BRPI0417825B1 - métodos para uso de lactobacilli probióticos para animais de estimação - Google Patents

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Michael Anthony Ceddia
Gary Mitchell Davenport
Barry Pius Kiely
Liam Diarmuid O'mahony
Gregory Dean Sunvold
Mark Alan Tetrick
Robert Jason Vickers
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Abstract

MÉTODOS PARA USO DE LACTOBACILLI PROBIÓTICOS PARA ANIMAIS DE ESTIMAÇÃO". De acordo com a presente invenção, são apresentados métodos para o uso de bactérias probióticas do gênero Lactobacilli em animais de estimação.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se ao campo de Lactobacilliprobióticos, mais especificamente métodos de uso de Lactobacilliprobióticos em animais de estimação.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Os mecanismos de defesa para proteção do trato gastrointestinal (Gl) de mamíferos contra a colonização por bactérias são altamente complexos. O trato Gl da maioria dos mamíferos é colonizado por microflora nativa e por microorganismos patogênicos invasivos. Em um estado saudável, essas microfloras concorrentes encontram-se em um estado de equilíbrio. A modificação do equilíbrio da microflora intestinal pode causar ou evitar diversos transtornos gastrointestinais, tanto em seres humanos como em outras espécies de mamíferos, como animais de estimação, inclusive gatos, cães e coelhos. O bem-estar de animais de estimação está estreitamente relacionado à alimentação e à saúde gastrointestinal, e a manutenção do equilíbrio da microflora intestinal nesses animais pode resultar em animais de estimação mais saudáveis.
[0003] O número e a composição da microflora intestinal tendem a ser estáveis, embora idade e dieta possam modificá-los. A acidez gástrica, a bílis, o peristaltismo intestinal e a imunidade local são fatores considerados importantes na regulação da flora bacteriana presente no intestino delgado de seres humanos e diversos outros mamíferos. Frequentemente, os transtornos gastrointestinais em animais de estimação, inclusive aqueles encontrados em cães e gatos, estão ligados a proliferação bacteriana e à produção de enterotoxinas por bactérias patogênicas. Esses fatores perturbam o equilíbrio da microflora intestinal e podem promover inflamação e respostas imunológicas aberrantes.
[0004] Recentemente, pesquisas começaram a revelar algumas valiosas cepas de bactérias obteníveis mediante o isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos, como seres humanos e cães, e seu uso potencial como agentes probioti∞s. Os probioti∞s são considerados preparações de bactérias, sejam estas viáveis ou mortas, tendo constituintes como proteínas ou carboidratos, ou frações purificadas de fermentos bacterianos, que promovem a saúde dos mamíferos ao preservar a microflora natural no trato Gl, e ao reforçar os controles normais contra respostas imunológicas aberrantes. Acredita-se que as bactérias probióticas sejam mais eficazes quando derivadas da espécie que se pretende tratar, ou de espécies com parentesco próximo a esta. Embora algumas cepas de bactérias probiβticas tenham sido elucidadas, os métodos de uso dessas cepas, bem como sua eficácia terapêutica, têm se limitado a modulação de transtornos gastrointestinais em seres humanos. Até o momento, não tem havido muita investigação quanto ao potencial desses organismos para afetar de modo benéfico outros sistemas fisiológicos que não o trato gastrointestinal em animais de estimação, como cães e gatos.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[0005] De acordo com a presente invenção, são apresentados métodos para o uso, em animais de estimação, de Lactobacilli probioti∞s obteníveis mediante o isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos. Os ditos métodos incluem o tratamento, seja este profilático ou terapêutico, do sistema imune, do ∞ntrole do peso e da ∞mpos^o ∞rporal, da saúde urinaria, de doenças da pele e da pelagem, e do envelhecimento.
[0006] Estes e outros aspectos, bem como características e vantagens da presente invenção, ficarão aparentes aos elementos versados na técnica a partir da leitura da presente descrição.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Sequências
[0007] SEQ. ID N° 1 - sequência de nucleotídeo do espaçador intergênkco 16s - 23s de Lactobacillus murinus AHC 1222 (NCIMB 41194).
[0008] SEQ. ID N° 2 - sequência de nucleotídeo do espaçador intergênkco 16s - 23s de Lactobacillus murinus AHC 3133 (NCIMB 41195).
[0009] SEQ. ID N° 3 - sequência de nucleotídeo do espaçador intergênkx) 16s - 23s de Lactobacillus murinus AHC 5323 (NC1 MB 41196).
[0010] SEQ. ID N° 4 - sequência de nucleotideo do espaçador intergênico 16s - 23s de Lactobacillus murinus AHC 6331 (NCIMB 41197).
[0011] SEQ. ID N° 5 - sequência iniciadora 16s - 23s de PCR do lado esquerdo para análise de sequência.
[0012] SEQ. ID N° 6 - sequência iniciadora 16s - 23s de PCR do lado direito, para análise da sequência.
Números de deposito das bactérias
[0013] A tabela abaixo descreve a espécie, o número da cepa e o número de 10 deposito para os Lactobacilliprobióticos obteníveis mediante o isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos, e úteis à presente invenção. As cepas bacterianas foram depositadas junto ao "National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria" (NCIMB), Aberdeen, Reino Unido.
Figure img0001
Figure img0002
[0014] Todos os pesos, medidas e concentrações na presente invenção são medidos a 25°C na composição em sua totalidade, exceto onde indicado em contrário.
[0015] Exceto onde indicado em contrário, todas as porcentagens das composições aqui mencionadas são porcentagens em peso, e todas as razoes são razoes em peso.
[0016] Exceto onde indicado em contrário, todos os pesos moleculares são pesos moleculares médios ponderais.
[0017] Exceto onde indicado em contrário, o conteúdo de todas as fontes de literatura mencionadas neste texto estão aqui incorporadas em sua totalidade, por referência.
[0018] Exceto onde são apresentados exemplos específicos de valores reais medidos, os valores numéricos aqui mencionados devem ser considerados como sendo qualificados pela expressão “cerca de”.
[0019] No âmbito da descrição apresentada a seguir, a abreviação UFC (“unidade formadora de colônia") designa o número de células bacterianas revelado por contagens microbiologicas em placas de ágar, como e de entendimento comum na técnica.
[0020] Para uso na presente invenção, o termo "mutantes dessas cepas" inclui cepas bacterianas derivadas, tendo ao menos 88% de homologia, de preferência ao menos 90% de homologia e, com mais preferência, 95% de homologia com a sequência de polinucleotídeo do espaçador intergênico 16s - 23s de uma cepa mencionada, porém compreendendo mutações de DNA em outras sequências de DNA no genoma bacteriano.
[0021] Para uso na presente invenção, o termo "mutações de DNA” inclui mutações naturais ou induzidas compreendendo ao menos alterações de base única, inclusive deleções, inserções, transversões e outras modificações de DNA conhecidas pelos versados na técnica, inclusive modificação genética introduzida em um nucleotídeo ou sequência de aminoácidos original (pai), mantendo-se ao menos 50% de homologia com a sequência-pai. De preferência, a sequência compreendendo a mutação ou mutações de DNA tem ao menos 60%, com mais preferência ao menos 75% e, com mais preferência ainda, 85% de homologia com a sequência-pai. Para uso na presente invenção, a “homologia” da sequência pode ser determinada mediante o uso de técnicas-padrão conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser determinada usando-se o programa online para algoritmo de homologia “BLAST", disponível publicamente em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
[0022] Para uso na presente invenção, o termo "modificação genética” inclui a introdução de sequências de DNA exógenas e/ou endógenas no genoma de um organismo, seja por meio de inserção no genoma do dito organismo, seja por meio de vetores, inclusive DNA de plasmídios ou bacteriófagos, conforme e de conhecimento do versado na técnica, sendo que a dita sequência de DNA tem um comprimento de ao menos duas bases de ácido desoxirribonucléico.
[0023] Para uso na presente invenção, o termo "animal de estimação" significa um animal doméstico. De preferência, “animal de estimação” significa animais domésticos como cães, gatos, coelhos, furões, cavalos, vacas ou similares. Com mais preferência, "animal de estimação" significa um cão ou gato doméstico.
[0024] A cepa de bactérias formadoras de ácido láctico do gênero Lactobacilli murínus, obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal canino ressecado e lavado, pode ser usado para proporcionar benefícios probióticos em seguida ao consumo via oral em animais, de preferência animais de estimação ou seres humanos. Esses benefícios probióticos geralmente mantêm ou melhoram a saúde geral do animal. Os elementos não-limitadores de saúde e fisiologia animal que são beneficiados, seja terapeuticamente pelo alivio de sintomas, ou profilaticamente pela prevenção de doenças, incluem transtornos inflamatórios, imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, câncer (particularmente aqueles dos sistemas gastrointestinal e imune), doença diarréica, diarréia associada ao uso de antibióticos, apendicite, transtornos autoimunes, esclerose múltipla, mal de Alzheimer, amiloidose, artrite reumatóide, artrite, mobilidade das articulações, diabetes mellitus, infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, trauma associado a cirurgia, doença metastática induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, ganho de peso, acúmulo excessivo de tecido adiposo, anorexia, ∞ntrole de febre, caquexia, cura de ferimentos, úlceras, infecção da barreira intestinal, alergia, asma, transtornos respiratórios, transtornos circulatórios, doença cardíaca coronariana, anemia, transtornos do sistema de coagulação sanguínea, doença renal, transtornos do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, transtornos nutricionais, osteoporose, transtornos endócrinos e transtornos da epiderme. São preferenciais o tratamento do trato gastrointestinal, inclusive tratamento ou prevenção de diarreia; regulação do sistema imune, de preferência tratamento ou prevenção de doença auto-imune e inflamação; manutenção ou melhoria da saúde da pele e/ou da pelagem, de preferência tratamento ou prevenção de doença atópica da pele; melhoria ou redução dos efeitos do envelhecimento, inclusive consciência mental e níveis de atividade; e prevenção da perda de peso durante e após uma infecção.
[0025] O tratamento dos transtornos apresentados acima pode ser medido mediante o uso de técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, transtornos inflamatórios, inclusive doença auto-imune e inflamação, podem ser detectados e monitorados utilizando-se testes de função imune in vivo, como blastogênese de linfócitos, atividade de células "Natural Killer", resposta de anticorpos a vacinas, hipersensibilidade de tipo retardado e combinações desses itens. Esses métodos são brevemente descritos na presente invenção, mas bem conhecidos pelos versados na técnica.
[0026] 1. Blastogênese de linfócitos: Este ensaio mede a resposta proliferativa in vitrode linfócitos isolados a partir de sangue integral fresco obtido de animais de teste e de controle para diversos mitogênios ,e é uma medida da função geral das células T e B. Em resumo, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC, ou “peripheral blood mononucleocytes") são isolados a partir de sangue integral por meio de métodos Ficoll-Hypaque de centrifugação por densidade, conhecidos pelos versados na técnica. As PBMCs isoladas são lavadas duas vezes em meio celular RPMI 1640 suplementado ∞m- HEPES, L-glutamina e penicilina/estreptomicina. As células lavadas são ressuspensas em RPM! 1640 e contadas, e a densidade de células é adequadamente ajustada. As 2x105 células são expostas a uma gama de concentrações (de 0,1 pg/mL a 100 pg/mL) de diversos mitogênios, exemplos dos quais incluem mitogénio de caruru-de-cacho (Gibco), fitoemaglutinina (Gibco) e concanavalina A (Sigma), em triplicata, durante 72 horas a 37°C e 5% de CO2 ∞m 10% de soro fetal bovino (Sigma). A 54 horas, as células são pulsadas ∞m 1 pCi 3H-timidina e coletadas, e as ∞ntagens de cintilação são lidas em um TopCount NXT a 72 horas.
[0027] 2. Atividade de células "Natural Killer”: Conforme descrito em US 6.310.090, este ensaio mede a atividade efetora in vitrode células "natural killer"(NK) isoladas a partir de sangue integral fres∞ de animais de teste e de ∞ntrole. As células "natural killer” são um ∞mponente da função imune inata de um mamífero. Células de adenocarcinoma de tiróide canina foram usadas ∞mo células-alvo na avaliação da atividade citotóxica de células NK. Foi anteriormente demonstrado que essa linhagem de células e sus∞tivel a morte por células NK caninas. As células-alvo foram cultivadas em um fras∞ T75 ∞m 20 ml_ de meio mínimo essencial (MEM; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, EUA.), suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. Quando ∞nfluentes, as células-alvo foram tripsinizadas, lavadas 3 vezes e ressuspensas a 5x105 células/mL em meio ∞mpleto (RPMI-1640 + 10% FCS+100 U/mL de penicilina + 100 pg/mL de estreptomicina). Triplicatas de alíquotas de 100 pL das células-alvo foram pipetadas em placas com 96 cavidades de fundo em U (Costar, Cambridge, Massachussets, EUA) e incubadas durante 8 horas para permitir a aderência das células. Os linfócitos (células efetoras, 100 pL) isolados por meio de separação Ficoll-Hypaque (conforme descrito acima) foram, então, adicionados às células-alvo para se obter uma razão entre células efetoras e células alvo (E:A) de 10:1. Após 10 horas de incubação a 37 °C, f oram adicionados 20 pL de um substrato contendo 5 pg de brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il) -2,5 difenil tetrazólico (MTT). A mistura foi incubada durante 4 horas a 37 °C, após os quais o MTT não-metabolizado foi removido por aspiração. Os cristais de formazan foram dissolvidos mediante a adição de 200 pL de etanol a 95%. A densidade óptica (DO) foi medida em 570 nm, utilizando-se um leitor de microplacas. A porcentagem de morte celular específica para célula NK foi calculada conforme exposto a seguir:
[0028] Citotoxicidade específica (%) = 100 x {1 - [(DO de células - alvo e células efetoras - DO de células efetoras) / (DO de células-alvo)]}
[0029] 3. Resposta de anticorpos a vacinas: Os indivíduos de teste receberam um conjunto (até 5) de vacinas após ao menos 12 semanas de alimentação probiótica ou de controle. As vacinas podem ser uma mistura de vacinas novas e redundantes. Alguns exemplos não-limitadores de conjuntos de vacina que podem ser usados incluem misturas de vacinas preparadas por Fort Dodge Animal Health. Alguns exemplos não-limitadores de vacinas adequadas ao uso na presente invenção incluem cinomose canina, adenovirus, coronavirus, parainfluenza e parvovirus. A história de vacinação do indivíduo determinará as vacinas a serem utilizadas. As quantidades, no sangue, de anticorpos específicos para as vacinas administradas são medidas durante 3 semanas, sendo comparadas a duração e a intensidade da resposta nos grupos com alimentação de controle e probiótica.
[0030] 4. Hipersensibilidade de tipo retardado: Um método in vivo não-invasivo para avaliação do estado do sistema imune. Este teste compreende uma injeção intradérmica do mitogênio policlonal fitoemaglutinina (PHA) em combinação com eritrθcitos de ovelha, uma vacina multivalente, histamina (100 pL de fosfato de histamina a 0,0275 g/L, Greer, Lenoir, NC), ou PBS (100 pL de solução salina tamponada com fosfato a 8,5 g/L, Sigma). A resposta imunológica ao antígeno é registrada como espessura da dobra de pele, usando calibres, em intervalos de tempo de 0, 24, 48 e 72 horas após a injeção. Um aumento na espessura da dobra de pele indica uma maior resposta de hipersensibilidade, que deve diminuir mediante o tratamento com as bactérias da presente invenção.
[0031] Métodos adicionais para a determinação do efeito das bactérias Lactobacilli da presente invenção são descritos em US6.133.323 e US6.310.090.
[0032] Além disso, a melhoria quanto aos efeitos do envelhecimento pode ser determinada mediante o uso de absorptometria de dupla emissão de raios X ou tomografia computadorizada para medir a composição corporal, inclusive massa corporal gorda, massa corporal magra e conteúdo mineral ósseo. De modo similar, esse método pode ser usado para determinar alterações de anatomia como perda de peso ou densidade óssea em indivíduos, após infecção.
[0033] Os Lactobacillida presente invenção também podem ser usados em um método para redução dos níveis de estresse em animais de estimação. As concentrações sanguíneas de hormônios de estresse, inclusive epinefrina, norepinefrina, dopamina, cortisol e proteína C-reativa, podem ser medidas para determinar os níveis de estresse e sua redução ou manutenção. Esses hormônios são reconhecidos biomarcadores de estresse, e podem ser prontamente medidos mediante o uso de técnicas conhecidas pelos versados na técnica.
[0034] Além disso, a manutenção ou a melhoria da saúde da pele e/ou da pelagem de animais de estimação, inclusive de doença atópica da pele, pode ser medida mediante o uso de avaliações de pele e pelagem conduzidas por dois indivíduos treinados. Exemplos de critérios examinados durante essas avaliações incluem:
[0035] a) índice de queda de pelos: Um índice de queda de pelos e atribuído a cada indivíduo de teste mediante a coleta de pelos produzidos durante uma sessão de escovação padronizada. Os pelos são retidos e pesados, e os indivíduos de controle e de teste são comparados.
[0036] b) Avaliações subjetivas de pele/pelagem: Examinadores treinados avaliam subjetivamente as condições de pele e pelagem, mediante a determinação de queda de pelos, caspa, brilho, uniformidade, maciez e densidade.
[0037] c) Avaliação funcional da pele: A função de barreira da pele pode ser avaliada mediante a esfregação da superfície da pele com uma gaze encharcada em acetona. Essa técnica perturba, de maneira eficaz, a função de barreira da pele ao remover da camada córnea camadas celulares individuais, juntamente ∞m as frações de lipídio a estas associadas. A perturbação da barreira é quantificada por meio da medição do aumento na perda transepidérmica de água (PTEA) e do grau de vermelhidão do local ofendido, mediante o uso de métodos ∞nhecidos pelos versados na técnica. As pontuações para vermelhidão (eritema) são obtidas mediante o uso do sistema de câmera e iluminação anteriormente descrito. Os registros de PTEA e as pontuações de vermelhidão são obtidos imediatamente antes e depois da perturbação, bem ∞mo nos pontos finais às cin∞ e às 24 horas, para avaliar as propriedades de proteção e cura da pele.
[0038] O tratamento ou prevenção de infecções gastrointestinais, inclusive diarreia, em animais de estimação pode ser medido utilizando-se um método de pontuação das fezes. A pontuação das fezes pode ser registrada diariamente, de a∞rdo ∞m as seguintes diretrizes, sendo os grupos de ∞ntrole e de teste ∞mparados antes e depois da alimentação ∞m as bactérias, de a∞rdo ∞m a presente invenção.
Pontuação: 5 Extremamente seca
[0039] Estas fezes são duras e não aderem a superfícies. Estas fezes rolam quando empurradas. Não são produzidas endentações quando estas fezes são apanhadas. Estas fezes são frequentemente defecadas em grupos de unidades individuais, em vez de uma unidade ∞mpleta. Estas fezes mantêm seu formato original após a ∞leta.
Pontuação: 4 Firme (fezes ideias)
[0040] Estas fezes são firmes, bem formadas e cilíndricas. Estas fezes não se rompem facilmente quando apanhadas. Estas fezes podem deixar resíduos sobre superfícies e luvas. Estas fezes são frequentemente defecadas como uma só unidade. Estas fezes mantem seu formato original após a coleta.
Pontuação: 3 Mole, com formato
[0041] Estas fezes são moles, no entanto têm formatos definidos. Estas fezes se rompem facilmente e, definitivamente, deixam resíduos sobre superfícies e luvas. Estas fezes frequentemente perdem seu formato original após a coleta. Estas fezes frequentemente se apresentam em conjunto com outra pontuação, mas podem compreender a totalidade da amostra.
Pontuação: 2 Mole, sem formato
[0042] Estas fezes são moles e não apresentam formato cilíndrico. O formato frequentemente associado a um "tipo 2" é aquele conhecido como "excremento de vaca". Estas fezes perdem o formato original quando coletadas, e definitivamente deixam resíduos sobre superfícies e luvas. Estas fezes frequentemente se apresentam em conjunto com outra pontuação, mas podem compreender a totalidade da amostra. Estas amostras podem se espalhar por uma área de vários centímetros.
Pontuação: 1 Líquida
[0043] As fezes com esta pontuação sempre parecerão liquidas, e pode ou não haver a presença de matéria particulada. Estas fezes são frequentemente defecadas em grupos de montes, em vez de uma unidade completa. Muco está frequentemente presente nas amostras deste tipo. As amostras deste tipo de fezes são de coleta muito difícil, e sempre deixa resíduos em superfícies e luvas. Estas amostras podem se espalhar por uma área de vários centímetros.
[0044] Além disso, são registradas outras observações, inclusive: presença de sangue, de objetos estranhos ou de muco nas fezes.
[0045] Além disso, o tratamento de infecção gastrointestinal em animais de estimação pode compreender a otimização da ecologia microbiana dos mesmos. A otimização da ecologia microbiana em animais de estimação compreende, de preferência, a dos teores de bactérias patogênicas nas fezes dos mesmos. Os teores de bactérias patogênicas presentes nas fezes de animais de estimação podem ser enumerados mediante o uso do método padrão de contagem em placa, conhecido pelos versados na técnica. Com mais preferência, as bactérias patogênicas são selecionadas a partir do grupo consistindo em Clostridia, Escherichia, Salmonella, bacteroides e combinações desses itens. Alguns exemplos não-limitadores de cepas de bactérias patogênicas adequadas incluem C. perfringens, C. difficile, Eschericia coli, Salmonella typhimurium e combinações desses itens.
[0046] O método de uso das bactérias da presente invenção pode incluir, também, o tratamento profilático ou terapêutico do trato urinário de mamíferos, de preferência animais de estimação. Alguns exemplos não-limitadores de tratamentos do trato urinário incluem tratamento ou prevenção de infecções do trato urinário, tratamento ou prevenção de doenças renais, inclusive cálculos renais, tratamento ou prevenção de infecções na bexiga, e similares. Sem se ater a teoria, acredita-se que as bactérias Lactobacillida presente invenção são uteis na prevenção dessas doenças como resultado de sua capacidade para degradar o ácido oxálico, conforme demonstrado in vitro.O ácido oxálico e um subproduto do metabolismo urinário que pode formar precipitados insolúveis, os quais resultam em infecções nos rins, na bexiga e em outras partes do trato urinário. Ao degradar o ácido oxálico e, portanto, potencialmente evitar sua precipitação e acúmulo no trato urinário, as bactérias da presente invenção podem tratar e prevenir infecções e outras doenças do trato urinário. A degradação do ácido oxálico pode ser medida in vitromediante o uso do kit para testes de ácido oxálico cat # 755699, disponível comercialmente junto a Boehringer Mannheim/R-Biopharm.
[0047] Os Lactobacillida presente invenção podem ser usados em um método para a melhoria ou manutenção da saúde de animais de estimação, compreendendo a melhoria da digestão de fibras. A melhoria da digestão de fibras é desejável, pois promove a proliferação das ditas bactérias probióticas, bem como da microflora endógena benéfica, o que auxilia na supressão de algumas bactérias potencialmente patogênicas. Além disso, uma diminuição na quantidade de metabólitos tóxicos e enzimas nocivas que resultam da fermentação colônica foi documentada em seres humanos (Tomomatsu, H. "Health effects of oligosaccharides”, (1994) Food Technol, 48, 61 - 65). A digestão de fibras pode ser determinada mediante o uso do método descrito em Vickers et al. (2001), "Comparison of fermentation of selected fπjctooligosaccharides and othe rfiber substrates by canine ∞lonic microflora", Am. J. Vet. Res. 61 (4), 609-615, exceto pelo fato de que em vez de inocular usando amostras fecais diluídas, cada experimento utilizou culturas puras das cepas bacterianas em questão.
[0048] De preferência, os métodos da presente invenção compreendem a administração de Lactobacilliselecionados das espécies compreendendo Lactobacilli salivaríus, Lactobacilli casei, ou Lactobacilli murinus.
[0049] Alguns exemplos não-limitadores de Lactobacilli probioti∞s obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos e uteis à presente invenção são descritos ∞m mais detalhes em WO 98/35014, WO 03/010298 e WO 03/010299.
[0050] Em WO 98/35014 são descritos Lactobacilli salivaríusprobioti∞s, isolados a partir de trato gastrointestinal humano ressecado e lavado. Essas bactérias estão depositadas no NCIMB sob os números de depósito 40829 e 40830.
[0051] Em WO 03/010298 são descritos outros exemplos de Lactobacilli salivaríusprobioti∞s, isolados a partir de trato gastrointestinal humane ressecado e lavado. Essas bactérias estão depositadas no NCIMB sob os números de depósito 41044,41045, 41047, 41093 e 41094.
[0052] Em WO 03/010299 são descritos outros exemplos de Lactobacilli casei probioti∞s, isolados a partir de trato gastrointestinal humano ressecado e lavado. Essas bactérias estão depositadas no NCIMB sob os números de depósito 41043, 41046,41095,41096 e 41097.
[0053] Exemplos adicionais incluem cepas de Lactobacilliobteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal canino ressecado e lavado, tendo atividade probiótica em animais. Os probioti∞s ∞nsistem em microorganismos viáveis ou mortos, composições processadas de microorganismos, seus constituintes como proteínas ou carboidratos, ou frações purificadas de fermentos bacterianos, que afetam de modo benéfico um hospedeiro. O uso geral de bactérias probióticas se dá sob a forma de células viáveis. No entanto, isso pode ser estendido a células não-viáveis, como culturas mortas ou composições contendo fatores benéficos expressos pelas bactérias probióticas. Isso pode incluir microorganismos mortos por meios térmicos, por exposição a um pH alterado, ou submetidos a pressão. Para o propósito da presente invenção, o teimo "probióticos" destina-se a incluir, ainda, os metabolites gerados pelos microorganismos da presente invenção durante a fermentação, caso estes não sejam separadamente indicados. Esses metabolites podem ser liberados no meio de fermentação, ou podem ser armazenados no interior do microorganismo. Para usa na presente invenção, o termo "probiótico" inclui, também, bactérias, homogenates bacterianos, proteínas bacterianas, extratos bacterianos, sobrenadantes de fermento bacteriano e misturas desses itens, os quais exercem funções benéficas ao animal hospedeiro, quando administrados em uma dose terapêutica.
[0054] Descobriu-se que as bactérias formadoras de ácido láctico do gênero Lactobacilli,obteníveis mediante isolamento direto a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos, são aderentes ao trato Gl em seguida a alimentação com células bacterianas viáveis, e apresentam, também, uma ação imunomodulatória significativa quando fornecidas aos animais sob suas formas viáveis, não-viáveis ou fracionadas. Sem se ater a teoria, acredita- se que os Lactobacilliobteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado mantenham estreita associação com os tecidos mucosos intestinais. Sem se ater à teoria, acredita-se que isso resulte na geração, pelos Lactobacilliprobióticos da presente invenção, de respostas alternativas no hospedeiro, as quais resultam em sua ação probiótica. Descobriu-se que as bactérias probióticas obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado podem modular o sistema imune do hospedeiro por meio de interação direta com o epitélio mucoso e com as células imunes do hospedeiro. Essa imunomodulação, em conjunto com o mecanismo tradicional de ação associado as bactérias probióticas, isto é, a prevenção da aderência de patógenos aos intestinos, mediante oclusão e competição por nutrientes, faz dos Lactobacillida presente invenção organismos probióticos altamente eficazes.
[0055] Os Lactobacillida presente invenção, obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal canino ressecado e lavado, apresentam atividade microbicida in vitro ∞ntra diversas cepas/espécies bacterianas patogênicas. Sem se ater a teoria, acredita-se que essa atividade microbicida in vitroindique o potencial de atividade probiótica in vivo em animais, de preferência animais de estimação como cães e gatos. As bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção apresentam, de preferência, atividade microbicida in vitro ∞ntra Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria innocua ou Eschericia coli, ∞m mais preferência uma ∞mbinação dessas cepas e, ∞m mais preferência ainda, todas essas cepas.
[0056] Sem se ater a teoria, acredita-se que a atividade microbicida das bactérias formadoras de ácido láctira da presente invenção pode ser o resultado de várias ações diferentes realizadas pelas ditas bactérias. Foi sugerido anteriormente, na técnica, que diversas ∞pas de bactérias isoladas a partir de amostras fecais exercem seu efeito probioti∞ no trato gastrointestinal, após seu ∞nsumo oral ao impedir, mediante oclusão, a fixação de organismos patogênicos à mu∞sa intestinal. Isto exige o ∞nsumo oral de células bacterianas "vivas" ou viáveis, para que uma ∞lonia de bactérias se estabeleça nos intestinos. No entanto, acredita-se que os Lactobacillida presente invenção, obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal canino ressecado e lavado, embora exerçam algum efeito probioti∞ mediante oclusão se fornecidos sob uma forma viável, possam oferecer um efeito probioti∞ substancial em suas formas tanto viáveis ∞mo não-viáveis devido a produção, durante a fermentação in vitro,de uma ou mais substancias que ou matam os microorganismos patogênicos ou inibem sua proliferação, e/ou que alteram a imuno∞mpet0ncia do animal hospedeiro. Essa forma de atividade probioti∞ é desejável, já que as bactérias da presente invenção podem ser fornecidas sob a forma de culturas viáveis ou não-viáveis, ou ∞mo produtos de fermentação purificados e, ainda assim, proporcionar um efeito terapêutico benéfico ao animal hospedeiro.
[0057] De preferência, as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção são capazes de manter sua viabilidade após trânsito pelo trato Gl. Isso e desejável, para que as culturas de bactérias vivas possam ser administradas por via oral, e para que o∞rra a colonização dos após o trânsito através do esôfago e do estomago. A ionização dos intestinos pelas bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção é desejável para proporcionar ao hospedeiro benefícios probioti∞s de longo prazo. A dosagem oral de células não-viáveis ou isolados purificados das mesmas induz benefícios temporários, mas, ∞mo as bactérias não são viáveis, não são capazes de se proliferar e proporcionar, de maneira ∞ntinua, um efeito probioti∞ in situ.Como resultado, isto pode exigir que o hospedeiro re∞ba doses regularmente, de modo a manter os benefícios de saúde. Em ∞ntraste, as células viáveis capazes de sobreviver ao trânsito gástrico em sua forma viável e, subsequentemente, ∞lonizar os intestinos mediante adesão a mu∞sa intestinal e proliferação sobre a mesma, são capazes de proporcionar de maneira ∞ntinua os efeitos probioti∞s in situ.
[0058] Portanto, é preferencial que as bactérias formadoras de ácido láctira da presente invenção mantenham sua viabilidade após a suspensão em um meio ∞m pH 2,5 durante 1 hora. Para uso na presente invenção, o termo "manter a viabilidade" significa que ao menos 25% das bactérias inicialmente em suspensão no meio de teste são viáveis, usando-se o método de ∞ntagem em placas ∞nhecido pelos versados na técnica. De preferência, o termo "manter a viabilidade" significa que ao menos 50% das bactérias inicialmente em suspensão são viáveis. É desejável que as bactérias formadoras de ácido láctira da presente invenção mantenham sua viabilidade após a exposição a um baixo pH, já que isso imita a exposição aos su∞s gástriras no estômago e no intestino superior in vivo, após a ∞nsumo oral por animais.
[0059] Além disso, e preferencial que as bactérias formadoras de ácido láctira da presente invenção apresentem uma proliferação de ao menos 66% quando na presença de ao menos 0,5 % de sais biliares de porco. A proliferação, para uso na presente invenção, e descrita com mais detalhes no Exemplo 3. Com mais preferência, as bactérias da presente invenção apresentam uma proliferação de ao menos 33% quando na presença de ao menos 1 % de sais biliares de porco. Com mais preferência ainda, as bactérias da presente invenção apresentam uma proliferação de 100% na presença de 0,5% de sais biliares de porco. Sem se ater à teoria, acredita-se que as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção que sejam capazes de manter a viabilidade na presença de ao menos 0,5% de sais biliares de porco, sejam capazes de sobreviver as condições presentes nos intestinos. Acredita-se que isso seja um resultado da adição de bílis de porco ao meio de cultura, reproduzindo as condições do intestino.
[0060] Além disso, é preferencial que as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção apresentem adesão significativa a células epiteliais de intestino in vitro.Para uso na presente invenção, o termo "adesão significativa" significa que ao menos 0,2% do número total de bactérias formadoras de ácido láctico coincubadas com as células epiteliais in vitroaderem as ditas células. Com mais preferência, ao menos 0,3% das células bacterianas coincubadas aderem às células in vitro.Sem se ater a teoria, acredita-se que a aderência a células epiteliais de intestino in vitroseja uma indicação da capacidade das bactérias formadoras de ácido láctico para colonizar o trato Gl de um animal in vivo.
[0061] De preferência, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico de acordo com a presente invenção pertence a uma espécie selecionada do grupo consistindo em Lactobacillus murínus/ruminus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus buchnerí, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus lactis,ou combinações dessas cepas, com mais preferência Lactobacillus murínus/ruminus.
[0062] A sequência de polinucleotídeo intergênico 16s - 23s é conhecida pelos versados na técnica como a sequência de DNA, no genoma bacteriano, que pode ser usada para identificar diferentes espécies e cepas de bactérias. Essa sequência de polinucleotídeo intergêniro pode ser determinada pelo método detalhado abaixo.
[0063] As colônias de Lactobacilliforam removidas de uma placa de ágar e ressuspensas em tampão IX PCR, aquecidas a 96°C durante 5 minutos, congeladas a -70°C durante um período de 5 a 10 minutos e, então, descongeladas, e uma alíquota foi adicionada a um tuba eppendorf para PCR. A PCR foi realizada utilizando os iniciadores de espaçador intergênico (IGS), IGS L: 5' -GCTGGATCACCTCCTTTC - 3' (SEQ. ID N° 5) e IGS R: 5' - CTGGTGCCAAGGCATCCA - 3' (SEQ. ID N° 6). As condições de ciclo foram de 96 °C durante 1 minuto (1 ciclo), 94 °C durante 30 segundos, 53 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 30 segundos (28 ciclos). A reação de PCR continha 5 pL de DNA, tampão para PCR (Bioline, Reino Unido), 0,2 mM de dNTPs (Roche, Reino Unido), 0,4 p de iniciador M IG5 L e R (150 ng / 50 pL) (MWG Biotech, Alemanha) e polimerase Bioline Taq (0,6 unidades). As reações de PCR foram realizadas em um teimociclo Hybaid. Os produtos da PCR (8 pL) foram passados juntamente ∞m um marcador para peso molecular (4>X.174 Hae III,Promega) por um gel a 2% de agarose manchada ∞m EtBr em TAE, para determinar seu perfil de IGS. Utilizando os mesmos iniciadores mencionados acima, o DNA do espaçador intergêniw (IGS) foi sequenciado para as 4 ∞pas de Lactobacillicaninos, utilizando métodos ∞nhecidos pelos versados na técnica.
[0064] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctira do gênero Lactobacillitem uma sequência de polinucleotídeo intergênkx) 16s - 23s apresenta ao menos 88%, de preferência ao menos 90% e, ∞m mais preferência, ao menos 95% de homologia ∞m a sequência de polinucleotídeo de a∞rdo ∞m a SEQ. ID N° 1. Com mais preferência, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctira de a∞rdo ∞m a presente invenção tem uma sequência de polinucleotídeo 16s - 23s de a∞rdo ∞m a SEQ. ID N° 1. Com mais preferência ainda, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctico de a∞rdo ∞m a presente invenção e a ∞pa Lactobacilli murínus/mminus NCMB 41194 (AHC1222), ou uma mutação da mesma.
[0065] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctico do gênero Lactobacillitem uma sequência de polinucleotídeo intergênico 16s - 23s que apresenta ao menos 88%, de preferência ao menos 90% e, ∞m mais preferência, ao menos 95% de homologia ∞m a sequência de polinucleotídeo de a∞rdo ∞m a SEQ. ID N° 2. Com mais preferência, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido tecti∞ de a∞rdo ∞m a presente invenção tem uma sequência de polinucleotídeo 16s - 23s de a∞rdo ∞m a SEQ. ID N° 2. Com mais preferência ainda, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctico de a∞rdo ∞m a presente invenção e a ∞pa Lactobacilli murínus/ruminus NCIMB 41196 (AHC5323), ou uma mutação da mesma.
[0066] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctira do gênero Lactobacillitem uma sequência de polinucleotídeo intergênico 16s - 23s que apresenta ao menos 88%, de preferência ao menos 90% e, ∞m mais preferência, ao menos 95% de homologia ∞m a sequência de polinucleotídeo de a∞rdo ∞m a SEQ. ID N° 3. Com mais preferência, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctira de a∞rdo ∞m a presente invenção tem uma sequência de polinucleotídeo 16s - 23s de a∞rdo ∞m a SEQ. ID N° 3. Com mais preferência ainda, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctico de a∞rdo ∞m a presente invenção e a ∞pa Lactobacilli murínus/ruminus NCIMB .41197 (AHC6331), ou uma mutação da mesma.
[0067] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctira do gênero Lactobacillitem uma sequência de polinucleotídeo intergênico 16s-23s que apresenta ao menos 88%, de preferência ao menos 90% e, ∞m mais preferência, ao menos 95% de homologia ∞m a sequência de polinucleotídeo de a∞rdo ∞m a SEQ. ID N° 4. Com mais preferência, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctira de a∞rdo ∞m a presente invenção tem uma sequência de polinucleotídeo 16s - 23s de acordo ∞m a SEQ. ID N° 4. Com mais preferência ainda, a ∞pa de bactérias formadoras de ácido láctico de a∞rdo ∞m a presente invenção e a ∞pa Lactobacilli murínus/ruminus NCIMB 41195 (AHC3133), ou uma mutação da mesma.
[0068] Em seguida ao sequenciamento, as sequências obtidas para as quatro cepas depositadas foram comparadas a base de dados de sequências "BUXST", disponível online em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/para verificação de homologia com outras sequências bacterianas 16s - 23s depositadas. As igualdades mais próximas para AHC 1222, 3133, 5323 e 6331 (NCIMB 41194, 41195, 41196 e 41197, respectivamente) foram encontradas na cepa Lactobacillus ruminis AF080103. No entanto, existem várias diferenças importantes entre as cepas AHC e a cepa de Lactobacillus ruminis na região do espaçador, resultando em um grau de homologia de 87%, e uma pontuação BLAST de ao menos 170.
[0069] O método de uso das bactérias Lactobacillida presente invenção tipicamente envolve o consumo oral pelo animal. O consumo oral pode ocorrer como parte da ingestão dietária normal, ou sob a forma de um suplemento a mesma. O consumo oral tipicamente ocorre ao menos uma vez por mês, de preferência ao menos uma vez por semana e, com mais preferência, ao menos uma vez por dia. Os Lactobacilli podem ser administrados ao animal de estimação em uma quantidade terapeuticamente eficaz para manter ou melhorar a saúde do animal, de preferência um animal de estimação. Para uso na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz”, no que se refere as bactérias formadoras de ácido láctico, significa aquela quantidade de bactérias que é suficiente para proporcionar o efeito ou benefício desejado a um animal hospedeiro precisando de tratamento, porem baixa o suficiente para evitar efeitos adversos como toxicidade, irritação ou resposta alérgica, proporcionalmente a uma relação risco/benefício razoável quando usada do modo indicado na presente invenção. A "quantidade terapeuticamente eficaz" específica irá variar conforme fatores como a condição especifica sendo tratada, as condições físicas do usuário, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (caso haja) , a forma de dosagem específica a ser utilizada, o veículo empregado, a solubilidade da forma de dosagem, e o regime de dosagem especifico.
[0070] De preferência, as bactérias formadoras de ácido láctico são fornecidas ao animal de estimação em uma dose na faixa de 1,0E+04 a 1,0E+14 UFC por dia e, com mais preferência, na faixa de 1,0E+06 a 1,0E+12 UFC por dia. A composição pode conter, de preferência, ao menos 0,001% de Lactobacillina faixa de 1,0E+04 a 1,0E+12 ufc/g, obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos. As bactérias do tipo Lactobacillipodem ser administradas ao animal em sua forma viável, sob a forma de células mortas, ou como destilados, isolados ou outras frações dos produtos de fermentação das bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção, ou qualquer mistura desses materiais.
[0071] De preferência, as bactérias Lactobacilli,ou uma fração purificada ou isolada das mesmas, são usadas para preparar uma composição destinada a manter ou melhorar a saúde de um animal. Conforme indicado acima, a composição pode ser parte da ingestão dietária normal, ou pode ser um suplemento. Nos casos em que a composição faz parte da ingestão dietária normal, esta pode estar sob a forma de um alimento seco para animais, como biscoitos ou ração, um alimento a base de grãos processados, um alimento úmido para animais, iogurtes, molhos, itens mascaveis, petiscos e similares.
[0072] Essas composições podem compreender outros componentes. Outros componentes são benéficos para inclusão nas composições usadas na presente invenção, mas são opcionais para os propósitos da invenção. Por exemplo, as composições alimentícias são, de preferência, nutricionalmente balanceadas. Em uma modalidade, as composições alimentícias podem compreender, ∞m base na matéria seca, de cerca de 20% a cerca de 50% e, de preferência, de cerca de 22% a cerca de 40% de proteína bruta, em peso da composição alimentícia. O material de proteína bruta pode ∞mpreender qualquer material tendo um teor de proteínas de ao menos cerca de 15% em peso, sendo que alguns exemplos não limitadores destes incluem proteínas vegetais como feijão soja, caroço de algodão e amendoim, e proteínas animais como caseína, albumina e tecido cárneo. Alguns exemplos, não-limitadores de tecido cárneo útil a presente invenção, incluem carne fresca e farinhas secas ou processadas, como farinha de peixe, farinha de aves, farinha de carne, farinha de ossos e similares. Outros tipos de fontes adequadas de proteína bruta incluem glúten de trigo ou de milho, e proteínas extraídas de fontes microbianas, como levedura.
[0073] Além disso, as composições alimentícias podem compreender, ∞m base na matéria seca, de cerca de 5% a cerca de 35% e, de preferência, de cerca de 10% a cerca de 30% de gordura, em peso da ∞mposigao alimentícia. Além disso, as composições alimentícias ∞mpreendendo as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção podem, também, ∞mpreender de cerca de 4% a cerca de 25% de fibra dietária total. As composições podem, também, ∞mpreender múltiplas fontes de amido, ∞nforme descrito em W099/51108.
[0074] As ∞mposigoes da presente invenção podem ∞nter, ainda, uma fonte de carboidrato. São fontes ilustrativas os grãos ou ∞reais ∞mo arroz, milho, milo, sorgo, ∞vada, alfafa, trigo e similares. Além disso, as composições também podem ∞nter outros materiais, ∞mo soro de leite se∞ e outros subprodutos lácteos.
[0075] As composições ∞mpreendendo as bactérias da presente invenção podem, também, ∞mpreender um prebioti∞. o termo "prebioti∞"inclui substâncias ou ∞mpostos que são fermentados pela flora intestinal do animal de estimação e, ∞nsequentemente, promovem a proliferação ou o desenvolvimento de bactérias formadoras de ácido láctira no trato gastrointestinal do dito animal, em detrimento de bactérias patogênicas. O resultado dessa fermentação é uma liberação de ácidos graxos, em particular ácidos graxos de cadeia curta, no cólon. Isto tem o feito de reduzir o valor de pH no cólon. Alguns exemplos não limitadores de prebioti∞s adequados incluem oligossacarídeos, ∞mo inulina e seus produtos de hidrólise ∞nhecidos ∞mo frutooligosacarídeos, galactooligosacarídeos, xilooligossacarídeos, ou oligoderivados de amido. Os prebioti∞s podem ser fornecidos sob qualquer forma adequada. Por exemplo, o prebioti∞ pode ser fornecido sob a forma de material de origem vegetal ∞ntendo essas fibras. Os materiais de origem vegetal adequados incluem aspargo, alcachofras, cebolas, trigo ou chicória, bem ∞mo resíduos desses materiais de origem vegetal. Altemativamente, a fibra prebioti∞ pode ser fornecida sob a forma de um extrato de inulina, sendo adequados, por exemplo, os extratos de chicória. Os extratos de inulina adequados podem ser obtidos junto a Orafti SA de Tirlemont 3300, B0lgi∞, sob a marca registrada "Raftiline". Por exemplo, a inulina pode ser fornecida sob a forma de Raftiline (g) ST, que é um pó bran∞ fino que contem de cerca de 90% a cerca de 94%, em peso, de inulina, até cerca de 4%, em peso, de glicose e frutose, e de cerca de 4% a 9% , em peso, de sacarose. Altemativamente, a fibra pode estar sob a forma de um frutooligossacarídeo como aquele obtido junto a Orafti SA de Tirlemont 3300, Bélgica, sob a marca registrada "Raftilose". Por exemplo, a inulina pode ser fornecida sob a forma de Raftilose (g) P95. De outro modo, os frutooligosacarideos podem ser obtidos pela hidrólise da inulina por meio de métodos enzimáticos, ou mediante o uso de microorganismos.
[0076] Para alimentos secos para animal de estimação, um processo adequado á a cocção com extrusão, embora assamento e outros processos adequados possam ser usados. Quando cozido com extrusão, o alimento seco para animais de estimação é geralmente fornecido sob a forma de uma ração. Se for usado um prebiótico, este pode ser misturado, antes do processamento, aos demais ingredientes do alimento seco para animais de estimação. Um processo adequado é descrito no Pedido de Patente Europeia N° 0850569. Se for usado um microorganismo probiótico, e melhor que este seja aplicado como um revestimento ou um recheio no alimento seco para animais de estimação. Um processo adequado e descrito na publicação de patente europeia número EP0862863.
[0077] Para alimentos úmidos, os processos descritos nas patentes U.S. N° 4.781.939 e 5.132.137 podem ser usados para produzir produtos cárneos simulados. Outros procedimentos para a produção de produtos em pedaços também podem ser usados como, por exemplo, cozimento em um forno a vapor. Altemativamente, produtos em filão podem ser produzidos mediante a emulsificação de um material cárneo adequado para produzir uma emulsão de carne, adicionando-se um agente gelificante adequado e aquecendo-se a dita emulsão de carne, antes de acondicionar a mesma em latas ou outros recipientes. As composições alimentícias úmidas típicas podem compreender de cerca de 5% a cerca de 15% de proteína, de cerca de 1% a cerca de 10% de gordura, e de cerca de 1% a cerca de 7% de fibra. Exemplos não-limitadores de ingredientes que podem ser usados em composições alimentícias úmidas incluem frango, peru, carne bovina, pescado branco, caldo de frango, caldo de peru, caldo de carne bovina, fígado de frango, quirela de arroz, grits de milho, farinha de peixe, ovos, polpa de beterraba, cloreto, farelo de linhaça, cordeiro, subprodutos de carne bovina, subprodutos de frango e misturas desses itens.
[0078] Em outra modalidade, as composições de suplemento como biscoitos, itens mascaveis e outros petiscos podem compreender, ∞m base na matéria seca, de cerca de 20% a cerca de 60% de proteína, ou de cerca de 22% a cerca de 40% de proteína, em peso da ∞mposipao de suplemento. Como outro exemplo, as ∞mposigoes de suplemento podem ∞mpreender, ∞m base na matéria seca, de ∞rca de 5% a ∞rca de 35% de gordura, ou de ∞rca de 10% a cerca de 30% de gordura, em peso da composição de suplemento. As ∞mposigoes alimentícias e de suplemento destinadas ao uso por cães ou gatos são de ∞nhecimento comum na técnica.
[0079] Os alimentos para animal de estimação podem ∞nter outros agentes ativos, ∞mo ácidos graxos de cadeia longa e zin∞. Os ácidos graxos de cadeia longa adequados incluem ácido alfa-linoléico, ácido gama-linolênkco, ácido linoléico, ácido ei∞sapentanoi∞ e ácido do∞saexanoi∞. Os óleos de peixe são uma fonte adequada de ácidos ei∞sapentanoi∞s e ácido do∞saexanoi∞.
[0080] O óleo de borragem, o óleo de semente de groselha negra e o óleo de prímula são fontes adequadas de ácido gama-linol0ni∞. Os óleos de cártamo, os óleos de girassol, os óleos de milho e os óleos de soja são fontes adequadas de ácido linoléico. Esses óleos também podem ser usados nos substratos para revestimento mencionados acima. O zin∞ pode ser fornecido de diversas formas adequadas, por exemplo ∞mo sulfato de zin∞ ou oxido de zin∞. Além disso, muitos ingredientes ∞mumente usados em alimentos para animal de estimação são fontes de ácidos graxos e de zin∞. Tem sido observado que a ∞mbinação de chicória, como uma fonte de prebioti∞, ∞m um óleo ri∞ em ácido linolei∞, ∞mo o óleo de soja, proporciona benefícios inesperados, que sugerem um efeito sinérgkco.
[0081] Nos casos em que a ramposição está sob a forma de um molho, esta ∞mpreende, de preferência, ao menos 10% de 5 um caldo, sendo que alguns exemplos não-limitadores destes incluem caldos de vegetais, de carne bovina, de frango ou de presunto. As ∞mposi∞es de molho típicas podem compreender de cerca de 0,5% a cerca de 5% de proteína bruta, de cerca de 2% a cerca de 5% de gordura bruta, e de cerca de 1 % a cerca de 5% de fibra.
[0082] Alguns outros exemplos não-limitadores de suplementos adequados ao uso na presente invenção incluem pós, suspensões de óleo, suspensões a base de 5 leite e queijos, bem como pílulas ou cápsulas. Nos casos em que a composição está sob a forma de uma pílula, agentes de ligação adequados são necessários para manter a pílula sob uma forma sólida e comprimida. Alguns exemplos não-limitadores de agentes de ligação adequados incluem as gomas naturais como goma xantana, pectinas, lecitinas, alginatos e outras conhecidas pelos versados na técnica. Nos 10 casos em que a composição está sob a forma de uma cápsula, esta é de preferência encapsulada mediante o uso de tecnologias conhecidas pelos versados na técnica. Alguns exemplos não-limitadores de materiais de encapsulação adequados incluem álcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona (PVP), alginatos e gelatina. As composições a base de iogurte podem compreender de cerca de 1 % a cerca de 5% 15 de proteína, de cerca de 10% a cerca de 20% de prebiótico Lactobacilli murínus, usado de acordo com a presente invenção.
Figure img0003
Figure img0004
[0083] Os Exemples de 8 a 10 são exemples de composições de suplemento à base de iogurte ∞mpreendendo probioti∞ Lactobacilli muiinus,usado de a∞rdo ∞m a presente invenção.
Figure img0005
[0084] Embora modalidades particulares da presente invenção tenham sido ilustradas e descritas, deve ficar evidente aos versados na técnica que várias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que se desvie do caráter e âmbito da invenção. Portanto, pretende-se ∞brir nas reivindicações anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram no es∞po da presente invenção.

Claims (4)

1. Uso de uma composição compreendendo uma cepa probiótica de Lactobacilli,CARACTERIZADO pelo dito Lactobacilliprobiótico ser da espécie Lactobacillus murinus', a cepa selecionada do grupo consistindo de Lactobacillus murinusNCIMB 41194 (AHC1222); Lactobacillus murinusNCIMB 41195 (AHC 3133), Lactobacillus murinusNCIMB 41196 (AHC 5323); Lactobacillus murinus NCIMB 41197 (AHC6331), obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos, para a fabricação de um medicamento para tratamento de um animal de estimação, sendo o dito tratamento selecionado dentre: regulação do sistema imune de um animal de estimação, a dita regulação compreendendo tratar ou prevenir doença autoimune em um animal de estimação, tratar ou impedir a inflamação em um animal de estimação ou misturas das mesmas, manutenção ou melhoria da saúde da pele e/ou da pelagem de um animal de estimação, compreendendo tratar ou prevenir doença atópica da pele em animais de estimação, prevenindo perda de peso durante e após infecção em um animal de estimação, prevenção ou tratamento de infecções do trato gastrointestinal de um animal de estimação ou misturas das mesmas, em que o dito animal de estimação é selecionado do grupo consistindo de caninos e felinos.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOpelo fato de que a dita cepa probiótica de Lactobacillié isolada a partir de tecido gastrointestinal ressecado e lavado obtido de seres humanos, cães ou gatos.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOpelo fato de prevenir ou tratar infecções do trato gastrointestinal, sendo que a dita prevenção ou tratamento compreende a redução do número de bactérias patogênicas encontradas nas fezes do dito animal de estimação, ou combinações desses itens.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOpelo fato de que as ditas bactérias patogênicas são selecionadas a partir do grupo consistindo em Clostridia, Escherichia, Salmonellae combinações desses itens.
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