídající vhodné délce templátové DNA. Za účelem optimální tvorby kolonií DNA je důležité definovat rozmezí hustot vázaných primerů a templátů, stejně jako stechiometrický poměr mezi templátem a primerem.
Materiál a metody
Příprava sklíček
Sklíčka se derivatizovala a funkcionalizovala, jak se popisuje shora v textu (materiály a metody). Primery kolonií
DNA jsou CPI a CP2. Templáty kolonií se připravily způsobem popsaným v přikladu 1 v případě templátu B', ale za použití
4 4 • 44
4 4
4·
4 4 4 4 templátů se • ··· • 44 • 4
4»
4* primerů TPB3 a TPB2. Upravené kolonie primerů aplikovaly na skleněný povrch v různých koncentracích koloniového primerů a koloniového templátu.
Tvorba kolonií
Sklíčka uchovávaná v 5 x koncentrovaném roztoku SSC se promyla vodou filtrovanou přes mikrofiltr, aby se odstranily sole. Růst kolonií se vyvolal na skleněném povrchu směsí PCR, která obsahuje čtyři druhy dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA, 0,1 % Tween 20, Ix pufr PCR a 0,05 U/μΙ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Poster City, CA). Směs PCR se umístila do zatavené komory (MJ Research, Watertown, MA). Sklíčka se umístila do teplotního cyklovače (The DNA Engine, MJ Research Watertown, MA) a provedly se následující teplotní cykly: krok 1 při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, krok 2 při teplotě 65 °C po dobu 3 minut, krok 3 při teplotě 74 °C po dobu 6 minut a tento program se opakuje 50 krát. Po ukončení tohoto programu se sklíčka držela při teplotě 6 °C až do dalšího použití.
Štěpení kolonií s dvouřetězcovou DNA
Skleněný povrch obsahující DNA se štěpil restrikční nukleázou tak, že se kolonie přelila restrikčním enzymem v lx koncentrovaném štěpícím pufru. Reakce proběhla dvakrát po dobu
1,5 hodiny při teplotě 37 °C. Kolonie s dvouřetězcovou DNA se denaturovaly ponořením sklíček dvakrát do pufru Tris (obsahuje 10 mM, pH 8) při teplotě 100 °C po dobu 5 minut. Pak následuje promytí 5x koncentrovaným roztokem SSC při teplotě 4 °C. Sklíčka se uchovávala v 5x koncentrovaném roztoku až do dalšího použití.
Hybridizace kolonií s jednořetězcovou DNA
Aby se zabránilo nespecifické hybridizaci, sklíčka se inkubovala s blokačním roztokem (5x koncentrovaný roztok SSC, 0,1 % Tween, 0,1 % BSA) po dobu 1 hodiny a sklíčka se promyla « · t ·*W· 99 ·♦ ·· • · · * · * ♦ · · · « * * * · ♦ 9 9 « » · · » · » 6 ♦ • *······* • · · · « · · 9 · · * · · ·
5x koncentrovaným roztokem SSC (promytí se provedlo dvakrát po dobu 5 minut). Oligonukleotid s fluorescenčně značeným 5'koncem pomocí molekuly Cy5 (Eurogentec, Brussels) se ředil na koncentraci 0,5 μΜ v 5x koncentrovaném roztoku SSC, Tween 0,1 % a nanesl se na skleněný povrch na dobu alespoň 2 hodin. Sklíčka se promyla za stálého míchání 5x koncentrovaným roztokem SSC po dobu 5 minut a dvakrát 5 x koncentrovaným roztokem s 0,1 % SDS po dobu 5 minut při teplotě 37 °C.
Sklíčka se zviditelnila dříve popsaným způsobem.
Pozorovalo se, že rozsah hybridizace je funkce hustoty zachycení oligonukleotidu. Podobná studie s vázanými templáty DNA ukázal, že tvorba kolonii je také funkcí koncentrace templátů zachyceného na sklíčkách. V závislosti na chemických postupech užívaných při zachycení oligonukleotidu a templátů je optimální koncentrace templátů 1 μΜ v případě bifunkčního síťovacího činidla s-MBS (obrázek č. 6B) a 1 nM v případě EDC karbodiimidu (obrázek č. 6A) . Je zajímavé, že vyšší koncentrace templátů nezvyšuje počet kolonií v případě chemie EDC a dosáhlo se hodnoty odpovídající maximálnímu počtu kolonií.
Studovaly jsme tvorbu kolonií (počet) jako funkci koncentrace primerů, koncentrace templátové DNA aplikované na povrch a délku templátů DNA.
Také se hodnotil počet kopií templátů v každé kolonii. Kvantifikace se založila na fluorescenční detekci fluoroforů značených molekulami Cy5, Cy3 nebo fluoresceinem doplněnými činidlem proti bělení (Prolong, Molecular Probes, Portland, OR) . Kalibrace se provedla pomocí hybridizačních experimentů pomocí primerů zachycených na povrchu a odpovídající skutečná hustota se stanovila pomocí radioaktivity.
• · ··· ·· ·* ·· · • · * * · · · • e » · « · «« • · « - · · B ·· * · · · · ** ·· ·· ·· ···
Přiklad 5: In-situ sekvenování DNA kolonií
Sklíčka (o průměru 5 mm, Verrerie de Carouga, Švýcarsko) se nejdříve umístily do 0,2 % roztoku Helmanex (ve vodě), do lázně IN NaOH po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, pak se propláchla destilovanou vodou, čistým hexanem a opět dvakrát destilovanou vodou a aplikovalo se 1 M HC1 přes noc při teplotě místnosti. Pak se sklíčka promyla dvakrát destilovanou vodou a ošetřila se H2SO4 (50 %) plus K2S20g po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Sklíčka se opět promyla destilovanou vodou a pak dvakrát etanolem. Sklíčka se derivatizovala ATS (jak se popisuje v příkladu 4).
Koloniové primery CPI (5'-p TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGG AAAGGGAAAGGG) a CP2 (5'-p TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) fosforylované na 5'konci (Microsynth GmbH, Švýcarsko) a templátová DNA B (připravený, jak se popisuje v příkladu 1) se kovalentně svým 5'koncem zachytily na sklíčku o průměru 5 mm (Verrerie de Carouge, Švýcarsko) tak, aby konečná koncentrace byla 1 μΜ až 10 nM. Postupuje se následovně. 2 nm každého primerů se přidaly k 0,2 nm templátu v 1 ml roztoku A (41 μΐ metylimidazolu (Sigma, kat. č. M-8878) v 50 ml H2O, pH se upravilo na hodnotu 7 pomocí HC1) a pak se vše smíchalo v poměru 1:1 s roztokem D (roztok D je 0,2 mM EDC v 10 ml roztoku A) . Na obě strany sklíček se naneslo 3,5 μΐ směsi a sklíčka se inkubovala přes noc při teplotě místnosti. Sklíčka se pak krátce opláchla 5x koncentrovaným roztokem SSC a umístila se do pufru 10 mM Tris pH 8,0 při teplotě 100 °C po dobu dvakrát pět minut.
Nespecifická místa na skle se blokovala bovinním sérovým albuminem (BSA, Boehringer Mannheim GmbH, Německo, kat. číslo 238040) o koncentraci 1 mg/ml v 5x koncentrovaném roztoku SSC po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a pak se promyly destilovanou vodou.
Sklíčka se pak jednotlivě umístily do reakční zkumavky Microamp™ (Perkin Elmer), která obsahuje 170 μΐ směsi PCR a pak se vytvořily kolonie DNA za použití Taq polymerázy (AmpliTaq, PE-Applied Biosystems lne., Foster City, CA), přičemž proběhlo 50 cyklů (teplota 94 °C po dobu 60 vteřin, teplota 60 °C po dobu 3 minut, teplota 72 °C po dobu 6 minut) v teplotním cyklovači MTC 200 (MJ Research, Watertown, MA) . DNA na každém sklíčku se štěpila dvakrát za použití 1,3 jednotek restrikční endonukleázy PvuII (Stratagene) v pufru NEB 2 (New England Biolabs) po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Po štěpení se zkumavky umístily do 10 mM pufru Tris pH 8,0 při teplotě 100 °C po dobu 2x 5 minut, pak se reakce blokovala filtrovaným (Millex GV4, Millipore) roztokem BSA o koncentraci 1 mg/ml v 2x koncentrovaném pufru SSC po dobu 30 minut při teplotě místnosti a promyly se nejdříve 2x koncentrovaným roztokem SSC s 0,1 % SDS a pak 5x koncentrovaným roztokem SSC. Každé sklíčko se inkubovalo přes noc při teplotě místnosti s 5x koncentrovaným roztokem SSC/0,1 % Tween 20, který obsahuje 1 μΜ sekvenačni primer pl81 (CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC) . Kontroly, které neobsahují primer se uchovávaly v 5x koncentrovaném roztoku SSC s 0,1 % Tween 20. Sklíčka se promyla dvakrát 5x koncentrovaným roztokem SSC s 0,1 % SDS při teplotě 37 °C po dobu 5 minut a dále pak 5x koncentrovaným roztokem SSC. Primer pl81 může hybridizovat s templátem B'a sekvence následující po pl81 je CAGCT.... Za účelem zaostření se zelené fluorescenční částice adsorbovaly na dno prohlubně a každá prohlubeň se inkubovala s 20 μΐ ředění 1/2 000 žlutých/zelených fluorescenčních FluoSpheres® potažených streptavidinem (Molecular Probes, Eugene, OR) v 5x koncentrovaném roztoku SSC po dobu 20 vteřin při teplotě místnosti.
Po hybridizaci s primerem se přidaly, na každé sklíčko 2 μΐ roztoku, který obsahuje 0,1 % BSA, 6 mM dithiotreitolu (Sigma
Chemicals), 5 μΜ Cy5(tm)-dCTP nebo 5 μΜ Cy5(tm)-dUTP (Amersham, UK) a lx koncentrovaný reakční pufr sekvenázy. Přidání Cy5(tm)nukleotidu se inicializuje přidáním 1,3 jednotky DNA polymerázy T7 Sequenase<tml (Amersham, UK) po dobu dvou minut v 5x koncentrovaném roztoku SSC s 0,1 % SDS po dobu 15 minut a sklíčka se promyla 5x koncentrovaným pufrem SSC.
Vzorky se pozorovaly za použití inverzního mikroskopu (Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Německo) vybavený CCD kamerou Mikromax 512x768 a za použití software Winview (Princeton Instruments, Trenton, NJ). Při zaostření se použil objektiv s 20-ti násobným zvětšením a sada filtrů XF 22 (Omega Optical, Brattleboro, VT) a při pozorováni vzorků se začleněným Cy5TM se použil objektiv s 20-ti násobným zvětšením a sada filtrů XF 47 (Omega Optical, Brattleboro, VT) při 50 vteřinové expozici za použití třídění 2x2 pixelů. Žluté/zelené FluoSpheres® (přibližně se jich v poli objektivu nachází 100) nevykazuji detekovatelný signál za použiti sady filtru XF47 a při 50 vteřinové expozici (data nejsou uvedeny). Fotografie se vytvořily pomocí programu Winview (Princeton Instruments).
Na obrázku č. 7A je zobrazen výsledek po inkubaci s Cy5™dCTP se vzorkem, který se před tím neinkuboval s primerem pl81. Je možné vidět pět rozmazaných bodů, což ukazuje, že dochází k ne příliš dramatickému rušivému srážení agregátů Cy5™-dCTP, adsorpce účinku (jako je nebo jednoduše nespecifické začlenění do DNA v koloniích nebo na povrchu).
Na obrázku č. 7b je zobrazen výsledek inkubace Cy5™-dUTP se vzorkem, který se neinkuboval s primerem pl81. Neobjevil se žádný bod, což indikuje, že neproběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množstvím, kdy nukleotid určený pro začlenění neodpovídá sekvenci templátů následující hybridizovaný primer.
Na obrázku č. 7c je zobrazen výsledek inkubace Cy5™-dCTP se vzorkem, který se inkuboval s primerem pl81. Objevila se řada fluorescenčních bodů, což indikuje, že proběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množství, přičemž nukleotid určený pro začlenění odpovídá sekvenci templátů následujícím po hybridizovaném primeru.
Ukázalo se, že je možné začlenit fluorescenční nukleotidy do DNA obsažené v koloniích způsobem, který je specifický pro sekvenci, a je možné monitorovat toto začlenění zde popsaným přístrojem nebo metodou. To je však pouze příklad. Je vhodné, když je potřeba, aby se fluorescenční báze opakovaly několikrát. Když se to provede způsobem specifickým pro sekvenci, je pak možné dedukovat část sekvence DNA obsažené v koloniích.
Příklad 6: Analýza značení 5' konce mRNA
Nejpřesnější způsob monitorování exprese genu v buňkách nebo tkáních je omezení počtu kroků mezi shromážděním vzorku a vyhodnocení mRNA. Běžně dostupné jsou také nové metody pro rychlou izolaci mRNA. Nejúčinnější metody zahrnují rychlou izolaci vzorku a bezprostřední porušení buněk do roztoku hydrochloridu guanidinu, který zcela rozloží proteiny a deaktivuje RNázy. Pak následuje čištění mRNA ze supernatantu porušených buněk pomocí oligo-dT afinitní chromatografie. Nakonec mRNA s čepičkou na svém 5'konci se může specificky cílit a transformovat do cDNA za použití jednoduché strategie (syntéza cDNA SMART, Clontech, Palo Alto).
Tato metoda dovoluje syntézu kopií cDNA pouze translačně aktivní mRNA s čepičkou na 5'konci. Kombinaci shora popsané rychlé metody izolace mRNA a přípravy cDNA tvorby kolonií DNA metodou vnesení templátů vznikl postup pro identifikaci velkého množství materiálu značek na 5'konci sekvence mRNA. Výhodou našeho vynálezu je možnost sekvenovat velké množství • · • ·
cDNA přímým zavedením produktu reakcí syntézy cDNA, amplifikací cDNA do tisíce kopií a současně následuje in sítu sekvenování cDNA.
Materiály a metody
Syntetické oligonukleotidy a plazmidy
Oligonukleotidy se syntetizovaly s 5'-fosfáty pomocí Eurogentec nebo Microsynth. Za použití standardních metod se vytvořily plazmidy obsahující částečné kódující a 3'nepřekládané sekvence myšího genu draslíkového kanálu mSlo, který následuje po promotoru T3 RNA polymerázy.
Syntéza mRNA
Plazmidy mSlo se linearizovaly v jediném místě, které rozeznává restrikční nukleáza Sáli nebo Sací a které následuje v plazmidu po sekvenci póly A+. Po ošetření štěpeného plazmidu proteinázou K, DNA linearizovaného plazmidu se extrahovala jednou směsí fenol/CHsCl/izoamylalkohol a srážela se s etanolem. Sraženina DNA se znovu rozpustila ve vodě v koncentraci 10 mikrogramů v mikrolitru. Syntetická mRNA s čepičkou 5'-metylguanozin se syntetizovala in vitro pomocí bitu pro syntézu mRNA „mMessage mMachine podle instrukcí výrobce (Ambion, Austin TX) . Syntetická mRNA se uchovávala při teplotě 80 °C.
Enzymy
Restrikční enzymy se získaly od firmy New England Biolabs (Beverly, MA).
Syntéza cDNA
Syntetická mRNA se smíchala s mRNA póly A+ myších jater v různých poměrech (1:1, 1:10, 1:100) a podle směsi mRNA myších jater a syntetické mRNA se uskutečnila za použiti sady pro syntézu cDNA „SMART PCR (Clontech, Palo Alto, CA) s nějakými malými úpravami. Při reakci syntézy cDNA se ···· ·· ·· • · · · • · · · · * ·· ·· ·· ··· přibližně 1 μα směsi mRNA smíchal s primerem CP5, který má 5'konec sekvence CPp, (5'p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTT TTTTTNN). Tento primer se používá při syntéze prvního řetězce cDNA. V případě syntézy druhého řetězce se použije metoda „SMART. Základem syntézy „SMART je vlastnost reverzní transkriptázy myšího viru Moloney přidat na 3'konec prvního řetězce cDNA tři až pět deoxycytozinových zbytků v případě, že mRNA obsahuje 5' -metylguanozinovou čepičku manuál pro použivatele sady SMART, Clontech, Palo Alto, CA) . Primer CP6, který obsahuje sekvenci CPp plus AAAGGGGG na 3'konci (5'pAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG) , se používá při syntéze druhého řetězce cDNA. Pufr a SUPERSCRIPT™ II RNáza II reverzní transkriptáza z viru myší leukémie Moloney (Lufe Technologies, Ltd.) se používá, jak se popisuje v instrukcích a reakce se provedla při teplotě 42 °C po dobu 1 hodiny. cDNA · se pak testovala pomocí PCR za použití primerů p251, který obsahuje fragment sekvence ΟΡβ (5'-GAGAAGGAAAGGGAAAGG) a Taq DNA polymerázou (Platinum Taq, Life Technologies, Ltd.).
Příprava kolonií DNA
5'p-cDNA se smíchala s různými koncentracemi koloniového primerů na chemicky vázaly na stěny zkumavek vhodných pro reakce
PCR „Nucleolink (NUNC) podle návodu výrobce. Kolonie
DNA se pak připravily za použití
Taq polymerázy (AmpliTaq
Gold, cyklech minuty,
PE-Applied Biosystems lne., (teplota 94 °C po dobu 30 teplota 72 °C po dobu 1,5 minuty)
Foster vteřin,
City, °C
CA)
PO v cyklovači v 30 dobu 1 teplot
MTC 200 (MJ Research, Watertown,
MA) .
Sondy DNA a hybridizace
Sondy DNA značené biotinem a radioaktivně 32P specifické pro sekvenci DNA genu mSlo se syntetizovaly pomocí primerů, který je značen na svém 5'konci biotinem a normálním přímým • · «
primerem metodou
PCR za použiti templátu (mSlo DNA plazmid).
Sonda začlenila cc[32P]-dCTP (Amersham,
Amersham UK) v poměru
300:1 (a[32P]-dCTP k dCTP) v reakci
PCR s konečnou koncentrací čtyř deoxynukleozidtrifosfátů μΜ.
Z výsledných biotinylovaných a radioaktivně značených sond DNA se odstranily sole na koloně Chromaspin-1 000 (Clontech, Palo
Alto, CA) .
Sondy
DNA se hybridizovaly se vzorky v pufru „easyhyb (Boehringer-Mannheim,
Německo) za použití následujícího schématu teploty (cyklovači teplot
MTC200):
teplota 94 °C po dobu 5 minut, pak následuje 68 kroků, kdy každých 30 vteřin se sníží teplota o 0,5°C (to znamená, že teplota se sníží během 34 minut o 65 °C) . Při hybridizaci se použily zatavené prohlubně. Vzorky se pak třikrát promyly 200 μΐ TNT při teplotě místnosti. Prohlubně se pak inkubovaly po dobu 30 minut s 50 μΐ TNT, které obsahuje 0,1 mg/ml BSA (New England Biolabs, Beverly, MA) . Prohlubně se pak inkubovaly po dobu 5 minut s 15 μΐ roztoku červených fluorescenčních mikrosfér o velikosti 40 nanometrů potažených streptavidinem (molecular Probes, Portland, OR) . Roztok mikrosfér se připravil tak, že se 2 μΐ zásobního roztoku mikrosfér , které sonikovaly po dobu 5 minut ve vodní lázni s ultrazvukem o výkonu 50 W (Elgasonic, Bienne, Švýcarsko) ředil v 1 ml roztoku TNT, který obsahoval 0,1 mg/ml BSA a filtroval se přes filtr Millex GV4 s velikosti pórů 0,22 pm (Millipore, Bedford, MA) .
Vizualizace kolonii DNA
Obarvené vzorky se pozorovaly za použití inverzního mikroskopu Axiovert 10 za použití objektivu s 20-ti násobným zvětšením (Carl Zeiss AG, Operkochen, Německo) vybavený kamerou Micromax 512x768 CCD (Princeton instruments, Trenton, NJ) za použití sady filtrů PB546/FT580/LP590 a deseti vteřinové expozice. Dokumenty se převedly do formátu TIFF a
zpracovaly se ve vhodném software (PhotoPaint, Corel Corp. Ltd., Dublin, Ireland). Zpracování spočívá v inverzi a v lineárním zesílení kontrastu za účelem vytvořit obrázek, který je vhodný pro černobílý tisk na laserové tiskárně.
Výsledky
Syntéza syntetické mRNA a cDNA
Syntéza cDNA se kontrolovala pomocí PCR za použití primerů p251 (vytvořeného na každém konci prvního řetězce cDNA), přičemž správná délka produktů se testovala elektroforézou na agarózovém gelu. Syntetická mRNA mSlo se ředila do mRNA jater a dokázala se pruhy specifickými pro mSlo se snižující se intenzitou zesílením nespecifického smíru cDNA jater.
Detekce a kvantifikace kolonií DNA
Kolonie DNA se testovaly za použití fluorescenci zobrazujícího mikroskopu CCD nebo scintilačního počítáni. Počet fluorescenčně detekovatelných kolonií se zvýšil jako funkce množství zavedeného templátu, jak je zobrazeno na obrázku č.
o o
6. Toto zvýšení se odráží jako množství detekovatelného P.
Pomocí radioaktivně značených sond je možné detekovat kopie mRNA v přibližném poměru
1:100. Pomocí fluorescenčního mikroskopu zobrazovací technologií CCD se může detekovat mRNA v ředění 1:10 000.
Příklad 7: Kovalentní navázáni primerů na pevný podklad
Oligonukleotidové primery se zachytily do mikrotitračních prohlubní Nucleolink (Nunc, Dánsko) plastových za účelem stanovit optimální čas párování. Oligonukleotidy (5'-(aminohexametylen) -TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) ,
CP9
CP10 (5'(dimethoxytrityl) -TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG a
CPU ······ a· • ·· · ··· ····· (5'(biotin)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), Microsynth
GmbH, Švýcarsko) se zachytily do mikrotitračních prohlubní Nucleolink následujícím způsobem (pro každý nukleotid se použilo 8 prohlubní): do každé prohlubně se dalo 20 μΐ roztoku, který obsahuje 0,1 μΜ oligonukleotid, 10 mM 1-metylimidazol (pH7,0) (Sigma Chemicals) a 10 mM l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimid (pH7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metylimidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se při teplotě 50 °C po dobu různou dobu. Tárovací reakce se ukončila ve specifický čas promytím dvakrát 200 μΐ RS (0,4 NaOH, 0,25 % Tween 20) a dvakrát 200 μΐ TNT (100 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) . Zkumavky se sušily při teplotě 50 °C po dobu 30 vteřin a uchovávaly se v plastovém sáčku při teplotě 4 °C.
Stabilita vázaných oligonukleotidů z podmínek tvorby kolonií pomocí PCR
Stabilita se testovala za podmínek růstu kolonií přidáním směsi PCR (20 μΐ čtyř dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA, 0,1 % Tween 20, 8 % DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka Švýcarsko), IX pufr PCR).Prohlubně se pak umístily do cyklovače teplot a proběhlo 33 cyklů za následujících podmínek: teplota 94 °C po dobu 45 vteřin, teplota 60 °C po dobu 4 minut, teplota 72 °C po dobu 4 minut. Po ukončení uvedeného programu se prohlubně promyly 5x koncentrovaným roztokem SSC, 0,1 % Tween 20 a nechaly se při teplotě 8 °C až do dalšího použití. Dříve než se naplnily hybridizační prohlubně 50 μΐ 5x koncentrovaného SSC, 0,1 %
| Tween 20 se zahřál na uchovával se při teplotě | teplotu místnosti. | 94 °C po | dobu | 5 minut a |
| Sondy: | ||||
| Oligonukleotidové | sondy | R57 | (5' (fosfát)- | |
| GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG, | kontrolní | sonda) a | R58 | (5'(fosfát)- |
• · · · · · • · · · * · · · • · · · · · ·· ·· ·· ··«
CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT, které jsou komplementární s CP2, CP8, CP9, CP10 a CP11 se enzymaticky značily na jejich 5'konci pomocí [y-32P]dATP (Amersham, UK) za použití polynukleotidové kinázy bakteriofága T4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Přebytek 32P dATP se odstranil pomocí kolony Chromá Spin TE-10 (Clontech, Palo Alto, CA) . Radioaktivně značené oligonukleotidy (0,5 μΜ v 5x koncentrovaném roztoku SSC, 0,1 % Tween 20) se pak hybridizovaly s oligonukleotidem deprivatizovaných v prohlubních Nucleolink při teplotě 37 °C po dobu dvou hodin. Prohlubně se promyly čtyřikrát 5x koncentrovaným roztokem SSC, 0,1 % Tween 20 po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Počítáním v scintilačním roztoku se pak testovala navázaná sonda.
Výsledky
Existuje znatelný rozdíl mezi rychlostí a specifikou párování oligonukleotidů závisejícího na podstatě funkční skupiny na 5'konci oligonukleotidu. Oligonukleotidy nesoucí na svém 5'konci aminoskupinu, která se páruje přibližně dvakrát rychleji jak se oligonukleotidy funkcionalizuj i fosfátovou skupinou na svém 5'konci (uvedeno v tabulce č. 2 a na obrázku č. 8). Vedle kontrolních oligonukleotidů funkcionalizovaných 5'hydroxylem, 5'-DMT nebo 5'-biotinem se všechny spojují rychlostí podobnou rychlosti 5'fosfátu, což je otázka specifické podstaty chemického zachycení za použití 5'fosfátové skupiny.
Tabulka č. 2:
| 5'-fosfát | 5'-amine | 5'-hydroxyl | 5'-DMT | 5'-biotin | |
| Ka (min *) | 0,0068 | 0,0135 | 0,0063 | 0,0070 | 0,0068 |
| zachycený oligonukleotid (fmol/prchlubeň) | 608 | 1344 | 542 | 602 | 650 |
| stabilita PCR (% zbývej íci) | 5 6 | 69 | 66 | 66 | 62 |
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukíeotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG
CHARAKTERISTIKA
SEKVENCE:
(A)
DÉLKA: 24 párů baží
TYP: nukleová kyselina
DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D)
TOPOLOGIE: lineární
DRUH
MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A)
POPIS: /popis: „oligonukíeotidový primer (xi)
Popis sekvence:
SEQ ID NO: 2:
CACCAACCCA AACCAACCCA AACC (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukíeotidový primer
SEQ ID NO: 3:
:
SEKVENCE:
(xi) Popis sekvence:
GAGGCCAGAA CA.GTTCAAGG (2) Informace o SEQ ID NO:
(i) CHARAKTERISTIKA (A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
CCTGTGACAA GACGACTGAA (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
CACCAACCCA AACCAACCCA AACC (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG (2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
TTTTTTTTTT CACCAACCCA aaccaaccca aacc (2) Informace o SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG (2) Informace o SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: | jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | ||
| li) | DRUH | MOLEKULY: jiná | nukleová kyselina |
| (A) | POPIS: /popis: | „oligonukleotidový primer |
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGTTTTTT TTTTTTTTTT NN (2) Informace o SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGG (2) Informace o SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTCGCCTGG TTCTGGAAGA CA (2) Informace o SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
• · • · · ·
| (A) | DÉLKA: 44 párů bázi . | |
| (B) | TYP: nukleová kyseiina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| ii) | DRUH | MOLEKULY: jiná nukleová kyselina |
| (A) | POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer' |
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGCCTGTG ACAAGACGAC TGAA (2) Informace o SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 62 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTGAGGCCA GTGGAAGTCA
GA (2) Informace o SEQ ID NO: 14:
CHARAKTERISTIKA
SEKVENCE:
| (A) | DÉLKA: 60 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: jiná nukleová kyselina |
| (A) | POPIS: /popis: „oligonukleotidový | |
| (xi) | Popis sekvence: SEQ ID NO: 14: |
primer
CACCAACCCA AACCAACCCA AACCGAGCTC AGGCTGAGGC AGGAGAATTG
(2) Informace o SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGAGCTG AGGAGGAAGA GAGG
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) | DÉLKA: 52 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: jiná nukleová kyselina |
| (A) | POPIS: /popis: „oligonukleotidový | |
| (xi) | Popis sekvence: SEQ ID NO: 16: |
primer
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTCGCCTGG TTCTGGAAGA CA (2) Informace o SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „oligonukleotidový primer (ix) ZNAKY:
• ·
| (A) | Název/klíč: modifikovaná | báze |
| (B) | Pozice: 11 | |
| (D) | Jiné informace: | |
| /mod.báze = i | ||
| (ix) ZNAKY: | ||
| (A) | Název/klíč: modifikovaná | báze |
(B) Pozice: 13 (D) Jiné informace:
/mod.báze = i
| (ix) | ZNAKY: | ||
| (A) | Název/klíč: modifikovaná | báze | |
| (B) | Pozice: 15 | ||
| (D) | Jiné informace: | ||
| /mod.báze = i | |||
| (ix) | ZNAKY: | ||
| (A) | Název/klíč: modifikovaná | báze |
(B) Pozice: 17 (D) Jiné informace:
/mod.báze = i
| ix) | ZNAKY: | |||
| (A) | Název/klíč: | modifikovaná | báze | |
| (B) | Pozice: 19 | |||
| (D) | Jiné informace: | |||
| /mod.báze = i | ||||
| ix) | ZNAKY: | |||
| (A) | Název/klíč: | modifikovaná | báze |
(B) Pozice: 21 (D) Jiné informace:
/mod.báze = i (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
NSNSNSNSNS NS
(2) Informace o SEQ ID NO: 18:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) | DÉLKA: 24 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: jiná nukleová kyselina |
| (A) | POPIS: /popis: „oligonukleotidový | |
| (xi) | Popis sekvence: SEQ ID NO: 18: | |
| CGACAGCCGG | AAGGAAGAGG GAGC | |
| 2) Informace o | SEQ ID NO: 19: | |
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 18 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: jiná nukleová kyselina |
(A) primer
POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer
Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
Claims (3)
- NÁROKY1. Způsob amplifikace alespoň z n a č u j vytvoření obsahující se t j edné nukleové kyseliny ž e zahrnuje:alespoň jednoho templátu nukleové nukleovou kyselinu(y), která se amplifikuje, obsahuje na 5'konci 3'konci i m, kyseliny přičemž uvedená nukleová kyselina(y) oligonukleotidovou sekvenci na oligonukleotidovou kyselinu(y) nesoucí sekvenci na 5'konci navíc nukleovou prostředky pro zachycení nukleové kyseliny(kyselin) na pevný podklad, smíchání uvedeného templátu(ů) nukleové kyseliny s jedním nebo více koloniových primerů s oligonukleotidovou sekvencíX, které mohou hybridizovatZ a nesou na svém 5' konci prostředky pro zachycení koloniových primerů na pevný podklad, přičemž v přítomnosti pevného podkladu se 5'konce templátu nukleové kyseliny a koloniových primerů vážou na pevný podklad, provedení amplifikačních reakcí jedné nebo více nukleových kyselin za použití navázaného templátu(ů) tak, že se vytvoří kolonie nukleové kyseliny.2.Způsob podle nároku1, vyznač t i ž komplementární oligonukleotidová sekvence s oligonukleotidovou sekvencí Y a jící Z je koloniový primer X je stejná sekvence jako oligonukleotidová sekvence Y.3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dva různé koloniové primery X se smíchaly s uvedeným templátem(y) v kroku (2) a kde sekvence koloniových primerů X jsou takové, že oligonukleotidová sekvence Z může hybridizovat s jedním z koloniových primerů X a • · · • · · · • * * • » « » · » • < · Φ « · * · · · V ř * · · • ► · · t i · * · · · · « ····»· · « ·» je stejná jako jeden jedné nukleové ž e zahrnuje:templátů nukleové kyseliny, kyseliny oligonukleotidová sekvence Y z koloniových primerů X.4. Způsob amplifikace alespoň vyznačující se tím,1) vytvoření alespoň jednoho zahrnující nukleovou kyselinu(y), která se bude amplifikovat, přičemž uvedená nukleová kyselina(y) nesou na svém 5'konci prostředky pro zachycení nukleové kyseliny(kyselin) na pevném povrchu,
- 2) smíchání uvedených templátů nukleové kyseliny s jedním nebo více degenerativních koloniových primerů X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí v uvedeném templátů(ech) na místě lemujícím sekvenci nukleové kyseliny, která se amplifikuje a nese na 5'konci prostředky pro zachycení koloniových primerů na pevný podklad, přičemž v přítomnosti pevného podkladu se 5'konce templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů vážou na pevný podklad,
- 3) provedení amplifikačních reakcí jedné nebo více nukleových kyselin za použití vázaného templátů(ů) tak, že se vytvoří kolonie nukleových kyselin.
5. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 4, v y z n a č u jící se tím, ž e zahrnuje další krok, který provádí alespoň v jednom kroku stanovení sekvence j edné nebo více vytvořených kolonií nukleové kyseliny. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící se tím, že krok stanovení sekvence zahrnuje začlenění a detekci značených oligonukleotidů.7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že celé nebo částečné sekvence templátů amplifikované nukleové kyseliny přítomných ve více než jedné kolonii nukleové kyseliny se stanoví současně.« · *až7, další krokV···4« • · • · · 9· • « ·, • ·· • · · ♦ ·Způsob podle libovolného z nároků vyznačuj ící se tím, ž e zahrnuje vizualizace vytvořených kolonií.9.Způsob podle nároku vyzná ící se tím, ž e uvedený krok vizualizace zahrnuje použití značené nebo neznačené sondy nukleové kyseliny.10.Způsob podle libovolného nároku 1 až9, vyzná zachycení č u j ící templátu(ů) pro zahrnuj e prostředky se tím, že prostředky koloniových primerů na pevný podklad sekvencí pro kovalentní zachycení nukleových kyselin na uvedený podklad.Způsob podle nároku 10, vyznač se tím, že uvedené prostředky pro kovalentní zachycení sekvencí nukleové kyseliny na upravitelná funkční skupina.pevný podklad je chemicky12 .Způsob podle nároku11, vyznač jící tím, ž e uvedená je fosfátová skupina, upravitelná funkční karboxylová nebo aldehydová chemicky skupina část, thiolová, hydroxylová, dimetoxytritylová (DMT) skupina nebo aminoskupina.13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že uvedená chemicky upravitelná funkční skupina je aminoskupina.14. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že uvedený pevný povrch se vybral ze skupiny zahrnující latexové, dextranové částice, polystyrénový, polypropylenový povrch, polyakrylamidový gel, zlaté, skleněné povrchy a křemíkové plátky.• · β * * · « · ♦ · · * * · 0 * ...* · · Λ · φ β fr· Γ· · · * « · « φ• WW WWW ·· ΦΦ φφ ·Φφ 15. Způsob podle nároku 14, vyzná č u j ící s e tím, ž e uvedený pevný podklad je sklo. 16. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 15, v y z n a č u ’ jící se tím, že hustota vytvořených kolonii nukleové kyseliny je 10 000 na milimetr čtvereční až100 000 na milimetr čtvereční.17. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 16, vyznačuj ící se tím, ž e hustota koloniových primerů X zachycených na uvedeném podkladu je alespoň 1 fmol/mm2. 18. Způsoby podle libovolného z nároků 1 až 17, vyznačuj ící se tím, ž e hustotě i templátů nukleové kyseliny je 10 000 na milimetr čtvereční až 100 000 na milimetr čtvereční.19. Velké množství templátů různých nukleových kyselin obsahující nukleové kyseliny, které se amplifikují, přičemž každá z uvedených nukleových obsahuje na svých 5'koncích známou oligonukleotidovou sekvenci Y a na 3' konci známou oligonukleotidovou sekvenci Z a navíc nukleová kyselina(y) nesou na 5'konci prostředek pro zachycení nukleové kyseliny(kyselin) na pevný podklad.20. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 19, kde oligonukleotidová sekvence Z je komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y.21. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 19, když se smíchá s velkým množstvím koloniových primerů X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na svých 5'koncích prostředky na zachycení koloniových primerů na pevný podklad.···· ·· ·· ·· • · · · · · · •·· · ···· · · • · · ·· ··· · ··· ·· ·· ·· ·22. Velké množství templátů nukleové kde kyseliny oligonukleotidová s oligonukleotidovou sekvencí Y sekvenceZ je a koloniový podle nároku 21, komplementární je stejná primer sekvence jako oligonukleotidová sekvence Y.23. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 19 se smíchá se dvěma různými koloniovými primery X a kde sekvence koloniových primerů X jsou takové, že oligonukleotidová sekvence Y je stejná jako koloniové primery X.24. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 21, kde koloniové primery X obsahují degenerovanou příměrovou sekvenci a templáty nukleové kyseliny neobsahují oligonukleotidové sekvence Y nebo Z.25. Pevný podklad, vyznačující se tím, že se na něj zachytilo velké množství koloniových primerů X podle libovolného z nároků 1 až 24 a množství templátů nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 19 až 24.26. Pevný podklad podle nároku 25, vyznačuj ící se tím, žejeto pevný podklad podle nároků 14 a 15.27. Pevný podklad podle libovolného z nároků 25 nebo 26, vyznačující se tím, že zachycení templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů na pevný podklad je kovalentní.28. Pevný podklad, vyznačující se tím, že zahrnuje jednu nebo více kolonií nukleových kyselin vytvořených metodou podle libovolného z nároků 1 až 18.29. Použití pevného podkladu podle libovolného z nároků 25 až28 při způsobech amplifikace nebo sekvenování nukleové kyseliny.30. Použiti podle nároku 29, kde uvedený způsob je způsob podle libovolného z nároků 1 až 18.31. Použití způsobu podle libovolného z nároků 1 až 18 při amplifikaci nebo sekvenování nukleové kyseliny. 32. Použití způsobu podle libovolného z nároků 1 až 18 nebo kolonií nukleové kyseliny vytvořených uvedenými způsoby nebo velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároků 19 až 24 nebo pevných podkladů podle nároků 25 až 28 při získávání molekul nukleových kyselin pro sekvenování a opětné sekvenování, monitorování exprese genu, profilování genetické diverzity, při diagnóze, testování, sekvenování celého genomu, zkoumání a hodnocení polymorfizmu celého genomu a při přípravě sklíček s celými genomy nebo při jiných aplikacích, které zahrnují amplifikaci nukleových kyselin nebo jejich sekvenování.33. Sada vyzná vhodná pro použití při amplifikaci nebo sekvenování, zahrnuje velké č u j ící se t i m, že množství templátů nukleových kyselin podle libovolného z nároků až 24 a koloniové primery podle libovolného z nároků1 až32 vázaných na pevný podklad.34.Sada podle nároku33, č u j ící se tím, že je vhodná pro použití y z n a při sekvenování, opětném sekvenování, monitorování exprese genu, profilování genetické diverzity, diagnóze, testování, sekvenování celého celého genomu nebo nukleových genomu, zkoumání a hodnocení polymorfizmu libovolné jiné aplikaci zahrnující amplifikaci kyselin nebo jejich sekvenování.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98307985 | 1998-09-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20011183A3 true CZ20011183A3 (cs) | 2001-09-12 |
Family
ID=8235083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20011183A CZ20011183A3 (cs) | 1998-09-30 | 1999-09-30 | Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7115400B1 (cs) |
| EP (2) | EP1117827B8 (cs) |
| JP (1) | JP2002525125A (cs) |
| KR (1) | KR20010085860A (cs) |
| CN (1) | CN1325458A (cs) |
| AR (1) | AR021833A1 (cs) |
| AT (1) | ATE311474T1 (cs) |
| AU (1) | AU771073B2 (cs) |
| BG (1) | BG105363A (cs) |
| BR (1) | BR9914159A (cs) |
| CA (1) | CA2344575A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20011183A3 (cs) |
| DE (1) | DE69928683T2 (cs) |
| EA (1) | EA004271B1 (cs) |
| EE (1) | EE200100195A (cs) |
| HK (1) | HK1042525A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0105052A3 (cs) |
| IL (1) | IL142178A0 (cs) |
| NO (1) | NO20011303L (cs) |
| NZ (1) | NZ510599A (cs) |
| PL (1) | PL347125A1 (cs) |
| SK (1) | SK4292001A3 (cs) |
| TR (1) | TR200100911T2 (cs) |
| WO (1) | WO2000018957A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200102420B (cs) |
Families Citing this family (943)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1591541B1 (en) * | 1997-04-01 | 2012-02-15 | Illumina Cambridge Limited | Method of nucleic acid sequencing |
| US20100130368A1 (en) * | 1998-07-30 | 2010-05-27 | Shankar Balasubramanian | Method and system for sequencing polynucleotides |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| DE10027040A1 (de) * | 2000-06-02 | 2001-12-06 | Basf Lynx Bioscience Ag | Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| DE60226856D1 (de) | 2001-04-20 | 2008-07-10 | Penn State Res Found | Verfahren zur manipulation von nukleinsäuren |
| US7195908B2 (en) * | 2002-10-31 | 2007-03-27 | Corning Incorporated | Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules |
| EP1587940A4 (en) * | 2002-12-20 | 2006-06-07 | Caliper Life Sciences Inc | SINGLE MOLECULAR AMPLIFICATION AND DNA PROOF |
| CA2513889A1 (en) | 2003-01-29 | 2004-08-19 | 454 Corporation | Double ended sequencing |
| US20110059865A1 (en) | 2004-01-07 | 2011-03-10 | Mark Edward Brennan Smith | Modified Molecular Arrays |
| US7622296B2 (en) | 2004-05-28 | 2009-11-24 | Wafergen, Inc. | Apparatus and method for multiplex analysis |
| EP1828412B2 (en) † | 2004-12-13 | 2019-01-09 | Illumina Cambridge Limited | Improved method of nucleotide detection |
| GB0427236D0 (en) | 2004-12-13 | 2005-01-12 | Solexa Ltd | Improved method of nucleotide detection |
| EP2236628A3 (en) | 2005-02-01 | 2010-10-13 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing |
| EP2272983A1 (en) | 2005-02-01 | 2011-01-12 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing |
| AU2006259565B2 (en) | 2005-06-15 | 2011-01-06 | Complete Genomics, Inc. | Single molecule arrays for genetic and chemical analysis |
| GB0514936D0 (en) * | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Preparation of templates for nucleic acid sequencing |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| GB0524069D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| EP1963530B1 (en) * | 2005-12-22 | 2011-07-27 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Active surface coupled polymerases |
| EP1987159B2 (en) | 2006-02-08 | 2020-08-12 | Illumina Cambridge Limited | Method for sequencing a polynucleotide template |
| EP2021503A1 (en) * | 2006-03-17 | 2009-02-11 | Solexa Ltd. | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| US20070231823A1 (en) | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Mckernan Kevin J | Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing |
| EP2032686B1 (en) | 2006-06-23 | 2022-01-12 | Illumina, Inc. | System and method for creation of dna cluster arrays |
| CN101495657B (zh) * | 2006-07-31 | 2016-08-10 | 毕万里 | 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸 |
| EP2049682A2 (en) * | 2006-07-31 | 2009-04-22 | Illumina Cambridge Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
| US20100137155A1 (en) * | 2006-08-08 | 2010-06-03 | Sharp Kabuchiki Kaisha | Biosensor, method for fabricating the same, detecting method utilizing the same |
| JP5244103B2 (ja) | 2006-08-09 | 2013-07-24 | ホームステッド クリニカル コーポレイション | 器官特異的蛋白質およびその使用方法 |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| WO2008045158A1 (en) | 2006-10-10 | 2008-04-17 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization |
| WO2008069906A2 (en) * | 2006-11-14 | 2008-06-12 | The Regents Of The University Of California | Digital expression of gene analysis |
| US8315817B2 (en) | 2007-01-26 | 2012-11-20 | Illumina, Inc. | Independently removable nucleic acid sequencing system and method |
| US12497656B2 (en) | 2007-01-26 | 2025-12-16 | Illumina, Inc. | Independently removable nucleic acid sequencing system and method |
| ATE521948T1 (de) * | 2007-01-26 | 2011-09-15 | Illumina Inc | System und verfahren zur nukleinsäuresequenzierung |
| WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2008096146A1 (en) | 2007-02-07 | 2008-08-14 | Solexa Limited | Preparation of templates for methylation analysis |
| US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| JP2010529862A (ja) * | 2007-06-16 | 2010-09-02 | スカラブ ゲノミクス， エルエルシー | 核酸パッケージングシステム |
| WO2008157640A2 (en) * | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Illumina, Inc. | Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates |
| JP2009000070A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Hitachi Ltd | 大規模並列核酸分析方法 |
| US8759077B2 (en) | 2007-08-28 | 2014-06-24 | Lightspeed Genomics, Inc. | Apparatus for selective excitation of microparticles |
| US8222040B2 (en) * | 2007-08-28 | 2012-07-17 | Lightspeed Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles |
| US20090093378A1 (en) * | 2007-08-29 | 2009-04-09 | Helen Bignell | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2009029728A1 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-05 | Applied Biosystems Inc. | Alternative nucleic acid sequencing methods |
| US8716190B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-05-06 | Affymetrix, Inc. | Amplification and analysis of selected targets on solid supports |
| US9388457B2 (en) | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
| US7767441B2 (en) * | 2007-10-25 | 2010-08-03 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
| US7811810B2 (en) | 2007-10-25 | 2010-10-12 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
| JP2009178159A (ja) | 2007-11-05 | 2009-08-13 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板 |
| US8202691B2 (en) * | 2008-01-25 | 2012-06-19 | Illumina, Inc. | Uniform fragmentation of DNA using binding proteins |
| US12060554B2 (en) | 2008-03-10 | 2024-08-13 | Illumina, Inc. | Method for selecting and amplifying polynucleotides |
| US8039817B2 (en) | 2008-05-05 | 2011-10-18 | Illumina, Inc. | Compensator for multiple surface imaging |
| EP2294214A2 (en) * | 2008-05-07 | 2011-03-16 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for providing substances to and from an array |
| US8407012B2 (en) * | 2008-07-03 | 2013-03-26 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods and systems of DNA sequencing |
| WO2010004695A1 (ja) | 2008-07-09 | 2010-01-14 | パナソニック株式会社 | シークエンサー |
| WO2010021936A1 (en) * | 2008-08-16 | 2010-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Digital pcr calibration for high throughput sequencing |
| US8583380B2 (en) | 2008-09-05 | 2013-11-12 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| WO2010038042A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Illumina Cambridge Ltd. | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| US20100087325A1 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-08 | Illumina, Inc. | Biological sample temperature control system and method |
| WO2010062775A2 (en) | 2008-11-03 | 2010-06-03 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting modification resistant nucleic acids |
| US8628927B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-14 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US9528160B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-12-27 | Adaptive Biotechnolgies Corp. | Rare clonotypes and uses thereof |
| US9506119B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-11-29 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of sequence determination using sequence tags |
| US9365901B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-06-14 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia |
| US9394567B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis |
| US8748103B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-06-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| EP2364368B1 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-15 | Sequenta, Inc. | Methods of monitoring conditions by sequence analysis |
| US8691510B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-04-08 | Sequenta, Inc. | Sequence analysis of complex amplicons |
| WO2010068702A2 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for hybridizing nucleic acids |
| EP2607496B1 (en) * | 2008-12-23 | 2014-07-16 | Illumina, Inc. | Methods useful in nucleic acid sequencing protocols |
| DK3059337T3 (da) | 2009-01-15 | 2019-07-22 | Adaptive Biotechnologies Corp | Adaptive immunity profiling og metoder til frembringelse af monoklonale antibodier |
| US20100216648A1 (en) | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Febit Holding Gmbh | Synthesis of sequence-verified nucleic acids |
| JP5600880B2 (ja) * | 2009-03-03 | 2014-10-08 | 東洋紡株式会社 | 改良された増幅試薬 |
| JP5239978B2 (ja) * | 2009-03-23 | 2013-07-17 | パナソニック株式会社 | センサおよびシーケンサー |
| US20100285970A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-11-11 | Rose Floyd D | Methods of sequencing nucleic acids |
| CN104404134B (zh) * | 2009-04-03 | 2017-05-10 | 莱弗斯基因股份有限公司 | 多重核酸检测方法和系统 |
| EP2425240A4 (en) | 2009-04-30 | 2012-12-12 | Good Start Genetics Inc | METHOD AND COMPOSITION FOR EVALUATING GENETIC MARKERS |
| US12129514B2 (en) | 2009-04-30 | 2024-10-29 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
| WO2010127186A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
| EP2248914A1 (en) | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
| US9309566B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification |
| US9309557B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| US9334531B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-05-10 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| RU2014144463A (ru) | 2009-06-25 | 2015-06-20 | Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер | Способ измерения адаптивного иммунитета |
| US10036063B2 (en) | 2009-07-24 | 2018-07-31 | Illumina, Inc. | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
| US20110040081A1 (en) * | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Epicentre Technologies Corporation | METHODS, COMPOSITIONS, AND KITS FOR GENERATING rRNA-DEPLETED SAMPLES OR ISOLATING rRNA FROM SAMPLES |
| ES2595055T3 (es) | 2009-08-25 | 2016-12-27 | Illumina, Inc. | Métodos para seleccionar y amplificar polinucleótidos |
| US8182994B2 (en) | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| US10385391B2 (en) * | 2009-09-22 | 2019-08-20 | President And Fellows Of Harvard College | Entangled mate sequencing |
| EP2957641B1 (en) | 2009-10-15 | 2017-05-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| US8524450B2 (en) | 2009-10-30 | 2013-09-03 | Illumina, Inc. | Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same |
| CN102648295B (zh) | 2009-12-07 | 2017-08-08 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于多重基因分型的多样品索引 |
| US10388403B2 (en) | 2010-01-19 | 2019-08-20 | Verinata Health, Inc. | Analyzing copy number variation in the detection of cancer |
| AU2010343277B2 (en) | 2010-01-19 | 2015-05-28 | Verinata Health, Inc. | Method for determining copy number variations |
| US9260745B2 (en) | 2010-01-19 | 2016-02-16 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| WO2011091046A1 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Verinata Health, Inc. | Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing |
| AU2011207561B2 (en) | 2010-01-19 | 2014-02-20 | Verinata Health, Inc. | Partition defined detection methods |
| US20120100548A1 (en) | 2010-10-26 | 2012-04-26 | Verinata Health, Inc. | Method for determining copy number variations |
| US9323888B2 (en) | 2010-01-19 | 2016-04-26 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| US20120010085A1 (en) | 2010-01-19 | 2012-01-12 | Rava Richard P | Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples |
| US9499814B2 (en) * | 2010-01-22 | 2016-11-22 | The Regents Of The University Of California | Methods for identifying drug effects on a cell by determining changes in the cell's spliced message profile |
| US20110312503A1 (en) | 2010-01-23 | 2011-12-22 | Artemis Health, Inc. | Methods of fetal abnormality detection |
| EP2539464B1 (en) | 2010-02-23 | 2016-11-16 | Illumina, Inc. | Amplification methods to minimise sequence specific bias |
| DE202011003570U1 (de) | 2010-03-06 | 2012-01-30 | Illumina, Inc. | Systeme und Vorrichtungen zum Detektieren optischer Signale aus einer Probe |
| US9465228B2 (en) | 2010-03-19 | 2016-10-11 | Optical Biosystems, Inc. | Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns |
| US8502867B2 (en) | 2010-03-19 | 2013-08-06 | Lightspeed Genomics, Inc. | Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| AU2011237729B2 (en) | 2010-04-05 | 2014-04-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| SG10201503540QA (en) * | 2010-05-06 | 2015-06-29 | Ibis Biosciences Inc | Integrated sample preparation systems and stabilized enzyme mixtures |
| WO2011139372A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Sequenta, Inc. | Sequence analysis of complex amplicons |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US12152275B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-11-26 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US12221653B2 (en) | 2010-05-18 | 2025-02-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US8825412B2 (en) | 2010-05-18 | 2014-09-02 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| CA2801039A1 (en) | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Enumeration of nucleic acids |
| US9353412B2 (en) | 2010-06-18 | 2016-05-31 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
| CN103069006A (zh) | 2010-07-23 | 2013-04-24 | 艾索特里克斯遗传实验室有限责任公司 | 区别表达的胚胎或母源基因组区的鉴定及其用途 |
| US9029103B2 (en) | 2010-08-27 | 2015-05-12 | Illumina Cambridge Limited | Methods for sequencing polynucleotides |
| EP2426214A1 (en) | 2010-09-01 | 2012-03-07 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Method for amplifying nucleic acids |
| CA2811294C (en) | 2010-09-16 | 2016-06-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Stabilization of ozone-labile fluorescent dyes by thiourea |
| RU2565550C2 (ru) | 2010-09-24 | 2015-10-20 | Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити | Прямой захват, амплификация и секвенирование днк-мишени с использованием иммобилизированных праймеров |
| US8759038B2 (en) | 2010-09-29 | 2014-06-24 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
| US10233501B2 (en) | 2010-10-19 | 2019-03-19 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| US20150218639A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-06 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| EA022475B1 (ru) * | 2010-10-19 | 2016-01-29 | Ооо "Центр Инновационных Технологий-Нано" | Способ секвенирования днк |
| US20150225792A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-13 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| US10093981B2 (en) | 2010-10-19 | 2018-10-09 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| WO2012055929A1 (en) | 2010-10-26 | 2012-05-03 | Illumina, Inc. | Sequencing methods |
| EP2632593B1 (en) | 2010-10-27 | 2021-09-29 | Illumina, Inc. | Flow cells for biological or chemical analysis |
| US8575071B2 (en) | 2010-11-03 | 2013-11-05 | Illumina, Inc. | Reducing adapter dimer formation |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| EP2643484A4 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-16 | Univ California | METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN |
| CN110079588B (zh) | 2010-12-17 | 2024-03-15 | 生命技术公司 | 用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒 |
| US20120152743A1 (en) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | General Electric Company | Method for electroeluting genetic material from dried samples |
| JP5616773B2 (ja) | 2010-12-21 | 2014-10-29 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置 |
| EP2656263B1 (en) | 2010-12-22 | 2019-11-06 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
| SG191409A1 (en) | 2010-12-27 | 2013-08-30 | Ibis Biosciences Inc | Nucleic acid sample preparation methods and compositions |
| US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
| WO2012100194A1 (en) | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Microfluidic transducer |
| WO2012106546A2 (en) | 2011-02-02 | 2012-08-09 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Massively parallel continguity mapping |
| US20130344540A1 (en) * | 2011-02-03 | 2013-12-26 | Mark T. Reed | Methods for minimizing sequence specific bias |
| JP6153874B2 (ja) | 2011-02-09 | 2017-06-28 | ナテラ， インコーポレイテッド | 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法 |
| CN108220297A (zh) | 2011-03-09 | 2018-06-29 | 细胞信号科技公司 | 用于生成单克隆抗体的方法和试剂 |
| EP3456844B1 (en) | 2011-04-12 | 2020-06-10 | Verinata Health, Inc. | Resolving genome fractions using polymorphism counts |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| GB2484764B (en) | 2011-04-14 | 2012-09-05 | Verinata Health Inc | Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies |
| US9411937B2 (en) | 2011-04-15 | 2016-08-09 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| AU2012242847B2 (en) | 2011-04-15 | 2017-01-19 | The Johns Hopkins University | Safe sequencing system |
| US8778848B2 (en) | 2011-06-09 | 2014-07-15 | Illumina, Inc. | Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis |
| KR102003660B1 (ko) | 2011-07-13 | 2019-07-24 | 더 멀티플 마이얼로머 리서치 파운데이션, 인크. | 데이터 수집 및 분배 방법 |
| WO2013022778A1 (en) | 2011-08-05 | 2013-02-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing by electrochemical detection |
| US10385475B2 (en) | 2011-09-12 | 2019-08-20 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Random array sequencing of low-complexity libraries |
| EP3623481B1 (en) | 2011-09-23 | 2021-08-25 | Illumina, Inc. | Compositions for nucleic acid sequencing |
| US10152569B2 (en) | 2011-09-26 | 2018-12-11 | Gen-Probe Incorporated | Algorithms for sequence determinations |
| EP2768983A4 (en) | 2011-10-17 | 2015-06-03 | Good Start Genetics Inc | METHODS OF IDENTIFYING MUTATIONS ASSOCIATED WITH DISEASES |
| SG10201510189WA (en) | 2011-10-19 | 2016-01-28 | Nugen Technologies Inc | Compositions And Methods For Directional Nucleic Acid Amplification And Sequencing |
| US9279159B2 (en) | 2011-10-21 | 2016-03-08 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| WO2013063308A1 (en) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | University Of Massachusetts | An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom |
| CA3003082C (en) | 2011-10-28 | 2020-12-15 | Illumina, Inc. | Microarray fabrication system and method |
| US9708649B2 (en) | 2011-10-31 | 2017-07-18 | Hitachi High-Technologies Corporation | Method and substrate for nucleic acid amplification, and method and apparatus for nucleic acid analysis |
| EP3388535B1 (en) | 2011-12-09 | 2021-03-24 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection |
| US9499865B2 (en) | 2011-12-13 | 2016-11-22 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| US20130189679A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-07-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Pseudogenes and uses thereof |
| WO2013096838A2 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids |
| ES2645418T3 (es) | 2011-12-22 | 2017-12-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplificación de una secuencia de un ácido ribonucleico |
| EP3211100A1 (en) | 2011-12-22 | 2017-08-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplification primers and methods |
| US9334491B2 (en) | 2011-12-22 | 2016-05-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples |
| WO2013096819A2 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule positioning by electrical potential |
| WO2013102091A1 (en) | 2011-12-28 | 2013-07-04 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid ligation systems and methods |
| US9823246B2 (en) | 2011-12-28 | 2017-11-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon |
| WO2013102081A2 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule delivery to nanowells |
| WO2013101741A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular, Inc. | Channels with cross-sectional thermal gradients |
| EP2802673B1 (en) | 2012-01-09 | 2019-07-03 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| CN108611398A (zh) | 2012-01-13 | 2018-10-02 | Data生物有限公司 | 通过新一代测序进行基因分型 |
| SG11201404243WA (en) | 2012-01-26 | 2014-08-28 | Nugen Technologies Inc | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
| WO2013117595A2 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Illumina Cambridge Limited | Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support |
| HUE053360T2 (hu) | 2012-02-17 | 2021-06-28 | Hutchinson Fred Cancer Res | Kompozíciók és eljárások mutációk pontos azonosítására |
| US9506117B2 (en) | 2012-02-21 | 2016-11-29 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| DK2823060T3 (en) | 2012-03-05 | 2018-05-28 | Adaptive Biotechnologies Corp | Determination of associated immune receptor chains from frequency-matched subunits |
| NO2694769T3 (cs) | 2012-03-06 | 2018-03-03 | ||
| AU2013229151A1 (en) | 2012-03-06 | 2014-09-25 | Aarhus University | Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer |
| US9803239B2 (en) | 2012-03-29 | 2017-10-31 | Complete Genomics, Inc. | Flow cells for high density array chips |
| US20130261984A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Illumina, Inc. | Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities |
| WO2013152114A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Biomarker associated with irritable bowel syndrome and crohn's disease |
| CA3138752C (en) | 2012-04-03 | 2024-02-06 | Illumina, Inc. | Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing |
| US8209130B1 (en) | 2012-04-04 | 2012-06-26 | Good Start Genetics, Inc. | Sequence assembly |
| US8812422B2 (en) | 2012-04-09 | 2014-08-19 | Good Start Genetics, Inc. | Variant database |
| US20130274148A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Illumina, Inc. | Portable genetic detection and analysis system and method |
| US10227635B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-12 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Capture reactions |
| EP3438286B1 (en) | 2012-05-02 | 2020-10-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequencing |
| US20150133310A1 (en) | 2012-05-02 | 2015-05-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing systems and methods |
| ES2683707T3 (es) | 2012-05-02 | 2018-09-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Secuenciación de ADN |
| ES2833524T3 (es) | 2012-05-02 | 2021-06-15 | Ibis Biosciences Inc | Secuenciación de ADN |
| EP3091089B1 (en) | 2012-05-08 | 2019-01-23 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions |
| US9012022B2 (en) | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
| US8895249B2 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-25 | Illumina, Inc. | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| JP6181751B2 (ja) | 2012-06-18 | 2017-08-16 | ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法 |
| WO2014005076A2 (en) | 2012-06-29 | 2014-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and biomarkers for detection of kidney disorders |
| WO2014008448A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Quantitative assessment of human t-cell repertoire recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation |
| US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
| EP2875173B1 (en) | 2012-07-17 | 2017-06-28 | Counsyl, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
| US9092401B2 (en) | 2012-10-31 | 2015-07-28 | Counsyl, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
| US9977861B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes |
| JP6367196B2 (ja) | 2012-08-14 | 2018-08-01 | テンエックス・ジェノミクス・インコーポレイテッド | マイクロカプセル組成物および方法 |
| US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9422602B2 (en) | 2012-08-15 | 2016-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for determining nucleic acid degradation |
| NL2017959B1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-19 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| US20140100126A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-04-10 | Natera, Inc. | Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data |
| CA3040684C (en) | 2012-08-20 | 2023-02-07 | Hod Finkelstein | Method and system for fluorescence lifetime based sequencing |
| LT2897978T (lt) | 2012-09-19 | 2017-06-12 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Antikūnų su sumažintu imunogeniškumu identifikavimo būdas |
| US20160002731A1 (en) | 2012-10-01 | 2016-01-07 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
| ES2701750T3 (es) | 2012-10-16 | 2019-02-25 | Abbott Molecular Inc | Procedimientos para secuenciar un ácido nucleico |
| US9593365B2 (en) | 2012-10-17 | 2017-03-14 | Spatial Transcriptions Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| US10150996B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-12-11 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| US9365896B2 (en) | 2012-10-19 | 2016-06-14 | Agilent Technologies, Inc. | Addition of an adaptor by invasive cleavage |
| US9410173B2 (en) | 2012-10-24 | 2016-08-09 | Clontech Laboratories, Inc. | Template switch-based methods for producing a product nucleic acid |
| ES2701742T3 (es) | 2012-10-29 | 2019-02-25 | Univ Johns Hopkins | Prueba de Papanicolaou para cánceres de ovario y de endometrio |
| CA2892043C (en) | 2012-11-21 | 2022-01-11 | Courtagen Life Sciences Inc. | A method of removing amplicons of a non-target nucleic acid having one or more methylated cytosines from a sample |
| EP3567116A1 (en) | 2012-12-14 | 2019-11-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| WO2014113204A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
| KR102190198B1 (ko) | 2013-02-08 | 2020-12-14 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 폴리뉴클레오티드 바코드 생성 |
| US9512422B2 (en) | 2013-02-26 | 2016-12-06 | Illumina, Inc. | Gel patterned surfaces |
| WO2014135223A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Illumina Cambridge Ltd | Rhodamine compounds and their use as fluorescent labels |
| EP2964612B1 (en) | 2013-03-08 | 2017-02-01 | Illumina Cambridge Limited | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| EP3553175B1 (en) | 2013-03-13 | 2021-07-14 | Illumina, Inc. | Method of preparing a nucleic acid sequencing library |
| US20160023208A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-28 | Illumina, Inc. | Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication |
| WO2014160233A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Abbott Molecular Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids |
| ES2732012T3 (es) | 2013-03-14 | 2019-11-20 | Abbott Molecular Inc | Minimización de errores utilizando uracil-ADN-N-glicosilasa |
| US8778609B1 (en) | 2013-03-14 | 2014-07-15 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for analyzing nucleic acids |
| JP2016512437A (ja) | 2013-03-14 | 2016-04-28 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | 多重メチル化特異的増幅システムおよび方法 |
| EP2971154A4 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid control panels |
| US10428379B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleotide analogs for sequencing |
| US9255265B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-09 | Illumina, Inc. | Methods for producing stranded cDNA libraries |
| WO2014144092A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
| CN105358709B (zh) | 2013-03-15 | 2018-12-07 | 雅培分子公司 | 用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法 |
| US20160153029A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-06-02 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequences to assess contamination in dna sequencing |
| EP2971071B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-02-28 | Illumina, Inc. | Enzyme-linked nucleotides |
| SG11201508193TA (en) | 2013-04-17 | 2015-11-27 | Agency Science Tech & Res | Method for generating extended sequence reads |
| EP2986762B1 (en) | 2013-04-19 | 2019-11-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
| EP3005200A2 (en) | 2013-06-03 | 2016-04-13 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and systems for storing sequence read data |
| DK3013983T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-03-06 | Prognosys Biosciences Inc | Spatialt kodede biologiske assays ved brug af en mikrofluidisk anordning |
| MX363806B (es) | 2013-07-01 | 2019-04-03 | Illumina Inc | Funcionalización de superficies sin catalizador e injerto de polímeros.. |
| US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
| EP3241913B1 (en) | 2013-07-03 | 2019-02-20 | Illumina, Inc. | System for sequencing by orthogonal synthesis |
| US10392670B2 (en) | 2013-07-25 | 2019-08-27 | Dch Molecular Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for detecting bacterial contamination |
| TWI707038B (zh) | 2013-08-05 | 2020-10-11 | 美商扭轉生物科技有限公司 | 重新合成之基因庫 |
| FI3030645T3 (fi) | 2013-08-08 | 2023-02-10 | Fluidijärjestelmä reagenssien toimittamiseen virtauskennoon | |
| US20150051088A1 (en) | 2013-08-19 | 2015-02-19 | Abbott Molecular Inc. | Next-generation sequencing libraries |
| JP2016539343A (ja) | 2013-08-30 | 2016-12-15 | イルミナ インコーポレイテッド | 親水性または斑状親水性表面上の液滴の操作 |
| EP3039161B1 (en) | 2013-08-30 | 2021-10-06 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genomic analysis |
| US10395758B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Sequencing methods |
| US9352315B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-05-31 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure |
| GB2535066A (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Personalis Inc | Methods for analyzing genotypes |
| CA2923812C (en) | 2013-10-17 | 2023-10-17 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same |
| EP3572527B1 (en) | 2013-10-17 | 2021-05-26 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries |
| WO2015057565A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for assessing a genomic region of a subject |
| US10851414B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-12-01 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for determining carrier status |
| AU2014334531B2 (en) | 2013-10-18 | 2019-05-16 | The Regents Of The University Of Michigan | Systems and methods for determining a treatment course of action |
| US10415083B2 (en) | 2013-10-28 | 2019-09-17 | The Translational Genomics Research Institute | Long insert-based whole genome sequencing |
| CA2929596C (en) | 2013-11-13 | 2022-07-05 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
| EP3080268A1 (en) | 2013-12-09 | 2016-10-19 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
| CN110411998B (zh) | 2013-12-10 | 2022-06-07 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于生物或化学分析的生物传感器及其制造方法 |
| WO2015089438A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Northwestern University | Biomarkers for post-traumatic stress states |
| EP3083700B1 (en) | 2013-12-17 | 2023-10-11 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Detection of an antibody against a pathogen |
| US9719136B2 (en) | 2013-12-17 | 2017-08-01 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same |
| WO2015095291A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Illumina, Inc. | Substrates comprising nano-patterning surfaces and methods of preparing thereof |
| US10246746B2 (en) | 2013-12-20 | 2019-04-02 | Illumina, Inc. | Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic DNA samples |
| US10537889B2 (en) | 2013-12-31 | 2020-01-21 | Illumina, Inc. | Addressable flow cell using patterned electrodes |
| WO2015108663A1 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Illumina, Inc. | Amplicon preparation and sequencing on solid supports |
| WO2015107430A2 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| US9677132B2 (en) | 2014-01-16 | 2017-06-13 | Illumina, Inc. | Polynucleotide modification on solid support |
| JP7011392B2 (ja) | 2014-02-18 | 2022-01-26 | イラミーナ インコーポレーテッド | Ｄｎａプロファイリングのための方法および組成物 |
| US9745614B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-08-29 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
| WO2015134787A2 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods using randomer-containing synthetic molecules |
| US11390921B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs) |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| CA2943624A1 (en) | 2014-04-10 | 2015-10-15 | 10X Genomics, Inc. | Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same |
| CN113774132A (zh) | 2014-04-21 | 2021-12-10 | 纳特拉公司 | 检测染色体片段中的突变和倍性 |
| WO2015175530A1 (en) | 2014-05-12 | 2015-11-19 | Gore Athurva | Methods for detecting aneuploidy |
| ES2876432T3 (es) | 2014-05-16 | 2021-11-12 | Illumina Inc | Técnicas de síntesis de ácidos nucleicos |
| CA2949984C (en) | 2014-05-27 | 2021-10-19 | Illumina, Inc. | Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge |
| US20180173846A1 (en) | 2014-06-05 | 2018-06-21 | Natera, Inc. | Systems and Methods for Detection of Aneuploidy |
| GB201410022D0 (en) | 2014-06-05 | 2014-07-16 | Orion Diagnostica Oy | Method |
| LT3669985T (lt) | 2014-06-05 | 2022-06-10 | Illumina, Inc. | Sistemos, įskaitant sukamąjį vožtuvą, skirtos bent vieno mėginio paruošimui arba mėginio analizei |
| US10760109B2 (en) | 2014-06-06 | 2020-09-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease |
| US20150353989A1 (en) | 2014-06-09 | 2015-12-10 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation for nucleic acid amplification |
| GB201410420D0 (en) | 2014-06-11 | 2014-07-23 | Illumina Cambridge Ltd | Methods for estimating cluster numbers |
| WO2015189636A1 (en) | 2014-06-13 | 2015-12-17 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for preparing sequencing libraries |
| GB201410646D0 (en) | 2014-06-14 | 2014-07-30 | Illumina Cambridge Ltd | Methods of increasing sequencing accuracy |
| EP3919621A1 (en) | 2014-06-23 | 2021-12-08 | The General Hospital Corporation | Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq) |
| WO2015200541A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital pcr barcoding |
| WO2015200869A1 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| JP2017526046A (ja) | 2014-06-26 | 2017-09-07 | １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド | 核酸配列アセンブルのプロセス及びシステム |
| EP4574974A3 (en) | 2014-06-26 | 2025-10-08 | 10x Genomics, Inc. | Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations |
| US12312640B2 (en) | 2014-06-26 | 2025-05-27 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| US10017759B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-07-10 | Illumina, Inc. | Library preparation of tagged nucleic acid |
| WO2015200833A2 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Abbott Laboratories | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING HUMAN PEGIVIRUS 2 (HPgV-2) |
| WO2016003814A1 (en) | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Illumina, Inc. | Methods and compositions using one-sided transposition |
| RU2697502C2 (ru) | 2014-07-24 | 2019-08-14 | Эбботт Молекьюлар Инк. | Композиции и способы обнаружения и анализа микобактерии туберкулеза (mycobacterium tuberculosis) |
| EP4219710A3 (en) | 2014-08-01 | 2023-08-16 | Dovetail Genomics, LLC | Tagging nucleic acids for sequence assembly |
| CN107075581B (zh) | 2014-08-06 | 2022-03-18 | 纽亘技术公司 | 由靶向测序进行数字测量 |
| CA2956723C (en) | 2014-08-12 | 2023-04-11 | Nextgen Jane, Inc. | System and method for monitoring health based on collected bodily fluid |
| US10174383B2 (en) | 2014-08-13 | 2019-01-08 | Vanadis Diagnostics | Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample |
| WO2016025818A1 (en) | 2014-08-15 | 2016-02-18 | Good Start Genetics, Inc. | Systems and methods for genetic analysis |
| EP3183577B1 (en) | 2014-08-21 | 2020-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Reversible surface functionalization |
| US11408024B2 (en) | 2014-09-10 | 2022-08-09 | Molecular Loop Biosciences, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
| WO2016040602A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Epicentre Technologies Corporation | Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv |
| WO2016044391A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Sequencing by synthesis using pulse read optics |
| JP6802154B2 (ja) | 2014-09-18 | 2020-12-16 | イラミーナ インコーポレーテッド | 核酸シーケンシングデータを解析するための方法およびシステム |
| JP2017536087A (ja) | 2014-09-24 | 2017-12-07 | グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド | 遺伝子アッセイのロバストネスを増大させるためのプロセス制御 |
| US10040048B1 (en) | 2014-09-25 | 2018-08-07 | Synthego Corporation | Automated modular system and method for production of biopolymers |
| KR20170066540A (ko) | 2014-10-09 | 2017-06-14 | 일루미나, 인코포레이티드 | 액체 중 적어도 하나를 효과적으로 격리시키기 위해 비혼화성 액체를 분리하기 위한 방법 및 디바이스 |
| JP6808617B2 (ja) | 2014-10-17 | 2021-01-06 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 連続性を維持した転位 |
| WO2016069939A1 (en) | 2014-10-29 | 2016-05-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
| CA2966201A1 (en) | 2014-10-29 | 2016-05-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples |
| US10125399B2 (en) | 2014-10-30 | 2018-11-13 | Personalis, Inc. | Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin |
| CN114805710B (zh) | 2014-10-31 | 2023-11-17 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 聚合物以及dna共聚物涂层 |
| GB201419731D0 (en) | 2014-11-05 | 2014-12-17 | Illumina Cambridge Ltd | Sequencing from multiple primers to increase data rate and density |
| US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
| WO2016073778A2 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Nirmidas Biotech, Inc. | Metal composites for enhanced imaging |
| CN107109495B (zh) | 2014-11-11 | 2021-12-24 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
| WO2016077426A1 (en) | 2014-11-11 | 2016-05-19 | Abbott Molecular Inc. | Hybridization probes and methods |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| US11789906B2 (en) | 2014-11-19 | 2023-10-17 | Arc Bio, Llc | Systems and methods for genomic manipulations and analysis |
| US10233490B2 (en) | 2014-11-21 | 2019-03-19 | Metabiotech Corporation | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
| EP3224384A4 (en) | 2014-11-25 | 2018-04-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing |
| US20180127804A1 (en) | 2014-12-05 | 2018-05-10 | Amyris, Inc. | High-throughput sequencing of polynucleotides |
| US10066259B2 (en) | 2015-01-06 | 2018-09-04 | Good Start Genetics, Inc. | Screening for structural variants |
| CN107427808B (zh) | 2015-01-12 | 2020-10-23 | 10X基因组学有限公司 | 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库 |
| WO2016115273A1 (en) | 2015-01-13 | 2016-07-21 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information |
| WO2016126987A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Compositions and methods for synthetic gene assembly |
| WO2016126882A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
| CN107208156B (zh) | 2015-02-09 | 2021-10-08 | 10X基因组学有限公司 | 用于使用变异识别数据来确定结构变异和定相的系统和方法 |
| CN107250383B (zh) | 2015-02-17 | 2022-09-06 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 使用受控的链置换的dna序列测定 |
| US10208339B2 (en) | 2015-02-19 | 2019-02-19 | Takara Bio Usa, Inc. | Systems and methods for whole genome amplification |
| WO2016134342A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Wafergen, Inc. | Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells |
| EP3262407B1 (en) | 2015-02-24 | 2023-08-30 | 10X Genomics, Inc. | Partition processing methods and systems |
| US11047008B2 (en) | 2015-02-24 | 2021-06-29 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing |
| CN107532202A (zh) | 2015-02-24 | 2018-01-02 | 10X 基因组学有限公司 | 用于靶向核酸序列覆盖的方法 |
| US9976174B2 (en) | 2015-03-24 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis |
| US20180100192A1 (en) | 2015-03-31 | 2018-04-12 | lllumina Cambridge Limited | Surface concatemerization of templates |
| WO2016161273A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
| CN120425026A (zh) | 2015-04-10 | 2025-08-05 | 十程基因技术瑞典公司 | 生物样本的空间区别、多重核酸分析 |
| AU2016250281A1 (en) | 2015-04-15 | 2017-10-26 | The General Hospital Corporation | LNA-based mutant enrichment next-generation sequencing assays |
| US9981239B2 (en) | 2015-04-21 | 2018-05-29 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
| WO2016170179A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support |
| ES2961374T3 (es) | 2015-04-24 | 2024-03-11 | Atila Biosystems Incorporated | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada |
| US11085073B2 (en) | 2015-04-24 | 2021-08-10 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support |
| US10844428B2 (en) | 2015-04-28 | 2020-11-24 | Illumina, Inc. | Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS) |
| DK3294906T3 (en) | 2015-05-11 | 2024-08-05 | Natera Inc | Methods for determining ploidy |
| JP2018518157A (ja) | 2015-05-11 | 2018-07-12 | イラミーナ インコーポレーテッド | 治療薬剤の発見および分析のためのプラットフォーム |
| US10395759B2 (en) * | 2015-05-18 | 2019-08-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for copy number variant detection |
| US20170016041A1 (en) * | 2015-05-18 | 2017-01-19 | 10X Genomics, Inc. | Stabilized reducing agents and methods using same |
| GB201508858D0 (en) | 2015-05-22 | 2015-07-01 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels |
| KR102134953B1 (ko) | 2015-05-29 | 2020-07-16 | 일루미나, 인코포레이티드 | 지정된 반응을 수행하기 위한 샘플 캐리어 및 검정 시스템 |
| US11274333B2 (en) | 2015-05-29 | 2022-03-15 | Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) LLC | Compositions and methods for preparing sequencing libraries |
| JP6609641B2 (ja) | 2015-05-29 | 2019-11-20 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | クラスターにおける表面プライマーの高度な利用 |
| CN107924121B (zh) | 2015-07-07 | 2021-06-08 | 亿明达股份有限公司 | 经由纳米压印的选择性表面图案化 |
| EP3322483A4 (en) | 2015-07-14 | 2019-01-02 | Abbott Molecular Inc. | Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis |
| CA2992449A1 (en) | 2015-07-14 | 2017-01-19 | Abbott Molecular Inc. | Purification of nucleic acids using copper-titanium oxides |
| WO2017015018A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-26 | Illumina, Inc. | Polymer sheets for sequencing applications |
| WO2017015543A1 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | Asuragen, Inc. | Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments |
| AU2016298541B2 (en) | 2015-07-30 | 2019-10-31 | Illumina, Inc. | Orthogonal deblocking of nucleotides |
| AU2016301354B2 (en) | 2015-08-06 | 2022-06-30 | Arc Bio, Llc | Systems and methods for genomic analysis |
| WO2017027653A1 (en) | 2015-08-11 | 2017-02-16 | The Johns Hopkins University | Assaying ovarian cyst fluid |
| CN108474805A (zh) | 2015-08-24 | 2018-08-31 | 亿明达股份有限公司 | 用于生物和化学测定的线路内蓄压器和流量控制系统 |
| CN107921432A (zh) | 2015-09-02 | 2018-04-17 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 改善流控系统中的液滴操作的系统和方法 |
| WO2017042040A1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-16 | Qiagen Gmbh | Polymerase enzyme |
| CN108350453A (zh) | 2015-09-11 | 2018-07-31 | 通用医疗公司 | 核酸酶dsb的完全查询和测序(find-seq) |
| KR20180050411A (ko) | 2015-09-18 | 2018-05-14 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성 |
| CN108698012A (zh) | 2015-09-22 | 2018-10-23 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于核酸合成的柔性基底 |
| GB201516987D0 (en) | 2015-09-25 | 2015-11-11 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| JP2018529353A (ja) | 2015-09-30 | 2018-10-11 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ） |
| US10253352B2 (en) | 2015-11-17 | 2019-04-09 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
| US11371094B2 (en) | 2015-11-19 | 2022-06-28 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides |
| WO2017095958A1 (en) | 2015-12-01 | 2017-06-08 | Twist Bioscience Corporation | Functionalized surfaces and preparation thereof |
| SG10202108763UA (en) | 2015-12-04 | 2021-09-29 | 10X Genomics Inc | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
| US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
| US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
| CA3007635A1 (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | Zymergen Inc. | Promoters from corynebacterium glutamicum |
| CA3007840C (en) | 2015-12-07 | 2020-09-15 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a htp genomic engineering platform |
| EP3400298B1 (en) | 2016-01-08 | 2024-03-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiple beads per droplet resolution |
| WO2017123533A1 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Illumina, Inc. | Detection apparatus having a microfluorometer, a fluidic system, and a flow cell latch clamp module |
| EP3848457B1 (en) | 2016-02-08 | 2025-08-13 | Rgene, Inc. | Multiple ligase compositions, systems, and methods |
| SG11201806757XA (en) | 2016-02-11 | 2018-09-27 | 10X Genomics Inc | Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data |
| CN109477127A (zh) | 2016-03-14 | 2019-03-15 | R基因股份有限公司 | 超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶 |
| EP3433373B1 (en) | 2016-03-22 | 2022-01-12 | Myriad Women's Health, Inc. | Combinatorial dna screening |
| PL3377226T3 (pl) | 2016-03-28 | 2021-07-26 | Illumina, Inc. | Wielopłaszczyznowe mikromacierze |
| EP3442706B1 (en) | 2016-04-13 | 2025-07-23 | NextGen Jane, Inc. | Sample collection and preservation methods |
| DK3443119T3 (da) | 2016-04-15 | 2022-05-23 | Natera Inc | Fremgangsmåde til bestemmelse af lunge cancer |
| EP3455372B1 (en) | 2016-05-11 | 2019-10-30 | Illumina, Inc. | Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems |
| WO2017197343A2 (en) | 2016-05-12 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic on-chip filters |
| WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
| US11118233B2 (en) | 2016-05-18 | 2021-09-14 | The University Of Chicago | BTK mutation and ibrutinib resistance |
| SG11201809376WA (en) | 2016-05-18 | 2018-12-28 | Illumina Inc | Self assembled patterning using patterned hydrophobic surfaces |
| US11299783B2 (en) | 2016-05-27 | 2022-04-12 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
| AU2017278350B2 (en) | 2016-06-06 | 2023-10-19 | Redvault Biosciences, Lp | Target reporter constructs and uses thereof |
| US11708574B2 (en) | 2016-06-10 | 2023-07-25 | Myriad Women's Health, Inc. | Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof |
| US10066263B2 (en) | 2016-06-17 | 2018-09-04 | California Institute Of Technology | Nucleic acid reactions and related methods and compositions |
| JP2019519242A (ja) | 2016-06-30 | 2019-07-11 | ザイマージェン インコーポレイテッド | 細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するための方法およびその使用 |
| WO2018005793A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Zymergen Inc. | Methods for generating a glucose permease library and uses thereof |
| WO2018013509A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias |
| EP3875603A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-08 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for detecting nucleic acid regions |
| CN106086203A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-11-09 | 深圳绿倍生态科技有限公司 | 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用 |
| US11460405B2 (en) | 2016-07-21 | 2022-10-04 | Takara Bio Usa, Inc. | Multi-Z imaging and dispensing with multi-well devices |
| KR102475710B1 (ko) | 2016-07-22 | 2022-12-08 | 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 | 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 및 이의 제조를 위한 조합 인덱싱 방법 |
| KR102212257B1 (ko) | 2016-08-22 | 2021-02-04 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 드 노보 합성된 핵산 라이브러리 |
| AU2017315252B2 (en) | 2016-08-22 | 2023-03-16 | Biolumic Limited | System, device and methods of seed treatment |
| WO2018042251A1 (en) | 2016-08-29 | 2018-03-08 | Oslo Universitetssykehus Hf | Chip-seq assays |
| WO2018057526A2 (en) | 2016-09-21 | 2018-03-29 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| WO2018064116A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems for data compression |
| US10385214B2 (en) | 2016-09-30 | 2019-08-20 | Illumina Cambridge Limited | Fluorescent dyes and their uses as biomarkers |
| CN109688817B (zh) * | 2016-10-03 | 2022-02-22 | Illumina公司 | 胺和肼的荧光检测及其分析方法 |
| WO2018067517A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| EP4439045A3 (en) | 2016-10-14 | 2024-11-27 | Illumina, Inc. | Cartridge assembly |
| GB201618485D0 (en) | 2016-11-02 | 2016-12-14 | Ucl Business Plc | Method of detecting tumour recurrence |
| WO2018093780A1 (en) | 2016-11-16 | 2018-05-24 | Illumina, Inc. | Validation methods and systems for sequence variant calls |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| EP3554514A4 (en) | 2016-12-16 | 2020-08-05 | Twist Bioscience Corporation | BANKS OF VARIANTS OF IMMUNOLOGICAL SYNAPSE AND THEIR SYNTHESIS |
| WO2018118971A1 (en) | 2016-12-19 | 2018-06-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna |
| US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| CN109476674B (zh) | 2016-12-22 | 2021-12-10 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途 |
| CA3048486A1 (en) | 2017-01-04 | 2018-07-12 | Complete Genomics, Inc. | Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides |
| GB201704754D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| US10844429B2 (en) | 2017-01-18 | 2020-11-24 | Illumina, Inc. | Methods and systems for generation and error-correction of unique molecular index sets with heterogeneous molecular lengths |
| EP4310183B1 (en) | 2017-01-30 | 2025-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for droplet-based single cell barcoding |
| DK3354746T3 (da) | 2017-01-30 | 2019-09-02 | Gmi Gregor Mendel Inst Fuer Molekulare Pflanzenbiologie Gmbh | Nye spike-in-nukleotider til normalisering af sekvensdata |
| US12264411B2 (en) | 2017-01-30 | 2025-04-01 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for analysis |
| US10968447B2 (en) | 2017-01-31 | 2021-04-06 | Myriad Women's Health, Inc. | Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides |
| WO2018144217A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Counsyl, Inc. | Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides |
| US10995333B2 (en) | 2017-02-06 | 2021-05-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation |
| WO2018148727A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from 9°n |
| WO2018148723A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi |
| WO2018148726A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from phage t4 |
| WO2018148724A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus |
| EP3580351A1 (en) | 2017-02-13 | 2019-12-18 | Qiagen Sciences, LLC | Polymerase enzyme from 9°n |
| US11492666B2 (en) | 2017-02-15 | 2022-11-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation |
| CN110892485B (zh) | 2017-02-22 | 2024-03-22 | 特韦斯特生物科学公司 | 基于核酸的数据存储 |
| AU2018234629A1 (en) | 2017-03-15 | 2019-10-17 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| EP3601593B1 (en) | 2017-03-24 | 2021-12-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Universal hairpin primers |
| US11584958B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-02-21 | Grail, Llc | Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification |
| US10737267B2 (en) | 2017-04-04 | 2020-08-11 | Omniome, Inc. | Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions |
| US12492430B2 (en) | 2017-04-11 | 2025-12-09 | Tecan Genomics, Inc. | Library quantitation and qualification |
| ES2893528T3 (es) | 2017-04-23 | 2022-02-09 | Illumina Cambridge Ltd | Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en colecciones de ácidos nucleicos indexadas |
| US10975430B2 (en) | 2017-04-23 | 2021-04-13 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| ES2937929T3 (es) | 2017-04-23 | 2023-04-03 | Illumina Inc | Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácido nucleico indexadas |
| AU2018259202B2 (en) | 2017-04-23 | 2022-03-24 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| US11028435B2 (en) | 2017-05-01 | 2021-06-08 | Illumina, Inc. | Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing |
| CN110832087B (zh) | 2017-05-08 | 2025-03-18 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于多核苷酸样品的索引的通用短衔接子 |
| CN110870018B (zh) | 2017-05-19 | 2024-11-22 | 10X基因组学有限公司 | 用于分析数据集的系统和方法 |
| WO2018213803A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Neon Therapeutics, Inc. | Immunogenic neoantigen identification |
| KR20200010285A (ko) | 2017-05-19 | 2020-01-30 | 지머젠 인코포레이티드 | 증가된 nadph를 유도하는 생합성 경로의 게놈 공학 |
| CN109526228B (zh) | 2017-05-26 | 2022-11-25 | 10X基因组学有限公司 | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 |
| US10844372B2 (en) | 2017-05-26 | 2020-11-24 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
| EP3635111A1 (en) | 2017-06-06 | 2020-04-15 | Zymergen, Inc. | High throughput transposon mutagenesis |
| KR20200026874A (ko) | 2017-06-06 | 2020-03-11 | 지머젠 인코포레이티드 | 대장균 개량을 위한 htp 게놈 공학 플랫폼 |
| KR20200026878A (ko) | 2017-06-06 | 2020-03-11 | 지머젠 인코포레이티드 | 균류 균주를 개량하기 위한 htp 게놈 공학 플랫폼 |
| JP7350659B2 (ja) | 2017-06-06 | 2023-09-26 | ザイマージェン インコーポレイテッド | Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａの改良のためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作プラットフォーム |
| KR102628035B1 (ko) | 2017-06-07 | 2024-01-22 | 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 | 메틸화 서열결정을 위한 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 |
| EP3634992B1 (en) | 2017-06-08 | 2024-03-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for identifying epitopes |
| WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| JP7169999B2 (ja) | 2017-06-12 | 2022-11-11 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | シームレス核酸アセンブリのための方法 |
| US11186862B2 (en) | 2017-06-20 | 2021-11-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | MDA using bead oligonucleotide |
| WO2019002265A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Universität Für Bodenkultur Wien | NOVEL BIOMARKERS FOR THE DETECTION OF SENESCENT CELLS |
| JP2020525002A (ja) | 2017-06-29 | 2020-08-27 | バイオルミック リミテッド | 作物の収量および／あるいは品質を改善する方法 |
| GB201711219D0 (en) | 2017-07-12 | 2017-08-23 | Illumina Cambridge Ltd | Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications |
| US11578180B2 (en) | 2017-07-18 | 2023-02-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Method of chemically modifying plastic surfaces |
| EP3662482A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-06-10 | Illumina Inc. | Sequencing system with multiplexed biological sample aggregation |
| FI3662083T3 (fi) | 2017-08-01 | 2024-11-20 | Illumina Inc | Geneettisen materiaalin ja kirjastovalmisteen spatiaalinen indeksointi hydrogeelihelmiä ja virtauskennoja käyttämällä |
| KR102480894B1 (ko) | 2017-08-01 | 2022-12-23 | 일루미나, 인코포레이티드 | 뉴클레오티드 서열분석용 하이드로겔 비드 |
| CN118086478A (zh) * | 2017-08-01 | 2024-05-28 | 深圳华大智造科技有限公司 | 核酸测序方法 |
| CN120400338A (zh) | 2017-08-07 | 2025-08-01 | 约翰斯霍普金斯大学 | 用于评估和治疗癌症的方法和材料 |
| JP7537746B2 (ja) | 2017-08-11 | 2024-08-21 | アティラ バイオシステムズ インコーポレイテッド | ヌクレオチド組成が限定されたプライマーを用いたデジタル増幅 |
| SG11202000964UA (en) | 2017-08-15 | 2020-02-27 | Omniome Inc | Scanning apparatus and methods useful for detection of chemical and biological analytes |
| WO2019038594A2 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Biolumic Limited | TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY |
| US20190076814A1 (en) | 2017-09-11 | 2019-03-14 | Synthego Corporation | Biopolymer synthesis system and method |
| AU2018328847A1 (en) | 2017-09-11 | 2020-04-23 | Twist Bioscience Corporation | GPCR binding proteins and synthesis thereof |
| US11447818B2 (en) | 2017-09-15 | 2022-09-20 | Illumina, Inc. | Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers |
| WO2019060640A1 (en) | 2017-09-20 | 2019-03-28 | Guardant Health, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR DIFFERENTIATING SOMATIC VARIANTS AND GERMINAL LINE VARIANTS |
| US10837047B2 (en) | 2017-10-04 | 2020-11-17 | 10X Genomics, Inc. | Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers |
| US11598780B2 (en) | 2017-10-06 | 2023-03-07 | The University Of Chicago | Engineering lymphocytes with specific alpha and beta chains on their t-cell receptor |
| KR20220031940A (ko) | 2017-10-16 | 2022-03-14 | 일루미나, 인코포레이티드 | 컨볼루션 신경망(cnn)을 사용하는 비정상 스플라이싱 검출 |
| NZ759818A (en) | 2017-10-16 | 2022-04-29 | Illumina Inc | Semi-supervised learning for training an ensemble of deep convolutional neural networks |
| GB201716931D0 (en) | 2017-10-16 | 2017-11-29 | Illumina Cambridge Ltd | New fluorescent compounds and their use as biomarkers |
| CA3079411C (en) | 2017-10-19 | 2023-12-05 | Omniome, Inc. | Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows |
| WO2019079769A1 (en) | 2017-10-20 | 2019-04-25 | Twist Bioscience Corporation | HEATED NANOWELLS FOR THE SYNTHESIS OF POLYNUCLEOTIDES |
| US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
| WO2019084043A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 10X Genomics, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS |
| CN111479631B (zh) | 2017-10-27 | 2022-02-22 | 10X基因组学有限公司 | 用于样品制备和分析的方法和系统 |
| US10907205B2 (en) | 2017-11-02 | 2021-02-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
| MX389484B (es) | 2017-11-13 | 2025-03-20 | The Multiple Myeloma Res Foundation Inc | Base de datos, de datos moleculares, omicos, de inmunoterapia, metabolicos, epigeneticos y clinicos, integrados |
| CN111051523B (zh) | 2017-11-15 | 2024-03-19 | 10X基因组学有限公司 | 功能化凝胶珠 |
| US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
| US10815484B2 (en) | 2017-11-22 | 2020-10-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating cancer |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
| WO2019108851A1 (en) | 2017-11-30 | 2019-06-06 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis |
| CN111699388B (zh) | 2017-12-12 | 2024-08-02 | 10X基因组学有限公司 | 用于单细胞处理的系统和方法 |
| WO2019118926A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | Tai Diagnostics, Inc. | Assessing graft suitability for transplantation |
| CN111712579B (zh) | 2017-12-22 | 2024-10-15 | 10X基因组学有限公司 | 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法 |
| US11701656B2 (en) | 2018-01-02 | 2023-07-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Multi-droplet capture |
| EP4715681A2 (en) | 2018-01-04 | 2026-03-25 | Atlas Data Storage, Inc. | Dna-based digital information storage |
| CA3279137A1 (en) | 2018-01-08 | 2025-10-30 | Illumina, Inc. | Systems and devices for high-throughput sequencing with semiconductor-based detection |
| WO2019136376A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Illumina, Inc. | High-throughput sequencing with semiconductor-based detection |
| EP3619653B1 (en) | 2018-01-15 | 2021-05-19 | Illumina Inc. | Deep learning-based variant classifier |
| CN111801937B8 (zh) | 2018-01-30 | 2022-10-14 | 瑞巴斯生物系统 | 用于使用结构化照射检测颗粒的方法和系统 |
| CN119614672A (zh) | 2018-01-31 | 2025-03-14 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 用于解卷积分区条码的方法和组合物 |
| CA3090102A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Dovetail Genomics, Llc | Sample prep for dna linkage recovery |
| SG11202007686VA (en) | 2018-02-12 | 2020-09-29 | 10X Genomics Inc | Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations |
| EP4253562A3 (en) | 2018-02-13 | 2023-10-25 | Illumina, Inc. | Dna sequencing using hydrogel beads |
| US11639928B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations |
| JP2021519607A (ja) | 2018-02-27 | 2021-08-12 | コーネル・ユニバーシティーＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | ゲノムワイド統合による循環腫瘍ｄｎａの超音波感受性検出 |
| WO2019169028A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | 10X Genomics, Inc. | Transcriptome sequencing through random ligation |
| CA3091228A1 (en) | 2018-03-20 | 2019-09-26 | Zymergen Inc. | A htp platform for the genetic engineering of chinese hamster ovary cells |
| KR20230128411A (ko) | 2018-03-22 | 2023-09-04 | 일루미나, 인코포레이티드 | Rna 및 dna로부터의 핵산 라이브러리의 제조 |
| JP7348603B2 (ja) | 2018-04-02 | 2023-09-21 | エニュメラ・モレキュラー・インコーポレイテッド | 核酸分子を計数するための方法、システム、および組成物 |
| CN110832086A (zh) | 2018-04-02 | 2020-02-21 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于制造用于基于序列的遗传检验的对照的组合物和方法 |
| WO2019195166A1 (en) | 2018-04-06 | 2019-10-10 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for quality control in single cell processing |
| EP3553182A1 (en) | 2018-04-11 | 2019-10-16 | Université de Bourgogne | Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection |
| US20190318806A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Illumina, Inc. | Variant Classifier Based on Deep Neural Networks |
| NL2020861B1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-22 | Illumina Inc | Variant classifier based on deep neural networks |
| US11746151B2 (en) | 2018-04-13 | 2023-09-05 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating cancer |
| DK3781714T3 (da) | 2018-04-14 | 2026-03-30 | Natera Inc | Fremgangsmåder til cancerpåvisning og -overvågning ved personlig påvisning af cirkulerende tumor-dna |
| US11512002B2 (en) | 2018-04-18 | 2022-11-29 | University Of Virginia Patent Foundation | Silica materials and methods of making thereof |
| CA3097583A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Omniome, Inc. | Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods |
| AU2019257320B2 (en) | 2018-04-20 | 2022-04-07 | Illumina, Inc. | Methods of encapsulating single cells, the encapsulated cells and uses thereof |
| WO2019209426A1 (en) | 2018-04-26 | 2019-10-31 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes |
| US12235273B2 (en) | 2018-05-04 | 2025-02-25 | Abbott Laboratories | HBV diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products |
| WO2019217758A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for molecular library generation |
| US12084474B2 (en) | 2018-05-15 | 2024-09-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for chemical cleavage and deprotection of surface-bound oligonucleotides |
| KR102640255B1 (ko) | 2018-05-17 | 2024-02-27 | 일루미나, 인코포레이티드 | 감소된 증폭 편향을 갖는 고속-대량 단일 세포 서열분석 |
| IL278771B2 (en) | 2018-05-18 | 2025-09-01 | Twist Bioscience Corp | Polynucleotides, reagents and methods for nucleic acid hybridization |
| US10801064B2 (en) | 2018-05-31 | 2020-10-13 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
| US11814750B2 (en) | 2018-05-31 | 2023-11-14 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
| AU2019276719B2 (en) | 2018-05-31 | 2025-11-13 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Increased signal to noise in nucleic acid sequencing |
| JP2021526791A (ja) | 2018-06-04 | 2021-10-11 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | セルフリー核酸の細胞起源を決定するための方法およびシステム |
| KR102507415B1 (ko) | 2018-06-04 | 2023-03-07 | 일루미나, 인코포레이티드 | 고속 대량 단일 세포 전사체 라이브러리 그리고 이의 제조 및 사용 방법 |
| US11932899B2 (en) | 2018-06-07 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules |
| US11703427B2 (en) | 2018-06-25 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for cell and bead processing |
| NL2021377B1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-08 | Illumina Inc | Interposer with first and second adhesive layers |
| US12234509B2 (en) | 2018-07-03 | 2025-02-25 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| CN110684829A (zh) * | 2018-07-05 | 2020-01-14 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒 |
| US12073922B2 (en) | 2018-07-11 | 2024-08-27 | Illumina, Inc. | Deep learning-based framework for identifying sequence patterns that cause sequence-specific errors (SSEs) |
| AU2019310041B2 (en) | 2018-07-23 | 2025-11-20 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for adjusting tumor mutational burden by tumor fraction and coverage |
| WO2020023362A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Omniome, Inc. | Serial formation of ternary complex species |
| US12188014B1 (en) | 2018-07-25 | 2025-01-07 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid processing using blocking agents |
| US20200032335A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for metabolome analysis |
| SG11202101164TA (en) | 2018-08-03 | 2021-03-30 | 10X Genomics Inc | Methods and systems to minimize barcode exchange |
| CA3109238A1 (en) | 2018-08-15 | 2020-02-20 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving library enrichment |
| CN113166807B (zh) | 2018-08-20 | 2024-06-04 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 通过分区中条码珠共定位生成核苷酸序列 |
| WO2020041148A1 (en) | 2018-08-20 | 2020-02-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for detection of protein-dna interactions using proximity ligation |
| US12065688B2 (en) | 2018-08-20 | 2024-08-20 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for cellular processing |
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| EP4603594A3 (en) | 2018-08-28 | 2025-11-12 | 10X Genomics, Inc. | Increasing spatial array resolution |
| CA3109646A1 (en) | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for detecting contamination between samples |
| SG11202101400UA (en) | 2018-08-31 | 2021-03-30 | Guardant Health Inc | Microsatellite instability detection in cell-free dna |
| JP7637615B2 (ja) | 2018-09-04 | 2025-02-28 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 無細胞核酸試料におけるアレル不均衡を検出するための方法およびシステム |
| CA3110668C (en) | 2018-09-20 | 2022-01-11 | Tamirna Gmbh | Micro-rna signatures for the prediction of liver dysfunction |
| JP6888123B2 (ja) | 2018-10-15 | 2021-06-16 | イルミナ インコーポレイテッド | 深層畳み込みニューラルネットワークを事前訓練するための深層学習ベースの技術 |
| AU2019364418B2 (en) | 2018-10-25 | 2025-11-13 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes |
| CA3113271A1 (en) | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Illumina, Inc. | Modulating polymer beads for dna processing |
| EP3874060B1 (en) | 2018-10-31 | 2024-10-16 | Guardant Health, Inc. | Method and system for calibrating epigenetic partitioning assays |
| US12139764B2 (en) | 2018-11-14 | 2024-11-12 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Systems and methods for characterizing and treating breast cancer |
| US10876148B2 (en) | 2018-11-14 | 2020-12-29 | Element Biosciences, Inc. | De novo surface preparation and uses thereof |
| US10704094B1 (en) | 2018-11-14 | 2020-07-07 | Element Biosciences, Inc. | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding |
| US10768173B1 (en) | 2019-09-06 | 2020-09-08 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| WO2020101795A1 (en) | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Omniome, Inc. | Electronic detection of nucleic acid structure |
| MX2021003771A (es) | 2018-11-30 | 2021-05-27 | Illumina Inc | Analisis de analitos multiples usando un ensayo unico. |
| CN211311438U (zh) | 2018-12-04 | 2020-08-21 | 欧姆尼欧美公司 | 流动池 |
| AU2019391274B2 (en) | 2018-12-05 | 2025-10-30 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification |
| CN113366120B (zh) * | 2018-12-07 | 2024-05-14 | 深圳华大生命科学研究院 | 纳米孔测序方法 |
| US11459607B1 (en) | 2018-12-10 | 2022-10-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes |
| US20220290217A1 (en) | 2018-12-10 | 2022-09-15 | 10X Genomics, Inc. | Resolving spatial arrays using deconvolution |
| WO2020120179A1 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Illumina Cambridge Limited | Decreasing phasing with unlabeled nucleotides during sequencing |
| JP7562424B2 (ja) | 2018-12-17 | 2024-10-07 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | シーケンシング用プライマーオリゴヌクレオチド |
| WO2020126593A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | Illumina Cambridge Limited | Compositions for use in polyunucleotide sequencing |
| JP7587425B2 (ja) | 2018-12-18 | 2024-11-20 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 単一表面プライマーを使用したペアエンドシーケンシングのための方法および組成物 |
| BR112020026667A2 (pt) | 2018-12-19 | 2021-07-27 | Illumina, Inc. | métodos para melhorar a prioridade de clonalidade do agrupamento de polinucleotídeo |
| JP2022514010A (ja) | 2018-12-20 | 2022-02-09 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 核酸分子の回収率を改善するための方法、組成物、およびシステム |
| WO2020132350A2 (en) | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Omniome, Inc. | Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes |
| US11293061B2 (en) | 2018-12-26 | 2022-04-05 | Illumina Cambridge Limited | Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group |
| WO2020139871A1 (en) | 2018-12-26 | 2020-07-02 | Twist Bioscience Corporation | Highly accurate de novo polynucleotide synthesis |
| US20220081714A1 (en) | 2019-01-04 | 2022-03-17 | Northwestern University | Storing temporal data into dna |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US12169198B2 (en) | 2019-01-08 | 2024-12-17 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for sample analysis |
| US11845983B1 (en) | 2019-01-09 | 2023-12-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for multiplexing of droplet based assays |
| EP3908678A1 (en) | 2019-01-10 | 2021-11-17 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence |
| CA3126428A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Guardant Health, Inc. | Compositions and methods for isolating cell-free dna |
| US12275993B2 (en) | 2019-02-12 | 2025-04-15 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| US11851683B1 (en) | 2019-02-12 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for selective analysis of cellular samples |
| US12305239B2 (en) | 2019-02-12 | 2025-05-20 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
| WO2020167862A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-20 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for transfer of reagents between droplets |
| WO2020167866A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-20 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for transposon loading |
| EP3924505B1 (en) | 2019-02-12 | 2025-12-17 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| US11467153B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-10-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| WO2020167574A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Omniome, Inc. | Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes |
| CN113613787B (zh) | 2019-02-20 | 2023-06-13 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法 |
| US11655499B1 (en) | 2019-02-25 | 2023-05-23 | 10X Genomics, Inc. | Detection of sequence elements in nucleic acid molecules |
| WO2020176678A1 (en) | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor |
| AU2020227802A1 (en) | 2019-02-26 | 2021-10-14 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for antibody optimization |
| WO2020176659A1 (en) | 2019-02-27 | 2020-09-03 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free dna |
| KR102865446B1 (ko) | 2019-03-01 | 2025-09-29 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 삼차 아민 치환된 쿠마린 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 |
| US12624350B2 (en) | 2019-03-01 | 2026-05-12 | Illumina, Inc. | High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using |
| WO2020178231A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina, Inc. | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| MY209343A (en) | 2019-03-01 | 2025-07-03 | Illumina Cambridge Ltd | Exocyclic amine substituted coumarin compounds and uses as fluorescent labels |
| NL2023327B1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-17 | Illumina Inc | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| US11920183B2 (en) | 2019-03-11 | 2024-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing optically tagged beads |
| NL2023316B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based sequencing |
| NL2023311B9 (en) | 2019-03-21 | 2021-03-12 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| WO2020191389A1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Illumina, Inc. | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| NL2023310B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| US11783917B2 (en) | 2019-03-21 | 2023-10-10 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based base calling |
| US11210554B2 (en) | 2019-03-21 | 2021-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| EP3947722A1 (en) | 2019-03-27 | 2022-02-09 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing rna from cells |
| US11421271B2 (en) | 2019-03-28 | 2022-08-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels |
| EP3947718A4 (en) | 2019-04-02 | 2022-12-21 | Enumera Molecular, Inc. | METHODS, SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR COUNTING NUCLEIC ACID MOLECULES |
| CN113905822B (zh) | 2019-04-12 | 2023-09-22 | 西部数据技术公司 | 使用磁传感器阵列边合成边核酸测序 |
| US11579217B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-02-14 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors |
| US11327073B2 (en) | 2019-04-12 | 2022-05-10 | Western Digital Technologies, Inc. | Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11112468B2 (en) | 2019-04-12 | 2021-09-07 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11738336B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-08-29 | Western Digital Technologies, Inc. | Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing |
| US11609208B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-03-21 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles |
| US12313627B2 (en) | 2019-05-01 | 2025-05-27 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US11593649B2 (en) | 2019-05-16 | 2023-02-28 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| US11423306B2 (en) | 2019-05-16 | 2022-08-23 | Illumina, Inc. | Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing |
| AU2020273459A1 (en) | 2019-05-16 | 2021-01-07 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| EP3976820A1 (en) | 2019-05-30 | 2022-04-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| US11939636B2 (en) | 2019-05-31 | 2024-03-26 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for improving patient monitoring after surgery |
| EP3980559A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-04-13 | Natera, Inc. | Methods for detecting immune cell dna and monitoring immune system |
| WO2020252186A1 (en) | 2019-06-11 | 2020-12-17 | Omniome, Inc. | Calibrated focus sensing |
| CA3144644A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Twist Bioscience Corporation | Barcode-based nucleic acid sequence assembly |
| SG11202105836XA (en) | 2019-07-12 | 2021-07-29 | Illumina Cambridge Ltd | Compositions and methods for preparing nucleic acid sequencing libraries using crispr/cas9 immobilized on a solid support |
| US11377655B2 (en) | 2019-07-16 | 2022-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Synthetic nucleic acids having non-natural structures |
| US10656368B1 (en) | 2019-07-24 | 2020-05-19 | Omniome, Inc. | Method and system for biological imaging using a wide field objective lens |
| US12496305B2 (en) | 2019-07-30 | 2025-12-16 | The Cleveland Clinic Foundation | Detection for determining corticosteroid responsiveness |
| EP4010472B1 (en) | 2019-08-05 | 2025-01-01 | Mission Bio, Inc. | Method and apparatus for single-cell analysis for determining a cell trajectory |
| WO2021041519A1 (en) | 2019-08-26 | 2021-03-04 | Pact Pharma, Inc. | Methods of performing guide-seq on primary human t cells |
| US12235262B1 (en) | 2019-09-09 | 2025-02-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for single cell protein analysis |
| TW202124406A (zh) | 2019-09-10 | 2021-07-01 | 美商歐姆尼歐美公司 | 核苷酸之可逆修飾 |
| US11208682B2 (en) | 2019-09-13 | 2021-12-28 | Western Digital Technologies, Inc. | Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags |
| EP4031682A1 (en) | 2019-09-20 | 2022-07-27 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes |
| US12091777B2 (en) | 2019-09-23 | 2024-09-17 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for CRTH2 |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US11111507B2 (en) | 2019-09-23 | 2021-09-07 | Zymergen Inc. | Method for counterselection in microorganisms |
| EP4034564A4 (en) | 2019-09-23 | 2023-12-13 | Twist Bioscience Corporation | VARIANT NUCLEIC ACID LIBRARIES FOR SINGLE-DOMAIN ANTIBODIES |
| EP3798319A1 (en) | 2019-09-30 | 2021-03-31 | Diagenode S.A. | An improved diagnostic and/or sequencing method and kit |
| EP4715839A2 (en) | 2019-10-11 | 2026-03-25 | Guardant Health, Inc. | Use of cell free bacterial nucleic acids for detection of cancer |
| WO2021076152A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for capping nucleic acids |
| LT3812472T (lt) | 2019-10-21 | 2023-03-10 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Objektyviai nešališkas tyrimas in vitro sąlygomis, skirtas vienos arba daugiau tikslinių programuojamų nukleazių ląstelėje nespecifinės sąveikos aktyvumui profiliuoti (abnoba-seq) |
| WO2021092066A1 (en) | 2019-11-05 | 2021-05-14 | Personalis, Inc. | Estimating tumor purity from single samples |
| WO2021092433A2 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| EP4055185A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-09-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
| US11747329B2 (en) | 2019-11-22 | 2023-09-05 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection |
| CN114746560A (zh) | 2019-11-26 | 2022-07-12 | 夸登特健康公司 | 改进甲基化多核苷酸结合的方法、组合物和系统 |
| JP2023510454A (ja) | 2019-11-27 | 2023-03-14 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | シクロオクタテトラエンを含有する色素及び組成物 |
| BR112022011235A2 (pt) | 2019-12-09 | 2022-12-13 | Twist Bioscience Corp | Bibliotecas de variantes de ácido nucleico para receptores de adenosina |
| MX2021011847A (es) | 2019-12-19 | 2021-11-17 | Illumina Inc | Genotecas de celulas unicas de alto rendimiento y metodos para elaborarlas y usarlas. |
| US12448648B2 (en) | 2019-12-23 | 2025-10-21 | Mgi Tech Co., Ltd. | Controlled strand-displacement for paired end sequencing |
| US11498078B2 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell receiver and methods of use |
| EP4081656A1 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-02 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays |
| CN121022991A (zh) | 2019-12-23 | 2025-11-28 | 10X基因组学有限公司 | 使用rna模板化连接进行空间分析的方法 |
| US11747262B2 (en) | 2019-12-23 | 2023-09-05 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell carrier and methods of use |
| EP4081777B1 (en) | 2019-12-23 | 2026-02-18 | 10X Genomics, Inc. | Reversible fixing reagents and methods of use thereof |
| CA3166578A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | Singular Genomics Systems, Inc. | Polynucleotide barcodes for long read sequencing |
| US12365942B2 (en) | 2020-01-13 | 2025-07-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods of decreasing background on a spatial array |
| US12405264B2 (en) | 2020-01-17 | 2025-09-02 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic system and method for analyte capture |
| EP3851542A1 (en) | 2020-01-20 | 2021-07-21 | Tecan Genomics, Inc. | Depletion of abundant uninformative sequences |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US20210230681A1 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using proximity ligation |
| US11821035B1 (en) | 2020-01-29 | 2023-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods of making gene expression libraries |
| WO2021152586A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state |
| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US12110541B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing high-resolution spatial arrays |
| CN113275053A (zh) | 2020-02-03 | 2021-08-20 | 帝肯基因组学公司 | 试剂存储系统 |
| WO2021158511A1 (en) | 2020-02-04 | 2021-08-12 | Omniome, Inc. | Flow cells and methods for their manufacture and use |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| WO2021158925A1 (en) | 2020-02-07 | 2021-08-12 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
| US11835462B2 (en) | 2020-02-11 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for partitioning a biological sample |
| US12449419B1 (en) | 2020-02-12 | 2025-10-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods for detecting binding of peptide-MHC monomers to T cells |
| US12421558B2 (en) | 2020-02-13 | 2025-09-23 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for joint interactive visualization of gene expression and DNA chromatin accessibility |
| EP4103580A4 (en) | 2020-02-13 | 2024-03-06 | Zymergen Inc. | METAGENOMIC LIBRARY AND NATURAL PRODUCT DISCOVERY PLATFORM |
| IL295297A (en) | 2020-02-14 | 2022-10-01 | Univ Johns Hopkins | Methods and materials for assessing nucleic acids |
| US12281357B1 (en) | 2020-02-14 | 2025-04-22 | 10X Genomics, Inc. | In situ spatial barcoding |
| WO2021162028A1 (ja) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | 東レ株式会社 | バイオチップの製造方法 |
| US12399123B1 (en) | 2020-02-14 | 2025-08-26 | 10X Genomics, Inc. | Spatial targeting of analytes |
| US12592298B2 (en) * | 2020-02-20 | 2026-03-31 | Illumina, Inc. | Hardware execution and acceleration of artificial intelligence-based base caller |
| US12354008B2 (en) | 2020-02-20 | 2025-07-08 | Illumina, Inc. | Knowledge distillation and gradient pruning-based compression of artificial intelligence-based base caller |
| US12591780B2 (en) | 2020-02-20 | 2026-03-31 | Illumina, Inc. | Data compression for artificial intelligence-based base calling |
| KR20220143854A (ko) | 2020-02-20 | 2022-10-25 | 일루미나, 인코포레이티드 | 인공 지능 기반 다-대-다 염기 호출 |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| US11926863B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells |
| US11768175B1 (en) | 2020-03-04 | 2023-09-26 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic methods for spatial analysis |
| CN114026250B (zh) | 2020-03-09 | 2025-05-16 | 因美纳有限公司 | 核酸测序的改善 |
| PL3969618T3 (pl) | 2020-03-09 | 2024-01-03 | Illumina, Inc. | Sposoby sekwencjonowania polinukleotydów |
| WO2021185320A1 (en) | 2020-03-18 | 2021-09-23 | Mgi Tech Co., Ltd. | Restoring phase in massively parallel sequencing |
| CN115768884A (zh) | 2020-03-20 | 2023-03-07 | 使命生物公司 | 用于全基因组扩增的单细胞工作流程 |
| WO2021214766A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto |
| WO2021216708A1 (en) | 2020-04-22 | 2021-10-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using targeted rna depletion |
| CA3177127A1 (en) | 2020-04-30 | 2021-11-04 | Guardant Health, Inc. | Methods for sequence determination using partitioned nucleic acids |
| US11188778B1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-30 | Illumina, Inc. | Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator |
| CN115836135A (zh) | 2020-05-05 | 2023-03-21 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法 |
| US20230203592A1 (en) | 2020-05-05 | 2023-06-29 | Akershus Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing bowel cancer |
| EP4150065A2 (en) | 2020-05-12 | 2023-03-22 | Illumina Inc | Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase |
| US11851700B1 (en) | 2020-05-13 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules |
| US12241126B2 (en) | 2020-05-14 | 2025-03-04 | Guardant Health, Inc. | Homologous recombination repair deficiency detection |
| CN116134308B (zh) | 2020-05-19 | 2025-05-27 | 10X基因组学有限公司 | 电泳盒和仪器 |
| EP4414459B1 (en) | 2020-05-22 | 2025-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| WO2021237087A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
| WO2021247543A2 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid library methods |
| US12265079B1 (en) | 2020-06-02 | 2025-04-01 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for detecting analytes from captured single biological particles |
| EP4158054B1 (en) | 2020-06-02 | 2025-04-16 | 10X Genomics, Inc. | Spatial transcriptomics for antigen-receptors |
| US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
| US20230193356A1 (en) | 2020-06-08 | 2023-06-22 | The Broad Institute, Inc. | Single cell combinatorial indexing from amplified nucleic acids |
| WO2021252499A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| WO2021252617A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Illumina, Inc. | Methods for increasing yield of sequencing libraries |
| US12435363B1 (en) | 2020-06-10 | 2025-10-07 | 10X Genomics, Inc. | Materials and methods for spatial transcriptomics |
| WO2021252747A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 1Ox Genomics, Inc. | Fluid delivery methods |
| EP4446430A3 (en) | 2020-06-10 | 2024-12-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| WO2021259881A1 (en) | 2020-06-22 | 2021-12-30 | Illumina Cambridge Limited | Nucleosides and nucleotides with 3' acetal blocking group |
| WO2021263111A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-30 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of dna methylation |
| EP4172364A1 (en) | 2020-06-30 | 2023-05-03 | Illumina, Inc. | Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless dna |
| US20230242967A1 (en) | 2020-07-02 | 2023-08-03 | Illumina, Inc. | A method to calibrate nucleic acid library seeding efficiency in flowcells |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US12209280B1 (en) | 2020-07-06 | 2025-01-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis |
| BR112023000073A2 (pt) | 2020-07-08 | 2023-04-11 | Illumina Inc | Microesferas como transportadores de transpossomos |
| WO2023282916A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Guardant Health, Inc. | Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids |
| EP4179111B1 (en) | 2020-07-10 | 2024-04-03 | Guardant Health, Inc. | Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids |
| EP4153606A4 (en) | 2020-07-13 | 2024-10-02 | Singular Genomics Systems, Inc. | METHODS FOR SEQUENCING COMPLEMENTARY POLYNUCLEOTIDES |
| US12116637B2 (en) | 2020-07-24 | 2024-10-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for detecting and treating high grade subtypes of uterine cancer |
| US11981964B2 (en) | 2020-07-28 | 2024-05-14 | Illumina Cambridge Limited | Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels |
| WO2022026761A1 (en) | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Guardant Health, Inc. | Methods for isolating cell-free dna |
| CA3190588A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Illumina, Inc. | Preparation of rna and dna sequencing libraries using bead-linked transposomes |
| CN116075596A (zh) | 2020-08-07 | 2023-05-05 | 牛津纳米孔科技公开有限公司 | 鉴定核酸条形码的方法 |
| US12553898B1 (en) | 2020-08-10 | 2026-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Fluorescent hybridization of antibody-oligonucleotide for multiplexing and signal amplification |
| IL299783A (en) | 2020-08-18 | 2023-03-01 | Illumina Inc | Sequence-Specific Targeted Transposition, Selection and Sorting of Nucleic Acids |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| WO2022046947A1 (en) | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for predicting an origin of a variant |
| IL300983A (en) | 2020-09-11 | 2023-04-01 | Illumina Cambridge Ltd | Methods for enriching a target sequence from a sequence library using hairpin adapters |
| WO2022061150A2 (en) | 2020-09-18 | 2022-03-24 | 10X Geonomics, Inc. | Sample handling apparatus and image registration methods |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| WO2022073012A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Guardant Health, Inc. | Compositions and methods for analyzing dna using partitioning and a methylation-dependent nuclease |
| AU2021366658A1 (en) | 2020-10-21 | 2023-06-22 | Illumina Cambridge Limited | Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput |
| WO2022087485A1 (en) | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid circularization and amplification on a surface |
| WO2022087309A1 (en) | 2020-10-23 | 2022-04-28 | Guardant Health, Inc. | Compositions and methods for analyzing dna using partitioning and base conversion |
| US12084715B1 (en) | 2020-11-05 | 2024-09-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for reducing artifactual antisense products |
| US12480158B1 (en) | 2020-11-05 | 2025-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| US20220195516A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing |
| EP4121555B1 (en) | 2020-12-21 | 2026-02-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods for capturing probes and/or barcodes |
| KR20230123872A (ko) * | 2020-12-21 | 2023-08-24 | 일루미나, 인코포레이티드 | 변형된 포획 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 포획 및 증폭시키기 위한 조성물 및 방법 |
| US20220195518A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| WO2022140629A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for analyzing methylated polynucleotides |
| JP2024502618A (ja) | 2021-01-08 | 2024-01-22 | セラノーム， インコーポレイテッド | 生体試料を分析するためのデバイスおよび方法 |
| US12576400B2 (en) | 2021-01-08 | 2026-03-17 | Cellanome, Inc. | Methods for incubating and analyzing a cell in a compartment of a fluidic device |
| US12398262B1 (en) | 2021-01-22 | 2025-08-26 | 10X Genomics, Inc. | Triblock copolymer-based cell stabilization and fixation system and methods of use thereof |
| KR20230154303A (ko) | 2021-01-29 | 2023-11-07 | 일루미나, 인코포레이티드 | 폴리뉴클레오티드로 플로우 셀의 시딩 효율을 개선하기위한 방법, 조성물 및 키트 |
| ES3015114T3 (en) | 2021-02-04 | 2025-04-29 | Illumina Inc | Long indexed-linked read generation on transposome bound beads |
| US11486001B2 (en) | 2021-02-08 | 2022-11-01 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides |
| WO2022174054A1 (en) | 2021-02-13 | 2022-08-18 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof |
| EP4421491A3 (en) | 2021-02-19 | 2024-11-27 | 10X Genomics, Inc. | Method of using a modular assay support device |
| CN120158497A (zh) | 2021-02-23 | 2025-06-17 | 10X基因组学有限公司 | 基于探针的核酸和蛋白质分析 |
| JP2024513668A (ja) | 2021-03-05 | 2024-03-27 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 分子応答を分析するための方法および関連する態様 |
| WO2022192889A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Guardant Health, Inc. | Detecting the presence of a tumor based on off-target polynucleotide sequencing data |
| WO2022197754A1 (en) | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Illumina Software, Inc. | Neural network parameter quantization for base calling |
| US12525320B2 (en) | 2021-03-16 | 2026-01-13 | Illumina, Inc. | Neural network parameter quantization for base calling |
| AU2022238446A1 (en) | 2021-03-18 | 2023-09-07 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
| CA3210451A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | Illumina Cambridge Limited | Methods for improving nucleic acid cluster clonality |
| CA3214282A1 (en) | 2021-03-29 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for assessing dna damage in a library and normalizing amplicon size bias |
| JP2024511766A (ja) | 2021-03-29 | 2024-03-15 | イルミナ インコーポレイテッド | 改善されたライブラリ調製方法 |
| MX2023010495A (es) | 2021-03-30 | 2023-09-18 | Illumina Inc | Metodos mejorados de preparacion de genoteca y adn complementarios isotermicos. |
| KR20230164668A (ko) | 2021-03-31 | 2023-12-04 | 일루미나, 인코포레이티드 | 오류 수정을 위한 고유 분자 식별자를 이용한 트랜스포존-기반 기술을 사용하는 방향성 태그먼트화 시퀀싱 라이브러리 제조 방법 |
| EP4428246B1 (en) | 2021-04-14 | 2025-12-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods of measuring mislocalization of an analyte |
| US12444482B2 (en) | 2021-04-15 | 2025-10-14 | Illumina, Inc. | Multi-channel protein voxelization to predict variant pathogenicity using deep convolutional neural networks |
| US12217829B2 (en) | 2021-04-15 | 2025-02-04 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based analysis of protein three-dimensional (3D) structures |
| JP2024516191A (ja) | 2021-05-05 | 2024-04-12 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | ビス－ホウ素縮合複素環を含有する蛍光色素及び配列決定における使用 |
| EP4320271B1 (en) | 2021-05-06 | 2025-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for increasing resolution of spatial analysis |
| JP2024521658A (ja) | 2021-05-14 | 2024-06-04 | プルトン・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド | クリセオバクテリウム属昆虫阻害性微生物組成物並びに作製及び使用方法 |
| CN117916390A (zh) | 2021-05-20 | 2024-04-19 | 伊鲁米纳公司 | 用于边合成边测序的组合物和方法 |
| WO2022256503A1 (en) | 2021-06-03 | 2022-12-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| US12570831B2 (en) | 2021-06-15 | 2026-03-10 | Illumina, Inc. | Hydrogel-free surface functionalization for sequencing |
| US11535892B1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-27 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
| US11859241B2 (en) | 2021-06-17 | 2024-01-02 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
| CN117597453A (zh) | 2021-06-23 | 2024-02-23 | 伊鲁米纳公司 | 用于测序试剂的组合物、方法、试剂盒、料筒和系统 |
| EP4359557B1 (en) | 2021-06-24 | 2026-05-20 | Illumina Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE COMBINATORY INDEXING OF NUCLEIC ACIDS BASED ON BEADS |
| AU2022300970A1 (en) | 2021-06-29 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Self-learned base caller, trained using oligo sequences |
| WO2023278184A1 (en) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| US12530882B2 (en) | 2021-07-01 | 2026-01-20 | Illumina, Inc. | Efficient artificial intelligence-based base calling of index sequences |
| US12423815B2 (en) | 2021-07-13 | 2025-09-23 | Illumina, Inc. | Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| WO2023003757A1 (en) | 2021-07-19 | 2023-01-26 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction with interpolation and adaptation for base calling |
| US11455487B1 (en) | 2021-10-26 | 2022-09-27 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling |
| EP4373965A1 (en) | 2021-07-21 | 2024-05-29 | DNAe Diagnostics Limited | Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides |
| GB2629259B (en) | 2021-07-21 | 2025-05-28 | Element Biosciences Inc | Optical systems for nucleic acid sequencing and methods thereof |
| GB202110479D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| GB202110485D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| WO2023004357A1 (en) | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Illumina, Inc. | Methods for preparing substrate surface for dna sequencing |
| CA3223746A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-02 | Rohan PAUL | Quality score calibration of basecalling systems |
| US12553805B2 (en) | 2021-08-02 | 2026-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Methods of preserving a biological sample |
| KR20240035413A (ko) | 2021-08-03 | 2024-03-15 | 일루미나, 인코포레이티드 | 다중 염기 호출자 모델을 사용한 염기 호출 |
| US11795500B2 (en) | 2021-08-19 | 2023-10-24 | Eclipse Bioinnovations, Inc. | Methods for detecting RNA binding protein complexes |
| WO2023023638A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Singular Genomics Systems, Inc. | Chemical and thermal assisted nucleic acid amplification methods |
| CN118103750A (zh) | 2021-08-31 | 2024-05-28 | 伊鲁米纳公司 | 具有增强的孔成像分辨率的流动池 |
| EP4196605B1 (en) | 2021-09-01 | 2024-12-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods for blocking a capture probe on a spatial array |
| WO2023035003A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Elegen Corp. | Multi-way bead-sorting devices, systems, and methods of use thereof using pressure sources |
| US12480157B2 (en) | 2021-09-30 | 2025-11-25 | Illumina, Inc. | Polynucleotide sequencing |
| WO2023056328A2 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Illumina, Inc. | Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples |
| EP4413580A4 (en) | 2021-10-05 | 2025-08-13 | Personalis Inc | PERSONALIZED TESTS FOR PERSONALIZED CANCER MONITORING |
| CA3234961A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Illumina, Inc. | Methods for capturing library dna for sequencing |
| EP4422792A4 (en) | 2021-10-26 | 2025-12-17 | Singular Genomics Systems Inc | TARGETED MULTIPLEX AMPLIFICATION OF POLYNUCLEOTIDS |
| WO2023086880A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample |
| EP4430206A1 (en) | 2021-11-10 | 2024-09-18 | Encodia, Inc. | Methods for barcoding macromolecules in individual cells |
| WO2023086635A1 (en) | 2021-11-15 | 2023-05-19 | Vir Biotechnology, Inc. | Virological and molecular surrogates of response to sars-cov-2 neutralizing antibody sotrovimab |
| WO2023102118A2 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis |
| US20250163491A1 (en) | 2021-12-16 | 2025-05-22 | Illumina, Inc. | Methods for metal directed cleavage of surface-bound polynucleotides |
| WO2023114397A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Illumina, Inc. | Hybrid clustering |
| CA3223615A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Fei Shen | Orthogonal hybridization |
| AU2022421156A1 (en) | 2021-12-20 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| EP4441711A1 (en) | 2021-12-20 | 2024-10-09 | 10X Genomics, Inc. | Self-test for pathology/histology slide imaging device |
| US20240401127A1 (en) | 2021-12-20 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| US20230212667A1 (en) | 2021-12-29 | 2023-07-06 | Illumina Cambridge Limited | Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers |
| US20250109442A1 (en) | 2022-01-13 | 2025-04-03 | Oslo Universitetssykehus Hf | Prostate cancer markers and uses thereof |
| AU2023208743A1 (en) | 2022-01-20 | 2024-01-04 | Illumina, Inc. | Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing |
| WO2023152568A2 (en) | 2022-02-10 | 2023-08-17 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing lung cancer |
| WO2023175037A2 (en) | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Illumina, Inc. | Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on separate polynucleotides for methylation detection |
| WO2023175026A1 (en) | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Illumina, Inc. | Methods of determining sequence information |
| EP4499862A1 (en) | 2022-03-28 | 2025-02-05 | Illumina, Inc. | Labeled avidin and methods for sequencing |
| AU2023246772A1 (en) | 2022-03-29 | 2024-01-18 | Illumina Inc. | Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing |
| US20230313294A1 (en) | 2022-03-30 | 2023-10-05 | Illumina Cambridge Limited | Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| CA3223090A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Xiaoyu Ma | Paired-end re-synthesis using blocked p5 primers |
| EP4499870A1 (en) | 2022-03-31 | 2025-02-05 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving sequencing signals |
| AU2023244351A1 (en) | 2022-03-31 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis |
| EP4504930A1 (en) | 2022-04-07 | 2025-02-12 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2023209606A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres |
| EP4523213A1 (en) | 2022-05-09 | 2025-03-19 | Guardant Health, Inc. | Detecting degradation based on strand bias |
| AU2023281871A1 (en) | 2022-05-31 | 2024-11-14 | Illumina, Inc | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2023240093A1 (en) | 2022-06-06 | 2023-12-14 | Element Biosciences, Inc. | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
| CA3259955A1 (en) | 2022-06-28 | 2024-01-04 | Illumina, Inc. | FLUORESCENT DYES CONTAINING A FUSIONED BIS-TETRACYCLIC BORON HETEROCYCLE AND THEIR USES IN SEQUENCED |
| AU2023325064A1 (en) | 2022-08-15 | 2025-03-06 | Element Biosciences, Inc. | Spatially resolved surface capture of nucleic acids |
| US20250361558A1 (en) | 2022-08-19 | 2025-11-27 | Illumina, Inc. | Third dna base pair site-specific dna detection |
| WO2024057280A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Illumina Cambridge Limited | Nanoparticle with polynucleotide binding site and method of making thereof |
| JP2025528992A (ja) | 2022-09-19 | 2025-09-04 | イルミナ インコーポレイテッド | 固定化プライマーを含む変形可能なポリマー |
| US20240102067A1 (en) | 2022-09-26 | 2024-03-28 | Illumina, Inc. | Resynthesis Kits and Methods |
| US20240124929A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Mesophilic compositions for nucleic acid amplification |
| CN120153070A (zh) | 2022-09-30 | 2025-06-13 | 因美纳有限公司 | 解旋酶-胞苷脱氨酶复合物及其使用方法 |
| US20250388894A1 (en) | 2022-09-30 | 2025-12-25 | Illumina, Inc. | Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides |
| US20240124914A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Thermophilic compositions for nucleic acid amplification |
| US20240110234A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Amplification Compositions and Methods |
| US20240110221A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of modulating clustering kinetics |
| CN119213083A (zh) | 2022-09-30 | 2024-12-27 | 伊路米纳有限公司 | 用于减少测序期间的光损伤的组合物和方法 |
| EP4594482A1 (en) | 2022-09-30 | 2025-08-06 | Illumina, Inc. | Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides |
| GB202215624D0 (en) | 2022-10-21 | 2022-12-07 | Dnae Diagnostics Ltd | Clonal amplification |
| WO2024102809A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of multiple analytes in a biological sample |
| KR20250110272A (ko) | 2022-11-15 | 2025-07-18 | 가던트 헬쓰, 인크. | 순환 종양 dna (ctdna)로부터 기준선 ctdna 수준 및 시간 경과에 따른 ctdna 수준의 종단적 변화 둘 다로부터의 신호를 이용하여 비소세포 폐암 (nsclc) 환자 약물 반응 또는 사망 또는 암 진행까지의 시간을 예측하는 방법 |
| KR20250130601A (ko) | 2022-11-29 | 2025-09-02 | 엘리먼트 바이오사이언스, 인크. | 핵산 시퀀싱을 위한 플로우 셀 디바이스 및 광학 시스템 |
| EP4627113A1 (en) | 2022-11-30 | 2025-10-08 | Illumina, Inc. | Chemoenzymatic correction of false positive uracil transformations |
| CN119095978A (zh) | 2022-12-07 | 2024-12-06 | 伊路米纳有限公司 | 使用具有模式化接种的双链dna大小排阻的单克隆聚簇 |
| EP4630435A1 (en) | 2022-12-09 | 2025-10-15 | Illumina, Inc. | Nucleosides and nucleotides with 3´ blocking groups and cleavable linkers |
| WO2024129672A1 (en) | 2022-12-12 | 2024-06-20 | The Broad Institute, Inc. | Trafficked rnas for assessment of cell-cell connectivity and neuroanatomy |
| WO2024129969A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Illumina, Inc. | Systems and methods for capture and enrichment of clustered beads on flow cell substrates |
| KR20250138733A (ko) | 2022-12-21 | 2025-09-22 | 가던트 헬쓰, 인크. | 세포-유리 핵산 분자의 메틸화 상태에 기초한 상동 재조합 결핍의 검출 |
| AU2023409219A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-10-03 | Illumina, Inc. | Palladium catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis |
| CA3246536A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Illumina, Inc. | TRANSITION METAL CATALYST COMPOSITIONS AND SYNTHETIC SEQUENCE PROCESSES |
| CN119095984A (zh) | 2022-12-27 | 2024-12-06 | 伊路米纳有限公司 | 使用3'烯丙基封端的核苷酸的测序方法 |
| CA3246669A1 (en) | 2023-01-06 | 2024-07-11 | Illumina, Inc. | URACIL REDUCTION BY POLYMERASE |
| EP4673167A1 (en) | 2023-02-27 | 2026-01-07 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Therapeutic t cell receptors targeting kras g12d |
| AU2024247164A1 (en) | 2023-03-29 | 2024-12-12 | Illumina, Inc. | Naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing |
| EP4689181A1 (en) | 2023-03-30 | 2026-02-11 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| EP4705522A1 (en) | 2023-05-05 | 2026-03-11 | Guardant Health, Inc. | Cell-free dna blood-based test for cancer screening |
| EP4720334A1 (en) | 2023-05-26 | 2026-04-08 | Illumina, Inc. | Methods for preserving methylation status during clustering |
| WO2024249061A1 (en) | 2023-05-31 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Detecting a methylated nucleotide using a quencher |
| EP4720339A1 (en) | 2023-05-31 | 2026-04-08 | Illumina, Inc. | Methods for double-stranded sequencing by synthesis |
| EP4720331A1 (en) | 2023-05-31 | 2026-04-08 | Illumina, Inc. | False positive reduction by translesion polymerase repair |
| WO2024254003A1 (en) | 2023-06-05 | 2024-12-12 | Illumina, Inc. | Identification and mapping of methylation sites |
| WO2024256581A1 (en) | 2023-06-14 | 2024-12-19 | Illumina, Inc. | Determination of modified cytosines |
| EP4728091A1 (en) | 2023-06-14 | 2026-04-22 | Illumina, Inc. | Concurrent sequencing with spatially separated rings |
| WO2024259251A1 (en) | 2023-06-15 | 2024-12-19 | Guardant Health, Inc. | Method for hrd detection in targeted cfdna samples using de novo mutational signatures |
| US20250075269A1 (en) | 2023-08-31 | 2025-03-06 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2025062002A1 (en) | 2023-09-20 | 2025-03-27 | Illumina, Inc. | Concurrent sequencing using nick translation |
| WO2025062001A1 (en) | 2023-09-20 | 2025-03-27 | Illumina, Inc. | Optimised nucleic acid sequencing |
| WO2025072783A1 (en) | 2023-09-28 | 2025-04-03 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2025072683A1 (en) | 2023-09-29 | 2025-04-03 | Illumina, Inc. | Solid supports and methods for strand invasion-based amplification |
| US20250246266A1 (en) | 2023-09-29 | 2025-07-31 | Guardant Health, Inc. | Genotyping cyp2d6 |
| WO2025081064A2 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Illumina, Inc. | Thermophilic deaminase and methods for identifying modified cytosine |
| WO2025090596A1 (en) | 2023-10-26 | 2025-05-01 | Illumina, Inc. | 4,5-substituted naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing |
| WO2025090646A1 (en) | 2023-10-27 | 2025-05-01 | Guardant Health, Inc. | Monitoring molecular response by allelic imbalance |
| WO2025104619A1 (en) | 2023-11-13 | 2025-05-22 | Oslo Universitetssykehus Hf | Breast cancer markers and uses thereof |
| US20250163505A1 (en) | 2023-11-17 | 2025-05-22 | Illumina, Inc. | Conjugated polymers or polymer dots as fluorescent labels |
| WO2025117738A1 (en) | 2023-11-28 | 2025-06-05 | Illumina, Inc. | Methods of improving unique molecular index ligation efficiency |
| WO2025136890A1 (en) | 2023-12-18 | 2025-06-26 | Illumina, Inc. | Hydrogel nanoparticles as labeling scaffold in sequencing |
| WO2025137222A1 (en) | 2023-12-19 | 2025-06-26 | Illumina, Inc. | Methylation detection assay |
| WO2025137479A1 (en) | 2023-12-22 | 2025-06-26 | Illumina, Inc. | Reusable flow cells and methods of using them for nucleic acid sequencing |
| US20250215493A1 (en) | 2023-12-28 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Nucleotides with enzymatically cleavable 3'-o-glycoside blocking groups for sequencing |
| WO2025144626A1 (en) | 2023-12-28 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Sequencing with single-stranded binding proteins |
| WO2025144711A1 (en) | 2023-12-29 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Tricyclic polymethine dyes for nucleic acid sequencing |
| WO2025184226A1 (en) | 2024-02-28 | 2025-09-04 | Illumina, Inc. | Nucleotides with terminal phosphate capping |
| WO2025188906A1 (en) | 2024-03-08 | 2025-09-12 | Illumina, Inc. | Modified adenosine nucleotides |
| WO2025207535A1 (en) | 2024-03-26 | 2025-10-02 | Illumina, Inc. | Photo-switchable surfaces |
| US20250320550A1 (en) | 2024-04-12 | 2025-10-16 | Robert Bosch Gmbh | Sequencing by synthesis using electroactively labeled 3-oh-modified nucleotides |
| WO2025221895A1 (en) | 2024-04-19 | 2025-10-23 | Illumina, Inc. | Water soluble polymer scaffolds for dye labeling |
| WO2025230914A1 (en) | 2024-04-29 | 2025-11-06 | Illumina, Inc. | Nucleotides with enzyme-triggered self-immolative linkers for sequencing by synthesis |
| WO2025240905A1 (en) | 2024-05-17 | 2025-11-20 | The Broad Institute, Inc. | Imaging-free high-resolution spatial macromolecule abundance reconstruction |
| WO2025264836A1 (en) | 2024-06-18 | 2025-12-26 | Illumina, Inc. | Methods for increasing sequencing quality of gc-rich regions |
| WO2025264831A1 (en) | 2024-06-18 | 2025-12-26 | Illumina, Inc. | Methods for increasing sequencing quality of gc-rich regions |
| WO2026006314A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Tagging target regions prior to nucleotide sequencing |
| WO2026006746A2 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Nucleic acid preparation and analysis techniques |
| WO2026006774A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2026035914A1 (en) | 2024-08-09 | 2026-02-12 | Illumina, Inc. | Nucleotides having 3'-hydroxy blocking groups |
| WO2026090042A1 (en) | 2024-10-21 | 2026-04-30 | The Broad Institute, Inc. | Single-cell and spatial dna methylation measurements |
| WO2026097017A2 (en) | 2024-11-01 | 2026-05-07 | Illumina, Inc. | Methods of improving sequencing accuracy |
Family Cites Families (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4957858A (en) | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| EP0224126A3 (en) | 1985-11-25 | 1989-02-01 | The University of Calgary | Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| CA1340843C (en) | 1987-07-31 | 1999-12-07 | J. Lawrence Burg | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| SE8801070D0 (sv) | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
| US6107023A (en) | 1988-06-17 | 2000-08-22 | Genelabs Technologies, Inc. | DNA amplification and subtraction techniques |
| GB8818020D0 (en) | 1988-07-28 | 1988-09-01 | Ici Plc | Method for amplification of nucleotide sequences |
| CA2004326A1 (en) | 1988-12-23 | 1990-06-23 | Nanibushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
| US5629158A (en) * | 1989-03-22 | 1997-05-13 | Cemu Bitecknik Ab | Solid phase diagnosis of medical conditions |
| US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| EP0450060A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-10-09 | Sri International | Dna sequencing |
| CA2036946C (en) | 1990-04-06 | 2001-10-16 | Kenneth V. Deugau | Indexing linkers |
| US5326692B1 (en) | 1992-05-13 | 1996-04-30 | Molecular Probes Inc | Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift |
| US5645994A (en) * | 1990-07-05 | 1997-07-08 | University Of Utah Research Foundation | Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences |
| ES2130177T3 (es) | 1991-08-10 | 1999-07-01 | Medical Res Council | Tratamiento de poblaciones de celulas. |
| WO1993004199A2 (en) | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Scientific Generics Limited | Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids |
| CA2077135A1 (en) * | 1991-08-30 | 1993-03-01 | Joh-E Ikeda | A method of dna amplification |
| AU3728093A (en) | 1992-02-19 | 1993-09-13 | Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The | Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids |
| WO1994002634A1 (en) * | 1992-07-24 | 1994-02-03 | University Of South Australia | Amplification and detection process |
| RU2048522C1 (ru) | 1992-10-14 | 1995-11-20 | Институт белка РАН | Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления |
| US5436142A (en) * | 1992-11-12 | 1995-07-25 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1995-08-08 | Hamamatsu Photonics Kk | 核酸塩基配列決定方法 |
| AU707391B2 (en) | 1994-05-28 | 1999-07-08 | Tepnel Medical Limited | Producing copies of nucleic acids |
| US5641658A (en) * | 1994-08-03 | 1997-06-24 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support |
| US6060288A (en) | 1994-08-03 | 2000-05-09 | Mosaic Technologies | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
| JPH11503611A (ja) | 1995-04-11 | 1999-03-30 | トラスティーズ・オブ・ボストン・ユニバーシティ | 生体高分子の固相配列決定法 |
| US5753439A (en) * | 1995-05-19 | 1998-05-19 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid detection methods |
| US6143495A (en) | 1995-11-21 | 2000-11-07 | Yale University | Unimolecular segment amplification and sequencing |
| US5939291A (en) | 1996-06-14 | 1999-08-17 | Sarnoff Corporation | Microfluidic method for nucleic acid amplification |
| US6218142B1 (en) * | 1997-03-05 | 2001-04-17 | Michael Wassenegger | Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP) |
| EP1498494A3 (en) * | 1997-04-01 | 2007-06-20 | Solexa Ltd. | Method of nucleic acid sequencing |
| EP1591541B1 (en) | 1997-04-01 | 2012-02-15 | Illumina Cambridge Limited | Method of nucleic acid sequencing |
| WO1998045474A1 (en) | 1997-04-04 | 1998-10-15 | Innogenetics N.V. | Isothermal polymerase chain reaction by cycling the concentration of divalent metal ions |
| US6235471B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
| ES2283936T3 (es) | 1997-07-07 | 2007-11-01 | Medical Research Council | Procedimiento de clasificacion in vitro. |
| US6326489B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-12-04 | Howard Hughes Medical Institute | Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays |
| US6124120A (en) | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
| US6511803B1 (en) | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6248558B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity |
| EP1098996A1 (en) | 1998-07-20 | 2001-05-16 | Yale University | Method for detecting nucleic acids using target-mediated ligation of bipartite primers |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| CA2375769A1 (en) | 1999-01-11 | 2000-07-20 | President And Fellows Of Harvard College | Isothermal amplification of dna |
| US6300070B1 (en) * | 1999-06-04 | 2001-10-09 | Mosaic Technologies, Inc. | Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids |
| JP6049051B2 (ja) | 2011-07-29 | 2016-12-21 | 日東電工株式会社 | 両面真空成膜方法 |
-
1999
- 1999-09-28 AR ARP990104889A patent/AR021833A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 EA EA200100402A patent/EA004271B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 WO PCT/GB1999/003248 patent/WO2000018957A1/en not_active Ceased
- 1999-09-30 CZ CZ20011183A patent/CZ20011183A3/cs unknown
- 1999-09-30 HK HK02104254.1A patent/HK1042525A1/zh unknown
- 1999-09-30 US US09/806,531 patent/US7115400B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 TR TR2001/00911T patent/TR200100911T2/xx unknown
- 1999-09-30 AT AT99947713T patent/ATE311474T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 JP JP2000572404A patent/JP2002525125A/ja active Pending
- 1999-09-30 NZ NZ510599A patent/NZ510599A/xx unknown
- 1999-09-30 AU AU61088/99A patent/AU771073B2/en not_active Ceased
- 1999-09-30 KR KR1020017003997A patent/KR20010085860A/ko not_active Ceased
- 1999-09-30 ZA ZA200102420A patent/ZA200102420B/en unknown
- 1999-09-30 EP EP99947713A patent/EP1117827B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 SK SK429-2001A patent/SK4292001A3/sk unknown
- 1999-09-30 CA CA002344575A patent/CA2344575A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-30 EE EEP200100195A patent/EE200100195A/xx unknown
- 1999-09-30 EP EP05016082.9A patent/EP1634963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 IL IL14217899A patent/IL142178A0/xx unknown
- 1999-09-30 HU HU0105052A patent/HUP0105052A3/hu unknown
- 1999-09-30 BR BR9914159-0A patent/BR9914159A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 DE DE69928683T patent/DE69928683T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 PL PL99347125A patent/PL347125A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 CN CN99813058A patent/CN1325458A/zh active Pending
-
2001
- 2001-03-14 NO NO20011303A patent/NO20011303L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-03-20 BG BG105363A patent/BG105363A/bg unknown
-
2006
- 2006-08-17 US US11/506,146 patent/US8652810B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-01-08 US US14/150,607 patent/US9297006B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-02-22 US US15/050,345 patent/US10370652B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7115400B1 (en) | Methods of nucleic acid amplification and sequencing | |
| US8182994B2 (en) | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing | |
| JP5916166B2 (ja) | 組織試料中の核酸の局在化された検出、又は空間的検出のための方法及び生成物 | |
| JP2018510662A (ja) | 生物学的試料の空間識別されるマルチプレックスな核酸分析 | |
| CZ20031582A3 (cs) | Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu | |
| CN102373265B (zh) | 一种检测遗传性耳聋的试剂盒 | |
| JP2017512071A (ja) | ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法 | |
| JP2003523183A (ja) | 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法 | |
| CA2803693A1 (en) | Methods for nucleic acid capture and sequencing | |
| KR20180014054A (ko) | 뉴클레오타이드의 직교 비블록화 | |
| CN109689883B (zh) | 用于连接细胞组成物和基质的方法 | |
| HK1222881A1 (zh) | 改进的ngs工作流程 | |
| US20060263790A1 (en) | Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction | |
| MXPA01003266A (en) | Methods of nucleic acid amplification and sequencing |