BRPI0611492B1

BRPI0611492B1 - Bifidobactéria probiótica felina

Info

Publication number: BRPI0611492B1
Application number: BRPI0611492-0A
Authority: BR
Inventors: Barry Pius Kiely; Liam Diarmuid O'mahony; Gregory Dean Sunvold; Thomas Williammaxwell Boileau; John Macsharr
Original assignee: Mars, Incorporated; Alimentary Health Ltd
Priority date: 2005-05-31
Filing date: 2006-02-02
Publication date: 2021-10-13
Also published as: US20090214499A1; EP1885383B1; US8034601B2; AU2006253007B2; EP1885383A1; CA2607949C; US20060269534A1; BRPI0611492A2; AU2006253007A1; US9404162B2; ES2607988T3; CA2607949A1; PL1885383T3; JP2008541757A; JP4938006B2; AR053805A1; WO2006130188A1

Abstract

de acordo com a presente invenção, é apresentada uma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico, do gênero bifidobacteria, obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, e apresentando uma atividade probiática em animais. são apresentados, também, métodos de uso e composições compreendendo as bifidobacteria da presente invenção.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo de microorganismos probióticos, mais específicamente a bactérias formadoras de ácido láctico probiótica felinas, bem como métodos para o uso das mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os mecanismos de defesa para proteção do trato gastrointestinal (GI) de mamíferos contra a colonização por bactérias são altamente complexos. O trato GI da maioria dos mamíferos é colonizado por microflora nativa e por microorganismos patogênicos invasivos. Em um estado saudável, essas microfloras concorrentes encontram-se em um estado de equilíbrio. A modificação do equilíbrio da microflora intestinal pode causar ou evitar diversos transtornos gastrointestinais, tanto em seres humanos como em outras espécies de mamíferos, como animais de estimação, inclusive gatos, cães e coelhos. O bem-estar de animais de estimação está estreitamente relacionado a alimentação e a saúde gastrointestinal, e a manutenção do equilíbrio da microflora intestinal nesses animais pode resultar em animais de estimação mais saudáveis.

[003] O número e a composição da microflora intestinal tendem a ser estáveis, embora idade e dieta possam modificá-los.

[004] A acidez gástrica, a bilis, o peristaltismo intestinal e a imunidade local são fatores considerados importantes na regulação da flora bacteriana presente no intestino delgado de seres humanos e diversos outros mamíferos.

[005] Frequentemente, os transtornos gastrointestinais em animais de estimação, inclusive aqueles encontrados em felinos, estão ligados a proliferação bacteriana e a produção de enterotoxinas por bactérias patogênicas. Esses fatores perturbam o equilíbrio da microflora intestinal e podem promover inflamação e respostas imunológicas aberrantes.

[006] Ao longo dos últimos anos, pesquisas começaram a revelar algumas valiosas cepas de bactérias, e seu uso potencial como agentes probióticos. Os probióticos são considerados preparações de bactérias, ou mortas, tendo constituintes sejam estas viáveis como proteínas ou carboidratos, ou frações purificadas de fermentos bacterianos, que promovem a saúde dos mamíferos ao preservar a microflora natural no trato GI, e ao reforçar os controles normais contra respostas imunológicas aberrantes. Acredita-se que as bactérias probiótica sejam mais eficazes quando derivadas da espécie que se pretende tratar, ou de espécies com parentesco próximo a esta. Portanto, existe uma necessidade por cepas probiótica derivadas de animais de estimação, para serem utilizadas para animais de estimação, que sejam diferentes daquelas derivadas de seres humanos.

[007] O documento WO 01/90311 apresenta microorganismos probióticos isolados a partir de amostras fecais obtidas a partir de gatos, as quais tem atividade probiótica. No entanto, essas bactérias foram obtidas a partir de amostras fecais, e podem não ser parte da microflora intestinal natural presente na porção superior do trato gastrointestinal.

[008] Consequentemente, existe uma necessidade pela obtenção de cepas de bactérias, mediante isolamento a partir da microflora intestinal natural presente na porção superior do trato gastrointestinal, que sejam particularmente adaptadas para gatos, e que tenham sido selecionadas por suas propriedades probiótica e capacidade para sobreviver o processamento, incorporando essas cepas a composições que são adequadas a seu uso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] De acordo com a presente invenção, são apresentadas cepas de bactérias formadoras de ácido lácticodo gênero Bifidobacteria, obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, e apresentando uma atividade probiótica em animais. As cepas de bactérias formadoras de ácido láctico são selecionadas, de preferência, dentre as espécies compreendendo Bifidobacterium longum Bifidabacterium animalis,Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis au Bifidobacterium thermophilum.

[0010] Em uma modalidade preferencial, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico é uma cepa selecionada do grupo consistindo em Bifidobacterium longum com uma sequência de DNA da região do espaçador 16s-23s tendo mais de 95% de homologia com SEQ. ID N° 1, ou mais de 94% de homologia com SEQ. ID N° 2.

[0011] Em uma outra modalidade preferencial, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico e selecionada do grupo consistindo em Bifidobacterium longum NCIMB 41290 (AHF5340), Bifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231) e misturas dos mesmos.

[0012] Além disso, a presente invenção refere-se ao uso das bactérias formadoras de ácido láctico, obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, para a manutenção e melhoria da saúde do animal de estimação, bem como composições compreendendo as ditas bactérias formadoras de ácido láctico.

[0013] Estes e outros aspectos, bem como características e vantagens da presente invenção, ficarão aparentes aos versados na técnica a partir da leitura da presente descrição.

SEQUÊNCIAS

[0014] SEQ. ID N° 1 - sequência de nucleotideo do espaçador intergênico 16s- 23s de Bifidobacterium longum NCIMB 41290 (AHF5340).

[0015] SEQ. ID N° 2 - sequência de nucleotideo do espaçador intergênico 16s- 23s de Bifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231).

[0016] SEQ. ID N° 3 - sequência iniciadora 16s-23s de PCR do lado esquerdo, para análise de sequência.

[0017] SEQ. ID N° 4 - sequência iniciadora 16s-23s de PCR do lado direito, para análise da sequência.

NÚMEROS DE DEPÓSITO DAS BACTÉRIAS

[0018] A Tabela abaixo indica as espécies de Bifidobacterium e seu número da cepa, para cepas que são exemplos da presente invenção. As cepas bacterianas estão depositadas junto ao "National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria" (NCIMB), Aberdeen, Reino Unido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] Todos os pesos, medidas e concentrações na presente invenção são medidos a 25 °C na composição em sua totalidade, exceto onde indicado em contrário.

[0020] Exceto onde indicado em contrário, todas as porcentagens das composições aqui mencionadas são porcentagens em peso, e todas as razões são razões em peso.

[0021] Exceto onde indicado em contrário, todos os pesos moleculares são pesos moleculares médios ponderais.

[0022] Exceto onde indicado em contrário, o conteúdo de todas as fontes de literatura mencionadas neste texto estão aqui incorporadas em sua totalidade, por referência.

[0023] Exceto onde são apresentados exemplos específicos de valores reais medidos, os valores numéricos aqui mencionados devem ser considerados como sendo qualificados pela expressão "cerca de".

[0024] No âmbito da descrição apresentada a seguir, a abreviação UFC ("unidade formadora de colônia") designa o número de células bacterianas revelado por contagens microbiológicas em placas de ágar, como é de entendimento, comum na técnica.

[0025] Para uso na presente invenção, o termo "mutantes dos mesmos" inclui cepas bacterianas derivadas compreendendo mutações de DNA em outras sequências de DNA do genoma bacteriano, excluindo-se a sequência intergênica 16s-23s.

[0026] Para uso na presente invenção, o termo "mutações de DNA" inclui mutações naturais ou induzidas compreendendo ao menos alterações de base única, inclusive deleções, inserções, transversões e outras modificações de DNA conhecidas pelos versados na técnica, inclusive modificação genética introduzida em um nucleotideo ou sequência de aminoácidos original (pai), mantendo-se ao menos 50% de homologia com a sequência-pai. De preferência, a sequência compreendendo a mutação ou mutações de DNA tem ao menos 60%, com mais preferência ao menos 75% e com mais preferência ainda, 85% de homologia com a sequência-pai.

[0027] Para uso na presente invenção, a sequência de "homologia" pode ser determinada mediante o uso de técnicas-padrão conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser determinada mediante o uso do algoritmo de homologia "BLAST" disponível publicamente online, em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

[0028] Para uso na presente invenção, o termo "modificação genética" inclui a introdução de sequências de DNA exógenas e/ou endógenas no genoma de um organismo, seja por meio de inserção no genoma do dito organismo, seja por meio de vetores, inclusive DNA de plasmídios ou bacteriófagos, conforme é de conhecimento do versado na técnica, sendo que a dita sequência de DNA tem um comprimento de ao menos duas bases de ácido desoxirribonucleico.

[0029] Para uso na presente invenção, o termo "animal de estimação" significa um animal doméstico. De preferência, "animal de estimação" significa animais domésticos como felinos (gatos), caninos (cães), coelhos, furões, cavalos, vacas ou similares. Com mais preferência, "animal de estimação" significa um gato doméstico.

CEPAS DE BIFIDOBACTERIA FORMADORAS DE ÁCIDO LÁCTICO

[0030] O primeiro aspecto da presente invenção compreende uma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico do gênero Bifidobacteria, obtenivel mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, e apresentando uma atividade probiótica em animais. Os probióticos consistem em microorganismos viáveis ou mortos, composições processadas de microorganismos, seus constituintes como proteínas ou carboidratos, ou frações purificadas de fermentos bacterianos, que afetam de modo benéfico um hospedeiro. O uso geral de bactérias probiótica se dá sob a forma de células viáveis. No entanto, isso pode ser estendido a células não-viáveis, como culturas mortas ou composições contendo fatores benéficos expressos pelas bactérias probiótica. Isso pode incluir microorganismos mortos por meios térmicos, por exposição a um pH alterado, ou submetidos a pressão. Para o propósito da presente invenção, o termo "probióticos" destina-se a incluir, ainda, os metabólitos gerados pelos microorganismos da presente invenção durante a fermentação, caso estes não sejam separadamente indicados. Esses metabólitos podem ser liberados no meio de fermentação, ou podem ser armazenados no interior do microorganismo. Para uso na presente invenção, o termo "probiótico" inclui, também, bactérias, homogenatos bacterianos, proteínas bacterianas, extratos bacterianos, sobrenadantes de fermento bacteriano e misturas desses itens, os quais exercem funções benéficas ao animal hospedeiro, quando administrados em uma dose terapêutica.

[0031] Descobriu-se que as bactérias formadoras de ácido láctico do gênero Bifidobacteria, obteníveis mediante isolamento direto a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado de mamíferos, são aderentes ao trato GI em seguida a alimentação com células bacterianas viáveis, e apresentam, também, uma ação imunomodulatória significativa quando fornecidas aos animais sob suas formas viáveis, não-viáveis ou fracionadas. Sem se ater a teoria, acredita-se que as Bifidobacteria obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado mantenham estreita associação com os tecidos mucosos intestinais. Sem se ater a teoria, acredita- se que isso resulte na geração, pelas Bifidobacteria probióticas da presente invenção, de respostas altemativas no hospedeiro, as quais resultam em sua ação probiótica. Descobriu-se que as bactérias probióticas obteníveis mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado podem modular o sistema imune do hospedeiro por meio de interação direta com o epitélio mucoso e com as células imunes do hospedeiro. Essa imunomodulação, em conjunto com o mecanismo tradicional de ação associado as bactérias probiótica, isto é, a prevenção da aderência de patógenos aos intestinos, mediante oclusão e competição por nutrientes, faz dos Bifidobacteria da presente invenção organismos probióticos altamente eficazes.

[0032] As Bifidobacteria da presente invenção, obteníveis mediante isolamento a partir de trato GI feline ressecado e lavado, apresentam atividade microbicida in vitro contra diversas cepas/espécies bacterianas patogênicas. Sem se ater a teoria, acredita-se que essa atividade microbicida in vitro indique o potencial de atividade probiótica in vivo em animais, de preferência animais de estimação, como gatos. As bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção apresentam, de preferência, atividade microbicida in vitro contra Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes,Listeria innocua ou Eschericia coli, com mais preferência uma combinação dessas cepas e, com mais preferência ainda, todas essas cepas.

[0033] Sem se ater a teoria, acredita-se que a atividade microbicida das bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção pode ser o resultado de várias ações diferentes realizadas pelas ditas bactérias. Foi sugerido anteriormente, na técnica, que diversas cepas de bactérias isoladas a partir de amostras fecais exercem seu efeito probiótico no trato gastrointestinal, após seu consumo oral ao impedir, mediante oclusão, a fixação de organismos patogênicos a mucosa intestinal. Isto exige o consumo oral de células bacterianas "vivas" ou viáveis, para que uma colônia de bactérias se estabeleça nos intestinos. No entanto, acredita-se que as Bifidobacteria da presente invenção, obteníveis mediante isolamento a partir de trato GI felino ressecado e lavado, embora exerçam algum efeito probiótico mediante oclusão se fornecidos sob uma forma viável, possam oferecer um efeito probiótico substancial em suas formas tanto viáveis como não-viáveis devido a produção, durante a fermentação in vitro, de uma ou mais substâncias que ou matam os microorganismos patogênicos ou inibem sua proliferação, e/ou que alteram a imunocompetência do animal hospedeiro. Essa forma de atividade probiótica é desejável, já que as bactérias da presente invenção podem ser fornecidas sob a forma de culturas viáveis ou não- viáveis, ou como produtos de fermentação purificados e, ainda assim, proporcionar um efeito terapêutico benéfico ao animal hospedeiro.

[0034] De preferência, as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção são capazes de manter sua viabilidade após trânsito pelo trato GI. Isso é desejável, para que as culturas de bactérias vivas possam ser administradas por via oral, e para que ocorra a colonização dos após o trânsito através do esôfago e do estômago. A colonização dos intestinos pelas bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção é desejável para proporcionar ao hospedeiro benefícios probióticos de longo prazo. A dosagem oral de células não-viáveis ou isolados purificados das mesmas induz beneficios temporários mas, como as bactérias nao são viáveis, nao são capazes de se proliferar e proporcionar, de maneira continua, um efeito probiótico in situ. Como resultado, isto pode exigir que o hospedeiro receba doses regularmente, de modo a manter os beneficios de saúde. Em contraste, as células viáveis capazes de sobreviver ao trânsito gástrico em sua forma viável e, subsequentemente, colonizar os intestinos mediante adesão a mucosa intestinal e proliferação sobre a mesma, são capazes de proporcionar de maneira continua os efeitos probióticos in situ.

[0035] Portanto, preferencial que as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção mantenham sua viabilidade após a suspensao em um meio com pH 2,5 durante 1 hora. Para uso na presente invenção, o termo "manter a viabilidade" significa que ao menos 25% das bactérias inicialmente em suspensão no meio de teste são viáveis, usando-se o método de contagem em placas conhecido pelos versados na técnica. De preferência, o termo "manter a viabilidade" significa que ao menos 50% das bactérias inicialmente em suspensão são viáveis. É desejável que as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção mantenham sua viabilidade após a exposição a um baixo pH, já que isso imita a exposisão aos sucos gástricos no estômago e no intestino superior in vivo, após a consumo oral por animais.

[0036] Além disso, é preferencial que as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção apresentem uma proliferação de ao menos 66% quando na presença de ao menos 0,3% de sais biliares de porco. A proliferação, para uso na presente invenção, é descrita com mais detalhes no Exemplo 3. Com mais preferência, as bactérias da presente invenção apresentam uma proliferação de ao menos 66% quando na presença de ao menos 1% de sais biliares de felino. Sem se ater a teoria, acredita-se que as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção que sejam capazes de manter a viabilidade na presença de ao menos 0,3% de sais biliares de porco, sejam capazes de sobreviver as condições presentes nos intestinos. Acredita- se que isso seja um resultado da adição de bilis de porco ao meio de cultura, reproduzindo as condições do intestino.

[0037] Além disso, é preferencial que as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção apresentem adesão significativa a células epiteliais de intestino in vitro. Para uso na presente invenção, o termo "adesão significativa" significa que ao menos 1% do número total de bactérias formadoras de ácido láctico co-incubadas com as células epiteliais in vitro aderem as ditas células. Com mais preferência, ao menos 1,5% das células bacterianas co-incubadas aderem as células in vitro. Sem se ater a teoria, acredita-se que a aderência a células epiteliais de intestino in vitro seja uma indicação da capacidade das bactérias formadoras de ácido láctico para colonizar o trato GI de um animal in vivo.

[0038] De preferência, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico de acordo com a presente invenção é de uma espécie selecionada do grupo consistindo em Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis ou Bifidobacterium thermophilum, de preferência Bifidobacterium langum.

[0039] A sequência de polinucleotídeo intergênico 16s-23s é conhecida pelos versados na técnica como a sequência de DNA, no genoma bacteriano, que po de ser usada para identificar diferentes espécies e cepas de bactérias. Essa sequência de polinucleotídeo intergênico pode ser determinada pelo método detalhado abaixo, no exemplo 4.

[0040] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico é selecionada do grupo consistindo em Bifidobacteria com uma sequência de polinucleotídeo intergênico 16s-23s que tem mais de 95% de homologia com SEQ. ID N° 1, ou mais de 94% de homologia com SEQ. ID N° 2. Com mais preferência, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico e selecionada do grupo consistindo em Lactobacilli com uma sequência de polinucleotídeo 16s-23s tendo mais de 95%, com mais preferência ainda mais de 97% de homologia com SEQ. ID N° 1 ou SEQ. ID N° 2. Com mais preferência, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico de acordo com a presente invenção é selecionada do grupo consistindo em Bifidobacteria tendo uma sequência de polinucleotídeo 16s-23s de acordo com SEQ. ID N° 1 ou SEQ. ID N° 2. Com mais preferência ainda, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico de acordo com a presente invenção e selecionada de Bifidobacterium longum NCIMB 41290 (AHF5340), Bifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231) ou uma mutação das mesmas.

[0041] A cepa de bactérias formadoras de ácido láctico do gênero Bifidobacteria, obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal feline ressecado e lavado, pode ser usado para proporcionar benefícios probióticos em seguida ao consumo via oral em animais, de preferência animais de estimação ou seres humanos. Esses benefícios probióticos geralmente mantém ou melhoram a saúde geral do animal. Os elementos não-limitadores de saúde e fisiologia animal que são beneficiados, seja terapêuticamente pelo alívio de sintomas, ou profilaticamente pela prevenção de doenças, incluem transtornos inflamatórios, imunodeficiência, doenca inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, câncer (particularmente aqueles dos sistemas gastrointestinal e imune), doença diarréica, diarréia associada aos transtornos autoimunes, uso de antibióticos, apendicite, esclerose múltipla, mal de Alzheimer, amiloidose, artrite reumatóide, artrite, mobilidade das articulações, diabetes mellitus, resistência a insulina, infecções bacterianas, infecções virais, infeções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, trauma associado a cirurgia, doença metastática induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, ganho de peso, acúmulo excessivo de tecido adiposo, anorexia, controle de febre, caquexia, cura de ferimentos, úlceras, infecção da barreira intestinal, alergia, asma, transtornos respiratórios, transtornos circulatórios, doença cardíaca coronariana, anemia, transtornos do sistema de coagulação sanguínea, doença renal, transtornos do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, transtornos nutricionais, osteoporose, transtornos endócrinos e transtornos da epiderme. São preferenciais o tratamento do trato gastrointestinal, inclusive tratamento ou prevenção de diarréia, a regulação do sistema imune, de preferência tratamento ou prevenção de doença autoimune e inflamação, a manutenção ou melhoria da saúde da pele e/ou da pelagem, de preferência tratamento ou prevenção de doença atópica da pele, a melhoria ou redução dos efeitos do envelhecimento, inclusive consciência mental e níveis de atividade, a prevenção de transtornos associados ao eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal, e a melhoria da saúde das articulações, de modo a otimizar a mobilidade.

[0042] O tratamento dos transtornos apresentados acima pode ser medido mediante o uso de técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, transtornos inflamatórios, inclusive doença autoimune e inflamação, podem ser detectados e monitorados utilizando-se testes de função imune in vivo, como blastogênese de linfócitos, atividade de células "Natural Killer", resposta de anticorpos a vacinas, hipersensibilidade de tipo retardado e combinações desses itens. Esses métodos são brevemente descritos na presente invenção, mas bem conhecidos pelos versados na técnica. 1. Blastogênese de linfócitos: Este ensaio mede a resposta proliferativa in vitro de linfócitos isolados a partir de sangue integral fresco obtido de animais de teste e de controle para diversos mitogênios, e é uma medida da função geral das células T e B. Em resumo, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC, ou "peripheral blood mononucleocytes") são isolados a partir de sangue integral por meio de métodos Ficoll-Hypaque de centrifugação por densidade, conhecidos pelos versados na técnica. As PBMCs isoladas são lavadas duas vezes em meio celular RPMI 1640 suplementado com HEPES, L-glutamina e penicilina/estreptomicina. As células lavadas são ressuspensas em RPMI 1640 e contadas, e a densidade de células e adequadamente ajustada. As 2x105 células são expostas a uma gama de concentrações (de 0,1 μg/mL a 100 μg/mL) de diversos mitogênios, exemplos dos quais incluem mitogênio de caruru-de-cacho (Gibco), fitoemaglutinina (Gibco) e concanavalina A (Sigma), em triplicata, durante 72 horas a 37°C e 5% de CO2 com 10% de soro fetal bovino (Sigma). A 54 horas, as células são pulsadas com 1 μCi 3H-timidina e coletadas, e as contagens de cintilação são lidas em um TopCount NXT a 72 horas. 2. Atividade de células "Natural Killer": Conforme descrito em US 6.310.090, este ensaio mede a atividade efetora in vitro de células "natural killer" (NK) isoladas a partir de sangue integral fresco de animais de teste e de controle. As células "natural killer" (NK) são um componente da função imune inata de um mamífero. As células de adenocarcinoma de tiróide felino são usadas como células- alvo na avaliação da atividade citotóxica de células NK. Foi anteriormente demonstrado que essa linhagem de células e suscetível a morte por células NK felinas. As células-alvo foram cultivadas em um frasco T75 com 20 mL de meio mínimo essencial (MEM; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, EUA.), suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Quando confluentes, as células-alvo foram tripsinizadas, lavadas 3 vezes e ressuspensas a 5x105 células/mL em meio completo (RPMI-1640 + 10% FCS+100 U/mL de penicilina + 100 μg/mL de estreptomicina). Triplicatas de alíquotas de 100 μL das células-alvo foram pipetadas em placas com 96 cavidades de fundo em U (Costar, Cambridge, Massachussets, EUA) e incubadas durante 8 horas para permitir a aderência das células. Os linfócitos (células efetoras, 100 I-lL) isolados por meio de separação Ficoll-Hypaque (conforme descrito acima) foram, então, adicionados as células-alvo para se obter uma razão entre células efetoras e células alvo (E:A) de 10:1. Após 10 horas de incubação a 37°C, foram adicionados 20 μL de um substrato contendo 5 μg de brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT). A mistura foi incubada durante 4 horas a 37°C, após os quais o MTT não-metabolizado foi removido por aspiração. Os cristais de formazan foram dissolvidos mediante a adição de 200 μL de etanol a 95%. A densidade óptica (DO) foi medida em 570 nm, utilizando-se um leitor de microplacas. A porcentagem de morte celular específica para célula NK foi calculada conforme exposto a seguir:

3. Resposta de anticorpos a vacinas: Os indivíduos de teste receberam um conjunto (até 5) de vacinas após ao menos 12 semanas de alimentação probiótica ou de controle. As vacinas podem ser uma mistura de vacinas novas e redundantes. Alguns exemplos não-limitadores de conjuntos de vacina que podem ser usado incluem misturas de vacinas preparadas por Fort Dodge Animal Health. Alguns exemplos não-limitadores de vacinas adequadas ao uso na presente invenção incluem cinomose felina, adenovírus, coronavírus, parainfluenza, e parvovírus. A história de vacinação do indivíduo determinará as vacinas a serem utilizadas. As quantidades, no sangue, de anticorpos especificos para as vacinas administradas são medidas durante 3 semanas, sendo comparadas a duração e a intensidade da resposta nos grupos com alimentação de controle e probiótica. 4. Hipersensibilidade de tipo retardado: Um método in vivo não- invasivo para avaliação do estado do sistema imune. Este teste compreende uma injeção intradérmica do mitogênio policlonal fitoemaglutinina (PHA) em combinação com eritrócitos de ovelha, uma vacina multi valente, histamina (100 μL de fosfato de histamina a 0, 0275 g/L, Greer, Lenoir, NC), ou PBS (100 μL de solução salina tamponada com fosfato a 8,5 g/L, Sigma). A resposta imunológica ao antígeno é registrada como espessura da dobra de pele, usando calibres, em intervalos de tempo de 0, 24, 48 e 72 horas após a injeção. Um aumento na espessura da dobra de pele indica uma maior resposta de hipersensibilidade, que deve diminuir mediante o tratamento com as bactérias da presente invenção.

[0043] Métodos adicionais para a determinação do efeito das bactérias Bifidobacteria da presente invenção são descritos em US 6.133.323 e US 6.310.090.

[0044] Além disso, a melhoria quanta aos efeitos do envelhecimento pode ser determinada mediante o uso de absorptometria de dupla emissão de raios X ou tomografia computadorizada para medir a composição corporal, inclusive massa corporal gorda, massa corporal magra e conteúdo mineral ósseo. De modo similar, esse método pode ser usado para determinar alterações de anatomia como perda de peso ou densidade óssea em indivíduos, após infecção.

[0045] As Bifidobacteria da presente invenção também podem ser usadas em um método para redução dos níveis de estresse em animais de estimação. As concentrações sanguíneas de hormônios de estresse, inclusive epinefrina, norepinefrina, dopamina, cortisol e proteína C-reativa e outras proteínas de fase aguda podem ser medidas para determinar os níveis de estresse e sua redução ou manutenção. Esses hormônios são reconhecidos biomarcadores de estresse, e podem ser prontamente medidos mediante o usa de técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Adicionalmente, a medição direta do tamanho adrenal como um marcador in vivo da atividade do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal pode ser feita por meio de imagens de tomografia computadorizada.

[0046] Além disso, a manutenção ou a melhoria da saúde da pele e/ou da pelagem de animais de estimação, inclusive de doença atópica da pele, pode ser medida mediante o uso de avaliações de pele e pelagem conduzidas por dois indivíduos treinados. Exemplos de critérios examinados durante essas avaliações incluem: a) índice de queda de pelos: Um índice de queda de pelos é atribuído a cada indivíduo de teste mediante a coleta de pelos produzidos durante uma sessão de escovação padronizada . Os pelos são retidos e pesados, e os indivíduos de controle e de teste são comparados. b) Avaliações subjetivas de pele/pelagem: Examinadores treinados avaliam subjetivamente as condições de pele e pelagem, mediante a determinação de queda de pelos, caspa, brilho, uniformidade, maciez e densidade. c) Avaliação funcional da pele: A função de barreira da pele pode ser avaliada mediante a esfregação da superficie da pele com uma gaze encharcada em acetona.

[0047] Essa técnica perturba, de maneira eficaz, a função de barreira da pele ao remover da camada córnea camadas celulares individuais, juntamente com as frações de lipídio a estas associadas. A perturbação da barreira é quantificada por meio da medição do aumento na perda transepidérmica de água (PTEA) e do grau de vermelhidão do local ofendido, mediante o uso de métodos conhecidos pelos versados na técnica. As pontuações para vermelhidão (eritema) são obtidas mediante o uso do sistema de câmera e iluminação anteriormente descrito. Os registros de PTEA e as pontuações de vermelhidão são obtidos imediatamente antes e depois da perturbação, bem como nos pontos finais as cinco e as 24 horas, para avaliar as propriedades de proteção e cura da pele.

[0048] O tratamento ou prevenção de diarreia de estimação pode ser medido utilizando-se uma pontuação das fezes. A pontuação das fezes registrada diariamente, de acordo com as diretrizes, sendo os grupos de controle e de teste comparados antes e depois da alimentação com as bactérias, de acordo com a presente invenção.

Pontuação: 5 Extremamente seca

[0049] Estas fezes são duras e não aderem a superfícies. Estas fezes rolam quando empurradas. Nao são produzidas indentações quando estas fezes são apanhadas. Estas fezes são frequentemente defecadas em grupos de unidades individuais, em vez de uma unidade completa. Estas fezes mantém seu formato original após a coleta.

Pontuação: 4 Firme (fezes ideais)

[0050] Estas fezes são firmes, bem formadas e cilíndricas. Estas fezes não se rompem facilmente quando apanhadas. Estas fezes podem deixar resíduos sobre superfícies e luvas. Estas fezes são frequentemente defecadas como uma só unidade. Estas fezes mantêm seu formato original após a coleta.

Pontuação: 3 Mole, com formato

[0051] Estas fezes são moles, no entanto têm formatos definidos. Estas fezes se rompem facilmente e, definitivamente, deixam resíduos sobre superficies e luvas. Estas fezes frequentemente perdem seu formato original após a coleta. Estas fezes frequentemente se apresentam em conjunto com outra pontuação, mas podem compreender a totalidade da amostra.

Pontuação: 2 Mole, sem formato

[0052] Estas fezes são moles e não apresentam formato cilíndrico. O formato frequentemente associado a um "tipo 2" é aquele conhecido como "excremento de vaca". Estas fezes perdem o formato original quando coletadas, e definitivamente deixam resíduos sobre superficies e luvas. Estas fezes frequentemente se apresentam em conjunto com outra pontuação, mas podem compreender a totalidade da amostra. Estas amostras podem se espalhar por uma área de vários centimetros.

Pontuação: 1 Líquida

[0053] As fezes com esta pontuação sempre parecerão líquidas, e pode ou não haver a presença de matéria particulada. Estas fezes são frequentemente defecadas em grupos de montes, em vez de uma unidade completa. Muco está frequentemente presente nas amostras deste tipo. As amostras deste tipo de fezes são de coleta muito difícil, e sempre deixa resíduos em superfícies e luvas. Estas amostras podem se espalhar por uma área de vários centímetros.

[0054] Além disso, são registradas outras observações, inclusive: presença de sangue, de objetos estranhos ou de muco nas fezes.

[0055] Além disso, o tratamento de infecção gastrointestinal em animais de estimação pode compreender a otimização da ecologia microbiana dos mesmos. A otimização da ecologia microbiana em animais de estimação compreende, de preferência, a redução dos teores de bactérias patogênicas nas fezes dos mesmos. Os teores de bactérias patogênicas presentes nas fezes de animais de estimação podem ser enumerados mediante o uso do método padrão de contagem em placa, conhecido pelos versados na técnica. Com mais preferência, as bactérias patogênicas são selecionadas a partir do grupo consistindo em Clostridia, Escherichia, Salmonella, bacteróides e combinações das mesmas. Alguns exemplos não-limitadores de cepas de bactérias patogênicas adequadas incluem C. perfringens, C. difficile, Eschericia coli, Salmonella typhimurium e combinações destas.

[0056] O método de uso das bactérias da presente invenção pode incluir, também, o tratamento profilático ou terapêutico do trato urinário de mamíferos, de preferência animais de estimação. Alguns exemplos não-limitadores de tratamentos do trato urinário incluem tratamento ou prevenção de infecções do trato urinário, tratamento ou prevenção de doenças renais, inclusive pedras no trato urinário, tratamento ou prevenção de infecções na bexiga, e similares. Sem se ater a teoria, acredita-se que as bactérias Bifidobacteria da presente invenção sejam úteis na prevenção dessas doenças como capacidade para degradar o ácido oxálico, conforme demonstrado in vitro. O ácido oxálico é um subproduto do metabolismo urinário que pode formar precipitados insolúveis, os quais resultam em infecções nos rins, na bexiga e em outras partes do trato urinário. Ao degradar o ácido oxálico e, portanto, potencialmente evitar sua precipitação e acúmulo no trato urinário, as bactérias da presente invenção podem tratar e prevenir infecções e outras doenças do trato urinário. A degradação do ácido oxálico pode ser medida in vitro mediante o uso do kit para testes de ácido oxálico cat # 755699, disponível comercialmente junto a Boehringer Mannheim/R-Biopharm.

[0057] As Bifidobacteria da presente invenção podem ser usadas em um método para a melhoria ou manutenção da saúde de animais de estimação, compreendendo a melhoria da digestão de fibras. A melhoria da digestão de fibras é desejável, pois promove a proliferação das ditas bactérias probióticas, bem como da microflora endógena benéfica, o que auxilia na supressão de algumas bactérias potencialmente patogênicas. Além disso, uma diminuição na quantidade de metabólitos tóxicos e enzimas nocivas que resultam da fermentação colônica foi documentada em seres humanos (Tomomatsu, H. "Health effects of oligosaccharides", (1994) Food Technol, 48, 25 61-65). A digestão de fibras pode ser determinada mediante o uso do método descrito em Vickers et al. (2001), "Comparison of fermentation of selected fructooligosaccharides and other fiber substrates by feline colonic microflora", Am. J. Vet. Res. 61 (4), 609-615, exceto pelo fato de que em vez de inocular usando amostras fecais diluídas, cada experimento utilizou culturas puras das cepas bacterianas em questão.

[0058] As cepas probiótica felinas da presente invenção podem ser usadas para reduzir o odor das fezes e da urina e, concomitantemente, na caixa de areia, mediante a redução da produção de compostos, nas fezes e na urina, que causam odor.

[0059] Alguns exemplos não-limitadores de compostos causadores de odor incluem amônia, indóis, fenóis, aminas, ácidos graxos de cadeia ramificada e compostos voláteis contendo enxofre. Sem se ater a teoria, acredita-se que a redução dos teores desses compostos nas fezes ou na urina de um animal de estimação reduz o odor associado as mesmas. Além disso, para animais de estimação que usem caixa de areia, há uma diminuição concomitante no odor da caixa de areia.

[0060] O método de uso das bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção tipicamente envolve o consumo oral pelo animal. o consumo oral pode ocorrer como parte da ingestão dietária normal, ou sob a forma de um suplemento a mesma. o consumo oral tipicamente ocorre ao menos uma vez por mês, de preferência ao menos uma vez por semana e, com mais preferência, ao menos uma vez por dia. As bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção podem ser administradas ao animal de estimação em uma quantidade terapeuticamente eficaz para manter ou melhorar a saúde do animal, de preferência um animal de estimação. Para uso na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz", no que se refere as bactérias formadoras de ácido láctico, significa aquela quantidade de bactérias que é suficiente para proporcionar o efeito ou benefício desejado a um animal hospedeiro precisando de tratamento, porém baixa o suficiente para evitar efeitos adversos como toxicidade/irritação ou resposta alérgica, relação risco/benefício razoável proporcionalmente a uma quando usada do modo indicado na presente invenção. A "quantidade terapeuticamente eficaz" específica irá variar conforme fatores como a condição específica sendo tratada/as condições físicas do usuário, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (caso haja), a forma de dosagem específica a ser utilizada, o veículo empregado, a solubilidade da forma de dosagem, e o regime de dosagem específico.

[0061] De preferência, as bactérias formadoras de ácido láctico são fornecidas ao animal de estimação em uma dose na faixa de 1,0E+04 a 1,0E+14 UFC por dia e, com mais preferência, na faixa de 1,0E+06 a 1,0E+12 UFC por dia. A composição pode conter, bactérias formadoras de preferência, ao menos 0,001% de ácido láctico do gênero Bifidobacteria, na faixa de 1,0E+04 a 1,0E+12 ufc/g, obteníveis mediante isolamento a partir de trato GI felino ressecado e lavado. As bactérias formadoras de ácido láctico podem ser administradas ao animal em sua forma viável, sob a forma de células mortas, ou como destilados, isolados ou outras frações dos produtos de fermentação das bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção, ou qualquer mistura desses materiais.

[0062] De preferência, as bactérias formadoras de ácido láctico, ou uma fração purificada ou isolada das mesmas, são usadas para preparar uma composição destinada a manter ou melhorar a saúde de um animal. Conforme indicado acima, a composiçao pode ser parte da ingestão dietária normal, ou pode ser um suplemento. Nos casos em que a composiçao faz parte da ingestão dietária normal, esta pode estar sob a forma de um alimento seco para animais, como biscoitos ou ração, um alimento a base de grãos processados, um alimento umido para animais, iogurtes, molhos, itens mascáveis, petiscos e similares.

[0063] Essas composições podem compreender outros componentes. Outros componentes são benéficos para inclusão nas composições usadas na presente invenção, mas são opcionais para os propósitos da invenção. Por exemplo, as composições alimentícias são, de preferência, nutricionalmente balanceadas. Em uma modalidade, as composições alimentícias podem compreender, com base na matéria seca, de cerca de 20% a cerca de 50% e, de preferência, de cerca de 22% a cerca de 40% de proteína bruta, em peso da composição alimentícia. O material de proteína bruta pode compreender qualquer material tendo um teor de proteínas de ao menos cerca de 15% em peso, sendo que alguns exemplos não-limitadores destes incluem proteínas vegetais como feijão soja, caroço de algodão e amendoim, e proteínas animais como caseína, albumina e tecido cárneo. Alguns exemplos não-limitadores de tecido cárneo útil a presente invenção incluem carne fresca e farinhas secas ou processadas, como farinha de peixe, farinha de aves, farinha de carne, farinha de ossos e similares. Outros tipos de fontes bruta incluem glúten de trigo ou adequadas de milho, de proteína e proteínas extraídas de fontes microbianas, como levedura.

[0064] Além disso, as composições alimentícias podem compreender, com base na matéria seca, de cerca de 5% a cerca de 35% e, de preferência, de cerca de 10% a cerca de 30% de gordura, em peso da composição alimentícia. Além disso, as composições alimentícias compreendendo as bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção podem, também, compreender de cerca de 4% a cerca de 25% de fibra dietária total. As composições podem, também, compreender múltiplas fontes de amido, conforme descrito em W099/51108.

[0065] As composições da presente invenção podem conter, ainda, uma fonte de carboidrato. São fontes ilustrativas os grãos ou cereais como arroz, milho, milo, sorgo, cevada, alfafa, trigo e similares. Além disso, também podem conter outros materiais, como seco e outros subprodutos lácteos.

[0066] As composições compreendendo as bactérias da presente invenção podem, também, compreender um prebiótico. O termo "prebiótico" inclui substâncias ou compostos que são fermentados pela flora intestinal do animal de estimação e, consequentemente, promovem a proliferação ou o desenvolvimento de bactérias formadoras de ácido láctico no trato gastrointestinal do dito animal, em detrimento de bactérias patogênicas. o resultado dessa fermentação é uma liberação de ácidos graxos, em particular ácidos graxos de cadeia curta, no cólon. Isto tem o feito de reduzir o valor de pH no cólon. Alguns exemplos não-limitadores de prebióticos adequados incluem oligossacarídeos, como inulina e seus produtos de hidrólise conhecidos como frutooligosacarídeos, galactooligosacarídeos, xilooligossacarídeos, ou oligoderivados de amido. Os prebióticos podem ser fornecidos sob qualquer forma adequada. Por exemplo, o prebiótico pode ser fornecido sob a forma de material de origem vegetal contendo essas fibras.

[0067] Os materiais de origem vegetal adequados incluem aspargo, alcachofras, cebolas, trigo ou chicória, bem como resíduos desses materiais de origem vegetal. Altemativamente, a fibra prebiótica pode ser fornecida sob a forma de um extrato de inulina, sendo adequados, por exemplo, os extratos de chicória. Os extratos de inulina adequados podem ser obtidos junto a Orafti SA de Tirlemont 3300, Bélgica, sob a marca registrada "Raftiline". Por exemplo, a inulina pode ser fornecida sob a forma de Raftiline (g) ST, que é um pó branco fino que contém de cerca de 90% a cerca de 94%, em peso, de inulina, até cerca de 4%, em peso, de glicose e frutose, e de cerca de 4% a 9%, em peso, de sacarose.

[0068] Altemativamente, a fibra pode estar sob a forma de um frutooligossacarídeo como aquele obtido junto a Orafti SA de Tirlemont 3300, Bélgica, sob a marca registrada "Raftilose".

[0069] Por exemplo, a inulina pode ser fornecida sob a forma de Raftilose (g) P95. De outro modo, os frutooligosacarídeos podem ser obtidos pela hidrólise da inulina por meio de métodos enzimáticos, ou mediante o uso de microorganismos.

[0070] Para alimentos secos para animal de estimação, um processo adequado é a cocção com extrusão, embora assamento e outros processos adequados possam ser usados. Quando cozido com extrusão, o alimento seco para animais de estimação é geralmente fornecido sob a forma de uma ração.

[0071] Se for usado um prebiótico, este pode ser misturado, antes do processamento, aos demais ingredientes do alimento seco para animais de estimação. Um processo adequado é descrito no Pedido de Patente Europeia N° 0850569. Se for usado um microorganismo probiótico, é melhor que este seja aplicado como um revestimento ou um recheio no alimento seco para animais de estimação. Um processo adequado é descrito na publicação de patente europeia número EP 0 862 863.

[0072] Para alimentos úmidos, os processos descritos nas patentes U.S. N° 4.781.939 e 5.132.137 podem ser usados para produzir produtos cárneos simulados. Outros procedimentos para a produção de produtos em pedaços também podem ser usados como, por exemplo, cozimento em um forno a vapor. Altemativamente, produtos em filão podem ser produzidos mediante a emulsificação de um material cárneo adequado para produzir uma emulsão de carne, adicionando-se um agente gelificante adequado e aquecendo-se a dita emulsão de carne, antes de acondicionar a mesma em latas ou outros recipientes. As composições alimentícias úmidas típicas podem compreender de cerca de 5% a cerca de 15% de proteína, de cerca de 1% a cerca de 10% de gordura, e de cerca de 1% a cerca de 7% de fibras. Exemplos não- limitadores de ingredientes que podem ser usados em composições alimentícias úmidas incluem frango, peru, carne bovina, pescado branco, caldo de frango, caldo de peru, caldo de carne bovina, fígado de frango, quirela de arroz, grits de milho, farinha de peixe, ovos, polpa de beterraba, cloreto, farelo de linhaça, cordeiro, subprodutos de carne bovina, subprodutos de frango e misturas desses itens.

[0073] Em outra modalidade, as composições de suplemento como biscoitos, itens mascáveis e outros petiscos podem compreender, com base na matéria seca, de cerca de 20% a cerca de 60% de proteína, ou de cerca de 22% a cerca de 40% de proteína, em peso da composição de suplemento. Como outro exemplo, as composições de suplemento podem compreender, com base na matéria seca, de cerca de 5% a cerca de 35% de gordura, ou de cerca de 10% a cerca de 30% de gordura, em peso da composição de suplemento. As composições alimentícias e de suplemento destinadas ao uso por felinos são de conhecimento comum na técnica.

[0074] Os alimentos para animal de estimação podem conter outros agentes ativos, como ácidos graxos de cadeia longa e zinco. Os ácidos graxos de cadeia longa adequados incluem ácido alfa-linoléico, ácido gama-linolênico, ácido 1inoléico, ácido eicosapentanóico e ácido docosaexanóico.

[0075] Os óleos de peixe são uma fonte adequada de ácidos eicosapentanóicos e ácido docosaexanóico.

[0076] O óleo de borragem, o óleo de semente de groselha negra e o óleo de prímula são fontes adequadas de ácido gama-linolênico. Os óleos de cártamo, os óleos de girassol, os óleos de milho e os óleos de soja são fontes adequadas de ácido linoléico. Esses óleos também podem ser usados nos substratos para revestimento mencionados acima. O zinco pode ser fornecido de diversas formas, por exemplo como sulfato de zinco ou óxido adequadas, de zinco.

[0077] Além disso, muitos ingredientes comumente usados em alimentos para animal de estimação são fontes de ácidos graxos e de zinco. Tem sido observado que a combinação de chicória, como uma fonte de prebiótico, com um óleo rico em ácido linoléico, como o óleo de soja, proporciona benefícios inesperados, que sugerem um efeito sinérgico. Nos casos em que a composição está sob a forma de um molho, esta compreende, de preferência, ao menos 10% de um caldo, sendo que alguns exemplos não-limitadores destes incluem caldos de vegetais, de carne bovina, de frango ou de presunto. As composições de molho típicas podem compreender de cerca de 0,5% a cerca de 5% de proteína bruta, de cerca de 2% a cerca de 5% de gordura bruta, e de cerca de 1% a cerca de 5% de fibras.

[0078] Alguns outros exemplos não-limitadores de suplementos adequados ao uso na presente invenção incluem pós, suspensões de óleo, suspensões a base de leite e queijos, e composições a base de manteiga de cacau bem como pílulas ou cápsulas. Nos casos em que a composição está sob a forma de uma pílula, agentes de ligação adequados são necessários para manter a pílula sob uma forma sólida e comprimida. Alguns exemplos não-limitadores de agentes de ligação adequados incluem as gomas naturais como goma xantana, pectinas, lecitinas, alginatos e outras conhecidas pelos versados na técnica. Nos casos em que a composição está sob a forma de uma cápsula, esta é de preferência encapsulada mediante o uso de tecnologias conhecidas pelos versados na técnica. Alguns exemplos não-limitadores de materiais de encapsulação adequados incluem álcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona (PVP), alginatos e gelatina. As composições a base de iogurte podem compreender de cerca de 1% a cerca de 5% de proteína, de cerca de 10% a cerca de 20% de carboidrato, de cerca de 1% a cerca de 5% de fibra, de cerca de 1% a cerca de 5% de gordura e de cerca de 50% a cerca de 90% de um veículo líquido, como leite.

Exemplos

[0079] Esses exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção, e não se destinam a limitar, em nenhum aspecto, o escopo da mesma.

Exemplo 1: isolamento de bactérias formadoras de ácido láctico a partir de trato gastrointestinal felino

[0080] Amostras de intestinos de feline foram obtidas a partir de gatos saudáveis apresentados a veterinários locais para eutanásia iniciada e aprovada pelos donos dos animais. Todos os animais estavam saudáveis e isentos de doenças. Foram dissecados o cólon, o cólon médio, o ceco e o íleo de cada gato, de maneira a expor a mucosa.

[0081] Os sobrenadantes foram removidos após agitação do tecido mucoso (em vórtice durante 1 minuto) e homogeneização mecânica do tecido. Cada sobrenadante foi colocado em uma placa de agar do tipo de Man Rogosa Sharpe (MRS) agar. Estas foram incubadas anaerobicamente, mediante o uso de um sistema Anerocult GasPak, durante 48 horas a 37°C. As colônias isoladas a partir das placas foram reaplicadas por esfregaço em MRS, e novamente cultivadas anaerobicamente sob as mesmas condições. As colônias isoladas foram reaplicadas por esfregaço mais 4 vezes, com a finalidade de purificar uma cepa única. Foram avaliadas a morfologia e a aparência microscópica da colônia. Os isolados adequados foram testados quanto a reação de Gram e atividade de catalase. A identificação de bastonetes Gram-positivos, catalasenegativos, foi realizada mediante teste de API (API 50CHL, BioMerieux) As células colhidas foram lavadas duas vezes com 0, 05M de tampão de fosfato (pH 6,5) e cisteína HCl (500 mg/L), sendo a lavagem seguida de sonicação. Os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação. Os sobrenadantes foram incubados com NaF (6 mg/mL) e Na iodoacetato (10 mg/mL) durante 30 minutos a 37°C. A reação foi interrompida mediante incubação com hidroxilamina HCl (pH 6,5) durante 10 minutos a temperatura ambiente. O desenvolvimento de cor foi monitorado em seguida a adição de HCl (4M), FeCl3 .6H2O (5% (p/v) em 0,1M HCl) e frutose-6- fosfato (sal de Na). A formação de acetil fosfato a partir de frutose-6-fosfato foi evidenciada pela cor avermelhada formada pelo quelato férrico de seu hidroximato.

Exemplo 2: triagem quanto a atividade microbicida

[0082] Cada uma das cepas de bactérias formadoras de ácido láctico foi incubada anaerobicamente em caldo MRS. 2 μL de cada cultura foram aplicados em pontos sobre placas de agar MRS, as quais foram incubadas anaerobicamente de um dia para outro. Salmonella typhimurium e E. Coli enteropatogênica (ExPEC) foram pré-cultivadas de um dia para outro, e 100 μl foram inoculados em agar fundido (1% v/v).

[0083] Essa cultura indicadora foi vertida sobre a superficie das 10 placas de MRS inoculadas. Após incubação de um dia para outro, as zonas de inibição em redor da colônia probiótica foram medidas. Todos os experimentos foram realizados em duplicata, em três ocasiões separadas. Além disso, a incorporação do tampão de 2% de betaglicerofosfato ao agar possibilitou determinar a contribuição da produção de ácido a inibição in vitro de patógenos que foi observada.

[0084] Os dados apresentados na Tabela 2 demonstram claramente que as cepas de bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção, obteníveis mediante isolamento a partir de trato GI felino ressecado e lavado, tem significativa atividade microbicida in vitro, indicadora de uma potencial atividade probiótica.Tabela 2

Exemplo 3: medições in vitro de sobrevivência e colonização Tolerância a pH

[0085] As células bacterianas foram colhidas de culturas incubadas de um dia para outro, lavadas duas vezes em tampão de fosfato (pH 6,5) e ressuspensas em caldo de MRS/TPY ajustado com 1M HCl até pH 2,5. As células foram incubadas anaerobicamente a 37°C, e sua sobrevivência foi medida a intervalos de 0, 30, 60, 120, 240 e 360 minutos, mediante o uso do método de contagem em placas conhecido pelos versados na técnica. A Tabela 3 sumariza esses dados por cepa.Tabela 3Sobrevivência de cepas em um ambiente de baixo pH (pH 2,5) .Os dados são contagens de log UFC.

Resistência a bílis

[0086] As cepas bacterianas foram aplicadas por esfregaço sobre agar MRS suplementado com bílis de porco (Sigma) a 0,5%, 1% e 5% (p/v). As placas foram incubadas a 37°C sob condições anaeróbicas, e a proliferação foi registrada após 48 horas. A proliferação foi comparada com placas de controle por um observador experiente, e a proliferação das colônias foi descrita como: Negativa (0) - nenhuma proliferação, + (1) - proliferação translúcida nebulosa (<33% em placas de controle com 0% de bílis) , ++ (2) proliferação definida, porém não tão boa como nas placas de controle (>33%, mas <66%); +++ (3) - proliferação equivalente a das placas de controle (>66%). Uma vez que a proliferação das colônias na presença de sais biliares é comparada as placas de controle, os descritores de proliferação recebem valores numéricos de 0, 1, 2 ou 3 (-, +, ++ ou +++, respectivamente) e são, então, expressos como uma porcentagem, em que 3 representa 100%.

[0087] A Tabela 4 demonstra que a Bifidobacterium da presente invenção claramente apresenta uma resistência a sais biliares, sendo capazes de proliferar e formar colônias em níveis de ao menos 66%, na maioria dos casos, quando expostos a 0,5% de sais biliares de porco.Tabela 4Sobrevivência de cepas em diversas concentrações de bílis de porco

[0088] Além disso, para avaliar quaisquer diferenças na capacidade das cepas para colonizar o trato GI de gatos, as cepas bacterianas foram aplicadas por esfregaço sobre agar MRS suplementado com bílis felina a 0,5%, 1% e 2% (peso/volume). A bílis felina foi obtida a partir de gatos sendo submetidos a endoscopia em um ambiente clínico durante um procedimento não-terminal. As placas foram incubadas a 37°C sob condições anaeróbicas, e a proliferação foi registrada após 48 horas. A proliferação foi comparada com placas de controle por um observador experiente, proliferação das colônias foi descrita como: Negativa (0) - nenhuma proliferação; + (1) - proliferação translúcida nebulosa (<33% em placas de controle com 0% de bílis); ++ (2) proliferação definida, porém não tão boa como nas placas de controle (>33%, mas <66%) i +++ (3) - proliferação equivalente a das placas de controle (>66%)

[0089] Uma vez que a proliferação das colônias na presença de sais biliares e comparada as placas de controle, os descritores de proliferação recebem valores numéricos de 0, 1, 2 ou 3 (-, +, ++ ou +++, respectivamente) e são, então, expressos como uma porcentagem, em que 3 representa 100%.

[0090] A Tabela 5 demonstra que a Bifidobacterium da presente invenção claramente apresenta uma resistência a sais biliares de felino, sendo capazes de proliferar e formar colônias em níveis de ao menos 66%, na maioria dos casos, quando expostos a 1% de sais biliares de felino. Tabela 5Sobrevivência de cepas em diversas concentrações de bílis feline

Adesão a células epiteliais intestinais

[0091] A linhagem de células epiteliais humanas HT-29 foi usada para avaliar as propriedades de adesão das cepas selecionadas. As células epiteliais foram cultivadas de modo rotineiro, sob a forma de camada única em frascos de75 cm2 para cultura de tecidos, a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 em meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de bezerro 10 (FCS), penicilina/estreptomicina, glutamina e fungizona.

[0092] Para propósitos do experimentol as células epiteliais foram semeadas a uma concentração de 5 x 105 células/mL (3 mL de volume total) por cavidade, em placas de cuI tura com 6 cavidades (Sarstedt). Após incubação durante 7 dias, para permitir diferenciação, as camadas únicas epiteliais foram lavadas com meio isento de antibióticos, contendo 10% de FCS. As suspensões bacterianas mais/em DMEM isento de antibióticos foram adicionadas a cada cavidade, e as células foram incubadas durante 90 minutos a 37°C. Após a incubação, as camadas únicas foram lavadas tres vezes com PBS. As células epiteliais foram lisadas em H2O desionizada, e o número de bactérias aderentes foi obtido mediante o uso do método de contagem em placas conhecido pelos versados na técnica. A adesão foi expressa como uma porcentagem do número de bactérias inicialmente aplicadas a placa. A Bifidobacteria longum AHF5340 apresentou um nível de adesão de 1,7%, enquanto a Bifidobacteria longum AHF1231 apresentou um nível de adesão de 44,1%.

Exemplo 4: sequenciamento de polinucleotídeo intergênico 16s-23s

[0093] Os isolados de Bifidobacterium felina foram centrifugados em tubos de estoque, e os peletes resultantes foram lisados em 100 μL de solução para extração e 25 μL de solução para preparação de tecidos (Sigma, kit XNAT2), e incubados durante 10 minutos a temperatura ambiente. As amostras foram, então, incubadas durante 5 minutos a 95°C e, então foram adicionados 100 μL de solução para neutralização (kit XNAT2). A solução de DNA genômica foi, então, quantificada mediante o uso de um espectrofotômetro Nanodrop, e armazenada a 4°C.

[0094] O PCR foi realizado mediante o uso de iniciadores de espaçador intergênico (IGS), IGS L: 5' -GCTGGATCACCTCCTTTC-3' e IGS R: 5'- CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (Bridgidi et al., 2000, System Appl. Microbiol., 23, 391-399 (2000)). As condições de ciclo foram de 94°C durante 3 minutos (1 ciclo), 94°C durante 30 segundos, 53°C durante 30 segundos, e 72°C durante 30 segundos (28 ciclos). A reação de PCR continha 4 μL (50 ng) de DNA, mistura de PCR (kit XNAT2), 0,4 μM de iniciador 1GS L e R (MWG Biotech, Alemanha). As reações de PCR foram realizadas em um termociclo Eppendorf. Os produtos de PCR (10 μL) foram passados, juntamente com um marcador para peso molecular (100 bp Ladder, Roche) por um gel a 2% de agarose manchado com EtBr em TAE, para determinar seu perfil de IGS.

[0095] Os produtos de PCR da Bifidobacterium (banda única) foram purificados mediante o uso do kit de purificação Promega Wizard PCR.

[0096] Os produtos de PCR purificados foram sequenciados mediante o uso de sequências iniciadoras (acima) para a região de espaçador intergênico. Os dados de sequência foram, então, pesquisados contra a base de dados de nucleotídeos do NCBI, para determinar a identidade da cepa por homologia de nucleotideos.

[0097] Após o sequenciamento, as sequências obtidas para as quatro cepas depositadas foram comparadas a base de dados de sequências "BLAST", disponível online em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ para verificação de homologia com outras sequências bacterianas 16s-23s 15 depositadas. As similaridades mais próximas para Bifidobacterium longum NCIMB 41290 (AHF534 0) e Bifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231) foi a cepa Bifidobacterium longum NCC2705, tendo um grau de homologia percentual de 95% e 94%, respectivamente.

Exemplo 5: exemplos de composição Os Exemplos de 1 a 4 são exemplos de composições de ração secacompreendendo a Bifidobacteria pseudolongum probiótica da presente invenção.

[0098] Os Exemplos de 5 a 7 são exemplos de composições úmidas de alimento para animais de estimação compreendendo as Bifidobacteria longum probióticas da presente invenção.

[0099] Os Exemplos de 8 a 10 são exemplos de composições de suplemento base de iogurte compreendendo as Bifidobacteria longum probióticas da presente invenção.

[00100] Todos os documentos citados na Descrição Detalhada da Invenção são, em sua parte relevante, aqui incorporadas por referência, e a citação de qualquer documento nao deve ser interpretada como admissão de que este represente técnica anterior com respeito a presente invenção.

[00101] Embora modalidades específicas da presente invenção tenham sido ilustradas e descritas, deve ficar óbvio aos versados na técnica que várias outras alterações e modificações podem ser feitas sern que se desvie do caráter e âmbito da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindicações anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram no escopo da presente invenção.

Claims

1. Composição, caracterizada pelo fato de compreender uma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico do gênero Bifidobacteria, obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, com atividade probiótica, e um veículo, que é composto de grãos de cereal, para composições secas, água e caldo, para composições úmidas, e leite, para produtos lácteos, sendo a cepa da espécie Bifidobacterium longum, selecionada do grupo de cepas tendo uma sequência de polinucleotídeo intergênico 16s-23s com SEQ.ID N° 1, ou SEQ. ID N° 2 e do grupo consistindo em Bifidobacterium longum NCIMB 41290 (AHF5340), Bifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231).

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa é selecionada com base em sua capacidade para sobreviver e colonizar o trato gastrointestinal de animais de estimação.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a cepa apresenta ao menos 66%, após 48 horas de proliferação, quando cultivada na presença de sais biliares a 0,5%.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de a cepa ser capaz de manter sua viabilidade após 1 hora sob pH 2,5.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o animal de estimação é um gato.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser um alimento para animais de estimação.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de ser um alimento para gatos.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de ser um alimento úmido para animais ou um alimento seco para animais.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de estar sob uma forma selecionada a partir do grupo consistindo em rações, itens mascáveis e biscoitos.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser um suplemento alimentar para animais de estimação.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de estar sob a forma de um molho, com 0,5% a 5% de proteína bruta, 2% a 5% de gordura bruta, e 1% a 5% de fibras.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de estar sob a forma de um iogurte, um queijo ou outro produto lácteo.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de estar sob uma forma selecionada a partir do grupo consistindo em cápsulas, tabletes e pílulas.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender 0,001% de bactérias formadoras de ácido láctico na faixa de l,0E+04 ufc/g a l,0E+12 ufc/g.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as bactérias formadoras de ácido láctico estão sob a forma de células viáveis.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as bactérias formadoras de ácido láctico estão sob a forma de células não-viáveis, ou de frações constituintes ativas das mesmas.