BRPI0608314B1 - Composição farmacêutica compreendendo hialuronidase peguilada e seu uso - Google Patents

Composição farmacêutica compreendendo hialuronidase peguilada e seu uso Download PDF

Info

Publication number
BRPI0608314B1
BRPI0608314B1 BRPI0608314-5A BRPI0608314A BRPI0608314B1 BR PI0608314 B1 BRPI0608314 B1 BR PI0608314B1 BR PI0608314 A BRPI0608314 A BR PI0608314A BR PI0608314 B1 BRPI0608314 B1 BR PI0608314B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
agent
shasegp
hyaluronidase
pharmaceutical composition
polypeptide
Prior art date
Application number
BRPI0608314-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Louis H. Bookbinder
Michael F. Haller
Gilbert A. Keller
Anirban Kundu
Gregory I. Frost
Tyler M. Dylan
Original Assignee
Halozyme, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36927767&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0608314(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US11/065,716 external-priority patent/US7871607B2/en
Application filed by Halozyme, Inc filed Critical Halozyme, Inc
Publication of BRPI0608314A2 publication Critical patent/BRPI0608314A2/pt
Publication of BRPI0608314B1 publication Critical patent/BRPI0608314B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO HIALURONIDASE (sHASEGP), COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DA GLICOPROTEÍNA HIALURONIDASE, HIALURONIDASE PEGUILADA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DA HIALURONIDASE PEGUILADA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA HIALURONIDASE PEGUILADA E COMBINAÇÕES DAS REFERIDAS HIALURONIDASES. A presente invenção refere-se a novas Glicoproteinas Hialuronidases ativas neutras solúveis (sHASEGPs), métodos de fabricação e seu uso para facilitar administração de outras moléculas ou para aliviar patologias associadas com glicosaminoglicano. Domínios de polipeptideo minimamente ativos dos domínios de sHASEGP ativos neutros, solúveis, são descritos, os quais incluem porções açúcar ligadas à asparagina requeridas para um domínio de hialuronidase ativo neutro funcional. Incluídos estão peptideos líderes amino-terminais modificados que aumentam a secreção de sHASEGP. A invenção compreende ainda formas sialidadas e peguiladas de uma sHASEGP recombinante para aumentar a estabilidade e farmacocinética no soro sobre enzimas de matadouro de ocorrência natural. São descritas ainda formulações adequadas de uma glicoproteina sHASEGP recombinante substancialmente purificada derivada de uma célula eucariótica que geram a glicosilação apropriada requerida para otimizar esta atividade.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADO(S)
[0001] O presente pedido de patente é uma continuação-em-parte da U.S. No. de Série 11/238.171 depositada em 27 de setembro, 2005, que é uma continuação- em-parte da U.S. No. de Série 11/065.716 depositada em 23 de fevereiro, 2005, cada uma das quais é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se em geral a enzimas Glicosaminoglicanases, incluindo Glicoproteínas Hialuronidase Solúveis (sHASEGPs), neutras-ativas, e suas porções, particularmente domínios Hialuronidase. Mais especificamente, a invenção refere-se a modificações químicas, composições farmacêuticas, plasmídeos de expressão, métodos para fabricação e métodos terapêuticos usando as Glicosaminoglicanases (e seus domínios e as moléculas de ácido nucléico de codificação) para a modificação terapêutica de glicosaminoglicanos no tratamento de doença e para uso para aumentar a difusão de outras moléculas tal como moléculas injetadas em um animal.
INFORMAÇÃO ANTECEDENTE
[0003] Glicosaminoglicanos (GAGs) são polissacarídeos lineares complexos da matriz extracelular (ECM). GAGs são caracterizados por estruturas dissacarídeo repetitivas de uma hexosamina N-substituída e um ácido urônico (no caso de hialuronan (HA), sulfato de condroitina (CS), condroitina (C), dermatan sulfato (DS), heparan sulfato (HS) e heparina (H), ou uma galactose (no caso de queratan sulfato (KS)). Execeto por HA, todos existem covalentemente ligados a proteínas de núcleo. Os GAGs com suas proteínas de núcleo são estruturalmente referidos como proteoglicanos (PGs).
[0004] Hi aluronan (HA) é encontrado em mamíferos predominantemente em tecidos conectivos, pele, cartilagem e em fluido sinovial. Hialuronan é também o constituinte principal do vítreo do olho. Em tecido conectivo, a água de hidratação associada com hialuronan cria matrizes hidratadas entre tecidos. O hialuronan desempenha um papel-chave nos fenômeros biológicos associados com motilidade celular incluindo rápido desenvolvimento, regeneração, reparo, embriogênese, desenvolvimento embriológico, cicatrização de ferida, angiogênese e tumorigênese (Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, Nova York, 1384-1386; Bertrand e outros, 1992, Int. J. Cancer, 52:1-6; Knudson e outros, 1993, FASEB J. 7:1233-1241). Ainda, níveis de hialuronan se relacionam com agressividade de tumor (Ozello e outros, 1960 Cancer Res. 20?600-604; Takeuchi e outros, 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata e outros, 1983, Cancer Res., 43:1347-1354).
[0005] HA é encontrado na matriz extracelular de muitas células, especialmente em tecidos conectivos moles. HA foi atribuído a várias funções fisiológicas, tal como em homeostase de água e proteína do plasma (Laurent, T.C. e outros (1992) FASEB J 6:2397-2404). A produção de HA aumenta em células em proliferação e pode desempenhar um papel em mitose. Ele foi implicado em locomoção e migração de célula. HA parece desempenar papéis importantes na regulação, desenvolvimento e diferenciação celular (Laurent e outros, supra).
[0006] HA tem sido usado em medicina clínica. Suas propriedades de proteção de tecido e reológicas provaram ser úteis em cirurgia oftálmica (por exemplo, para proteger o endotélio da córnea durante cirurgia de catarata). HA no soro é diagnóstico de doença do fígado e várias condições inflamatórias, tal como artrite reumatóide. Edema intersticial causado por acúmulo de HA pode causar disfunção em vários órgãos (Laurent e outros, supra).
[0007] Interações de proteína hialuronan estão também envolvidas na estrutura da matriz extracelular ou "substância fundamental".
[0008] Hi aluronidases são um grupo de enzimas geralmente neutras ou ativas ácidas encontradas em todo o reino animal. As hialuronidases variam com relação à especificidade do substrato e mecanismo de ação.
[0009] Existem três classes gerais de hialuronidases: 1. Hialuronidases do tipo mamífero, (EC 3.2.1.35) que são endo-beta-N-acetilexosaminidases com tetrassacarídeos e hexassacarídeos como os produtos de extremidade principais. Elas têm ambos atividades hidrolítica e transglicosidase, e podem degradar hialuronan e sulfatos de condroitina (CS), geralmente C4-S e C6-S. 2. Hialuronidases bacterianas (EC 4.2.99.1) degradam hialuronan e, e até vários graus, CS e DS. Elas são endo-beta-N-acetilexosaminidases que operam através de uma reação de eliminação beta que dá principalmente produtos de extremidade dissacarídeo. 3. Hialuronidases (EC 3.2.1.36) de sanguessugas, outros parasitas, e crustáceos são endo-beta- glucuronidases que geram produtos de extremidade tetrassacarídeo e hexassacarídeo através de hidrólise de ligação 1-3 beta.
[0010] As hialuronidases de mamífero podem ser ainda divididas em dois grupos: enzimas neutras-ativas e ácido-ativas. Existem seis genes ligados à hialuronidase no genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 E PH20/SPAM1. HYALP1 é um pseudogene, e HYAL3 não foi mostrado possuir atividade de enzima com relação a quaisquer substratos conhecidos. HYAL4 é uma condroitinase e exibe pouca atividade com relação a hialuronan. HYAL1 é a enzima ácido-ativa prototípica e PH20 é a enzima neutro-ativa prototípica. Hialuronidases ácido-ativas, tal como HYAL1 e HYAL2, geralmente não têm atividade catalítica em pH neutro (isto é, pH 7). Por exemplo, HYAL1 tem pouca atividade catalítica in vitro em pH 4,5 (Frost e outros, Anal. Biochemistry, 1997). HYAL2 é uma enzima ácido-ativa com atividade específica muito baixa in vitro.
[0011] As enzimas do tipo hialuronidase podem ser também caracterizadas por aquelas que estão geralmente atadas na membrana de plasma através de uma âncora de fosfatidil inositol tal como HYAL2 humana e PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2003, Abril 15;100(8):4580-5, Phelps e outros, Science 1988), e aquelas que são geralmente solúveis tal como HYAL1 humana (Frost e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 9 de Julho;236(1):10-5). No entanto, existem variações de espécie para espécie: PH20 bovina, por exemplo, é muito frouxamente ligada à membrana de plasma e não é ancorada através de uma âncora sensível à fosfolipase (Lalancette e outros, Biol. Reprod. 2001;Agosto;65(2):628-36). Esta característica singular de hialuronidase bovina permitiu o uso de enzima hialuronidase de testes bovina solúvel como um extrato para uso clínico (Wydase®, Hyalase®). Outras espécies de PH20 são enzimas ancoradas a lipídeo que são geralmente não solúveis sem o uso de detergentes ou lipases. Por exemplo, PH20 humana está ancorada à membrana de plasma através de uma âncora GPI. Tentativas em se fazer construtos de DNA de PH20 humana que não instroduziriam uma âncora de lipídeo no polipeptídeo resultaram em ou uma enzima cataliticamente inativa ou uma enzima insolúvel (Arming e outros, Eur. J. Biochem. 1997 1o de Agosto;247(3):810-4). Hialuronidase de esperma de macaco de ocorrência natural é encontrada em ambas forma solúvel e ligada à membrana. Enquanto a forma de membrana de 64 kDa ligada possui atividade de enzima em pH 7,0, a forma de 54 kDa é apenas ativa em um pH de 4,0 (Cherr e outros, Dev. Biol., 1996, 10 de Abril;175(1):142-53). Deste modo, formas solúveis de PH20 estão freqüentemente sem atividade de enzima sob condições neutras.
[0012] Condroitinases são enzimas encontradas em todo o reino animal. Essas enzimas degradam glicosaminoglicanos através de uma reação de endoglicosidase. Exemplos específicos de Condroitinases conhecidas incluem: Condroitinase ABC (derivada de Proteus vulgaris; Pedido de Patente Japonês Publicado No. 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi e S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai e T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968)); Condroitinase AC (derivada de Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi e S. Suzuki, J. Biol. Chem, 243, 1523 (1968)); Condroitinase AC II (derivada de Arthrobacter aurescens; K. Hiyama e S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975). K. Hiyama e S. Okada, J. Biochem. (Tóquio), 80, 1201 (1976)); Hialuronidase ACIII (derivada de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa e Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)); Condroitinase B (derivada de Flavobacterium heparinum; Y.M. Michelacci e C.P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commum., 56, 973 (1974), Y.M. Michelacci e C.P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), Kenichi Maeyama, Akira Tawada, Akiko Ueno e Keiichi Yoshida, Seikagaku, 57, 1189 (1985)); Condroitinase C (derivada de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Kelichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa e Kiyochika Tokuyasy, Seikagaku, 61, 1023 (1989)); e similar.
[0013] Glicoproteínas são compostas de uma cadeia de polipeptídeo covalentemente ligada a uma ou mais porções de carboidrato. Existem duas categorias amplas de glicoproteínas que possuem carboidratos acoplados através de ligações ou N-glicosídicas ou O-glicosídicas à sua proteína constituinte. Os glicanos N e O ligados são ligados a polipeptídeos através de ligações asparagina-N-acetil-D- glucosamina e serina (treonina)-N-acetil-D-galactosamina, respectivamente. Oligossacarídeos N-ligados complexos não contêm resíduos de manose terminais. Eles contêm apenas resíduos de N-acetilglicosamina, galactose e/ou ácido siálico terminais. Oligossacarídeos híbridos contêm resíduos de manose terminais bem como resíduos de N- acetilglicosamina, galactose e/ou ácido siálico terminais.
[0014] Com glicoproteínas N-ligadas, um precursor de oligossacarídeo é ligado ao grupo amino de asparagina durante síntese de peptédeo no retículo endoplasmático. A porção oligossacarídeo é então seqüencialmente processada por uma série de enzimas específicas que deletam e adicionam porções de açúcar. O processamento acontece no retículo endoplasmático e continua com passagem através do aparelho de Golgi cis, médio e trans.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0015] São providas aqui enzimas glicosaminoglicanase solúveis particularmente membros da família de Glicoproteína Hialuronidase neutra-ativa solúvel (também referida aqui como sHASEGPs), membros preferidos sendo Glicoproteínas Hialuronidase neutras-ativas solúveis humanas, particularmente as Glicoproteína Hialuronidase PH20 solúveis humanas (também referidas aqui como rHuPH20s). As hialuronidases neutras-ativas solúveis providas aqui são cada uma um membro da família sHASEGP, chamadas aqui sHASEGP. O domínio Hialuronidase solúvel e seus usos são também providos. Embora vários usos e aplicações de glicosaminoglicanases solúveis (algumas vezes aqui referidas como Enzimas GAG) sejam aqui ilustradas usando rHuPH20 como uma glicosaminoglicanase exemplar (por exemplo, na promoção da aplicação de agentes farmacológicos e outros agentes dentro de tecidos do corpo mamífero), será compreendido por aqueles versados na técnica que outras glicosaminoglicanases tal como aquelas descritas aqui ou outras conhecidas na técnica podem ser aplicadas a várias outras aplicações. Glicosaminoglicanases solúveis aqui preferidas, tal como sHASEGPs, exibem um pouco de atividade de hialuronidase e podem exibir outras atividades de glicosaminoglicanase também. Glicosaminoglicanases solúveis humanas são aqui preferidas para aplicações onde enzima deve ser empregada dentro do corpo humano, incluindo muitas aplicações médicas conforme aqui descrito e ilustrado.
[0016] Um aspecto da invenção é baseado na constatação de que uma atividade de hialuronidase neutra- ativa, solúvel, pode ser produzida com alto rendimento em um sistema de expressão de mamífero através da introdução de ácidos nucléicos que não têm aminoácidos de codificação de região estreita no terminal carbóxi do cDNA de PH20 humana. Modificações adicionais das sHASEGP para aumentar a secreção através do uso de peptídeos líder não-nativos são também providas. São ainda providos métodos para modificar sHASEGP para prolongar sua meia-vida através de mascaramento da proteína com polietileno glicol (PEG) e/ou modificações pós- traducionais na glicosilação nativa. Tentativas anteriores em gerar glicoproteínas hialuronidase humanas neutras-ativas solúveis não foram bem-sucedidas. Foi concluído que cortes do polipeptídeo de hialuronidase humana resultaram em uma perda de atividade enzimática neutra, e uma incapacidade das células em secretar a proteína recombinante em sistemas de expressão de mamífero (Arming e outros, Eur. J. Biochem., 1997, 1o de agosto;247 (3):810-4). É crítico gerar sHASEGP secretada de ação neutra para produção comercial e utilidade terapêutica como uma hialuronidase. A invenção, descrita aqui, supera esses e outros desafios.
[0017] A invenção compreende ainda uma glicoproteína sHASEGP humana cataliticamente ativa onde a sHASEGP possui pelo menos uma porção açúcar N-ligada. Os estudos mostrados aqui demonstram que a PH20 humana requer glicanos N-ligados para atividade catalítica, enquanto hialuronidases bovinas e de veneno de abelha permanecem ativas sem tais glicanos N-ligados. Um domínio hialuronidase humana PH20 destituído de porções N-ligadas é cataliticamente inativo. Deste modo, tecnologia de DNA recombinante clássica não permite a produção de uma sHASEGP humana cataliticamente ativa, diferente da hialuronidase de veneno de abelha, que pode ser produzidas em E. coli.
[0018] A invenção inclui métodos e células para geração de um polipeptídeo de glicoproteína sHASEGP N- ligada, através do uso de uma célula capaz de introduzir as ditas porções açúcar ligadas ou através da introdução das ditas porções N-ligadas em um polipeptídeo de sHASEGP. Métodos de identificação de sHASEGPs apropriadamente glicosiladas são descritos mais.
[0019] Glicoproteínas sHASEGP PEGuiladas e/ou supersialadas cataliticamente ativas são também providas. SHASEGP PEGuiladas e/ou supersialadas possuem meias-vidas no soro maiores comparado com sHASEGPs de teste bovinias e ovinas não-sialadas de ocorrência natural, e são então preferidas para ambos estabilidade de enzima e uso como fármacos ou adjuvantes em circunstâncias onde meias-vidas prolongadas são desejadas (tal como é geralmente o caso com aplicação intravenosa). A invenção provê métodos para a preparação de sHASEGPs PEGuiladas e/ou supersialadas, suas composições e usos. Sem ser restrito a nenhuma aplicação ou mecanismo de ação particular, é geralmente considerado que a ligação de porções PEG à sHASEGP e outros glicosaminoglicanos pode ser usada para proteger eficazmente as moléculas, diminuindo sua sensibilidade relativa a proteases e também potencialmente diminuindo a extensão e taxa de sua aplicação e eliminação do corpo. Aplicação desses princípios e técnicas às outras glicosaminoglicanases, PEGuiladas, supersialadas e/ou versões de outro modo modificadas de tais outras glicosaminoglicanases pode ser da mesma maneira gerada e usada no contexto de métodos e técnicas conforme aqui descrito e ilustrado (por exemplo, técnicas para promoção da dispersão de agentes farmacológicos e outros agentes dentro dos tecidos do corpo).
[0020] Proteínas codificadas por variantes unidas de sHASEGP deficientes em âncora GPI naturalmente são também providas.
[0021] São ainda providas composições da sHASEGP compreendendo uma glicoproteína sHASEGP solúvel com um íon de metal, onde o íon de metal é Cálcio, Magnésio ou Sódio. SHASEGPs são geralmente otimamente ativas na presença dos ditos metais. Formulações consistindo em sHASEGP na presença dos ditos íons de metal são também providas.
[0022] Modificações de sHASEGPs e outras aminoglicanaes para prolongar mais sua meia-vida são providas. Modificações químicas de uma sHASEGP e outras glicosaminoglicanases com polímeros tal como polietileno glicol e dextrano são providas. Tais modificações protegem sHASEGPs e outras glicosaminoglicanases de remoção da circulação e do sistema imune bem como receptores de glicosilação para manose e asialoglicoproteína. São ainda providos métodos para ligar a grupos funcionais específicos tal como sítios de glicosilação, aminoácidos positivamente carregados e cisteínas.
[0023] Ensaios para identificação de efetores, tal como compostos, incluindo moléculas pequenas, e condições, tal como pH, temperatura e resistência iônica, que modulem a ativação, expressão ou atividade de sHASEGPs, são também providos aqui. Em ensaios exemplares, os efeitos de compostos de teste sobre a habilidade de um domínio Hialuronidase de sHASEGP em clivar um substrato conhecido, tipicamente um glicosaminoglicano ou proteoglicano, são avaliados. Agentes, geralmente compostos, particularmente moléculas pequenas, que modulam a atividade do domínio Hialuronidase são compostos candidatos para modulação da atividade da sHASEGP. Os domínios Hialuronidase podem ser também usados para produzir anticorpos específicos de Hialuronidase com atividade de perturbação da função. Os domínios Hialuronidase providos aqui incluem, mas não estão limitados a, domínio glicosil-hidrolase N-terminal com suas porções truncadas C-terminais que exibem atividade catalítica in vitro.
[0024] Moléculas de ácido nucléico codificando as proteínas e domínios Hialuronidase são também providas. Moléculas de ácido nucléico que codificam um domínio Hialuronidase solúvel ou suas porções cataliticamente ativas e também aquelas que codificam sHASEGP de comprimento completo são providas. Ácido nucléico codificando um domínio Hialuronidase exemplar e ácido nucléico a jusante são descritos na SEQ ID N. 6; e o domínio hialuronidase de uma sHASEGP exemplar é descrito na SEQ ID NO. 1 (aminoácidos 35464). A seqüência de proteína e a seqüência de ácido nucléico de codificação de sHASEGP de comprimento completo exemplar são mostradas nas SEQ ID Nos. 1 e 6.
[0025] São também providas moléculas de ácido nucléico que hibridizam para tal ácido nucléico de codificação de sHASEGP ao longo de seu comprimento completo ou ao longo de pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% do comprimento completo e codificam o domínio Hialuronidase ou suas porções. Hibridização é geralmente realizada sob condições de pelo menos baixa, geralmente pelo menos moderada e freqüentemente alta estringência.
[0026] O fragmento de ácido nucléico isolado é DNA, incluindo genômico ou cDNA, ou é RNA, ou pode incluir outros componentes, tal como ácido nucléico de proteína ou outros análogos de nucleotídeo. O ácido nucléico isolado pode incluir componentes adicionais, tal como promotores heterólogos ou nativos, aumentadores e outras seqüências reguladoras transcripcionais e traducionais, esses genes podem ser ligados a outros genes, tal como genes repórter ou outros genes indicadores ou genes que codificam indicadores.
[0027] É também provida uma molécula de ácido nucléico isolada que inclui a seqüência de moléculas que é complementar à seqüência de nucleotídeo codificando sHASEGP ou a sua porção.
[0028] São também providos seus fragmentos ou oligonucleotídeos que podem ser usados como sondas ou iniciadores e que contêm pelo menos cerca de 10 a 16 nucleotídeos, tipicamente pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, e geralmente menos do que 1000, tipicamente menos do que cerca de 100 nucleotídeos, mostrado na SEQ ID NO. 6 (ou o seu complemento); ou contêm pelo menos cerca de 30 nucleotídeos (ou o seu complemento) ou contêm oligonucleotídeos que hibridizam ao longo de seu comprimento completo (ou pelo menos cerca de 70, 80 ou 90% dela) a quaisquer tais fragmentos ou oligonucleotídeos. O comprimento dos fragmentos é uma função do propósito para o qual eles são usados e/ou a complexidade do genoma de interesse. Em geral sondas e iniciadores contêm menos do que cerca de 50, 150 ou 500 nucleotídeos.
[0029] São também providos plasmídeos contendo qualquer uma das moléculas de ácido nucléico providas aqui. Células contendo os plasmídeos são também providas. Tais células incluem, mas não estão limitadas a, células bacterianas, células de fungos, células de planta, células de inseto e células de animais.
[0030] São também providos sistemas de expressão de mamífero aumentados usando líderes de sinal capazes de secreção eficiente de sHASEGPs. Um exemplo de tal seqüência de aminoácido de peptídeo líder secretor eficiente e proteína de fusão com uma sHASEGP é encontrado nas SEQ ID Nos. 43 e 46.
[0031] É também provido um método de produção de sHASEGPs através do cultivo das células acima descritas sob condições com o que a sHASEGP é expressa pelas células, e recuperação do polipeptídeo ou glicoproteína sHASEGP expresso. Métodos para isolamento de ácido nucléico codificando outras sHASEGPs são também providos.
[0032] São também providas células, geralmente células eucarióticas, tal como células de mamífero e células de levedura, onde um polipeptídeo de sHASEGP é expresso na superfície das células. Tais células podem ser usadas em ensaios de avaliação de fármaco para identificar compostos que modulam a atividade do polipeptídeo de sHASEGP. Esses ensaios, incluindo ensaios de ligação in vitro, e ensaios baseados em transcrição onde transdução de sinal mediada direta ou indiretamente, tal como através de ativação de fatores de pró-crescimento, pela sHASEGP é avaliada.
[0033] São também providos peptídeos codificados por tais moléculas de ácido nucléico. Incluídos dentre esses polipeptídeos está o domínio Hialuronidase de sHASEGP ou um polipeptídeo com mudanças de aminoácido de modo que a especificidade e/ou atividade de Hialuronidase permanece substancialmente não-modificada. Em particular, uma glicoproteína sHASEGP de mamífero substancialmente purificada é provida, a qual compreende uma enzima neutra- ativa secretada.
[0034] A invenção também inclui um domínio catalítico hialuronidase e pode incluir ainda outros domínios. A sHASEGP pode formar homodímeros e pode também formar heterodímeros com algumas outras proteínas, tal como proteína ligada à membrana. É também provida uma glicoproteína substancialmente purificada incluindo uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 60,%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para uma sHASEGP exemplar onde a identidade percentual é determinada usando algoritmos padrão e "gap penalties" que maximizam a identidade percentual.
[0035] Variantes unidas de sHASEGPs, particularmente aquelas com domínios Hialuronidase cataliticamente ativos, são compreendidas aqui.
[0036] Em outras modalidades, polipeptídeos substancialmente purificados que incluem um domínio Hialuronidase de um polipeptídeo de sHASEGP ou uma porção cataliticamente ativa dele, mas não incluem a seqüência total de aminoácidos mostrada na SEQ ID No. 1, são providos, dentre esses estão polipeptídeos que incluem uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de seqüência com a SEQ ID No. 1 ou 3.
[0037] Em uma modalidade específica, um ácido nucléico que codifica uma glicoproteína hialuronidase eucariótica, chamada uma sHASEGP eucariótica, é provido. Em particular, o ácido nucléico inclui a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID No. 6, particularmente mostrada como nucleotídeos 106-1446 da SEQ ID No. 6, ou uma porção dela que codifica um polipeptídeo cataliticamente ativo.
[0038] São também providas moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condições de pelo menos baixa estringência, geralmente estringência moderada, mais tipicamente alta estringência para a SEQ ID No. 6 ou seus degenerados.
[0039] Em uma modalidade, o fragmento de ácido nucléico isolado hibridiza para uma molécula de ácido nucléico contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID No. 6 (ou seus degenerados) sob condições de alta estringência. Uma sHASEGP de comprimento completo é mostrada na SEQ ID No. 1 e é codificada pela SEQ ID No. 6 ou seus degenerados.
[0040] São também providas muteínas do domínio Hialuronidase de sHASEGPs, particularmente muteínas onde um ou mais resíduos Cys no domínio Hialuronidase que são livres (isto é, não formam ligações dissulfeto com qualquer outro resíduos Cys no domínio Hialuronidase) são substituídos com um outro aminoácido, tipicamente, embora não necessariamente, com uma substituição de aminoácido conservadora ou uma substituição que não elimine a atividade, e muteínas onde um sítio de glicosilação específico (ou sítios) seja eliminado.
[0041] Polipeptídeos de sHASEGP, incluindo, mas não limitado a suas variantes unidas, e ácidos nucléicos codificando sHASEGP, e seus domínios, derivados e análogos, são providos aqui. Glicoproteínas Hialuronidase secretadas de cadeia simples que têm um N-terminal funcionalmente equivalente àquele gerado pela ativação de uma peptidase de sinal para formar sHASEGP são também providas. Existem sete sítios de glicosilação N-ligados potenciais em N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 da sHASEGP PH20 humana exemplificados na SEQ ID NO:1. Ligações dissulfeto se formam entre os resíduos Cys C60-C351 e resíduos Cys C224 a C238 para formar o domínio Hialuronidase núcleo. No entanto, cisteínas adicionais são requeridas no terminal carbóxi para atividade catalítica enzimática neutra de modo que o domínio sHASEGP dos aminoácidos 36 a Cys 464 na SEQ ID NO: 1 compreende o domínio hialuronidase de sHASEGP PH20 humana minimamente ativo. Deste modo, sítio de glicosilação N- ligado N-490 não é requerido para a atividade de sHASEGP apropriada. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, pequenas mudanças podem ser feitas em tais composições descritas e ilustradas aqui sem substancialmente eliminar ou em alguns casos sem substancialmente reduzir (ou potencialmente até mesmo melhorar) sua atividade útil, e podem então ser similarmente empregadas em várias aplicações conforme aqui descrito.
[0042] Glicosilação N-ligada de algumas sHASEGPs (tal como a sHASEGP compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:1) pode ser muito importante para sua atividade catalítica e estabilidade. Enquanto alteração do tipo de glicano modificando uma glicoproteína pode ter efeitos drásticos sobre a antigenicidade de uma proteína, dobra estrutural, solubilidade e estabilidade, a maioria das enzimas não é imaginada requerer glicosilação para atividade de enzima ótima. Tais sHASEGPs são então únicas com relação a isso, pelo fato de que remoção de glicosilação N-ligada pode resultar em inativação quase completa da atividade de Hialuronidase. Para tais sHASEGPs, a presença de glicanos N- ligados é crítica para geração de uma enzima ativa. Sistemas de expressão de proteína adequados para a introdução de resíduos de glicosilação N-ligados críticos em sHASEGP estão incluídos. Adicionalmente, a introdução de polipeptídeo de sHASEGP desglicosilado na presença de extratos capazes de introduzir glicanos N-ligados é incluída. Em um aspecto da invenção, glicosilação complexa capeada com sialilação é descrita, enquanto outras capeadas com resíduos de manose livres são compreendidas também. De preferência, os resíduos de ácido siálico são encontrados nos resíduos terminais de glicosilação N-ligada em sHASEGPs.
[0043] Oligossacarídeos N-ligados se encaixam em vários tipos principais (oligomanose, complexo, híbrido, sulfatado), todos os quais têm núcleos 3-GlcNAc-GlcNAc (Man) ligados através da nitrogênio amida de resíduos Asn que se encaixam nas seqüências -Asn-Xaa-Thr/Ser (onde Xaa não é Pro) . Glicosilação em um sítio -Asn-Xaa-Cys foi descrita para coagulação da proteína C. Sítios N-ligados são freqüentemente indiretamente designados pela aparência de um ciclo "vazio" durante o seqüenciamento. Identificação positiva pode ser feita após aplicação do oligossacarídeo pela PNGase F, que converte Asn glicosilado em Asp. Após aplicação de PNGase F, oligossacarídeos N-ligados podem ser purificados, por exemplo, usando cromatografia Bio-Gel P-6, com o grupo de oligossacarídeo submetido à cromatografia de troca de ânion de pH alto (HPAEC) (Townsend e outros (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Certos isômeros de oligossacarídeo podem ser separados usando HPAEC. Resíduos Fucose vão mudar posições de eluição mais cedo no cromatograma de HPAEC, enquanto resíduos de ácido siálico adicionais vão aumentar o tempo de retenção. Tratamento concomitante de glicoproteínas cujas estruturas de oligossacarídeo são conhecidas (por exemplo, fetuína bovina, glicoproteína ácida a-1), ovalbumina, RNAse B, transferrina) pode facilitar a determinação de picos de oligossacarídeo. Os oligossacarídeos coletados podem ser caracterizados por uma combinação de análises composicional e ligação de metilação (Waegheet e outros (1983) Carbohydr. Res. 123, 281-304), com configurações anoméricas determinadas através de espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) em Methods Enzymol 230).
[0044] No caso de algumas sHASEGPs, exemplificadas pela sHASEGP rHuPH20 humana descrita aqui, a sHASEGP pode compreender ambas ligações N-glicosídicas e O- glicosídicas. Por exemplo, rHUPH20 (conforme produzida na linhagem DG44 CHO 3D3, conforme descrito nos exemplos abaixo) foi verificada ter oligossacarídeos O-ligados bem como oligossacarídeos N-ligados. Modificações glicosídicas de tais sHASEGPs (por exemplo, modificações compreendendo uma ou mais adições, remoções ou alterações de tais oligossacarídeos N-ligados e/ou O-ligados podem ser usadas para gerar variantes glicosídicas sHASEGPs exibindo perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos alterados que as tornam desejáveis para aplicações particulares. A título de ilustração, mas sem ser restrito a um mecanismo de ação particular, remoção ou alteração de (tal como através de capeamento ou outra falta de exposição) um ou mais oligossacarídeos N-ligados e/ou O-ligados que estão envolvidos em ligação a receptores celulares ou outros pode ser usada para alterar a extensão e/ou taxa na qual sHASEGP se liga a ou é absorvida por um tecido particular, que pode por sua vez ser usado para alterar, por exemplo, seu perfil farmacocinético (por exemplo, através de aumento de sua meia- vida no soro ou de outro modo alterando sua bioabsorção).
[0045] Formulações de sHASEGPs são também providas. SHASEGPs podem ser formuladas em formas liofilizadas e soluções estabilizadas por exemplo. Formulações contendo íons de metal específicos, tal como cálcio, magnésio ou sódio, são úteis para atividade ótima em pH neutro. Em adição a formulações de solução estabilizada, formulações de aplicação lenta são compreendidas aqui para remoção estendida de glicosaminoglicanos ou promoção estendida de espalhamento ou difusão de agentes tal como farmacológicos. São também providos aqui estojos provendo seringas pré-embaladas de sHASEGPs para a administração de pequenos volumes de sHASEGP para procedimentos cirúrgicos intraoculares e outros procedimentos de pequeno volume. Formulações de sal equilibradas para uso ex vivo em procedimentos de tecnologia reprodutiva são também providos.
[0046] Métodos para uso de glicosaminoglicanases incluindo sHASEGPs na remoção de glicosaminoglicanos são também providos. Glicosaminoglicanases incluindo sHASEGP abrem canais no espaço intersticial através da degradação de glicosaminoglicanos que geralmente permitem a difusão de moléculas de menos do que cerca de 500 nm de tamanho. Esses canais podem permanecer relativamente abertos por um período de 24-48 horas dependendo da dose e da formulação. Tais canais podem ser usados para facilitar a difusão de moléculas exogenamente adicionadas tal como fluidos, moléculas pequenas, proteínas, ácidos nucléicos e vetores de terapia de gene e outras moléculas de menos do que cerca de 500 nm de tamanho. Ainda, sem ser restrito a uma teoria ou mecanismo de ação particular, acredita-se que a formação de tais canais possa facilitar o fluxo de fluido bruto dentro de um espaço intersticial, que pode por sua vez promotor a dispersão ou movimento de um soluto (tal como uma molécula detectável ou outro agente de diagnóstico, um anestésico ou outro agente de modificação de tecido, um agente farmacológica ou farmaceuticamente eficaz ou um cosmético ou outro agente estético) que é eficazmente carreado pelo fluido em um processo algumas vezes aqui referido como "transporte convectivo" ou simplesmente convecção. Tal transporte convectivo pode substancialmente exceder a taxa e efeitos cumulativos de difusão molecular e pode então fazer com que o agente terapêutico ou outra molécula administrada mais rápido e eficazmente realize perfusão de um tecido. Ainda, quando uma molécula tal como um agente terapêutico ou outro (tal como um fármaco de molécula pequena ou uma molécula maior ou complexo) é co-formulada ou co-administrada como uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) e ambas são injetadas em um sítio local relativamente confinado, tal como um sítio de administração parenteral não-intravenosa (por exemplo, intradermal, subcutânea, intramuscular ou no ou em torno de outros tecidos internos, órgãos e outros espaços relativamente confinados dentro do corpo), então o fluido associado com a dose administrada pode ambos prover uma força impulsora local (isto é, pressão hidrostática) bem como baixa impedância para o fluxo (através de canais abertos dentro da matriz intersticial) - ambos os quais tenderiam a aumentar o fluxo de fluido, e com ele transporte convectivo do agente terapêutico ou outra molécula contida dentro do fluido. Conforme discutido e ilustrado em mais detalhes aqui, e como será compreendido por aqueles versados na técnica, esses aspectos do uso de sHASEGP e outras glicosaminoglicanases pode ter utilidade substancial para melhorar a biodisponibilidade bem como manipular outras características farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas de agentes co-formulados ou co-administrados.
[0047] sHASEGPs e outras glicosaminoglicanases podem ser também usadas para remover glicosaminoglicanos em excesso tal como aqueles que acontecem seguindo isquemia reperfusão, inflamação, arteriosclerose, edema, câncer, dano ao cordão espinhal e outras formas de cicatrização. Em alguns casos, sHASEGPs e outras glicosaminoglicanases podem ser aplicadas sistemicamente através de infusão intravenosa. Isto pode ser útil quando acesso local não está prontamente disponível tal como o coração ou cérebro ou no caso de neoplasma espalhado onde a doença está em todo o corpo. Para tais aplicações intravenosas ou outras intravasculares, sHASEGPs Supersialadas são freqüentemente preferíveis para aumentar a meia-vida no soro e distribuição nas enzimas hialuronidase nativas que não têm ácidos siálicos terminais.
[0048] Em algumas circunstâncias, tal como dano ao cordão espinal e outros distúrbios do sistema nervoso, glaucoma e certos outros distúrbios do olho, bem como várias outras condições autoimunes, inflamatórias, cânceres e outras doenças e condições cronicamente progressivas, e tratamento cosméticos, aplicação prolongada é preferida. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, várias composições e técnicas diferentes foram desenvolvidas para prover formulações de aplicação lenta ou aplicação sustentada ou depósitos de moléculas de interesse.
[0049] Em outras indicações, uma dose de ação curta única é preferível. Remoção temporária de glicosaminoglicanos pode ser usada para aumentar a aplicação de soluções e fármacos no e/ou através dos espaços intersticiais. Isto pode ser útil para a difusão de anestesia e para a administração de fluidos terapêuticos, moléculas e proteínas. Administração subcutânea, intradermal e intramuscular de moléculas na presença de sHASEGPs (e/ou outras glicosaminoglicanases) também facilita sua distribuição sistêmica mais rapidamente. Tais métodos são muito úteis quando acesso intravenoso não está disponível ou onde aplicação sistêmica mais rápida de moléculas é necessária. A título de ilustração, aplicação de outras moléculas grandes tal como Fator VIII, que são pobremente biodisponíveis quando da administração subcutânea, pode ser injetada com sHASEGPs para aumentar sua biodisponibilidade.
[0050] Usos de sHASEGPs para remoção enzimática de matriz de cúmulo circundando oócitos são também providos. A remoção da matriz de cúmulo usando uma sHASEGP purificada sem os contaminantes tóxicos de extrato derivado de hialuronidase permite recuperação mais suave do oócito com maiores disponibilidades. Além disso, sHASEGPs podem ser fabricadas sem o uso de extratos de gado ou outros organismos que carregam vírus e outros patógenos tal como encefalopatias espongiformes transmissíveis.
[0051] Injeções de volumes pequenos de sHASEGP para uso intraocular podem ser também usadas para espaços pequenos. Por exemplo, sHASEGPs e/ou outras glicosaminoglicanases podem ser injetadas na câmara anterior do olho para remover excesso de substratos viscoelásticos que são administrados durante cirurgia. Injeção intraocular de sHASEGPs pode ser também usada para reduzir a pressão intraocular em glaucoma, para dissolver agregados vítreos, ou "moscas-volantes", para limpar hemorragia vítrea, para o tratamento de degeneração macular, para promover descolamento retinal vítreo em retinopatia diabética e ser misturadas com outras enzimas para promover remodelagem da córnea junto com lentes corretivas. Conforme aqui descrito, sHASEGPs e/ou outras glicosaminoglicanases podem ser também injetadas no olho ou em espaços periorbitais circundantes como uma forma de "agente de espalhamento", isto é, para promover a aplicação de agentes de diagnóstico, anestésicos ou farmacológicos a sítios dentro e/ou em torno do tecido alvo. Por exemplo, injeção de uma sHASEGP concomitante com ou em proximidade temporal com injeção de agentes de diagnóstico, anestésicos ou farmacológicos no espaço do subTenon ou episcleral pode ser usada para promover aplicação transcleral do agente farmacológico nas porções interiores do olho (tal como a coróide, retina e corpo vítreo). O espaço episcleral é um espaço contendo linfo entre o Fascia Bulbi (cápsula ou Tenon) e a esclera que é um tecido protetor relativamente duro circundando a coróide e retina e o interior do olho. O espaço do Sub-Tenon ou episcleral, que é algumas vezes referido como o espaço do linfo periscleral, é geralmente também contínuo com as cavidades subdural e subaracnóide e é atravessado por faixas de tecido conectivo se estendendo da fascia para a esclera. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, a habilidade em promover aplicação de composições através da camada escleral protetora cobrindo o olho permite que uma variedade maior de agentes farmacológicos e outros seja convenientemente e eficientemente aplicada a tecidos de sustentação dentro do olho, tal como a coróide, retina ou humor vítreo. Através da aplicação de composições da presente invenção a tais vias de aplicação in vivo mesmo tecidos relativamente difíceis de atingir, tal como aqueles por trás do olho, podem ser tratados através de meios minimamente invasivos. Será reconhecido que em alguns casos, o uso de uma sHASEGP de duração mais longa tal como sHASEGP peguilada será desejável.
[0052] É importante notar que embora hialuronidases derivadas de animal possam e tenham sido aplicadas para tratar certas condições do olho, e como um fator de espalhamento para promover a aplicação de anestésicos e outros agentes terapêuticos ou farmacológicos, várias considerações importantes se aplicam ao uso de enzimas derivadas de animal e potencialmente ou limitam seu uso ou introduzem preocupações com segurança ou riscos adicionados quando elas são usadas para tratar seres humanos. Dentre essas considerações está a preocupação de que proteínas e outras impurezas presentes nas formulações possam levar a problemas imunogênicos e/ou outros quando aplicadas a tecidos humanos in vivo. Ainda, até o ponto que enzimas animais não-humanas são empregadas, mesmo enzimas purificadas podem contribuir para imunogenicidade uma vez que elas não são de origem humana. Ainda com relação a isso, o potencial para enzimas degradantes tal como hialuronidases em promover eficazmente sua própria dispersão (conforme aqui descrito) poderia aumentar a probabilidade de que versões ou formulações imunogênicas de tais produtos derivados de animal fossem contatadas pelo sistema imune.
[0053] Preocupações com fatores e/ou impurezas derivados de animal são também de grande significância em várias situações; por exemplo, situações onde o tecido alvo já foi submetido a procedimentos cirúrgicos ou outros, situações onde o agente está sendo introduzido em um espaço privilegiado relativamente imune (tal como porções do olho, o coração, o sistema nervoso e muitos outros tecidos ou órgãos que não são tipicamente expostos ao ambiente externo) e/ou situações onde o paciente é imunocomprometido ou de outro modo sob risco elevado associado com infecção. Uso de tais formulações derivadas de animal pode então ser evitado em várias aplicações onde o risco de infecção ou outras complicações reduzem sua utilidade potencial. Nessas situações e em outras, o uso de sHASEGPs recombinantemente preparadas da presente invenção pode prover aplicações que são ambos altamente eficazes e têm perfis de segurança favoráveis, e então melhoram e expandem as condições e situações onde essas enzimas são beneficamente usadas.
[0054] No contexto de injeções parenterais não- intravenosas (tal como injeções intradermais, subcutâneas, intramusculares e outras injeções em espaços outros que não a vasculatura), uma sHASEGP (e/ou ou uma outra glicosaminoglicanase) e um outro agente (por exemplo, uma co-formulação ou uma mistura compreendendo uma sHASEGP e um outro agente tal como um agente de diagnóstico, um agente anestésico, um agente farmacológico, um agente estético, ou suas combinações) em um volume de líquido (por exemplo, um excipiente farmacêutico ou outra solução) pode ser introduzido em um sítio ou sítios dentro do corpo através de injeção ou infusão. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que várias forças possam ser movidas para aumentar a aplicação do agente farmacológico ou outro (até o ponto que dependa em parte da composição, volume e sítio de administração particular, por exemplo). Essas forças impulsoras podem incluir um aumento na pressão hidrostática como um volume de fluido é eficazmente forçado para um espaço contido (tal como o do espaço sub-Tenon referido acima, ou um sítio de injeção intradermal, subcutânea, intramuscular ou outra parenteral não-IV), um aumento subseqüente em transporte convectivo de solutos (ou convecção) como fluxo de fluido é aumentado abaixo de seu gradiente de pressão (e moléculas dissolvidas ou complexos macromoleculares são carregados com ele), bem como um aumento na difusão e/ou permeação mediada por degradação de glicosaminoglicanos e formação de canal concomitante dentro da matriz intercelular a jusante ou espaço intersticial.
[0055] No caso de sHASEGPs serem injetadas na câmara interior do olho para remover substratos viscoelásticos em excesso tal como formulações contendo glicosaminoglicanos (que são geralmente usados como auxiliares oftalmocirúrgicos em uma variedade de procedimentos do segmento anterior), será compreendido por aqueles versados na técnica, em vista dos ensinamentos da presente invenção, que sHASEGP pode ser usada para suplementar ou para obviar a necessidade de procedimentos pós-cirúrgicos tal como irrigação ou aspiração, que são geralmente usados para reduzir a quantidade de viscoelástico aplicado restante no olho após cirurgia ter terminado. Viscoelásticos são geralmente usados durante cirurgias do segmento anterior para manter uma câmara anterior profunda permitindo manipulações mais eficientes e potencialmente protegendo o endotélio da córnea e o outros tecidos durante a cirurgia. Uma variedade de viscoelásticos contendo hialuronato e/ou sulfato de condroitina são usados em cirurgias tal como procedimentos de segmento do olho anterior (vide, por exemplo, Provisc®, Viscoat® e Duovisc® (disponíveis da Alcon Laboratories, Inc., www.alconlabs.com); Healon®, Healon5® e Healon GV® (disponíveis da Advanced Medical Optics, www.healon.com); Amvisc® e Amvisc® Plus (disponíveis da Bausch & Lomb, www.bausch.com); I-Visc®, I-Vis®Plus, I-Visc® 18 e I-Visc® Phaco (disponível da I-MED Pharma, www.imedpharma.com); LA LON® (disponível da General Innovation, www.generaltrade.net)). No entanto, como sabido na técnica, viscoelástico retido na câmara anterior seguindo procedimentos cirúrgicos tal como cirurgia de catarata pode levar à saída de fluxo comprometido a partir da câmara anterior (potencialmente reduzindo o fluxo de saída através da rede trabecular) que pode causar elevações na pressão intraocular (aumentos da IOP) que podem levar ao glaucoma.
[0056] Deste modo, as sHASEGP da presente invenção podem ser introduzidas, por exemplo, através de injeção na câmara anterior do olho como um "antídoto de viscoelástico" para formulações viscoelásticas anteriormente aplicadas contendo glicosaminoglicanos tal como hialuronan. Para uso como tal antídoto de viscoelástico, a sHASEGP será geralmente introduzida através de injeção pós-cirúrgica na câmara anterior (com ou sem irrigação ou aspiração anterior para remover alguma porção do viscoelástico anteriormente aplicado) seguindo procedimentos do segmento anterior tal como cirurgia de catarata e implante de lente intraocular (por exemplo, através de facoemulsificação ou cirurgia extracapsular), cirurgia de filtragem de glaucoma (trabeculectomia), cirurgia de transplante de córnea (por exemplo, queratoplastia penetrante), cirurgia do olho pós- traumática e similar. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, a quantidade de sHASEGP aplicada em tal contexto vai depender, inter alia, de sua atividade específica bem como da quantidade de viscoelástico usado e se ou não um pouco do viscoelástico é primeiro fisicamente removido (por exemplo, através de irrigação ou aspiração). Cada aplicação será então otimizada para as circunstâncias particulares, como será compreendido por aqueles versados na técnica em vista das descrições e ilustrações providas aqui.
[0057] Alguns viscoelásticos, tal como Viscoat® e Duovisc® (disponíveis da Alcon Labs) compreendem ambos hialuronato e sulfato de condroitina. Vantajosamente, muitas sHASEGPs da presente invenção são enzimaticamente ativas ambos como hialuronidases e como condroitinases, tornando- as particularmente eficazes para tais viscoelásticos de formulação dupla.
[0058] Hi aluronidases incluindo sHASEGPs podem ser também combinadas com uma ou mais glicosaminoglicanases (tal como condroitinases) para aplicações tal como as acima ou para ainda abrir canais dentro de espaços intersticiais para outras aplicações tal como aquelas descritas e ilustradas aqui.
[0059] Até o ponto que viscoelásticos são também usados em outros procedimentos, as sHASEGPs da presente invenção podem da mesma maneira ser usadas em conjunto com ou como substituição de técnicas para redução ou eliminação de quantidades de viscoelástico aplicado, isto é, como um antídoto de viscoelástico.
[0060] Em aplicações de sHASEGPs como agentes de espalhamento em tecidos tal como aqueles do olho, uma formulação compreendendo uma ou mais sHASEGPs conforme aqui descrito é tipicamente aplicada a um tecido alvo antes da ou concomitantemente com aplicação de um agente anestésico, de diagnóstico, farmacológico ou outro que é descrito ser liberado no ou na vizinhança do tecido alvo. Em alguns contextos, sHASEGPs podem ser usadas para promover aplicação de um agente farmacológico ou outro através de um primeiro tecido para atingir um ou mais tecidos distais ao primeiro. A título de ilustração, introdução de sHASEGPs no espaço episcleral circundando o olho antes da ou concomitantemente com a introdução de um agente farmacológico ou outro no espaço episcleral pode ser usada para promover aplicação do agente através do tecido escleral protetor e na coróide, na retina e no corpo vítreo. Desta maneira, vários agentes farmacológicos e/ou outros que são úteis para tratamento de condições da coróide, retina e/ou vítreo pode ser aplicados relativamente localmente aos tecidos alvo mas ao mesmo tempo usando uma abordagem relativamente não-invasiva tal como injeção do Sub-Tenon. Situações análogas existem em outras situações onde sHASEGPs podem ser aplicadas a um tecido ou local no corpo a fim de facilitar a aplicação de um agente farmacológico ou outro dentro de um tecido ou local e/ou sítios distais, conforme aqui descrito e ilustrado.
[0061] Embora o grau e taxa de dispersão de um agente co-formulado ou co-administrado dependam em parte do tecido e do agente envolvido, tal dispersão pode ser geralmente aumentada, inter alia, aumentando a quantidade de sHASEGP aplicada, empregando uma sHASEGP tendo atividade específica maior, empregando uma sHASEGP que é mais resistente à degradação ou outras inativação (tal como PEGuilada, supersialada ou outra tal sHASEGP modificada), provendo uma formulação de aplicação sustentada ou depósito da sHASEGP, e outras tais abordagens para aumentar a atividade eficaz e/ou duração da sHASEGP aplicada. Ainda, onde for desejado que a sHASEGP facilite a dispersão de um agente em um tecido ou local distal a, por exemplo, um sítio de injeção, então provisão da sHASEGP e/ou agente em um volume de líquido significante (de modo que enchesse parcialmente ou até mesmo distendesse o sítio de injeção) pode ser usado para promover mais dispersão através de um processo de transporte convectivo, conforme aqui descrito e ilustrado.
[0062] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, sHASEGPs podem ser então usadas para promover eficazmente aplicação de vários agentes anestéticos, de diagnóstico, farmacológicos e/ou outros aos segmentos posteriores do olho para tratamento de condições tal como descolamentos de retina, oclusão da veia retinal, retinopativas proliferativas, retinopatias diabéticas, condições inflamatórias (tal como uveíte, coroidite, retinite e similar), bem como doenças degenerativas, doenças vasculares e vários tumores. Novamente como será compreendido por aqueles versados na técnica, uma variedade de agentes farmacologica ou farmaceuticamentes eficazes pode ser utilmente aplicada para tratar tais condições e doenças do segmento posterior, incluindo, a título de ilustração, agentes anestésicos e farmacológicos tal como aqueles descritos e ilustrados abaixo.
[0063] Co-formulações ou co-administrações de sHASEGP com outras substâncias podem ser também pretendidas para canetas injetáveis para administração subcutânea de volume pequeno ou rápida. Exemplos tal como Epipen®, insulina e outros fluidos podem ser formulados. Os métodos da invenção incluem administração do polipeptídeo de sHASEGP ou composições farmacêuticas contendo sHASEGP antes da, simultaneamente com a ou seguindo a administração de outras moléculas terapêuticas. A sHASEGP pode ser administrada em um sítio diferente do sítio de administração da molécula terapêutica ou a sHASEGP pode ser administrada em um sítio o mesmo que o sítio de administração da molécula terapêutica.
[0064] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a habilidade de sHASEGPs e outras glicosaminoglicanases em causar a degradação de uma porção dos glicosaminoglicanos nos espaços intersticiais entre células resulte em uma abertura de canais temporária dentro do interstício, que por sua vez tende a aumentar o fluxo de fluido intersticial e concomitantemente facilita a difusão e/ou transporte de soluto convectivo (convecção) de componentes dissolvidos dentro do fluido intersticial (tal como anestésicos, fármacos e outros agentes farmacológicos, agentes marcadores e de diagnóstico, e similar). Como será compreendido por aqueles versados na técnica, as sHASEGPs da presente invenção podem ser aplicadas para aumentar a biodisponibilidade (e potencialmente melhorar outras propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas) de vários agentes farmacológicos e outros que são úteis para tratamento ou diagnóstico de várias condições de doença ou de outro modo modificação de um ou mais tecidos in vivo. Categorias ilustrativas de tais agentes incluem: agentes anticâncer, antiinfectivos, anestésicos, antiinflamatórios, citocinas, anticorpos e outras proteínas, ácidos nucléicos, complexos macromoleculares e várias outras moléculas e agentes farmacológicos que modificam atividades celulares e outras fisiológicas, incluindo várias categorias de agentes (e seus membros exemplares) descritos aqui e na técnica.
[0065] Embo ra a difusão e transporte convectivo até mesmo de moléculas pequenas possa ser aumentado através da abertura de canais intersticiais e aumento do fluxo de fluido, no caso de agentes farmacológicos ou outros maiores, tal como muitos bioterapêuticos (incluindo anticorpos e outras proteínas, ácidos nucléicos grandes, complexos macromoleculares (tal como lipossomas e outros veículos macromoleculares), bem como vetores de terapia de gene e similar)), o tamanho das moléculas e a presença de componentes intersticiais tal como glicosaminoglicanos substancialmente prejudicam a difusão e/ou convecção dos agentes. Várias conseqüências potencialmente limitantes do utilidade do agente podem resultar. Por exemplo, a farmacocinética do agente pode ser eficaz prejudicada por uma diminuição de absorção e então distribuição do agente. Ainda, aprisionamento de uma porção do agente no ou próximo ao sítio de administração ambos limita sua biodisponibilidade e pode também causar toxidez como um resultado de uma dose local potencialmente sustentada e alta. Na última consideração, toxidez local que pode ser associada com efeitos colaterais dolorosos ou outros é um problema com muitas biomoléculas grandes que são administradas quando da injeção não-intravenosa, tal como através de injeção subcutânea, intradermal ou intramuscular. Como resultado, vários agentes farmacológicos têm perfis farmacocinéticos (PK) e/ou farmacodinâmicos (PD) que podem ser aumentados pela co-formulação do agente com uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) e/ou co-administrando o agente com uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase), que pode ser provida antes, coincidente com ou após o agente, e administrada no mesmo sítio ou um diferente, parâmetros que seriam o objeto de otimização em modelos padrão (tal como modelos de animal tipicamente usados para avaliar a farmacocinética e farmacodinâmica do agente). Qualquer um de uma variedade de agentes terapêuticos e farmacológicos bem como outros agentes (tal como formulações cosméticas ou estéticas) que são tipicamente administrados através de administração parenteral pode então ser aprimorados usando sHASEGP.
[0066] Embora administração intravascular, particularmente através de injeção intravenosa (IV), possa geralmente prover biodisponibilidade rápida, injeções IV são freqüentemente inconvenientes, associadas com riscos ou inaplicáveis (e mesmo onde praticável podem estar associadas com perfis de PK/PD gerais menos do que ótimos). Uma vez que sHASEGPs podem ser aplicadas para aumentar a biodisponibilidade de agentes administrados através de vias parenterais não-IV (tal como subcutânea, intradermal, intramuscular e outras vias de aplicação de agente no interstício), agentes que foram aplicados através de injeção IV podem ser reformulados para aplicação através de vias parenterais não-IV. Tais reformulações podem prover benefícios substanciais tal como permitir o uso de agentes onde administração IV é inconveniente, inaplicávle, insegura, muito dispendiosa ou de outro modo limitada. A reformulação de agentes IV como parenterais não-IV pode também permitir que pacientes auto-administrem os agentes, e pode permitir que a dosagem seja otimizada (por exemplo, melhor adaptada aos parâmetros PK/PD do agente) evitando a necessidade de administração através de injeção intravenosa.
[0067] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, parâmetros de PK/PD que podem ser melhorados usando sHASEGPs (e/ou outras glicosaminoglicanases) incluem medidas tal como Cmax (a concentração máxima de agente atingida seguindo absorção na, por exemplo, corrente sangüínea), Tmax (o tempo requerido para atingir concentração máxima), T1/2 (o tempo requerido para que a concentração caia pela metade), Cmin (a concentração mínima de agente seguindo metabolismo e excreção), AUC (área sob a curva de concentração versus tempo, uma medida da quantidade geral de biodisponibilidade), concentrações em vários tecidos de interesse (incluindo, por exemplo, a taxa de atingimento das concentrações desejadas, os níveis gerais e a duração da manutenção dos níveis desejáveis) e Emax (o efeito máximo atingido). A título de ilustração, reformulação de um fármado ou outro agente farmacológico com uma sHASEGP ou co- administração do agente com uma sHASEGP (que pode ser introduzida local ou sistemicamente, e antes, junto com ou após o agente) pode ser usada por exemplo para aumentar a Cmax do agente, diminuir seu Tmax, diminuir sua T1/2, a aumentar sua AUC e/ou diminuir sua Emax. Como será compreendido, a habilidade em prontamente e proporcionalmente manipular tais parâmetros de PK e PD (por exemplo, através da aplicação de mais ou menos unidades de sHASEGP e alteração do tempo e/ou local de administração) permite a melhora de vários de um agente farmacológico e outros. Avaliação dos níveis desses parâmetros pode ser realizada em modelos tal como modelos animais usados para medições de PK/PD do agente, e co-formulações e/ou co- administrações que aumentam a eficácia relativa para perfil de segurança então selecionado para uma aplicação particular.
[0068] Dentre parenterais não-IV, sHASEGPs (e/ou outras glicosaminoglicanases) podem ser também usadas para permitir que os agentes sejam administrados através de vias mais convenientes e/ou com maior eficiência. A título de ilustração (e sem limitação), através de reformulação e/ou co-administração de agentes com sHASEGP (ou local ou sistemicamente e ou antes, coincidente ou após administração do agente) agentes que são tipicamente administrados através de injeção subcutânea podem ao invés ser administrados através de injeção intradermal, e agentes que são tipicamente administrados através de injeção intramuscular podem ao invés ser administrados através de injeção subcutânea ou intradermal. Alternativamente, agentes podem ser administrados através da mesma via, mas com farmacocinética e/ou farmacodinâmica aperfeiçoada usando sHASEGPs.
[0069] O uso de sHASEGPs (e/ou outras glicosaminoglicanases) para reformular fármacos IV e outros agentes como parenterais não-IV também permite aplicação dos agentes usando qualquer um de uma variedade de novos dispositivos de injeção feitos para aplicação fácil e/ou rápida, e para facilitar auto-administração. Tais dispositivos incluem, por exemplo, dispositivos ultra- afiados e de microagulha (tal como aqueles desenvolvidos pela Becton Dickinson e outros) bem como dispositivos para injeção sem agulha (tal como Biojector® e outros dispositivos disponíveis da Biojetc; IntraJect® e outros dispositivos disponíveis da Aradigm; dispositivos Medijector® e similar). Vários dispositivos (tal como o Biojector) são particularmente úteis para facilitação de injeções intradermais que tendem a requerer mais experiência quando usando agulhas padrão (devido ao potencial para penetração da derme durante a colocação da agulha, e aplicação do agente a um sítio de tecido de base tal como a camada subcutânea). Para alguns agentes farmacológicos, tal como vacinas, por exemplo, (por exemplo, uma vacina baseada em DNA ou outra), pode ser particularmente vantajoso aplicar o agente nas camadas dermais conforme oposto às subdermais uma vez que há uma tendência a haver uma concentração relativamente alta de células apresentando antígeno (APCs) localizadas dentro da derme.
[0070] No contexto daqueles agentes que são tipicamente aplicados através de injeção intradermal (seja através de agulhas padrão ou outros dispositivos mais novos), ou aqueles muitos outros agentes que não são atualmente mas poderiam ser aplicados através de injeção intradermal, a co- introdução local de uma sHASEGP (e/ou outras glicosaminoglicanases) pode ser usada para aumentar a aplicação do agente farmacológico ou outro agente aplicado e para promover sua dispersão ou espalhamento dentro da derme. No caso de uma vacina, onde a derme pode ser o tecido alvo primário, dada a abundância local de APCs, a sHASEGP (e/ou outra glicosaminoglicanase) pode então facilitar a dispersão da vacina dentro do tecido alvo, dessa maneira então aumentando a probabilidade e extensão de interações entre uma vacina e APCs (que pode significantemente potencializar a geração de uma resposta imunomoduladora). No caso de outros agentes, a derme pode não ser o tecido alvo primário mas é ao contrário um tecido onde uma dose do agente é introduzida a partir do qual é desejado que o agente seja absorvido em um outro tecido, tipicamente a corrente sangüínea. No último caso, a corrente sangüínea pode ser ela mesma o tecido alvo de interesse (por exemplo, para fatores moduladores do sangue conforme aqui descrito e na técnica), ou a corrente sangüínea pode ser ela mesma um tecido de aplicação através do qual o agente é transportado para um tecido alvo distal (por exemplo, um tecido no corpo suprido pela corrente sangüínea). Em qualquer um desses últimos casos (onde aplicação é intradermal mas é desejado que o agente seja aplicado à corrente sangüínea), a sHASEGP (e potencialmente um volume de líquido onde ela é injetada) pode facilitar a dispersão do agente primeiro dentro da derme e então na vasculatura que drena a derme e eventualmente no suprimento de sangue maior), conforme aqui descrito e ilustrado.
[0071] O uso de sHASEGPs para aumentar a farmacocinética e/ou farmacodinâmica de outros agentes terapêuticos ou farmacológicos pode ser também aplicado a agentes aplicados através de vias outras que não administração parenteral não-IV. Por exemplo, sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a presença de sHASEGPs em espaços intertisciais dentro do corpo (que pode ser conseguida através de administração local e/ou sistêmica de sHASEGPs) tende a promover canais intersticiais e um aumento no fluxo de fluido dentro do espaço intersticial que por sua vez facilita ambos difusão e transporte convectivo de agentes dissolvidos com o fluido intersticial (tal como agentes farmacológicos e outros). A título de ilustração, agentes que são administrados diretamente na corrente sangüínea (por exemplo, através de injeção intravenosa), ou oralmente (e então entram na corrente sangüínea após absorção a partir do trato gastrointestinal, por exemplo), podem ser ainda submetidos a restrições na pós-absorção, isto é, fase de distribuição de sua farmacocinética. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que sHASEGPs possam aumentar a aplicação a células alvo através do aumento da permeabilidade intersticial e fluxo de fluxo e então aumentando a difusão e/ou convecção de agentes dentro do espaço intersticial (que eficazmente forma o interposto entre quase todas as vias de aplicação farmacológicas e as células alvo).
[0072] Ainda, acredita-se que mudanças em pressão oncótica causadas pela administração de sHASEGPs possa contribuir para o aumento da aplicação de agentes farmacológicos. Novamente, sem desejar ser limitado pela teoria, a presença de sHASEGP e degradação concomitante ao longo do lado intersticial de um tecido vascularizado tenderiam a diminuir a pressão oncótica dentro do espaço intersticial que por sua vez aumentaria a filtragem de fluido da vasculatura para o espaço intersticial.
[0073] O potencial para diminuir pressão intersticial é considerado ser particularmente importante no contexto de muitos cânceres onde pressão intersticial dentro do tumor (pressão intersticial de tumor de TIF) é elevada. A TIF alta pode resultar em impedância relativa para fluxo de fluido a partir da vasculatura em direção ao centro de um tumor, deste modo limitando a quantidade de agente anticâncer que eficazmente atinge um tumor, particularmente sítios que são mais profundos dentro de uma massa de tumor. A introdução de sHASEGPs em interstícios de tumor tenderia então a aumentar a aplicação de agentes anticâncer localmente aplicados bem como sistemicamente disponíveis que podem penetrar mais prontamente o tumor quando a pressão oncótica intersticial é reduzida e difusão e/ou transporte convectivo aumentado. Medições de TIF e condutividade hidráulica (K) dentro de tumores (por exemplo, usando moléculas marcadas tal como albumina marcada com corante Azul de Evan) podem ser usadas para avaliar quantitativamente o efeito de várias concentrações de sHASEGPs sobre dinâmica de fluido de tumores in vivo, conforme aqui ilustrado e/ou na técnica.
[0074] Exacerbação adicional da dinâmica de fluido reduzido dentro de muitos tumores, e destaque de um benefício potencial adicional de aplicação de sHASEGPs a tumores, é o fato de que muitos tumores exibem acúmulo de glicosaminoglicanos, particularmente hialuronan (que pode ser devido ao fato de que linfáticos, que são a via predominante para catabolismo de hialuronan, são prejudicados ou faltam em muitos tumores). Tal hialuronan em excesso pode contribuir para o impedimento de condutividade hidráulica. A introdução de sHASEGPs pode ser então usada para combater o acúmulo de glicosaminoglicanos em muitos tumores, melhorando a condutividade elétrica dentro do tumor e tornando-os eficazmente mais suscetíveis a agentes antitumor (sejam local ou sistemicamente aplicados).
[0075] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, os princípios descritos aqui podem ser também aplicados a vários outros agentes farmacológicos e outros que são desejados ser aplicados a sítios dentro do corpo, tal como para a prevenção, diagnóstico e/ou tratamento de doença ou de outro modo modular as funções fisiológicas. Classes ilustrativas de tais agentes (e seus membro exemplares) são providas aqui, e muito mais são conhecidas na técnica ou estão sob desenvolvimento.
[0076] Em adição ao seu uso em aperfeiçoamentos e/ou reformulações potenciais de uma variedade de agentes farmacológicos e/ou agentes parenteralmente administrados, sHASEGPs podem ser também empregadas com utilidade em conexão com agentes não-parenterais (tal como agentes formulados como pílulas, líquidos ou outras formas para ingestão e absorção típica através do trato gastrointestinal). Por exemplo, uma vez que a maioria dos fármacos não-parenterais deve no final atingir células dentro do interstício a fim de exercerem seus efeitos desejados, o uso de sHASEGPs para aumentar a difusão e/ou transporte convectivo dentro do interstício (ou sistemicamente ou localmente (por exemplo, através de administração local ou direcionada de sHASEGP)) pode ser aplicado para melhorar a extensão e/ou taxa na qual não-parenterais (bem como parenterais) atingem as células alvo desejadas.
[0077] Ainda, vários agentes que são tipicamente administrados não-parenteralmente (por exemplo, oralmente), podem ser reformulados, ou seus ingredientes ativos reformulados, para uso em administrações parenterais que são tornadas mais eficazes e/ou seguras em combinação com sHASEGPs. Para ilustrar esta abordagem amplamente aplicável, a habilidade de sHASEGPs em facilitar aplicação direcionada a tecidos particulares (tal como a habilidade de sHASEGPs em prover aplicação transescleral a tecidos dentro da parte posterior do olho) pode ser usada para aplicar qualquer um de uma variedade de agentes (incluindo agentes anteriormente administrados sistemicamente) diretamente e de preferência a um sítio localizado de interesse dentro do corpo. Isto pode não apenas prover concentrações mais desejáveis e/ou mais rapidamente atingidas no sítio de interesse, mas pode substancialmente reduzir problemas e limitações potenciais associados com administração sistêmica onde concentrações em sítios indesejados podem igualar ou até mesmo exceder concentrações no sítio alvo desejado (potencialmente dando início a efeitos colaterais indesejados bem como agente de refugo). Em alguns casos, agentes que não são amplamente usados ou não são usados para certas indicações ou em certos pacientes, por exemplo, podem ser eficazmente aplicados para beneficiar pacientes adicionais ao serem co-formulados ou co-adiministrados com sHASEGPs conforme aqui descrito e ilustrado.
[0078] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, a habilidade em empregar sHASEGP para aumentar, acelerar e/ou direcionar distribuição de agentes co-formulados e/ou co-administrados, e manipular outros aspectos de sua farmacocinética ou farmacodinâmica (por exemplo, a fim de melhorar o perfil de risco:benefício ou facilitar seu uso pelos pacientes, família ou profissionais de cuidado da saúde), provê uma oportunidade grande para melhorar fármacos e outros agentes que são usados para tratar, diagnosticar ou prevenir doenças.
[0079] Sem desejar ser limitado a um conjunto de aplicações particular, glicosaminoglicanases, incluindo sHASEGPs conforme aqui descrito (bem como outras hialuronidases e outras glicosaminoglicanases), podem ser usadas para eficazmente obter aplicação de bolus ou tipo bolus de qualquer número de agentes farmacológicos e outros através de vias parenterais intravenosas, bem como através de outras vias de administração (por exemplo, através do aumento da aplicação de agentes em e/ou através de um tecido alvo após eles deixarem a corrente sangüínea (sejam eles introduzidos na corrente sangüínea diretamente (tal como através de administração IV) ou indiretamente (tal como através de administração oral ou parenteral não-IV)).
[0080] Sem ser restrito a um mecanismo de ação específico ou seu aspecto, acredita-se que a habilidade dessas enzimas em temporariamente degradar componentes da matriz intersticial entre células (que é responsável por uma porção substancial do espaço fluido no corpo e um espaço correspondentemente grande que deve ser atravessado a fim de que agentes farmacológicos e outros atinjam a maioria das células alvo) pode significantemente promover a aplicação de agentes a células alvo através de um ou mais meios potencialmente sinérgicos. Primeiro, embora o bruto do fluido intersticial exiba algum grau de fluxo, este fluxo é freqüentemente restringido ou impedido pelos glicosaminoglicanos tal como hialuronan e outros componentes intersticiais. A habilidade de glicosaminoglicanases incluindo sHASEGPs (bem como outras hialuronidases e outras glicosaminoglicanases) em abrir canais dentro de tais espaços intersticiais, conforme aqui descrito e ilustrado, pode ser usada para diminuir a impedância e aumentar o grau e taxa de fluxo a "jusante" resultante de qualquer dada pressão a "montante". Segundo, no caso de injeções parenterais não-IV de sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) e um outro agente farmacológico ou outro, o volume da injeção parenteral não-IV pode ser usado para aumentar a pressão motriz a montante ou cabeça de pressão (por exemplo, através do aumento da pressão hidrostática dentro de um espaço confinado), que pode promover mais fluxo. Terceiro, uma vez que o volume de fluido compreendendo a sHASEGP introduzida (ou outra glicosaminoglicanase) e o outro agente está eficazmente diminuindo gradiente de pressão aumentado (isto é, o gradiente aumentado criado através da elevação da pressão hidrostática associada com o "bolus" injetado e simultaneamente diminuindo a pressão intersticial dentro do tecido circundante), solutos dentro do bolus podem ser eficazmente carreados (por exemplo, através de transporte convectivo) para o tecido adjacente. Este fluido ou bolus injetado pode então ser eficientemente e relativamente mais rapidamente movido para um tecido adjacente e aplicar qualquer que seja agente farmacológico ou outro que foi introduzido no ou próximo ao mesmo sítio de introdução (por exemplo, através de co-formulação ou co-administração do agente em combinação com a sHASEGP ou outras glicosaminoglicanases).
[0081] A título de ilustração, uso de glicosaminoglicanases tal como sHASEGPs para abrir canais dentro de espaços intersticiais, conforme aqui descrito e ilustrado, pode ser usado para aumentar o fluxo intersticial para e através de tecidos tal como tumores e outros onde fluxo é tipicamente impedido e pressões intersticiais elevadas. Exemplos ilustrativos desses princípios conforme aqui descritos incluem o uso de sHASEGPs para reduzir a pressão intersticial dentro de um tumor in vivo.
[0082] Fluxo aumentado pode da mesma maneira ser aplicado a tecido normal para, por exemplo, permitir que um agente anestésico, de diagnóstico, cosmético ou estético ou um farmacológico ou outro seja aplicado a um tecido (por exemplo, para modificar o tecido ou introduzir uma formulação depósito em um tecido). Fluxo maior pode da mesma maneira ser aplicado a um primeiro tecido ou proximal para promover aplicação de um agente através do tecido de introdução a um tecido distal, tecido distal que pode ser ele mesmo o tecido alvo desejado ou uma via para o tecido alvo desejado. Exemplos ilustrativos desses princípios conforme aqui descritos incluem, por exemplo: (i) o uso de sHASEGPs introduzidas no espaço episcleral circundando o olho para promover a aplicação de agentes através da esclera a fim de se direcionar a tecidos alvo distais dentro do interior do olho tal como a retina e coróide; e (ii) o uso de sHASEGPs introduzidas intradermalmente para promover a aplicação de agentes através das camadas subdermais e para a corrente sangüínea, que pode ser ela mesma o tecido alvo (por exemplo, para agentes de modificação do sangue) ou uma via através da qual o(s) agente(s) pode(m) ser aplicado(s) a outros tecidos alvo dentro do corpo.
[0083] A título de ilustração adicional dessas técnicas e composições para promoção de aplicação de agentes farmacológicos e outros a tecidos desejados dentro do corpo, os exemplos adicionais que seguem são providos. Por meio de tais conforme aqui descrito e ilustrado, os perfis farmacocinéticos e/ou farmacodinâmicos dos agentes farmacológicos e os perfis de absorção, distribuição e/ou eficácia de outros agentes podem ser aumentados ou de outro modo modificados. Ainda, agentes que eram essencialmente ou praticamente limitados à aplicação através de uma via (tal como através de injeção IV) podem ser aplicados através de outras vias mais seguras, menos invasivas, de menos custo e/ou mais convenientes.
[0084] Po r meio de ilustração adicional e sem ser limitado a um tipo particular de aplicação, um volume (V) de líquido (L) compreendendo uma sHASEGP ou outras glicosaminoglicanase (Enzima GAG) pode ser introduzido em um sítio de tecido no corpo (um Tecido de Dosagem). Por meios conforme descrito e ilustrado aqui, a Enzima GAG pode ser aplicada no e até certo ponto através do Tecido de Dosagem. Sem ser restrito a um mecanismo de ação particular, as Enzimas GAG podem ser eficazmente carreadas para o Tecido de Dosagem através de transporte convectivo através do volume de líquido (L). O transporte convectivo pode por sua vez ser promovido em parte pela pressão hidrostática associada com L (que pode prover uma pressão motriz) e em parte pela habilidade da Enzima GAG em abrir canais dentro dos espaços intersticiais do Tecido de Dosagem (que pode reduzir a impedância a jusante para fluxo e então diminuir a pressão de resistência). Um diferencial de pressão motriz de fluido pode ser então criado e até o ponto desejado ele pode ser aumentado, por exemplo, através de um ou ambos que seguem: (i) introdução e se desejado aumento de uma pressão hidrostática motriz (por exemplo, através de introdução de L em um espaço confinado e se desejado aumento de V); e (ii) redução da impedância a jusante para fluxo (por exemplo, através da introdução da enzima GAG, e se desejado aumento de sua eficácia através de, por exemplo, aumento de sua concentração, aumento de sua resistência à degradação (por exemplo, através de PEGuilação, supersialação e outra modificação) e/ou aumento de sua aplicação através de transporte convectivo (por exemplo, através do aumento de V)).
[0085] Em certas modalidades (por exemplo, onde o grau ou taxa maior de aplicação é desejado), V é um volume suficiente para temporariamente distender o sítio dentro do Tecido de Dosagem onde a Enzima GAG é introduzida. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, o volume (V) que pode ser acomodado e o grau resultante de distensão (D) dependem do tecido particular. Para propósitos de ilustração e não limitação, o ponto até o qual distensão acontece varia, por exemplo, de situações onde (i) o Tecido de Dosagem é um espaço relativamente grande e/ou cheio com fluido de rápido movimento (tal como corrente sangüínea em conexão aplicação intravenosa ou intra-arterial), caso onde L pode ser grande (por exemplo, muitos ml se desejado) mas D tende a ser relativamente mínimo; (ii) o Tecido de Dosagem é um espaço relativamente menor e/ou cheio com fluido se movendo menos rapidamente (tal como fluido cerebroespinhal em conexão com aplicação intratecal), caso onde L pode ser ainda relativamente grande mas D pode ser mais do que mínimo dependendo do sítio preciso e do volume de injeção; (iii) o Tecido de Dosagem é um relativamente menor mas espaço um pouco distensível (tal como o espaço episcleral circundando o olho para propósitos de ilustração); ou (iv) o Tecido de Dosagem é um espaço relativamente mais denso e/ou mais confinado com pressão de resistência maior (tal como a derme em conexão com aplicação intradermal para propósitos de ilustração).
[0086] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, V pode variar de volumes de menos do que 0,1 ml a volumes de mais do que 100 ml, para aplicações estando na faixa de cerca de 0,5 ml a 20 ml, e para muitos na faixa de 1 ml a 10 ml, freqüentemente de a partir de 2 a 5 ml; mas pode ser variado para situações particulares conforme aqui ilustrado. V pode ser também especificamente otimizado dentro de tais faixas para uma aplicação particular conforme desejado, por exemplo, através da comparação de perfis farmacocinéticos e/ou farmacodinâmicos em uma faixa de volumes de teste.
[0087] Como será compreendido por aqueles versados na técnica em vista desses ensinamentos, através da combinação da ação e reiniciação rápidas da atividade de abertura de canal da Enzima GAG (que ambos promove e é promovida pela sua própria aplicação), junto com um sistema de aplicação que ambos promove e é promovido pela atividade catalítica, um sistema de aplicação de fármaco multiplamente sinérgico pode então ser gerado; conforme descrito e ilustrado mais aqui.
[0088] Em um primeiro aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP ou outra glicosaminoglicanase (Enzima GAG) e um ou mais agentes farmacológicos ou outros (Agente(s) (tal como moléculas detectáveis ou outros agentes de diagnóstico, anestésicos ou outros agentes de modificação de tecido, agentes farmacológicos ou farmaceuticamente eficazes, agentes cosméticos ou outros estéticos, e outros agentes desejados ser introduzidos em um ou mais tecidos dentro do corpo) é introduzido em um primeiro sítio de tecido no corpo (um Tecido de Dosagem) que é ele mesmo um tecido alvo desejado (um Tecido Alvo) para o agente. Através de meios conforme aqui descrito e ilustrado, o(s) agente(s) é/são aplicados no e através do Tecido Alvo a um grau e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da Enzima GAG.
[0089] Como será compreendido por aqueles versados na técnica em conexão com este e os outros aspectos ilustrativos aqui, o Tecido de Dosagem pode ser qualquer um de uma variedade de tecidos que podem ser atingidos de fora do corpo (por exemplo, usando várias vias de administração conforme descrito e ilustrado aqui e/ou conforme sabido na técnica) ou de dentro do corpo (por exemplo, em conexão com cirurgia ou usando qualquer um de uma variedade de abordagens e técnicas não-cirúrgicas ou minimamente invasivas para atingir tecidos dentro do corpo). Tais Tecidos de Dosagem incluem aqueles descritos e ilustrados aqui bem como outros conhecidos na técnica.
[0090] Como da mesma maneira será compreendido por aqueles versados na técnica em conexão com esses e outros aspectos ilustrativos aqui, o Tecido Alvo pode ser qualquer um de uma variedade de tecidos aos quais é desejado que uma Enzima GAG e potencialmente outro(s) Agente(s) sejam aplicados (por exemplo (i) tecidos que são o sujeito de esforços para diagnosticar, prevenir ou tratar uma condição de doença (seja intrinsicamente causada tal como condição de doença herdada ou desenvolvida ou extrinsicamente causada tal como uma infecção); (ii) tecidos que são desejados que sejam anestesiados ou de outro modo modulados (por exemplo, no contexto de cirurgia e/ou outros procedimetos); (iii) tecidos onde for desejado dar início a uma resposta imune (tal como associado com vacinação); (iv) tecidos que são para servir como um sítio depósito para aplicação de agente(s) a outros tecidos; (v) tecidos a serem modificados para propósitos estéticos ou cosméticos; e (vi) tecidos ou sítios no corpo a serem modificados para outros propósitos). Tais Tecidos Alvo incluem aqueles descritos e ilustrados aqui bem como outros conhecidos na técnica.
[0091] Como será da mesma maneira compreendido por aqueles versados na técnica com relação com o acima e com outros aspectos ilustrativos aqui, o(s) Agente(s) pode(m) ser qualquer um de uma variedade de moléculas, macromoléculas e complexos macromoleculares, que são ou podem ser usados para alteração ou modulação das condições dentro do corpo (por exemplo, (i) para propósitos de diagnóstico, prevenção ou tratamento de uma condição de doença (seja intrinsicamente causada tal como uma condição de doença herdada ou desenvolvida ou extrinsicamente causada tal como uma infecção) afetando o Tecido Alvo e/ou tecidos adjacentes; (ii) para propósitos de anestesia ou de outro modo modulação da fisiologia do Tecido Alvo; (iii) para propósitos de dar início a uma resposta imune conforme associado com vacinação; (iv) para propósitos de uso do Tecido Alvo como um sítio depósito para aplicação de agente(s) a outros tecidos; (v) para propósito estéticos ou cosméticos; e/ou (vi) para outros propósitos servidos através da aplicação de uma enzima GAG e potencialmente outro(s) Agente(s) a um tecido ou outro sítio no corpo). Tais Agentes incluem as várias classes de agentes e seus membros descritos e ilustrados aqui, bem como outros membros de tais classes de agentes, e outras classes de agentes (e seus membros) conhecidos na técnica.
[0092] Em um segundo aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP ou outra glicosaminoglicanase (Enzima GAG) e um ou mais agentes farmacológicos ou outros (Agente(s)) é introduzido em um sítio de tecido no corpo (Tecido de Dosagem) que é adjacente ou proximal a um tecido (Tecido B) que é ele mesmo um tecido alvo desejado. Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, o(s) Agente(s) é/são aplicados a partir do Tecido A para o Tecido alvo B a um grau e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da Enzima GAG.
[0093] Em um terceiro aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outras glicosaminoglicanases) (Enzima GAG) e um ou mais agentes farmacológicos ou outros (Agente(s)) é introduzido em um sítio de tecido no corpo (Tecido de Dosagem) que é proximal a um ou mais tecidos (Tecidos Intervenientes) localizados entre os Tecidos A e um outro tecido ou tecidos (Tecidos Distais) que são eles mesmos tecidos alvo desejados ou incluem um tecido alvo desejado (Tecidos Alvo). Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, o(s) Agente(s) é/são aplicados a partir do Tecido A e através de um ou mais Tecidos Intervenientes para atingir um ou mais Tecidos Alvo a um grau e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da(s) Enzima(s) GAG.
[0094] Em um quarto aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outras glicosaminoglicanases) (Enzima GAG) e um ou mais agentes farmacológicos ou outros (Agente(s)) é introduzido em um sítio de tecido no corpo (Tecido de Dosagem) que é proximal a um ou mais tecidos de aplicação, tal como a corrente sangüínea, linfo ou fluido cerebroespinhal (Tecidos de Aplicação), que são os tecidos alvo desejados ou incluem um tecido alvo desejado. Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, o(s) Agente(s) é/são aplicados a partir do Tecido A a um ou mais Tecidos de Aplicação a um grau e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da(s) Enzima(s) GAG.
[0095] Em um quinto aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outras glicosaminoglicanases) (Enzima GAG) e um ou mais agentes farmacológicos ou outros (Agente(s)) é introduzido em um sítio de tecido no corpo (Tecido de Dosagem) que é proximal a um ou mais tecidos de aplicação, tal como a corrente sangüínea, linfo ou fluido cerebroespinhal (Tecidos de Aplicação), que aplicam fluido a um ou mais tecidos alvo desejados (Tecidos Alvo) dentro do corpo. Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, o(s) Agente(s) é/são aplicados a partir do Tecido A a um ou mais Tecidos de Aplicação e deles para um ou mais Tecidos Alvo a jusante a um grau e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da(s) Enzima(s) GAG.
[0096] Em um sexto aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) (Enzima GAG) junto com um ou mais agentes farmacológicos ou outros (Agente(s)) é introduzido em um ou mais tecidos de aplicação, tal como a corrente sangüínea, linfo ou fluido cerebroespinhal (Tecidos de Aplicação) que fornece fluido para um ou mais Tecidos Alvo desejados (por exemplo, através da corrente sangüínea suprindo um Tecido Alvo). Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, o(s) Agente(s) permeia(m) o Tecido Alvo até um ponto e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da(s) Enzima GAG.
[0097] Em um sétimo aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) (Enzima GAG) é introduzido em um sítio de tecido no corpo (Tecido A) que é um tecido alvo desejado ou próximo a um tecido alvo desejado (Tecido Alvo) e um ou mais outros agentes farmacológicos ou outros (Agente(s)) são introduzidos no corpo através de uma outra via de administração (tal como através de aplicação oral ou injeção intravenosa) que permite que o(s) Agente(s) atinjam o Tecido Alvo (por exemplo, através da corrente sangüínea suprindo o Tecido Alvo, seguindo absorção ou injeção no sangue). Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, o(s) Agente(s) permeia(m) o Tecido Alvo a um ponto e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da(s) Enzimas GAG.
[0098] Em um oitavo aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) (Enzima GAG) é introduzida em um sítio ou sítios de tecido dentro do corpo (Sítio(s) de Tecido)) que têm uma pressão intersticial elevada. Através de meios conforme aqui descrito e ilustrado, a pressão intersticial dentro do(s) Sítio(s) de Tecido é reduzida através da atividade degradante da(s) Enzima(s) GAG.
[0099] Em um nono aspecto da invenção, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) (Enzima GAG) é introduzido em um sítio ou sítios de tecido dentro do corpo (Sítios(s) de Tecido)) que tem um excesso de hialuronan ou outro glicosaminoglicano. Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, o excesso de hialuronan ou outro glicosaminoglicano dentro dos Sítio(s) de Tecido é reduzido através da atividade degradante da(s) Enzima(s) GAG.
[00100] Em um décimo aspecto ilustrativo, um volume de líquido (V) compreendendo uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) (Enzima GAG) é introduzido em um sítio ou sítios de tecido dentro do corpo (Sítio(s) de Tecido)) que estão no ou próximo a um ponto de acesso desejado para hipodermóclise (um Sítio de Clise). Através de meios conforme descritos e ilustrados aqui, fluidos podem ser então aplicados no e através do(s) Sítio(s) de Clise a um ponto e/ou taxa maior do que aconteceria na ausência da(s) Enzima(s) GAG.
[00101] Como será compreendido por aqueles versados na técnica em vista das descrições detalhadas e modalidades ilustrativas providas aqui, qualquer um de uma grande variedade de agentes pode ser co-introduzido (por exemplo, através de co-formulação ou co-administração com a Enzima GAG) e qualquer uma de uma variedade de Enzimas GAG pode ser empregada em concentrações em faixas tal como aquelas providas aqui mas tipicamente otimizadas para o tecido e objetivo particulares envolvidos. O volume de líquido (V) aplicado nos aspectos ilustrativos acima vai geralmente depender da natureza do sítio de introdução e vai da mesma maneira tipicamente ser otimizado para o tecido e objetivo particulares envolvidos. Conforme descrito e ilustrado aqui, no caso de administrações parenterais não- IV, V pode ser aumentado (dentro dos limites particulares do sítio de tecido) a fim de prover uma pressão motriz hidrostática aumentada que, acoplada com impedância menor associada com degradação de hialuronan ou outro glicosaminoglicano, pode fazer com que eficazmente o volume de líquido funcione como um bolus - carreando qualquer soluto que ele contenha para o espaço intersticial a jusante e potencialmente além.
[00102] Desse modo, é provida aqui uma variedade de técnicas empregando hialuronidases (e/ou outras glicosaminoglicanases) para prover a aplicação de agentes farmacológicos e outros a sítios dentro do corpo, bem como uma família de glicoproteínas hialuronidase neutras ativas secretadas eucarióticas chamadas sHASEGPs, e seus domínios funcionais, especialmente Hialuronidase ou seus domínios (catalíticos), muteínas e outros seus derivados e análogos. São também providos aqui ácidos nucléicos codificando sHASEGPs. São ainda providas aqui formulações, co- formulações e usos terapêuticos das ditas sHASEGPs (incluindo através de co-administração com outros agentes) para tratar, prevenir ou diagnosticar doença, e para uso como enzimas de modificação de tecido.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO
[00103] A Figura é um vetor map do Vetor HZ24 de sHASEGP.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. DEFINIÇÕES:
[00104] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como é geralmente compreendido por um versado na técnica à qual a(s) invenção(ões) pertence. Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos de patente publicados e publicações, seqüências do Genbank, websites e outros materiais publicados referidos em toda a presente descrição, a menos que de outro modo mencionado, são incorporados aqui a título de referência em sua totalidade. No caso de haver uma pluralidade de definições para os presentes termos, aqueles nesta seção prevalecem.
[00105] Onde for feito referência a um URL ou outro tal identificador ou endereço, é compreendido que tais identificadores podem mudar e informação particular na internet pode ir e vir, mas informação equivalente pode ser encontrada através de pesquisa na internet. Referência a isto evidencia a disponibilidade e disseminação pública de tal informação.
[00106] Conforme aqui usado, as abreviações para quaisquer grupos de proteção, aminoácidos e outros compostos são, a menos que de outro modo indicado, de acordo com seu uso comum, abreviações reconhecidas, ou a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (vide (1972) Biochem. 11:942-944).
[00107] Conforme aqui usado, Hialuronidase eucariótica refere-se a uma família diversa de endoglicosaminidases glicosaminoglicano, onde o resíduo glutamato na Hialuronidase hidrolisa as ligações 1,4 beta de hialuronan e condroitina sulfatos através de um mecanismo catalítico de ácido-base.
[00108] De interesse particular são hialuronidases neutras-ativas ou sHASEGPs de origem de mamífero, incluindo humana. Aqueles versados na técnica reconhecem que, em geral, substituições de aminoácido únicas em regiões não-seqüenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (vide, por exemplo, Watson e outros (1987) Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, The Benjamin/Cumming Pub. Co. p. 224).
[00109] Conforme aqui usado, sHASEGP ancorada à membrana refere-se a uma família de Hialuronidases ancorada à membrana que compartilham características estruturais comuns conforme aqui descrito. Conforme descrito e ilustrado aqui, hialuronidases (isto é, glicosaminoglicanases capazes de quebrar hialuronan, de preferência aquelas exibindo pelo menos alguma atividade nas faixa de pH neutro) que são normalmente ancoradas à membrana podem ser convertidas em sHASEGPs solúveis ou sHASEGPs através da remoção ou de outro modo modificação de uma ou mais das regiões que estão associadas com ancoramento da hialuronidase na membrana.
[00110] Conforme aqui usado, hialuronidase solúvel refere-se a um polipeptídeo caracterizado por sua solubilidade sob condições fisiológicas. HASEGP solúvel pode ser distinguida por exemplo através de sua divisão para a fase aquosa de uma solução de Triton X-114 aquecida para 37oC (Bordier e outros, J. Biol. Chem. 1981 25 de fevereiro;256(4):1604-7). HASEGP ancorada a lipídeo por outro lado vai se dividir na fase rica em detergente, mas vai se dividir na fase pobre de detergente ou aquosa seguindo tratamento com Fosfolipase C.
[00111] Deste modo, referência, por exemplo, à "sHASEGP" compreende todas as glicoproteínas codificadas pela família de gene de sHASEGP, incluindo mas não limitado a: sHASEGP humana, sHASEGP de camundongo, ou uma molécula equivalente obtida de qualquer outra fonte ou que tenha sido preparado sinteticamente ou que exiba a mesma atividade. Seqüências de moléculas de ácido nucléico de codificação e as seqüências de aminoácido codificado de sHASEGP exemplares e/ou seus domínios são mostradas, por exemplo, na SEQ ID NO:4. O termo também compreende sHASEGP com substituições de aminoácido que não alteram a atividade substancialmente de cada membro e também compreende suas variantes unidas. Substituições adequadas, incluindo, embora não necessariamente, substituições conservadoras de aminoácidos, são conhecidas daqueles versados na técnica e podem ser feitas sem eliminar a atividade biológica, tal como a atividade catalítica, da molécula resultante.
[00112] Conforme aqui usado, uma sHASEGP, sempre que referida aqui, inclui pelo menos um ou todos de uma combinação de: um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:6 ou por uma seqüência de nucleotídeos que inclui nucleotídeos que codificam os aminoácidos 1-509 da SEQ ID NO:1; um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de estringência baixa, moderada ou alta para a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:6; um polipeptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1-509 da SEQ ID NO:1; um polipeptídeo que inclui uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:1 ou como aminoácidos 1-448 da SEQ ID NO:4.
[00113] Em particular, o polipeptídeo de sHASEGP, com os domínios hialuronidase conforme indicado na SEQ ID NO.4, é provido. O polipeptídeo é um polipeptídeo de cadeia simples ou duas. Suas porções menores que retêm atividade de Hialuronidase são também providas. Os domínios Hialuronidase de sHASEGPs variam em tamanho e constituição, incluindo inserções e deleções em alças de superfície. Deste modo, para os presente propósitos, o domínio catalítico é uma porção de uma sHASEGP, conforme aqui definido, e é homólogo a um domínio de outras seqüências do tipo hialuronidase, tal como HYAL1, HYAL2, HYAL3, que foram anteriormente identificadas; não foi reconhecido, no entanto, que uma forma de cadeia simples isolada do domínio de Hialuronidase humana pudesse funcionar em ensaios in vitro. Os resíduos de Aspartato e Glutamato necessários para atividade são apresentados em motivos conservados.
[00114] Confo rme aqui usado, um "domínio hialuronidase neutro de uma sHASEGP solúvel" refere-se a um domínio beta 1,4 endoglicosaminidase de uma sHASEGP que exibe atividade hialuronidase em pH neutro, é solúvel sob condições conforme descrito e compartilha homologia e características estruturais com os domínios da família glicosil-hidrolase de hialuronidase mas contém seqüências adicionais no terminal carbóxi que são requeridas para atividade neutra. Deste modo, é pelo menos a porção mínima do domínio que exibe atividade de Hialuronidase conforme avaliado através de ensaios in vitro padrão e permanece solúvel. São aqui compreendidos tais domínios Hialuronidase e suas porções cataliticamente ativas. São também providas formas truncadas da domínio Hialuronidase que incluem o seu menor fragmento que age cataliticamente como uma forma de cadeia simples. Conforme aqui usado e na técnica, neutra ou neutra-ativa refere-se a uma proteína exibindo atividade em pH neutro (por exemplo, exibindo atividade em cerca de pH 7) e que é então ativa em uma faixa de pH característica de muitos tecidos fisiológicos. Como será também compreendido por aqueles versados na técnica, uma proteína geralmente exibe uma faixa de atividade em torno de seu pH ótimo. O pH ótimo de uma proteína ativa neutra estará tipicamente dentro de uma a várias unidades de pH acima ou abaixo de pH 7, mas sua faixa de atividade pode se estender em muitas unidades de pH.
[00115] Um domínio Hialuronidase de uma sHASEGP, sempre que aqui referido, inclui pelo menos uma ou todas de ou qualquer combinação de ou uma porção cataliticamente ativa de: um polipeptídeo de glicoproteína N-ligado que inclui a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:1; um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de estringência baixa, moderada ou alta para a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:6; um polipeptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:1; um polipeptídeo que inclui uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:1 e/ou um domínio Hialuronidase de um polipeptídeo codificado por uma variante unida da sHASEGP.
[00116] Deste modo, para os presentes propósitos, o domínio Hialuronidase é uma porção de uma sHASEGP, conforme aqui definido, e é homólogo a um domínio de outras sHASEGPs. Como com a classe maior de enzimas da família hialuronidase, os domínios catalíticos de sHASEGP compartilham uma alto grau de identidade de seqüência de aminoácido. Os resíduos Asp e Glu necessários para atividade estão presentes em motivos conservados.
[00117] Por forma ativa se quer dizer uma forma ativa in vivo e/ou in vitro. Conforme aqui descrito, o domínio Hialuronidase também pode existir como uma glicoproteína secretada solúvel. É mostrado aqui que, pelo menos in vitro, as formas de cadeia simples das sHASEGP e os seus domínios catalíticos ou porções enzimaticamente ativas (tipicamente truncamentos C-terminais) exibem atividade de Hialuronidase. Então são aqui providas formas isoladas dos domínios Hialuronidase de sHASEGPs e seu uso em ensaios de avaliação de fármaco in vivo para identificação de agentes que modulam a sua atividade.
[00118] Conforme aqui usado, o domínio cataliticamente ativo de uma sHASEGP refere-se ao domínio endoglicosaminidase neutro ativo conforme definido através da atividade in vitro com relação a um substrato de glicosaminoglicano.
[00119] SHASEGPs de interesse incluem aquelas que são ativas contra sulfatos de condroitina e proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG's) in vivo e in vitro; e aquelas que são ativas contra hialuronan. Conforme aqui usado, uma sHASEGP humana é uma codificada por ácido nucléico, tal como DNA, presente no genoma de um ser humano, incluindo todas as variantes alélicas e variações conservadoras contanto que elas não sejam variantes encontradas em outros mamíferos.
[00120] Conforme aqui usado, ácido nucléico codificando um domínio Hialuronidase ou porção cataliticamente ativa de uma sHASEGP" deve ser considerado como se referindo a um ácido nucléico codificando apenas o domínio Hialuronidase de cadeia simples mencionado ou sua porção ativa, e não as outras porções contíguas da sHASEGP como uma seqüência contínua.
[00121] Confo rme aqui usado "doença" ou "distúrbio" refere-se a uma condição patológica em um organismo resultante de, por exemplo, infecção ou defeito genético, e caracterizado por sintomas indentificáveis.
[00122] Conforme aqui usado, uma variante unida refere-se a uma variante produzida através de processamento diferencial de um transcrito primário de ácido nucléico genômico, tal como DNA, que resulta em mais de um tipo de mRNA. Variantes unidas de tais sHASEGPs são providas aqui.
[00123] Conforme aqui usado, o domínio Hialuronidase de uma proteína sHASEGP refere-se ao domínio Hialuronidase de uma sHASEGP que exibe atividade de endoglicosaminidase neutra. Então ele é pelo menos a porção mínima da proteína que exibe atividade de endoglicosaminidase conforme avaliado através de ensaios padrão in vitro. Domínios hialuronidase humana exemplares incluem pelo menos uma porção suficiente de seqüências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:4 exibir atividade de endoglicosaminidase.
[00124] Também compreendidas são moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo que tem atividade de endoglicosaminidase em um ensaio de Hialuronidase in vitro e que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com o comprimento completo de um domínio Hialuronidase de um polipeptídeo de sHASEGP, ou que hibridiza ao longo de seu comprimento completo ou ao longo de pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% do comprimento completo para um ácido nucléico que codifica um domínio Hialuronidase, particularmente sob condições de estringência moderada, geralmente alta.
[00125] Para os domínios Hialuronidase de PH20, por exemplo, resíduos dentro da região N-terminal podem ser críticos ainda que não suficientes para atividade. Através da aplicação de técnicas tal como mostrado aqui uma pessoa pode gerar domínios Hialuronidase da sHASEGP que são cataliticamente ativos. A título de ilustração, embora o domínio Hialuronidase de PH20 humana geralmente requeira os seus aminoácidos N-terminais para atividade; a porção C- terminal pode ser truncada até o último resíduo cisteína, ainda que necessite aminoácidos adicionais para ser otimamente ativa. A quantidade que pode ser removida pode ser determinada empiricamente através de teste do polipeptídeo quanto à atividade de Hialuronidase em um ensaio in vitro que avalia clivagem catalítica.
[00126] Então porções menores dos domínios Hialuronidase, particularmente os domínios de cadeia simples, que retêm atividade de Hialuronidase são compreendidas. Tais versões menores geralmente são versões truncadas C-terminais dos domínios Hialuronidase. Os domínios Hialuronidase variam em tamanho e constituição, incluindo inserções e deleções nas alças de superfície. Tais domínios exibem estrutura conservada, incluindo pelo menos uma característica estrutural, tal como o doador de próton, e/ou outras características de domínios Hialuronidase de endoglicosaminidases. Então, para os presentes propósitos, o domínio Hialuronidase é uma porção de cadeia simples de uma sHASEGP, conforme aqui definido, mas é homólogo em características estruturais e de retenção de seqüência de similaridade ou homologia ao domínio Hialuronidase de outras seqüências do tipo hialuronidase. A glicoproteína exibe atividade de Hialuronidase como uma cadeia simples.
[00127] Confo rme aqui usado, por homólogo significa cerca de mais do que 25% de identidade de seqüência de ácido nucléico, tal como 25%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%. Se necessário, a homologia percentual será especificada. Os termos "homologia" e "identidade" são freqüentemente usados intercomutavelmente. Em geral, seqüências são alinhadas de modo que a combinação de ordem maior é obtida (vide, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. Ed. Oxford University Press, Nova York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. e outros, Academic Press, Nova York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte /, Griffin, A.M. e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Iniciador, Gribskov, M. e Devereux, J. Eds., M. Stockton Press, Nova York, 1991; Carillo e outros (1988), Slam, J., Applied Math 48]:1037).
[00128] Através de identidade de seqüência, os números de aminoácidos conservados são determinados através de programas de algoritmos de alinhamento padrão, e são usados com "padrão" estabelecidas por cada fornecedor. Moléculas de ácido nucléico substancialmente homólogas hibridizariam tipicamente em estringência moderada ou em estringência alta em todo o comprimento do ácido nucléico ou ao longo de pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% da molécula de ácido nucléico de comprimento completo de interesse. São também compreendidas moléculas que contêm códons degenerados no lugar de códons na molécula de ácido nucléico de hibridização.
[00129] Se quaisquer duas moléculas de ácido nucléico têm seqüências de nucleotídeo que são pelo menos, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticas" pode ser determinado usando algoritmos de computador conhecidos tal como o programa "FASTA", usando, por exemplo, os parâmetros padrão como em Pearson e outros (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:2444 (outros programas incluem o pacote de programa GCG (Devereux, J. e outros, Nucleic Acids Research, 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. e outros, J. MOLEC. BIOL. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin, J. Bishop, [Ed.], Academic Press, São Diego, 1994, e [CARILLO e outros] (1988) SIAM, J., Applied Math 48:1073). Por exemplo, a função BLAST do National Center for Biotechnology Information database pode ser usada para determinar identidade. Outros programas comercialmente ou publicamente disponíveis incluem, DNASTAR "MEGALIGN" PROGRAM (Madison, WI) e o programa University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap" (Madison WI)). Homologia ou identidade percentual de proteínas e/ou moléculas de ácido nucléico pode ser determinada, por exemplo, através de comparação de informação de seqüência usando um programa de computador GAP, por exemplo, Needleman e outros (1970)), J. Mol. Biol., 48:443, conforme revisado por Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482). Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são similares, dividido pelo número total de símbolos na mais curta das duas seqüências. Parâmetros padrão do programa GAP podem inclui: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) e a matriz de comparação pesada de Gribskov e outros (1986) Nucle. Acids Res. 14:6745, conforme descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence and Structure, National Biomedial Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalty de 3,0 para cada gap e uma penalty adicional de 0,010 para cada símbolo em cada gap; e (3) nenhuma penalty para gaps de extremidade. Deste modo, conforme aqui usado, o termo "identidade" representa uma comparação entre um polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste e um de referência.
[00130] Conforme aqui usado, o termo "pelo menos 90% idêntico a" refere-se a identidades percentuais de a partir de 90 a 99,99 com relação aos polipeptídeos de referência. Identidade em um nível de 90% ou mais é indicativo do fato de que, supondo para propósitos de exemplificação que um polinucleotídeo de teste e um referência de comprimento de 100 aminoácidos são comparados. Não mais do que 10% (isto é, 10 de 100) aminoácidos no polipeptídeo de teste diferem daqueles dos polipeptídeos de referência. Comparações similares podem ser feitas entre um polinucleotídeo de teste e um de referência. Tais diferenças podem ser representadas como mutações por ponto aleatoriamente distribuídas em todo o comprimento de uma seqüência de aminoácido ou elas podem ser agrupadas em um ou mais locais de comprimento variável até o máximo permissível, por exemplo, 10/100 aminoácidos de diferença (aproximadamente 90% de identidade). Diferenças são definidas como substituições de ácido nucléico ou aminoácido, ou deleções. No nível de homologias ou identidades acima de 85-90%, o resultado deve ser independente do programa e ajustes de parâmetro de gap; tais níveis altos de identidade podem ser avaliados prontamente, freqüentemente sem recorrer a software.
[00131] Conforme aqui usado, iniciador refere-se a um oligonucleotídeo contendo dois ou mais desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, tipicamente mais de três, a partir dos quais síntese de um produto de extensão de iniciador pode ser iniciada. Condições experimentais que conduzem à síntese incluem a presença de nucleosídeo trifosfatos e um agente para polimerização e extensão, tal como polimerase de DNA, e um tampão, temperatura e pH adequados.
[00132] Conforme aqui usado, animais incluem qualquer animal, tal como, mas não limitado a, cabras, vacas, cervo, ovelha, roedores, porcos e seres humanos. Animais não-humanos excluem o ser humano como o animal compreendido. As sHASEGPs providas aqui são de qualquer fonte, animal, planta, procariótica ou fúngica. SHASEGPs preferidas são de origem animal, incluindo de origem de mamífero, e com mais preferência de origem humana no caso de seu uso em seres humanos.
[00133] Conforme aqui usado, terapia genética envolve a transferência de ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, para certas células, células alvo, de um mamífero, particularmente um ser humano, com um distúrbio ou condição para o qual tal terapia é prevista. O ácido nucléico, tal como DNA, é introduzido nas células alvo selecionadas de uma maneira tal que o ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, é expresso e um produto terapêutico codificado então é produzido.
[00134] Alternativamente, o ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, pode de alguma maneira mediar a expressão de DNA que codifica o produto terapêutico, ou ele pode codificar um produto, tal como um peptídeo ou RNA que de alguma maneira faz a mediação, direta ou indiretamente, da expressão de um produto terapêutico. Terapia genética pode ser também usada para aplicar ácido nucléico codificando um produto de gene que substitui um gene com defeito ou suplementa um produto de gene produzido pelo animal ou pela célula onde ele é introduzido. O ácido nucléico introduzido pode codificar um composto terapêutico, tal como um inibidor de fator de crescimento dele, ou um fator de necrose de tumor ou seu inibidor, tal como um receptor para ele, que não é normalmente produzido no hospedeiro mamífero ou que não é produzido em quantidades terapeuticamente ativas ou em um tempo terapeuticamente útil. O ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, codificando o produto terapêutico pode ser modificado antes da introdução nas células do hospedeiro afligido a fim de aumentar ou de outro modo alterar o produto ou expressão dele. Terapia genética pode também envolver aplicação de um inibidor ou repressor ou outro modulador de expressão de gene.
[00135] Conforme aqui usado, ácido nucléico heterólogo é um ácido nucléico que codifica proteínas (ou, se DNA, codifica RNA que codifica proteínas) que não são normalmente produzidas in vivo pela célula onde ele é expresso ou que faz a mediação ou codifica mediadores que alteram a expressão de ácido nucléico endógeno, tal como DNA, através da realização de transcrição, tradução ou outros processos bioquímicos reguláveis. Ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, pode também ser referido a ácido nucléico estranho, tal como DNA. Qualquer ácido nucléico, tal como DNA, que um versado na técnica reconheceria ou consideraria como heterólogo ou estranho para a célula onde ele é expresso é aqui compreendido por ácido nucléico heterólogo; ácido nucléico heterólogo inclui ácido nucléico exogenamente adicionado que é também expresso endogenamente. Exemplos de ácido nucléico heterólogo incluem, mas não estão limitados a, ácido nucléico que codifica proteínas marcadoras que podem ser traçadas, tal como uma proteína que confere resistência a fármaco, ácido nucléico que codifica substâncias terapeuticamente eficazes, tal como agentes anticâncer, enzimas e hormônio, e ácidos nucléicos (tal como DNA e RNA), que indireta ou diretamente codificam outros tipos de proteínas, tal como anticorpo. Anticorpos que são codificados por ácido nucléico heterólogo podem ser secretados ou expressos na superfície da célula onde o ácido nucléico heterólogo foi introduzido.
[00136] Áci do nucléico heterólogo é geralmente não-endógeno para a célula onde ele é introduzido, mas foi obtido de uma outra célula ou preparado sinteticamente.
[00137] Em geral, embora não necessariamente, tal ácido nucléico codifica RNA e/ou proteínas que não são normalmente produzidos pela célula onde ele é expresso.
[00138] Conforme aqui usado, um produto terapeuticamente eficaz é um produto que é codificado por ácido nucléico heterólogo, tipicamente DNA que, quando da introdução do ácido nucléico em um hospedeiro, um produto é expresso que melhora ou elimina os sintomas, manifestações de uma doença herdada ou adquirida ou que cura a doença.
[00139] Conforme aqui usado, relato de que uma glicoproteína consiste essencialmente no domínio Hialuronidase significa que a única porção sHASEGP do polipeptídeo é um domínio Hialuronidase ou uma porção cataliticamente ativa dele. O polipeptídeo pode opcionalmente, e geralmente vai, incluir seqüências derivadas de não-sHASEGP adicionais de aminoácidos.
[00140] Conforme aqui usado, domínio refere-se a uma porção de uma molécula, por exemplo, glicoproteínas ou os ácidos nucléicos de codificação, que é estrutural e/ou funcionalmente distinta de outras porções da molécula.
[00141] Conforme aqui usado, Hialuronidase refere-se a uma enzima de catálise de hidrólise de glicosaminoglicanos incluindo hialuronans.
[00142] Para clareza referência à Hialuronidase refere-se a todas as formas, e formas particulares serão especificamente designadas. Para os presentes propósitos, os domínios Hialuronidase incluem as formas ligadas à membrana e solúveis de uma proteína sHASEGP.
[00143] Conforme aqui usado, ácidos nucléicos incluem DNA, RNA e seus análogos, incluindo ácidos nucléicos de proteína (PNA) e suas misturas. Ácidos nucléicos podem ser de filamento único ou duplo. Quando se referindo a sondas ou iniciadores, opcionalmente marcados com um marcador detectável, tal como um marcador fluorescente ou radiomarcador, moléculas de filamento simples são geralmente compreendidas. Tais moléculas são tipicamente de um comprimento tal que seu alvo é estatisticamente único ou de número de cópia baixo (tipicamente menos do que 5, geralmente menos do que 3) para análise ou inicialização de uma biblioteca. Como é sabido na técnica, geralmente uma sonda ou iniciador contém pelo menos 14, 16, 20 ou 30 resíduos de seqüência contígua ou quase-contígua complementares a ou idênticos a um gene de interesse. Sondas e iniciadores podem ser de 10, 20, 30, 50, 100 ou mais ácidos nucléicos de comprimento.
[00144] Conforme aqui usado, ácido nucléico codificando um fragmento ou porção de uma sHASEGP refere-se a um ácido nucléico codificando apelas o fragmento ou porção mencionado de sHASEGP, e não as outras porções contíguas da sHASEGP.
[00145] Conforme aqui usado, ligação operativa de nucléico heterólogo a seqüências reguladoras e efetoras de nucleotídeos, tal como promotores, aumentadores, sítios de parada transcripcional e traducional, e outras seqüências de sinal refere-se à relação entre tal ácido nucléico, tal como DNA, e tais seqüências de nucleotídeos. Por exemplo, ligação operativa de DNA heterólogo a um promotor refere-se à relação funcional (e tipicamente física) entre o DNA e o promotor de modo que a transcrição do DNA é iniciada a partir do promotor através de uma polimerase de RNA que especificamente reconhece, se liga a e transcreve o DNA em estrutura de leitura. Deste modo, operativamente ligado ou operacionalmente associado refere-se à relação funcional de ácido nucléico, tal como DNA, com seqüências reguladoras e efetoras de nucleotídeos, tal como promotores, aumentadores, sítios de parada transcripcional e traducional, e outras seqüências de sinal. A fim de otimizar a expressão e/ou transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar porções não-traduzidas 5' dos clones para eliminar códons de partida, isto é, iniciação traducional alternativa inapropriada potencial, extra, ou outras seqüências que possam interferir com ou reduzir a expressão, ou no nível de transcrição ou tradução. Alternativamente, sítios de ligação de ribossomo de consenso (vide, por exemplo, Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991) podem ser inseridos imediatamente 5' do códon de partida e podem aumentar a expressão. O desejo de (ou a necessidade de) tal modificação pode ser empiricamente determinado.
[00146] Conforme aqui usado, uma seqüência complementar a pelo menos uma porção de um RNA, com referência a oligonucleotídeos de anti-sentido, significa uma seqüência tendo complementaridade suficiente para ser capaz de hibridizar com o RNA, geralmente sob condições de estringência moderada ou alta, formando um dúplex estável; no caso de ácidos nucléicos de anti-sentido de sHASEGP de filamento duplo, um filamento simples do DNA dúplex (ou dsRNA) pode então ser testado, ou formação de triplex pode ser ensaiada. A habilidade em hibridizar depende do grau de complementaridade e do comprimento do ácido nucléico de anti- sentido. Geralmente, quanto maior o ácido nucléico de hibridização, mais faltas de combinação de base com um RNA codificando sHASEGP ele pode conter e ainda formar um dúplex estável (ou triplex, conforme for o caso). Um versado na técnica pode determinar um grau tolerável de falta de combinação através do uso de procedimentos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridizado.
[00147] P ara os presentes propósitos, substituições de aminoácido podem ser feitas em qualquer um de sHASEGP e seus domínios Hialuronidase contanto que a proteína resultante exiba atividade de Hialuronidase. Substituições de aminoácido compreendidas incluem substituições conservadoras, tal como aquelas mostradas na Tabela 1, e outras modificações que não eliminam atividade proteolítica. Conforme aqui descrito, substituições que alteram propriedades das proteínas, tal como remoção de sítios de clivagem e outros sítios, são também compreendidas; tais substituições são geralmente não-conservadoras, mas podem ser prontamente realizadas por aqueles versados na técnica.
[00148] Substituições conservadoras adequadas de aminoácidos são conhecidas daqueles versados na técnica e podem ser feitas geralmente sem eliminar (e de preferência sem substancialmente alterar) a atividade biológica, por exemplo, atividade enzimática, da molécula resultante. Aqueles versados na técnica reconhecem que, em geral, substituições de aminoácido simples em regiões não- essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (por exemplo, vide, Watson e outros, Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p 224). Também incluído nesta definição está o fragmento cataliticamente ativo de uma sHASEGP, particularmente uma porção Hialuronidase de cadeia simples. Substituições de aminoácido conservadoras são feitas, por exemplo, de acordo com aquelas mostradas na TABELA 1 como segue:
[00149] TABELA 1 Substituição Conservadora de Resíduo Original Ala (A) Gly; Ser, Abu Arg ® Lys, Orn Asn (N) Gln; His Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) ASP Gly (G); Ala; Pro His (H) Asn; Gln Ile (I) Leu; Val; Met; Nle; Nva Leu (L); Val; Met; Nle; Nva Lys (K) Arg; Gln; Glu Met (M) Leu; Tyr; Ile; Nle Val Orn Lys; Arg he (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) ILE; Leu; Met; Nle; Nva. Outras substituições são também permissíveis e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com substituições conservadoras conhecidas.
[00150] Conforme aqui usado, Abu é ácido 2- aminobutírico; Nle é norleucina; Nva é norvalina; Orn é ornitinina. Conforme aqui usado, os aminoácidos, que acontecem nas várias seqüências de aminoácido que aparecem aqui, são identificados de acordo com suas abreviações de três letras ou uma letra, bem-conhecidas. Os nucleotídeos, que acontecem nos vários fragmentos de DNA, são designados com as designações de uma letra padrão usadas rotineiramente na técnica.
[00151] Conforme aqui usado, uma sonda ou iniciador baseado em uma seqüência de nucleotídeo descrita aqui inclui pelo menos 10, 14, tipicamente pelo menos 16, seqüências contíguas de nucleotídeo da SEQ ID NO:6, e com mais preferência ainda pelo menos 20, 30, 50 ou 100 seqüências contíguas de nucleotídeos da SEQ ID NO:6. O comprimento da sonda ou iniciador para hibridização única é uma função da complexidade do genoma de interesse.
[00152] Conforme aqui usado, melhora dos sintomas de um distúrbio particular através da administração de uma composição farmacêutica particular refere-se a uma diminuição, seja permanente ou temporária, duradoura ou transiente que pode ser atribuída à ou associada com administração da composição.
[00153] Conforme aqui usado, polinucleotídeos de anti-sentido refere-se a seqüências sintéticas de bases de nucleotídeo complementares a mRNA ou o filamento de sentido de DNA de filamento duplo. Mistura de polinucleotídeos de sentido e anti-sentido sob condições apropriadas leva à ligação das duas moléculas, ou hibridização. Quando esses polinucleotídeos se ligam a mRNA (hibridizam com), inibição de síntese de proteína (tradução) acontece. Quando esses polinucleotídeos se ligam a DNA de filamento duplo, inibição da síntese de RNA (transcrição) acontece.
[00154] A inibição resultante de tradução e/ou transcrição leva a uma inibição da síntese da proteína codificada pelo filamento de sentido. Molécula de ácido nucléico de anti-sentido tipicamente contém um número suficiente de nucleotídeos para Especificamente se ligar a um ácido nucléico alvo, geralmente pelo menos 5 nucleotídeos contíguos, freqüentemente pelo menos 14 ou 16 ou 30 nucleotídeos contíguos ou nucleotídeos modificados complementares à porção de codificação de uma molécula de ácido nucléico que codifica um gene de interesse, por exemplo, ácido nucléico codificando um domínio Hialuronidase de cadeia simples de uma sHASEGP.
[00155] Conforme aqui usado, uma disposição refere-se a uma coleção de elementos, tal como anticorpos, contendo três ou mais membros. Uma disposição endereçável é uma onde os membros da disposição são identificáveis, tipicamente através da posição em um apoio de fase sólida. Deste modo, em geral, os membros da disposição são imobilizados em locais identificáveis diferentes sobre a superfície de uma fase sólida.
[00156] Conforme aqui usado, anticorpo refere-se a uma imunoglobulina, seja natural ou parcialmente ou completamente produzida, incluindo qualquer seu derivado que retenha a habilidade de ligação específica do anticorpo. Então anticorpo inclui qualquer proteína tendo um domínio de ligação que é homólogo a ou substancialmente homólogo a um domínio de ligação de imunoglobulina. Anticorpos incluem membros de quaisquer reivindicações de imunoglobulina, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
[00157] Conforme aqui usado, fragmento de anticorpo refere-se a qualquer derivado de um anticorpo que é menos do que comprimento completo, retendo pelo menos uma porção da habilidade de ligação específica do anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab', F(AB)2, Fvs de cadeia simples (scFv), FV, diacorpo dsFv e fragmentos de Fd. O framento pode incluir cadeias múltiplas ligadas juntas, tal como através de pontes dissulfeto. Um fragmento de anticorpo geralmente contém pelo menos cerca de 50 aminoácidos e tipicamente pelo menos 200 aminoácidos.
[00158] Conforme aqui usado, o fragmento de anticorpo Fv é composto de um domínio pesado variável (VH) e um domínio leve variável ligado por interações não- covalentes.
[00159] Conforme aqui usado, um dsFv refere-se a um Fv com uma ligação dissulfeto intermolecular engenheirada.
[00160] Conforme aqui usado, um fragmento F(AB)2 é um fragmento de anticorpo que resulta da digestão de uma imunoglobulina com pepsina em pH 4,0-4,5; ele pode ser recombinantemente expresso para produzir o fragmento equivalente.
[00161] Conforme aqui usado, fragmentos Fab são fragmentos de anticorpo que resultam da digestão de uma imunoglobulina com papaína; eles podem ser recombinantemente expressos para produzirem o fragmento equivalente.
[00162] Conforme aqui usado, scFVs referem-se a fragmentos de anticorpo que contêm uma cadeia leve variável V e cadeia pesada variável (VH) covalentemente conectadas por um ligante de polipeptídeo em qualquer ordem. O ligante é de um comprimento tal que os dois domínios variáveis estão em ponte sem interferência substancial. Ligantes incluídos são resíduos (Gly-Ser)n com alguns resíduos Glu ou Lys dispersos por toda parte para aumentar a solubilidade.
[00163] Conforme aqui usado, anticorpos humanizados referem-se a anticorpos que são modificados para incluir seqüências de aminoácido humanas de modo que a administração a um ser humano não provoque uma resposta imune. Métodos para preparação de tais anticorpos são conhecidos. Por exemplo, para produzir tais anticorpos, o hibridoma ou outra célula procariótica ou eucariótica, tal como uma uma célula de E. coli ou CHO, que expresse o anticorpo monoclonal é alterada através de técnicas de DNA recombinantes para expressar um anticorpo onde a composição de aminoácido da região não-variável é baseada em anticorpos humanos. Programas de computador foram feitos para identificar tais regiões.
[00164] Conforme aqui usado, diacorpos são scFV diméricos; diacorpos tipicamente têm ligantes de peptídeo mais curtos do que scFV, e eles geralmente dimerizam.
[00165] Conforme aqui usado, produção através de meios recombinantes usando métodos de DNA recombinantes significa o uso dos métodos bem-conhecidos de biologia molecular para expressão de proteínas codificadas por DNA clonado.
[00166] Conforme aqui usado, o termo avaliação pretende incluir determinação quantitativa e qualitativa no sentido de obtenção de um valor absoluto para a atividade de uma sHASEGP, ou um seu domínio, presente na amostra, e também de obtenção de um índice, razão, porcentagem, visual ou outro valor indicativo do nível de atividade. Avaliação pode ser direta ou indireta e a espécie química realmente detectada não precisa ser com certeza o próprio produto de proteólise mas pode ser, por exemplo, um seu derivado ou alguma substância adicional.
[00167] Conforme aqui usado, atividade biológica refere-se às atividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam quando da administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. Atividade biológica, então, compreende efeitos terapêuticos e atividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. Atividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro feitos para testar ou usar tais atividades. Deste modo, para os presentes propósitos, a atividade biológica de uma luciferase é sua atividade de oxigenase, com o que, quando da oxidação de um substrato, luz é produzida.
[00168] Conforme aqui usado, atividade funcional refere-se a um polipeptídeo ou sua porção que mostra uma ou mais atividades associadas com uma proteína de comprimento completo.
[00169] Atividades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, atividade biológica, atividade catalítica ou enzimática, antigenicidade (habilidade em se ligar a ou competir com um polipeptídeo para ligação a um anticorpo anti-polipeptídeo), imunogenicidade, habilidade em formar multímeros, a habilidade em Especificamente se ligar a um receptor ou ligante para o polipeptídeo.
[00170] Conforme aqui usado, um conjugado refere-se aos compostos providos aqui que incluem uma ou mais sHASEGPs, incluindo uma sHASEGP, particularmente seus domínios Hialuronidase de cadeia simples, e um ou mais agentes de direcionamento. Esses conjugados incluem aqueles produzidos através de meios recombinantes como proteínas de fusão, aqueles produzidos através de meios químicos, tal como através de acoplamento químico, através de, por exemplo, acoplamento a grupos sulfidrila, e aqueles produzidos através de qualquer outro método com o que pelo menos uma sHASEGP, ou um seu domínio, é ligado, direta ou indiretamente via através de ligante(s) a um agente de direcionamento.
[00171] Conforme aqui usado, um agente de direcionamento é qualquer porção, tal como uma proteína ou porção eficaz dela, que provê ligação específica do conjugado a um receptor de superfície de célula, que, pode internalizar o conjugado ou porção sHASEGP dele. Um agente de direcionamento pode ser também um que promova ou facilite, por exemplo, isolamento ou purificação de afinidade do conjugado; ligação do conjugado a uma superfície; ou detecção do conjugado ou complexos contendo o conjugado.
[00172] Conforme aqui usado, um conjugado de anticorpo refere-se a um conjugado onde o agente de direcionamento é um anticorpo.
[00173] Conforme aqui usado, derivado ou análogo de uma molécula refere-se a uma porção derivada de ou uma versão modificada da molécula.
[00174] Conforme aqui usado, uma quantidade eficaz de um composto para tratamento de uma doença particular é uma quantidade que é suficiente para melhorar, ou de alguma maneira, reduzir, os sintomas associados com a doença. Tal quantidade pode ser administrada como uma dosagem simples ou pode ser administrada de acordo com um regime, com o que ela for eficaz. A quantidade pode curar a doença mas, tipicamente, é administrada a fim de melhorar os sintomas da doença. Administração repetida pode ser requerida para obter a melhora desejada de sintomas.
[00175] Conforme usado aqui equivalente, quando se referindo a duas seqüências de ácidos nucléicos, significa que as duas seqüências em questão codificam a mesma seqüência de aminoácido ou proteínas equivalentes. Quando equivalente é usado ao se referir a duas proteínas ou peptídeos, significa que as duas proteínas ou peptídeos têm substancialmente a mesma seqüência de aminoácido com apenas substituições de aminoácido (tal como, mas não limitado a, mudanças conservadoras tal como aquelas mostradas na Tabela 1 acima) que não alteram substancialmente a atividade ou função da proteína ou peptídeo. Quando equivalente refere- se a uma propriedade, a propriedade não precisa estar presente até o mesmo ponto (por exemplo, dois peptídeos podem exibir taxas diferentes do mesmo tipo de atividade enzimática), mas as atividades são geralmente substancialmente as mesmas. Complementar, quando se referindo a duas seqüências de nucleotídeo, significa que as duas seqüências de nucleotídeo são capazes de hibridizar, tipicamente com menos do que 25%, 15%, 5% ou 0% de falta de combinação entre nucleotídeos opostos. Se necessário a porcentagem de complementaridade será especificada. Tipicamente as duas moléculas são selecionadas de modo que elas vão hibridizar sob condições de alta estringência.
[00176] Conforme aqui usado, um agente que modula a atividade de uma proteína ou expressão de um gene ou ácido nucléico ou diminui ou aumenta ou de outro modo altera a atividade da proteína ou, de alguma maneira, supraou sub-regula ou de outro modo altera a expressão do ácido nucléico em uma célula.
[00177] Conforme aqui usado, inibidor da atividade de uma sHASEGP compreende qualquer substância que proíbe ou diminui a produção, modificação(ões) pós- traducionais, maturação ou localização de membrana da sHASEGP ou qualquer substância que interfira com ou diminua a sua eficácia proteolítica, particularmente de uma forma de cadeia simples em um ensaio de avaliação in vitro.
[00178] Conforme aqui usado, um método para tratamento ou prevenção de doença neoplástica significa que qualquer um dos sintomas, tal como o tumor, sua metástase, a vascularização dos tumores ou outros parâmetros através do qual a doença é caracterizada são reduzidos, melhorados, prevenidos, postos em estado de remissão ou mantidos em um estado de remissão. Também significa que as características de doença neoplástica e metástase podem ser eliminadas, reduzidas ou prevenidas através do tratamento. Exemplos não- limitantes das características incluem degradação incontrolada da membrana de base e matriz extracelular proximal, migração, divisão e organização das células endoteliais em capilares de funcionamento novos e a persistência de tais capilares de funcionamento.
[00179] Conforme aqui usado, sais, ésteres ou outros derivados do conjugado farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer sais, ésteres ou derivados que podem ser prontamente preparados por aqueles versados na presente técnica usando métodos conhecidos para tal derivatização e que produzem compostos que podem ser administrados a animais ou seres humanos sem efeitos tóxicos substanciais e que são ou ativos farmacêuticos ou são pró-fármacos.
[00180] Conforme aqui usado, um pró-fármaco é um composto que, quando da administração in vivo, é metabolizado ou de outro modo convertido na forma biológica, farmacêutica ou terapeuticamente ativa do composto. Para produzir uma pró-fármaco, o composto ativo farmacêutico é modificado de modo que o composto ativo é regenerado através de processos metabólicos. O pró-fármaco pode ser feito para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de um fármaco, para mascarar efeitos colaterais ou toxidez, para melhorar o sabor de um fármaco ou para alterar outras características ou propriedades de uma fármaco. Em virtude de conhecimento de processos farmacodinâmicos e metabolismo de fármaco in vivo, aqueles versados na técnica, uma vez um composto farmaceuticamente ativo sendo conhecido, podem produzir pró-fármacos do composto (vide, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nova York, páginas 388-392).
[00181] Conforme aqui usado, um fármaco identificado através dos métodos de avaliação providos aqui refere-se a qualquer composto que é um candidato para uso como um agente terapêutico ou como um composto principal para a produção de um agente terapêutico. Tais compostos podem ser moléculas pequenas, incluindo moléculas orgânicas pequenas, peptídeos, miméticos de peptídeo, moléculas de anti-sentido ou dsRNA, tal como RNAi, anticorpos, fragmentos de anticorpos, anticorpos recombinantes e outros tais compostos que podem servir como candidatos a fármaco ou compostos principais.
[00182] Conforme aqui usado, um peptidomimético é um composto que imita a conformação e certas características estereoquímicas da forma biologicamente ativa de um peptídeo particular. Em geral, peptidomiméticos são feitos para imitar certas propriedades desejáveis de um composto, mas não as propriedades indesejadas, tal como flexibilidade, que leva a uma perda de uma conformação biologicamente ativa e quebra de ligação. Peptidomiméticos podem ser preparados a partir de compostos biologicamente ativos através da substituição de certos grupos ou ligações que contribuem para as propriedades indesejadas com bioisósteres. Bioisósteres são conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, o bioisóstere de metileno CH2S tem sido usado como uma substituição de amida em análogos de encefalina (vide, por exemplo, Spatola (1983) pp. 267-357 em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weistein, Ed. Volume 7, Marcel Dekker, Nova York). Morfina, que pode ser administrada oralmente, é um composto que é um peptidomimético do peptídeo endorfina. Para os presentes propósitos, peptídeos cíclicos são incluídos entre os peptidomiméticos.
[00183] Conforme aqui usado, uma região promotora ou elemento promotor refere-se a um segmento de DNA ou RNA que controla a transcrição do DNA ou RNA ao qual ele está operativamente ligado. A região promotora inclui seqüências específicas que são suficientes para iniciação de reconhecimento, ligação e transcrição de polimerase de RNA.
[00184] Est a porção da região de promotor é referida como o promotor. Ainda, a região promotora inclui seqüências que modulam esta atividade de iniciação de reconhecimento, ligação e transcrição de polimerase de RNA. Essas seqüências podem ser de ação cis ou podem ser responsivas a fatores de ação trans. Promotores, dependendo da natureza da regulação, podem ser constitutivos ou regulados. Promotores exemplares compreendidos para uso em procariontes incluem os promotores T7 e T3 de bacteriófago.
[00185] Conforme aqui usado, um receptor refere- se a uma molécula que tem uma afinidade para um dado ligante. Receptores podem ser moléculas de ocorrência natural ou sintéticas. Receptores podem também ser referidos na técnica com antiligantes. Conforme aqui usado, receptor e antiligantes são intercambiáveis. Receptores podem ser usados em seu estado inalterado ou como agregados com outras espécies. Receptores podem ser ligados, covalentemente ou não-covalentemente, ou em contato físico com, a um membro de ligação, ou direta ou indiretamente através de uma substância de ligação específica ou ligante. Exemplos de receptores incluem, mas não estão limitados a: anticorpos, receptores de membrana de célula, receptores de superfície e receptores de internalização, anticorpos monoclonais e anti-soro reativos com determinantes antigênicos específicos tal como em vírus, células ou outros materiais, fármacos, polinucleotídeos, ácidos nucléicos, peptídeos, fatores, lectinas, açúcares, polissacarídeos, células, membranas celulares e organelas.
[00186] Exemplos de receptores e aplicações usando tais receptores incluem mas não estão restritos a: a) enzimas: proteínas ou enzimas de transporte específicas essenciais para sobrevivência de microorganismos, que poderiam servir como alvo para seleção de antibiótico [ligante]; b) anticorpos: identificação de um sítio de ligação de ligante na molécula de anticorpo que combine com o epitopo de um antígeno de interesse pode ser investigada; determinação de uma seqüência que imita um epitopo antigênico pode levar ao desenvolvimento de vacinas cujo o imunógeno é baseado em uma ou mais de tais seqüências ou leva ao desenvolvimento de agentes de diagnóstico relacionados ou compostos úteis em tratamento terapêuticos tal como para doenças autoimunes; c) ácidos nucléicos: identificação de sítios de ligação de ligante, tal como proteína ou RNA; d) polipeptídeos catalíticos: polímeros, incluindo polipeptídeos, que são capazes de promover uma reação química envolvendo a conversão de um ou mais reagentes em um ou mais produtos; tais polipeptídeos geralmente incluem um sítio de ligação específico para pelo menos um reagente ou intermediário de reação e um ativo funcionalmente próximo ao sítio de ligação, onde a funcionalidade é capaz de quimicamente modificar o reagente ligado (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.215.899); e) receptores de hormônio: determinação dos ligantes que se ligam com alta afinidade a um receptor é útil no desenvolvimento de terapias de reposição de hormônio; por exemplo, identificação de ligantes que se ligam a tais receptores pode levar ao desenvolvimento de fármacos para controlar pressão sangüínea; e f) receptores de opiato: determinação de ligantes que se ligam aos receptores de opiato no cérebro é útil no desenvolvimento de substituições menos viciantes para morfina e fármacos relacionados.
[00187] Conforme aqui usado, amostra refere-se a qualquer coisa que possa conter um analito para o qual um ensaio de analito é desejado. A amostra pode ser uma amostra biológica, tal como um fluido biológico ou um tecido biológico. Exemplos de fluidos biológicos incluem urina, sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, fezes, esputo, fluido cerebral espinhal, lágrimas, muco, esperma, fluido aminiótico ou similar. Tecidos biológicos são agregados de células, geralmente de um tipo particular junto com sua substância intercelular que forma um dos materiais estruturais de um ser humano, animal, planta, bactéria, fungo ou estrutural viral, incluindo tecidos conectivo, epitelial, muscular e nervoso. Exemplos de tecidos biológicos também incluem órgãos, tumores, nós linfáticos, artérias e células individuais.
[00188] Conforme aqui usado: estringência de hibridização na determinação da falta de combinação de porcentagem é como segue: 1) alta estringência: 0,1 x SspE, 0,1% de SDS, 65o C; 2) estringência média: 0,2 x SspE, 0,1% de SDS, 50o C; 3) estringência baixa: 1,0 x SspE, 0,1% de SDS, 50o C. Aqueles versados na técnica sabem que a etapa de lavagem seleciona híbridos estáveis e também conhecem os ingredientes de SspE (vide, por exemplo, Sambrook, E.F., Fritsch, T., Maniatis, em: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 Vol. 3, p.B.13, vide, também, vários catálogos que descrevem soluções de laboratório geralmente usadas). SspE é um NaCl 0,18 tamponado em fosfato de pH 7,4. Ainda, aqueles versados na técnica reconhecem que a estabilidade de híbridos é determinada por TmT que é uma função da concentração de íon de sódio e temperatura (Tm = 81,5°C -16,6 + 0,41 (% de G+C)- 600/L)) de modo que os únicos parâmetros nas condições de lavagem críticas para estabilidade do híbrido são concentração de íon de sódio no SspE (ou SSC) e temperatura.
[00189] É compreendido que estringências equivalentes podem ser obtidas usando tampões, sais e temperaturas alternativos. A título de exemplo e não limitação, procedimentos usando condições de baixa estringência são como segue (vide também Shilo e Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 (1981)); filtros contendo DNA são pré-tratados por 6 horas a 40°C em uma solução contendo 35% de formamida, 5X SSC, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 5 mM, 0,1% de PVP, 0,1% de Ficoll, 1% de BSA e 500 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado (10x) SSC é cloreto de sódio a 1,5M, e citrato de sódio a 0,15M, ajustado para um pH de 7).
[00190] Hibridizações são realizadas na mesma solução com as modificações que seguem: 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,2% de BSA, 100 VG/M de DNA de esperma, 10% (p/vol) de sulfato de dextrano e sonda marcada com 32P de 520 X 106 é usada. Filtros são incubados na mistura de hibridização por 18-20 horas a 40°C e então lavados por 1,5 hora a 55°C em uma solução contendo 2X SSC, Tris-HCl a 25 mM (pH 7,4), EDTA a 5 mM e 0,1% de SDS. A solução de lavagem é substituída com solução fresca e incubada mais 1,5 hora a 60o C. Filtros são secos de forma absorvente e expostos para auto-radiografia. Se necessário, os filtros são lavados uma terceira vez a 65-68°C e novamente expostos à película. Outras condições de estringência baixa que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica, por exemplo, conforme empregado para hibridizações de espécies cruzadas).
[00191] A título de exemplo e não de limitação, procedimentos usando condições de estringência moderada incluem, por exemplo, mas não estão limitados a, procedimentos usando tais condições de estringência moderada são como segue: Filtros contendo DNA são pré-tratados por 6 horas a 55°C em uma solução contendo 6X SSC, 5X solução de Denhart, 0,5% de SDS e 100 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Hibridizações são realizadas na mesma solução e sonda marcada com 32P 5-20X é usada. Os filtros são incubados em mistura de hibridização por 18-20 horas a 55°C e então lavados duas vezes por 30 minutos a 60°C em uma solução contendo 1X SSC e 0,1% de SDS. Os filtros são de forma absorvente secos e expostos para auto-radiografia. Outras condições de estringência moderada que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica. Lavagem de filtros é feita a 37°C por 1 hora em uma solução contendo 2X SSC, 0,1% de SDS.
[00192] A título de exemplo e não a título de limitação, procedimentos usando condições de alta estringência são como segue: pré-hibridização de filtros contendo DNA é realizada por 8 horas da noite para o dia a 65°C em tampão composto de 6X SSC, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 1 mM, PVP a 0,02%, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,02% e 500 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridizados por 48 horas a 65°C em mistura de pré- hibridização contendo 100 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e sonda marcada com 32P 5-20 X 106. Lavagem dos filtros é feita a 37°C por 1 hora em uma solução contendo 2X SSC, PVP a 0,01%, Ficoll a 0,01% e BSA a 0,01%. Isto é seguido por uma lavagem em 0,1X SSC a 50°C por 45 minutos antes da auto-radiografia. Outras condições de alta estringência que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica.
[00193] O termo substancialmente idêntico ou substancialmente homólogo ou similar varia com o contexto conforme compreendido por aqueles versados na técnica relevante e geralmente significa pelo menos 60% ou 70%, de preferência significa pelo menos 80%, 85% ou com mais preferência pelo menos 90% e com mais preferência pelo menos 95% de identidade.
[00194] Conforme aqui usado, substancialmente idêntico a um produto significa suficientemente similar de modo que a propriedade de interesse é insuficientemente modificada de modo que o produto substancialmente idêntico pode ser usado no lugar do produto.
[00195] Conforme aqui usado, substancialmente puro significa substancialmente homogêneo para parecer livre de impurezas prontamente detectáveis conforme determinado através de métodos de análise padrão, tal como cromatografia de camada fina (TLC), eletroforese de gel e cromatografia líquida de alta desempenho (HPLC), usados por aqueles versados na técnica para avaliar tal pureza, ou suficientemente puro de modo que purificação adicional não alteraria detectavelmente as propriedades físicas e químicas, tal como atividades enzimáticas e biológicas, da substância. Métodos para purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente quimicamente puros são conhecidos daqueles versados na técnica. Um composto substancialmente quimicamente puro pode, no entanto, ser uma mistura de estereoisômeros ou isômeros. Em tais casos, purificação adicional poderia aumentar a atividade específica do composto.
[00196] Conforme aqui usado, célula alvo refere- se a uma célula que expressa uma sHASEGP (no contexto de produção de sHASEGP conforme aqui descrito) ou a uma célula que é direcionado por uma sHASEGP ou agente co-formulado ou co-administrado in vivo (no contexto de uso de sHASEGPs para promover a aplicação de agentes farmacológicos e outros a células alvo conforme aqui descrito).
[00197] Conforme aqui usado, a substância de teste (ou composto de teste) refere-se a um composto quimicamente definido (por exemplo, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas/inorgânicas, proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, oligonucleotídeos, lipídeos, polissacarídeos, sacarídeos ou híbridos dentre essas moléculas tal como glicoproteínas, etc) ou misturas de compostos (por exemplo, uma biblioteca de compostos de teste, extratos naturais ou sobrenadantes de cultura, etc) que tem efeito sobre uma sHASEGP, particularmente uma forma de cadeia simples que inclui o domínio Hialuronidase ou uma porção suficiente dele para atividade, conforme determinado através de um método in vitro, tal como os ensaios providos aqui.
[00198] Conforme aqui usado, os termos "um agente terapêutico", "regime terapêutico", "dispositivo radioprotetor" ou "quimioterapêutico" significam fármacos e terapias de fármacos convencionais, incluindo vacinas, que são conhecidos daqueles versados na técnica. Agentes radioterapêuticos são bem-conhecidos na técnica.
[00199] Conforme aqui usado, tratamento significa qualquer maneira na qual os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença são melhorados ou de outro modo beneficamente alterados.
[00200] Tratamento também compreende qualquer uso farmacêutico das presentes composições.
[00201] Conforme aqui usado, vetor (ou plasmídeo) refere-se a elementos diferentes que são usados para introduzir ácido nucléico heterólogo em células ou para sua expressão ou replicação. Os vetores tipicamente permanecem epissomais, mas podem ser produzidos para realizar integração de um gene ou porção dele em um cromossomo do genoma. Também compreendidos são vetores que são cromossomos artificiais, tal como cromossomos artificiais de levedura e cromossomos artificiais de mamífero. Seleção e uso de tais veículos são bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar DNA que é operavelmente ligado com seqüências reguladoras, tal como regiões promotoras, que são capazes de realizar a expressão de tais fragmentos de DNA. Deste modo, um vetor de expressão refere-se a um construto de DNA ou RNA recombinante, tal como um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, quando da introdução em uma célula hospedeiro apropriada, resulta em expressão do DNA clonado. Vetores de expressão apropriados são bem-conhecidos daqueles versados na técnica e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem epissomais ou aqueles que integram ao genoma da célula hospedeiro.
[00202] Conforme aqui usado, seqüência de ligação de proteína refere-se a uma seqüência de proteína ou peptídeo que é capaz de ligação específica a outras seqüências de proteína ou peptídeo geralmente, a um conjunto de seqüências de proteína ou peptídeo ou a uma seqüência de proteína ou peptídeo particular.
[00203] Conforme aqui usado, marcador de epitopo refere-se a uma extensão curta de resíduos de aminoácido correspondendo a um epitopo para facilitar análises bioquímica e imunológicas subseqüentes da proteína ou peptídeo marcado com epitopo. Marcação de epitopo é conseguida incluindo a seqüência do marcador de epitopo na seqüência de codificação de proteína em um vetor de expressão apropriado. Proteínas marcadas com epitopo podem ser purificadas com afinidade usando anticorpos altamente específicos criados contra os marcadores.
[00204] Conforme aqui usado, seqüência de ligação de metal refere-se a uma seqüência de proteína ou peptídeo que é capaz de ligação específica a íons de metal em geral, a um conjunto de íons de metal ou a um íon de metal particular.
[00205] Conforme aqui usado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre dois ou entre mais itens.
[00206] Conforme aqui usado, uma composição refere-se a qualquer mistura. Ela pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, aquosa, não-aquosa ou qualquer combinação delas.
[00207] Conforme aqui usado, fluido refere-se a qualquer composição que pode fluir. Fluidos então compreendem composições que estão na forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras tais composições.
[00208] Conforme aqui usado, um extrato celular refere-se a uma preparação ou fração que é feita de uma célula lisada ou rompida.
[00209] Conforme aqui usado, um agente é dito ser aleatoriamente selecionado quando o agente é escolhido aleatoriamente sem considerar as seqüências específicas envolvidas na associação de uma proteína sozinha ou com seus substratos associados, contrapartes de ligação, etc. Um exemplo de agentes aleatoriamente selecionados é o uso de uma biblioteca química ou uma biblioteca combinatorial de peptídeo, ou um caldo de crescimento de um organismo ou meio condicionado.
[00210] Conforme aqui usado, um agente é dito ser racionalmente selecionado ou produzido quando o agente é escolhido em uma base não-aleatória que leva em consideração a seqüência do sítio alvo e/ou sua conformação em conexão com a ação do agente. Conforme descrito nos Exemplos, são propostos sítios de ligação para Hialuronidase e sítios (catalíticos) na glicoproteína tendo SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:4. Agentes podem ser racionalmente selecionados ou racionalmente produzidos utilizando as seqüências de peptídeo que formam esses sítios. Por exemplo, um agente peptídeo racionalmente selecionado pode ser um peptídeo cuja seqüência de aminoácido é idêntica aos sítios ou domínios de ligação de ATP ou calmodulina.
[00211] Oligossacarídeos são considerados ter uma extremidade de redução e uma extremidade de não-redução, seja ou não o sacarídeo na extremidade de redução de fato um açúcar de redução. De acordo com a nomenclatura aceita, oligossacarídeos são mostrados aqui com a extremidade de não-redução à esquerda e a extremidade de redução à direita. Todos os oligossacarídeos descritos aqui são descritos com o nome ou abreviação para o sacarídeo de não-redução (por exemplo, Gal), seguido pela configuração da ligação glicosídica (.alfa. ou .beta.), a ligação do anel, a posição do anel do sacarídeo de redução envolvido na ligação, e o nome ou abreviação do sacarídeo de redução (por exemplo, GlcNAc). A ligação entre dois açúcares pode ser expressa, por exemplo, como 2,3, 2.fw darw.3 ou (2,3). Cada sacarídeo é uma piranose.
[00212] Conforme aqui usado, porção açúcar N- ligada refere-se a um oligossacarídeo ligado a uma sHASEGP através da nitrogênio amida de resíduos Asn. Oligossacarídeos N-ligados se encaixam em vários tipos principais (oligomanose, complexo, híbrido, sulfatado), todos eles têm núcleos 3-GlcNAc-GlcNAc (Man) ligados através da nitrogênio amida de resíduos Asn que se encaixam dentro das seqüências -Asn-Xaa-Thr/Ser- (onde Xaa não é Pro) . Sítios N-ligados são freqüentemente indiretamente determinados pelo aparecimento de um ciclo "vazio" durante o seqüenciamento. Identificação positiva pode ser feita após aplicação do oligossacarídeo através de PNGaseF, que converte Asn glicosado em Asp. Após aplicação de PNGase, oligossacarídeos N-ligados podem ser purificados usando cromatografia Bio-Gel P-6, com o grupo de oligossacarídeo submetido à cromatografia de troca de ânion de alto pH preparativa (HPAEC) (Townsend e outros (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Certos isômeros de oligossacarídeo podem ser separados usando HPAEC. Resíduos de fucose vão mudar posições de eluição mais cedo na cromatografia de HPAEC, enquanto resíduos de ácido siálico adicionais vão aumentar o tempo de retenção. Tratamento concomitante de glicoproteénas cujas estruturas de oligossacarídeo são conhecidas (por exemplo, fetuína bovina, glicoproteína ácida a-1, ovalbumina, RNAase B, transferrina) pode facilitar a determinação dos picos de oligossacarídeo. Os oligossacarídeos coletados podem ser caracterizados através de uma combinação de análises composicional e de ligação de metilação (Waegheet e outros (1983) Carbohydr. Res. 123, 281-304), com configurações anoméricas determinadas através de espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) em Methods Enzymol 230).
[00213] Alternativamente, oligossacarídeos podem ser identificados através de eletroforese de carboidrato auxiliada por fluorescência (FACE) Callewaert e outros (2001) Glycobiology 11, 275-281.
[00214] ‘Confo rme aqui usado, o termo "ácido siálico" refere-se a qualquer membro de uma família de açúcares carboxilados de nove carbonos. O membro mais comum da família de ácido siálico é ácido N-acetilneuramínico ácido (2-ceto-5-acetamindo-3,5-dietóxi-D-glicero-D- galactononulopiranos-1-ônico (freqüentemente abreviado como Neu5Ac, NeuAc ou NANA). Um segundo membro da família é ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc ou NeuGc), onde o grupo N- acetila de NauAc é hidroxilado. Um terceiro membro da família do ácido siálico é ácido 2-ceto-3-desóxi-nonulosônico (KDN) (Nadano e outros (1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557; Kanamori e outros (1990) J. Biol. Chem. 265:2181-21819. Também incluídos estão ácido siálicos 9-substituídos tal como 9-O-C.sub-1-C.sub.6acil-Neu5Ac tipo 9-O-lactil-Neu5Ac ou 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desóxi-9-fluor-Neu5Ac e 9-azido-9- desóxi-Neu5Ac. Para revisão da família de ácido siálico, vide, por exemplo, Varki (1992) Glycobiology 2:25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, N.Y. (1992)). A síntese e uso de compostos de ácido siálico em um procedimento de sialilação é mostrada no pedido de patente internacional WO 92/16640, publicado em 1 de outubro de 1992.
[00215] Conforme aqui usado, PNGase refere-se a uma N-glicosidase F específica de Peptídeo Asparagina tal como peptídeo-N-glicosidase de Flavobacterium maningoseptum. Enzimas PNGASE são caracterizadas por sua especificidade com relação a oligossacarídeos N-ligados ao invés de O-ligados. Caracterização da eficácia de PNGASE pode ser definida por ambas eletroforese de SDS PAGE ou eletroforese de carboidrato auxiliada por fluorescência.
[00216] Conforme aqui usado Sialilação substancialmente terminada refere-se a oligossacarídeos N- ligados terminando com resíduo de ácido siálico como um açúcar terminal. Ácidos siálicos terminais podem ser identificados através de análise FACE de carboidratos liberados seguindo tratamento com neuraminidase.
[00217] O tempo de vida de circulação de glicoproteínas no sangue é altamente dependente da composição e da estrutura de seus grupos de carboidrato N- ligados. Este fato é de relevância direta para glicoproteínas terapêuticas que são pretendidas ser administradas parenteralmente. Em geral, meia-vida circulatória máxima de uma glicoproteína requer que seus grupos carboidrato N- ligados terminem na seqüência NeuAc-Gal-GlcNAc. Sem o ácido siálico terminal (NeuAc), a glicoproteína é rapidamente eliminada do sangue através de um mecanismo envolvendo o reconhecimento dos resíduos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) ou galactose (Gal) de base (Goochee e outros (1991) Bio/Technology 9:1347-1355). Por esta razão, assegurar a presença de ácido siálico terminal nos grupos carboidrato N- ligados de glicoproteínas terapêuticas é uma consideração importante para seu desenvolvimento comercial.
[00218] Glicoproteínas de circulação são expostas a sialidase(s) (ou neuraminidase) que pode(m) remover resíduos de ácido siálico terminais. Tipicamente a remoção do ácido siálico expõe resíduos de galactose, e esses resíduos são reconhecidos e ligados por receptores específicos de galactose em hepatócitos (revisto em Ashwell e Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:531). O fígado também contém outros receptores específicos de açúcar que fazem a mediação da remoção de glicoproteínas da circulação. Especificidades de tais receptores também inclui N- acetilglucosamina, manose, fucose e fosfomanose. Glicoproteínas eliminadas pelos receptores de galactose de hepatócitos sofrem degradação substancial e então entram na bile; glicoproteínas eliminadas pelo receptor de manose de células Kupfer entram no sistema reticuloendotelial (revisto em Ashwell e Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:53).
[00219] Conforme aqui usado, Neutra Ativa refere-se a uma glicoproteína sHASEGP com atividade catalítica com relação a um substrato glicosaminoglicano in vitro em um pH entre 5 e 8 sob condições de sal de menos do que 150 mM e resistência de tamponamento de menos do que 50 mM.
[00220] Conforme aqui usado, uma solução estabilizada refere-se a uma sHASEGP que retém mais do que 60% de sua atividade inicial após armazenamento em temperatura ambiente por 30 dias.
[00221] Conforme aqui usado, a menos que de outro modo especificado, uma unidade é expressa em unidades de redução de turbidez (TRU). Uma TRU é definida como a quantidade de atividade de hialuronidase requerida para reduzir a turbidez de uma solução acidificada de ácido hialurônico e é equivalente à U.S.P./National Formulary (NF XIII) units (NFU). O ensaio de enzima do tipo ELISA descrito aqui pode ser relacionado às TRU, às NFU e à unidade U.S.P. através de uma curva padrão de uma amostra de hialuronidase (por exemplo, padrão USP ou WHO) padronizado através da U.S.P. Deste modo, as atividades de enzima determinadas pelo ensaio de enzima do tipo ELISA são realmente relativas à TRU, uma vez que a atividade enzimática não é realmente medida usando o ensaio turbidométrico (Dorfman e outros, 1948, J. Biol. Chem. 172:367).
[00222] Conforme aqui usado, potência é definida pela quantidade de proteína sHASEGP requerida para degradar substrato in vitro com base em uma Turbidity Reducing Unit ou Relative Turbidity Reducing Unit.
[00223] Conforme aqui usado, atividade específica refere-se a Unidades de atividade por mg de proteína. A quantidade de proteína sHASEGP é definida pela absorção de uma solução de sHASEGP em 280 nm supondo um coeficiente de extinção molar de aproximadamente 1,7, em unidades de M-1 cm-1.
[00224] Polietileno glicol (PEG) tem sido amplamente usado em biomateriais, biotecnologia e medicina principalmente porque PEG é um polímero biocompatível, não- tóxico, não-imunogênico e solúvel em água (Zhao e Harris, ACS Symposium Series 680:458-72, 1997). Na área de aplicação de fármaco, derivados de PEG têm sido amplamente usados em ligação covalente (isto é, PEGuilação") a proteínas para reduzir a imunogenicidade, proteólise e liberação pelo rim e para aumentar a solubilidade (Zalipsky, Adv. Drug. Del. Rev. 16:157-82, 1995). Similarmente, PEG tem sido ligado a fármacos de peso molecular baixo, relativamente hidrofóbicos, para aumentar a solubilidade, reduzir a toxidez e alterar biodistribuição. Tipicamente, fármacos PEGuilados são injetados como soluções.
[00225] Uma aplicação intimamente relacionada é síntese de redes ou formulações de PEG degradáveis ligadas com cruzamento para uso em aplicação de fármaco uma vez que muito da mesma química usada na produção de veículos de fármaco solúveis, degradáveis, pode ser também usado na produção de géis degradáveis (Sawhney e outros, Macromolecules 26:581-87, 1993). Sabe-se também que complexos intermacromoleculares podem ser formados através de mistura de soluções de dois polímeros complementares. Tais complexos são geralmente estabilizados através de interações eletrostáticas (poliânion-policátion) e/ou ligações hidrogênio (poliácido-polibase) entre os polímeros envolvidos e/ou por interações hidrofóbicas entre os polímeros em um ambiente aquoso (Krupers e outros, Eur. Polym. J. 32:785-790, 1996). Por exemplo, mistura de soluções de ácido poliacrílico (PAAc) e óxido de polietileno (PEO) sob as condições apropriadas resulta na formação de complexos baseados principalmente em ligação hidrogênio. Dissociação desses complexos em condições fisiológicas tem sido usada para aplicação de fármacos livres (isto é, não-PEGuilados). Ainda, complexos de polímeros complementares têm sido formados a partir de ambos homopolímeros e copolímeros.
[00226] Em um aspecto, o polietileno glicol tem um peso molecular variando de a partir de cerca de 3 kD a cerca de 50 kD, e de preferência de a partir de cerca de 5 kD a cerca de 30 kD. Ligação covalente do PEG ao fármaco (conhecida como "PEGuilação") pode ser realizada através de técnicas de síntese química conhecidas. Por exemplo, em um aspecto da presente invenção, a PEGuilação de uma proteína pode ser realizada através da reação de PEG ativado com NHS com a proteína sob as condições de reação adequadas.
[00227] Embo ra várias reações tenham sido descritas para PEGuilação, aquelas que são mais geralmente aplicáveis para conferir direcionalidade utilizam condições de reação suaves e não necessitam de processamento a jusante extensivo para remover catalisadores ou subprodutos tóxicos. Por exemplo, monometóxi (mPEG) tem apenas uma hidroxila terminal reativa, e então seu uso limita um pouco da heterogeneidade da mistura de produto de PEG-proteína resultante. Ativação do grupo hidroxila no final do polímero oposto ao grupo metóxi terminal é geralmente necessária para realizar PEGuilação de proteína eficiente, com o objetivo sendo tornar o PEG derivatizado mais suscetível a ataque nucleofílico. O nucleófilo de ataque é geralmente um grupo epsilon-amino de um resíduo lisila, mas outras aminas podem também reagir (por exemplo, a alfa-amina N-terminal ou as aminas de anel de histidina) se condições locais forem favoráveis. Uma ligação mais direta é possível em proteínas contendo uma lisina ou cisteína única. O último resíduo pode ser direcionado pelo PEG-maleimida para modificação específica de tiol. Alternativamente, PEG-hidrazida pode ser reagido com sHASEGP oxidada com periodato e reduzido na presença de NaCNBH3. Mais especificamente, açúcares CMP PEGuilados podem ser reagidos com sHASEGP na presença de glicosil-transferase apropriada. Uma técnica é a técnica de PEGuilação onde várias moléculas poliméricas são acoplados ao polipeptídeo em questão. Quando usando esta técnica, o sistema imune tem dificuldades em reconhecer os epitopos na superfície do polipeptídeo responsável pela formação de anticorpos, deste modo reduzindo a resposta imune. Para polipeptídeos introduzidos diretamente no sistema circulatório do corpo humano para dar um efeito fisiológico particular (isto é, agentes farmacêuticos) a resposta imune potencial típica é uma resposta de IgG e/ou IgM, enquanto polipeptídeos que são inalados através do sistema respiratório (isto é, polipeptídeo industrial) podem causar potencialmente uma resposta IgE (isto é, resposta alérgica). Uma das teorias explicando a resposta imune reduzida é que a(s) molécula(s) polimérica(s) protege(m) o(s) epitopo(s) na superfície do polipeptídeo responsável pela resposta imune levando à formação de anticorpo. Uma outra teoria ou pelo menos um fator parcial é que quanto mais pesado for o conjugado, mais resposta imune reduzida é obtida.
[00228] No caso de sHASEGPs humanas sendo usadas no corpo humano, uma combinação preferida conforme aqui descrito, a tendência da sHASEGP em elicitar uma resposta imune pode ser significantemente reduzida conforme comparado com, por exemplo, enzimas derivadas de animal não-humano, tal como hialuronidases bovinas ou ovinas (isto é, mesmo que aquelas enzimas derivadas de animal pudessem ser completamente purificadas de outras proteínas derivadas de animal, o que é difícil a impossível de se obter na prática). Embora sHASEGPs humanas então representem um aperfeiçoamento substancial e muito importante sobre produtos derivados de animal, elas podem ser aperfeiçoadas ainda mais para muitos usos através de modificações pós-traducionais (PTMs) tal como PEGuilação para aumentar sua resistência à degradação ou eliminação e/ou para melhorar outras propriedades tornando-as ainda mais benéficas para aplicações particulares.
[00229] Por exemplo, embora composições preferidas para seres humanos (tal como as sHASEGP humanas) exibam imunogenicidade reduzida comparado com hialuronidases derivadas de animal ou sHASEGPs não-humanas, PEGuilação de tais sHASEGPs humanas pode ser usada, por exemplo, para prolongar a meia-vida na corrente sangüínea e/ou em outros tecidos dentro do corpo. Sem ser restrito a um mecanismo de ação particular, é geralmente considerado que a ligação de porções de PEG a sHASEGPs pode ser usada para eficazmente proteger a molécula, diminuindo sua sensibilidade relativa a proteases e potencialmente também diminuindo o grau e taxa de sua eliminação do corpo.
[00230] As moléculas poliméricas acopladas ao polipeptídeo podem ser qualquer molécula polimérica adequada com um peso molecular conforme definido de acordo com a invenção, incluindo homopolímeros naturais e sintéticos, tal como polióis (isto é, poli-OH), poliaminas (isto é, poli- NH2) e ácidos policarboxílicos (isto é, poli-COOH) e heteropolímeros adicionais, isto é, polímeros compreendendo um ou mais grupos de acoplamento diferentes, por exemplo, um grupo hidroxila e grupos amina.
[00231] Exemplos de moléculas poliméricas adequadas incluem moléculas poliméricas selecionadas do grupo compreendendo óxidos de polialquileno (PAO), tal como polialquilenoglicóis (PAG), incluindo polipropileno glicóis (PEG), metoxipolietileno glicóis (mPEG) e polipropileno glicóis, PEG-glicidil éteres (Epox-PEG), PEG- oxicarbonilimidazol (CDI-PEG) polietileno glicóis ramificados (PEGs), álcool polivinílico (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D,L- aminoácidos, anidrido do ácido polietileno-co-maléico, anidrido do ácido poliestireno-co-maléico, dextranos incluindo carboximetil-dextranos, heparina, homólogos de albumina, celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxietilcelulose e hidroxipropilcelulose, hidrolisatos de quitosana, amidos tal como hidroxietil-amidos e hidroxipropil-amidos, glicogênio, agaroses e seus derivados, goma guar, pululano, inulina, goma xantano, carragenina, pectina, hidrolisatos de ácido algínico e biopolímeros.
[00232] Moléculas poliméricas preferidas são moléculas poliméricas não-tóxicas tal como (m)polietileno glicol (mPEG) que requere ainda uma química relativamente simples para seu acoplamento covalente a grupos de ligação na superfície da enzima.
[00233] Óxi dos de polialquileno geralmente vistos (PAO), tal como óxidos de polietileno, tal como PEG e especialmente mPEG, são as moléculas poliméricas preferidas, uma vez que essas moléculas poliméricas, em comparação com polissacarídeos tal como dextrano, pululano e similar, têm poucos grupos reativos capazes de reticulação, o que é indesejável.
[00234] Aperfeiçoamentos em PEGuilação e outros tipos de modificações pós-traducionais (PTMs) têm sido extensivos e existe agora um grande número de técnicas e reagentes de PTM conhecidos na técnica, e novas estão sendo regularmente desenvolvidas. Técnicas e reagentes para PEGuilação incluem, por exemplo: (i) ligantes e químicas de acoplamento especializados (vide, por exemplo, reagentes e tecnologias revistos por Harris, J.M., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476 (2002) e as referências primárias revistas lá); (ii) PEGs ramificados que eficazmente permitem que grupos PEG adicionais sejam ligados a um sítio de conjugação único (vide, por exemplo, Veronese, F.M. e outros, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180 (2002)); (iii) PEGuilação específica de sítio, incluindo monoPEGuilação específica de sítio (vide, por exemplo, Chapman, A.P. e outros, Nature Biotech. 17:780-783 (1999); e (iv) PEGuilação enzimática direcionada a sítio (por exemplo, usando uma reação de transglutaminase conforme descrito por Sato, H., Adv. Drug. Deliv. Rev. 54:487-504 (2002)). Existem também tecnologias e reagentes adicionais disponíveis de um grande número de fornecedores comerciais (vide, por exemplo, Nektar/Shearwater (www.nektar.com), Sunbio (www.sunbio.com e www.sunbio.com/peg-shop), Celares GmbH (www.celares.com) e outros).
B. PERFIS DE EXPRESSÃO DE TECIDO DE sHASEGP
[00235] Embora anteriormente imaginada ser específica de testículos, sHASEGP humana é expressa em múltiplos tecidos em seres humanos quando usando técnicas mais sensíveis tal como RT-PCR. O transcrito de sHASEGP é encontrado na medula (cérebro), endotélio microvascular, próstata, mama, retina, melanócito humano agrupado, coração fetal e útero grávido. SHASEGP é também expressa em tumores de célula germinativa. Detecção baseada em RT-PCR de transcritos de sHASEGP é geralmente requerida para detectar níveis em tecidos outros que não testículos.
C. ENSAIOS PARA ATIVIDADE DE ENZIMA sHASEGP ENSAIO DE MICROTITULAÇÃO TURBIDOMÉTRICO PARA ATIVIDADE DE HIALURONIDASE
[00236] Atividade de hialuronidase pode ser detectada por meio de um ensaio turbidométrico modificado em solução de soro acidificada. Os reagentes requeridos são como segue:
Figure img0001
Figure img0002
[00237] Os reagentes que seguem são preparados: Solução Tampão de Acetato - 14,0 g de acetato de potássio e 25,0 mL de ácido acético glacial em água para fazer 100 mL. Solução Tampão de Fosfato - 2,5 g de fosfato de sódio monobásico, 1,0 g de fosfato de sódio anidro dibásico e 8,2 g de cloreto de sódio em água para fazer 1000 mL. Solução Estoque Diluente de Enzima - 500 mL de Solução Tampão de Fosfato com 500 mL de água. Solução de Trabalho Diluente de Enzima - 33 mg de gelatina hidrolisada em 50 mL de Solução de Estoque Diluente de Enzima - preparada dentro de 2 horas de uso. Solução Tampão de Estabilização de Amostra (Solução "SSB") - 125 microlitros (μL) de uma Solução de Albumina de Soro Humano a 20% e 50 μL de uma solução de Cloreto de Cálcio a 1M em 50 mL de Solução de Trabalho Diluente de Enzima, e misturar cuidadosamente. Solução de Estoque de Soro - Diluir 1 volume de Soro de Cavalo com 9 volumes de Solução Tampão de Acetato. Ajustar com ácido clorídrico 4N para um pH de 3,1 e permitir que a solução descanse em temperatura ambiente por 18 a 24 horas. Armazenar a solução a 4°C e usar dentro de 30 dias. Solução de Trabalho de Soro - 10 mL da Solução Estoque de Soro em 30 mL de Solução Tampão de Acetato, ajustada para temperatura ambiente. Solução Estoque de Ácido Hialurônico - Ácido Hialurônico de Sódio para uma concentração de 5,0 mg/mL em água. Solução de Trabalho de Ácido Hialurônico - 0,75 mL da Solução de Estoque de Ácido Hialurônico em 4,25 mL da Solução Tampão de Fosfato. Solução de Estoque Padrão - Um recipiente de Hialuronidase Padrão de Referência USP para uma concentração de 1000 Unidades/mL em água, separada em alíquotas em porções de 50 μL, e armazenada a --20o C. Solução de Trabalho Padrão - 40 μL de Solução de Estoque Padrão em 960 μL de Solução de Trabalho Diluente de Enzima para se obter uma solução tendo uma concentração conhecida de 40 unidades/mL, preparada imediatamente antes do uso no ensaio.
[00238] Todas as amostras de enzimas são diluídas em uma placa de 96 cavidades de "Ligação de Proteína Baixa" de acordo com as orientações que seguem: a) a faixa de sensibilidade máxima deste ensaio está enre 10-30 Unidades/mL. Para minimizar o número de vezes que um ensaio deve ser repetido a fim de dar resultados que estejam dentro da faixa, primeiro determinar o número aproximado de unidades totais/mL para a amostra, e então escolher uma diluição (número inteiro) de modo que a concentração final seja aproximadamente 20 Unidades/mL. b) Volumes de Amostra Mínimos necessários para realizar o ensaio são como segue: Frações de FPLC = 50 μL, Sobrenadantes de Cultura de Tecido = 1 mL, Material Purificado/Concentrado/Etapa Final = 10 μL. c) Para amostras com diluições seriais, diluições 1:10 na placa de 96 cavidades de "Ligação de Proteína Baixa" são feitas em triplicata pipetando 360 μL da solução de "SSB" e 40 μL de Amostra em cada cavidade.
[00239] Para preparação de Padrão USP preparar a Curva Padrão USP na placa de 96 cavidades de "Ligação de Proteína Baixa" como segue:
Figure img0003
[00240] P ara preparação do Controle de Ácido Hialurônico nas colunas 1-3, preparar o Controle de H.A. na placa de 96 cavidades de "Fundo Plano" como segue:
Figure img0004
[00241] A Placa de Reação: 30 μL por cavidade de Solução de Trabalho de Ácido Hialurônico são pipetados usando uma pipeta de transferência de 8 canais de 50 μL em uma placa de microtitulação de 96 cavidades de "Fundo Plano" deixando as cavidades H1-H3 vazias. 60 μL/cavidade de Solução de Trabalho Diluente de Enzima são pipetados nas cavidades H1- H3 da mesma placa como o controle de H.A.
[00242] Solução de Trabalho de Soro; 400 mL de Solução de Trabalho de Soro são despejados em uma bacia de transferência e em seguida para o Bloco de Aquecimento.
[00243] Estágio de Pré-aquecimento: Uma vez ambas placas tendo sido preparadas, a placa de 96 cavidades de Ligação de Proteína Baixa contendo as amostras diluídas, padrões, controles e a placa de 96 cavidades de Fundo Plano contendo a Solução de Trabalho de Ácido Hialurônico são postas em um bloco de aquecimento e deixadas que aqueçam por 5 minutos a 37oC.
[00244] A reação é iniciada através da adição de Enzima ao Substrato: 30 μL da placa de enzima em todas as cavidades na coluna No. 1 da placa de fundo plano de 96 cavidades (contendo o substrato) usando uma pipeta de 8 canais de 5-50 μL. A mistura de reação de Enzima/Extrato é aspirada 5 vezes (puxando a solução para cima e para baixo com o dispositivo de transferência durante os primeiros 15 segundos para assegurar mistura completa da amostra). Após mistura da enzima e substrato, as ponteiras são ejetadas e um novo conjunto de ponteiras carregado na pipeta de transferência para a próxima coluna. Um cronômetro é reiniciado, em um tempo (t) = 0:30, este processo é repetido para a coluna 2. No intervalo de 30 segundos próximo (t)=1:00, este processo é repetido para a coluna 3. Este processo é repetido movendo da esquerda para a direita através da placa, a cada 30 segundos até que todas as cavidades contenham ambos enzima e substrato.
[00245] Parando a reação: Quanto o timer atingir 6 minutos (t)=6:00, 240 μL da Solução de Trabalho de Soro são pipetados em cada cavidade, usando uma pipeta de transferência de 8 canais de 50-300 μL, na coluna 1 da placa de fundo plano de 96 cavidades a partir do Reservatório de Reagente de 50 mL adjacente. A mistura é aspirada 3 vezes (puxando a solução para cima e para baixo com a Pipeta de transferência) durante os primeiros 10 segundos para assegurar mistura completa. O processo é repetido a cada 30 segundos, prosseguindo das colunas 1 a 12. Quando do término da última coluna (coluna 12), a placa de reação é removida do bloco de aquecimento e pôr a placa na bandeja de leitura da leitora de placa a 640 nM. Um ajuste de curva linear é gerado a partir da curva padrão que permite extrapolação das amostras de teste.
ENSAIOS ALTERNATIVOS PARA HIALURONIDASE ENSAIO DE MICROTITULAÇÃO DE HIALURONAN BIOTINILADO
[00246] Os grupos carboxila livres em resíduos de ácido glucurônico de Hialuronan são biotinilados em uma reação de uma etapa usando biotina-hidrazina (Pierce), Sulfo NHS (Pierce) e 1-Etil dimetil aminopropil-carbodiimida (Sigma). Este substrato de HA biotinilado é covalentemente acoplado a uma placa de microtitulação de 96 cavidades em uma segunda reação. No término da reação de enzima, substrato residual é detectado com uma reação de avidina-peroxidase que pode ser lida em uma leitora de placa ELISA padrão. Como o substrato é covalentemente ligado à placa de microtitulação, artefatos tal como deslocamento dependendo do pH do substrato biotinilado não acontecem. A sensibilidade permite medição rápida de atividade de Hialuronidase a partir de células culturadas e amostras biológicas com uma variação interensaio de menos do que 10%.
[00247] A atividade específica de hialuronidase é expressa em unidades de redução de turbidez (TRU). Uma TRU é definida como a quantidade de atividade de hialuronidase requerida para reduzir a turbidez de uma solução acidificada de ácido hialurônico e é equivalente às U.S.P./National Formulary (NF XIII) units (NFU). O ensaio de enzima tipo ELISA usado para purificação é relacionado às unidades TRU, NFU e U.S.P. através de uma curva padrão de uma amostra de hialuronidase (por exemplo, USP) padronizada através da U.S.P. Então, as atividades de enzima determinadas através de ensaio de enzima tipo ELISA são realmente relativas à TRU, uma vez que atividade enzimática não é realmente medida usado do ensaio turbidométrico (Dorfman e outros, 1948, J. Biol. Chem., 172:367).
[00248] Muitos ensaios de hialuronidase têm sido baseados na medição da geração de novos grupos N-acetilamino de redução (Bonner e Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966) ou perda de viscosidade (De Salegui e outros, Arch. Biochem. Biophys. 121:548-554, 1967) ou turbidez (Dorfman e Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948). Com substratos purificados, todos esses métodos são suficientes para determinação da presença ou ausência de atividade endoglucosamídica.
[00249] Substratos de glicosaminoglicano substancialmente purificados podem ser também usados em um Gel Shift Assay. Glicosaminoglicanos são misturados com sHASEGP recombinante para testar a atividade de endoglicosidase que resulta em uma mudança na mobilidade do substrato dentro do gel. Sulfato de condroitina-4 e 6, sulfato de dermatan, sulfato de heparan podem ser obtidos da Sigma Chemical. Hialuronan de cordão umbilical humano pode ser obtido da ICN. Cada substrato de teste é diluído para 0,1 mg/ml em uma faixa de tampão de pH 3,5-7,5. Amostras de 10 ul de sHASEGP purificada ou meios condicionados das células expressando sHASEGP também são misturados com 90 ul de substrato de teste em tampão desejado e incubados por 2 horas a 37o C. Seguindo a incubação, as amostras são neutralizadas com tampão de amostra (Tris EDTA PH 8,0, Bromophenol Blue e glicerol) seguido por eletroforese. Glicosaminoglicanos são detectados através de tingimento dos géis em Alcian Blue a 0,5% em Ácido Acético Glacial a 3% da noite para o dia seguido por retirada do tingimento em Ácido Acético Glacial a 7%. Degradação é determinada através de comparação da mobilidade do substrato na presença e ausência de enzima.
[00250] Atividade de hialuronidase pode ser também detectada através de zimografia de gel de substrato (Guentenhoner e outros, 1992, Matrix 388-396). Neste ensaio uma amostra é aplicada a gel SDS-PAGE contendo ácido hialurônico e as proteínas na amostra separadas através de eletroforese. O gel é então incubado em um tampão de ensaio de enzima e subseqüentemente tingido para detectar o ácido hialurônico no gel. Atividade de hialuronidase é visualizada como uma zona clara no gel de substrato.
D. IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTO DE GENES DE POLIPEPTÍDEO DE sHASEGP
[00251] O gene do polipeptídeo de sHASEGP e/ou seus domínios podem ser obtidos através de métodos bem- conhecidos na técnica para isolamento de DNA. Qualquer método conhecido daqueles versados na técnica para identificação de ácidos nucléicos que codificam genes desejados pode ser usado. Qualquer método disponível na técnica pode ser usado para se obter um clone de cDNA de comprimento completo (isto é, compreendendo a região de codificação inteira) ou DNA genômico codificando um polipeptídeo de sHASEGP. Por exemplo, a reação de cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar uma seqüência que é expressa em tecidos normais, por exemplo, ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo de sHASEGP (SEQ ID Nos: 1 e 2), em uma biblioteca genômica ou de cDNA. Iniciadores de oligonucleotídeo que hibridizam as seqüências nos terminais 3' e 5' das seqüências identificadas podem ser usados como iniciadores para amplificar através de PCR seqüências de uma amostra de ácido nucléico (RNA ou CNA geralmente uma biblioteca de cDNA, a partir de uma fonte apropriada (exemplo, testículos, próstata, mama).
[00252] PCR pode ser realizada, por exemplo, através do uso de um ciclizador térmico Perkin-Elmer Cetus e Taq polimerase (Gene Amp). O DNA sendo amplificado pode incluir mRNA ou cDNA ou DNA genômico de qualquer espécie eucariótica. Uma pessoa pode escolher sintetizar vários iniciadores degenerados diferentes, para uso nas reações de PCR.
[00253] É também possível variar a estringência de condições de hibridização usadas na iniciação de reação de PCR, para amplificar homólogos de ácido nucléico (por exemplo, obter seqüências de polipeptídeo de sHASEGP de espécies outras que não humanos ou obter seqüências humanas com homologia com o polipeptídeo de sHASEGP), ao permitir maiores ou menores graus de similaridade de seqüência de nucleotídeo entre a seqüência de nucleotídeo conhecida e o homólogo de ácido nucléico sendo isolado. Para hibridização de espécies cruzadas, condições de baixa estringência a estringência moderada são usadas. Para hibridização de mesma espécie, condições moderadamente estringentes a altamente estringentes são usadas. As condições podem ser empiricamente determinadas.
[00254] Após amplificação bem-sucedida do ácido nucléico contendo toda ou uma porção da seqüência de polipeptídeo de sHASEGP identificada ou de um ácido nucléico codificando todo ou uma porção do homólogo de polipeptídeo de sHASEGP, este segmento pode ser molecularmente clonado e seqüenciado, e usado como uma sonda para isolar um cDNA completo ou clone genômico. Isto, por sua vez, permite a determinação da seqüência de nucleotídeo completa do gene, a análise de sua expressão e a produção de seu produto de proteína para análise funcional. Uma vez determinada a seqüência de nucleotídeo, uma estrutura de leitura aberta codificando o produto de proteína de gene de polipeptídeo de sHASEGP pode ser determinada através de qualquer método bem- conhecido na técnica para determinação de estruturas de leitura aberta, por exemplo, usando programas de computador publicamente disponíveis para análise de seqüência de nucleotídeo. Uma vez uma estrutura de leitura aberta sendo definida, é rotina determinar a seqüência de aminoácido da proteína codificada pela estrutura de leitura aberta. Deste modo, as seqüências de nucleotídeo dos genes de polipeptídeo de sHASEGP inteiros bem como as seqüências de aminoácido de proteínas de polipeptídeo de sHASEGP e análogos podem ser identificadas.
[00255] Qualquer célula eucariótica pode potencialmente servir como a fonte de ácido nucléico para a clonagem molecular do gene de polipeptídeo de sHASEGP. Os ácidos nucléicos podem ser isolados de vertebrados, mamíferos, seres humanos, porcino, bovino felino, ave, eqüino, canino bem como fontes primatas adicionais, insetos, plantas e outros organismos. O DNA pode ser obtido através de procedimentos padrão conhecidos na técnica de DNA clonado (por exemplo, uma "biblioteca" de DNA), através de síntese química, através de clonagem de cDNA, ou através da clonagem de DNA genômico, ou seus fragmentos, purificados da célula desejada (vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York; Glover, D.M., Ed., 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd. Oxford, Reino Unido, Vol. 1, 11. Clones derivados de DNA genômico podem conter regiões de DNA reguladoras e de íntron em adição a regiões de codificação; clones derivados de cDNA vão conter apenas seqüências de exon. Para qualquer fonte, o gene é clonado em um vetor adequado para sua propagação.
[00256] Na clonagem molecular do gene de DNA genômico, fragmentos de DNA são gerados, alguns dos quais vão codificar o gene desejado.
[00257] O DNA pode ser clivado em sítios específicos usando várias enzimas de restrição.
[00258] Alternativamente, uma pessoa pode usar DNAse na presença de manganês para fragmentar o DNA, ou o DNA pode ser fisicamente cortado, por exemplo, através de sonificação. Os fragmentos de DNA lineares então podem ser separados de acordo com o tamanho através de técnicas padrão, incluindo, mas não limitado a, eletroforese de gel de agarose e poliacrilamida e cromatografia de coluna.
[00259] Uma vez os fragmentos de DNA sendo gerados, identificação do fragmento de DNA específico contendo o gene desejado pode ser realizada de várias maneiras.
[00260] Por exemplo, uma porção do gene de polipeptídeo de sHASEGP (de qualquer espécie) (por exemplo, um produto de amplificação de PCR obtido conforme descrito acima ou um oligonucleotídeo tendo uma seqüência de uma porção de seqüência de nucleotídeo conhecida) ou seu RNA específico, ou um seu fragmento a ser purificado e marcado, e os fragmentos de DNA gerados podem ser avaliados através de hibridização de ácido nucléico para a sonda marcada (Benton e Davis, Science 196:180 (1977); Grunstein e Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961 (1975)). Aqueles fragmentos de DNA com homologia substancial para a sonda vão hibridizar. É também possível identificar o fragmento apropriado através de digestão(ões) de enzima de restrição e comparação de tamanhos de fragmento com aqueles esperados de acordo com um mapa de restrição conhecido se tal estiver disponível ou através de análise de seqüência de DNA e comparação com a seqüência de nucleotídeo conhecida de polipeptídeo de sHASEGP. Seleção adicional pode ser realizada com base nas propriedades do gene. Alternativamente, a presença do gene pode ser detectada através de ensaios baseados nas propriedades físicas, químicas ou imunológicas de seu produto expresso. Por exemplo, clones de cDNA, ou clones de DNA que híbrido- selecionam o mRNA apropriado, podem ser selecionados, os quais produzem uma proteína que, por exemplo, tem migração, comportamento de foco isoelétrico, mapas de digestão proteolítica, propriedades antigênicas, atividade de Hialuronidase similares ou idênticos. Se um anticorpo de polipeptídeo anti-sHASEGP estiver disponível, a proteína pode ser identificada através de ligação de anticorpo marcado aos clones de sintetização de polipeptídeo de sHASEGP putativamente, em um procedimento do tipo ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima).
[00261] Alternativas para isolamento do DNA genômico de polipeptídeo de sHASEGP incluem, mas não estão limitadas a, quimicamente sintetização da seqüência de gene a partir de uma seqüência conhecida ou fabricação do cDNA para o mRNA que codifica o polipeptídeo de sHASEGP.
[00262] Por exemplo, RNA para clonagem de cDNA do gene de polipeptídeo de sHASEGP pode ser isolado de células expressando a proteína. Os ácidos nucléicos identificados e isolados então podem ser inseridos em um vetor de clonagem apropriado. Um grande número de sistemas de vetor-hospedeiro conhecidos na técnica pode ser usado. Vetores possíveis incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema de vetor deve ser compatível com a célula hospedeiro usada. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, bacteriófagos tal como derivados lambda ou plasmídeos tal como derivados de plasmídeo pBR322 ou pUC ou o vetor Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). A inserção em um vetor de clonagem pode, por exemplo, ser realizada ligando o fragmento de DNA em um vetor de clonagem que tem terminais coesos complementares.
[00263] Se os sítios de restrição complementares usados para fragmentar o DNA não estiverem presentes no vetor de clonagem, as extremidades das moléculas de DNA podem ser enzimaticamente modificadas. Alternativamente, qualquer sítio desejado pode ser produzido através de ligação da seqüência de nucleotídeo (ligantes) nos terminais de DNA; esses ligantes ligados podem incluir oligonucleotídeos quimicamente sintetizados específicos codificando seqüências de reconhecimento de endonuclease de restrição. Em um método alternativo, o vetor clivado e o gene de polipeptídeo de sHASEGP podem ser modificados através de tailing homopolimérico.
[00264] Moléculas recombinantes podem ser introduzidas em células hospedeiro através de transformação, transfecção, infecção, eletroforação, precipitação de cálcio e outros métodos, de modo que muitas cópias da seqüência de gene são geradas.
[00265] Em modalidades específicas, transformação das células hospedeiro com moléculas de DNA recombinantes que incorporam o gene de polipeptídeo de sHASEGP isolado, cDNA, ou seqüência de DNA sintetizada, permite a geração de cópias múltiplas do gene.
[00266] Deste modo, o gene pode ser obtido em grandes quantidades através de criação de transformantes, isolamento das moléculas de DNA recombinantes a partir dos transformantes e, quando necessário, retomar o gene inserido do DNA recombinante isolado.
E. VETORES, PLASMÍDEOS E CÉLULAS QUE CONTÊM ÁCIDOS NUCLÉICOS CODIFICANDO UM POLIPEPTÍDEO DE SHASEGP OU SEU DOMÍNIO HIALURONIDASE E EXPRESSÃO DE VETORES DE POLIPEPTÍDEO DE SHASEGP E CÉLULAS
[00267] Para expressão recombinante de um ou mais dos polipeptídeos de sHASEGP, o ácido nucléico contendo toda ou uma porção da seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo de sHASEGP pode ser inserido em um vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da seqüência de codificação de proteína inserida. Os sinais de transcrição e tradução necessários podem também ser fornecidos pelo promotor nativo para os genes sHASEGP e/ou suas regiões de flanqueamento.
[00268] São também providos vetores que contêm ácido nucléico codificando as sHASEGPs que podem ser introduzidos em um sistema de expressão capaz de produzir uma sHASEGP ativa neutra solúvel.
[00269] Células contendo os vetores são também providas. As células incluem células eucarióticas e procarióticas, e os vetores adequados para uso nelas.
[00270] Células eucarióticas, incluindo Células de Ovário de Hamster Chinês deficientes em diidrofolato redutase (DG44), contendo os vetores são providas. Células adequadas incluem células de levedura, células fúngicas, células de planta, células de inseto e células animais. As células são usadas para produzir um polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio Hialuronidase através de (a) cultivo das células acima descritas sob condições com o que o polipeptídeo de sHASEGP ou o domínio Hialuronidase do polipeptídeo de sHASEGP é expresso pela célula, e então (b) recuperação da proteína de domínio Hialuronidase expresso. Nas modalidades exemplificadas, o domínio Hialuronidase é secretado no meio.
[00271] Em uma modalidade, os vetores que incluem uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade Hialuronidase e contém todo ou uma porção apenas do domínio Hialuronidase, ou cópias múltiplas dele, de uma proteína sHASEGP são providos. São também providos vetores que compreendem uma seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio Hialuronidase e porções adicionais de uma proteína sHASEGP até e incluindo uma proteína sHASEGP de comprimento completo, bem como cópias múltiplas dele, são também providos. Os vetores podem ser selecionados para expressão de uma proteína sHASEGP ou domínio Hialuronidase dela na célula ou tal que a proteína sHASEGP seja expressa como uma proteína secretada. Alternativamente, os vetores podem incluir sinais necessários para secreção de proteínas codificadas. Quando o domínio Hialuronidase é expresso o ácido nucléico é ligado a ácido nucléico codificando um sinal de secreção, tal como a Saccharomyces cerevisiae, uma seqüência de sinal de fator de emparceiramento (mating) ou uma porção dela, ou a seqüência de sinal nativa.
[00272] A fim de gerar uma sHASEGP neutra ativa, solúvel, células capazes de introdução de glicosilação N- ligada são requeridas. Na modalidade preferida, células de Ovário de Hamster Chinês de mamífero deficientes em diidrofolato redutase tal como DG44, são eletroforadas com um plasmídeo codificando um promotor de mamífero forte, tal como CMV, ácido nucléico codificando uma sHASEGP seguido por um sítio de entrada ribossomal interno, o gene de diidrofolato redutase de camundongo e a seqüência de poliadenilação de SV40 conforme mostrado na SEQ ID NO:51. Tais células são então culturadas em meio quimicamente definido na ausência de hipoxantina e timidina, seguido por amplificação de gene adicional com concentrações altas de metotrexato.
[00273] Uma variedade de sistemas hospedeiro- vetor pode ser usada para expressar a seqüência de codificação da proteína. Esses incluem mas não estão limitados a sistemas de célula de mamífero infectados com vírus, por exemplo, vírus vaccínia, adenovírus, etc); sistemas de célula de inseto infectados com vírus (por exemplo, baculovírus); microorganismos tal como vetores de levedura contendo levedura; ou bactérias transformadas com bacteriófago, DNA, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo. Os elementos de expressão de vetores variam em suas resistência e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro-vetor usado, qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados pode ser usado. Note que a expressão bacteriana de DNA de sHASEGP não vai resultar em uma sHASEGP cataliticamente ativa per se, mas quando combinada com maquinário de glicosilação apropriado pode ser artificialmente glicosada como tal.
[00274] Quaisquer métodos conhecidos daqueles versados na técnica para a inserção de fragmentos de ácido nucléico em um vetor podem ser usados para construir vetores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais de controle transcripcionais/traducionais e seqüências de codificação de proteína apropriados. Esses métodos podem incluir técnicas de DNA recombinante in vitro e sintéticas e recombinantes in vivo (recombinação genética). Expressão de seqüências de ácido nucléico codificando polipeptídeo de sHASEGP, ou seus domínios, derivados, fragmentos ou homólogos, pode ser regulada por uma segunda seqüência de ácido nucléico de modo que os seus genes ou fragmentos são expressos em um hospedeiro transformado com a molécula(s) de DNA recombinante. Por exemplo, expressão das proteínas pode ser controlada através de qualquer promotor/aumentador conhecido na técnica. Em uma modalidade específica, o promotor não é nativo dos genes para polipeptídeo de sHASEGP. Promotores que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, promotor early de SV40 (Bernoist e Chambon, Nature 290:304-310 (1981) o promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus sarcoma Rous (Yamamoto e outros, Cell22:789-797 (1980) o promotor de timidina cinase do herpes (Wagner e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981) as seqüências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster e outros, Nature 296:39-42 (1982)); vetores de expressão procarióticos tal como promotor de β-lactamase (Villa-Kamaroff e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:37273731 (1978)) ou o Promotor TAC (Deboer e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); vide também "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": em Scientific American 242:7994 (1980)); vetores de expressão de planta contendo o promotor de opalina sintetase (Herrera-Estrella e outros, Nature 303:209-213 (1984)) ou o promotor de RNA do vírus do mosaico da couve-flor 35S (Gardner e outros, Nucleic Acids RES. 9:2871 (1981) e o promotor da enzima fotossintética ribulose bifosfato carboxilase (Herrera-Estrella e outros, Nature 310:115-120 (1984); elementos promotores de levedura e outros fungos tal como o promotor de Gal4, o promotor de álcool desidrogenase e o promotor de fosfoglicerol cinase, o promotor de fosfatase alcalina e as regiões de controle transcripcional de animal que seguem que exibem especificidade de tecido e têm sido usadas em animais transgênicos: região de controle de gene elastase I que é ativa em células acinares pancreáticas (Swift e outros, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz e outros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); Macdonald, Hepatology 7:425515 (1987)); região de controle de gene de insulina que é ativa em células beta pancreáticas (Hanahan e outros, Nature 315:115-122 (1985)), região de controle de gene de imunoglobulina que é ativa em células linfóides (Grosschedl e outros, Cell 38:647-658 (1984); Adams e outros, Nature 318:533-538 (1985); Alexander e outros, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444 (1987)), região de controle de vírus de tumor mamífero de camundongo que é ativa em células testiculares, de mama, linfóides e masto (Leder e outros, CELL 45:485-495 (1986)), região de controle do gene de albumina que é ativa em fígado (PINCKERT e outros, Genes and Devel. 1:268-276 (1987)), região de controle de gene alfa-fetoproteína que é ativa em fígado (Krumlauf e outros, Mol. Cell. Biol. 5:16391648 (1985); Hammer e outros, Science 235:53-58 (1987)), região de controle de gene de alfa-1 antitripsina que é ativa em fígado (Kelsey e outros, Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), região de controle de gene beta globina que é ativa em células mielóide (Mogram e outros, Nature 315:338-340 (1985); Kollias e outros, Cell 46:89-94 (1986)), região de controle de gene de proteína básica mielina que é ativa em células oligodendrócito do cérebro (Readhead e outros, Cell 48:703-712 (1987)), região de controle de gene 2 de cadeia leve de miosina que é ativa em músculo esqueletal (Sani, Nature 314:283-286 (1985)) e região de controle de gene de hormônio de liberação gonadotrópico que é ativa em gonadrotofos do hipotálamo (Mason e outros, Science 234:1372-1378 (1986)).
[00275] Em uma modalidade específica, um vetor é usado o qual contém um promotor operavelmente ligado a ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo de sHASEGP, ou seu domínio, fragmento, derivado ou homólogo, uma ou mais origens de replicação, e, opcionalmente, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, gene de resistência a antibiótico).
[00276] Sinais de iniciação específicos podem ser também requeridos para tradução eficiente de uma seqüência de sHASEGP. Esses sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüências adjacentes. Nos casos onde sHASEGP, seu códon de iniciação e seqüências a montante estão inseridos no vetor de expressão apropriado, quaisquer sinais de controle de tradução adicionais podem ser necessários. No entanto, em casos onde apenas seqüência de codificação, ou uma porção dela, está inserida, sinais de controle transcripcional exógenos incluindo o códon de iniciação ATG devem ser providos. Ainda, o códon de iniciação deve esta na estrutura de leitura correta para assegurar transcrição do toda a inserção. Elementos transcripcionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, ambas natural e sintética. A eficiência de expressão pode ser aumentada através da inclusão de aumentadores apropriados ao sistema de célula em uso (Scharf, D. e outros (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-62; Bittner e outros (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).
[00277] Ainda, uma linhagem de célula hospedeiro pode ser escolhida pela sua habilidade em modular a expressão das seqüências inseridas ou processar a proteína expressa da maneira desejada. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não estão limitadas a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Processamento pós-traducional que cliva uma forma "prepro" da proteína pode ser também importante para inserção, dobra e/ou função correta. Células hospedeiro diferentes tal como CHO (DG44, DXB11 CHO-K1), HeLa, MDCK, 293, WI38, etc, têm maquinário celular específico e mecanismos característicos para tais atividades pós-traducionais e podem ser escolhidas para assegurar modificação e processamento corretos da proteína estranha, introduzida.
[00278] Para produção de alto rendimento, a longo prazo, de proteínas recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens de célula que expressam estavelmente sHASEGP podem ser transformadas usando vetores de expressão que contêm origens de replicação virais ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Seguindo a introdução do vetor, células pode ser deixadas crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido antes delas serem mudadas para meios seletivos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite crescimento e recuperação de células que expressam com sucesso as seqüências introduzidas. Agrupamentos resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados usando técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula.
[00279] Qualquer número de sistemas de seleção pode ser usado para recuperar linhagens de célula transformadas. Esses incluem, mas não estão limitados a, genes de timidina cinase do vírus herpes simplex (Wigler, M. e outros (1977) Cell 11:223-32) e adenina fosforribosiltransferase ( Lowy, I. e outros, (1980) Cell 22:817-23) que podem ser empregados em células TK- ou APRT, respectivamente. Também, resistência a antimetabolito, antibiótico ou herbicida pode ser usada como a base para seleção; por exemplo, DHFR que confere resistência a metotrexato (Wigler, M. e outros (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina e G-418 (Colbere-Garapin, F. e outros (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) e als ou pat, que confere resistência a clorsulfuron e fosfinotricin acetiltransferase, respectivamente (Murry, supra). Genes selecionáveis adicionais foram descritos, por exemplo, trpB, que permitem que as células utilizem indol no lugar de triptofano, ou hisD, que permite que células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman, S.C. e R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). Recentemente, o uso de marcadores visíveis ganhou popularidade com tais marcadores como antacianinas, beta glucuronidase e seu substrato, GUS, e luciferase e seus substratos, luciferina, sendo amplamente usados não apenas para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão de proteína transiente ou estável atribuível a um sistema de vetor específico (Rhodes, C.A. e outros (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
IDENTIFICAÇÃO DE TRANSFORMANTES CONTENDO A SEQÜÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO
[00280] Embo ra a presença/ausência de expressão de gene marcador sugira que o gene de interesse está também presente, a presença e expressão de uma sHASEGP ativa devem ser confirmadas. Por exemplo, se a sHASEGP for inserida dentro de uma seqüência de gene marcador, células recombinantes contendo sHASEGP podem ser identificadas pela ausência de função de gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser posto em tandem com uma seqüência de sHASEGP sob o controle de um promotor único. Expressão do gene marcador em resposta à indução ou seleção geralmente indica expressão da sHASEGP em tandem também. Detecção de uma sHASEGP neutra ativa apropriadamente glicosilada pode ser determinada por meio de teste dos meios condicionados para atividade de enzima sHASEGP sob condições apropriadas.
PURIFICAÇÃO DE SHASEGP
[00281] Células hospedeiro transformadas com uma seqüência de nucleotídeo de sHASEGP podem ser culturadas sob condições adequadas para a expressão e recuperação da proteína codificada a partir da cultura de célula. A proteína produzida por uma célula recombinante é de preferência secretada mas pode estar contida intracelularmente dependendo da seqüência e/ou do vetor usado. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, vetores de expressão contendo sHASEGP podem ser produzidos com seqüências de sinal que facilitam secreção direta de sHASEGP através da membrana de célula procariótica ou eucariótica. Outras construções recombinantes podem unir sHASEGP à seqüência de nucleotídeo codificando um domínio de polipeptídeo que vai facilitar a purificação de proteínas solúveis (Kroll, D.J. e outros, (1993) DNA Cell Biol. 12:44153; cf discussão de vetores infra contendo proteínas de fusão).
[00282] SHASEGP pode ser também expressa como uma proteína recombinante com um ou mais domínios de polipeptídeo adicionais adicionados para facilitar a purificação de proteína. Tais domínios de facilitação de purificação incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de quelação de metal tal como módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de purificação por extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp. Seattle Wash). A inclusão de uma seqüência ligante clivável tal como Fator XA ou enterocinase (Invitrogen, São Diego, Califórnia) entre o domínio de purificação e sHASEGP é útil para facilitar purificação. Um tal vetor de expressão provê expressão de uma proteína de fusão aceitando uma sHASEGP e contém ácido nucléico codificando 6 resíduos de histidina seguido por tiorredoxina e um sítio de clivagem de enterocinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação em IMIAC (cromatografia de afinidade de íon de metal imobilizado conforme descrito em Porah e outros (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281) enquanto o sítio de clivagem de enterocinase provê um meio para purificação da quimiocina a partir da proteína de fusão.
[00283] Em adição à produção recombinante, fragmentos de sHASEGP podem ser produzidos através de síntese de peptídeo direta usando técnicas de fase sólida (vide, por exemplo, Stewart e outros (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, W.F. Freeman Co., São Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Síntese de proteína in vitro pode ser realizada usando técnicas manuais ou através de automação. Síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando o Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City Califórnia) de acordo com as instruções providas pelo fabricante. Vários fragmentos de sHASEGP podem ser quimicamente sintetizados separadamente e combinados usando métodos químicos para produzir a molécula de comprimento completo.
[00284] Veto res de expressão contendo as seqüências de codificação, ou suas porções, de um polipeptídeo de sHASEGP, são feitos, por exemplo, através de subclonagem das porções de codificação no sítio de restrição EcoRI de cada um dos três vetores PGEX (vetores de expressão de glutationa S-transferase (Smith e Johnson, Gene 7:31-40 (1988)). Isto permite a expressão de produdos na estrutura de leitura correta. Vetores e sistemas exemplares para expressão dos domínios Hialuronidase dos polipeptídeos de sHASEGP incluem os vetores Pichia bem-conhecidos (disponíveis, por exemplo, da Invitrogen, São Diego, CA), particularmente aqueles feitos para secreção das proteínas codificadas. A proteína pode ser também expressa citoplasmicamente, tal como nos corpos de inclusão. Um vetor exemplar é descrito nos exemplos.
[00285] Plasmídeos para transformacao de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vetores de expressão PET (vide Patente U.S. 4.952.496; disponíveis da Novagen, Madison, WI; vide também literatura publicada pela Novagem descrevendo o sistema).
[00286] Tais plasmídeos incluem pET 11a, que contém o promotor T761ac, terminador T7, o operador lac de E. coli induzível e o gene repressor lac; pET 12A-C, que contém o promotor T7, terminador T7 e o sinal de secreção de OMPT de E. coli; e pET 15B e PET19B (Novagen, Madison, Wi), que contém uma seqüência líder His-Tag para uso em purificação com uma coluna His e um sítio de clivagem de trombina que permite clivagem seguindo purificação na coluna; a região de promotor lac-T7 e o terminador T7.
[00287] Os vetores são introduzidos em células hospedeiras, tal como células Pichia e células bacterianas, tal como E. coli, e as proteínas expressas nelas. Cepas Pichia exemplares incluem, por exemplo, GS115. Hospedeiros bacterianos exemplares contêm cópias cromossômicas de DNA codificando polimerase de RNA T7 operavelmente ligada a um promotor induzível, tal como o promotor LACUV (vide Patente U.S. No. 4.952.496). Tais hospedeiros incluem, mas não estão limitados a, linhagem de E. coli lisogênica BL21 (DE3).
[00288] Os domínios, derivados e análogos de sHASEGP podem ser produzidos através de vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma vez uma célula expressando um polipeptídeo de sHASEGP, ou um seu domínio, fragmento ou derivado, sendo identificada, o produto de gene individual pode ser isolado e analisado. Isto é conseguido através de ensaios baseados nas propriedades físicas e/ou funcionais da proteína, incluindo, mas não limitado a, marcação radioativa do produto seguido por análise através de eletroforese de gel, imunoensaio, ligação cruzada a produto marcado com marcador e ensaios de atividade proteolítica.
[00289] Os polipeptídeos de sHASEGP podem ser isolados e purificados através de métodos padrão conhecidos na técnica (ou de fontes naturais ou de células hospedeiro recombinantes expressando os complexos ou proteínas), incluindo, mas não restrito à, cromatografia de coluna (por exemplo, troca de ferro, afinidade, exclusão de gel, pressão alta de fase reversa e líquido de proteína rápido), centrifugação diferencial, solubilidade diferencial ou através de outra técnica padrão usada para a purificação de proteínas.
[00290] Em uma modalidade, uma sHASEGP pode ser purificada para homogeneidade a partir dos meios condicionados quimicamente definidos de células DG44 transfectadas com HZ24 e amplificadas com metotrexato através de 1) diafiltragem de fluxo tangencial, 2) ligação e eluição de cromatografia de troca de âniona, 3) fluxo através de cromatografia de fenil sefarose, 4) ligação e eluição a partir de cromatografia de fenilboronato e 4) ligação e eluição com cromatografia de hidroxiapatita.
[00291] Propriedades funcionais podem ser avaliadas usando qualquer ensaio adequado conhecido na técnica.
[00292] Alternativamente, uma vez o polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio ou derivado sendo identificado, a seqüência de aminoácido da proteína pode ser deduzida da seqüência de nucleotídeo do gene que a codifica. Como resultado, a proteína ou seu domínio ou derivado pode ser sintetizado através de métodos químicos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, vide Hunkapiller e outros, Nature 310:105-111 (1984)) seguido por glicosilação in vitro.
[00293] Manipulações de seqüências de polipeptídeo de sHASEGP podem ser feitas no nível de proteína. Também compreendidas aqui são proteínas de polipeptídeo de sHASEGP, seus domínios, seus derivados ou análogos ou fragmentos, que são diferencialmente modificados durante ou após tradução, por exemplo, através de glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, peguilação, derivatização através de grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligante celular.
[00294] Qualque r uma de várias modificações químicas pode ser realizada através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitado a, clivagem química específica através de brometo de cianogênio, tripsina, quimiotripsina, papaína, V8, NABH4, acetilação, formilação, oxidação, redução, síntese metabólica na presença de tunicamicina e outros tais agentes.
[00295] Ainda, domínios, análogos e derivados de um polipeptídeo de sHASEGP podem ser quimicamente sintetizados. Por exemplo, um peptídeo correspondendo a uma porção de um polipeptídeo de sHASEGP, que inclui o domínio desejado ou que faz a mediação da atividade desejada in vitro, pode ser sintetizado através do uso de um sintetizador de peptídeo.
[00296] Ainda, se desejado, aminoácidos não- clássicos ou análogos de aminoácido químicos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição na seqüência de polipeptídeo de sHASEGP. Aminoácidos não-clássicos incluem mas não estão limitados aos isômeros D dos aminoácidos comuns, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, E-ABU, e-Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2-amino butírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t- butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, β-alanina, fluor-aminoácidos, aminoácidos designer tal como β-metil aminoácidos, metil aminoácidos de na, metil aminoácidos de na e análogos de aminoácidos em geral. Ainda, o aminoácido pode ser d (dextrorrotatório) ou l (levorrotatório).
[00297] Em casos onde produtos naturais são suspeitos de ser mutados ou são isolados de novas espécies, a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de sHASEGP isolado da fonte natural, bem como aqueles expressos in vitro, ou de vetores de expressão sintetizados in vitro ou in vivo, pode ser determinada a partir de análise da seqüência de DNA, ou, alternativamente, através de seqüenciamento direto da proteína isolada. Tal análise pode ser realizada através de seqüenciamento manual ou através do uso de um seqüenciador de aminoácido automático.
[00298] Modificações - Uma variedade de modificações dos polipeptídeos sHASEGP e domínios é compreendida aqui. Uma molécula de ácido nucléico codificando sHASEGP pode ser modificada através de qualquer uma de várias estratégias conhecidas na técnica (Sambrook e outros (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York). As seqüências podem ser clivadas em sítios apropriados com endonuclease(s) de restrição, seguido por modificação enzimática adicional se desejado, isoladas e ligadas in vitro. Na produção do gene codificando um domínio, derivado ou análogo de sHASEGP, deve-se ter cuidado em assegurar que o gene modificado retenha a estrutura de leitura traducional original, não-interrompida por sinais de parada traducional, na região do gene onde a atividade desejada é codificada.
[00299] Adi cionalmente, as moléculas de ácido nucléico codificando sHASEGP podem ser mutadas in vitro ou in vivo, para criar e/ou destruir seqüências de tradução, iniciação e/ou terminação, ou para criar variações nas regiões de codificação e/ou formar novos sítios de endonuclease de restrição ou destruir os pré-existentes, para facilitar modificação in vitro adicional. Também, conforme descrito aqui muteínas com alterações de seqüência primária, tal como substituições de resíduos Cys e eliminação ou adição de sítios de glicosilação, são compreendidas, a sHASEGP da SEQ ID NO:1 tem sete sítios de glicosilação potenciais. Tais mutações podem ser realizadas através de qualquer técnica para mutagênese conhecida no campo, incluindo, mas não limitado a, mutagênese química e mutagênese direcionada ao sítio in vitro (Hutchinson e outros, J. Biol. Chem. 253:6551-6558 (1978)), uso de Ligantes TABE (Pharmacia). Em uma modalidade, por exemplo, um polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio é modificado para incluir um marcador fluorescente. Em outras modalidades específicas, o polipeptídeo de sHASEGP é modificado para ter um reagente heterobifuncional, tais reagentes heterobifuncionais podem ser usados para ligar com cruzamento os membros do complexo.
[00300] Ainda, domínios, análogos e derivados de uma sHASEGP podem ser quimicamente sintetizados. Por exemplo, um peptídeo correspondendo a uma porção de uma sHASEGP, que inclui o domínio desejado ou que faz a mediação da atividade desejada in vitro, pode ser sintetizado através do uso de um sintetizador de peptídeo. Ainda, se desejado, análogos de aminoácidos não-clássicos ou de aminoácido químico podem ser introduzidos como uma substituição ou adição na seqüência de sHASEGP. Aminoácidos não-clássicos incluem, mas não estão limitados aos, isômeros D dos aminoácidos comuns, ácido α-amino isobutírico, ácido 4- aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, S-ABU, e-Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t- butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, β-alanina, fluor-aminoácidos, aminoácidos designer tal como metil aminoácidos de ti, metil aminoácidos de ca, metil metil aminoácidos de na, e análogos de aminoácido em geral. Ainda, o aminoácido pode ser d (dextrorrotatório) ou l (levorrotatório).
F. GERAÇÃO DE UMA SHASEGP GLICOSILADA FUNCIONALMENTE ATIVA COM PORÇÕES AÇÚCAR N-LIGADAS
[00301] SHASEGP humana apropriadamente N- glicosilada é requerida para gerar uma proteína cataliticamente estável. Glicosilação N-ligada de sHASEGP pode ser obtida através de várias técnicas. Glicosilação de sHASEGP pode ser obtida através da introdução de ácidos nucléicos codificando sHASEGP em células de origem eucariótica capazes de glicosilação N-ligada apropriada ou, alternativamente, através de contato de polipeptídeo de sHASEGP com extratos livres de célula ou enzimas purificadas capazes de introdução das porções açúcar N-ligadas desejadas.
SELEÇÃO DE UM SISTEMA DE EXPRESSÃO
[00302] Sist emas de expressão de célula eucariótica variam no grau e tipo de glicosilação que eles introduzem em um polipeptídeo ectopicamente expresso. Células de CHO são, por exemplo, altamente eficientes na introdução de glicosilação N-ligada em um polipeptídeo de sHASEGP ativo.
[00303] Sist emas de expressão eucarióticos adicionais que introduzem glicosilação N-ligada para gerar um produto de sHASEGP funcional podem ser testados através da introdução de um plasmídeo de expressão de sHASEGP nas ditas células e teste quanto à atividade neutra. Glicosilação N-ligada apropriada pode ser determinada por meio de análise FACE de oligossacarídeos liberados de PNGASE. Perfis de glicosilação de sHASEGPs cataliticamente ativas são providos mais aqui. Verificação de glicosilação pode ser também feita através de tratamento de sHASEGP das ditas células com um PNGASE-F ou através de cultivo de tais células em tunicamicina seguindo introdução de ácidos nucléicos codificando sHASEGP.
[00304] N-glicosilação de polipeptídeo de sHASEGP in vitro. O polipeptídeo de sHASEGP pode ser N- glicosilado através de contato de polipeptídeo de sHASEGP com extratos livres de célula contendo atividade capaz de transferir açúcares N-ligados para polipeptídeo de sHASEGP tal como membranas microssomais caninas ou através de transcrição e tradução acopladas como é comercialmente disponível (Promega Madison WI).
[00305] Oligossacarídeos são considerados ter uma extremidade de redução e uma extremidade de não-redução, seja ou não o sacarídeo na extremidade de redução de fato um açúcar de redução. De acordo com a nomenclatura aceita, oligossacarídeos são mostrados aqui com a extremidade de não-redução à esquerda e a extremidade de redução à direita. Todos os oligossacarídeos descritos aqui são descritos com o nome ou abreviação para o sacarídeo de não-redução (por exemplo, Gal), seguido pela configuração da ligação glicosídica (.alfa. ou .beta.), da ligação do anel, da posição do anel do sacarídeo de redução envolvido na ligação, e então o nome ou abreviação do sacarídeo de redução (por exemplo, GlcNAc). A ligação entre dois açúcares pode ser expressa, por exemplo, como 2,3 2.fw darw.3 ou (2,3). Cada sacarídeo é uma piranose.
[00306] Conforme aqui usado, porção açúcar N- ligada refere-se a um oligossacarídeo ligado a uma sHASEGP através do nitrogênio amida de resíduos Asn. Oligossacarídeos N-ligados se encaixam em vários tipos principais (oligomanose, complexo, híbrido, sulfatado), todos eles têm núcleos 3-GlcNAc-GlcNAc (Man) ligados através da nitrogênio amida de resíduos Asn que se encaixam nas seqüências -Asn-Xaa-Thr/Ser (onde Xaa não é Pro). Sítios N- ligados são freqüentemente indiretamente designados pela aparência de um ciclo "vazio" durante o seqüenciamento. Identificação positiva pode ser feita após aplicação do oligossacarídeo pela PNGase F, que converte o Asn glicosilado em Asp. Após aplicação de PNGase F, oligossacarídeos N- ligados podem ser purificados usando cromatografia Bio-Gel P-6, com o grupo de oligossacarídeo submetido à cromatografia de troca de ânion de pH alto (HPAEC) (Townsend e outros (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Certos isômeros de oligossacarídeo podem ser separados usando HPAEC. Resíduos de Fucose vão mudar posições de eluição mais cedo no cromatograma de HPAEC, enquanto resíduos de ácido siálico adicionais vão aumentar o tempo de retenção. Tratamento concomitante de glicoproteínas cujas estruturas de oligossacarídeo são conhecidas (por exemplo, fetuína bovina, glicoproteína ácida a-1), ovalbumina, RNAse B, transferrina) pode facilitar a determinação de picos de oligossacarídeo. Os oligossacarídeos coletados podem ser caracterizados através de uma combinação de análises composicional e de ligação metilação (Waegheet e outros (1983) Carbohydr. Res. 123, 281-304), com configurações anoméricas determinadas através de espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) em Methods Enzymol 230).
[00307] Alternativamente, oligossacarídeos podem ser identificados através de eletroforese de carboidrato auxiliada por fluorescência (FACE) Callewaert e outros (2001) Glycobiology 11, 275,281.
G. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PORÇÕES AÇÚCAR N-LIGADAS EM sHASEGP
[00308] Determinar se uma proteína é de fato glicosilada é a etapa inicial em análise de glicano de glicoproteína. Eletroforese de gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) se tornou o método de escolha como a etapa final antes do seqüenciamento de proteína. Proteínas glicosiladas freqüentemente migram como faixas difusas através de SDS-PAGE. Uma diminuição acentuada em largura de faixa e mudança em posição de migração após tratamento com peptídeo-N4-(N-acetil-D- glicosaminil)asparagina amidase (PNGase F) são consideradas diagnóstico de glicosilação N-ligada. Se os outros tipos de glicosilação forem predominantes outras abordagens devem ser usadas. Métodos de blotting de lecitina provêem uma abordagem que é independente da classe de glicosilação (N versus O). Lectinas, proteínas de ligação de carboidrato de vários tecidos de planta, têm ambos alta afinidade e especificidade estreita para uma ampla faixa de epitopos de açúcar definidos encontrados em glicanos de glicoproteínas (Cummings, R.D. (1994) Methods in Enzymol, 230, 66-86). Quando conjugadas com biotina ou digoxigenina, elas podem ser facilmente identificadas em blots de membrana através de uma reação colorimétrica utilizando anticorpos avidina ou anti- digoxigenina conjugados com fosfatase alcalina (Haselbeck e outros (1993) Methods in Mol. Biol. 14, 161-173), análogo a reações de anticorpo secundário-fosfatase alcalina empregadas em Western blotting. Avaliação com um painel de lectinas com especificidade bem definida pode prover informação considerável sobre o complemento carboidrato da glicoproteína. Importante, a amplificação de desenvolvimento de cor é suficientemente alta que 10-50 ng de uma glicoproteína podem ser facilmente vistos em um blot de membrana em um SDS-PAGE. Embora lectinas exibam afinidade muito alta para seus ligantes cognatos, algumas realmente revelam significantemente avidez para epitopos estruturalmente relacionados. Deste modo, é importante notar com cuidado a possibilidade de reatividade cruzada quando escolhendo um painel de lectinas e aplicar aquelas com a probabilidade mais alta de individualmente distinguir glicanos N-ligados complexos, híbridos e com muita manose a partir de estruturas O-ligadas.
[00309] Análise de monossacarídeo pode ser também usada para determinar se sHASEGP é glicosilada e como no caso de análise de lectina provê informação adicional sobre características estuturais. Análise de composição de monossacarídeo quantitativa i) identifica proteínas glicosiladas, ii) dá a razão molar de açúcares individuais para proteína, iii) sugere, em alguns casos, a presença de classes de oligossacarídeo, iv) é a primeira etapa na designação de uma estratégia de elucidação estrutural e v) provê uma medida de consistência de produção para agentes terapêuticos de glicoproteína recombinante. Nos últimos anos, cromatografia de troca de ânion de alto pH com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) tem sido extensivamente usada para determinar composição de monossacarídeo (Townsend e outros (1985) em Carbohydrate Analysis: High-desempenho liquid chromatography and capillary electrophoresis (Z. El Rassi ed.) pp. 181-209). Mais recentemente, métodos de marcação baseados em fluoróforo foram introduzidos e muitos estão disponíveis em forma de estojo. Uma vantagem distinta de métodos fluorescentes é um aumento na sensibilidade (50 vezes). Uma vantagem potencial é que monossacarídeos diferentes podem demonstrar seletividade diferente para o fluoróforo durante a reação de acoplamento, ou no hidrolisato ou na mistura padrão externa. No entanto, o aumento na sensibilidade e habilidade em identificar quais monossacarídeos estão presentes a partir de uma porção pequena da quantidade total de glicoproteína disponível, bem como o potencial para sensibilidade maior usando fluorescência induzida por laser, torna esta abordagem atraente.
[00310] Análise de composição de monossacarídeo de quantidades pequenas de sHASEGP é melhor realizada em membranas PVDF (PSQ), após ou eletroblotting (Weitzhandleret e outros, (1993) J. Biol. Chem. 268, 5121-5130) ou se alíquotas menores tiverem que ser analisadas em dot blots. PVDF é uma matriz ideal para análise de carboidrato uma vez que nem mono- ou oligossacarídeos se ligam à membrana, uma vez liberados através de hidrólise ácida ou enzimática.
[00311] Análise FACE é um meio eficiente de detecção de perfis de glicosilação de sHASEGPs. FACE® N- Linked Oligosaccharide Profiling (Prozyme) com 30% de géis de oligossacarídeo é um tal mecanismo. Oligossacarídeos clivados a partir de 100 μg de glicoproteínas através de digestão enzimática com N-Glicanase (a.k.a. PNGase), marcados usando o fluorforo ANTS, e separados através de eletroforese podem ser usados para detecção de perfis de glicosilação de sHASEGP. As posições relativas das faixas de oligossacarídeo são determinadas administrando a amostra e diluições da amostra ao longo de uma escala padrão de oligossacarídeo que designa a distância de migração em unidades de Grau de Polimerização (DP).
H. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS QUE MODULAM A ATIVIDADE DE SHASEGP
[00312] Vári os tipos de ensaios são exemplificados e descritos aqui. É compreendido que os domínios Hialuronidase podem ser usados em outros ensaios. É mostrado aqui, no entanto, que os domínios hialuronidase exibem atividade catalítica.
[00313] Deste modo eles são ideais para ensaios de avaliação in vitro.
[00314] Eles podem ser também usados em ensaios de ligação.
[00315] Os zimógenos de comprimento completo, enzimas ativadas e domínios Hialuronidase de sHASEGP são compreendidos para uso em qualquer ensaio de avaliação conhecido daqueles versados na técnica, incluindo aqueles providos aqui. Então a descrição que segue, se direcionada a ensaios de Hialuronidase, é pretendida aplicar ao uso de um domínio Hialuronidase de cadeia simples ou uma porção cataliticamente ativa dele de qualquer Hialuronidase, incluindo uma sHASEGP. Outros ensaios, tal como ensaios de ligação são providos aqui, particularmente para uso com uma sHASEGP, incluindo quaisquer variantes, tal como suas variantes unidas.
I. Ensaios catalíticos para identificação de agentes que modulam a atividade de Hialuronidase de uma proteína sHASEGP.
[00316] Métodos para identificação de um modulador da atividade catalítica de uma sHASEGP, particularmente um domínio Hialuronidase de cadeia simples ou sua porção cataliticamente ativa, são providos aqui. Os métodos podem ser praticados através de: contato da sHASEGP, uma forma zimógena ou ativada de comprimento completo, e particularmente um seu domínio de cadeia simples, com um substrato da sHASEGP na presença de uma substância de teste, e detecção da proteólise do substrato, com o que a atividade da sHASEGP é avaliada, e comparação da atividade com um controle. Por exemplo, um controle pode ser a atividade da sHASEGP avaliada através de contato de uma sHASEGP, incluindo uma forma de zimógeno ou ativada de comprimento completo, e particularmente um seu domínio de cadeia simples, particularmente um seu domínio de cadeia simples, com um substrato da sHASEGP, e detecção da proteólise do substrato, com o que a atividade da sHASEGP é avaliada. Os resultados na presença e ausência dos compostos de teste são comparados. Uma diferença na atividade indica que a substância de teste modula a atividade da sHASEGP. Ativadores de clivagem de ativação de sHASEGP são também compreendidos; tais ensaios são discutidos abaixo.
[00317] Em uma modalidade, uma pluralidade das substâncias de teste é avaliada simultaneamente no método de avaliação acima. Em uma outra modalidade, a sHASEGP é isolada de uma célula alvo como um meio para então identificar agentes que são potencialmente específicos para a célula alvo.
[00318] Em uma outra modalidade, uma substância de teste é um composto terapêutico, e com o que uma diferença da atividade de sHASEGP medida na presença e na ausência de uma substância de teste indica que a célula alvo responde ao composto terapêutico.
[00319] Um método inclui as etapas de (a) contato do polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio Hialuronidase com um ou uma pluralidade de compostos de teste sob condições que conduzem à interação entre o ligante e os compostos; e (b) identificação de um ou mais compostos na pluralidade que especificamente se liga ao ligante.
[00320] Um outro método provido aqui inclui as etapas de a) contato de um polipeptídeo de sHASEGP ou um seu domínio Hialuronidase com um substrato do polipeptídeo de sHASEGP, e detecção da degradação de substrato, com o que a atividade do polipeptídeo de sHASEGP é avaliada; b) contato do polipeptídeo de sHASEGP com um substrato do polipeptídeo de sHASEGP na presença de uma substância de teste, e detecção da degradação do substrato, com o que a atividade do polipeptídeo de sHASEGP é avaliada; e c) comparação da atividade do polipeptídeo de sHASEGP avaliada nas etapas a) e b), com o que a atividade medida na etapa a) difere da atividade medida na etapa b) indica que a substância de teste modula a atividade do polipeptídeo de sHASEGP.
[00321] Em uma outra modalidade, uma pluralidade das substâncias de teste é avaliada simultaneamente. Na comparação da atividade de um polipeptídeo de sHASEGP na presença e ausência de uma substância de teste para avaliar se a substância de teste é um modulador do polipeptídeo de sHASEGP, é desnecessário avaliar a atividade em paralelo, embora tal medição paralela seja típica. É possível medir a atividade do polipeptídeo de sHASEGP em um ponto de tempo e comparar a atividade medida com um valor histórico da atividade do polipeptídeo de sHASEGP.
[00322] Por exemplo, uma pessoa pode medir a atividade do polipeptídeo de sHASEGP na presença de uma substância de teste e comparar com valor histórico da atividade do polipeptídeo de sHASEGP medido anteriormente na ausência da substância de teste, e vice versa. Isto pode ser realizado, por exemplo, provendo a atividade do polipeptídeo de sHASEGP em um panfleto provido com um estojo para realizar o ensaio.
[00323] Métodos para seleção de substratos para uma sHASEGP particular são descritos nos EXEMPLOS, e ensaios Hialuronidase particulares são exemplificados.
[00324] Combinações e estojos contendo as combinações opcionalmente incluindo instruções para realização dos ensaios são providos. As combinações incluem um polipeptídeo de sHASEGP e um substrato do polipeptídeo de sHASEGP a ser ensaiado; e, opcionalmente reagentes para detecção de proteólise do substrato. Os substratos, que podem ser moléculas cromogênicas ou fluorgênicas, incluindo glicosaminoglicanos, submetidos à proteólise por um polipeptídeo de sHASEGP particular, podem ser identificados empiricamente através de teste da habilidade do polipeptídeo de sHASEGP em clivar o substrato de teste. Substratos que são clivados mais eficazmente, isto é, nas concentrações menores e/ou taxas mais rápidas ou sob condições desejáveis, são identificados.
[00325] É adicionalmente provido aqui um estojo contendo a combinação acima descrita. O estojo inclui opcionalmente instruções para identificação de um modulador da atividade de um polipeptídeo de sHASEGP. Qualquer polipeptídeo de sHASEGP é compreendido como alvo para identificação de moduladores de sua atividade.
J. Ensaios de ligação. São também providos aqui métodos para identificação e isolamento de agentes, particularmente compostos que se ligam à sHASEGP.
[00326] Os ensaios são feitos para identificar agentes que se ligam ao domínio Hialuronidase isolado (ou uma proteína, outra que não um polipeptídeo de sHASEGP, que contenha o domínio Hialuronidase de um polipeptídeo de sHASEGP), e a sua forma ativada, incluindo a forma ativada derivada do zimogeno de comprimento completo ou de um domínio Hialuronidase estendido. Os compostos identificados são candidatos ou levam à identificação de compostos para tratamentos de distúrbios e doenças envolvendo atividade de Hialuronidase aberrante. Os polipeptídeos de sHASEGP usados nos métodos incluem qualquer polipeptídeo de sHASEGP conforme aqui definido, incluindo o domínio Hialuronidase de cadeia simples de sHASEGP ou sua porção proteoliticamente ativa.
[00327] Uma variedade de métodos é provida aqui. Esses métodos podem ser realizados em reações em solução ou em fase sólida onde o(s) polipeptídeo(s) de sHASEGP ou seu(s) domínio(s) Hialuronidase são ligados, ou direta ou indiretamente através de um ligante, a um apoio sólido. Ensaios de secreção são descritos nos Exemplos, e esses ensaios foram usados para identificar compostos candidatos.
[00328] P ara os presentes propósitos, todos os ensaios de ligação descritos acima são providos para sHASEGP.
[00329] Métodos para identificação de um agente, tal como um composto, que especificamente se liga a um domínio Hialuronidase de cadeia simples de sHASEGP, uma sHASEGP ativada de comprimento completo ou seu domínio Hialuronidase de duas cadeias são providos aqui. O método pode ser praticado através de (a) contato da sHASEGP com uma pluralidade de agentes de teste sob condições que conduzam à ligação entre a sHASEGP e um agente; e (b) identificação de um ou mais agentes dentro da pluralidade que especificamente se liga à sHASEGP.
[00330] Por exemplo, na prática de tal método o polipeptídeo de sHASEGP é misturado com um contraparte de ligação potencial ou um extrato ou fração de uma células sob condições que permitem a associação de contrapartes de ligação potenciais com o polipeptídeo. Após mistura, os peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou outras moléculas que se tornaram associados a uma sHASEGP são separados da mistura. O contraparte de ligação que se liga à sHASEGP pode ser então removido e analisado mais. Para identificar e isolar um contraparte de ligação, a proteína toda, por exemplo, a proteína toda descrita da SEQ ID No. 1, pode ser usada. Alternativamente, um fragmento da proteína pode ser usado.
[00331] Uma variedade de métodos pode ser usada para se obter extratos celulares ou fluidos do corpo, tal como sangue, soro, urina, suor, fluido sinovial, CSF e outros tais fluidos.
[00332] Por exemplo, as células podem ser rompidas usando métodos de rompimento ou físicos ou químicos. Exemplos de métodos de rompimento físicos incluem, mas não estão limitados a, sonificação e cisalhamento mecânico. Exemplos de métodos de lise química incluem, mas não estão limitados a, lise de detergente e lise de enzima. Um versado na técnica pode prontamente adaptar métodos para preparação de extratos celulares a fim de se obter extratos para uso nos presentes métodos.
[00333] Uma vez um extrato de uma célula sendo preparado, o extrato é misturado com a sHASEGP sob condições onde a associação da proteína com a ligação contraparte de pode acontecer. Uma variedade de condições pode ser usada, incluindo condições que lembram condições encontradas no citoplasma de uma célula humana ou em um fluido do corpo, tal como sangue. Características, tal como oslmolaridade, pH, temperatura e a concentração de extrato celular usado, podem ser variadas para otimizar a associação da proteína com par em particular. Similarmente, métodos para isolamento de moléculas de interesse dos fluidos do corpo são conhecidos.
[00334] Após mistura sob condições apropriadas, o complexo ligado é separado da mistura. Uma variedade de técnicas pode ser usada para separar a mistura. Por exemplo, anticorpos específios para uma sHASEGP podem ser usados para imunoprecipitar o complexo de contraparte de ligação. Alternativamente, técnicas de separação química padrão tal como cromatografia e centrifugação de densidade/sedimento podem ser usadas.
[00335] Após remoção dos constituintes celulares não-associados nos extratos, o contraparte de ligação pode ser dissociado do complexo usando métodos convencionais. Por exemplo, dissociação pode ser realizada alterando a concentração de sal ou pH da mistura.
[00336] Para auxiliar na separação de pares de contraparte de ligação associados do extrato da mistura, a sHASEGP pode ser imobilizada em um apoio sólido. Por exemplo, a proteína pode ser ligada a uma matriz de nitrocelulose ou contas acrílicas. Ligação da proteína ou um seu fragmento a um apoio sólido auxilia na separação de peptídeo/ pares de contraparte de ligação de outros constituintes encontrados no extrato. Os contrapartes de ligação identificados podem ser ou uma proteína única ou um complexo formado de duas ou mais proteínas.
[00337] Alternativamente, as moléculas de ácido nucléico codificando as Hialuronidades de cadeia simples podem ser usadas em um sistema de dois híbridos em levedura. O sistema de dois híbridos de levedura tem sido usado para identificar outros pares de contraparte de proteína e pode ser prontamente adaptado para empregar as moléculas de ácido nucléico aqui descritas.
[00338] Um outro ensaio de ligação in vitro, particularmente para uma sHASEGP, usa uma mistura de um polipeptídeo que contém pelo menos o domínio catalítico de uma dessas proteínas e um ou mais alvos de ligação ou substratos candidatos. Após incubação da mistura sob condições apropriadas, a habilidade da sHASEGP ou um seu fragmento de polipeptídeo contendo o domínio catalítlido em se ligar a ou interagir com o substrato candidato é avaliada. Para ensaios de ligação livres de células, um dos componentes inclui ou é acoplado a um marcador detectável. O marcador pode prover detecção direta, tal como radioatividade, luminescência, densidade óptica ou eletrônica, etc, ou detecção indireta tal como um marcador de epitopo, uma enzima, etc., uma variedade de métodos pode ser empregada para detectar o marcador dependendo da natureza do marcador e outros componentes do ensaio. Por exemplo, o marcador pode ser detectado ligado ao substrato sólido ou uma porção do complexo ligado contendo o marcador pode ser separada do substrato sólido, e o marcador depois detectado.
K. Detecção de sHASEGP de transdução de sinal, que é uma proteína ancorada à membrana, pode ser envolvida direta ou indiretamente em transdução de sinal diretamente como um receptor de superfície de célula ou indiretamente através de proteínas de ativação, tal como fatores de pró-crescimento que podem iniciar transdução de sinal.
[00339] Ainda, sHASEGP secretada, tal como o domínio solúvel de sHASEGP conforme descrito na SEQ ID NO:4, pode estar envolvida em transdução de sinal ou diretamente através de ligação a ou interagindo com um receptor de superfície de célula ou indiretamente através de proteínas de ativação, tal como fatores de pró-crescimento que podem iniciar a transdução de sinal. Ensaios para avaliação de transdução de sinal são bem-conhecidos daqueles versados na técnica, e podem ser adaptados para uso com o polipeptídeo de sHASEGP.
[00340] Ensaios para identificação de agentes que afetam ou alteram a transdução de sinal mediada direta ou indiretamente, tal como através de ativação de um fator de pró-crescimento, por uma sHASEGP, particularmente o comprimento completo ou uma porção suficiente para ancorar o domínio extracelular ou uma porção funcional dele de uma sHASEGP na superfície de uma célula são providos. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios baseados em transcrição onde modulação de um sinal transduzido é avaliada através da detecção de um efeito sobre uma expressão de um gene repórter (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.436.128).
L. Métodos para identificação de Agentes que Modulam a Expressão de um Ácido Nucléico codificando uma sHASEGP.
[00341] Uma outra modalidade provê métodos para identificação de agentes que modulam a expressão de um ácido nucléico codificando uma sHASEGP. Tais ensaios usam quaisquer meios disponíveis de monitoramento de mudanças no nível de expressão dos ácidos nucléicos codificando uma sHASEGP.
[00342] Formiatos de ensaio podem ser usados para monitorar a habilidade do agente em modular a expressão de um ácido nucléico codificando uma sHASEGP. Por exemplo, expressão de mRNA pode ser monitorada diretamente através de hibridização para os ácidos nucléicos. Também ensaios de enzima conforme descrito podem ser usados para detectar agentes que modulam a expressão de sHASEGP.
[00343] Linhagens de célula são expostas ao agente a ser testado sob condições e tempo apropriados e o RNA ou mRNA total é isolado através de procedimentos padrão (vide, por exemplo, Sambrook e outros (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Sondas para detectar diferenças em níveis de expressão de DNA entre células expostas ao agente e células de controle podem ser preparadas a partir de ácidos nucléicos. É típico, mas não necessário, fazer sondas que hibridizem apenas com ácidos nucléicos alvo sob condições de alta estringência. Apenas híbridos de ácido nucléico altamente complementares se formam sob condições de alta estringência. Deste modo, a estringência das condições de ensaio determina a quantidade de complementaridade que deve existir entre dois filamentos de ácido nucléico a fim de formar um híbrido. Estringência deve ser escolhida para maximizar a diferença em estabilidade entre a sonda: híbrido alvo e sonda potencial:híbridos não-alvo.
[00344] Por exemplo, fragmentos N e C terminais da sHASEGP podem ser expressos em bactérias e usados para pesquisar por proteínas que se liguem a esses fragmentos. Proteínas de fusão, tal como fusão de His-tag ou GST às regiões N ou C terminais da sHASEGP podem ser preparadas para uso como um substrato. Essas proteínas de fusão podem ser acopladas a, por exemplo, contas de Glutationa-Sepharose e então ensaiadas com lisatos de célula ou fluidos do corpo. Antes da lise, as células ou fluidos do corpo podem ser tratados com um agente candidato que pode modular uma sHASEGP ou proteínas que interagem com domínios nelas. Proteínas de lisato se ligando às proteínas de fusão podem ser separadas através de SDS-PAGE, isoladas e identificadas através de seqüenciamento de proteína ou espectroscopia de massa, como é sabido na técnica.
[00345] Sondas de anticorpo são preparadas através de imunização de hospedeiros mamíferos adequados em protocolos de imunização apropriados usando os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas se eles forem de comprimento suficiente (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais aminoácidos consecutivos do polipeptídeo de sHASEGP ou se requerido aumentar imunogenicidade, conjugados a veículos adequados. Métodos para preparação de conjugados imunogênicos com veículos, tal como albumina de soro bovino (BSA), hemocianina de keyhole limpet (KLH) ou outras proteínas veículos são bem-conhecidas na técnica. Em algumas circunstâncias, conjugação direta usando, por exemplo, reagentes carbodiimida pode ser eficaz; em outros casos reagentes de ligação tal como aqueles fornecidos pela Pierce Chemical Co., Rockford, IL, podem ser desejáveis para prover acessibilidade ao hapteno. Peptídeos hapteno podem ser estendidos ou no terminal amino ou carbóxi com um resíduo Cys ou interspersos com resíduos cisteína, por exemplo, para facilitar a ligação a um veículo.
[00346] Administração dos imunógenos é conduzida geralmente através de injeção durante um perído de tempo adequado e com uso de adjuvantes adequados, como é geralmente conhecido na técnica. Durante o programa de imunização, títulos de anticorpo são obtidos para determinar adequação de formação de anticorpo.
[00347] Anticorpos antipeptídeo podem ser gerados usando peptídeos sintéticos correspondendo aos, por exemplo, aminoácidos carbóxi terminais da sHASEGP.
[00348] Peptí deos sintéticos podem ser tão pequenos quanto 1-3 aminoácidos de comprimento, geralmente pelo menos 4 ou mais resíduos de aminoácido de comprimento. Os peptídeos podem ser acoplados à KHL usando métodos padrão e podem ser imunizados em animais, tal como coelhos ou ungulados. Anticorpos policlonais podem ser então purificados, por exemplo, usando contas Actigel contendo o peptídeo covalentemente ligado.
[00349] Embo ra o anti-soro policlonal produzido deste modo possa ser satisfatório para algumas aplicações, para composições farmacêuticas, uso de preparações monoclonais é geralmente feito. Linhagens de célula imortalizadas que secretam os anticorpos monoclonais desejados podem ser preparadas usando o método padrão para Kohler e outros (Nature 256:495-7 (1975)) ou modificações que afetem a imortabilizaçã de linfócitos ou células do baço, como é geralmente sabido. As linhagens de célula imortalizadas secretando os anticorpos desejados são avaliadas através de imunoensaio onde o antígeno é o peptídeo hapteno, polipeptídeo ou proteína.
[00350] Quando a cultura de célula imortalizada apropriada secretandoo anticorpo desejado é identificada, as células podem ser culturadas ou in vitro ou através de produção in vivo através de fluido ascites. De interesse particular são anticorpos monoclonais que reconhecem o domínio catalítico ou sítio de clivagem de ativação (região) de uma sHASEGP.
[00351] Os anticorpos ou fragmentos podem ser também produzidos. Regiões que se ligam especificamente às regiões desejadas de receptor podem ser também produzidas no contexto de quimeras com origem de espécie múltipas.
[00352] Agentes que são ensaiados no método acima podem ser aleatoriamente selecionados ou racionalmente selecionados ou produzidos.
[00353] Os agentes podem ser, como exemplos, peptídeos, moléculas pequenas e carboidratos. Um versado na técnica pode reconhecer imediatamente que não há nenhum limite com relação à natureza estrutural dos agentes.
[00354] Os agentes peptídeo podem ser preparados usando métodos de síntese de peptídeo de fase sólida padrão (ou fase de solução), como é sabido na técnica. Ainda, o DNA codificando esses peptídeos pode ser sintetizado usando instrumentação de síntese de oligonucleotídeo comercialmente disponível e produzido recombinantemente usando sistemas de produção recombinante padrão. A produção usando síntese de peptídeo de fase sólida é necessitada se aminoácidos não- codificados por gene tiverem que ser incluídos.
I.MÉTODOS DE TRATAMENTO
[00355] SHASEGPs identificadas através dos presentes métodos são usadas para tratamento ou prevenção de acúmulos anormais de substratos de sHASEGP em um animal, particularmente um mamífero, incluindo um ser humano. Em uma modalidade, o método incliu administração a um mamífero de uma quantidade eficaz de uma glicoproteína sHASEGP, com o que a doença ou distúrbio é tratado ou prevenido.
[00356] Em uma outra modalidade, um inibidor de sHASEGP pode ser usado no tratamento de uma quantidade em excesso de atividade de hialuronidase neutra. O mamífero tratado pode ser um ser humano. Os inibidores providos aqui são aqueles identificados através dos ensaios de avaliação. Ainda, anticorpos e ácidos nucléicos de anti-sentido ou RNA de filamento duplo (dsRNA), tal como RNAi, são compreendidos.
1. Tratamento de anti-sentido:
[00357] Em uma modalidade específica, conforme acima descrito, função do polipeptídeo de sHASEGP é reduzida ou inibida pelos ácidos nucléicos de anti-sentido do peptídeo de sHASEGP, para tratar ou prevenir atividade de condroitinase excessiva. O uso terapêutico ou profilático de ácidos nucléicos de pelo menos seis nucleotídeos, geralmente até cerca de 150 nucleotídeos, que são de anti-sentido para um gene ou cDNA codificando polipeptídeo de sHASEGP ou uma porção dele é provido. Um ácido nucléico de "anti-sentido" de polipeptídeo de sHASEGP conforme aqui usado refere-se a um ácido nucléico capaz de hibridização para uma porção de um RNA de polipeptídeo de sHASEGP (geralmente mRNA) em virtude de um pouco de complementaridade de seqüência, e geralmente sob condições de alta estringência. O ácido nucléico de anti-sentido pode ser complementar a uma regiâo de codificação e/ou não-codificação de um mRNA de polipeptídeo de sHASEGP. Tais ácidos nucléicos de anti- sentido têm utilidade como agentes terapêuticos que reduzem ou inibem a função do polipeptídeo de sHASEGP, e podem ser usados no tratamento ou prevenção de distúrbios conforme descrito supra.
[00358] Os ácidos nucléicos de anti-sentido do polipeptídeo de sHASEGP são de pelo menos seis nucleotídeos e são geralmente oligonucleotídeos (variando de 6 a cerca de 150 nucleotídeos incluindo 6 a 50 nucleotídeos). A molécula de anti-sentido pode ser complementar a todo ou uma porção do domínio Hialuronidase. Por exemplo, o oligonucleotídeo é pelo menos de 10 nucleotídeos, pelo menos 15 nucleotídeos, de preferência pelo menos 20, 40, 80 a pelo menos 100 nucleotídeos, ou pelo menos 125 nucleotídeos. Os oligonucleotídeos podem ser DNA ou RNA ou suas misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas, de filamento simples ou filamento duplo. O oligonucleotídeo pode ser modificado na porção de base, porção açúcar ou estrutura principal de fosfato. O oligonucleotídeo pode incluir outros grupos apensos tal como peptídeos, ou agentes que facilitam o transporte através da membrana celular (vide, por exemplo, Letsinger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556 (1989); Lemaitre e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648652 (1987); Publicação PCT No. WO 88/09810, publicada em 15 de dezembro de 1988) ou barreira sangue-cérebro (vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 89/10134, publicada em 25 de abril de 1988), agentes de clivagem ativados por hibridização (vide, por exemplo, Krol e outros, BioTechniques 6:958-976 (1988)) ou agentes de intercalação (vide, por exemplo, Zon. Pharm. Res. 5:539-549 (1988).
[00359] O ácido nucléico de anti-sentido do polipeptídeo de sHASEGP geralmente é um oligonucleotídeo, tipicamente DNA ou RNA de filamento simples ou um seu análogo ou suas misturas. Por exemplo, o oligonucleotídeo inclui uma seqüência de anti-sentido para uma porção de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de sHASEGP humana. O oligonucleotídeo pode ser modificado em qualquer posição em sua estrutura com substituintes geralmente conhecidos na técnica.
[00360] O oligonucleotídeo de anti-sentido do polipeptídeo de sHASEGP pode incluir pelo menos uma porção de base modificada que é selecionada do grupo incluindo, mas não limitado, a 5-fluoruracila, 5-bromouracila, 5- clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina, xantina, 4- acetilcitosina, 5-(carboxiidroximetil)uracila, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracila, diidrouracina, beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2- metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5- metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, beta-d-manosilqueosina, 5-apos-metoxicar-boximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2- tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metil éster do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5- metil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-n-2-carboxipropil)uracila, (ACP3)w e 2,6-diaminopurina.
[00361] Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma porção açúcar modificada selecionada do grupo incluindo, mas não limitado a arabinose, 2-fluorarabinose, xilulose e hexose. O oligonucleotídeo pode incluir pelo menos uma estrutura principal de fosfato modificada selecionada de um fosforotioato, um fosforoditioato, um fosforamidotioato, uma fosforamida, um fosfordiamidato, um metilfosfonato, um alquil fosfotriéster e formacetal ou seu análogo.
[00362] O oligonucleotídeo pode ser um oligonucleotídeo a-anomérico. Um oligonucleotídeo a- anomérico forma híbridos de filamento duplo específicos com RNA complementar onde os filamentos correm paralelos um ao outro (Gautier e outros, Nucl. Acids. Res. 15:6625-6641 (1987)).
[00363] O oligonucleotídeo pode ser conjugado a uma outra molécula, tal como, mas não limitado a, um peptídeo; agente de ligação com cruzamento ativado por hibridização, agente de transporte ou um agente de clivagem ativado por hibridização. Os oligonucleotídeos podem ser sintetizados através de métodos padrão conhecidos na técnica, por exemplo, através do uso de um sintetizador de DNA automatizado (tal como são comercialmente disponíveis da Biosearch, Applied Biosystems, etc). Como exemplos, oligonucleotídeos de fosforotioato podem ser sintetizados através do método de Stein e outros, Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)), oligonucleotídeos de metilfosfonato podem ser preparados através do uso de apoios de polímero de vidro de poro controlado (Sarin e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448-7451 (1988)), etc. Em uma modalidade específica, o oligonucleotídeo de anti-sentido de polipeptídeo de sHASEGP inclui RNA catalítico ou uma ribozima (vide, por exemplo, Publicação Internacional PCT WO 90/11364, publicada em 4 de outubro de 1990; Sarver e outros, Science 247:1222-1225 (1990)). Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo é 2'- 0-metilribonucleotídeo (Inoue e outros, Nucl. Acids. Res. 15:6131-6148 (1987)), ou um análogo de RNA-DNA quimérico (Inoue e outros, FEBS Lett. 215:327-330 (1987)).
[00364] Alternativamente, o oligonucleotídeo pode ser um RNA de filamento duplo (dsRNA) tal como RNAi.
[00365] Em uma modalidade alternativa, o ácido nucléico de anti-sentido do polipeptídeo de sHASEGP é produzido intracelularmente através de transcrição a partir de uma seqüência exógena.
[00366] Por exemplo, um vetor pode ser introduzido in vivo de modo que ele é absorvido por uma célula, dentro de tal célula o vetor ou uma porção dele é transcrita, produzindo um ácido nucléico de anti-sentido (RNA). Tal vetor conteria uma seqüência codificando o ácido nucléico de anti-sentido de polipeptídeo de sHASEGP. Tal vetor pode permanecer epissomal ou se tornar cromossomalmente integrado, contanto que ele possa ser transcrito para produzir o RNA de anti-sentido desejado. Tais vetores podem ser construídos através de métodos de tecnologia de DNA recombinante padrão na técnica. Vetores podem ser plasmídeos, virais ou outros conhecidos na técnica, usados para replicação e expressão em células de mamífero. Expressão da seqüência codificando o RNA de anti-sentido de polipeptídeo de sHASEGP pode ser através de qualquer promotor conhecido na técnica agir em células de mamífero, incluindo, ser humano. Tais promotores podem ser induzíveis ou constitutivos. Tais promotores incluem, mas não estão limitados: a região de promotor early SV40 (Bernoist e Chambom, Nature 290:310 (1981), o promotor contido a repetição terminal longa 3'do vírus do sarcoma Rous (Yamamoto e outros, Cell22:787-797 (1980), o promotor timidina cinase do herpes (Wagner e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 91981), as seqüências reguladoras do gene metalotioneía (Brinster e outros, Nature 296:39-42 (1982), etc.
[00367] Os ácidos nucléicos de anti-sentido incluem seqüência complementar a pelo menos uma porção de um transcrito de RNA de um gene de polipeptídeo de sHASEGP, incluindo um gene de polipeptídeo de sHASEGP humano. Complementaridade absoluta não é requerida. A quantidade de ácido nucléico de anti-sentido de polipeptídeo de sHASEGP que é eficaz no tratamento ou prevenção de doença neoplástica depende da natureza da doença, e pode ser determinada empiricamente através de técnicas clínicas padrão.
[00368] Onde possível, é desejável determinar a citotoxidez de anti-sentido em células in vitro, e então em sistemas de modelo de animal úteis antes do teste e uso em seres humanos. 2. Interferência de RNA. Interferência de RNA (RNAi) (vide, por exemplo, Chuang e outros (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985) pode ser empregada para inibir a expressão de um gene codificando uma sHASEGP.
[00369] Fragmentos de RNA de interferência (RNAi), particularmente (ds) RNAi de filamento duplo, podem ser usados para gerar função de perda-de-sHASEGP. Métodos com relação ao uso de RNAi para silencionar genes em organismos incluindo mamíferos, C. elegans, Drosophila e plantas, e humanos são conhecidos (vide, por exemplo, Fire e outros 91998) Nature 391:806-811; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-363; Sharp (2001) Genes Dev. 15:485-490; Hammond e outros (2001) Nature Rev. Genet. 2:110-119; Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2:239-245; Hamilton e outros (1999) Science 286:950-952; Hammond e outros (2000) Nature 404:293-296; Zamore e outros (2000) Cell 101:25-33; Bernstein e outros (2001) Nature 409:363-366; Elbashir e outros (2001) Genes Dev. 15:188-200; Elbashir e outros (2001) Nature 411:494498; Pedido de patente Internacional PCT No. WO 01/29058; Pedido de Patente Internacional No. WO 99/32619).
[00370] Construtos expressando RNA de filamento duplo (dsRNA) são introduzidos em um hospedeiro, tal como um animal ou planta, usando um vetor replicável que permanece epissomal ou integra ao genoma. Ao selecionar as seqüências apropriadas, expressão de dsRNA pode interferir com o acúmulo de mRNA endógeno codificando uma sHASEGP. RNAi pode ser também usado para inibir expressão in vitro.
[00371] Regi ões incluem pelo menos cerca de 21 (ou 21) nucleotídeos que são seletivos (isto é, únicos) para sHASEGP e são usados para preparar o RNAi. Fragmentos menores de cerca de 21 nucleotídeos podem ser transformados diretamente (isto é, in vitro ou in vivo) em células; moléculas de dsRNA de RNAi maiores são geralmente introduzidas usando vetores que as codificam. Moléculas de dsRNA são pelo menos cerca de 21 pb de comprimento ou mais longas, tal como 50, 100, 150, 200 e mais longas. Métodos, reagentes e protocolos para introdução de moléculas de ácido nucléico em células in vitro e in vivo são conhecidos daqueles versados na técnica. 3. Terapia de Gene em uma modalidade exemplar, ácidos nucléicos que incluem uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo de sHASEGP ou seus domínios funcionais ou derivados são administrados para promover função de polipeptídeo de sHASEGP, por meio de terapia de gene.
[00372] Terapia de gene refere-se à terapia realizada através da administração de um ácido nucléico a um indivíduo. Nesta modalidade, o ácido nucléico produz sua proteína codificada que faz a mediação de um efeito terapêutico através da promoção da função de polipeptídeo de sHASEGP. Quaisquer um dos métodos para terapia de gene disponíveis na técnica podem ser usados (vide, Goldspiel e outros, Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu e Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, An. Rev. Pharmacol Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260; 926-932 (1993); e Morgan e Anderson, An. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIBTECH 115:155-215 (1993). Por exemplo, uma composição terapêutica para terapia de gene inclui o ácido nucléico codificando polipeptídeo de sHASEGP que é parte de um vetor de expressão que expressa um polipeptídeo de sHASEGP ou domínio, fragmento ou proteína quimérica dele em um hospedeiro adequado. Em particular, tal ácido nucléico tem um promotor operavelmente ligado à região de codificação de polipeptídeo de sHASEGP, o promotor sendo induzível ou constitutivo e, opcionalmente, específico de tecido. Em uma outra modalidade particular, uma molécula de ácido nucléico é usada onde as seqüências de codificação de polipeptídeo de sHASEGP e quaisquer outras seqüências desejadas são flanqueadas por regiões que promovem recombinação homóloga em um sítio desejado no genoma, deste modo provendo expressão intracromossomal do ácido nucléico da proteína sHASEGP (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra e outros, Nature 342:435-438 (1989)).
[00373] Aplicação do ácido nucléico a um paciente pode ser ou direta, caso onde o paciente é diretamente exposto ao ácido nucléico ou vetor carregando ácido nucléico, ou indireta, caso onde células são primeiro transformadas com o ácido nucléico in vitro, então transplantadas para o paciente. Essas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia de gene in vivo e ex vivo.
[00374] Em uma modalidade específica, o ácido nucléico é diretamente administrado in vivo, onde ele é expresso para produzir o produto codificado. Isto pode ser realizado através de qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através de construção dele como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e sua administração de modo a se tornar intracelular, por exemplo, através de infecção usando um vetor retroviral defeituoso ou atenuado ou outro (vide Patente U.S. No. 4.980.286), ou através de injeção direta de DNA nu, ou através do uso de bombardeamento de micropartícula (por exemplo, uma pistola de gene; Biolistic, Dupont) ou revestimento com lipídeos ou receptores de superfície de célula ou agentes de transfecção, encapsulação em lipossomas, micropartículas ou microcápsulas, ou através de sua administração em ligação com um peptídeo que é sabido entrar no núcleo, através de administração dele em ligação a um ligante submetido à endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que pode ser usado para direcionar a tipos de célula especificamente expressando os receptores), etc. Em uma outra modalidade, o complexo ácido nucléico-ligante pode ser formado onde o ligante é um peptídeo viral fusogênico para romper endossomas, permitindo que o ácido nucléico evite degradação lisossomal. Em ainda uma outra modalidade, o ácido nucléico pode ser direcionado in vivo para absorção e expressão específicas de célula, através de direcionamento a um receptor específico (vide, por exemplo, Publicações PCT WO 92/06180 datado de 16 de abril de 1992 (Wu e outros); WO 92/22635 datado de 23 de dezembro de 1992 (Wilson e outros); WO 92/20316 datado de 26 de novembro de 1992 (Findeis e outros); WO 93/14188 datado de 22 de julho de 1993 (Clarke e outros), WO 93/20221 datado de 14 de outubro de 1993 (Young)). Alternativamente, o ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado ao DNA da célula hospedeiro para expressão, através de recombinação homóloga (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijistra e outros; Nature 342:435-438 (1989)).
[00375] Em uma modalidade específica, um vetor viral que contém o ácido nucléico do polipeptídeo de sHASEGP é usado. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (vide Miller e outros, Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Esses vetores retrovirais foram modificados para deletar seqüências retrovirais que não são necessárias para empacotamento do genoma viral e integração ao DNA da células hospedeiro. O ácido nucléico do polipeptídeo de sHASEGP a ser usado em terapia de gene é clonado no vetor, que facilita a aplicação do gene a um paciente. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados em Boesen e outros, Biotherapy 6:291-302 (1994), que descreve o uso de um vetor retroviral para aplicar o gene mdr1 a células tronco hematopoiéticas a fim de tornar as células tronco mais resistentes à quimioterapia.
[00376] Out ras referências ilustrando o uso de vetores retrovirais em terapia de gene são: Clowes e outros, J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem e outros, Blood 83:1467-1473 (1994)); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3:110-114 (1993).
[00377] Adenovírus são outros vetores virais que podem ser usados em terapia de gene. Adenovírus são veículos especialmente atraentes para aplicação de genes a epitélios respiratórios. Adenovírus naturalmente infectam os eptélios respiratórios onde eles podem causar uma doença leve. Outros alvos para sistemas de aplicação baseados em adenovírus são fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais e músculo. Adenovírus têm a vantagem de ser capazes de infectar células de não-divisão. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) apresentam uma revisão de terapia de gene baseada em adenovírus. Bout e outros, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para os epitélios respiratórios de macacos rhesus. Outros casos do uso de adenovírus em terapia de gene podem ser encontrados em Rosenfeld e outros, Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld e outros, Cell 68:143-155 91992); e Mastrangeli e outros, J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993).
[00378] Vírus adeno-associados (AAV) foram também propostos para uso em terapia de gene (Walsh e outros, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993).
[00379] Uma outra abordagem para terapia de gene envolve transferência de um gene para células em cultura de tecidos através de métodos tal como eletroforação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio ou infecção viral. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável para as células. As células são então postas sob seleção para isolar aquelas células que absorveram e estão expressando o gene transferido. Essas células são então aplicadas a um paciente.
[00380] Ne sta modalidade, o ácido nucléico é introduzido em uma célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser realizada através de qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, transfecção, eletroforação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago contendo as seqüências de ácido nucléico, fusão de célula, transferência de gene mediada por cromossomo, transferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, etc. Várias técnicas são conhecidas no campo para a introdução de genes estrangeiros em células (vide, por exemplo, Loeffler e Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen e outros, Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)) e podem ser usadas, contanto que as funções desenvolvimentais e fisiológicas necessárias das células recipientes não sejam rompidas. A técnica deve prover a transferência estável do ácido nucléico para a célula, de modo que o ácido nucléico seja expressável pela e geralmente herdado e expressável por sua progênie de célula.
[00381] As células recombinantes resultantes podem ser aplicadas a um paciente através de vários métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, células epiteliais são injetadas, por exemplo, subcutaneamente. Em uma outra modalidade, células da pele recombinantes podem ser aplicadas como um enxerto de pele no paciente. Células de sangue recombinantes (por exemplo, células tronco hematopoiéticas ou progenitoras) podem ser administradas intravenosamente. A quantidade de células pretendidas para uso depende do efeito desejado, do estado do paciente, etc, e pode ser determinada por um versado na técnica.
[00382] Células onde um ácido nucléico pode ser introduzido para propósitos de terapia de gene compreendem qualquer tipo de célula disponível, desejado, e incluem, mas não estão limitadas a, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células do sangue tal como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, magacariócitos, granulócitos; várias células tronca ou progenitoras, em particular células tronca hematopoiéticas ou progenitoras, por exemplo, tal como células tronca obtidas de medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal e outras suas fontes.
[00383] Por exemplo, uma célula usada para terapia de gene é autóloga para o paciente. Em uma modalidade onde células recombinantes são usadas em terapia de gene, um ácido nucléico de polipeptídeo de sHASEGP é introduzido nas células de modo que ele é expressável pelas células ou suas progênies, e as células recombinantes são então administradas in vivo para efeito terapêutico. Em uma modalidade específica, células tronco ou progenitoras são usadas. Quaisquer células tronco e/ou progenitoras que podem ser isoladas e mantidas in vitro podem ser potencialmente usadas de acordo com esta modalidade.
[00384] Tais células tronco incluem, mas não estão limitadas a, células tronco hematopoiéticas (HSC), células tronco para tecidos epiteliais tal como pele e o revestimento do intestino, células musculares do coração embriônicas, células tronco do fígado, (Publicação PCT WO 94/08598 datado de 28 de abril de 1994) e células tronco neurais (Stemple e Anderson, Cell 71:973-985 (1992)).
[00385] Células tronco epiteliais (ESC) ou queratinócitos podem ser obtidos de tecidos tal como a pele e o revestimento do intestino através de procedimentos conhecidos (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980)). Em tecido epitelial estratificado tal como a pele, renovação acontece através de mitose de células tronco dentro da camada germinal, a camada mais próxima da lâmina basal. Células tronco dentro do revestimento do intestino provêem uma renovação rápida deste tecido. ESC ou queratinócitos obtidos da pele ou revestimento do intestino de um paciente ou doador podem ser cultivados em cultura de tecido (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21a:229 (1980); Pittelkow e Scott, Cano. Clinic Proc. 61:771 (1986). Se ESC forem providas por um doador, um método para supressão da reatividade hospedeiro versus enxerto (por exemplo, administração de irradiação, fármaco ou anticorpo para promover imunossupressão moderada) pode ser também usado.
[00386] Com relação a células tronco hematopoiéticas (HSC), qualquer técnica que proveja o isolamento, propagação e manutenção in vitro de HSC pode ser usada nesta modalidade. Técnicas através das quais isto pode ser realizado incluem (a) o isolamento e estabelecimento de culturas de HSC de células de medula óssea isoladas do futuro hospedeiro, ou um doador, ou (b) o uso de culturas de HSC a longo prazo previamente estabelecidas, que podem ser alergênicas ou xenogênicas.
[00387] HSCs não-autóloga geralmente são usadas com um método de supressão de reações imunes de transplante do hospedeiro/paciente futuro. Em uma modalidade particular, células de medula óssea humana podem ser obtidas a partir do cresto ilíaco posterior através de aspiração com agulha (vide, por exemplo, Kodo e outros, J. Clin. Invest. 73:13771384 (1984)). Por exemplo, a HSC pode ser feita em uma forma altamente enriquecida ou substancialmente pura. Este enriquecimento pode ser realizado antes, durante ou após cultura a longo prazo, e pode ser feito através de quaisquer técnicas conhecidas no campo. Culturas a longo prazo de células da medula óssea podem ser estabelecidas e mantidas através do uso de, por exemplo, técnicas de cultura de célula Dexter (Dexter e outros, J. Cell Physiol. 91:335 (1977)) ou técnicas de cultura Witlock-Witte (Witlock e Witte, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612 (1982)).
[00388] Em uma modalidade específica, o ácido nucléico a ser introduzido para propósitos de terapia de gene inclui um promotor induzível operavelmente ligado à região de codificação, de modo que a expressão do ácido nucléico é controlável através de controle da presença ou ausência do indutor de transcrição apropriado. 3. Pró-fármacos - Um método para tratamento de tumores é provido.
[00389] O método é praticado através da administração de um pró-fármaco que é clivado em um sítio específico por uma sHASEGP para liberar um fármaco ativo ou precursor que pode ser convertido em fármaco ativo in vivo. Quando do contato com uma célula que expressa atividade de sHASEGP, o pró-fármaco é convertido em um fármaco ativo. O pró-fármaco pode ser conjugado, o qual contém o agente ativo, tal como um fármaco antitumor, tal como um agente citotóxico, ou outro agente terapêutico (TA), ligado a um substrato para a sHASEGP direcionada, de modo que o fármaco ou agente seja inativo ou incapaz de entrar em uma célula, no conjugado, mas é ativado quando da clivagem. O pró-fármaco, por exemplo, pode conter uma molécula de sulfato de condroitina, tipicamente uma relativamente curta, de menos do que cerca de 20 unidades de dissacarídeo, que é cataliticamente clivada pela sHASEGP direcionada. Agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, agentes de alquilação, agentes antiproliferativos e agentes de ligação de tubulina. Outros incluem, fármacos vinca, mitomicinas, bleomicinas e taxanos. J. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MODOS DE ADMINISTRAÇÃO
1. Componentes das composições.
[00390] Composições farmacêuticas contendo uma sHASEGP ativa são providas aqui. São também providas combinações de compostos que modulam a atividade de um polipeptídeo de sHASEGP e um outro tratamento ou composto para tratamento de um distúrbio de hialuronidase, tal como um composto de anticorpo.
[00391] O polipeptídeo de sHASEGP e um segundo agente podem ser embalados como composições separadas para administração juntos ou seqencial ou intermitentemente. Alternativamente, eles podem ser providos como uma composição única para administração ou como duas composições para administração como uma composição única. As combinações podem ser embaladas como estojos.
2. Formulações e Via de Administração
[00392] Os polipeptídeos de sHASEGP e seu domínio de hialuronidase humana solúvel providos aqui podem ser formulados como composições farmacêuticas, tipicamente para administração de dosagem única. As concentrações dos polipeptídeos nas formulações são eficazes para aplicação de uma quantidade, quando da administração, que é eficaz para o tratamento pretendido. Tipicamente, as composições são formuladas para administração de dosagem única. Para formular uma composição, uma fração em peso de um polipeptídeo de sHASEGP, seus domínios de hialuronidase humana solúveis ou suas misturas são dissolvidos, suspensos, dispersos ou de outro modo misturados em um veículo selecionado em uma concentração eficaz de modo que a condição tratada é aliviada ou melhorada.
[00393] Veículos ou veículos farmacêuticos adequados para administração da sHASEGP ou seus domínios de hialuronidase humana solúveis providos aqui incluem quaisquer tais veículos conhecidos daqueles versados na técnica sendo adequados para o modo de administração particular.
[00394] Ainda, os polipeptídeos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos. Suspensões lipossomais, incluindo lipossomas direcionados a tecido, podem ser também adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Essas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, formulações de lipossoma podem ser preparadas conforme descrito na Patente U.S. No. 4.522.811.
[00395] A sHASEGP ativa ou seu domínio hialuronidase humana solúvel é incluído no veículo farmaceuticamente aceitável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejados no paciente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente através do teste de polipeptídeos em sistemas in vitro e in vivo conhecidos tal como através do uso dos ensaios providos aqui ou vide, por exemplo, Taliani e outros (1996) Anal. Biochem. 240:60-67, Filocamo e outros, (1997) J. Virology 71:1417-1427, Sudo e outros (1996) Antiviral Res. 32:9-18, Buffard e outros (1995) Virology 209:52-59, Bianchi e outros (1996) Anal. Biochem. 237:239-244, Hamatake e outros 91996) Intervirology 39:249-258, Steinkühler e outros (1998) Biochem. 37:8899-8905, D'Souza e outros (1995) J. Gen. Virol. 76:1729-1736, Takeshita e outros (1997) Anal. Biochem. 247:242-246; vide também, por exemplo, Shimizu e outros (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani e outros (1996) J. Virol. 70:7219-7223, Mizutani e outros (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:822-826, Lu e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:1412-1417, Hahm e outros (1996) Virology 226:318-326, Ito e outros (1996) J. Gen. Virol. 77:1043-1054, Mizutani e outros (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 212:906-911, Cho e outros (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 e então extrapolada para dosagens para seres humanos.
[00396] Tipicamente uma dosagem terapeuticamente eficaz é compreendida. As quantidades administradas podem ser da ordem de 0,001 a 1 mg/ml, incluindo cerca de 0,0050,05 mg/ml e cerca de 0,01 mg/ml, de volume de sangue. As formas de unidade de dosagem farmacêuticas são preparadas para proverem de a partir de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg, incluindo de a partir de cerca de 10 a cerca de 500 mg, e incluindo cerca de 25-75 mg do ingrediente ativo essencial ou uma combinação de ingredientes essenciais por forma de unidade de dosagem. A dosagem precisa pode ser empiricamente determinada.
[00397] Em alguns casos, uma dose de Unidade alta de sHASEGP humana é preferida. Por exemplo, com administração intravenosa de sHASEGP concentrações de sHASEGP de a partir de 500-100.000 Unidades por ml são preferidas. Formulações liofilizadas de sHASEGP são também ideais para armazenamento de doses de Unidade grandes de sHASEGP. Frascos liofilizados de 200.000 Unidades de sHASEGP são compreendidos para aplicação intravenosa.
[00398] Doses em alta concentração são também compreendidas para a aplicação de pequenos volumes de sHASEGP. Administração de 10-100 ul de 5000 unidades/ml de sHASEGP é compreendida para injeção na câmara anterior para dissolver substâncias viscoelásticas pré-administradas durante cirurgias de catarata e implante de lente intraocular implantável. Injeções de volume pequeno de doses de 50-200 U/ml são também compreendidas para procedimentos intravítreos tal como o tratamento de hemorragia vítrea ou descolamento vitro-retinal em retinopatia diabética.
[00399] Injeções de volume um pouco maior (por exemplo, entre cerca de um a vários ml, ou mais) são compreendidas para espaços um pouco maiores e/ou mais prontamente drenados dentro do corpo. Por exemplo, conforme aqui ilustrado, injeções periorbitais de um a vários ml ou mais podem ser feitas em um ou mais espaços circundando o olho, por exemplo, através de injeção no espaço do sub-Tenon ou episcleral, a fim de promover a aplicação transcleral de agentes farmacológicos a tecidos por trás do olho tal como o plexo coróide e/ou retina. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, alguns espaços dentro do corpo podem prontamente acomodar volumes maiores. A título de ilustração, o espaço episcleral ou do sub-Tenon em torno do olho pode imediatamente acomodar um a vários ml ou volumes ainda maiores (por exemplo, até ou maiores do que 5 a 10 ml, dependendo, por exemplo, das características do tecido particular e da taxa na qual o volume é aplicado).
[00400] Ainda, conforme aqui descrito e ilustrado, parece que a introdução de uma sHASEGP (potencialmente em combinação com um ou mais agentes farmacológicos ou outros adicionais) em um volume maior pode ser usada para direcionar mais a aplicação de agentes a sítios alvo desejados dentro do corpo. Sem desejar ser restrito a um mecanismo de ação particular, acredita-se que tais injeções de volume maior podem direcionar mais a permeação ou espalhamento de ambos sHASEGP bem como outro(s) agente(s) presente(s) no tecido tratado através de um processo de transporte convectivo que é promovido por um diferencial de pressão maior. Novamente, sem desejar ser restrito a nenhum mecanismo de ação particular, acredita-se que tal diferencial de pressão alto possa ser causado no contexto da presente invenção por, inter alia, um ou ambos do que seguem: (i) uma pressão motriz elevada ou "pressão na cabeça" elevada (por exemplo, causada por pressão hidrostática aumentada associada com uma injeção que enche muito ou enche um pouco em excesso ou distende um espaço ou sítio de injeção); e (ii) uma pressão a jusante reduzida ou "impedância" reduzida (por exemplo, causada pela abertura de canais na matriz intersticial associada com atividade de hialuronidase localizada e conseqüente degradação de hialuronan relativamente hidratado). Hialuronidases preferidas para uso nesta e outras aplicações da presente invenção (tal como facilitação da aplicação de agentes farmacológicos e outros) são sHASEGPs, particularmente sHASEGPs humanas no contexto de aplicação de agentes a um ou mais tecidos no corpo humano. No entanto, essas e outras abordagens para o uso de aplicação de hialuronidases podem ser também aplicadas usando sHASEGPs não-humanas, tal como sHASEGPs de mamífero, bem como outras hialuronidases humanas ou de mamífero, de preferência formas solúveis de tais hialuronidases.
[00401] O ingrediente ativo pode ser administrado de uma vez, ou pode ser dividido em várias doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. É compreendido que a dosagem precisa e a duração do tratamento são uma função da doença sendo tratada e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou através de extrapolação de dados de teste in vivo ou in vitro. Deve ser notado que valores de concentração e dosagem podem também variar com a severidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda compreendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de concentração mostradas aqui são exemplares apenas e não pretendem limitar o escopo ou uso das composições reivindicadas e combinações contendo-as.
[00402] De rivados farmaceuticamente aceitáveis incluem ácidos, sais, ésteres, hidratos, solvatos e forma de pró-fármaco. O derivado é tipicamente selecionado de modo que suas propriedades farmacocinéticas são superiores à sHASEGP neutra correspondente ou seu domínio hialuronidase humana solúvel.
[00403] Deste modo, concentrações ou quantidades eficazes de um ou mais dos presentes polipeptídeos ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis são misturadas com um veículo farmacêutico adequado para administração sistêmica, tópica ou local para formar composições farmacêuticas. Polipeptídeos de sHASEGP ou seus domínios de hialuronidase humana solúveis são incluídos em uma quantidade eficaz para melhorar ou tratar o distúrbio para o qual tratamento é compreendido. A concentração de polipeptídeo ativo na composição depende das taxas de absorção, inativação, excreção do polipeptídeo ativo, do programa de dosagem, da quantidade administrada, da formulação particular bem como o outros fatores conhecidos daqueles versados na técnica.
[00404] Os agentes terapêuticos para uso nos métodos podem ser administrados através de qualquer via conhecida daqueles versados na técnica, tal como, mas não limitado a, tópica, intra-articular, intracisternal, intraocular, peri-orbitalmente, intraventricular, intratecal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intradermal, subcutânea e intratecalmente, bem como através de qualquer combinação de qualquer dois ou mais deles. Formulações pulmonares em pó secas podem ser também previstas.
[00405] A vida para administração mais adequada vai variar dependendo do uso proposto, tal como, por exemplo, uso como um agente de aplicação para facilitar aplicação subcutânea de fluidos, uso para reduzir a pressão intraocular nos olhos de pacientes com glaucoma recebendo viscoelásticos ou uso como um "agente de espalhamento" para aumenter a atividade de agentes quimioterapêuticos, e o local de interesse, tal como um órgão interno particular, um crescimento de tumor, cavidade intraocular e a epiderme. Modos de administração incluem, mas não estão limitados a, tópica, local, intra-articular, intracisternal, intraocular, periorbital, intraventricular, intratecal, intravenosa, intramuscular, intratecalmente, intraperitoneal, intradermal e subcutânea e através de combinação de qualquer dois ou mais deles. Por exemplo, para tratamento de vários cânceres, tal como carcinoma de célula escamosa, câncer de mama, câncer da bexiga urinária e câncer gastrointestinal, administração local, incluindo administração ao sítio do crescimento do tumor (por exemplo, intratecal, intraventricular ou intracisternalmente) provê a vantagem de que o agente terapêutico pode ser administrado em alta concentração sem o risco das complicações que podem acompanhar a administração sistêmica de um agente terapêutico.
[00406] Como uma classe exemplar de agentes farmacológicos que podem ser combinados com sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) (por exemplo, combinadas através de co-formulação com uma ou mais sHASEGPs ou através de co-administração com uma ou mais sHASEGPs (que podem ser administradas antes da, coincidentes com ou seguindo a administração do agente), vários agentes tendo eficácia ou eficácia potencial no tratamento de vários cânceres foram descritos na técnica, e novos agentes anticâncer estão sendo regularmente desenvolvidos que podem da mesma maneira ser combinados com uma ou mais sHASEGPs (por exemplo, providos através de co-formulação ou através de co-administração antes, coincidente com e/ou seguindo administração do agente) para melhorar a farmacocinética, farmacodinâmica e outros propriedades úteis do agente.
[00407] A título de ilustração (e sem limitação) vários agentes anticâncer ou quimioterapêuticos foram agora aprovados para o tratamento de vários cânceres que podem ser combinados com sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) através de co-formulação ou co-administração (antes, coincidente com ou após administração do agente anticâncer). Tais agentes incluem, por exemplo, Aldesleucinas (por exemplo, PROLEUKIN®); Alemtuzumabs (por exemplo, CAMPATH®); Alitretinoínas (por exemplo, PANRETIN™®); Alopurinóis (por exemplo, ZYLOPRIM®); Altretaminas (por exemplo, HEXALEN®); Amifostinas (por exemplo, ETHYOL®); Anastrozóis (por exemplo, ARIMIDEX®); Trióxidos Arsênicos (por exemplo, TRISENOX®); Asparaginases (por exemplo, ELSPAR®); BCG Viva (por exemplo, TICE® BCG); Bexarotenos (por exemplo, TARGRETIN®); Bleomicinas (por exemplo, BLENOXANE®); Bussulfan intravenoso (por exemplo, BUSULFEX®); Bussulfan orais (por exemplo, MYLERAN®); Calusteronas (por exemplo, METHOSARB®); Capecitabinas (por exemplo, XELODA®); Carboplatinas (por exemplo, PARAPLATIN®); Carmustinas (por exemplo, BCNU®, BiCNU®); Carmustinas com Polifeprosans (por exemplo, GLIADEL® Wafer); Celecoxibs (por exemplo, CELEBREX®); Clorambucil (por exemplo, LEUKERAN®); Cisplatinas (por exemplo, PLATINOL®); Cladribines (por exemplo, LEUSTATIN®, 2-CdA®); Ciclofosfamidas (por exemplo, CYTOXAN®, NEOSAR®); Citarabinas (por exemplo, CYTOSAR-U®); Citarabina liposomais (por exemplo, DepoCyt®); Dacarbazinas (por exemplo, DTIC-Dome®); Dactinomicinas (por exemplo, COSMEGEN®); Darbepoetin Alfas (por exemplo, ARANESP®); Daunorrubicina liposomais (por exemplo, DANUOXOME®); Daunorrubicinas/Daunomicinas (por exemplo, CERUBIDINE®); Denileucina Diftitoxes (por exemplo, ONTAK®); Dexrazoxanas (por exemplo, ZINECARD®); Docetaxéis (por exemplo, TAXOTERE®); Doxorrubicinas (por exemplo, ADRIAMYCIN®, RUBEX®); Doxorrubicina liposomais (por exemplo, DOXIL®); Propionatos de dromostanolona (por exemplo, Injeção DROMOSTANOLONE® e MASTERONE®); Soluções B de Elliot (por exemplo, Elliott's B Solution®); Epirrubicinas (por exemplo, ELLENCE®); Epoetina alfas (por exemplo, EPOGEN®); Estramustinas (por exemplo, EMCYT®); Fosfatos de etoposídeo (por exemplo, ETOPOPHOS®); Etoposídeo VP-16s (por exemplo, VEPESID®); Exemestanas (por exemplo, AROMASIN®); Filgrastins (por exemplo, NEUPOGEN®); Floxuridinas (por exemplo, FUDR®); Fludarabinas (por exemplo, FLUDARA®); Fluorouracilas incl. 5-FUs (por exemplo, ADRUCIL®); Fulvestrants (por exemplo, FASLODEX®); Gemcitabinas (por exemplo, GEMZAR®); Gemtuzumabs/Ozogamicinas (por exemplo, MYLOTARG®); Acetatos de goserelina (por exemplo, ZOLADEX®); Hidroxiuréias (por exemplo, HYDREA®); Ibritumomabs/Tiuxetanos (por exemplo, ZEVALIN®); Idarrubicinas (por exemplo, IDAMYCIN®); Ifosfamidas (por exemplo, IFEX®); Mesilatos de imatinib (por exemplo, GLEEVEC®); Interferon alfa-2as (por exemplo, ROFERON-A®); Interferon alfa- 2bs (por exemplo, ÍNTRON A®); Irinotecanos (por exemplo, CAMPTOSAR®); Letrozóis (por exemplo, FEMARA®); Leucovorinas (por exemplo, WELLCOVORIN®, LEUCOVORIN®); Levamisóis (por exemplo, ERGAMISOL®); Lomustinas/CCNUs (por exemplo, CeeBU®); Mecloretaminas/Nitrogênio mostardas (por exemplo, MUSTARGEN®); Acetatos de megestrol (por exemplo, MEGACE®); Melfalans/L-PAMs (por exemplo, ALKERAN®); Mercaptopurina incl. 6-MPs (por exemplo, PURINETHOL®); Mesnas (por exemplo, MESNEX®); Metotrexatos; Metoxsalenos (por exemplo, UVADEX®); Mitomicina Cs (por exemplo, MUTAMYCIN®, MITOZYTREX®); Mitotanos (por exemplo, LYSODREN®); Mitoxantronas (por exemplo, NOVANTRONE®); Fenpropionatos de nandrolona (por exemplo, DURABOLIN-50®); Nofetumomabs (por exemplo, VERLUMA®); Oprelvecinas (por exemplo, NEUMEGA®); Oxaliplatinas (por exemplo, ELOXATIN®); Paclitaxéis (por exemplo, PAXENE®, TAXOL®); Pamidronatos (por exemplo, AREDIA®); Pegademases (por exemplo, ADAGEN®); Pegaspargases (por exemplo, ONCASPAR®); Pegfilgrastins (por exemplo, NEULASTA®); Pentostatinas (por exemplo, NIPENT®); Pipobromanos (por exemplo, VERCYTE®); Plicamicina/Mitramicinas (por exemplo, MITHRACIN®); Porfímero dissódico (por exemplo, PHOTOFRIN®); Procarbazinas (por exemplo, MATULANE®); Quinacrinas (por exemplo, ATABRINE®); Rasburicases (por exemplo, ELITEK®); Rituximabs (por exemplo, RITUXAN®); Sargramostins (por exemplo, PROKINE®); Streptozocinas (por exemplo, ZANOSAR®); Talcos (por exemplo, SCLEROSOL®); Tamoxifenos (por exemplo, NOLVADEX®); Temozolomidas (por exemplo, TEMODAR®); Teniposídeos/VM-26s (por exemplo, VUMON®); Testolactonas (por exemplo, TESLAC®); Thioguaninas incl. 6-TG; Tiotepas (por exemplo, THIOPLEX®); Topotecanos (por exemplo, HYCAMTIN®); Toremifenos (por exemplo, FARESTON®); Tositumomabs (por exemplo, BEXXAR®); Trastuzumabs (por exemplo, HERCEPTIN®); Tretinoínas/ATRA (por exemplo, VESANOID®); Uracil
[00408] Mostardas; Valrubicinas (por exemplo, VALSTAR®); Vinblastinas (por exemplo, VELBAN®); Vincristinas (por exemplo, ONCOVIN®); Vinorrelbinas (por exemplo, NAVELBINE®); Zoledronatos (por exemplo, ZOMETA®); bem como outros agentes descritos aqui e na técnica.
[00409] Como com outras classes de agentes farmacológicos descritos aqui, sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) pode ser usada em conjunto com a administração de (ou co-formulada com) um agente farmacológico individual (tal como um antineoplástico para propósitos de ilustração, ou com um membro de uma outra classe de agentes conforme aqui descrito e/o sabido na técnica). Alternativamente, uma sHASEGPs (ou outra glicosaminoglicanase) pode ser usada em conjunto com a administração de (ou co-formulada com) mais de um agente farmacológico de uma dada classe (tal como agentes antineoplásticos múltiplos para propósitos de ilustração, ou membros múltiplos de outras classes de agentes conforme descrito aqui e/ou sabido na técnica). No caso de combinações com dois ou mais agentes de uma dada classe, é freqüentemente preferido que os dois ou mais agentes ajam através de dois ou mais mecanismos de ação diferente. Uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) pode ser também usada em conjunto com a administração de (ou co-formulada com) um agente farmacológico de uma primeira dada classe (tal como um antineoplástico para propósitos de ilustração, ou um membro de uma das outras classes de agentes conforme aqui descrito e/ou sabido na técnica), e um ou mais agentes farmacológicos adicionais de uma ou mais classes diferentes que são úteis para tratamento de qualquer uma de uma variedade de condições. Embora certos princípios sejam então referidos aqui no caso de agentes anticâncer para propósitos de ilustração, esses princípios são também aplicados a, por exemplo, antiinfectivos e a vários membros de outras classes de agentes que são descritos e ilustrados aqui, bem como agentes adicionais que já são conhecidos na técnica ou são recém-desenvolvidos.
[00410] No caso de qualquer uma das combinações e/ou co-formulações descritas aqui (compreendendo pelo menos uma sHASEGPs (ou outra glicosaminoglicanase) e pelo menos um outro agente (tal como um agente farmacológico, por exemplo, um membro de uma das classes de agentes ilustradas aqui )), é também compreendido que tal combinação e/ou co-formulação pode ainda compreender um ou mais agentes (tal como vários estabilizadores, excipientes e similar) que não exercem eles mesmos efeitos farmacodinâmicos mas que promovem a utilidade da combinação e/ou formulação (por exemplo, através da estabilização de um ou mais dos componentes ou uma formulação toda, ajudando a promover ou direcionar a atividade de um ou mais dos agentes ou da sHASEGP e/ou reduzindo a toxidez ou de outro modo melhorando o perfil de segurança da combinação ou co-formulação.
[00411] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, novas versões e formulações desses e outros agentes anticâncer (bem como membros de outras classes de agentes conforme aqui descrito) estão sendo regularmente desenvolvidas que podem da mesma maneira ser combinadas com sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases). Ainda, uma vez que tais enzimas podem ser usadas para melhorar os perfis farmacocinéticos e/ou farmacodinâmicos de uma grande variedade de agentes, e permitir que os agentes sejam aplicados através de vias diferentes (e potencialmente mais direcionadas), por exemplo, sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) podem ser usadas para aumentar perfis de PK e/ou PD de vários agentes anteriormente considerados ter perfis subótimos. Teste de agentes em modelos de animal apropriados com e sem sHASEGP concomitante pode ser usado para avaliar a eficácia e toxidez relativas de agentes particulares.
[00412] Conforme ilustrado e exemplificado aqui, vários agentes de molécula grande (tal como anticorpos e outras proteínas, particularmente aqueles administrados através de injeção parenteral não-IV), exibem perfis farmacocinéticos relativamente pobres e podem ser particularmente aumentados através de co-formulação ou co- administração com sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases). Sem ser restrito a um mecanismo de ação particular, é geralmente considerado que agentes de molécula pequena exibindo hidrofobicidade relativamente baixa são mais eficazmente dispersáveis através de, por exemplo, transporte convectivo dentro de fluidos intersticiais como pode ser promovido por sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases). Um método geralmente usado para prever tais atributos é avaliar os coeficientes de divisão de octanol:água estimados (Kow) que foram descritos para vários compostos. Com relação a isso, agentes exibindo log Kow de <3, com mais preferência <2 ou <1, com mais preferência <0, com mais preferência ainda <(-1). Como será compreendido por aqueles versados na técnica, muitos agentes podem ser também modificados covalentemente e/ou não- covalentemente para aumentar a sua hidrofobicidade e/ou para compreender tais agentes dentro de vesículas ou complexos macromoleculares para facilitar sua permeação e/ou aplicação.
[00413] P ara propósitos de ilustração adicional (e sem limitação), agentes farmacológicos anticâncer ou quimioterapêuticos exemplares que podem ser combinados com sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) estão incluídos na lista que segue (e outros são conhecidos na técnica): Acivicinas; Aclarrubicinas; Acodazóis; Acroninas; Adozelesinas; Aldesleucinas; Alitreninoínas (Ácidos 9-Cis- Retinóicos); Altretaminas; Alvocidibs; Ambazonas; Ambomicinas; Ametantronas; Aminoglutetimidas; Ansacrinas; Anastrozóis; Anaxironas; Ancitabinas; Antramicinas; Apaziquonas; Argimesnas; Asparaginases; Asperlinas; Atrimustinas; Azacitidinas; Azetepas; Azotomicinas; Banoxantronas; Batabulinas; Batimastats; Benaxibinas; Bendamustinas; Benzodepas; Bexarotenos; Bicalutamidas; Bietaserpinas; Biricodars; Bisantrenos; Bisantrenos; Dimesilatos de Bisnafida; Bizelesinas; Bleomicinas; Bortezomibs; Brequinars; Bropiriminas; Budotitanos; Bussulfanos; Cactinomicinas; Calusteronas; Canertinibs; Capecitabinas; Caracemidas; Carbetímeros; Carboplatinas; Carboquonas; Carmofurs; Carmustinas; Carrubicinas; Carzelesinas; Cedefingols; Cemadotinas; Clorambucis; Cioteroneis; Cirolemicinas; Cisplatinas; Cladribinas; Clanfenurs; Clofarabinas; Crisnatols; Ciclofosfamidas; Citarabinas; Dacarbazinas; Dactinomicinas; Daunorrubicinas; Decitabinas; Dexniguldipinas; Dexormaplatinas; Dezaguaninas; Diaziquonas; Dibrospidiuns; Dienogests; Dinalinas; Disermolidas; Docetaxéis; Dofequidars; Doxifluridinas; Doxorrubicinas; Droloxifenos; Propionatos de Dromostanolona; Duazomicinas; Ecomustinas; Edatrexatos; Edotecarinas; Eflornitinas; Elacridars; Elinafidas; Elsamitrucinas; Emitefurs; Enloplatinas; Enpromatos; Enzastaurinas; Epipropidinas; Epirrubicinas; Eptaloprosts; Erbulozóis; Esorrubicinas; Estramustinas; Etanidazóis; Etoglucids; Etoposídeos; Etoprinas; Exisulindes; Fadrozóis; Fazarabinas; Fenretinidas; Floxuridinas; Fludarabinas; Fluorouracilas; Fluoximesteronas; Flurocitabinas; Fosquidonas; Fostriecinas; Fostriecinas; Fotretaminas; Galarrubicinas; Galocitabinas; Gencitabinas; Geroquinóis; Gimatecans; Gimeracilas; Gloxazonas; Glufosfamidas; Hidroxiuréias; Idarrubicinas; Ifosfamidas; Ilmofosinas; Ilomastats; Imexons; Improssulfanos; Indissulans; Inproquonas; Interferons; Interferon Alfas; Interferon Betas; Interferon Gamas; Interleucina-2s e outras Interleucinas (incluinso Interleucinas recombinantes); Intoplicinas; Iobenguanos [131-I]; Iproplatinas; Irinotecanos; Irsogladinas; Ixabepilonas; Cetotrexatos; L- Alanosinas; Lanreotidas; Lapatinibs; Ledoxantronas; Letrozóis; Leuprolidas; Leuprorelinas (Leuprorelidas); Lexacalcitóis; Liarozóis; Lobaplatinas; Lometrexols; Lomustinas; Lonafarnibs; Losoxantronas; Lurtotecanos; Mafosfamidas; Manossulfanos; Marimastats; Masoprocóis; Maitansinas; Mecloretaminas; Megestróils; Melengestróis; Melfalans; Menogarilas; Mepitiostanos; Mercaptopurinas; Metesindas; Metotrexatos; Metomidatos; Metoprinas; Meturedepas; Miboplatinas; Miproxifenos; Misonidazóis; Mitindomidas; Mitocarcinas; Mitocrominas; Mitoflaxonas; Mitogillinas; Mitoguazonas; Mitomalcinas; Mitomicinas; Mitonafidas; Mitoquidonas; Mitospers; Mitotanos; Mitoxantronas; Mitozolomidas; Mivobulinas; Mizoribinas; Mofarotenos; Mopidamóis; Mubritinibs; Ácido Micofenólicos; Nedaplatinas; Nelzarabinas; Nemorrubicinas; Nitracrinas; Nocodazóis; Nogalamicinas; Nolatrexeds; Nortopixantronas; Octreotidas; Ormaplatinas; Ortataxéis; Oteracilas; Oxissuranos; Oxofenarsinas; Paclitaxels; Pamidronatos; Patubilonas; Pegaspargases; Peldesinas; Peliomicinas; Pelitrexóis; Pemetrexeds; Pentamustinas; Peplomicinas; Perfosfamidas; Perifosinas; Picoplatinas; Pinafidas; Pipobromans; Pipossulfanos; Pirfenidonas; Piroxantronas; Pixantronas; Plevitrexeds; Plicamicinas; Plomestanos; Plomestanos; Porfímeros; Porfiromicinas; Prednimustinas; Procarbazinas; Propamidinas; Prospidiuns; Pumitepas; Puromicinas; Pirazofurinas; Ranimustinas; Riboprinas; Ritrossulfanos; Rogletimidas; Roquinimexs; Rufocromomicinas; Sabarrubicinas; Safingols; Satraplatinas; Sebriplatinas; Semustinas; Simtrazenos; Sizofirans; Sobuzoxanos; Sorafenibs; Sparfosatos; Ácidos Esparfósicos; Esparsomicinas; Espirogermânios; Espiromustinas; Espiroplatinas; Espiroplatinas; Esqualaminas; Estreptonigrinas; Estreptovaricinas; Estreptozocinas; Sufosfamidas; Sulofenurs; Tacedinalinas; Talisomicinas; Talimustinas; Tariquidars; Tauromustinas; Tecogalans; Tegafurs; Teloxantronas; Temoporfinas; Teniposidas; Teroxironas; Testolactonas; Tiamiprinas; Tioguaninas; Tiotepas; Tiamiprinas; Tiazofurinas; Tilomisóis; Tilorones; Timcodars; Timonacics; Tirapazaminas; Topixantronas; Toremifenos; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); Trastuzumabs; Trestolonas; Triciribinas; Triciribinas; Trilostanos; Trimetrexatos; Tetranitratos de Triplatina; Triptorelinas; Trofosfamidas; Tubulozóis; Ubenimexs; Uracil Mostardas; Uredepas; Valspodars; Vapreotidas; Verteporfinas; Vinblastinas; Vincristinas; Vindesinas; Vinepidinas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos; Vinleucinóis; Vinleurosinas; Vinorelbinas; Vinrosidinas; Vintriptols; Vinzolidinas; Vorozóis; Xantomicina A's (Guameciclinas); Zeniplatinas; Zilascorbs [2-H]; Zinostatinas; Zorrubicinas; Zosuquidars; e similar.
[00414] Veículos farmacêuticos e cosméticos adequados para administração de polipeptídeos de sHASEGP ou seu domínio hialuronidase humana solúvel providos aqui incluem quaisquer tais veículos conhecidos daqueles versados na técnica como sendo adequados para o modo de administração particular. Ainda, os polipeptídeos podem ser formulados como o ingrediente farmaceuticamente ativo único na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos que não prejudiquem a ação desejada, ou com materiais que suplementem a ação desejada conhecida daqueles versados na técnica. Por exemplo, os polipeptídeos de sHASEGP providos aqui podem ser usados como um agente de aplicação ou "espalhamento" em combinação com um segundo composto ativo, tal como um agente terapeuticamente eficaz, incluindo, mas não limitado a um fármaco ou pró-fármaco, para facilitar a aplicação de ou para aumentar a atividade do segundo ingrediente ativo. Em uma modalidade particular, um polipeptídeo de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humano solúvel pode ser co-formulado ou co-administrado com um agente anestésico, tal como Lignocaína, Bupivicaína ou uma mistura dos dois, e, opcionalmente, um agente hormonal, tal como epinefrina, para diminuir ou parar a absorção de sangue durante cirurgia oftálmica. Em uma outra modalidade particular, um polipeptídeo de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel pode ser co-formulado ou co- administrado com um agente farmacológico tal como um agente antiinflamatório para aumentar a aplicação do agente farmacológico a tecidos de mamífero in vivo (por exemplo, a porções do olho) onde tal agente é desejado para tratamento de uma condição particular. Por co-administração se pretende a administração de sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) junto com ou em proximidade temporal próxima com administração de um agente farmacológico. Tipicamente é preferido que a sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) seja administrada um pouco cantes (por exemplo, 5 a 60 minutos antes) ou, para conveniência máxima, junto com o agente farmacológico. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, a proximidade desejada de co-administração depende em parte significante das meias-vidas eficazes dos agentes no ambiente de tecido particular, e da doença particular sendo tratada, e pode ser prontamente otimizada através de teste dos efeitos da administração dos agentes em tempos variáveis em modelos adequados, tal como em modelos animais adequados. Em algumas situações, o tempo de administração ótimo da sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) vai exceder 60 minutos. A título de ilustração e sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas situações de tumor, por exemplo, a entrada máxima de agente quimioterapêutico no tumor pode acontecer após a degradação do hialuronan no tumor estar substancialmente completa de modo a reduzir o volume intersticial do tumor, que é seguido por uma fase regenerativa de hialuronan durante a qual fluido é novamente posto no tumor resultando em uma absorção aumentada de um agente quimioterapêutico a partir do plasma. No último caso, administração ótima de sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) pode ser obtida entre cerca de uma a vinte horas antes da administração do agente farmacológico. A fim de otimizar o tempo de pré-administração com relação a agente farmacológico para uma combinação particular de condição de doença e agente farmacológico, um versado pode conduzir um curso de tempo de rotina de pré-administração, tipicamente comparando um ou vários pontos de tempo de uma hora ou menos com um ou vários pontos de tempo de mais de uma hora (mas tipicamente não excedendo um dia) a fim de otimizar o tempo de administração. Um polipeptídeo de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel pode ser também co-formulado ou co-administrado com vários quimioterapêuticos, tal como uma toxina e um fator de necrose de tumor, para aumentar a atividade do agente quimioterapêutico e/ou a acessibilidade dos tumores alvo ao agente quimioterapêutico. O composto ativo é incluído no veículo em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos tóxicos sérios no indivíduo tratado. A concentração eficaz pode ser determinada empiricamente através de teste dos compostos usando sistemas in vitro e in vivo, incluindo os modelos de animais descritos aqui.
[00415] No caso de agentes farmacológicos que são aplicados através de administração parenteral (isto é, por vias outras que não através do trato digestivo, tal como através de vias subcutânea, intradermal, intramuscular ou intravenosa, por exemplo), sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) podem ser prontamente co-formuladas com ou co-administradas com qualquer um de uma variedade de agentes farmacológicos para aumentar sua aplicação a sítios desejados dentro do corpo. Por exemplo, dependendo da combinação particular de agente farmacológico e da via de administração, aplicação pode ser aumentada através do aumento até o ponto (e/ou taxa) onde o agente difunde através de um tecido ou próximo ao sítio de aplicação (por exemplo, seguindo sua injeção) e/ou até o ponto (e/ou taxa) na qual o agente difunde e/ou é carregado através de transporte convectivo através de um tecido alvo (por exemplo, seguido sua liberação a partir da corrente sangüínea, linfo, fluido cerebroespinhal ou outro sistema fluido). O ponto até o qual a aplicação é aumentada pode ser prontamente avaliado, por exemplo, em sistemas de modelo de animal onde a adição de uma sHASEGP resulta em um aumento mensurável na biodisponibilidade do agente em tecidos de interesse dentro do corpo.
[00416] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que no caso de parenterais não-intravenosos (tal como injetáveis subcutâneos, intradermais e intramusculares), a presença de sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) na vizinhança de um sítio de injeção e em sítios a "jusante", tal como aqueles entre um sítio de injeção e um leito vascular distal, possa aumentar a difusão e/ou transporte convectivo do agente para um sistema de aplicação tal como a vasculatura. Aplicação aumentada em tal situação pode ser associada com um aumento na quantidade do agente que passa eficazmente através de e para fora do sítio de aplicação inicial (potencialmente através de ambos aumento do volume e taxa de fluxo de fluido bruto).
[00417] No caso de muitos agentes farmacológicos, que são submetidos à degradação, remoção ou outras formas de inativação em tecidos, aumento da taxa de sua passagem por um tecido pode por sua vez substancialmente aumentar a quantidade de agente eficaz que transita através do tecido, aumentando mais a sua biodisponibilidade. Para ambos parenterais não-intravenosamente administrados que subseqüentemente entram na corrente sangüínea ou outro canal, bem como agentes aplicados diretamente aos recipientes do canal (tal como através de administração intravenosa, IV), a habilidade do agente em difundir através de um tecido alimentado pelo canal pode ser também aumentada pela presença de sHASEGP no tecido. Se sHASEGP estiver presente no "tecido aplicado" tal como no primeiro caso, e/ou no "tecido alvo" como no último caso, a presença de sHASEGP pode então aumentar o ponto e/ou taxa eficaz de aplicação do agente farmacológico a tecidos alvo dentro do corpo. Em qualquer caso, a sHASEGP pode ser usada para aumentar a biodisponibilidade eficaz de um agente farmacológico como qual ela foi co-formulada ou co- administrada. Como resultado, a sHASEGP pode ser usada para atingir concentrações mais elevadas e/ou mais rapidamente atingidas do agente para prover, por exemplo, uma resposta mais potente e/ou mais rápida para uma dada dose. Alternativamente, a sHASEGP pode ser usada para permitir que uma dada resposta seja atingida com uma dose menor de agente administrado, por exemplo. A habilidade de uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) em aumentar o fluxo de fluido bruto e próximo a um sítio de injeção pode também melhorar outros aspectos associados com aplicação farmacológica. Por exemplo, o aumento no fluxo de fluido bruto pode ajudar a permitir que o volume de fluido injetado seja mais rapidamente disperso a partir do sítio de injeção (reduzindo potencialmente conseqüências dolorosas ou outras adversas de injeção). Na verdade, foi reconhecido que tais sensações adversas associadas com injeções parenterais não-IV são uma razão chave pela qual pacientes podem resistir ou evitar administração parenteral não-IV (que pode requerer eficazmente que um produto seja administrado intravenosamente quando ele poderia ser de outro modo dado mais convenientemente e/ou seguramente através de uma via não-IV).
[00418] Ao usar uma sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) da presente invenção para aumentar a aplicação de um ou mais agentes farmacológicos ou outros no corpo (um uso que é algumas vezes referido como "espalhado"), a própria sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) pode ser administrada através da mesma via que seu agente farmacológico (caso onde ela pode ser co-formulada ou de outro modo co-administrada junto com o agente farmacológico ou ela pode ser administrada separadamente, de preferência antes do agente farmacológico conforme acima discutido. Alternativamente, ou ainda, a sHASEGP (ou outra glicosaminoglicanase) pode ser administrada através de uma via de administração diferente. Por exemplo, o agente farmacológico pode ser introduzido localmente através de injeção parenteral não-IV e a sHASEGP pode ser introduzida intravenosamente. Como um outro exemplo ilustrativo e não- limitante, a sHASEGP pode ser introduzida localmente através de injeção parenteral não-IV (em um tecido que é desejado ser direcionado pelo agente farmacológico) e o próprio agente farmacológico pode ser introduzido por uma outra via, tal como intravenosa, não-parenteral (por exemplo, oral) ou outra via. Como será então compreendido por aqueles versados na técnica, as sHASEGPs da presente invenção podem ser usadas para aumentar a aplicação e biodisponiblidade de uma variedade de agentes farmacológicos e outros incluindo agentes que são tipicamente aplicados através de vias parenteral bem como não-parenteral.
[00419] Por exemplo, sHASEGP (ou outras glicosaminoglicanases) podem ser co-formuladas ou co- administradas com uma variedade de agentes farmacológicos que são tipicamente administrados através de aplicação parenteral, por exemplo, para aumentar sua eficácia e/ou para aumentar seu perfil de risco/benefício no tratamento da doença.
[00420] A título de ilustração da variedade de agentes farmacológicos que podem ser parenteralmente administrados e sua aplicação e/ou biodisponibilidade aumentada através de co-formulação e/ou co-administração com sHASEGP (ou outras glicosaminoglicanases) da presente invenção, a lista que segue não é exaustiva (e então não é pretendida ser limitante) mas simplesmente prover agentes exemplares: Adalimumabs (por exemplo, Humira®), Agalsidase Betas (por exemplo, Fabrazyme®), Aldesleucinas (PROLEUKIN® IL-2), Alefacepts (por exemplo, Amevive®), Ampicilinas (por exemplo, Injeção UNASYN®), Anacinras (por exemplo, Kineret®), Vacinas antipoliomelíticas (por exemplo, PEDIARIX®), Anti-Timócitos (por exemplo, THYMOGLOBULIN®), Azitromicinas (por exemplo, Zithromax® IV), Becaplerminas (por exemplo, Regranex®), Caspofunginas (por exemplo, Cancidas®), Cefazolinas (por exemplo, ANCEF® e CEFAZOLIN®), Cefepimas (por exemplo, Maxipime®), Cefotetanos (por exemplo, CEFOTAN®), Ceftazidimas (por exemplo, FORTAZ®), Ceftriaxonas (por exemplo, Rocefin®), Cetuximabs (por exemplo, ERBITUX®), Cilastatinas (por exemplo, Primaxin® IV), Ácidos Clavulânicos (por exemplo, em conjunto com Amoxilinas tal como em AUGMENTIN®), Clindamicinas (por exemplo, CLEOCIN®), Darbepoetin Alfas (por exemplo, Aranesp®), Deaclizumabs (por exemplo, Zenapax®), Toxóides da Difteria (tipicamente em combinações, por exemplo, DAPTACEL®, INFARIX® e PEDIARIX®), Efalizumabs (por exemplo, Raptiva®), Epinefrinas (por exemplo, EPIPEN®), Eritropoietinas Alfas (por exemplo, EPOGEN® e PROCRIT®), Etanercepts (por exemplo, ENBRELl®), Filgrastinas (por exemplo, NEUPOGEN®), Fluconazóis (por exemplo, Injeção DIFLUCAN®), Hormônio de Estimulação de Folículo tal como Folitropin Alfas (por exemplo, GONAL-F®) e Folitropin Betas (por exemplo, FOLLISTIN®), Fosfenitoínas (por exemplo, CEREBYX®), Fluconazóis (por exemplo, Diflucan®), Gadodiamidas (por exemplo, OMNISCAN®), Gadopentetatos (por exemplo, MAGNEVIST®), Gatifloxacinas (por exemplo, TEQUIN®), Glatirâmeros (por exemplo, COPAXONE®), GM-CSF's (por exemplo, LEUKINE®), Goserelinas (por exemplo, ZOLADEX®), Granisetrons (por exemplo, KYTRIL®), Haemophilus Influenza B's (por exemplo, COMVAX® e HibTITER®), Haloperidóis (por exemplo, HALDOL®), Vacinas da Hepatite A (por exemplo, HAVRIX®, TWINRIX® e VAQTA®), Vacinas da Hepatite B (por exemplo, recombinantes COMVAX®, ENGERIX®-B, RECOMBIVAX®-HB, TWINRIX® e não-recombinantes BAYHEP®-B e NABI®-HB), Ibritumomab Tiuxetanos (por exemplo, ZEVALIN®), Imunoglobulinas (incluindo misturas de imunoglobulinas tal como GAMMAGARD® e similar, bem como qualquer uma de uma variedade de imunoglobulinas purificadas), Vacinas do Vírus Influenza (por exemplo, FLUMIST®), Infliximabs (por exemplo, Remicade®), Insulinas (por exemplo, produtos HUMALOG®, HUMALOG® MIX 75/25®, HUMULIN® (incl. 50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra e Ultralente), e NOVOLIN™), Insulina Glarginas (por exemplo, LANTUS®), Interferon Alfa-2a's (ROFERAN®-A), Interferon Alfa-2b's (por exemplo, Íntron-A®), Interferon Alfacon-1 's (por exemplo, INFERGEN®), Interferon Alfa-n3s (por exemplo, ALFERON N®), Interferon Betas (por exemplo, BETASERON® e BETAFERON®), Interferon Beta-1a's (por exemplo, AVONEX® e REBIF®), Interferon Gamas (por exemplo, ACTIMMUNE®), Iodixanóis (por exemplo, VISIPAQUE®), Ioexóis (OMNIPAQUE®), Iopamidóis, Ioversóis (por exemplo, OPTIRAY®), Ketorolacs (por exemplo, TORADOL®), Laronidases (por exemplo, ALDURAZYME®), Levofloxacinas (por exemplo, LEVAQUIM®), Lidocaínas, Linezolidas (por exemplo, ZYVOX®), Lorazepans (por exemplo, ATIVAN®), Vacinas do Sarampo (por exemplo, ATTENUVAX®), Vacinas do Vírus do Sarampo-Caxumba- Rubéola (por exemplo, M-M-R® II), Medroxiprogesteronas (por exemplo, DEPO-PROVERA®), Meropenens (por exemplo, MERREM® IV), Metilprednisolonas (por exemplo, Solu-Medrol®), Midazolans (por exemplo, VERSED®), Morfinas (por exemplo, ASTRAMORPH/PF®), Octreotídeos (por exemplo, SANDOSTATIN®), Omalizumabs (por exemplo, XOLAIR®), Ondansetrons (por exemplo, ZOFRAN®), Palivizumabs (por exemplo, SYNAGIS®), Pantoprazóis (por exemplo, PROTONIX®), Pegaspargases (por exemplo, ONCASPAR®), Pegfilgrastins (por exemplo, NEULASTA®), Peg-Interferon Alfa-2a's (por exemplo, PEGASYS®), Peg-Interferon Alfa-2b's (por exemplo, PEG- ÍNTRON®), Pegvisomants (por exemplo, SOMA VERT®), Vacinas da Coqueluche, Piperacilinas (por exemplo, ZOSYN®), Vacinas Pneumocócicas (por exemplo, PNEUMOVAX® 23) e Vacinas Conjugadas Pneumocócicas (por exemplo, PREVNAR®), Prometazinas (por exemplo, PHENERGAN®), Reteplases (por exemplo, RETAVASE®), Somatropinas (por exemplo, GENOTROPIN®, HUMATROPE®, NORDITROPIN®, NUTROPIN®, SAIZEN®, SEROSTIM®, ZORBTIVE®), Sulbactans, Sumatriptanos (por exemplo, IMITREX®), Tazobactans, Tenecteplases (por exemplo, TNKASE®), Toxóides Purificados do Tétano, Ticarcilinas (por exemplo, TIMENTIN®), Tositumomabs (por exemplo, BEXXAR®), Triamcinolona Acetonidas, Vancomicinas (por exemplo, VANCONCIN®), Vacinas da Varicela (por exemplo, VARIVAX®) bem como outras vacinas; e similar.
[00421] Conforme aqui descrito e ilustrado, agentes farmacológicos de várias classes e vias de administração diferentes podem ser beneficiados pela co- administração e/ou co-formulação com sHASEGP (ou outras glicosaminoglicanases) para melhorar um ou mais de seus aspectos de uso. Tais melhorias podem compreender, por exemplo, uma ou qualquer combinação do que segue: (i) melhora do ponto e/ou taxa de absorção e então biodisponibilidade de um agente (por exemplo, fazendo com que mais dele atinja a corrente sangüínea após administração parenteral não-IV, e/ou menos dele seja degradado após tal administração local através de permeação mais rápida), que pode ser causada, por exemplo, através da aceleração de fluido intersticial e transporte potencialmente convectivo seguindo administração parenteral não-IV (por exemplo, através da aplicação de pressão hidrostática associada com o volume de injeção combinado com uma redução na impedância de fluxo associada com degradação de hialuronan); (ii) provisão de uma via mais segura e conveniente de administração (por exemplo, permitindo administração parenteral não-IV no lugar de IV, ou administrações parenterais não-IV melhoradas e mais convenientes tal como intradermal ou subcutânea no lugar de intramuscular); (iii) regimes de dosagem mais favoráveis (por exemplo, dosagem menos freqüente, ou uma dose mais freqüente mas menor via não-IV conforme oposto à dose IV menos freqüente mas maior); (iv) redução de um efeito colateral ou de outro modo diminuindo a toxidez (por exemplo, um efeito associado com a concentração inicialmente alta (Cmax alta) gerada pela dosagem IV, ou de uma dose local alta gerada por absorção lenta e/ou incompleta seguindo administração parenteral não-IV; (v) de outro molho melhorando a farmacocinética e/ou farmacodinâmica (por exemplo, permitindo que mais de um agente atinja o sítio alvo (por exemplo, através de fluxo de fluido intersticial e transporte convectivo aumentados devido à presença de sHASEGP no ou próximo ao sítio de aplicação tal como um sítio de injeção) e/o aprimorando a permeação dentro de um sítio alvo (por exemplo, através de fluxo de fluido intersticial e transporte convectivo aumentados devido à presença de sHASEGP dentro do sítio alvo), ou através da aplicação de um agente de preferência a um sítio alvo (por exemplo, através de administração local a um sítio alvo em conexão com administração local ou sistêmica de uma sHASEGP para promover permeação do alvo, ou usando veículos ou complexos macromoleculares para de preferência direcionar um agente a um sítio particular combinado com administração local ou sistêmica de sHASEGP para promover permeação do sítio alvo); Agentes que foram aplicados oralmente podem ser também beneficiados através de reformulações para aplicação parenteral para, por exemplo, evitar perda de agente para o trato gastrointestinal ou subseqüente degradação ou toxidez, permitir direcionamento mais eficaz a um sítio de ação desejado e então potencialmente maior eficácia e/ou menos toxidez, ou de outro modo provisão de perfis farmacocinéticos e/ou farmacodinâmicos mais favoráveis. Ainda, sHASEGPs podem ser usadas para melhorar a farmacodinâmica de agentes que são administrados oralmente (por exemplo, através do aumento da permeação de um agente oralmente administrado dentro de seu sítio alvo desejado (por exemplo, através de fluxo de fluido intersticial e transporte convectivo aumentados devido à presença de sHASEGP dentro do sítio de transporte seguindo administração sistêmica de sHASEGP e/ou seguindo administração local de sHASEGP ao sítio alvo).
[00422] Me smo em situações onde o sítio alvo desejado para um agente tal como farmacológico é a própria corrente sangüínea, tais agentes podem ser aumentados através de co-administração e/ou co-formulação com sHASEGP (ou outras glicosaminoglicanases). Por exemplo, existem vários agentes que agem como modificadores de sangue, que podem ser administrados através de uma ou várias vias incluindo dosagem oral bem como administração parenteral (tal como injeção IV). Vários agentes que são ou poderiam ser administrados oralmente não-obstante exibem absorção relativamente limitada ou lenta e/ou são submetidos à degradação indesejada (e há outros agentes que são geralmente seguros e eficazes uma vez introduzidos na corrente sangüínea mas não são administrados oralmente por esta razão). Administração parenteral de tais agentes (por exemplo, através de vias intramusculares, subcutâneas, intradermais ou transdermais em combinação com administração de sHASEGP, de preferência no ou próximo ao sítio de administração parenteal) pode então ser empregada para prover a introdução na corrente sangüínea. Ainda, existem várias situações médicas urgentes onde aplicação rápida de um agente à corrente sangüínea é essencial mas dosagem oral é muito lenta e dosagem intravenosa é ou inconveniente, insegura ou indisponível. Essas situações urgentes incluem aquelas onde o sangue é o alvo bem como aquelas onde a corrente sangüínea é simplesmente a via de aplicação para um outro tecido alvo. Em tais situações, a habilidade em combinar administração com uma sHASEGP (ou aplicar uma co-formulação já preparada com uma sHASEGP) pode permitir aplicação rápida do agente através de administração parenteral não-IV. Como será também compreendido por aqueles versados na técnica, existem várias formulações e dispositivos feitos para administrações não- parenterais que podem prover, por exemplo, aplicação de agentes cronometrada ou de outro modo ativada, bem como dosagem variavelmente controlada e similar. Um grande número de tais agentes farmacológicos (que podem ser co-formulados com ou usados em combinação com uma sHASEGP) é regularmente aplicado em prática médica e aspectos de seu uso bem- descritos (vide, por exemplo, a Physician's Desk Reference, Thomson, 2003, 2004, 2005) e muitos outros tais agentes são conhecidos na técnica. Com relação à última consideração, como será compreendido por aqueles versados na técnica, sHASEGPs podem ser empregadas em combinação com agentes atualmente usados (por exemplo, para melhorar sua aplicabilidade conforme aqui descrito), com agentes que não são atualmente usados (para, por exemplo, melhorar sua farmacocinética e/ou farmacodinâmica e então torná-los úteis), ou com agentes que são recém-desenvolvidos.
[00423] Deste modo, para agentes farmacológicos (tal como agentes anticâncer, modificadores de sangue ou membros de outras classes de agentes conforme aqui descrito) que são tipicamente introduzidos parenteralmente (por exemplo, através de injeção IV), sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) podem ser usadas, por exemplo, para permitir que tais agentes sejam administrados através de outras vias potencialmente mais convenientes e/ou seguras tal como através de administração parenteral não-IV (por exemplo, através de vias intramusculares, subcutâneas, intradermais ou transdermais). Para agentes que já são aplicados através de uma via parenteral não-IV, sHASEGPs podem ser usadas para aumentar seu ponto e/ou taxa de absorção e aplicação (por exemplo, através de promoção de sua dispersão e subseqüente entrada na corrente sangüínea, o que pode ser provavelmente auxiliado por transporte convectivo conforme descrito aqui). Vantagens de tais efeitos incluem ter uma porção maior do agente atingindo a corrente sangüínea, ter exposição local reduzida ao agente (em termos de concentração e/ou tempo) (por exemplo, no ou próximo ao sítio de injeção, que freqüentemente limita a dosagem ou resulta em questões de toxidez local), aumento da velocidade na qual um agente pode ser aplicado na corrente sangüínea, outras propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas aperfeiçoadas e conveniência de administração. Na última consideração, administrações parenterais não-IV podem permitir que muitos agentes sejam administrados fora do hospital que de outro modo requereriam hospitalização ou outra atenção médica tipicamente requerida para administrações intravenosas.
[00424] Exemplos ilustrativos de modificadores de sangue incluem agentes tal como agente anti-hemofílicos e agentes de deficiência de fator de sangue (incluindo, por exemplo, fatores anti-hemofílicos (por exemplo, ADVATE®, HEMOFIL®, KOATE®-DVI, KOGENATE®-FS, RECOMBINATE® e REFACTO®), complexos coagulantes anti-inibidor (por exemplo, FEIBA® VH), antitrombina IIIs (por exemplo, THROMBATE® III), Factor VIIs de coagulação (por exemplo, NOVOSEVEN®), Factor VIIIs de coagulação (por exemplo, ADVATE®, KOGENATE®-FS e RECOMBINATE®), Factor IXs de coagulação (por exemplo, BEBULIN®, BENEFIX® e PROPLEX® T), frações de proteína do plasma (por exemplo, PLASMANATE®), fatores von Willebrand)); agentes antiplaqueta (incluindo, por exemplo, abciximabs (por exemplo, REOPRO®), anagrelidas (por exemplo, AGRYLIN®), cilostazóis (por exemplo, PLETAL®), bissulfatos de clopidogrel (por exemplo, PLAVIX®), dipiridamóis (por exemplo, AGGRENOX® e PERSANTINE®), epoprostenóis (por exemplo, FLOLAN®), eptifibatídeos (por exemplo, INTEGRILIN®), tirofibans (por exemplo, AGGRASTAT®)); fatores de estimulação de colônica (CSFs) (incluindo, por exemplo, CSFs de Granulócito (por exemplo, NEULASTA® e NEUPOGEN®) e CSFs de Granulócito Macrófago (por exemplo, LEUKINE®)); estimuladores de eritropoiese (incluindo, por exemplo, eritropoietinas tal como darbepoetin alfa (por exemplo, ARANESP®) e epoetin alfas (por exemplo, EPOGEN® e PROCRIT®); hemostáticos e albuminas (incluindo, por exemplo, aprotininas (por exemplo, TRASYLOL®), combinações de fatores anti-hemofílicos e plasma (por exemplo, ADVATE®), Acetatos de Desmopressina (por exemplo, DDAVP®), e albuminas (por exemplo, BUMINATE® e PLASBUMIN®)); globulinas imunes (por exemplo, BAYGAM®, CARIMUNE®NF IV, FLEBOGAMMA®, GAMIMUNE®, GAMMAGARD S/D®, GAMUNEX®, IVEEGAM®, IVEEGAM® EN IGIV, MICRHOGAM®, RHOGAM®, PANGLOBULIN® e THYMOGLOBULIN®, bem como globulinas imunes da hepatite B (por exemplo, BAYHEP® B, NABI-HB® e NOVAPLUS® NABI-HB); inibidores de trombina (incluindo, por exemplo, inibidores de trombina diretos (por exemplo, ARGATROBAN®) e lepirudina (por exemplo, REFLUDAN®) e drotecogin alfas (por exemplo, XIGRIS®); anticoagulantes (incluindo, por exemplo, dalteparinas, enoxaperinas e outras heparinas (por exemplo, FRAGMIN® e LOVENOX®), warfarinas (por exemplo, COUMADIN® e JANTOVEN®)); e similar.
[00425] A título de ilustração adicinal, exemplos de vários tipos de agentes que foram administrado parenteralmente e que podem ser co-adiministrados e/ou co- formulados com sHASEGPs (ou outras glicosaminoglicanases) estão incluídos na lista que segue: Acetazolamidas; Aciclovirs; Adipiodonas; Alatrofioxacinas; Aldesleucinas; Alemtuzumabs; Alfentanilas; Extratos Alergênicos; Alopurinóis; Inibidores de afa 1-proteinase; Alprostadils; Amifostinas; Amicacinas; Aminoácidos; Ácidos aminocapróicos; Aminofilinas; Amitriptilinas; Amobarbitáis; Amrinonas; Anaquinras; Analgésicos; Vacinas antipoliomelíticas; Soros anti-rábicos; Imunoglobulinas antitétano; antitrombina IIIs; Soros antídotos; Argatrobans; Argininas; Arsênicos; Ácidos Ascórbicos; Asparaginases; Atenolóis; Atracuriuns; Atropinas; Aurotioglicoses; Azatioprina; Azitromicinas; Aztreonams; vacinas de Bacillus Calmette-Guerin (BCG); Bacitracins; Baclofenos; Basiliximabs; Ácidos benzóicos; Benztropinas; Betametasonas; Biotinaa; Bivalirudinas; Bleomicinas; Antitoxinas de Botulismo; Bretiliuns; Bumetanidas; Bupivacaínas; Buprenorfinas; Bussulfanos; Butorfanóis; Calcitoninas; Calcitrióis; Cálcios; Capreomicinas; Carboprosts; Carmustinas; Carnitinas; Caspofunginas; Cefamandóis; Cefazolinas; Cefoperazonas; Cefotaximas; Cefotetanos; Cefoxitinas; Ceftazidimas; Ceftizoximas; Cefuroximas; Cloranfenicóis; Cloroprocaínas; Cloroquinas; Clorotiazidas; Clorpromazinas; Ácidos Condroitinsulfúricos; Coriogonadotropina alfas; Cromos; Cidofovirs; Cimetidinas; Ciprofloxacinas; Cisatracuriuns; Cisplatinas; Cladribinas; Ácidos Clavulânicos; Clindamicinas; Clonidinas; Codeínas; Colchicinas; Colistinas; Colágenos; Triflutato Ovino de Corticorelina; Corticotrofinas; Cosintropinas; Cianocobalaminas; Ciclofosfamindas; Ciclosporinas; Cisteínas; Citarabinas; Dacarbazinas; Dacliximabs; Dactinomicinas; Dalfopristinas; Dalteparinas; Danaparóides; Dantrolenos; Daunorrubicinas; Deferoxamins; Denileucina; Diftitoxs; Desmopressins; Dexametasonas; Dexmedetomidinas; Dexpantenóis; Dexrazoxanas; Dextranss; Ácidos Diatrizóicos; Diazepans; Diazoxidas; Diciclominas; Digibinds; Digoxinas; Diidroergotaminas; Diltiazens; Difendraminas; Difteria, vacinas do tétano e coqueluche; Antitoxinas da difteria; Dipiridamóiss; Dobutaminas; Dopaminas; Doxacuriuns; Doxaprans; Doxercalciferóis; Doxiciclinas; Droperidóis; Drotrecogin alfas; Difilinas; Ácidos edéticos; Edrofonios; Enalaprilatos; Efedrinas; Epoprostenóis; Ergocalciferols; Ergonovinas; Ertapenens; Eritromicinas; Esmolóis; Estradióis; Estrogênicos; Ácidos Etacrínicos; Etanolaminas; Etanóis; Óleos etiodizados; Ácidos etidrônicos; Etomidatos; Etoposídeo; Fator VIIIs; Famotidinas; Fenoldopans; Fentanilas; Floxuridinas; Fludarabinas; Flumazenilas; Fluoresceínas; Fluorouracilas; Flufenazinas; Ácidos fólicos; Hormônios de estimulação de folículo; Fomepizóis; Fomivirsenos; Fondaparinuxs; Foscarnets; Fosfenitoínas; Fulvestrants; Furosemidas; Gadoteridóis; Gadoversetamidas; Ganciclovirs; Gatifloxacinas; Gemtuzumab ozogamicinas; Gentamicinas; Glucagons; Glicoses; Glicinas; Glicopirrolatos; Gonadorelinas; Gonadotropina coriônicas; polissacarídeos Haemophilus B; Haloperidóis; Heminas; vacinas de Hemophilus influenza; Vacinas da hepatite; Herbais; Histaminas; Hidralazinas; Hidrocortisonas; Hidromorfonas; Hidroxocobalaminas; Hidroxizinas; Hiosciaminas; Ibutilidas; Idarrubicinas; Ifosfamidas; Imiglucerases; Imunoglobulinas; Índigo carminas; Indometacinas; Interferon alfa-con1s; Interferon alfa-2As; Interferon alfa-N3s; Interferon beta- IAs; Iodidas; Iopromidas; Ácidos iotalâmicos; Ácidos ioxáglicos; Ioxilanos; injeções de ferro dextrano; Isoniazidas; Isoproterenóis; vacinas da encefalite Japonesa; Canamicinas; Cetaminas; Cetorolacs; Labetalóis; Lepirudinss; Leucovorinas; Leuprolidas; Levobupivacaínas; Levotiroxinas; Lidocaínas; Lincomicinas; Linezolidas; Liotironinas; Lorazepans; Hormônios luteinizantes; Vacinas da doença de Lyme; Mangafodipirs; Manitóis; Vírus do sarampo; Mecloretaminas; Melfalans; Vacinas de polissacarídeo Meningocócico; Meperidinas; Mepivacaínas; Meropenens; Mesnas; Mesoridazinas; Metaraminóis; Metadonas; Metocarbamóis; Methoexitais; Metotrexatos; Metildopatos; Metilergonovinas; Metoclopramidas; Metoprolóis; Metronidazóis; Midazolans; Minociclinas; Mitrancinas; Mitomicinas; Mitoxantronas; Mivacuriuns; Ácido morruicos; Moxifloxacins; Vírus da cachumba; Muromonab-CD3s; Micofenolato mofetis; Nafcilinas; Nalbufinas; Nalmefenos; Naloxonas; Nandrolonas; Neostigminas; Niacinamidas; Nicardipinas; Nitroglicerinass; Nitroprussidas; Norepinefrinas; Oprelvecinas; Orfenadrinas; Oxacillinas; Oxaliplatinas; Oxiniorfonas; Oxitetraciclinas; Oxitocinas; Pancuroniuns; Pantenóis; Ácidos pantotênicos; Papaverinss; Pegaspargases; Peginterferon alfa 2As; Penicilina Gs; Pentamidinas; Pentazocinas; Pentobarbitals; Pentostatinas; Perflutrens; Perfenazinas; Vacina da coqueluche; Fenobarbitais; Fentolaminas; Fenilefrinas, Fentoínas; Fisostigminas; Fitonadionas; Vacinas pneumococais; Polimixina bs; Porfímeros; Pralidoximas; Prilocaínas; Procainamidas; Procaínas; Proclorperazinas; Progesteronas; Prometazinas; Propranolóis; Hidróxidos de piridostigmina; Piridoxinas; Quinidinas; Quinupristinas; Imunoglobulinas da raiva; Vacinas da raiva; Ranitidinas; Rasburicases; Remifentanilas; Riboflavinas; Rifampinas; Ropivacaínas; Vacinas da rubéola; Samariuns; Escopolaminas; Selênio; Sermorelinas; Sincalidas; Somatrens; Espectinomicinas; Estreptocinases; Estreptomicinas; Estreptozocinas; Succinilcolinas; Sufentanilas; Sulbactans; Sulfametoxazóis; Sumatriptanos; Tacrolimus; Teniposídeos; Terbutalinas; Teriparatidas; Testosteronas; Antitoxinas do tétano; Tetracaínas; sulfatos de Tetradecila; Teofilinas; Tiaminas; Tietillperazinas; Tiopentais; Hormonios estimulantes da tireóide; Ticarcilinas; Tinzaparinas; Tirofibanos; Tobramicinas; Tolazolinas; Tolbutamidas; Topotecanos; Torsemidas; Ácidos tranexâmicos; Treprostinilas; Triancinolona acetonidas; Triancinolona hexacetonidas; Triancinolonas; Trietilenetiofosforamidas (Thiotepa); Trifluoperazinas; Trimetobenzamidas; Trimetoprins; Trimetrexatos; Triptorelinas; Trometaminas; Tuberculinas; Vacinas tifóides; Urofolitropinas; Urocinases; Ácidos valpróicos; Valrubicinas; Imunoglobulinas de Varicella Zoster; Vasopressinas; Vecuroniuns; Verapamils; Vinblastinas; Vincristinas; Voriconazóis; Warfarinas; Vacinas da febre amarela; Zidovudinas; Zincos; Cloridratos de Ziprasidona; e agentes relacionados ao acima ou nas mesmas classes ou classes similares às acima.
[00426] Soluções ou suspensões usadas para administração parenteral (incluindo através de aplicação intramuscular, intradermal, subcutânea, tópica e outras vias não-orais) podem incluir qualquer um dos componentes que seguem: um diluente estéril, tal como água para injeção, solução salina, óleo fixo, polietileno glicol, glicerina, propileno glicol ou outro solvente sintético; agentes antimicrobianos, tal como álcool benzílico e metil parabenos; antioxidantes, tal como ácido ascórbico e bissulfeto de sódio; agentes de quelação, tal como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA); tampões, tal como acetatos, citratos e fosfatos; e agentes para o ajuste de tonicidade, incluindo, mas não limitado a, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, dextrose, glicerol e ácido bórico. Preparações parenterais podem ser encerradas em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose única ou múltipla feitos de vidro, plástico ou outro material adequado.
[00427] Os polipeptídeos de sHASEGP ou seus domínios hialuronidase humana solúveis podem ser suspensos em forma micronizada ou outra adequada e podem ser derivatizados para produzir um produto ativo mais solúvel ou produzir um pró-fármaco. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do polipeptídeo no veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar a condição direcionada e pode ser empiricamente determinada usando métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Para formular uma composição, a fração em peso de polipeptídeo é dissolvida, suspensa, dispersa ou de outro modo misturada em um veículo selecionado em uma concentração eficaz de modo que a condição direcionada é aliviada ou melhorada.
[00428] Em casos onde os polipeptídeos de sHASEGP ou seu domínio hialuronidase humana solúvel exibirem solubilidade insuficiente, métodos para solubilização de polipeptídeos podem ser usados. Tais métodos são conhecidos daqueles versados na técnica, e incluem, mas não estão limitados a, uso de co-solventes, tal como sulfóxido de dimetila (DMSO), uso de tensoativos, tal como TWEEN® e Pluronic® F68; ou dissolução em bicarbonato de sódio aquoso. Derivados dos polipeptídeos, tal como pró-fármacos dos polipeptídeos podem ser também usados em formulação de composições farmacêuticas eficazes. Para indicações oftálmicas, as composições são formuladas em um veículo oftalmicamente aceitável. Para os presentes usos oftálmicos, administração local, ou através de administração tópica ou através de injeção, é compreendida. Formulações de liberação com o tempo são também desejáveis. Tipicamente, as composições são formuladas para administração de dosagem única, de modo que uma dose única administra uma quantidade eficaz.
[00429] Quando da mistura ou adição do polipeptídeo com o veículo, a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou outra composição e pode ser formulada como uma mistura aquosa, um creme, géis, ungüentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irritações, sprays, supositórios, bandagens ou qualquer outra formulação adequada para administração sistêmica, tópica ou local.
[00430] A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no veículo selecionado. Se necessário, sais farmaceuticamente aceitáveis ou outros derivados dos compostos são preparados. Para administração interna local, tal como administração intramuscular, parenteral ou intra-articular, os compostos são de preferência formulados como uma solução suspensão em um meio de base aquosa, tal como solução salina isotonicamente tamponada ou são combinados com um apoio biocompatível ou bioadesivo pretendido para administração interna.
[00431] O polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio hialuronidase humana solúvel é incluído no veículo farmaceuticamente aceitável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejados no paciente tratado. É compreendido que o número e grau de efeitos colaterais dependem da condição para a qual os compostos são administrados. Por exemplo, certos efeitos colaterais tóxicos e indesejados são tolerados quando tratando doenças ameaçadoras à vida que não seriam tolerados quando tratando distúrbios de menor conseqüência. Quantidades eficazes para uso terapêutico vão, com certeza, depender da severidade da doença e do peso e estado geral do indivíduo bem como da via de administração. Administração local do agente terapêutico vai tipicamente requerer uma dosagem menor do que qualquer modo de administração sistêmica, embora a concentração local do agente terapêutico possa, em alguns casos, ser maior seguindo administração local que pode ser obtida com segurança quando da administração sistêmica.
[00432] Uma vez que sujeitos individuais podem apresentar uma ampla variação na severidade de sintomas e cada agente terapêutico tem características terapêuticas únicas, é decisão do praticamente determinar a resposta de um indivíduo a tratamento e variar as dosagens conseqüentemente. As dosagens usadas in vitro podem prover orientação útil das quantidades úteis para administração in situ da composição farmacêutica, e modelos animais podem em alguns casos ser usados para determinar dosagens eficazes para tratamento de distúrbios particulares. Em geral, no entanto, para administração local, é compreendido que uma quantidade eficaz do agente terapêutico será uma quantidade dentro da faixa de a partir de cerca de 0,1 picograma (pg) a até cerca de 1 ng por kg de peso do corpo. Várias considerações para chegar a uma quantidade eficaz são conhecidas daqueles versados na técnica e são descritas (vide, por exemplo, Goodman e Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a ed., Pergamon Press, 1990; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; e Mantyh e outros (Science, 278:275-79, 1997) envolvendo a injeção intratecal de um ligante-toxina específico neuronal, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade).
[00433] As formulações dos polipeptídeos de sHASEGP ou seus domínio hialuronidase humanas solúveis para uso aqui incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, tópica, inalação, bucal, sublingual, outra parenteral (por exemplo, subcutânea, intramuscular, intradermal, transdermal ou intravenosa) ou qualquer via. A via mais adequada em qualquer caso dado depende da natureza e da severidade da condição sendo tratada e da natureza do composto ativo particular que está sendo usado. As formulações são providas para administração a seres humanos e animais em formas de dosagem unitárias, tal como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parenterais estéreis e soluções ou suspensões orais, e emulsões óleo-água contendo quantidades adequadas dos polipeptídeos e/ou outros agentes ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis. Os polipeptídeos terapeuticamente ativos farmacêuticos e/ou outros agentes ou seus derivados são tipicamente formulados e administrados em formas de dosagem unitária ou formas de dosagem múltipla. Uma forma de dosagem unitária conforme aqui usado refere-se a unidades fisicamente diferentes adequadas para indivíduos humanos e animais e embaladas individualmente como é sabido na técnica.
[00434] As composições farmacêuticas são providas para administração a seres humanos e animais em formas de dosagem unitária, tal como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parenterais estéreis e soluções ou suspensões orais, e emulsões óleo- água contendo quantidades adequadas do polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio hialuronidase humana solúvel e, opcionalmente, um outro agente ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos farmaceuticamente terapeuticamente ativos e seus derivados são tipicamente formulados e administrados em formas de dosagem unitária ou formas de dosagem múltiplas. Uma forma de dose unitária conforme aqui usado refere-se a unidades fisicamente separadas adequadas para indivíduos humanos e animais e individualmente embaladas como é sabido na técnica. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada do composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo, veículo ou diluente farmacêutico requerido. Exemplos de formas de dose unitária incluem, mas não estão limitados a, ampolas, seringas e comprimidos ou cápsulas individualmente embalados. Por exemplo, uma formulação de volume pequeno contendo uma solução estabilizada com 1 a 5000 Unidades de sHASEGP em um volume pequeno, tal como 5 a 50 μL, pode ser embalada em uma seringa para uso, tal como após injeção de viscoelástico. Formas de dosagem unitária podem ser administradas em suas frações ou múltiplos. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitárias idênticas embaladas em um único recipiente a serem administradas em forma de dosa unitária segregada. Exemplos de formas de dose múltipla incluem frascos, garrafas de comprimidos ou cápsulas ou garrafas de "pintas" (medida de líquido) ou galões. Deste modo, forma de dose múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não são segregadas em embalagem.
[00435] A composição pode conter junto com o ingrediente ativo, tal como um polipeptídeo de sHASEGP: um diluente, tal como lactose, sacarose, fosfato dicálcio ou carboximetilcelulose; um lubrificante, tal como estearato de magnésio e talco; e um ligante tal como amido, gomas naturais, tal como goma acácia, gelatina, glicose, molassas, polivinilpirrolidona, celuloses e seus derivados, povidona, crospovidonas e outros tais ligantes conhecidos daqueles versados na técnica. Composições farmaceuticamente administráveis líquidas podem, por exemplo, ser preparadas através de dissolução, dispersão ou de outro modo misturando um composto ativo conforme acima definido e opcionalmente adjuvantes farmacêuticos em um veículo, tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, glicóis, etanol e similar, para então formar uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada pode também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas tal como agentes umectantes, agentes emulsificantes, ou agentes solubilizantes, agentes de tamponamento de pH e similar, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato sorbitano, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina e outros tais agentes. Métodos de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão aparentes, àqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa, 15a Edição, 1975). A composição ou formulação a ser administrada contém uma quantidade do composto ativo em uma quantidade suficiente para aliviar os sintomas do indivíduo tratado. Por exemplo, uma formulação estabilizada padrão de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel conforme aqui provido inclui 150 Unidades/ml de glicoproteína solúvel formulada em EDTA, NaCl e CaCl2. Adicionalmente, um agente antibacteriano ou antifúngico, incluindo, mas não limitado a timerosal, pode estar presente na formulação. Uma outra formulação provida aqui é uma solução estabilizada ou forma liofilizada de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel em EDTA, NaCl e CaCl2, contendo uma quantidade ativa eficaz da glicoproteína solúvel, tal como 150 Unidade/ml, com a adição de lactose, tal como 13 mg/ml. É também provida aqui uma formulação contendo uma solução estabilizada ou forma liofilizada de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel em EDTA, NaCl e CaCl2 contendo uma quantidade ativa eficaz da glicoproteína solúvel, tal como 150 Unidade/ml, com a adição de lactose, tal como 13 mg/ml, e Albumina, Pluronic® F68, TWEEN® e/ou outro detergente. Uma outra formulação provida aqui, ou liofilizada ou como uma solução estabilizada, contém uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, tal como 1 a 300 Unidades/ml, em EDTA, NaCl e CaCl2.
[00436] Fo rmas de dosagem ou composições contendo ingrediente ativos na faixa de 0,005% a 100% com o equilíbrio formado de veículo não-tóxico podem ser preparadas. Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparados através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tal como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinil pirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogênio fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos através de métodos bem-conhecidos na técnica.
[00437] A sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados com veículos que protegem a glicoproteína solúvel contra eliminação rápida do corpo, tal como formulações ou revestimento de aplicação com o tempo. As composições podem incluir outros agentes farmaceuticamente eficazes conhecidos na técnica geral serem de valor no tratamento de uma ou mais das doenças ou condições médicas, incluindo, mas não limitado a, um agente quimioterapêutico, um agente analgésico, um agente antiinflamatório, um agente antimicrobiano, um agente amoebicida, um agente tricomonocidal, um agente anti- parkison, um agente antimalária, um agente anticonvulsivo, um agente antidepressivo, um agente antiarrítmico, um agente antifúngico, um agente anti-hipertensivo, um agente antipirético, um agente antiparasita, um agente anti- histamina, um agente agonista alfa-adrenérgico, um agente alfa-bloqueador, um agente anestésico, um agente dilatador dos brônquios, um agente biocida, um agente bactericida, um agente bacteriostático, um agente bloqueador betaadrenérgico, um agente bloqueador de canal de cálcio, um agente de fármaco cardiovascular, um agente contraceptivo, um agente descongestionante, um agente diurético, um agente depressivo, um agente de diagnóstico, um agente eletrólito, um agente hipnótico, um agente de hormônio, um agente hiperglicêmico, um agente relaxante muscular, um agente de contração muscular, um agente oftálmico, um agente parassimpatomimético, um agente energizador psíquico, agente oftálmico, um parassimpatomimético, um agente energizador psicótico, um agente sedativo, um agente simpatomimético, um agente tranqüilizante, um agente urinário, um agente vaginal, um agente viricida, um agente vitamina, um agente antiinflamatório não-esteroidal, um agente inibidor de enzima de conversão angiotensina, um polipeptídeo, uma proteína, um ácido nucléico, um fármaco, um pró-fármaco, uma molécula orgânica e um indutor do sono, para se obter combinações de propriedades desejadas. Deve ser compreendido que tal terapia de combinação constitui um aspecto adicional das composições e métodos de tratamento providos aqui.
1. COMPOSIÇÕES PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL
[00438] Fo rmas de dosagem farmacêuticas são sólidas, em gel ou líquidas. As formas de dosagem sólidas são comprimidos, cápsulas, grânulos e pós brutos. Tipos de comprimidos orais incluem pastilhas comprimidas, mastigáveis, e comprimidos, que podem ser revestidos entericamente, revestidos com açúcar ou revestidos com película. Cápsulas podem ser cápsulas e gelatina dura ou mole, enquanto grânulos e pós podem ser providos em forma não-efervescente ou efervescente com a combinação de outros ingredientes conhecidos daqueles versados na técnica.
[00439] As composições farmacêuticas contendo uma sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel podem estar em forma líquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentadas como um produto de fármaco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tal como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não-aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, propil-p- hidroxibenzoatos de metila ou de ou ácido sórbico).
[00440] Em certas modalidades, as formulações são formas de dosagem sólidas, de preferência cápsulas ou comprimidos. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e similar podem conter qualquer um dos ingredientes que seguem, ou compostos de uma natureza similar: um ligante; um diluente; um agente de desintegração; um lubrificante; um agente de deslizamento; um agente adoçante; e um agente aromatizante.
[00441] Exemplos de ligantes incluem celulose microcristalina, goma tragacanto, solução de glicose, mucilagem acácia, solução de gelatina, pasta de sacarose e amido. Lubrificantes incluem talco, amido, estearato de magnésio ou cálcio, licopódio ou ácido esteárico. Diluentes incluem, por exemplo, lactose, sacarose, amido, caulim, sal, manitol e fosfato dicálcio. Agente de deslizamentos incluem, mas não estão limitados a, dióxido de silício coloidal. Agentes de desintegração incluem croscarmelose de sódio, amido glicolato de sódio, ácido algínico, amido de milho, amido de batata, bentonita, metilcelulose, ágar e carboximetilcelulose. Agentes de coloração incluem, por exemplo, qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água certificados aprovados, suas misturas; e corantes FD e C insolúveis em água suspenso sem hidrato de alumina. Agentes adoçantes incluem sacarose, lactose, manitol e agentes adoçantes artificiais tal como sacarina, e qualquer número de aromas secos com pulverização. Agentes aromatizantes incluem aromas naturais extraídos de plantas tal como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação agradável, tal como, mas não limitado a, hortelã-pimenta e salicilato de metila. Agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e polioxietileno laural éter. Revestimentos eméticos incluem ácidos graxos, gorduras, ceras, goma-laca, goma-laca amoniada e ftalatos de acetato de celulose. Revestimentos em película incluem hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, polietileno glicol 4000 e ftalato de acetato de celulose.
[00442] Se administração oral for desejada, a sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel poderia ser provido em uma composição que a protege do ambiente ácido do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formulada em um revestimento entérico que mantém sua integridade no estômago e libera o composto ativo no intestino. A composição pode ser também formulada em combinação com um antiácido ou outro tal ingrediente.
[00443] Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula, ela contém, em adição a material do tipo acima, um veículo líquido tal como um óleo graxo. Em adição, formas de unidade de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar e outros agentes entéricos. Os compostos podem ser também administrados como um componente de um elixir, suspensão, xarope, wafer, pulverizador, goma de mascar ou similar. Um xarope de conter, em adição aos compostos ativos, sacarose como um agente adoçante e certos conservantes, corantes e agentes de coloração e aromatizantes.
[00444] A sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel pode ser também misturada com outros materiais ativos que não prejudiquem a ação desejada, ou com materiais que suplementem a ação desejada, tal como antiácidos, bloqueadores de H2 e diuréticos. O ingrediente ativo é um composto ou seu derivado farmaceuticamente aceitável conforme aqui descrito. Concentrações mais altas, até cerca de 98% em,peso do ingrediente ativo, podem ser incluídas.
[00445] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluídos em comprimidos são ligantes, lubrificantes, diluentes, agentes de desintegração, agentes de coloração, agentes de aromatização e agentes umectantes. Comprimidos entericamente revestidos, por causa de seu revestimento entérico, resistem à ação do ácido do estômago e dissolvem ou desintegram nos intestinos neutros ou alcalinos. Comprimidos revestidos com açúcar são comprimidos prensados aos quais camadas diferentes de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são aplicadas. Comprimidos revestidos com película são comprimidos prensados que foram revestidos com um polímero ou outro revestimento adequado. Comprimidos prensados múltiplos são comprimidos prensados feitos de mais de um ciclo de compressão utilizando as substâncias farmaceuticamente aceitáveis anteriormente mencionadas. Agentes de coloração podem ser também usados nas formas de dosagem acima. Agentes aromatizantes e adoçantes são usados em comprimidos revestidos, comprimidos revestidos com açúcar, prensados múltiplos e mastigáveis. Agentes aromatizantes e adoçantes são especialmente úteis na formação de comprimidos e pastilhas mastigáveis.
[00446] Formas de dosagem oral líquidas incluem soluções, emulsões, suspensões aquosas, soluções e/ou suspensões reconstituída a partir de grânulos não- efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas de grânulos efervescentes. Soluções aquosas incluem, por exemplo, elixires e xaropes. Emulsões ou são óleo-em-água ou água-em-óleo.
[00447] El ixires são preparações transparentes, adoçadas, hidroalcoólicas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em elixires incluem solventes. Xaropes são soluções aquosas concentradas de açúcar, por exemplo, sacarose, e podem conter um conservante. Uma emulsão é um sistema de duas fases onde um líquido é disperso na forma de glóbulos pequenos em um outro líquido. Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em emulsões são líquidos não-aquosos, agentes emulsificantes e conservantes. Suspensões usam agentes de suspensão e conservantes farmaceuticamente aceitáveis. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos não-efervescentes, a serem reconstituídas em uma forma de dosagem oral líquida, incluem agentes diluentes, adoçantes e umectantes. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos efervescentes, a serem reconstituídas em uma forma de dosagem oral líquida, incluem ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Agentes de coloração e aromatização são usados em todas as formas de dosagem acima.
[00448] Solventes incluem glicerina, sorbitol, álcool etílico e xarope. Exemplos de conservantes incluem glicerina, metil e propilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio e álcool. Exemplos de líquidos não-aquosos utilizados em emulsões incluem óleo mineral e óleo de semente de algodão. Exemplos de agentes emulsificantes incluem gelatina, acácia, tragacanto, bentonita e tensoativos tal como monooleato de polioxietileno sorbitano. Agentes de suspensão incluem carboximetilcelulose de sódio, pectina, tragacanto, Veegum e acácia. Diluentes incluem lactose e sacarose. Agentes adoçantes incluem sacarose, xaropes, glicerina e agentes adoçantes artificiais tal como sacarina. Agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e polioxietileno lauril éter. Aditivos orgânicos incluem ácidos cítrico e tartárico. Fontes de dióxido de carbono incluem bicarbonato de sódio e carbonato de sódio. Agentes de coloração incluem qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água certificados aprovados e suas misturas. Agentes aromatizantes incluem aromatizantes naturais extraídos de plantas tal como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação de gosto prazerosa.
[00449] P ara uma forma de dosagem sólida, a solução ou suspensão, em, por exemplo, carbonato de propileno, óleos vegetais ou triglicerídeos, é encapsulada em uma cápsula de gelatina. Tais soluções, e sua preparação e encapsulação, são descritas nas Patentes U.S. Nos. 4.328.245; 4.409.239; e 4.410.545. Para uma forma de dosagem líquida, a solução, por exemplo, em um polietileno glicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um veículo líquido farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água, para ser facilmente medida para administração.
[00450] Alternativamente, formulações orais líquidas ou semi-sólidas podem ser preparadas através de dissolução ou dispersão da a sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel em óleos vegetais, glicóis, triglicerídeos, propileno glicol ésteres (por exemplo, carbonato de propileno) e outros tais veículos, e encapsulação dessas soluções ou suspenso em cascas de cápsula de gelatina dura ou mole. Outras formulações úteis incluem aquelas mostradas nas Patentes U.S. Nos. Re 28.819 e 4.358.603.
[00451] Formulações adequadas para administração bucal (sublingual) incluem, por exemplo, pastilhas contendo a sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel em uma base aromatizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto; e pastilhas contendo o composto em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.
[00452] Em todas as modalidades, formulações de comprimido e cápsulas podem ser revestidas como sabido por aqueles versados na técnica para modificar ou suster a dissolução do ingrediente ativo. Deste modo, por exemplo, elas podem ser revestidas com um revestimento entericamente revestido convencional, tal como fenilsalicilato, ceras e ftalato de acetato de celulose.
2. INJETÁVEIS, SOLUÇÕES E EMULSÕES
[00453] Administração parenteral da sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, geralmente caracterizada por injeção, ou subcutânea, intramuscular ou intravenosamente, é também compreendida aqui. Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, ou como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol e etanol. Ainda, se desejado, as composições farmacêuticas a serem administradas podem também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas tal como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH, estabilizadores, aprimoradores de solubilidade e outros tais agentes, tal como, por exemplo, acetato de sódio, monolaurato sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas. Implante de um sistema de aplicação lenta ou aplicação sustentada, de modo que um nível constante de dosagem seja mantido (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 3.710.795) é compreendido aqui. A porcentagem da sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel contida em tais composições parenterais é dependente da sua natureza específica, bem como da atividade do composto e das necessidades do indivíduo.
[00454] Administração parenteral das composições inclui administrações intravenosas, subcutâneas e intramusculares. Preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis secos estéreis, tal como pós liofilizados, prontos para ser combinados com um solvente ou solução estéril um pouco antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para ser combinados com um veículo um pouco antes do uso e emulsões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não-aquosas.
[00455] Se administrados intravenosamente, os veículos incluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), e soluções contendo agentes de espessamento ou solubilizantes, tal como glicose, polietileno gicol e polipropileno glicol e suas misturas.
[00456] Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não-aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, oxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersão, agentes emulsificantes, agentes de seqüestro ou quelação e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis.
[00457] Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de dextrose isotônica, Injeção de Água Estéril, Dextrose e Injeção de Ringer Lactada. Veículos parenterais não-aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo e óleo de amendoim. Agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas devem ser adicionados a preparações parenterais embaladas em recipientes de dose múltipla que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres do ácido metil e propil p- hidroxibenzóico, timerossal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilose e polivinilpirrolidona. Agentes de emulsificação incluem Polissorbato 80 (TWEEN® 80). Um agente de seqüestro ou quelação de íons de metal inclui EDTA. Veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para ajuste do pH.
[00458] A concentração de composto farmaceuticamente ativo é ajustada de modo que a injeção provê uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. A dose exata depende da idade, peso e condição do paciente ou animal como é sabido na técnica.
[00459] As preparações parenterais de dose unitária são embaladas em ampolas, um frasco ou uma seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parenteral devem ser estéreis, como é sabido e praticado na técnica.
[00460] Ilustrativamente, infusão intravenosa ou intraarterial de uma solução aquosa estéril contendo um composto ativo é um modo de administração eficaz. Uma outra modalidade é uma solução ou suspensão aquosa ou oleosa estéril contendo um material ativo injetado conforme necessário para produzir o efeito farmacológico desejado.
[00461] Injetáveis são feitos para administrações local e sistêmica. Tipicamente uma dosagem terapeuticamente eficaz é formulada para conter uma concentração de pelo menos cerca de 0,1% p/p até cerca de 90% p/p ou, com mais preferência, mais de 1% p/p do composto ativo ao(s) tecido(s) tratado(s). O ingrediente ativo, tal como sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, pode ser administrado de uma vez, ou pode ser dividido em várias doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. É compreendido que a dosagem precisa e duração do tratamento são uma função do tecido sendo tratado e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou através de extrapolação a partir de dados de teste in vivo ou in vitro. É também notado que concentrações e valores de dosagem podem também variar com a idade do indivíduo sendo tratado. Deve ser ainda compreendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das formulações, e que as faixas de concentração mostradas aqui são exemplares apenas e não pretendem limitar o escopo ou prática das formulações reivindicadas.
[00462] Os compostos providos aqui podem ser formulados para administração parenteral através de injeção, por exemplo, injeção de bolus ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose, com um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tal como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirógeno estéril ou outros solventes, antes do uso. Por exemplo, são providas aqui formulações parenterais contendo uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, tal como 500 a 500.000 Unidades, em uma solução estabilizada ou uma forma liofilizada.
[00463] O composto pode ser suspenso em forma micronizada ou outra adequada ou pode ser derivatizado para produzir um produto ativo mais solúvel para produzir um pró- fármaco. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da condição e pode ser empiricamente determinada.
3. Pós Liofilizados
[00464] São também providos aqui pós liofilizados contendo sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, que podem ser reconstituídos para administração como soluções, emulsões ou outras misturas. Essas formulações podem ser também reconstituídas e formuladas como sólidos ou géis.
[00465] O pó estéril, liofilizado, é preparado através de dissolução de uma porção sólida de ou mistura de uma alíquota de uma solução contendo uma sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel em um solvente adequado. O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconstituída, preparado a partir do pó. Excipientes que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose, lactose ou outro agente adequado. O solvente pode também conter um tampão, tal como fosfato de citrato, sódio ou potássio ou outro tal tampão conhecido daqueles versados na técnica, tipicamente, por volta de pH neutro. Filtragem estéril subseqüente da solução seguido por liofilização sob condições padrão conhecidas daqueles versados na técnica provê a formulação liofilizada. Em geral, a solução resultante da filtragem estéril é distribuída em frascos para liofilização. Cada frasco pode conter uma única dose, tal como 10-1000 mg ou 100-500 mg, ou dosagens múltiplas do composto.
[00466] Resumidamente, o pó liofilizado é preparado dissolvendo dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose, lactose ou outro agente adequado, cerca de 1-20%, em um tampão adequado, tal como fosfato de citrato, sódio ou potássio ou outro tal tampão conhecido daqueles versados na técnica em pH por volta de neutro. Então, um sal selecionado, tal como, por exemplo, o sal de sódio da sHASEGP (cerca de 1 g do sal por 10-100 g da solução tampão, tipicamente cerca de 1 g/30 g), é adicionado à mistura resultante acima da temperatura ambiente, tal como por volta de 30-35°C, e agitado até ele dissolver. A mistura resultante é diluída adicionando mais tampão, para diminuir a concentração resultante do sal em cerca de 10-50%, tipicamente cerca de 15-25%). A mistura resultante é filtrada estéril ou tratada para remover partículas e para assegurar esterilidade, e distribuída em frascos para liofilização. O pó liofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, tal como em cerca de 4°C em temperatura ambiente.
[00467] Re constituição deste pó liofilizado com água para injeção provê uma formulação para uso em administração parenteral. Para reconstituição, uma quantidade terapeuticamente eficaz do pó liofilizado contendo uma sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel é adicionada por mililitro de água estéril ou outro veículo adequado. A quantidade precisa depende do composto selecionado e pode ser empiricamente determinada através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica.
4. Administração Tópica
[00468] Misturas tópicas são preparadas conforme descrito para as administrações local e sistêmica. Administração tópica, que é algumas vezes referida na técnica como administração percutânea, tipicamente envolve aplicações feitas para absorção através da pele, membranas mucosas ou outras superfícies do corpo (por exemplo, aplicações aplicadas diretamente sobre e pele, sob a língua (sublingual), contra a bochecha (bucal), aos olhos, nariz ou orelhas, ou aos pulmões (inalação). A mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou similar e é formulada como cremes, géis, ungüentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, sprays, supositórios, bandagens, emplastros dermais ou quaisquer outras formulações adequadas para administração tópica.
[00469] As composições da sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas como aerossóis para aplicação tópica, tal como através de inalação (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.044.126, 4.414.209 e 4.364.923, que descrevem aerossóis para aplicação de um esteróide útil para tratamento de doenças inflamatórias, particularmente asma). Essas formulações para administração ao trato respiratório podem estar na forma de um aerossol ou solução para um nebulizador, ou como um pó microfino para insuflação, sozinhas ou em combinação com um veículo inerte tal como lactose. Em tal caso, as partículas da formulação terão tipicamente diâmetros de menos do que 50 mícrons, tal como menos do que 10 mícrons.
[00470] P ara administração através de inalação, as composições para uso aqui podem ser aplicadas na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de propelente adequado, incluindo, mas não limitado a, diclorodifluormetano, triclorotrifluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono e outros gases adequados. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada provendo uma válvula para aplicar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina, para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido.
[00471] As composições podem ser formuladas para aplicação local ou tópica, tal como para aplicação tópica à pele e membranas da mucosa, tal como no olho, na forma de géis, cremes e loções e para aplicação ao olho ou para aplicação intracisternal ou intra-espinhal. Administração tópica é compreendida para aplicação transdermal e também para administração aos olhos ou mucosa, ou para terapias de inalação. Soluções nasais do composto ativo sozinho ou em combinação com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser também administradas.
[00472] Por exemplo, formulações adequadas para aplicação tópica à pele ou ao olho geralmente são formuladas como um ungüento, creme, loção, pasta, gel, spray, aerossol e óleo. Veículos que podem ser usados incluem vaselina, lanolina, polietileno glicóis, álcoois e combinações de dois ou mais deles. As formulações tópicas podem conter ainda vantajosamente 0,05 a 15 por cento em peso de espessantes, incluindo, mas não limitado a, hidroxiproprilmetilcelulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, poli(alquileno glicóis), poli/hidroxialquila, (metil)acrilatos ou poli(met)acrilamidas. Uma formulação tópica é freqüentemente aplicada através de instilação ou como um ungüento ao saco conjuntival. Ela pode ser também usada para irrigação ou lubrificação do olho, seios faciais e meato auditivo externo. As formulações tópicas no estado líquido podem também estar presentes em uma matriz de polímero tridimensional hidrofílica na forma de uma tira, lente de contato e similar a partir da qual os componentes ativos são liberados. Ela pode ser também injetada na câmara do olho anterior, no espaço episcleral e outros locais. Por exemplo, é provida aqui uma formulação para uso intraocular após injeção viscoelástica contendo uma solução estabilizada de uma quantidade eficaz de uma sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, tal como 1 a 5000 Unidades da glicoproteína solúvel com 30 a 150.000 Unidades/mg de atividade específica, em um volume pequeno, tal como 5 a 50 μl. Como um outro exemplo, é provida aqui uma formulação para uso intraocular para aumentar a aplicação de um ou mais agentes farmacológicos a tecidos dentro do olho seguindo injeção através de vias de administração tal como injeção do Sub-Tenon no espaço episcleral circundando a esclera, compreendendo uma solução estabilizada de uma quantidade eficaz de uma sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, tal como 50 a 5.000 Unidades da glicoproteína solúvel com 30 a 150.000 Unidades/mg de atividade específica, em um volume tal como 0,05 a 10 ml.
[00473] Es sas soluções, particularmente aquelas pretendidas para uso oftálmico, podem ser formuladas como soluções isotônicas a 0,01%-10%, pH cerca de 5-7, com sais apropriados.
CO-APLICAÇÕES COM IONTOFORESE
[00474] No caso de administrações tópicas e outras aplicações a tecidos que são suscetíveis à iontoforese, o uso de uma ou mais sHASEGPs (potencialmente co-formuladas ou co-administradas com um outro agente farmacológico ou outro) pode ser combinado com técnicas iontoforéticas a fim de direcionar mais a permeação de um tecido. Com relação a isso, iontoforese e sHASEGPs podem funcionar cooperativamente pelo fato de que a iontoforese pode promover aplicação de sHASEGPs a um tecido ou outro local dentro do corpo, e a sHASEGP então aplicada pode direcionar mais a permeação da enzima, bem como co-formuladas ou co-administradas ou outras moléculas presentes no tecido, isto é, através da abertura enzimaticamente de canais para facilitar a difusão bem como promovendo fluxo de fluido bruto e então transporte convectivo de solutos tal como farmacológicos. 5. Composições para outras Vias de Administração
[00475] Outras vias de administração, tal como aplicação tópica, emplastos transdermais e administração retal são também aqui compreendidas.
[00476] Por exemplo, formas de dosagem farmacêuticas para administração oral são supositórios retais, cápsulas e comprimidos para efeito sistêmico. Supositórios retais que são usados aqui significam corpos sólidos para inserção no reto que derretem ou amolecem na temperatura do corpo liberando um ou mais ingredientes farmacológica ou terapeuticamente ativo. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis utilizadas em supositórios retais são bases ou veículo se agentes para aumentar o ponto de fusão. Exemplos de bases incluem manteiga de cacau (óleo de teobroma), glicerina, gelatina, Carbowax (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Combinações das várias bases podem ser usadas. Agentes para aumentar o ponto de fusão de supositórios incluem espermacete e cera. Supositórios retais podem ser preparados ou através do método comprimido ou através de moldagem. O peso típico de um supositório retal é cerca de 2 a 3 g.
[00477] Comprimidos e cápsulas para administração retal são fabricados usando a mesma substância farmaceuticamente aceitável e através dos mesmos métodos para formulações para administração oral.
[00478] Formulações adequadas para administração transdermal podem ser apresentadas como emplastros separados adaptados para permanecerem em contato íntimo com a epiderme do recipiente por um período de tempo prolongado. Tais emplastos contêm adequadamente o composto ativo como uma solução aquosa opcionalmente tamponada de, por exemplo, concentração de 0,1 a 0,2M com relação ao composto ativo. Formulações adequadas para administração transdermal podem ser também aplicadas através de iontoforese (vide, por exemplo, Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986)) e tipicamente tomam a forma de uma solução aquosa opcionalmente tamponada do composto ativo.
[00479] As composições farmacêuticas podem ser também administradas através de meios de aplicação e/ou dispositivos de aplicação controlada (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 3.536.809; 3.598.123; 3.630.200; 3.845.770; 3.847.770; 3.916.899; 4.008.719; 4.687.610; 4.796.027; 5.059.595; 5.073.543; 5.120.548; 5.354.566; 5.591.767; 5.639.476; 5.674.533 e 5.733.566). Os compostos ativos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados com veículos que protegem o composto contra eliminação rápida do corpo, tal como formulações ou revestimentos de aplicação com o tempo.
[00480] Em uma modalidade das composições e métodos providos aqui, o agente terapêutico é administrado localmente em um veículo de aplicação de aplicação lenta , por exemplo, encapsulado em um sistema de dispersão coloidal ou em cristais estabilizados de polímero. Sistemas de dispersão coloidal úteis incluem nanocápsulas, microesferas, contas e sistemas baseados em lipídeo, incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Por exemplo, o sistema de dispersão coloidal pode ser um lipossoma ou microesfera. Lipossomas são vesículas de membrana artificiais que são úteis como veículos de aplicação de aplicação lenta quando injetados ou implantados. Alguns exemplos de conjugados de lipídeo-polímero e lipossomas são descritos na Patente U.S. No. 5.631.018, que são incorporados aqui a título de referência em sua totalidade. Outros exemplos de veículos de aplicação de aplicação lenta são matrizes de hidrogel biodegradáveis (Patente U.S. No. 5,041,292), conjugados de polímero dendrítico (Patentes U.S. No. 5,714,166) e lipossomas multivesiculares (Depofoam®, Depotech, São Diego, CA) (Patentes U.S. Nos. 5,723,147 e 5,766,627). Um tipo de microesferas adequado para encapsulação de agentes terapêuticos para injeção local (por exemplo, em tecido subdermal) é microesferas de poli(D,L)lactídeo, conforme descrito em D. Fletcher, Anesth. Analg. 84:90-94 (1997). Por exemplo, uma formulação de aplicação lenta contendo uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, tal como 1 a 5000 Unidades/ml, pode ser empregada para vários usos ou para tratar várias condições, incluindo, mas não limitado a, formulações cosméticas, tratamento de danos ao cordão espinhal e outros distúrbios do sistema nervoso, certos distúrbios oftálmicos, condições inflamatórias ou autoimunes, cânceres e outros condições de doença crônicas, onde aplicação prolongada da sHASEGP é benéfica.
[00481] Níveis no sangue desejados podem ser mantidos através de uma infusão contínua do agente ativo conforme verificado através de níveis no plasma. Deve ser notado que o médico acompanhante saberia como e quando terminar, interromper e ajustar a terapia para diminuir a dosagem devido à toxidez, ou disfunções da medula óssea, fígado ou rim. Por outro lado, o médico atendente também saberia como e quando ajustar o tratamento para níveis mais altos se a resposta clínica não for adequada (precludindo efeitos colaterais tóxicos).
[00482] A eficácia e/ou toxidez do polipeptídeo de sHASEGP e/ou seu inibidor(s), sozinho ou em combinação com outros agentes, tal como agentes terapeuticamente eficazes, pode ser também avaliada através de métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, O & Após; Reilly, Investigational New Drugs 15:5-13 (1997)). 6. Artigos de fabricação
[00483] Os polipeptídeos de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel ou composições contendo qualquer um dos agentes precedentes podem ser embalados como artigos de fabricação contendo material de embalagem, um composto ou seu derivado adequado provido aqui, que é eficaz para tratamento de uma doença ou distúrbios compreendidos aqui, dentro do material de embalagem, e um rótulo que indica que o composto ou um seu derivado adequado é para tratamento das doenças ou distúrbios compreendidos aqui. O rótulo pode incluir opcionalmente os distúrbios para os quais a terapia é prometida.
[00484] Os artigos de fabricação providos aqui contêm materiais de embalagem. Materiais de embalagem para uso em embalagem de produtos farmacêuticos são bem- conhecidos daqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.323.907, 5.052.558 e 5.033.352). Exemplos de materiais de embalagem farmacêuticos incluem, mas não estão limitados a, embalagens blister, garrafas, tubos, inaladores, bombas, bolsas, frascos, recipientes, seringas, garrafas e qualquer material de embalagem adequado para uma formulação selecionada e modo de administração e tratamento pretendidos. Uma disposição ampla de formulação dos compostos e composições providos aqui é compreendida, como é uma variedade de tratamentos para qualquer distúrbio onde infecção por HCV é implicada como um mediador ou contribuidor para o sintoma ou causa.
[00485] Estojos contendo as composições e/ou combinações com instruções para sua administração são também providos aqui. O estojo pode incluir ainda uma agulha ou seringa, tipicamente embalada em forma estéril, para injeção do complexo e/ou uma almofada de álcool embalada. Instruções são opcionalmente incluídas para administração do agente ativo por um médico ou pelo paciente. Por exemplo, é provido aqui um estojo contendo uma seringa de volume pequeno com uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, tal como 1 a 5000 Unidades da glicoproteína solúvel, em um volume de 5 a 50 μl, opcionalmente contendo uma segunda seringa contendo um viscoelástico. É também aqui provido um estojo contendo uma seringa de volume pequeno contendo uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel, tal como 1 a 500 Unidades da glicoproteína solúvel, e uma quantidade terapêutica de um segundo ingrediente ativo, tal como um fármaco, uma molécula pequena, uma proteína ou um ácido nucléico.
K. MODELOS DE ANIMAL
[00486] Modelos de animal e animais transgênicos, tal como roedores, incluindo camundongo e ratos, galinhas, porcos, cabras, ovelhas, macacos, incluindo gorilas, e outros primatas, são aqui providos. Em particular, animais não-humanos transgênicos que contêm ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídeo de sHASEGP ou um animal transgênico onde expressão do polipeptídeo foi alterada, tal como através de substituição ou modificação da região de promotor ou outra região reguladora do gene endógeno são providos. Tal animal pode ser produzido através da promoção de recombinação entre ácido nucléico endógeno e um gene de sHASEGP exógeno que poderia ser superexpresso ou expresso com erro, tal como expressão sob um promotor forte, via evento homólogo ou outro de recombinação.
[00487] Animais transgênicos podem ser produzidos através da introdução do ácido nucléico usando qualquer método conhecido de aplicação, incluindo, mas não limitado a, microinjeção, lipofecção e outros modos de aplicação de gene em uma célula de linha germinativa ou células somáticas, tal como uma célula tronco embriônica. Tipicamente o ácido nucléico é introduzido em uma célula, tal como uma célula tronco embriônica (ES), seguido por injeção das células ES em um blastócito, e implante do blastócito em uma mãe adotiva, que é seguido pelo nascimento de um animal transgênico. Geralmente, a introdução de uma molécula de ácido nucléico heteróloga em um cromossomo do animal acontece através da recombinação entre o ácido nucléico codificando sHASEGP heteróloga e o ácido nucléico endógeno. O ácido nucléico heterólogo pode ser direcionado a um cromossomo específico. Em alguns casos, animais incapacitados podem ser produzidos. Tal animal pode ser inicialmente produzido promovendo recombinação homóloga entre um gene de polipeptídeo de sHASEGP em seu cromossomo e um gene de polipeptídeo exógeno que foi tornado biologicamente inativo (tipicamente através de inserção de uma seqüência heteróloga, por exemplo, um gene resistência a antibiótico). Em uma modalidade, esta recombinação homóloga é realizada através da transformação de células tronco embrionárias (ES) com um vetor contendo o gene de polipeptídeo de sHASEGP insercionalmente inativado, de modo que recombinação homóloga acontece, seguido por injeção das células ES em um blastócito, e implante dos blastócito em uma mãe adotiva, seguido pelo nascimento do animal quimérico ("animal inativo") onde o gene do peptídeo sHASEGP foi inativado (vide Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)). O animal quimérico pode ser cruzado para produzir animais inativados homozigotos, que podem ser então usados para produzir animais inativados adicionais. Animais inativados incluem, mas não estão limitados a, camundongos, hamsters, ovelhas, porcos, gado e outros mamíferos não-humanos. Por exemplo, um camundongo inativado é produzido. Os animais resultantes podem servir como modelos de doenças específicas, tal como cânceres, que exibem subexpressão de um polipeptídeo de sHASEGP. Tais animais inativados podem ser usados como modelos de animal de tais doenças, por exemplo, para avaliar ou testes moléculas quanto à habilidade em tratar ou prevenir tais doenças ou distúrbios.
[00488] Outros tipos de animais transgênicos podem ser também produzidos, incluindo aqueles que superexpressam o polipeptídeo de sHASEGP. Tais animais incluem animais "knock-in" que são animais onde o gene normal é substituído por uma variante, tal como um mutante, uma forma superexpressa, ou outra forma. Por exemplo, o gene de uma espécie, tal como o gene endógeno de roedor, pode ser substituído pelo gene de uma outra espécie, tal como de um ser humano. Animais podem ser também produzidos através de recombinação não-homóloga e outros sítios em um cromossomo; incluindo animais que têm uma pluralidade de eventos de integração.
[00489] Após produção do animal transgênico de primeira geração, um animal quimérico pode ser cruzado para produzir animais adicionais com polipeptídeos de sHASEGP superexpressos ou expressos com erro. Tais animais incluem, mas não estão limitados a, camundongos, hamsters, ovelha, porcos, gado e outros mamíferos não-humanos. O animal resultante pode servir como modelos de doenças específicas, tal como cânceres, que exibem superexpressão ou expressão com erro de um polipeptídeo de sHASEGP. Tais animais podem ser usados como modelos de animal de tais doenças, por exemplo, para avaliar ou testar moléculas quanto à habilidade em tratar ou prevenir tais doenças ou distúrbios. Em uma modalidade específica, um camundongo com polipeptídeo sHASEGP superexpresso ou expresso com erro é produzido.
[00490] Os exemplos que seguem são incluídos para propósitos ilustrativos apenas e não pretendem limitar o escopo da invenção. L. USOS TERAPÊUTICOS DE sHASEGP
[00491] En zimas hialuronidase de ocorrência natural de matadouros têm sido a fonte principal de preparações de enzima clínica para mais de quarenta anos. Testículos ovinos são a fonte principal deste material. Essass preparações de enzima clínica no entanto são muito brutas, vendidas em preparações variando de a partir de 0,55% de pureza com base em atividades específicas conhecidas entre 30-100.000 Unidades/mg. Deste modo sua falta de pureza combinada com sua origem de matadouro, as deixa ambos imunogênicas para seres humanos bem como fonte potencial para a doença Jacob Creutzfeld e outros patópgenos bovinos e ovinos. Reações anafláticas a preparações de hialuronidase bovina e ovina são sabidas acontecer.
[00492] Hi aluronidase de gado ou bacterialmente derivada têm sido usadas no tratamento de doenças associadas com ácido hialurônico em excesso e aumentar a circulação de fluidos fisiológicos e/ou agentes terapêuticos. Por exemplo. Hialuronidase bovina pode ser co-injetada com anestesia em blocos peribulbares, retrobulbares e de sub-Tenon para procedimentos cirúrgicos oftálmicos. Além disso, complicações cirúrgicas maiores acontecem nesta ausência (Brown, S.M. e outros, J. Cataract Refract. Surg. 1999, setembro; 25(9):1245-9). Hialuronidase bovina é também usada como um antídoto para necrose local de injeção paravenosa de substância necróticas tal como vinca alcalóies (Few, B.J. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12, 23-26). Hialuronidase de testes bovina é também útil para o tratamento de cistos do gânglio (Paul e outros, J. Hand Surg. 1997 abril; 11(2):219-21). Hialuronidase pode ser também usada para facilitar aplicação subcutânea de fulidos em hipodermóclise (Berger, E.Y., Am. Geriatr. Soc., 1984, Março; 32(3):199- 203). Hialuronidase tem sido também utilizada para reduzir pressão intraocular nos olhos em pacientes com glaucoma e pacientes com catarata recebendo viscoelásticos (Patente U.S. No. 4.820.516 expedida em 11 de abril de 1989).
[00493] Hi aluronidases de gado ou bacterialmente derivadas têm sido usadas como um agente de "espalhamento" para aumentar a atividade de quimioterapêuticos e/ou a acessibilidade de tumores a quimioterapêuticos (Schuller e outros, 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32:173, abstratc no. 1034; Czejka e outros, 1990; Pharmazie 45:H.9). quimioterapia de combinação com hialuronidase é eficaz no tratamento de uma variedade de canceres incluindo câncer da bexiga urinária (Horn e outros, 1985, J. Surg. Oncol. 28:304307), carcinoma de célula escamosa (Kohno e outros, 94, J. Cancer Res. Oncol. 120:293-297), câncer de mama (Beckenlehner e outros, 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118:591596) e câncer gastrointestinal (Scheithauer e outros, 1988, Anticancer Res., 8:391-396). Hialuronidase é eficaz como o único agente terapêutico no tratamento de câncer do cérebro (gliomas) (Pedido de patente publicado PCT No. WO88/02261 publicado em 7 de abril de 1988). Administração de hialuronidase também induz responsividade de tumores resistentes à quimioterapia anteriormente do pâncreas, estômago, colo, ovários e mama (Baumgartner e outros, 1988, Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker e outros, 1986, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390). Infelizmente, os contaminantes e natureza não-humana de tais hialuronidases resultam em reações anafláticas.
[00494] Em adição aos seus efeitos anticâncer indiretos, hialuronidase derivada de gado tem efeitos anticarcinogênicos diretos. A hialuronidase previne crescimentos de tumores transplantados em camundongos (De Mayer e outros, 1992, Int. J. Cancer 51:657-660) e inibe formação de tumor quando da exposição a carcinógenos (Pawlowski e outros, 1979, Int. J. Câncer 23:105-109; Haberman e outros, 1981, Proceedings of the 17 Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 22:105, abstract no. 415).
[00495] Dado o valor de hialuronidase derivada de gado como um agente terapêutico, particularmente em quimioterapia em conjunto com quimioterapeuticos convencionais ou como um quimioterapêutico em si ou dele mesmo, há a necessidade no campo de preparações substancialmente puras de hialuronidase de origem humana. Há também uma necessidade quanto a métodos eficientes, de custo eficaz, de fabricação de hialuronidase para prover quantidades comercialmente significantes da enzima. A presente invenção refere-se a esses problemas.
[00496] Áci do hialurônico é um componente essencial da matriz extracelular. Ácido hialurônico é encontrado no tecido conectivo de mamíferos e é o constituinte principal do vítreo do olho. Em tecido conectivo, a água de hidratação associada com ácido hialurônico cria espaços entre tecidos, deste modo criando um ambiente que conduz a movimento e proliferação de célula. Ácido hialurônico desempenha um papel principal em fenômenos biológicos associados com motilidade celular incluindo desenvolvimento rápido, regeneração, reparo, embriogênese, desenvolvimento embriônico, cicatrização de ferida, angiogênese e tumorigênese (Toole, 1991, Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed), Plenum Press, Nova York, 13841386; Bertrand e outros, 1992, Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson e outros, 1993, FASEB J. 7:1233-1241). Ainda, os níveis de ácido hialurônico se relacionam com agressividade de tumor (Ozello e outros, 1960, Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi e outros, 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata e outros, 1983, Cancer Res. 43:1347-1354).
[00497] Seguindo dano ao cordão espinhal, cicatrizes gliais são produzidas por astrócitos e contêm proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs). CSPGs desempenham um papel crucial na inibição de crescimento de axon (Levine, 1994; Powell e outros, 1997). Por exemplo, durante o desenvolvimento fetal, CSPGs repelem axons e inibem a adesão de célula. CSPGs também desempenham um papel importante na formação do limite (Snow e outros, 1990, 1992; Powell e Geller, 1999). Ainda, a expressão de CSPG aumenta seguindo dano do SNC (Mckeon e outros, 1991: Davies e outros, 1997).
[00498] Estudos indicam que os efeitos inibidores de CSPGs são principalmente devido à cadeia açúcar de glicosaminoglicano (GAG) do sulfato de condroitina (CS) (Snow e outros, 1990; Cole e McCable, 1991; Geisert e Bidanset, 1993). Isto é apoiado pela constatação de que administração de condroitinase bacteriana na verdade promove regeneração de axon quando administrada intratecalmente. Além disso, experimentos eletrofisiológicos determinaram que axons CST regenerados estabeleceram conexões funcionais (Bradbury e outros, 2002). Em adição aos seus efeitos inibidores diretos, CSPGs poderiam também interagir com moléculas de adesão celular ou fatores neurotróficos para influenciar a formação de neuritos (Roberts e outros, 1988; Ruoslahti e Yamaguchi, 1991; Milev e outros, 1994). Hialuronidases de mamífero recombinantes são então úteis para reverter a inibição de CSPGs na cicatriza glial e promover regeneração de axon seguindo dano.
[00499] A quantidade de sHASEGP requerida para degradar suficientemente CSPGs na cicatriz glical vai variar. Em alguns casos administração repetida de 10-5000 Unidades de sHASEGP através de aplicação intratecal será requerida para remover os CSPGs na cicatriz. Em outros casos, aplicação sustentada de sHASEGP através do uso de uma formulação de aplicação lenta pode ser preferida. Alternativamente, administração de vetores de terapia de gene codificando sHASEGP pode ser eficaz para aumentar a eliminação de CSPGs.
[00500] SHASEGPs podem ser também utilizadas para o tratamento de discos herniados em um processo conhecido como quimionucleólise. Condroitinase ABC e enzima clivando substratos similares como sHASEGP podem induzir a redução de pressão intradiscal na espinha lombar. (Sasaki e outros, 2001, Ishikawa e outros, 1999). Existem três tipos de danos a disco. Um disco protudido é um que está intacto mas saliente. Em um disco extrudado, a cobertura fibrosa se despedaçou e o NP vazou, mas está ainda conectado ao disco. Em um disco seqüestrado, um fragmento do NP soltou-se do disco e está solto no canal espinhal. Quimionucleólise é eficaz em danos de discos protrudidos e extrudados, mas não em disco seqüestrado. Nos Estados Unidos, quimionucleólise é aprovada apenas para uso na espinha lombar (inferior). Em outros países, ela também tem sido usada com sucesso para tratar hérnias cervicais (espinha superior). Quimionucleólise é então uma alternativa conservadora para cirurgia de disco quando é preferido reduzir pressão de disco.
[00501] A composição e a estrutura precisas da(s) cadeia(s) de carboidrato em uma glicoproteína podem diretamente influenciar seu tempo de vida no soro, uma vez que células no fígado e sistema retículo-endotelial podem se ligar e internalizar glicoproteínas em circulação com carboidratos específicos. Hepatócitos têm receptores em suas superfícies que reconhecem cadeias de oligossacarídeo com resíduos Gal terminais (isto é, na(s) extremidade(s) mais para fora de glicanos com relação ao polipeptídeo), macrófagos contêm receptores para resíduos Man ou GlcNAc terminais, e hepatócitos e linfócitos têm receptores para resíduos de fucose expostos. Quaisquer receptores específicos de ácido siálico foram encontrados, no entanto. Embora um pouco dependente da disposição espacial dos oligossacarídeos, como uma regra geral, quanto maior o número de resíduos de açúcar expostos reconhecidos pelos receptores de superfície no fígado e sistema retículo-entotelial, mais rápido a glicoproteína será liberada do soro. Por causa da ausência de receptores específicos de ácido siálico, no entanto, oligossacarídeos com todas as ramificações terminadas, ou "capeadas", com ácido siálico não vão promover a eliminação da proteína à qual eles estão ligados.
[00502] A presença e a natureza da(s) cadeia(s) de oligossacarídeo em uma glicoproteína podem também afetar propriedades bioquímicas importantes em adição ao seu reconhecimento pelos receptores específicos de açúcar nas células do fígado e retículo-endotelial. Remoção do carboidrato a partir de uma glicoproteía vai geralmente diminuir sua solubilidade, e pode também aumentar sua susceptibilidade à degradação proteolítica através da desestabilização do padrão de dobra de polipeptídeo correto e/ou não-mascaramento de sítios sensíveis à protease. Por razões similares, o estado de glicosilação de uma proteína pode afetar seu reconhecimento pelo sistema imune.
[00503] SHASEGPs podem ser usadas para remover as células de cúmulo circundando um ovo antes da criopreservação e outros técnicas de fertilização in vitro tal como uma injeção de esperma intracitoplásmica (ICSI). Hialuronidase pode ser adicionada a oócitos coletados entre 10-200 U/ml em soluções de sal tamponadas. Oócitos são separados das células de cúmulo liberadas através de aspiração e lavadas através de várias lavagens com meio sem hialuronidase. Os ovos podem então ser processados para criopreservação ou técnicas IVF. SHASEGPs são também úteis para a penetração mais eficaz de agentes quimioterapêuticos em tumores sólidos.
[00504] SHASEGPs podem ser injetadas intratumoralmente com agentes anticâncer ou intravenosamente para cânceres espalhados ou difíceis de atingir. O agente anticâncer pode ser um agente quimioterapêutico, um anticorpo, um peptídeo ou um vetor de terapia de gene, vírus ou DNA. Adicionalmente, sHASEGPs podem ser usadas para recrutar células de tumor no grupo de ciclo para sensibilização em tumores quimiorrefratários anteriores que adquiriram resistência a fármaco multicultural, St. Croix e outros, Cancer Lett. 1998, 11 de setembro; 131(1):35-44). SHASEGPs são também úteis para aprimorar aplicação de biológicos tal como anticorpos monoclonais, citocinas e outros fármacos a tumores que acumulam glicosaminoglicanos. Muitos tumores deletam genes envolvidos com o catabolismo de glicosaminoglicanos de modo que acumulação localizada pode prevenir que agentes neoplásticos e o sistema imune atinjam a massa de tumor.
[00505] SHASEGP pode ser também usada para aumentar a sensibilidade de tumores que são resistentes à quimioterapia convencional. Em uma modalidade, sHASEGP é administrada a um paciente tendo um tumor associado com um defeito LuCa-1 em uma quantidade eficaz para aumentar a difusão em torno do sítio do tumor (por exemplo, para aumentar a circulação de fatores quimioterapêuticos (por exemplo, para facilitar a circulação e/ou concentrações de agentes quimioterapeuticos no e em torno do tumor), inibir a motilidade de célula do tumor (por exemplo, através de degradação de HA) e/ou diminuir o limiar de célula(s) de apoptose (isto é, trazer as células de tumor para um estado de apoptose causada por perda de adesão (Anoikis), um estado que torna a(s) célula(s) do tumor mais suscetíveis à ação de agentes quimioterapeuticos ou outros agentes que podem facilitar a morte, de preferência morte de célula programada preferêncialmente facilitada de células em anoikis. Agentes quimioterapêuticos conforme aqui usado pretendem compreender todas as moléculas, sintéticas (por exemplo, cisplatina) bem como de ocorrência natural (por exemplo, fator IF de necrose de tumor), que facilitem a inibição de crescimento de célula de tumor, e de preferência facilitem a morte de célula de tumor.
[00506] De interesse particular é o uso de sHASEGP para o tratamento de cânceres metastáticos e não- metastáticos, particularmente cânceres metastáticos, tendo diminuição para atividade de hialuronidase não-detectável com relação a células não-cancerosas (normais). SHASEGP pode ser usada como um agente quimioterapêutico (sozinha ou em combinação com outros agentes quimioterapêuticos) no tratamento de qualquer um de uma variedade de cânceres, particularmente tumores invasivos. Por exemplo, sHASEGP pode ser usada no tratamento de carcinoma de célula de pulmão pequena, carcinoma de célula de pulmão escamosa, bem como cânceres de mama, ovários, cabeça e pescoço, ou qualquer outro câncer associado com níveis deprimidos de hialuronidase ou com um gene LuCa-1 defeituoso (hpHAse) (por exemplo, um gene LuCa-1 que não provê expressão de níveis de hpHAse adequados ou não codifica uma hpHAse defeituosa que não provê um nível adequado de atividade de hialuronidase) ou outro defeito associado com catabolismo de hialuronidase menor. SHASEGP é preferida para o tratamento de males associado com catabolismo de HA deficiente uma vez que ela não requer participação celular para degradação acontecer.
[00507] A dosagem específica apropriada para administração pode ser prontamente determinada por uma pessoa de versada na técnica de acordo comos fatores discutidos acima (vide, por exemplo, Harrison's Principle of Internal Medicine, 11a Edicao, 1987). Ainda, as estimativas para dosagens apropriadas em seres humanos podem ser extrapoladas das determinações do nível de atividade enzimática de sHASEGP in vitro e/ou dosagens eficazes em estudos animais. Por exemplo, 70-300 TRU de hialuronidase são eficazes na redução da carga de tumor em camundongo scid. Dada esta informação, as dosagens correspondentes no humano de 70 kg médios variaria de a partir de cerca de 250.0001.200.000 TRU de hialuronidase. A quantidade de sHASEGP administrada a um paciente humano está geralmente na faixa de 1 TRU a 5.000.000 TRU de atividade enzimática, de preferência entre cerca de 1.000 TRU a 2.500.000 TRU, com mais preferência entre cerca de 100.000 TRU a 1.500.000 TRU, normalmente entre cerca de 250.000 TRU a 1.200.000 TRU, com cerca de 725.000 TRU representando as doses prescritas médias.
[00508] Em uma modalidade, uma sHASEGP é formulada em uma solução salina a 0,15M contendo sHASEGP em uma concentração de cerca de 150.000 TRU/cm3. A formulação é injetada intravenosamente a 15.000 TUR/kg de peso do corpo do paciente. Alternativamente, a formulação de enzima pode ser também injetada subcutaneamente para permitir que a hialuronidase realize perfusão em torno do sítio do tumor. Em uma modalidade preferida, sHASEGP é injetada peritumoralmente no na massa de tumor. Em uma outra modalidade preferida, sHASEGP é formulada como um lipossoma e é aplicada através de injeção ou intravenosamente ou no ou próximo ao sítio de células cancerosas associadas com um defeito no gene LuCa-1 (hpHAse). Injeção de sHASEGP intravenosamente resulta em sHASEGP no sítio do tumor. Além disso, sHASEGP Super Sialada é de preferência para administração parenteral pelo fato de que os ácidos siálicos terminais na sHASEGP previnem a aplicação da enzima da circulação pelo sistema reticulo-endotelial. Comparações de sHASEGPs super sialada com hialuronidase bovina e ovina não- sialada revelam que farmacocinética substancialmente mais favorável é obtida.
FACILITAÇÃO DE TERAPIA DE GENE
[00509] A eficácia da maioria dos veículos de aplicação de gene in vivo não corresponde à eficácia encontrada in vitro. Glicosaminoglicanos podem impedir a transferência e difusão de DNA e vetores virais para muitos tipos celulares. Os níveis de tal material de matriz extracelular podem impedir o processo consideravelmente. Dubensky e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984 Dez;81(23):7529-33) demonstraram que hialuronidase quando combinada com colagenase poderia facilitar a tradução de DNA in vivo. Foi demonstrado que vírus adeno-associado é também receptivo à terapia de gene mediada por hialuronidase Favre e outros, (Gene Ther. 2000; Agosto; 7(16):1417-20).
[00510] Foi aqui determinado que canais de tamanho definido na matriz extracelular são abertos com sHASEGP. Esses poros geralmente não aprimoram a difusão de substâncias maiores do que cerca de 200-500 nm de diâmetro. No entanto, moléculas menores tal como retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados e complexos de DNA são receptivos à difusão mediada por sHASEGP. O fato de que sHASEGP geralmente age para abrir canais que são substancialmente grandes o suficiente para permitir o movimento da maioria dos agentes terapêuticos e outros farmacológicos de interesse (incluindo macromoléculas tal como proteínas e ácidos nucléicos bem como complexos macromoleculares tal como vetores de terapia de gene), e ainda são geralmente não tão grandes de modo a promoverem o deslocamento e movimento de células, provê aplicações particularmente vantajosas no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de uma variedade de doenças, por exemplo.
[00511] Alternativamente, vírus podem ser munidos com o gene sHASEGP para facilitar sua replicação e se espalharem dentro de um tecido por exemplo. O tecido alvo pode ser um tecido canceroso, com o que o vírus é capaz de replicação seletiva dentro do tumor. O vírus pode ser também um vírus não-lítico onde o vírus seletivamente replica sob um promotor específico de tecido. Conforme o vírus replica, a co-expressão de sHASEGP com genes virais vai facilitar o espalhamento do vírus in vivo.
[00512] Alternativamente, o ácido nucléico de interesse e uma sHASEGP podem ser usados simultânea ou consecutivamente ou de modo a serem balanceados com o tempo. Simultaneamente refere-se a uma co-administração. Neste caso, esses dois componentes essenciais podem ser misturados para formarem uma composição antes de serem administrados, ou podem ser administrados ao mesmo tempo à célula ou ao organismo hospedeiro. É também possível administrá-los consecutivamente, isto que dizer, um depois do outro, sem importar qual componente do produto de combinação de acordo com a invenção é aplicado primeiro. Finalmente, é possível usar um modo de administração que é balanceado com o tempo ou é intermitente e que pára e reinicia em intervalos que podem ou não ser regulares. É salientado que as vias e sítios de administração dos dois componentes podem ser diferentes. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, a sHASEGP é administrada antes do ácido nucléico, com a via de administração dos dois componentes de preferência sendo similar. O intervalo de tempo entre as injeções não é crítico e pode ser definido pela pessoa de habilidade na técnica. É possível recomendar um intervalo de a partir de 10 minutos a 72 horas, vantajosamente de a partir de 30 minutos s 48 horas, de preferência de a partir de 1 a 24 horas e, com mais preferência, de a partir de 1 a 6 horas.
[00513] Ainda, o produto de combinação de acordo com a invenção pode ser combinado com uma ou mais molécula(s) que é/são pretendidas melhorar a administração de ácido nucléico. As moléculas podem ser moléculas que têm um efeito protetor sobre o ácido nucléico (proteção com relação à degradação na célula), que melhorem sua penetração ou sua expressão na célula hospedeiro (peptídeo fusogênico, sinal de localização nuclear, etc.), que permitam que um tipo de célula particular seja direcionado (ligante ou anticorpo que reconhece uma proteína de superfície celular, etc.) ou que prolonguem o efeito terapêutico (agente imunossupressivo, etc.). O produto de combinação pode ser também combinado com agentes que facilitem a transfecção (proteínas, etc.).
[00514] O produto de combinação de acordo com a invenção pode ser preparado com uma visão para administração local ou parenteral ou para administração através da via digestiva. Vias que podem ser em particular mencionadas são vias intragástrica, subcutânea, intracardíaca, intravenosa, intraperitoneal, intrasinovial, intratumor, intrapulmonar, intranasal e intratraqueal, e, muito particularmente, a via intramuscular. A administração pode ser realizada por meio de qualquer técnica do campo (injeção, via oral, aerossol, instilação, etc), como uma dose única ou como uma dose que é repetida uma vez ou várias vezes após um intervalo de tempo particular. A via de administração pode ser ajustada para se adequar ao gene de interesse a ser transferido e a doença a ser tratada. A formulação pode incluir veículos farmaceuticamente aceitáveis (excipientes, adjuvantes, etc). A substância que leva à desorganização da matriz extracelular e o ácido nucléico de interesse são de preferência dissolvidos em um tampão que é adequado para uso farmacêutico e que pode ser hipertônico, hipotônico ou isotônico. Vários tampões podem ser pretendidos. Aqueles que podem ser mencionados a título de ilustração são solução salina fisiológica (NaCl a 0,9%), uma solução salina não- fisiológica (NaCl a 1,8%), uma solução de Hepes-Ringer, uma solução de Lactato-Ringer, um tampão que é baseado em Tris- HCl (Tris-HCl a 10 mM, pH 7,5 a EDTA a 1 mM; Tris-HCl a 10 mM, pH 7,5 a 8, MgCl2 a 1 mM), um tampão de fosfato (tampão de fosfato H2O Krebs), uma solução de açúcar (glicose, sacarose, trealose, etc.) ou simplesmente água.
HIPODERMÓCLISE
[00515] Hipodermóclise, a infusão subcutânea de fluidos, é uma técnica de hidratação útil e fácil adequada para pacientes adultos leve a moderadamente desidratados, especialmente os mais idosos. O método é considerado seguro e não impõe quaisquer complicações sérias. O efeito adverso mais freqüente é edema subcutânea leve que pode ser tratado através de massagem local ou diuréticos sistêmicos. Aproximadamente 3L podem ser dados em um período de 24 horas em dois sítios separados. Sítios de infusão comuns são o peito, abdômen, nádegas e braços superiores. A solução preferida é uma solução salina normal, mas outras soluções, tal como solução salina metade-normal, glicose com solução salina ou 5 por cento de glicose, podem ser também usadas. Cloreto de potássio pode ser adicionado à bolsa da solução se necessário. Adicionalmente, outros fármacos podem ser aplicados através de vias similares. SHASEGP humana pode ser adicionada para aumentar a absorção de fluido e aumentar a taxa de administração geral. SHASEGP humana é preferida para Hipodermóclise repetida em enzimas derivadas de matadouro pelo fato dela não ser provavelmente imunogênica como a enzima bovina é sabida ser. Ela pode ser administrada em casa pelos membros da família ou uma enfermeira; a técnica deve ser familiar a todo médico de família.
[00516] Em pacientes de ambulatório, sítios de hipodermóclise incluem o abdômen, peito superior, acima da mama, sobre um espaço intercostal e na área escapular. Em pacientes acamados, sítios preferido são as nádegas, o abdômen e o aspecto externo do braço superior. Após um a quatro dias, a agulha e os tubos devem ser mudados, embora aparelhos de infusão tenham sido deixados no lugar por períodos muito mais longos sem complicações. Administração de bolus de 500 mL durante uma a duas horas três vezes foi dia pode ser também dada, com 150 U de sHASEGP dadas no sítio subcutâneo antes da primeira infusão da manhã
FACILITAÇÃO DE INJEÇÕES TERAPÊUTICAS
[00517] Muitas moléculas injetadas percutaneamente (por exemplo, usando uma agulha ou um outro dispositivo que penetre a pele e seja usado para depositar as moléculas em uma camada subdermal) atingem a circulação lentamente ou com eficiência muito baixa. Vários fatores regulam a farmacocinética e farmacodinâmica de moléculas subcutaneamente injetadas (SC) ou intramuscularmente (IM). Em geral, moléculas maiores atingem a circulação mais lentamente e menos eficientemente sem transporte ativo para a circulação. Biodisponibilidade subcutânea é determinada através de cálculo da razão de área sob as curvas para SC versus administração intravenosa (AUCsc/AUVintravenosa). Um segundo fator é carga e afinidade para moléculas de matriz que podem desempenar um papel no seqüestro de moléculas subcutaneamente. Se esses materiais forem degradados localmente eles podem nunca atingir seus alvos desejados e então demonstrar uma biodisponibilidade sistêmica geral menor para os órgãos alvo.
[00518] P roteínas grandes são normalmente dadas intravenosamente de modo que o medicamento está diretamente disponível na corrente sangüínea. Seria então vantajoso se um medicamento pudesse ser dado subcutânea, intramuscular ou intradermalmente (ID) uma vez que essas formas de administração são muito mais fáceis de manusear para o paciente. Especialmente, se o medicamento tiver que ser tomado regularmente durante toda a vida e tratamento for iniciado cedo, já quanto o paciente é uma criança. No entanto, um medicamento com uma molécula muito grande e lábil, tal como fator de coagulação VIII de 170 a 300 kDa, tem normalmente uma biodisponibilidade muito baixa se dado subcutânea, intramuscular ou intradermalmente, uma vez que a absorção não é suficiente e degradação é severa.
[00519] Em adição à necessidade de aumentar a biodisponibilidade de muitos biológicos subcutaneamente administrados, farmacocinética mais rápida é também criticamente importante em casos de medicina de emergência. O tempo requerido para atingir acesso intravenoso em muitos pacientes pode prevenir um fármaco normalmente de ação rápida quando administrado sistemicamente de ser utilizado. Em alguns casos falha em atingir acesso intravenoso é então seguida por injeção subcutânea, que leva a um retardo adicional em atingir os órgãos alvo. Deste modo, a biodisponibilidade mais rápida de fármacos subcutâneos seria de benefício como uma primeira linha de tratamento ao invés de arriscar o tempo requerido para atingir acesso intravenoso. Exemplos de moléculas que podem ser aplicadas subcutaneamente bem como intravenosamente incluem epinefrina, atropina, narcan, lignocaína e dextrose.
[00520] Um benefício adicional da invenção se encontra na habilidade em aplicar volumes equivalentes ou maiores de soluções ID, IC ou IM sem a dor e morbidez associadas com a pressão e volume da solução no sítio de injeção.
[00521] A título de ilustração (e sem limitação), existem vários biológicos que podem ser aprimorados através da combinação com uma ou mais sHASEGPs (por exemplo, através de co-formulação ou co-administração de sHASEGP antes, coincidente com ou após administração do biológico), incluindo por exemplo: Abciximabs (por exemplo, REOPRO®), Adalimumabs (por exemplo, HUMIRA®), Agalsidase betas (por exemplo, FABRAZYME®), Aldesleucinas (por exemplo, PROLEUKIN®), Alefacepts (por exemplo, AMEVIVE®), Alemtuzumabs (por exemplo, CAMPATH®), Alteplases (por exemplo, ACTIVASE®), Alteplases (por exemplo, CATHFLO ACTIVASE®), Anaquinras (por exemplo, KINERET®), Arcitumomabs (por exemplo, CEA-Scan®), Asparaginases (por exemplo, ELSPAR®), Basiliximabs (por exemplo, SIMULECT®), Becaplermins (por exemplo, REGRANEX®), bevacizumabs (por exemplo, AVASTIN®), Toxina Botulina Tipo A's (por exemplo, BOTOX®), Toxina Botulina Tipo B's (por exemplo, MYOBLOC®), Capromab Pendetides (por exemplo, PROSTASCINT®), Cetuximabs (por exemplo, ERBITUX®), Daclizumabs (por exemplo, ZENAPAX®), Darbepoetin alfas (por exemplo, ARANESP®), Denileucin diftitoxs (por exemplo, ONTAK®), Dornase alfas (por exemplo, PULMOZYME®), Drotrecogin alfas (por exemplo, XIGRIS®), Efalizumabs (por exemplo, RAPTIVA®), Epoetin alfas (por exemplo, EPOGEN®), Etanercepts (por exemplo, ENBREL®), Filgrastins (por exemplo, NEUPOGEN®), Ibritumomabs/Tiuxetanos (por exemplo, ZEVALIN®), Imciromab Pentetatos (por exemplo, MYOSCINT®), Infliximabs (por exemplo, REMICADE®), Interferon alfa-2as (por exemplo, ROFERON-A®), Interferon alfacon-ls (por exemplo, INFERGEN®), Interferon alfa-n3s (por exemplo, ALFERON N®), Interferon beta- las (por exemplo, AVONEX®, BETASERON®), Interferon beta-1as (por exemplo, REBIF®), Interferon gama-1bs (por exemplo, ACTIMMUNE®), Laronidases (por exemplo, ALDURAZYME®), Nofetumomabs (por exemplo, VERLUMA®), Omalizumabs (por exemplo, XOLAIR®), Oprelvecinas (por exemplo, NEUMEGA®), Palivizumabs (por exemplo, SYNAGIS®), Pegfilgrastins (por exemplo, NEULASTA®), Peg-interferon alfa-2as (por exemplo, PEGASYS®), Peginterferon alfa-2bs (por exemplo, PEG-ÍNTRON®), Rasburicases (por exemplo, ELITEK®), Reteplases (por exemplo, RETAVASE®), Rituximabs (por exemplo, RITUXAN®), Tenecteplases (por exemplo, TNKase®), Tositumomab e Iodo 1-131s (por exemplo, BEXXAR®), Trastuzumabs (por exemplo, HERCEPTIN®), Urocinases (por exemplo, ABBOKINASE®).
HEMORRAGIA VÍTREA
[00522] Em um esforço em minimizar o potencial para causar descolamento ou rasgamento adicional da retina durante a realização da vitrectomia, foi anteriormente proposto na Patente U.S. No. 5.292.509 (Hageman) injetar certas enzimas glicosaminoglicanaes livres de proteases no corpo vítreo, para fazer com que o corpo vítreo ficasse não- acoplado ou "desinserido" da retina, antes da remoção do corpo vítreo. Tal desinserção ou não-acoplamento do corpo vítreo é suposto minimizar a probabilidade de que mais rasgamento ou descolamento da retina vá acontecer conforme o corpo vítreo é removido. Exemplos de enzimas glicosaminoglicanases livres de protease específicas que podem ser usadas para realizar esta desinserção vítrea supostamente incluem: condroitinase ABC, condroitinase AC, condroitinase B, 4-sulfatase de condroitinase, 6-sulfatase de condroitinase, hialuronidase e beta-glucuronidase.
[00523] Embora enzima hialuronidase seja sabida ser útil para várias aplicações oftálmicas, incluindo a aplicação adjunta de vitrectomia descrita na Patente U.S. No. 5.292.509 (Hageman), estudos publicados indicaram que a enzima hialuronidase pode por si só ser tóxica para a retina e/ou outras estruturas anatômicas do olho. Vide, The Safety of Intravitreal Hyaluronidase. Gottleib, J.L.; Antoszyk, A.N., Hatchell, D.L. e Soloupis, P., Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 31:11, 2345-52 (1990). Além disso, o uso de preparações de hialuronidase de matadouro impuras pode causar uveíte ou inflamação do olho. O uso de sHASEGP humana é então preferível em ambos sua potência maior, pureza e falta de origem animal que pode dar origem a reações imunogênicas e neutralização mediada por anticorpo seguindo administração repetida. Em uma outra modalidade, uma forma peguilada de uma sHASEGP pode ser injetada no olho. Tal sHASEGP peguilada não é eliminada do vítreo de maneira rápida e mantém sua atividade no vítreo por um período de tempo maior.
[00524] A toxidez oftálmica de algumas preparações de hialuronidase foi confirmada por outros investigadores, que propuseram que tais preparações de hialuronidase fossem usadas como um irritante tóxico para causar neovascularização experimentalmente induzida do olho, em modelos de toxidez de animal (vide An Experimental Model of Preretinal Neovascularization in the Rabbit; Antoszyk, A.N., Gottleib, J.L., Casey. R. C., Hatchell, D.L. e Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis. Sci. 32:1, 46-51 (1991). O uso de uma sHASEGP altamente purificada destituída de contaminantes à base de mercúrio e bacterialmente derivados ou de gado, é preferido para procedimentos intraoculares. Além disso, uma sHASEGP humana recombinante é preferida às preparações derivadas de matadouro em ambos falta de pureza de patógenos bovinos e risco reduzido de imunogenicidade. Com mais preferência uma sHASEGP peguilada é pretendida.
[00525] Um método enzimático usando uma sHASEGP humana é então provido para tratamento de distúrbios oftálmicos do olho mamífero. Em uma modalidade da invenção, a dita sHASEGP é PEGuilada para prolongar sua residência dentro do vítreo e prevenir absorção localizada. Prevenção de neovascularização e a taxa aumentada de aplicação do vítreo de materiais tóxicos para a retina, são obtidas através da administração de uma quantidade eficaz de hialuronidase para liquefazer o humor vítreo do olho tratado sem causar dano tóxico ao olho. Liquefação do humor vítreo aumenta a taxa de troca líquida a partir da câmara vítrea. Este aumento na troca remove aqueles materiais e condições cuja presença causas oftalmológicas e dano retinal.
USOS COSMÉTICOS DE sHASEGP
[00526] Sabe-se que a hialuronidase tem o efeito de despolimerização das cadeia de mucopolissacarídeo longas da substância fundamental, responsáveis pela retenção de água ligada e da diminuição, através de compressão capilar, da difusão de líquidos orgânicos, o que elimina refugos metabólicos. Tal retenção de água e refugos associada com carregamento em excesso de gordura dos lipócitos constitui edema "pele de porco" clássico ou edema "casca de laranja". Esta despolimerização vai então cortar as cadeias longas de mucopolissacarídeos em cadeias menores, de onde a eliminação de água ligada, de refugos, restauração da circulação venosa e linfática e desaparecimento de edema local.
[00527] Uso de sHASEGP por meio de administração subcutânea é então preferido para a remoção de glicosaminoglicanos envolvidos no acúmulo da chamada celulite e para promover fluxo linfático. SHASEGP humana é preferida para o tratamento de celulite pelo fato de que ela é capaz de remoção dos ditos glicosaminoglicanos sem os componentes inflamatórios de proteínas derivadas de matadouro e é de alta pureza e não é provável de ser imunogênica. A sHASEGP pode ser administrada através de injeções subcutâneas repetidas, através de aplicação transdérmica na forma de ungüentos ou cremes ou através do uso de formulações de aplicação lenta injetáveis para promover a degradação contínua de glicosaminoglicanos e prevenir seu retorno.
TRANSPLANTE DE ÓRGÃO
[00528] A hialuronidase tem vários efeitos biológicos, que são em parte relacionados com seu tamanho molecular (West, D.C., Kumar, S. Exp. Cell. Res. 183, 179196, 1989). O teor de hialuronano em um órgão aumenta em condições diferentes de inflamação do órgão. Deste modo, uma concentração alta de hialuronan foi mostrada em tecido de diferentes órgãos caracterizada por dano inflamatório- imunológico tal como alveolite (Nettelbladt e outros, Am. Rev. Resp. Dis. 1989;139:759-762) e infarto do miocárdio (Waldenstrom e outros, J. Clin. Invest. 1991; 88(5):1622- 1628). Outros exemplos são rejeição de aloenxerto após um transplante renal (Há'llgren e outros, J. Exp. Med. 1990a;171:2063-2076; Wells e outros, Transplantation 1990; 50:240-243), intestino delgado (Wallander e outros, Tranplant Int. 1993; 6:133-137) ou cardíaco (Hallgren e outros, J. Clin. Invest. 1990b;85:668-673); ou uma inflamação miocardial de origem viral (Waldenstrdm e outros, Eur. J. Clin. Invest. 1993;23:277-282).
[00529] A ocorrência de edemas intersticiais em conexão com o enxerto de um órgão constitui um problema grave no campo de cirurgia de transplante. Até que 25% dos enxertos vão inflamar a tal ponto que a função será temporariamente perdida. Além disso, em 2-3% dos casos, as inflamações causam rompimento do rim, resultando em uma hemorragia massiva.
[00530] SHASEGP pode ser usada para degradar glicosaminoglicanos acumulados em um transplante de órgão. Remoção de tais glicosaminoglicanos promove remoção de água do enxerto e então funcionamento do órgão. Dose variando de 500-10.000 Unidades/kg podem ser administradas para reduzir a pressão intestinal como tal.
ACÚMULOS PATOLÓGICOS DE GLICOSAMINOGLICANOS NO CÉREBRO
[00531] Os níveis de hialuronan são elevados em várias condições patológicas cerebroespinhais. Níveis de hialuronan cerebroespinhal são normalmente menos do que 200 ug/L em adultos (Laurent e outros, Acta Neurol Scand. 1996 Setembro;94(3):194-206). Esses níveis podem elevar para mais de 8.000 Ug/L em doenças tal como meningite, estenose espinha, dano à cabeça e infarto cerebral. Deste modo, administração de sHASEGP (por exemplo, através de aplicação intratecal ou injeção sistêmica de uma sHASEGP, sHASEGP PEGuilada ou sHASEGP supersialada) pode ser utilizada para degradar níveis de substrato criticamente elevados.
[00532] A falta de linfáticos eficazes no cérebro pode também levar a edema ameaçador à vida seguindo trauma craniano. Acúmulo de hialuronona é um resultado de síntese aumentada por uma HA sintase, e degradação menor. Acúmulo de hialuronan pode servir inicialmente o propósito benéfico de aumento do teor de água no tecido ferido, para facilitar o extravasamento de leucócito, mas acúmulo continuado pode ser letal. Administração de sHASEGP humana a um paciente sofrendo de trauma craniano pode ser então remoção de acúmulo de hialuronan de tecido e a água associada com ele. SHASEGP humana pode ser administrada intratecalmente através de um derivação gotejamento ou, alternativamente, sHASEGP, sHASEGP PEGuilada ou sHASEGP Supersialada (de preferência sua versão humana) pode ser administrada intravenosamente para atingir o tecido cerebral.
[00533] Seguindo isquemia e reperfusão do cérebro conforme ocorre em derrame, o teor de hialuronona tipicamente aumenta drasticamente devido à expressão aumentada de HA sintases e catabolismo menor. Falha de bombas de íon e vazamento de plasma para o interstício resultam em retenção de fluido que se não apropriadamente limpo pelos linfáticos, resulta em necrose de tecido. Alguns grupos têm tentado prevenir acúmulo de fluido intersticial seguindo isquemia reperfusão através do bloqueio de permeabilidade vascular. No entanto, uma vez o fluido tendo extravasado, prevenção de permeabilidade vascular pode prevenir a resolução do edema e condições exacerbadas. Conforme acima mencionado, sHASEGP humana pode ser administrada intratecalmente (por exemplo, através de uma derivação), ou sHASEGP, sHASEGP PEGuilada ou sHASEGP Supersialada (de preferência suas versões humanas) podem ser administradas intravenosamente para atingir o tecido cerebral.
[00534] SHASEGP humana pode ser também usada no tratamento de edema associado com tumores cerebrais, particularmente aqueles associados com glioblastoma multiforme. O edema associado com tumores cerebrais resulta do acúmulo de hialuronona nas porções não-cancerosas do cérebro adjacentes ao tumor. Administração de hialuronidase ao sítio de acúmulo de hialuronan (por exemplo, através de injeção intravenosa ou através de derivação) pode aliviar o edema associado com tais males através da degradação do hialuronan em excesso nesses sítios. Deste modo, hialuronidase é bem-sucedida no tratamento de tumores cerebrais não apenas na redução da massa do tumor e inibição de crescimento e/ou metástase de tumor, mas também é útil no alívio de edema associado com o mal. SHASEGP humana pode ser administrada para tratamento de edema de uma maneira similar àquela para administração de hialuronidase testicular bovina para tratar edema (vide, por exemplo, Sa Earp Arq. Braz. Med. 44:217-20).
[00535] Sem desejar ser limitado a uma aplicação ou mecanismo de ação particular, sHASEGPs podem potencialmente melhorar derrame isquêmico ou hemorrágico e/ou outras condições que danifiquem o SNC através de um ou mais do que segue: (i) aumento da oxigenação do tecido danificado através da redução da pressão intracranial; (ii) facilitação da dissolução de coágulos e reabsorção de metabolitos tóxicos; (iii) supressão de extravasamento de leucócito para as regiões infartadas ou com hemorragia (por exemplo, através de remoção de hialuronan que é um receptor para CD44); (iv) promoção de regeneração neural de tecido danificado; ou (vi) aumento de vasculogênese cerebral.
TRATAMENTO DE ACÚMULO DE GLICOSAMINOGLICANO EM DOENÇA CARDIOVASCULAR
[00536] Foi mostrado que a administração de hialuronidase em modeles de animal seguindo infarto do miocárdio experimental pode reduzir o tamanho do infarto (Maclean e outros, Science 1976 8 de Outubro;194(4261):199- 200). O mecanismo proposto através do qual hialuronidase bovina reduz o tamanho do infarto em animais é redução de acúmulo de hialuronan que acontece seguindo isquemia reperfusão. Redução de tamanho de infarto é acreditada acontecer a partir da drenagem de linfo maior e oxigenação de tecido maior e redução de teor de água miocardial. Embora tamanho de infarto reduzido pudesser ser obtido em modelos de animal, os benefícios não foram obtidos em estudos clínicos maiores em seres humanos. Hialuronidases de testes bovina possuem uma meia-vida no soro notavelmente curta de aproximadamente 3 minutos em animais e homem, Wolf e outros, J. Pharmacol. Exp. Ther. 1982 Agosto;222(2):331-7. Esta meia-vida curta é devido a resíduos de manose terminais que são prontamente reconhecidos pelos receptores de seqüestro do sistema reticulo-endotelial. Embora animais pequenos possam se beneficiar de hialuronidase devido a um leito vascular menor, uma enzima com uma meia-vida maior é necessária. SHASEGP supersialada possui farmacocinética mais favorável devido à sialação para a qual não há nenhum receptor de seqüestro. SHASEGP supersialada em doses variando de 100-200.000 Unidades/kg pode ser utilizada para facilitar a resolução de hialuronan em excesso seguindo isquemia reperfusão e para reduzir tamanho do infarto.
[00537] SHASEGP supersialada pode ser também usada para limitar placas coronárias de arteriosclerose. Tais placas acumulam glicosaminoglicano e fazem a mediação de adesão de macrófago e célula espumosa, Kolodgie e outros, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002 1 de Outubro;22(10):1642-8. Administração de sHASEGP supersialada pode ser usada para reduzir formação de placa. Como administração repetida de hialuronidase é compreendida em doses de a partir de 100-100.000 U/kg, a necessidade em utilizar proteína recombinante humana com risco baixo de imunogenicidade e meia-vida maior vai resultar em redução de placas superior.
TRATAMENTO DE NECROSE DE TECIDO PERIFÉRICO
[00538] Necrose de tumor acontece em muitas doenças devido à insuficiência venosa. A falta de oxigenação suficiente é um dos principais obstáculos para novo crescimento de tecido. Foi demonstrado que tratamento com hialuronidase intra-arterial melhora significantemente o quadro clínico em pacientes com doença oclusiva arterial periférica (Elder e outros, Lancet (1980) 648-649). SHASEGP pode ser injetada intra-arterialmente 3-5 vezes por semana em doses de a partir de 10-200.000 Unidades.
APLICAÇÃO AUMENTADA DE ANESTÉSICOS E OUTROS AGENTES FARMACOLÓGICOS A TECIDOS DE MAMÍFERO
[00539] H ialuronidase derivada de matadouro é geralmente usada para bloqueio peribulbar em anestesia local antes de cirurgia oftálmica. A presença da enzima previne a necessidade de bloqueios adicionais e acelera o tempo para o início de acinesia (perda de movimento do olho). Bloqueio peribulbar e do sub-Tenon é a aplicação mais comum de hialuronidase para procedimentos oftálmicos. Desde a descontinuação de Wydase®, relatos de diplopia e ptose maiores foram feitos com bloqueio peribulbar (Brown e outros, J. Cataract Refract Surg. 1999;25:1245-9).
[00540] Com a descontinuação de Wydase® da Wyeth de, material de hialuronidase derivado de testes bovinos é agora fornecido por farmácias misturadas. No entanto, existem várias preocupações com o uso de um produto estéril extemporaneamente composto
[00541] (http://www.ashp.org/shortage/hyaluroni dase.cfm?cfid=11944667&CFToken=9426953-ref#ref. Preparações compostas não são produtos aprovados pela FDA. Deste modo, a FGA não tem controle sobre a qualidade ou consistência do processo de fabricação.
[00542] SHASEGP de a partir de 10-500 Unidades pode ser misturada diretamente com 5 ml de lidocaína a 2% (Xylocaine), 5 ml de bupivacaína a 0,5% (Marcaine) e opcionalmente com epinefrina 1:200.000. sHASEGP pode ser usada para aumentar o início de acinesia e para remover a necessidade de bloqueios adicionais. SHASEGP é também ideal para acinesia para cirurgia cosmética em blefaroplastias e lifts faciais. SHASEGP pode ser também utilizada seguindo tais procedimentos cirúrgicos para difundir antiinflamatórios e para reduzir inchaço do tecido.
[00543] SHASEGP pode ser também misturada com uma solução de tamponamento tal como bicarbonato para prevenir desconforto durante o procedimento de injeção. SHASEGP pode ser também misturada com anestesia para lacerações para ambos reduzir em o volume total de material requerido para injeção e para reduzir dor de inchaço de tecido.
USO DE sHASEGPs PARA PROMOVER DISPERSÃO DE AGENTES FARMACOLÓGICOS E OUTROS
[00544] Conforme aqui descrito, as composições e métodos da presente invenção podem ser usados para promover ou aumentar a aplicação de anestésicos e outros agentes farmacológicos (tal como membros das várias classes de agentes farmaceuticamente eficazes referidos aqui) para qualquer um de uma variedade de tecidos de mamífero in vivo. Com relação a isso, sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel pode ser usada para facilitar a difusão e então promover a aplicação de agentes farmacológicos de molécula pequena, tal como anestésicos, antiinfectivos e antiinflamatórios, por exemplo, bem como agentes farmacológicos de molécula maior, tal como proteínas (incluindo, por exemplo, enzimas, anticorpos monoclonais e similar), ácidos nucléicos (incluindo ácido desoxirribonucléico (por exemplo, genes e moléculas de anti- sentido) e ácidos ribonucléicos (incluindo moléculas de interferência de RNA (RNAi) e similar) e composições macromoleculares que podem compreender uma combinação de tais componentes (incluindo combinações de ácidos nucléicos, proteínas, carboidratos, lipídeos e moléculas à base de lipídeo, e similar). A título de ilustração e sem limitação, moléculas e complexos macromoleculares variando de menos do que cerca de 10 nm a em torno de 500 nm de diâmetro, particularmente de a partir de cerca de 20 a 200 nm, são prováveis de exibir melhoras drásticas na aplicação através de espaços intersticial quando o espaço intersticial foi previamente, ou é coincidentemente, exposto a uma sHASEGP conforme aqui descrito e ilustrado.
[00545] Sem ser restrito a uma teoria ou mecanismo de ação particular, acredita-se que a sHASEGP da presente invenção funcione principalmente através da hidrólise de glicosaminoglicanos dentro da matriz extracelular circundando as células de mamífero para criar passagens tipo poro ou canais que facilitem a difusão ou o movimento de moléculas dentro da matriz extracelular exposta; e, ainda, que permeabilização de tais porções da matriz extracelular tenha o maior efeito sobre a difusão ou "espalhamento" de moléculas que não são tão grandes de modo a serem também impedidas por outros componentes macromoleculares da matriz extracelular, tal como uma rede dominante de colágeno. O grau do efeito de espalhamento obtenível com uma dada sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel em um ambiente de tecido particular pode ser prontamente averiguado conforme aqui ilustrado através da avaliação do efeito da sHASEGP ou seu domínio sobre a difusão de moléculas de teste detectáveis de vários tamanhos (tal como contas fluoresceinadas ou de outro modo marcadas) dentro do tecido de teste, ou com ou sem pré- tratamento ou tratamento concomitante com sHASEGP ou seu domínio em uma faixa de tempos e concentrações. A título de ilustração, no caso de rHUPH20 recombinante injetada subcutaneamente na pela lateral de camundongos, testes de difusão de conta fluoresceinada (conforme aqui exemplificado) indicaram que os efeitos sobre a difusão eram maiores com partículas de menos do que cerca de 500 nm de diâmetro.
[00546] Acredita-se ainda que macromoléculas maiores (exemplificadas por contas de 500 nm ou maiores) podem ser impedidas em difusão não apenas pelo seu tamanho maior mas pela sua interação potencial com outras redes relativamente mais abertas dentro da matriz extracelular, tal como rede formada de filamentos de colágeno intersticial. Ainda, e diferentemente das hialuronidases derivadas de animal descritas, sHASEGPs aqui preferidas da presente invenção não contêm agentes que promovam extravasamento ou agentes de contaminação tal como colagenases (que podem abrir canais maiores) ou outros contaminantes que possam provocar reações imunes. Em aplicações particulares onde poros ou canais maiores são desejados, sHASEGP ou um seu domínio hialuronidase humana solúvel pode ser combinado com de preferência formas relativamente puras de outras enzimas de degradação de matriz tal como colagenases para facilitar espalhamento adicional de complexos macromoleculares ou células de tamanho maior. Para a maioria das aplicações, o uso de um agente que promova a permeabilidade de macromoléculas tendo um tamanho de menos do que cerca de 500 nm, e com mais preferência menos do que cerca de 200 nm, é muito vantajoso pelo fato de que o agente não promove substancialmente o movimento de células dentro do tecido mas promove a passagem de complexos e agentes menores.
[00547] Conforme aqui descrito e ilustrado, sHASEGP pode ser usado para aumentar a aplicação de uma variedade de outros agentes farmacológicos e/ou outros a tecidos dentro do corpo humano (incluindo tecidos tal como aqueles por trás do olho que são tipicamente relativamente difíceis de atingir). Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que sHASEGPs possam aumentar os perfis farmacocinéticos e/ou farmacêuticos de vários tais agentes ao potencialmente aumentar sua difusão ou permeação dentro de um tecido, e/ou aprimorando seu transporte convectivo através do aumento do fluxo de fluido bruto dentro do espaço intersticial de um tecido. Para propósitos de ilustração (e sem limitação), exemplos de agentes farmacológicos que podem ser combinados com sHASEGPs da presente invenção (por exemplo, combinados através de co-formulação com uma ou mais sHASEGPs ou através de co-admisnitração com uma ou mais sHASEGPs (que podem ser administradas antes, coincidente com ou seguindo administração do agente) para tratamento de várias condições que afetam o olho incluem, por exemplo, inibidores de angiogênese (tal como angiostatinas, acetatos de anecortave (por exemplo, RETAANE®), endostatinas, trombospondinas (por exemplo, trombospondina-1 e trombospondina-2 ), anticorpos antiangiogênicos e outros agentes antiangiogênicos ou agentes de direcionamento vascular (VTAs) (por exemplo, anticorpos anti-VEGF tal como bevacizumabs (por exemplo, AVASTIN®), carboxamido triazol (CAI), Interleucina-12 (IL-12), OLTIPRAZ® (5-[2-(pirazinil)- 4-metil-1,2,3-tiona), SU-5416, TNP-470, talidomida) e similar); substâncias anticatarata e antidiabéticas (tal como inibidores de aldose redutase (ARIs), por exemplo, tolrestats (por exemplo, ALREDASE®) e zopolrestats (por exemplo, ALOND®), lisinoprils, enalaprils, estatils e tiol); Agentes antiinflamatórios (incluindo agentes antiinflamatórios esteroidais e não-esteroidais conforme aqui descrito na técnica); Antiinfectivos (incluindo compostos conforme descrito abaixo, bem como várias de suas preparações oftálmicas tal como BLEPHAMIDE®, CILOXAN®, POLYTRIM®, QUIXIN®, TOBRADEX®, VIGAMOX®, ZYMAR®); Agentes de bloqueio beta-adrenérgicos (tal como betaxolóis (por exemplo, BETOPTIC S®), timolóis (por exemplo, BETIMOL® e TIMOPTIC®) e suas combinações (por exemplo, timolóis e inibidor de anidrase carbônica tal como dorzolamida (por exemplo, COSOPT®); inibidores de anidase carbônica (tal como acetazolamidas, brinzolamidas (por exemplo, AZOPT®), diclorofenamida, dorzolamidas (por exemplo, TRUSOPT®, e em combinações com outros agentes como em, por exemplo, COSOPT®), metazolamidas e similar); Midriáticos (tal como sulfatos de atropina, ciclopentolatos, homatropinas, escopolaminas, tropicamidas, eucatropinas e hidroxianfetaminas e similar); Agentes de terapia fotodinâmica (tal como verteporfin (por exemplo, VISUDYNE®); Análogos de prostaglandina (tal como bimatoprosts (por exemplo, LUMIGAN®), latanoprosts (por exemplo, XALATAN®) e travoprosts (por exemplo, TRAVATAN®); Simpatomiméticos (tal como brimonidinas (por exemplo, ALPHAGAN® P); bem como suas combinações (tal como combinações de agente de bloqueio beta- adrenérgico e inibidor de anidrase carbônica como em COSOPT®); e várias outras classes de agentes tal como antiinfectivos e vários outros moduladores fisiológicos conforme descrito abaixo ou em um outro lugar aqui, e/ou conforme sabido na técnica ou recém-desenvolvido.
[00548] Vários outros agentes que podem ser combinados com sHASEGPs da presente invenção (por exemplo, combinados através de co-formulação com uma ou mais sHASEGPs ou através de co-adminsitração com uma ou mais sHASEGPs (que podem ser administradas antes da, coincidente com ou segundo a administração do agente) podem ser usados para tratamento de várias condições que afetam o olho ou afetam vários outros tecidos do corpo. Para propósitos de ilustração (e sem limitação), tais agentes incluem, por exemplo: Anestésicos; Agentes antimetabolitos, antineoplásticos e outros anticâncer; Agentes antiinfectivos, incluindo Antibacterianos e outros antibióticos, Antifúngicos e outros antiinfectivos; Agentes imunomoduladores; Antiinflamatórios esteroidais e não-esteroidais; Beta-bloqueadores; Simpatomiméticos; Ducosanóides, prostaglandinas e análogos de prostaglandina; Mióticos, colinérgicos e anticolinesterases; Antialergênicos e Descongestionantes; Agentes hormonais; Fatores de crescimento; outros agentes sintéticos ou biologicamente derivados; e suas combinações. Alguns exemplos ilustrativos de agentes tendo tais propriedades que podem ser combinados com sHASEGPs na formulação de novos agentes farmacológicos e/ou reformulações de farmacológicos existentes incluem as várias categorias de agentes descritas acima e abaixo (bem como outros agentes conhecidos e novos que estão sendo regularmente identificados para o diagnóstico, prevenção ou tratamento de várias doenças):
[00549] Anestésicos, particularmente anestésicos locais de não-inalação (tal como ambucaínas; amoxecaínas; amilocaínas; aptocaínas; articaínas; benoxinatos; álcoois benzílicos; benzocaínas; betoxicaínas; bifenaminas; bucricaínas; bumecaínas; bupivacaínas; butacaínas; butambens; butanilicaínas; carbizocaínas; cloroprocaína; clibucaínas; clodacaínas; cocaínas; dexivacaínas; diamocaínas; dibucaínas; diclonínas; elucaínas; etidocaínas; euprocinas; fexicaínas; fomocaínas; heptacaínas; hexilcaínas; hidroxiprocaínas; hidroxitetracaínas; isobutambens; cetocaínas; leucinocaínas; lidocaínas; mepivacaínas; meprilcaínas; octocaínas; ortocaínas; oxetacaínas; oxibuprocaínas; fenacaínas; pinolcaínas; piperocaínas; piridocaínas; polidocanóis; pramocaínas; prilocaínas; procaínas; propanocaínas; propipocaínas; propoxicaínas; proximetacaínas; pirrocaínas; quatacaínas; quinisocaínas; risocaínas; rodocaínas; ropivacaínas; álcoois salicílicos; suicaínas; tetracaínas; trapencaínas; trimecaínas) e similar; bem como vários outros anestésicos de não-inalação (tal como alfaxalonas; amolanonas; etoxadróis; fentanilas; cetaminas; levoxadrols; metiturais; metoexitais; midazolams; minaxolonas; propanidids; propoxatos; pramoxinas; propofóis; remifentanilas; sufentanilas; tiletaminas; zolamina e similar);
[00550] Antimetabolitos (tal como análogos de ácido fólico (por exemplo, denopterins, edatrexatos, metotrexatos, piritrexins, pteropterins, Tomudex, trimetrexatos), análogos de purina (por exemplo, cladribinas, fludarabinas, 6-mercaptopurinas, tiamiprinas, tiaguaninas) e análogos de pirimidina (por exemplo, ancitabinas, azacitidinas, 6-azauridinas, carmofurs, citarabines, doxifluridinas, emitefurs, enocitabines, floxurridinas, fluoruracils, gemcitabinas, tegafurs) e similar;
[00551] Antineoplásticos (tal como aclacinomicinas, actinomicinas, adriamicinas, ancitabinas, antramicinas, azacitidinas, azaserinas, 6-azauridinas, bisantrenos, bleomicinas, cactinomicinas, carmofurs, carmustinas, carubicinas, carzinofilinas, cromomicinas, cisplatinas, cladribinas, citarabinas, dactinomicinas, daunorrubicinas, denopterinas, 6-diazo-5-oxo-L-norleucinas, doxifluridinas, doxorrubicinas, edatrexatos, emitefurs, enocitabinas, fepirubicinas, fludarabinas, fluorouracilas, gemcitabinas, idarrubicinas, loxuridinas, menogarilas, 6- mercaptopurinas, metotrexatos, mitramicinas, mitomicinas, ácidos micofenólicos, nogalamicinas, olivomicinas, peplomicinas, pirarrubicinas, piritrexins, plicamicinas, porfiromicinas, pteropterinas, puromicinas, ácidos retinóicos, estreptonigrinas, estreptozocinas, tagafurs, tamoxifenos, tiamiprinas, tioguaninas, triamcinolonas, trimetrexatos, tubercidinas, vinblastinas, vincristinas, zinostatinas, zorrubicinas e similar) (vide também os agentes anticâncer ilustrativos descritos aqui);
[00552] Antivirais (tal como abacavirs (por exemplo, ZIAGEN®), aciclovirs (por exemplo, ZOVIRAX®), amantadinas e rimantadinas (por exemplo, SYMMETREL®), amprenavirs (por exemplo, AGENERASE®), cidofovirs (por exemplo, VISTIDE®), delavirdinas (por exemplo, RESCRIPTOR®), didanosinas (por exemplo, VIDEX®), efavirenz (por exemplo, SUSTIV A®), famciclovirs (por exemplo, FAMVIR®), fomivirsens (por exemplo, VITRAVENE®), foscarnets (por exemplo, FOSCAVIR®), ganciclovirs (por exemplo, CYTOVENE®) e valganciclovirs (por exemplo, VALCYTE®), idoxuridinas (por exemplo, HERPLEX®), indinavirs (por exemplo, CRIXIVAN®), interferons (por exemplo, ALFERON N®, ÍNTRON® A, PEGASYS®, PEG-ÍNTRON®, ROFERON- A® e combinações de interfersons e outros antivirais tal como ROBETRON® e PEGASYS/COPEGUS®), lamivudinas (por exemplo, 3TC® e EPIVIR®) e combinações de lamivudinas e zidovudinas (por exemplo, COMBIVIR®), anticorpos monoclonais tal como palivizumabs (por exemplo, SYNAGIS®), nelfmavirs (por exemplo, VIRACEPT®), nevirapinas (por exemplo, VIRAMUNE®), oseltamivirs (TAMIFLU®), penciclovirs (por exemplo, DENAVIR®), pleconarils, ribavirins (por exemplo, COPEGUS® e REBETOL®), rimantadinas (por exemplo, FLUMADINE®), ritonavirs (NORVIR®), saquinavirs (por exemplo, INVERASE®), stavudines (d4T, por exemplo, ZERIT®), valaciclovirs (por exemplo, VALTREX®), vidarrabinas (por exemplo, VIRA-A®), zalcitabinas (por exemplo, HWID®), zanamivirs (RELENZA®), zidovudinas (por exemplo, AZT, RETROVIR®) e similar);
[00553] Antibacterianos e outros antibióticos, incluindo, por exemplo, Aminoglicosídeos; Anfenicóis; Ansamicinas; Carbacefens; Carbapenens; Cefalosporinas ou Cefens; Cefamicinas; Clavans; lipopeptídeos cíclicos; Diaminopirimidínas; Cetolidas; Lincosamidas; Macrolidas; Monobactans; Nitrofuranos; Oxacefens; Oxazolidinonas; Penens, tienamicinas beta-lactamas mistas; Penicilinas; Antibióticos polipeptídeos; Quinolonas; Sulfonamidas; Sulfonas; Tetraciclínas; e outros antibióticos, cujos membros ilustrativos são providos abaixo (e outros conhecidos na técnica ou recém-desenvolvidos):
[00554] Aminoglicosídeos (por exemplo, amicacinas, apramicinas, arbecacinas, bambermicinas, butirosinas, dibecacinas, diidroestreptomicinas, fortimicinas, gentamicinas, isepamicinas, canamicinas, micronomicinas, neomicinas, neomicin undecilenatos, netilmicinas, paromomicinas, ribostamicinas, sisomicinas, espectinomicinas, estreptomicinas, tobramicinas, trospectomicinas e similar);
[00555] Anfenicóis (por exemplo, azidamfenicóis, cloranfenicóis, florfenicóis, tianfenicóis e similar);
[00556] Ansamicinas (por exemplo, rifamidas, rifampins ou rifampicins (por exemplo, RIFADIN®, RIFADIN IV®, bem como as combinações compreendendo/isoniazida (por exemplo, RIFAMATE®) e rifampin/isoniazida/piirazinamida (por exemplo, RIFATER®), rifamicinas, rifapentinas, rifaximins (por exemplo, XIFAXAM®), e similar);
[00557] Carbacefens (por exemplo, loracarbefs, 3-cloro-1-carbacefens, carbacefens 3-tiossubstituídos, carbacefens descritos no Pedido de Patente Publicado U.S. No. 20050004095 e similar);
[00558] Carbanepens (por exemplo, bianepens, imipenens, meropenens, panipenens e similar);
[00559] Cefalosporinas e cefens (por exemplo, cefaclors (por exemplo, CECLOR®), cefadroxilas, cefamandóis, cefatrizinas, cefazedonas, cefazolinas (por exemplo, ANCEF®), cefcapeno pivoxilas, cefclidinas, cefdinirs, cefditorens, cefepimas (por exemplo, MAXIPIME®), cefetamets, cefiximas, cefinoximes, cefmetazóis, cefodizimas, cefonicidas, cefoperazonas, ceforanidas, cefotaximas, cefotians, cefotetans, cefoxitinas, cefozoprans, cefpimizóis, cefpiramidas, cefpiromas, cefpodoxima proxetilas, cefprozilas, cefroxadinas, cefsulodinas, ceftazidimas (por exemplo, FORTAZ®), cefterams, ceftezóis, ceftibutenos, ceftizoximas, ceftriaxonas (por exemplo, ROCEFIN®), cefuroximas (por exemplo, ZINACEF®), cefuzonans, cefacetrilas, cefalexinas, cefaloglicinas, cefaloridinas, cefalosporinas, cefalotinas, cefapirinas, cefradinas, pivcefalexinas e similar);
[00560] Cefamicinas (por exemplo, cefbuperazonas, cefinetazóis, cefininoxas, cefotetans, cefotoxinas (por exemplo, MEFOXIN®) e similar);
[00561] Cl avans (por exemplo, ácido clavulínico ou clavulanato, 2- e 3-fenil clavans e combinações compreendendo tais agentes tal como amoxicilina/clavulanatos (por exemplo, AUGMENTIN®) e ticarcilin/clavulanatos (por exemplo, TIMENTIN®) e similar);
[00562] Polipeptí deos cíclicos (por exemplo, daptomicinas (por exemplo, CUBICIN®);
[00563] Diaminopiridinas tal como 2,4- diaminopiridinas (por exemplo, bromidoprins, tetroxoprins, trimetoprins e similar);
[00564] Cetolidas (por exemplo, telitromicinas (por exemplo KETEK® e cetolidas bicíclicas em ponte (por exemplo, Enanta EP-013420 e cetolidas 6-11 bicíclicas conforme descrito no pedido de patente U.S. 20040157787) e similar);
[00565] L incosamidas (por exemplo, clindamicinas, lincomicinas e similar);
[00566] Macrólidos (por exemplo, azitromicinas (por exemplo, ZITROMAX®), carbomicinas, claritromicinas, diritromicinas, eritromicinas, acistratos de eritromicina, estolates de eritromicina, glucoeptonatos de eritromicina, lactobionatos de eritromicina, propionatos de eritromicina, estearatos de eritromicina, josamicinas, leucomicinas, midecamicinas, miocamicinas, oleandomicinas, primicinas, roquiitamicinas, rosaramicinas, roxitromicinas, espiramicinas, troleandomicinas e similar);
[00567] Monobactans (por exemplo, aztreonans (por exemplo, AZACTAM®), carumonans, tigemonans similar);
[00568] Nit rofurans (por exemplo, furaltadonas, cloretos de furazólio, nifuradenos, nifuratéis, nifurfolinas, nifurpirinóis, nifurprazinas, nifurtoinóis, nitrofurantoínas e similar);
[00569] Oxacefens (por exemplo, flomoxefs, latamoxefs ou moxalactamas (por exemplo, MOXAM®), e similar);
[00570] Oxazolidinonas (por exemplo, linezolidas (por exemplo, ZYVOXR®), eperezolidas, e similar);
[00571] Penens, tienamicinas e beta-lactamas mistas (por exemplo ertapenens (por exemplo, INVANZ®), imipenens (por exemplo, com Cilastatina como em PRIMAXIN®), meropenens (por exemplo, MERREM®) e similar.
[00572] Penicilinas (por exemplo, amdinocilinas, amdinocilin pivoxilas, amoxicilinas, ampicilinas (incluindo suas combinações (por exemplo, como sublactamas como em UNASYN®)), apalcilinas, aspoxicilinas, azidocilinas, azlocilinas, bacampicilinas, ácidos benzilpenicilínicos, benzilpenicilina sódica, carbenicilinas, carindacilinas, clometocilinas, cloxacilinas, coamoxiclavs, ciclacilinas, dicloxacilinas, epicilinas, fenbenicilinas, floxacilinas, hetacilinas, lenampicilinas, metampicilinas, meticilina sódica, mezlocilinas, nafcilinas, oxacilinas, penamecilinas, iodidrato de penetamato, penicilina G benetaminas, penicilina G benzatinas (por exemplo, BICILIN® L-A), penicilina G benzidrilaminas, penicilina G cálcio, penicilina G hidrabaminas, penicilina G potássio, penicilina G procaínas, penicilina N, penicilina O, penicilina V, penicilina V benzatinas, penicilina V hidrabaminas, penimepiciclinas, feneticilin potássio, piperacilinas (incluindo suas combinações (por exemplo, com inibidores de beta-lactamase tal como tazobactam, como em ZOSYN®), pivampicilinas, propicilinas, quinacilinas, sulbenicilinas, sultamicilinas, talampicilinas, tazocilinas, temocilinas, ticarcilinas (por exemplo, com clavulanato como em TIMENTIN®), e similar);
[00573] Antibióticos polipeptídeo (por exemplo, anfomicinas, bacitracinas, capreomicinas, colistimetatos (por exemplo, COLI-MICIN® M), colistinas, enduracidinas, enviomicinas, fusafunginas, gramicidinas, micamicinas, polimixinas, pristinamicinas (e derivados de pristinamicina tal como quinupristinas e dalfopristinas (por exemplo, SYNERCID®)), ristocetinas, teicoplaninas, tiostreptons, tuberactinomicinas, tirocidinas, tirotricinas, vancomicinas, viomicinas, virginiamicinas, bacitracins de zinco e similar);
[00574] Quinolonas (incl. fluoroquinolonas e análogos) (por exemplo, mesilatos de alatrofloxacina, cinoxacinas, ciprofloxacinas (por exemplo, CIPRO®), clinafloxacinas, difloxacinas, enoxacinas, fleroxacinas, flumequinas, gatifloxacinas (por exemplo, TEQUIN®), grepafloxacinas, levofloxacinas (por exemplo, LEVAQUIN®), lomefloxacinas, miloxacinas, moxifloxacinas (por exemplo, AVELOX®), nadifloxacinas, ácido nalidíxicos, norfloxacinas, ofloxacinas, ácidos oxolínicos, pazufloxacinas, pefloxacinas, ácidos pipemídicos, ácido piromídicos, rosoxacinas, rufloxacinas, esparfloxacinas, temafloxacinas, tosufloxacinas, mesilato de trovafloxacina e similar);
[00575] Sulfonamidas (por exemplo, acetilsulfametoxipirazinas, benzilsulfamidas, cloramine-B, cloramine-T, dicloramina T, formilsulfisomidinas, beta- glucosilsulfanilamidas, mafenidas, 4'- (metilsulfamoil)sulfanilanilidas,
[00576] noprilsulfamidas, ftalilsulfacetamidas, ftalilsulfatiazóis, salazossulfadimidinas, succinilsulfatiazóis, sulfabenzamidas, sulfacetamidas, sulfaclorpiridazinas, sulfacrisoidinas, sulfacitinas, sulfadiazinas, sulfadicramidas, sulfadimetoxinas, sulfadoxinas, sulfaetidóis, sulfaguanidinas, sulfaguanóis, sulfalenos, ácidos sulfalóxicos, sulfamerazinas, sulfameters, sulfametazinas, sulfametizóis, sulfametomidinas, sulfametoxazóis, sulfametoxipiridazinas, sulfametróis, sulfamidoclirisoidinas, sulfamoxóis, sulfanilamidas, ácidos 4-sulfanilamidosalicílicos, sulfanililsulfanilamidas, sulfaniluréias, n-sulfanilil-3,4- xilamidas, sulfanitrans, sulfaperinas, sulfafenazóis, sulfaproxilinas, sulfapirazinas, sulfapiridinas, sulfasomizóis, sulfasimazinas, sulfatiazóis, sulfatiouréias, sulfatolamidas, sulfisomidinas, sulfisoxazósi e similar);
[00577] Sulfonas (por exemplo, acedapsonas, acediassulfonas, acetossulfona sódica, dapsonas, diatimossulfonas, glucossulfona sódica, solassulfonas, sublactamas, succissulfonas, ácidos sulfanílicos, p- sulfanililbenzilaminas, sulfoxona sódica, tiazolsulfonas e similar);
[00578] Tetraciclinas (por exemplo, apiciclinas, clortetraciclinas, clomociclinas, demeclociclinas, doxiciclinas, guameciclinas, lymeciclinas, meclociclinas, metaciclinas, minociclinas, oxitetraciclinas, penimepiciclinas, pipaciclinas, rolitetraciclinas, sanciclinas, tetraciclina), e outras (por exemplo, cicloserinas, mupirocinas, tuberinas e similar);
[00579] e out ros antibióticos (tal como clofoctóis, ácidos fusídicos, hexedinas, metenaminas (incluindo, por exemplo, metenamina, metenamina anidrometileno-citratos, hipuratos de metenamina, mandelato de metenamina, subsalicilatos de metenamina), nitrofurantoínas (por exemplo, FURAD ANTIN®), nitroxolinas, ritipenens, taurolidinas, xibomóis e similar);
[00580] Antifúngicos, incluindo polienos tal como anfotericina Bs (por exemplo, ABELCET® e AMBISOME®), candicidinas, dermostatinas, filipinas, fungicrominas, haquimicinas, hamicinas, lucensomicinas, mepartricinas, natamicinas (por exemplo, Natacyn), nistatinas, pecilocinas, perimicinas e outros (por exemplo, azaserinas, griseofulvinas, oligomicinas, undecilenatos de neomicina, pirrolnitrinas, siccaninas, tubercidinas, viridinas); bem como antifúngicos sintéticos tal como alilaminas (por exemplo, butenafinas, naftifinas, terbinafinas); imidazóis (por exemplo, bifonazóis, butoconazóis, clordantoínas, clormidazóis, cloconazóis, clotrimazóis, econazóis, enilconazóis, fenticonazóis, flutrimazóis, isoconazóis, itraconazol, cetoconazóis, lanoconazóis, miconazóis, omoconazóis, nitratos de oxiconazol, sertaconazóis, sulconazóis, tioconazóis, voriconazóis (por exemplo, VFEND®)); tiocarbamatos (por exemplo, , tolciclatos, tolindatos, tolnaftatos); triazóis (por exemplo, fluconazóis (por exemplo, DIFLUCAN®), itraconazóis (por exemplo, SPORANOX®), saperconazóis, terconazóis); e outros sintéticos (por exemplo, acrisorcinas, amorolfinas, bifenaminas, bromossalicilcloranilidas, buclosamidas, propionatos de cálcio, clorfenesinas, ciclopiroxes, cloxiquinas, coparafinatoes, bicloridratos de diamtazol, exalamidas, flucitosinas, haletazóis, hexetidinas, lipopeptídeos tal como equinocandina (como em caspofungina CANCIDAS®), loflucarbans, nifuratéis, iodetos de potássio, ácidos propiônicos, piritionas, salicilanilidas, propionatos de sódio, sulbentinas, tenonitrozóis, triacetinas, ujotions, ácidos undecilênicos, propionato de zinco) e similar;
[00581] Amebi cidas e antiprotozoários (incluindo, por exemplo, atovaquona, cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazol, cloridrato de metronidazol, isetionato de pentamidina e similar); Anti- helmínticos e antiparasíticos (incluindo, por exemplo, mebendazol, pirantel pamoato, tiabendazol e similar); Antimalários (incluindo, por exemplo, cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquina, cloridrato de mefloquina, fosfato de pimaquina, pirimetamina, pirimetamina com sulfadoxina; Antituberculóticos e antilepróticos (incluindo, por exemplo, clofazima, cicloserina, dapsona, cloridrato de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutin, rifampin, rifapentina, sulfato de estreptomicina e similar, bem como suas combinações tal como rifampin/isoniazida (por exemplo, RIFAMATE®) e rifampin/isoniazida/pirazinamida (por exemplo, RIFATER®).
[00582] P ara propósitos de ilustração adicional (e sem limitação), exemplos de agentes imunomoduladores que podem ser combinados com sHASEGPs da presente invenção (por exemplo, combinados através de co-formulação com uma ou mais sHASEGPs ou através de co-administração com uma ou mais sHASEGPs (que podem ser administradas antes da, coincidente com ou seguindo administração do agente) incluem, por exemplo, membros das classes de agentes que seguem:
[00583] Imunossupressores (incluindo, por exemplo, azatioprina, basiliximab, ciclosporina, daclizumab, imunoglobulina de linfócito, muromonab-CD3, micofenolato mofetil, cloridrato de micofenolato mofetol, sirolimus, tacrolimus e similar);
[00584] Vacinas e toxóides (incluindo, por exemplo, vacina, BCG, vacina do cólera, difteria e toxóides do tétano (absorvidas), vacina da difteria e toxóides do tétano e coqueluche aceulares absorvidos, vacina da difteria e toxóides do tétano e coqueluche de célula integral, vacinas conjugadas de Haemophilus b, vacina da hepatite A (inativada), vacina da hepatite B (recombinante), vacinas do vírus influenza (baseadas em antígenos de superfície), vacinas do fírus influenza (baseadas em subvírions e subvírions purificados), vacinas do vírus influenza (com base em vírions integrais), vacina do vírus da encefalite Japonesa (inativada), vacina da doença de Lyme (OspA recombinante), vacina do vírus do sarampo e caxumba e rubéola (viva), vacina do vírus do sarampo e caxumba e rubéola (viva atenuada), vacina do vírus do sarampo (viva atenuada), vacina de polissacarídeo meningocócica, vacina do vírus da caxumba (viva), vacina de peste, vacina pneumococal (polivalente), vacina de polivírus (inativada), vacina de polivírus (viva, oral, trivalente), vacina da raiva (absorvida), vacina da raiva (célula diplóide humana), vacina do vírus da rubéola e caxumba (viva), vacina do vírus da rubéola (viva, atenuada), toxóide do tétano (absorvida), toxóide do tétano (fluida), vacina tifóide (oral), vacina tifóide (parenteral), vacina de polissacarídeo tifóide VI, vacina a vírus da varicela, vacina da febre amarela e similar);
[00585] Antitoxinas e antivirais (incluindo, por exemplo, antídotos da viúva negra e outra aranha, antídoto de Crotalíneos (polivalente), antitoxina da difteria (equina), antídoto de Micrurus fulvius e similar);
[00586] Soros imunes (incluindo por exemplo, globulina imune de citomegalovírus (intravenosa), globulina imune de hepatite B (humana), globulina imune intramuscular, globulina imune intravenosa, globulina imune da raiva (humana), globulina imune intravenosa do vírus sincitial respiratório (humana), globulinas imunes (humanas), globulina humana do tétano (humana), globulina imune de varicella-zoster e similar);
[00587] Outros imunomoduladores (incluindo, por exemplo, aldesleucina, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatirâmero para injeção, interferon alfacon-1, interferon alfa-2a (recombinante), interferon alfa-2b (recombinante), interferon alfa-n3, interferon beta-1a, interferon beta-1b (recombinante), interferon gama-1b, cloridrato de levamisol, oprelvecina, sargramostim e similar).
[00588] Outros agentes que podem ser combinados com sHASEGPs da presente invenção (por exemplo, combinados através de co-formulação com uma ou mais sHASEGPs ou através de co-administração com uma ou mais sHASEGPs (que podem ser administradas antes da, coincidente com ou seguindo administração do agente) incluem, por exemplo, o que segue:
[00589] Antiinflamatórios esteroidais (tal como alclometasonas, algestonas, beclometasonas, betametasonas, budesonidas, clobetasóis, clobetasonas, clocortolonas, cloprednóis, corticosteronas, cortisonas e hidrocortisonas (por exemplo, acetato de hidrocortisona), cortivazóis, deflazacorts, desonidas, desoximetasonas, dexametasonas (por exemplo, dexametasona 21-fosfato), difluorosonas, diflucortolonas, difluprednatos, enoxolonas, fluazacorts, fiucloronidas, flumetasonas, flunisolidas, fluocinolonas, fluocinonidas, fluocortinas, fluocortolonas, fiuorometolonas, fluperolonas, fluprednidenos, fluprednisolonas, flurandrenolidas, fluticasonas, formocortals, halcinonidas, halobetasóis, halometasonas, halopredonas, hidrocortamatos, hidrocortisonas, etabonato de loteprednol, mazipredonas, medrisonas, meprednisonas, metilprednisolonas, furoato de mometasona, parametasonas, prednicarbatos, prednisolonas (por exemplo, prednisolona 25- dietilamino-acetato, fosfato de sódio de prednisolona), prednisonas, prednivais, prednilidenos, rimexolonas, tixocortóis, triamcinolonas (por exemplo, triamcinolona acetonida, triamcinolona benetonida e triamcinolona hexacetonida) e similar);
[00590] Antiinflamatórios não-esteroidais (tal como cromoglicatos, diclofenacos, flurbiprofenos, indometacinas, ibuprofenos, cerotolacs (por exemplo, trometamina de cetorolaco), lodoxaminas, nedocromils, piroxicans, salicilatos e similar);
[00591] Beta-bloqueadores ( tal como betaxolóis (por exemplo, cloridrato de betaxolol), carteolóis, esmolóis, levobunolóis, metipranalóis, timolóis (por exemplo, hemiidrato de timol e várias formas de maleato de timolol) e similar);
[00592] Simpatomiméticos (tal como adrenalina, brimonidinas, dipivefrinas, epinefrinas e similar);
[00593] Ducosanóides, prostaglandinas e análogos de prostaglandina (tal como bimatoprosts, latanoprosts, travoprosts, unoprostonas e similar) bem como antiprostaglandinas e precursores de prostaglangina;
[00594] Mióticos, colinérgicos e anticolinesterases (tal como cloretos de acetilcolina, carbacóis, brometos de demecário, diisopropil fluorfosfatos, eserinas, fisostigminas, pilocarpinas, fosfolino iodinas, salicilatos e similar);
[00595] Antialérgicos (tal como antazolinas de sódio, cetirizinas, clorfeniraminas, cromoglicatos, cromolin dissódico (Crolom), difumarato de emedastina, cetotifinas (por exemplo, fumarato de cetotifeno), levocabastinas, metapirilinas, nedocromil dissódico, olopatadinas, pirilaminas, profenpiridaminas e similar);
[00596] Descongestionantes (tal como fenilefrinas, nafazolinas, tetraidrozolinas e similar);
[00597] Agentes hormonais (tal como estrógenos, estradióis, progestacionais, progesteronas, insulinas, calcitoninas, hormônio paratireóide e peptídeo e fator de aplicação do hipotálamo vasopressina e similar);
[00598] Fatores de crescimento (tal como fator de crescimento epidermal, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator beta de crescimento transformante, somatropina e fibronectina e similar);
[00599] Analgé sicos (tal como acetaminofeno; alfentanil; aminobenzoato; aminobenzoato; anidoxima; anileridina; anileridina; anilopam; anirolac; antipirina; aspirina; benoxaprofeno; benzidamina; cloridrato de bicifadina; brifentanil; bromadolina; bromfenac; buprenorfina; butacet; butixirato; butorfanol; butorfanol; carbamazepina; carbaspirina cálcica; carbifeno; carfentanil; ciprefadol succinato; ciramadol; ciramadol; clonixeril; clonixin; codeína; fosfato de codeína; sulfato de codeína; conorfona; ciclazocina; dexoxadrol; dexpemedolac; dezocina; diflunisal; diidrocodeína; dimefadana; dipirona; doxpicomina; drinideno; enadolina; epirizol; tartrato de ergotamine; etoxazeno; etofenamato; eugenol; fenoprofen; fenoprofeno cálcico; fentanil citrato; floctafenina; flufenisal; flunixin; flunixin meglumina; flupirtina; fluproquazona; fluradolina; flurbiprofeno; hidromorfona; ibufenac; indoprofen; cetazocina; cetorfanol; cetorolac; letimida; acetato de levometadila; cloridrato de acetato de levometadila; levonantradol; levorfanol; lofemizol; oxalato de lofentanil; lorcinadol; lomoxicarn; salicilato de magnésio; ácido mefenâmico; menabitan; meperidina; meptazinol; metadona; acetato de metadila; metofolina; metotrimeprazina; acetato de metcefamid; mimbano; mirfentanil; molinazona; sulfato de morfina; moxazocina; nabitan; nalbufina; nalmexona; namoxirato; nantradol; naproxeno; naproxeno; naproxol; nefopam; nexeridina; noracimetadol; ocfentanila; octazamida; olvanila; oxetorona; oxicodona; oxicodona; tereftalate de oxicodona; oximorfona; pemedolac; pentamorfona; pentazocina; pentazocina; fenazopiridina; feniramidol; picenadol; pinadolina; pirfenidona; piroxicam olamina; pravadolina; prodilidina; profadol; propiram; propoxifeno; napsilato de propoxifeno; proxazol; proxorfan; pirrolifeno; remifentanil; salcolex; maleato de saletamida; salicilamida; salicilato de meglumina; salsalato; salicilato; spiradolina; sufentanil; sufentanil; sucapsaicina; talmetacina; talniflumato; talosalato; tazadoleno; tebufelona; tetridamina; tifurac; tilidina; tiopinac; tonazocina; tramadol; trefentanil; trolamina; veradolina; verilopam; volazocina; xorfanol; xilazina; mesilato de zenazocina; zomepirac; e similar);
[00600] Out ros agentes farmacológicos macromoleculares tal como outras proteínas, ácidos nucléicos e similar; bem como complexos de macromoléculas tal como vários veículos de aplicação de fármaco, aplicação de proteína e/ou aplicação de gene (incluindo veículos sinteticamente preparados tal como lipossomas e similar, bem como veículos biologicamente tratados tal como vetores virais e similar); e
[00601] Outros agentes usados para uma variedade de condições (e informação adicional com relação a uso, dosagens, contra-indicações, etc, de vários agentes incluindo aqueles identificados aqui), conforme sabido na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles agentes adicionais em referências tal como Physician's Desk Reference (PDR) (Thomsom 2003, 2004, 2005); the American College of Physicians Complete Home Medical Guide (DK Publishing 2003); e agentes adicionais identificados em referências de patente incluindo, por exemplo, Pedidos de Patente Publicados U.S. 20040224,23, 200440224012 e 200550002865 (listas de agentes que estão aqui incorporadas a título de referência).
[00602] Combinações de agentes (por exemplo, dois ou mais agentes selecionados de um ou mais grupos anteriores de agentes e/o de outros grupos ou classes de agentes farmacológicos e outros especificados aqui ou conhecidos na técnica.
USO DE sHASEGPs PARA REDUÇÃO DE PRESSÃO INTRAOCULAR E OUTRAS INDICAÇÕES OFTÁLMICAS
[00603] Um efeito colateral comum que acontece em pacientes com catarata pós-operatória é uma aumento significante inicial, e ocasionalmente prolongado, na pressão intraocular. Tal condição é algumas vezes séria, especialmente em pacientes com mudanças no disco óptico glaucomatoso. Embora o aumento de pressão tenda a ser mais grave quando agentes viscoelásticos tal como ácido hialurônico são injetados no olho durante cirurgia, a pressão intraocular pode se tornar elevada pós-operativamente mesmo quando tais agentes não são utilizados. Ainda, tal aumento de pressão pode acontecer mesmo quando quaisquer medicações adicionais são usadas durante o procedimento cirúrgico. Em alguns casos, é vantajoso deixar um agente viscoelástico no olho, o que freqüentemente necessita dar aos pacientes doses grandes de inibidores de anidrase carbônica. Esses inibidores diminuem a pressão intraocular ao diminuir a formação de humor aquoso, um fluido que é normalmente secretado no olho, pelo corpo ciliar. Métodos atuais de alívio de aumentos de pressão pós-operatória no olho incluem vários tipos de colírios tal como agentes de bloqueio beta- adrenérgico, agentes simpatomiméticos, mióticos, agentes seletivos alfa II, inibidores de anidrase carbônica e agentes prostaglandina.
[00604] Um método preferido de remoção do viscoelástico tal como ácido hialurônico é através de injeção de sHASEGP durante ou imediatamente seguindo procedimentos cirúrgicos do segmento anterior ou segmento posterior, embora outros métodos de administração conhecidos na técnica sejam também possíveis. É preferido se o ácido hialurônico ou a sHASEGP for administrado através de injeção na câmara anterior durante procedimentos cirúrgicos oculares do segmento anterior para permitir que ácido hialurônico aja como um espaçador durante o início do procedimento cirúrgico. Em alguns casos de transplante de córnea, a combinação de ácido hialurônico e sHASEGP pode ser posta sobre a superfície das estruturas intraoculares antes da sutura do transplante de córnea no lugar. Esta combinação pode ser também usada em cirurgia do segmento posterior, tal como cirurgia da retina ou do vítreo.
[00605] Em alguns casos, pode ser conveniente deixar um agente viscoelástrico tal como Healon®, Viscoat® ou outras substâncias de ocupação de espaço na câmara anterior do olho no final da cirurgia. Isto é especialmente verdadeiro em aumento de pressão positiva quando os conteúdos intraoculares tendem a ir para a frente e pressionar contra a superfície posterior da córnea. Se isso acontecer em um olho com uma lente intraocular sintética no local, pressão do endotélito corneal pode causar dano significativo às células e subseqüente inchaço da córnea e opacificação podem acontecer, que estão associados com visão menor. Tipicamente, se a pressão intraocular de um paciente estiver significantemente elevada no término do procedimento de operação, é necessário dar a tal paciente uma dose grande de inibidores de anidrase carbônica, bem como colírios tópicos tal como agonistas beta-bloqueadores e alfa II a fim de diminuir a formação aquosa e/ou aumentar o fluxo de saída aquoso. Esses agentes têm todos efeitos colaterais significantes e, em alguns casos, são contra-indicados em pacientes com vários tipos de condições médicas tal como problemas respiratórios, doença cardíaca ou pressão sangüínea alta. No entanto, o uso de sHASEGP nessas situações vai eliminar a necessidade de dar a esses pacientes doses grandes de tais fármacos.
[00606] Ainda, há uma quantidade significante de ácido hialurônico na rede trabecular. A sHASEGP vai quebrar isto e então melhorar o fluxo de saída do aquoso através da rede trabecular. A pressão intraocular do paciente vai então diminuir. A combinação de sHASEGP com outros agentes de câmara anterior, tal como metil celulose (Ocucoat®, por exemplo, comercialmente disponível da Storz Instrument Co.), usada como agentes espaçadores e/ou de proteção em cirurgia de catarata, será também eficaz na prevenção de aumentos de pressão significantes porque ela vai na verdade abrir a rede trabecular e permitir mais drenagem de humor aquoso ao quebrar uma quantidade significante do ácido hialurônico presente na rede trabecular.
[00607] Remoção de glicosaminoglicanos a partir da rede trabecular é também útil para a redução de pressão intraocular em indivíduos sofrendo de glaucoma de ângulo aberto. SHASEGP humana pode ser administrada através de injeção subconjuntival ou injeção diretamente na câmara anterior. Uma vez que a sHASEGP age enzimaticamente, mesmo quantidades relativamente limitadas de sHASEGP podem funcionar eficazmente como um antídoto viscoelástico ou para outras situações que são auxiliares ou melhoradas através da aplicação de uma glicosaminoglicanase. Como com outros usos, as unidades de atividade de hialuronidase providas pela sHASEGP para aplicação ótima vão depender em parte da situação particular sendo tratada - especialmente da quantidade de degradação de glicosaminoglicano que é desejada - mas podem ser prontamente avaliadas usando modelos apropriados e então otimizadas conforme apropriado para usos particulares. A título de ilustração, as unidades de sHASEGP a serem aplicadas como um antídoto serão influenciadas, inter alia, pelo procedimento particular empregado e pela quantidade de viscoelástico aplicada, e também se qualquer um dos viscoelásticos deve ser removido usando outros procedimentos tal como irrigação e aspiração. Onde sHASEGP for usada seguindo irrigação e aspiração, geralmente quantidades provendo na faixa de 10 a 12.000 unidades, tipicamente 100 a 5.000 unidades, mais tipicamente 500 a 2.000 unidades, podem ser aplicadas, embora isto vá novamente depender da aplicação particular. Onde sHASEGP for usada para obviar a necessidade de irrigação e aspiração, quantidades maiores serão aplicadas a fim de digerir eficazmente uma volume maior de viscoelástico aplicado, com quantidades geralmente provendo na faixa de 50 a 20.000 unidades, tipicamente 400 a 10.000, mais tipicamente 1.500 a 5.000 unidades podem ser aplicadas, embora isto vá novamente depender da aplicação particular.
[00608] No caso de sHASEGPs sendo usadas para reduzir pressão intraocular associada com glaucoma, aplicação de sHASEGPs pode ser também usada como um tratamento primário para reduzir IOP associada com glaucoma e então potencialmente evitar a necessidade de procedimentos cirúrgicos tal como filtragem de glaucoma, implantes de drenagem de glaucoma (derivações de tubo), trabeculoplastia a laser, citofotocoagulação e iridotomia. Deste modo, as sHASEGPs da presente invenção podem ser introduzidas, por exemplo, através de injeção na câmara anterior do olho para prover um meio invasivo mínimo para redução da pressão intraocular associada com glaucoma. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a administração de sHASEGPs em tais ambientes possa aumentar o fluxo de saída de fluido através da rede trabecular e então diminuir a IOP através da redução de pressões hidrostática e/ou oncótica dentro da câmara anterior.
[00609] No caso de sHASEGPs sendo usadas para dissolver agregados vítreos ou "moscas-volantes", que são geralmente agregados opacos macroscópicos de fibras vítreas, a administração de sHASEGP ao corpo vítreo pode ser usada para promover desintegração.
[00610] Similarmente, as sHASEGPs conforme aqui descritas podem ser aplicadas ao vítreo para promover a resolução de hemorragias vítreas (isto é, extravasamento de sangue para o vítreo) que pode acontecer em conexão com condições tal como retinopatia diabética, neovascularização retinal, oclusão de via retinal, descolamento vítreo posterior, rasgamentos retinais, traumas oculares e similar. A presença de hemorragias vítreas, que são tipicamente lentas de resolver, pode retardar, complicar ou prevenir procedimentos que requerem que a retina seja visualizada através do vítreo para procedimentos de diagnóstico e/ou tratamento tal como fotocoagulação a laser e similar que são freqüentemente tratamentos primários para condições tal como retinopatia diabética proliferativa. Uso de sHASEGPs para promover resolução de tais hemorragias vítreas pode então ser feito para facilitar diagnóstico de condições retinais e/ou para obviar a necessidade de procedimentos mais radicais tal como vitrectomia.
[00611] No caso de sHASEGPs sendo usadas para promover descolamento vítreo-retinal em tratamento de condições tal como retinopatia diabética, a administração de sHASEGP no vítreo pode ser usada para promover descolamento ou desacoplamento do corpo vítreo da retina. Neste contexto, sHASEGP pode não apenas promover o descolamento mas ajudá- lo a acontecer de uma maneira que reduza a potencial para distorção ou rasgamento de retina.
[00612] As sHASEGPs da presente invenção podem ser também usadas para tratamento de opacidades da córnea. Com relação a isso, uma variedade de distorções ou deformidades pode afetar a estrutura normalmente organizada da córnea e levar a rompimentos na passagem de luz através da córnea e danos concomitantes na visão. Deste modo, várias condições e causas levam a distorções da córnea que podem aparecer como cicatrizes, névoa ou opacificação. Ao aplicar sHASEGPs para a melhora ou tratamento de tais condições da córnea, a sHASEGP (em uma solução farmaceuticamente aceitável que pode compreender um ou mais agentes farmacológicos adicionais) pode ser introduzida na córnea através de qualquer uma de vária vias de administração, dependendo em parte do grau e local do dano à córnea. A título de ilustração, sHASEGPs podem ser introduzidas na superfície externa do olho (usando gotas ou outra aplicação tópica por exemplo), potencialmente encapsuladas dentro de veículos tal como lipossomas e similar que podem ser usados para facilitar a transferência através do epitélio corneal, através de injeção ou microinjeção sobre ou na própria córnea, ou através de outras abordagens para ao tecido da córnea. Em adição aos auxiliares bioquímicos ou mecânicos para promoção de aplicação, outros meios para promoção de permeação tal como iontoforese podem da mesma maneira ser aplicados.
[00613] As sHASEGPs da presente invenção podem ser também usadas, por exemplo, para aumentar a permeabilidade de agentes empregados em terapia fotodinâmica (PDT). PDT é um tratamento para membranas neovasculares coroidais (CNVM), que são geralmente estruturas vasculares vazadas sob a retina na forma "úmida" de degeneração macular relacionada com a idade (AMD)). Em PDT, um corante fotossensível tal como VISUDYNE® (verteporfin) é tipicamente administrado intravenosamente (IV) e deixado perfundir a CNVM, bem como o restante do corpo. Um oftalmologista então geralmente trata a CNVM com um laser vermelho de um comprimento de onda específico (por exemplo, 689 nm) por cerca de 90 segundos. A luz laser não-térmica ativa o corante (tal como VISUDYNE®) produzindo uma forma ativa de oxigênio que ambos coagula e reduz o crescimento de vasos sangüíneos anormais, que por sua vez inibem o vazamento de líquido da SNVM. As sHASEGPs da presente invenção podem ser usadas, por exemplo, para promover administração mais localizada de um corante (tal como VISUDYNE®) diretamente ao olho; e/ou para facilitar a aplicação de outros agentes que são utilmente administrados ao olho em conexão com procedimentos tal como PDT.
CISTOS DE GÂNGLIO
[00614] O cisto do gânglio (também conhecido como cisto do punho, cisto da Bíblia ou cisto do tendão dorsal) é a massa de tecido mole mais comum da mão. Ele é um saco cheio de fluido que pode sentido abaixo da pele. Ele é geralmente ligado ao revestimento do tendão (revestimento que lubrifica o tendão) na mão ou punho ou conectado com uma junta de base; no entanto, alguns não têm qualquer conexão óbvia com quaisquer estruturas. Esses podem acontecer no pé. Ele freqüentemente acontece onde um uma ruptura dos ligamentos que estão sobre o revestimento dos tendões ou juntas e o revestimento de hérnias fora do ligamento defeituoso causando uma protuberância sob a pele. Devido ao fato de que há freqüentemente inflamação associada, o tecido inflamado produz um fluido tipo geléia que enche o saco saliente. Eles podem ser duros devido a uma pressão do muco tipo fluido contido dentro do cisto, e são freqüentemente confundidos com uma proeminência óssea.
[00615] SHASEGP pode ser usada para melhorar cistos de gânglio. Injeção intralesional de sHASEGP de 51000 Unidades seguido por aspiração com agulha fina vai remover o cisto sem a necessidade de cirurgia. Corticosteróides podem ser opcionalmente injetados também com a sHASEGP. Injeção adicional pode ser requerida para alguns pacientes.
MIXEDEMA
[00616] Infiltração de glicosaminoglicano (GAG) da pele é uma caracteristica de hipertiroidismo, hipotiroidismo, mixedema pré-tibial, escleromixedema e escleredema. Ácido hialurônico é o GAG principal em todas as condições e em pele normal. Há variabilidade histológica mínima de distribuição dermal de GAG. As mucinoses cutâneas adquiridas exibem distribuição de GAG na pele e composição bioquímica similares. As diferenças morfológicas em atividade de fibroblasto sugerem que as mucinoses de esclerederma e escleromixedema representam um processo local, enquanto a infiltração de GAG de doenças da tireóide pode ter uma origem sistêmica. Esses distúrbios podem ser melhorados com uma sHASEGP de ambas vias de administração local e sistêmica. Para terapia crônica, uma sHASEGP PEGuilada pode ser pretendida.
USOS PULMONARES DE sHASEGP
[00617] Níveis de Hialuronan em lavagens broncoalveolares (BAL) de indivíduos normais estão geralmente abaixo de 15 mg/ml. No entanto, os níveis de BAL aumentam drasticamente em condições de agonia respiratória (Bjermer, Br. Med. J. (Clin. Res. Ed.) 1987 3 de outubro:296(6602):803-6). Em ARDS, por exemplo, os níveis de hialuronan podem aumentar para 500 ng/ml enquanto em pulmão de fazendeiros, os níveis de BAL podem ultrapassar 1000 ng/ml (Hallgren e outros, Am. Rev. Respir. Dis. 1989 Março;139(3):682-7) (Larrson e outros, Chest., 1992 Janeiro;101(1):109-14). Mais hialuronan no pulmão pode prevenir difusão de oxigênio e troca de gás bem como ativação de respostas de neutrófilo e macrófago.
[00618] Preparações bovinas de hialuronidase não são preferidas para o tratamento de tais condições por várias razões. Primeiro, preparações de hialuronidase derivadas de testes de matadouro são sabidas estar contaminadas com serina proteases tal como acrosina. Segundo, a natureza estranha das enzima bovinas aumenta a probabilidade de uma reação anaftálica, que poderia resultar em morte do paciente. Deste modo, uma preparação altamente purificada de sHASEGP humana recombinante pode ser aplicada através de aplicação ou pulmonar ou intravenosa. SHASEGP humana pode ser também administrada a pacientes sofrendo de outras complicações pulmonares que estão associadas com glicosaminoglicanos elevados ou para aumentar a aplicação de outras moléculas co-aplicadas ao pulmão.
[00619] A invenção será agora descrita em mais detalhes através de referência aos exemplos não-limitantes que seguem:
EXEMPLO 1 ENSAIOS DE HIALURONIDASE BASEADOS EM MICROTITULAÇÃO
[00620] O exemplo que segue provê um ensaio rápido para medição da atividade de hialuronidase de sHASEGP. Este ensaio pode estar relacionado a TRU, a IU ou NFU através do uso de uma preparação padrão da W.H.O de hialuronidase.
ENSAIO DE MICROTITULAÇÃO DE HIALURONAN BIOTINILADO
[00621] Os grupos carboxila livres em resíduos de ácido glucurônico de Hialuronan são biotinilados em uma reação de uma etapa usando biotina-hidrazida (Pierce), Sulfo NHS (Pierce) e 1-Etil dimetilaminopropil-carbodiimida (Sigma). Este substrato de HA biotinilado é covalentemente acoplado a uma placa de microtitulação de 96 cavidades em uma segunda reação. No término da reação da enzima, substrato residual é detectado com uma reação de avidina-peroxidase que pode ser lida em uma leitora de placa de ELISA padrão. Como o substrato é covalentemente ligado à placa de microtitulação, artefatos tal como deslocamento dependente do pH do substrato biotinilado não acontecem. A sensibilidade permite medição rápida de atividade de Hialuronidase a partir de células culturadas e amostras biológicas com uma variação inter-ensaio de menos do que 10%.
a. Protocolo PREPARAÇÃO DE SUBSTRATO DE HA BIOTINILADO
[00622] Cem mg de HA (Sigma Chemicals) foram dissolvidos em MES a 0,1M, pH 5,0, para uma concentração final de 1 mg/ml e deixados dissolver por pelo menos 25 horas a 4°C antes do acoplamento de biotina. Sulfo-NHS (Pierce;Rockford IL) foi adicionado à solução de MES CS04 para uma concentração final de 0,184 mg/ml. Hidrazida de biotina (Pierce) foi dissolvida em DMSO como uma solução de estoque de 100 mM e adicionada à solução de CS04 para uma concentração final de 1 mM. Uma solução de estoque de 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) foi preparada como uma solução de estoque a 100 mM em água destilada e adicionada a uma fonte de biotina de HA em uma concentração final de 30 mM. Esta solução foi deixada agitar da noite para o dia a 4o C. diferente da biotina, EDAC foi removida através de diálise contra água com 3 mudanças de 100x volume de água. O HA biotinilado (bHA), dialisado, foi separado em alíquota e armazenado a -20°C por até vários meses.
[00623] Sulfo-NHS foi diluído para 0,184 mg/ml em água com o bHA em uma concentração de 0,2 mg/ml e pipetado em placas COVALINK-NH de 96 cavidades (NUNC; Placerville, NJ) a 50 μl por cavidade. EDAC foi diluído para 0,123 mg/ml em água e pipetada nas placas COVALINK-NH com a solução de bHA resultando em uma concentração final de 10 μg/cavidade de bHA em 6,15 μg/cavidade de EDAC. As placas foram incubadas da noite para o dia a 4°C por 2 horas a 23o C, o que deu resultados comparáveis. Após imobilização covalente de bCS04 nas placas de microtitulação, a solução de acoplamento foi removida através de agitação e as placas foram lavadas 3 vezes em PBS contendo NaCl a 2M e MgSO4 a 50 mM (Tampão A). As placas poderiam ser armazenadas a 4°C por até uma semana.
[00624] As placas COVALINK-NH com bHA imobilizado foram equilibradas com 100 μl/cavidade de tampão - ou formiatoM, pH 3,7, NaCl a 0,1M, detergente TRITON X-100 a 1%, sacarolactona a 5 mM para Hialuronidase lisossomal; ou Hepes a 10 mM, pH 7,4 com CaCl2 a 1 MM e 1 mg/ml de Albumina de Soro Bovino (ICN) para enzimas neutras-ativas. Um conjunto de padrões para calibragem da atividade de enzima contra "Unidades de Redução de Turbidez relativas" (rTRU's) foi gerado diluindo hialuronidase testicular bovina (Sigma Tipo VI-S) em tampão de enzima neutro de 1,0 a 1x10-6 rTRU/cavidade e ensaiando 100 μl/cavidade em triplicata. Amostras de Hialuronidase ácida-ativa que foram diluídas em tampão de ensaio lisossomal de 1:10 a 1:130.000 foram pipetadas em triplicata a 100 μl/cavidade. Para a maioria dos ensaios de extratos de tecido e plasma humano, uma incubação de 30 minutos a 37°C era suficietne. Cavidades de controle positivo e negativo (nenhuma enzima ou nenhum ABC (vide abaixo), respectivamente) foram incluídas em triplicata.
[00625] A reação foi terminada através da adição de 200 μl/cavidade de HCl de Guanidina a 6M seguido por três lavagens de 300 μg/cavidade com PBS, NaCl a 2M, MgSO4 a 50 mM, detergente 20 TWEEN a 0,05% (Tampão B). Um estojo de complexo de avidina biotina (ABC) (Vector Labs; Burlingame CA) foi preparado em 10 ml de PBS contendo detergente TWEEN 20 a 0,1%, que foi pré-incubado por 30 minutos em temperatura ambiente durante a incubação. A solução de ABC foi adicionada (100 μl/cavidade) e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. A placa foi lavada cinco vezes com Tampão B, então um substrato de o-fenilenodiamina (OPD) foi adicionado a 100 μg/cavidade dissolvendo um comprimento de 10 mg de OPD em 10 ml de tampão de citrato-PO4 a 0,1M, pH 5,3 e adição de 7,5 μl de H2O2 a 30%. A placa foi incubada no escuro por 10-15 minutos, então lida usando um filtro de 492 nm em uma leitora de placa de ELISA (Titertek Multiskan PLUS;ICN) monitorada por computador usando o software leitor de placa Delta Soft II da Biometallics (Princeton NJ). Uma curva padrão usando a hialuronidase bovina testicular foi gerada através de um ajuste de curva de quatro parâmetros da preparação de hialuronidase comercial e amostras desconhecidas foram interpoladas através de sua absorbância a 492 nm.
[00626] Para analisar a dependência de pH de Hialuronidase, sHASEGP recombinante purificada e hialuronidase bovina testicular são usadas. A dependência de pH de atividade de enzima é medida diluindo sHASEGP purificada ou hialuronidase testicular bovina parcialmente purificada para 0,1 rTRU nos tampões que seguem: formiato a 50 mM, pH 3-4,5; acetato a 50 mM, pH 5-6; MES a 50 mM; pH 67; ou HEPES a 50 mM, pH 7-8. As amostras são ensaiadas por 30 minutos a 37°C e atividade foi expressa como uma porcentagem de atividade máxima. NaCl não foi usado em tampões, uma vez que ele pode alterar o pH ótimo das preparações de hialorunidase testicular (Gold, Biochem. J. 205:69-74, 1982; Gacesa e outros, Biochem. Soc. Trans. 7:1287-1289, 1979); concentrações de sal fisiológicas (0,15M) diminuem o pH aparente ótimo, um efeito que foi mais pronunciado em preparações purificadas da enzima testicular do que na amostra bruta original. b. Resultados
[00627] Hi aluronan foi biotinilado em uma reação de uma etapa usando biotina-hidrazida e EDAC. Ao limitar a EDAC, que acopla três grupos carboxila livres em HA com biotina hidrazida, apenas uma pequena fração dos resíduos de ácido glucurônico totais em HA foi marcada. Esta quantidade de EDAC (3 x 10-5 M) adicionada a HA (2,8 x 10-3 M) resulta em um máximo de uma molécula de biotina hidrazida acoplada por 93 unidades dissacarídeo de HA.
[00628] Um ajuste de curva de quatro parâmetros de reações padrão de hialuronidase testicular bovina medidas em pH 3,7, e diluídas de 1,0 x 1x10-6 TRU/cavidade, foi preparado. Ajustes de curva de quatro parâmetros foram estabelecidos a partir da equação y=((A- D)/(1+(conc/C)AB))+D) onde logit y=1n (y’/1-y’), y'=(y- D)/(A-D), B=-b/ln 10 e C=EXP (a/B). Os quatro parâmetros (A,B,C,D) foram calculados com um programa de software que utilizou o algoritmo 2+2 com regressão linear (Rodbard e outros, Clin. Chem. 22:350, 1976). Este ajuste de curva incorpora os aspectos sigmoidais da curva padrão. Precisão ótima para medição de uma amostra tipicamente acontece de a partir de 0,001 a 0,01 TRU/cavidade para uma incubação de 30 minutos. Durante uma incubação de 60 minutos, 1/1000o de TRU é detectável. Uma curva logarítmica padrão pode ser também utilizada em uma faixa mais curta de valores para estabelecer um ajuste de curva padrão. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferidas específicas, deve ser compreendido que a invenção conforme reivindicado não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas.
EXEMPLO 2 CLONAGEM DE cDNA DE sHASEGP
[00629] Ácido nucléico codificando sHASEGP humana pode ser obtido por um versado na técnica através de vários procedimentos incluindo, mas não limitado a, síntese de gene artificial, RT-PCR e hibridização de biblioteca de cDNA (por exemplo, vide Gmachl e FEBS 336(3) 1993, Kimmel e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 10071-10075). Alternativamente, clones codificando sHASEGP humana podem ser obtidos de IMAGE, ou outros fornecedores de seqüências de gene humano (Invitrogen Clone ID IOHI10647).
[00630] O cDNA PH20 de comprimento completo humano foi calculado ser 2009 nucleotídeos de comprimento e contendo uma estrutura de leitura aberta de 1530 nucleotídeos. A 5' UTR é geralmente grande, que pode indicar um íntron retido e pode inibir tradução através da prevenção do ribossoma de se ligar ao códon de metionina de iniciação correto devido a 9 códons de partida de não-codificação na 5' UTR. A proteína (Número de Acesso no Genbank NP_003108) é prevista compreender SEQ ID NO: 1 com 509 aminoácidos com uma massa molecular calculada de 58 kDa.
[00631] Para seqüenciamento de clones, faixas amplificadas por PCR foram excisadas, e eluídas com Gel Extraction Kit (Qiagen) e clonadas nos vetores apropriados com extremidades compatíveis após digestão de restrição. Todas as reações de seqüenciamento foram realizadas em DNA de filamento duplo com o Taq dye deoxy terminador cycle sequencing kit (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante, e realizadas em um seqüenciador automático ABI Prism® (Applied Biosystems).
[00632] A estrutura de leitura aberta de PH-20 humana foi obtida através de amplificação de uma biblioteca de cDNA de testículo humana (Clontech, Palo Alto, CA) através de Reação de Cadeia de Polimerase usando iniciadores SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 47. Produtos de PCR foram digeridos com NheI e BamHI e clonados nos sítios NheI e BamHI do vetor IREspuro2 (Clontech).
EXEMPLO 4 ISOLAMENTO DE sHASEGP de cDNA de PH20 HUMANA
[00633] Um vetor de expressão de sHASEGP humana recombinante secretada cataliticamente ativa capaz de glicosilação eficaz em células de mamífero foi gerado conforme descrito abaixo. Outros construtos de expressão com genes promotores e de seleção para espécies diferentes tal como células de inseto e levedura que são também capazes de gerar sHASEGP são compreendidos. Genes de seleção positivos tal como Glutamina Sintase ou Diidrofolato Redutase (DHFR) podem ser também usados. Os exemplos dados abaixo não pretendem restringir mas ao contrário providos como um exemplo de vários sistemas de expressão de plasmídeo que podem ser usados.
[00634] A fim de construir formas secretadas de sHASEGP, mutantes de truncamento que não têm extremidade terminal C foram construídos. Usando um programa de previsão de clivagem de GPI o sítio de clivagem de âncora GPI foi localizado em torno da posição do aminoácido N 483 na proteína ancorada GPI de comprimento completo. Um conjunto de sete iniciadores 3' aninhados foi usado para construir um conjunto de sete mutantes de deleção truncados sem o início de âncora GPI previsto na posição Y 482 e deletado progressivamente em um aminoácido. Esses iniciadores foram feitos para ter sítios NheI (51) e BamHl (3') compatíveis para clonar os mutantes de truncamento no vetor Irespuro2 ou não-marcado com um códon de parada no iniciador 3' ou como uma proteína marcada com His no terminal C para facilidade de purificação e detecção. Por exemplo, iniciadores reversos das SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 foram usados para gerar mutantes de deleção terminando nas posições Y 482, F 481 e I 480 sem um marcador 6 His. Outros iniciadores mutantes foram gerados com o mesmo design de base com as modificações apropriadas para incluir e excluir os aminoácidos particulares. Para geração de variantes marcadas com His o mesmo conjunto de iniciadores é usado para variantes não-marcadas exceto que iniciadores não têm o códon de parada nos respectivos iniciadores reversos, o iniciador adiantado permanecendo o mesmo (para construção marcada com His referir-se aos iniciadores das SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25 que são os iniciadores reversos sem códon de parada correspondendo aos iniciadores reversos não-marcados para seus respectivos construtos). Iniciadores de sobreposição foram usados para construir um espaçador de seis aminoácidos seguido por hexaistidina dentro de sítios BamH1 e Not1 no vetor Irespuro2 de modo que mutantes marcados com His foram gerados através de ligação dos produtos amplificados por PCR e digeridos com restrição dentro dos sítios Nhel e BamHl no vetor Irespuro2 contendo marcador His.
[00635] Para identificar se sHASEGP humana poderia ser modificada em seu terminal carbóxi para gerar uma enzima secretada e neutra ativa, uma série de truncamentos foi feita a partir do sítio de ligação de âncora GPI para o "domínio catalítico" previsto com base em homologia com a enzima de veneno de abelha.
[00636] DNA codificando o clone ancorado de GPI de comprimento completo em IRESPuro2 foi usado como um molde para gerar os vários mutantes de deleção truncados. Programas de modelagem de software deram vários sítios de clivagem previstos para o polipeptídeo de comprimento completo. Um de tais sítios previstos estava em uma posição de aminoácido N 483 (SEQ ID NO: 1). Iniciadores de PCR foram feitos para truncar sucessivamente a proteína de N483 para gerar seis mutantes de deleção começando em Y 482 (sem N) e terminando em E 477 (sem P). a. Protocolo Geração de mutante de truncamento sem N483:
[00637] O clone de sHASEGP ancorado em GPI de comprimento completo entre os sítios Nhel e BamHl em pIRESPuro2 foi usado como um molde. Este molde foi amplificado com iniciador 5' contendo sítio NheI que inicia na Metionina de partida do peptídeo de sinal nativo em M1 (SEQ ID NO: 14) e um iniciadores 3' contendo sítio BamHI nas extremidades em Y 482 (SEQ ID NO: 8). O produto de PCR foi administrado em um gel de agarose a 1% para resolver e confirmar a faixa amplificada dimensionada correta, purificado com gel, digerido com restrição com NheI e BamHI e clonado no vetor pIRESPuro2 (Clontech) entre sítios NheI e BamHI gerando um vetor de expressão para expressão deste mutante de truncamento de sHASEGP terminando na posição de aminoácido N482 e sem âncora GPI com a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 5 para a seqüência do polipeptídeo resultante de sHASEGP até Y 482) e seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 48 - nucleotídeos de codificado para polipeptídeo na SEQ ID NO: 5) conforme indicado. Geração de outros mutantes de truncamento sem Y 482, F 481, I 480, Q 479 e P 478 respectivamente.
[00638] A mesma estratégia foi usada com a única diferença sendo uso do iniciador 3' apropriado para cada mutante. Os respectivos iniciadores 3' são como segue: Iniciador 3' para mutante de sHASEGP que não tem Y 482 - SEQ ID NO: 9 Iniciador 3' para mutante que não tem F 481 - SEQ ID NO: 10 Iniciador 3' para mutante que não tem I 480 - SEQ ID NO: 11 Iniciador 3' para mutante que não tem Q 479 - SEQ ID NO: 12 Iniciador 3' para mutante que não tem Y 482 - SEQ ID NO: 13. Geração de mutantes de deleção adicional para determinar o domínio minimamente ativo de sHASEGP:
[00639] Deleções adicionais, em blocos de dez a vinte aminoácidos, foram feitas da extremidade 3' do mutante de truncamento ativo de pH neutro mais interno de sHASEGP, que é sHASEGP até E 477. O iniciador adiantado NheI SEQ ID NO: 14 foi usado com um iniciador 3' apropriadamente posicionado para amplificar através de PCR um mutante de deleção de sHASEGP do comprimento desejado da extremidade carbóxi terminal. Por exemplo, PCR com iniciadores descritos na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 26 como os iniciadores 5' e 3' respectivamente foi usada para gerar o polipeptídeo na SEQ ID NO: 49 quando expresso a partir de um construto de expressão no vetor IresPUro2. Similarmente, PCR com iniciadores 3' reversos descritos nas SEQ ID Nos: 27, 28, 29, 30, 31 e 32 foram usados para gerar mutantes de deleção terminando nas posições de aminoácido A 447, S 430, G 413, S 394, A 372 e S 347, respectivamente da sHASEGP madura. Os produtos de PCR em cada caso foram digeridos com enzimas NheI e BamHI e o produto digerido clonado em vetor pIrePuro2 entre sítios NheI e BamHI. Alguns clones independentes no construto de expressão final de cada grupo foram testados quanto à atividade de sHASEGP neutra ativa secretada através de transfecção transiente em células CHO em meios livres de soro CD-CHO (Invitrogen, CA) e amostras retiradas em pontos de tempo indicados para ensaio. Miniprep de DNA preparada de culturas da noite para o dia foi transfectada com reagente de transfecção Genejuice (Novagen, CA) seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante. A atividade de hialuronidase foi medida através de ensaio de microtitulação conforme acima descrito. b. Resultados
[00640] A atividade de hialuronidase foi medida em mutantes de truncamento de sHASEGP para identificar o domínio minimamente ativo para atividade de hialuronidase ativa neutra secretada.
Figure img0005
[00641] Os resultados mostraram que todos os seis mutantes de deleção de um aminoácido terminando em aminoácidos indicados de Y 482 a E 477 deram atividade secretada maior do que sHASEGP ancorada em GPI.
[00642] Os resultados também mostraram que as deleções além de A 467 eliminaram qualquer atividade secretada. Atividade neutra secretada de clones de A 467 diminuiu para aproximadamente 10% daquela encontrada em clones P 478 ou N 483. Foi então concluído que mais do domínio carbóxi terminal de sHASEGP humana era requerido para criar o domínio de hialuronidase ativo neutro do que anteriormente suposto a partir da enzima de veneno de abelha. As cisteínas no domínio carbóxi terminal são então necessárias para atividade neutra. Uma faixa muito estreita se estendendo aproximadamente 10 aminoácidos antes do sítio de clivagem de GLI em N 482 então define o domínio minimamente ativo.
EXEMPLO 5 EFEITOS DE MODIFICAÇÃO DE PEPTÍDEO DE SINAL SOBRE ATIVIDADE DE SECREÇÃO DE sHASEGP
[00643] SHASEGP humana possui um peptídeo líder nativo previsto excepcionalmente grande. Adicionalmente, a existência de dois resíduos de cisteína adjacentes no peptídeo líder pode levar à agregação de multímeros de polipeptídeo dentro do retículo endoplasmático durante expressão em alto nível e então prevenir expressão em alto nível de uma sHASEGP. Uma série de peptídeos líder secretores mais eficientes foi então testada para examinar sua habilidade em aumentar o direcionamento de sHASEGP para secreção. a. Protocolo
[00644] O peptídeo líder Kappa foi construído sobrepondo anelamento de iniciador e PCR de extensão com iniciadores correspondendo a seqüências nas SEQ ID Nos: 37, 38, 39 e 40. A seqüência kappa amplificada de PCR resultante foi amplificada com iniciadores de flanqueamento contendo sítio NheI na extremidade 5' (conforme descrito na SEQ ID NO: 41) e sítio EcoRI na extremidade 3' (conforme descrito na SEQ ID NO: 42). Isto permitiu clonagem do peptídeo líder Kappa (a seqüência de polipeptídeo é conforme descrito na SEQ ID NO: 43) no vetor Litmus 39 (NEB) entre os sítios NheI e EcoRI. SHASEGP tem um sítio EcoRI interno; deste modo, este construto kappa entre o sítio NheI e EcoRI foi amplificado mais com o iniciador SpeI 5' (conforme descrito na SEQ ID NO: 44) e um iniciador 3' MluI (conforme descrito na SEQ ID NO: 45). SHASEGP sem âncora GPI terminando em P 478 foi cortada de pIresPuro 2 com NheI e BamHI e clonada em um vetor Litmus (NEB) dentro dos sítios NheI e BamHI do vetor Litmus 39. Este vetor Litmus contendo sHASEGP resultante foi digerido com enzimas de restrição SpeI e MluI e o construto líder kappa amplificado com SepI e MluI foi clonado nele. Mutagênese direcionada ao local foi realizada neste vetor Litmus 39 contendo ambas seqüências Kappa e sHASEGP para gerar a fusão em estrutura de seqüência líder Kappa com o polipeptídeo maduro de sHASEGP. Pares de iniciador correspondendo às SEQ ID NOS: 34 e 35 foram usados para gerar o líder kappa com o Asp nativo como o aminoácido terminal fundido o F38 de sHASEGP (até P 478) (conforme descrito na SEQ ID NO: 46 para a seqüência de polipeptídeo da proteína de fusão). Outras combinações de par de iniciador tal como concretizado pela SEQ ID NO: 33 com SEQ ID NO: 35 foram usadas para gerar líder Kappa terminando no terminal Asp (D) fundido a L 36 de sHASEGP, SEQ ID NO: 33 com SEQ ID NO: 36 foram usadas para gerar o líder Kappa terminando no Gly (G) antes do terminal (Asp (D)) fundido a L 36 de sHASEGP; e SEQ ID NO: 4 com SEQ ID NO: 35 foram usadas para gerar Kappa terminando em Gly (G) (antes do Asp terminal (D)) fundido a F38 de sHASEGP. As fusões de Kappa-sHASEGP obtidas através de mutagênese direcionada ao local foram purificadas com gel, digeridas com enzima DpnI para digerir qualquer DNA parental excedente, e então digeridas com NheI e Bam HI e clonadas na estrutura principal HisIresPuro2 digerida com NheI/BamHI que tem o marcador his (espaçador de seis aminoácidos seguido por seis histidinas) clonado entre os sítios BamHl e Notl no vetor pIRESPuro2. Deste modo, quando da ligação foi obtido um construto que é NheI-kappa-sHASEGP- BamHI-His em pIresPuro2. Quatro conjuntos de tais construtos foram obtidos, o que corresponderia à combinação de G ou D na extremidade do líder Kappa e L 36 ou F 38 no início de sHASEGP madura. Alguns clones independentes de cada tipo de construto foram transfectados em células CHO em meio CD-CHO (Invitrogen, CA) para testar se a presença de líder de secreção kappa promoveria níveis altos de proteína secretada conforme comparado com líder de secreção nativo. Miniprep de DNA preparada de culturas da noite para o dia foram transfectadas com reagente de transfecção Genejuice (Novagen, CA) seguindo protocolos recomendado pelo fabricante e amostras foram retiradas para teste através do ensaio de microtitulação em pontos de tempo indicados. A atividade de hialuronidase foi medida através de ensaio de microtitulação conforme acima descrito.
[00645] Construtos de fusão de sHASEGP de peptídeo líder de cadeia Kappa IgG de camundongo foram testados quanto a níveis maiores de atividade de sHASEGP ativa neutra secretada. b. Resultados CONSTRUTO DE GENE DE sHASEGP HUMANA U/ML/24 HORAS PH 7,4 SHASEGP de Lider Kappa IgG AA 38-478 HIS6 3,0257 SHASEGP de Líder Nativo AA 1 478 HIS6 0,4857
[00646] Os resultados de ensaio de enzima indicaram que o líder Kappa IgG era capaz de aumentar a secreção de sHASEGP aproximadamente 7 a 8 vezes mais do que o líder de secreção nativo quando comparado com clones P 478, Y 482 ou N 483 que não tinham tal líder. Outros construtos de líder kappa com variações do sítio de fusão de líder de Asp ou Gly do líder Kappa para L36 ou F38 de sHASEGP deram níveis maiores de atividade de hialuronidase neutra ativa secretada. Esses exemplos pretendem expandir ao invés de limitar o escopo da invenção, como outras seqüências líder secretoras eficientes podem ser utilizadas com a mesma tecnologia.
EXEMPLO 6 GERAÇÃO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO DE sHASEGP HUMANA
[00647] Uma sHASEGP sem um marcador de epitopo foi gerada através de clonagem em um cassete de expressão bicistrônico, HZ24 (SEQ ID NO: 47). O vetor de plasmídeo HZ24 para expressão de sHASEGP compreende uma estrutura principal de vetor pCI (Promega), seqüência de DNA codificando aminoácidos 1-482 de hialuronidase PH20 humana, um sítio de entrada ribossomal interno (IRES) do vírus ECMV (Clontech) e o gene de diidrofolato redutase (DHFR) humano. A estrutura principal do vetor pCI também inclui DNA codificando o gene de resistência à Beta-lactamase (AmpR), uma origem de replicação f1, uma região aumentadora/promotora imediata/inicial de Citomegalovírus (CMV), um íntron quimérico e um sinal de poliadenilação final SV40. O DNA codificando o construto de sHASEGP continha uma seqüência de consenso Kozak na Metionina do líder de sinal nativo e um códon de parada na Tirosina 482. O construto resultante pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ-24) resulta em uma espécie de mRNA única direcionada pelo promotor CMV que codifica os aminoácidos 1-482 de PH20 e aminoácidos 1-187 da diidrofolato redutase separados pelo sítio de entrada ribossomal interno.
[00648] A estrutura de leitura aberta de PH20 humana foi amplificada a partir do clone ORF da Invitrogen (IOH10647, Invitrogen, Carlsbad CA) com um Iniciador 5' que introduziu um sítio NheI e seqüência de consenso Kozack antes da Metionina de PH20 e um iniciador reverso que introduziu um códon de parada seguindo Tirosina 482 e introduziu um sítio de restrição BamHl. O produto de PCR resultante foi ligado ao plasmídeo pIRESpuro2 (Clontech, Palo Alto, CA) seguindo digestão do fragmento de PCR de PH20 com NheI e BamHl. EXEMPLO 7 GERAÇÃO DE UMA LINHAGEM DE CÉLULA EXPRESSANDO UMA sHASEGP
[00649] Células de CHO DG44 não-transfectadas crescendo me meios CD-CHO Modificado GIBCO para células DHFR(-), suplementado com 4 mM de Glutamina e 18 ml de Pluronic F68/L (Gibco), foram semeadas a 0,5 x 106 células/ml em um frasco de agitação em preparação para transfecção. As células foram cultivadas a 37°C em uma incubadora umidificada com CO2 a 5% com 120 rpm para agitação. Célulcas de CHO DG44 não-transfectadas crescendo exponencialmente foram testadas quanto à viabilidade para transfecção.
[00650] 60.000.000 células viáveis da cultura de célula de CHO DG44 não-transfectadas foram peletizadas e ressuspensas para uma densidade de 20.000.000 células em 0,7 mL de tampão de transfecção 2x (2X HeBS = Hepes a 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KCl a 10 mM, Na2HPO4 a 1,4 mM, dextrose a 12 mM). A cada alíqouta de células ressuspensas, 0,09 mL do plasmídeo linear HZ24 (250 μg) foi adicionado, e as soluções de célula/DNA foram transferidas para cadinhos de eletroforação BTX de distância de 0,4 cm (Gentronics) em temperatura ambiente. Uma eletroforação de controle negativo foi realizada sem nenhum plasmídeo misturado com as células. As misturas de célula/plasmídeo foram eletroforadas com uma descarga de capacitor de 330 V e 960 μF ou a 350 V e 960 μF.
[00651] As células foram removidas dos cadinhos após eletroforação e transferidas para 5 mL de meios de CD- CHO Modificado para células DHFR(-), suplementados com Glutamine a 4 mM e 18 ml de Plurionic F68/L (Gibco), e deixadas crescer em uma cavidade de uma placa de cultura de tecido de 6 cavidades sem seleção por 2 dias a 37°C em uma incubadora umidificada com CO2 a 5%.
[00652] Dois dias pós-eletroforação, 0,5 mL de meio de cultura de tecido foi removido de cada cavidade e testado quando à presença de atividade de hialorunidase.
[00653] Atividade de Hialuronidase Inicial de Células de CHO DG44 Transfectadas com HZ24 em 40 horas Pós-
Figure img0006
[00654] Células da transfecção 2 (350 V) foram coletadas da cavidade de cultura de tecido, contadas e diluídas para 10.000 a 20.000 célula viaveis por mL. Uma alíquota de 0,1 mL da suspensão celular foi transferida para cada cavidade de cinco, placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 cavidades. 0,1 mL de meios de CD-CHO (GIBCO) contendo Glutamax-1 a 4 mM e sem suplementos de hipoxantina e timidina foi adicionado às cavidades contendo célula (volume final 0,2 mL).
[00655] Dez clones foram identificados de 5 placas crescimento sem metotrexato.
Figure img0007
[00656] Seis clones de HZ24 foram expandidos em cultura e transferidos para frascos de agitação como suspensões celulares únicas. Os clones 3D3, 3E5, 2G8, 1E11 e 4D10 foram postas em placa em placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 cavidades usando uma estratégia de diluição infinita tridimensional. Clones diluídos foram cultivados em uma base de 500 células de CHO DG44 não- transfectadas por cavidade, para prover fatores de crescimento necessários para os dias iniciais em cultura. Dez placas foram feitas por subclone.
[00657] O clone 3D3 produziu 24 subclones visuais. Atividade de hialuronidase significante foi medida nos sobrenadantes de 8 a 24 subclones (>50 unidades/mL), e esses 8 subclones foram expandidos para frascos de cultura de tecido T-25 na presença de metotrexato a 50 nM. Clone 3D3 a 50 nM foi expandido mais em 500 nM de metotrexato dando origem a clones produzindo em excesso de 1.000 Unidades/ml em frascos de agitação (clone 3D3, 5M).
EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE sHASEGP
[00658] Um frasco de 3D3 a 5M foi descongelado e expandido de frascos T através de frascos de giratórios de 1L em CDM de CHO (Invitrogen, Carlsbad CA) suplementado com Metotrexato a 100 nM e Glutamax (Invitrogen). As células foram transferidas de frascos giratórios para um biorreator de 5 L (Braun) em uma densidade de inoculação de 4,0 x 10E5 células viáveis por mL. Os parâmetros eram ajuste de ponto de temperatura, 37o C, pH 7,2 (Ponto de ajuste de partida), com Ponto de Ajuste de Oxigênio Dissolvido a 25% e uma cobertura de ar de 0-100 cm3/min. Em 168 horas, 250 ml de Meio de Alimentação N° 1 (CHO de CD + 50 g/L de Glicose) foram adicionados. Em 216 horas, 250 ml de Meio de Alimentação N° 2 (CHO de CD + 50 g/L de Glicose + Butirato de Sódio a 10 mM) foram adicionados, e em 264 horas 250 ml de Meio de Alimentação N° 1 foram adicionados. Este processo resultou em uma produtividade final de 1600 Unidades por ml com uma densidade de célula máxima de 6 milhões células/ml. A adição de butirato de sódio foi verificada aumentar drasticamente a produção de sHASEGP nos estágios finais de produção. Crescimento de 3D3-5M & Produção de sHASEGP, Biorreator de 5L
Figure img0008
Figure img0009
EXEMPLO 9 PURIFICAÇÃO DE sHASEGP
[00659] Me ios condicionado dos clone de 3D3 foram purificados através de filtragem profunda e diafiltragem de fluxo tangencial em Hepes a 10 mM pH 7,0. SHASEGP foi então purificada através de cromatografia seqüencial em cromatografia de troca de íon Q Sepharose (Pharmacia), cromatografia de interação hidrofóbica de Phenyl Sepharose (Pharmacia), Cromatografia de boronato de fenila (Prometics) e Hidroxiapatita (Biorad, Richmond, CA).
[00660] SHASEGP se ligou à Q Sepharose e eluiu a 400 mM de NaCl no mesmo tampão. O eluato foi diluído com Sulfato de amônio a 2M para uma concentração final de ASO4 a 500 mM e passado por uma coluna de Phenyl Sepharose (sub- baixa), seguido por ligação sob as mesmas condições à resina de boronato de fenila. A sHASEGP foi eluída a partir da resina de fenil sefarose em Hepes pH 6,9 após lavagem em pH 9,0 em 50 mM de bicina sem AS04. O eluato foi carregado em uma resina de hidroxiapatita de cerâmica em pH 6,9 em 5 mM de PO4, 1 mM de CaCl2 e eluído com 80 mM de PO4 pH 7,4 com 0,1 mM de CaCl2.
[00661] A sHASEGP purificada resultante possuía uma atividade específica em excesso de 65.000 USP Unidades/mg de proteína por meio de ensaio de microturbidez usando o padrão de referência USP. SHASEGP purificada eluiu como um pico único a partir de 24 minutos a 26 minutos a partir de uma coluna de estireno divinilbenzeno Pharmacia 5RPC com um gradiente entre TFA 0,1%/H2O e TFA 0,1%/acetonitrila 90%/;H2O 10% e resolvida como uma faixa de 61 kDa ampla única através de eletroforese de SDS que reduziu para uma faixa de 51 kDa quando do tratamento com PNGASE-F. Seqüenciamento de aminoácido N-terminal revelou que peptídeo líder tinha sido eficientemente reduzido. Sequência de Aminoácido N-terminal de sHASEGP bioquimicamente purificada
Figure img0010
EXEMPLO 10 ANÁLISE DE GLICOSILAÇÃO DE sHASEGP DERIVADA DE CHO DG44
[00662] Existem dados conflitantes de se sHASEGPs de espécies diferentes requerem glicosilação para sua atividade catalítica. Por exemplo, é descrito que hialuronidase de veneno de abelha enzimaticamente ativo pode ser sintetizada em células que não têm maquinário de glicosilação, isto é, tal como E. coli. Além disso, tratamento de hialuronidase de testes bovinos purificada com PNGase não inativou atividade de enzima (Yamagata e outros, 1997). Outros estudos descrevem a perda de atividade seguindo desglicosilação e que ligações dissulfeto são adicionalmente requeridas.
[00663] Como todos tais testes anteriores foram feitos usando preparações brutas ou parcialmente purificadas, no entanto não era aparente se a perda de atividade era um resultado de exposição de enzima de desglicosilação a proteases contaminantes nas preparações brutas ou uma relação funcional direta entre glicosilação e atividade catalítica. a. Protocolo
[00664] Para determinar se glicosilação N-ligada funcional poderia ser introduzida na sHASEGP humana usando um sistema de expressão baseado em CHO sob condições livres de proteína, um cDNA codificando sHASEGP-HIS6 humana foi expresso em células CHO usando um cassete bicistrônico IRESpuro em meios quimicamente definidos. As células foram cultivadas por 72 horas em CDM de CHO (Invitrogen/Gibco) seguido por concentração e diafiltragem de fluxo tangencial em uma unidade Pellicon TFF (Milipore) com membranas de corte de 30 kDa. O concentrado foi trocado com Hepes a 10 mM pH 7,4, NaCl a 50 mM. O diafiltrado foi então carregado em uma resina DEAE de sefarose simplificada e eluída com gradiente de NaCl de a partir de 0-1 M de Nacl em uma resina Pharmacia FPLC. SHASEGP humana eluiu entre 10-30% de NaCl. Os níveis de sHASEGP em frações de coluna determinou que a maioria da enzima foi recuperada no gradiente de 10-30% de NaCl. A enzima do gradiente de 10-30% de NaCl foi então purificada mais através de cromatografia de afinidade em uma resina IMAC carregada com Ni. SHASEGP humana foi eluída de resina IMAC após lavagem com Imidazol a 10 mM com Acetato a 50 mM pH 5,0. A proteína foi concentrada e dialisada contra Hepes a 10 mM pH 7,4. A enzima altamente purificada foi determinar possuir uma atividade específica de 97.000 Unidades/mg de proteína na presença de Cálcio a 1 mM e 1 mg/ml de HSA no ensaio de microtitulação de substrato biotinilado baseado em ELISA.
[00665] Para detectar mudanças em massa molecular relativa de proteína, sHASEGP humana purificada foi tratada com PNGASE ou Neuraminidase da noite para o dia seguido através de eletroforese de gel, eletroransferência e análise western blot com um anticorpo monoclonal anti His6 ligado a HRP (Qiagen) e detecção ELC. b. Resultados
[00666] Análise western blot determinou que sHASEGP humana produzida em células CHO era sensível a tratamento com PNGASE. A massa molecular relativa de sHASEGP humana revelou que a proteína era altamente glicosilada. Quando da digestão da noite para o dia completa com PNGASE, sHASEGP humana reduziu para uma única espécie confirmando que heterogeneidade leve da faixa não-ligada poderia ser atribuída a resíduos de açúcar N-ligados. Digestão parcial de PNGaseF mostrou uma série de intermediários mudando de não-tratados e mudança progressiva com tratamento mais longo. Embora ligações estivessem um pouco difusas em um Gel a 7%, pelo menos 6 isoformas de intermediário diferentes podiam ser visualizadas.
[00667] Tratamento de sHASEGP com Neuraminidase revelou que células CHO eram de fato capazes de sintetização de sHASEGP humana sialada. Quando do tratamento com neuraminidase e análise Western Blot de sHASEGP em Géis a 7%, sHASEGP recombinante Humana derivada de CHO revelou uma mudança de aproximadamente 1-3 kDa em mobilidade comparado com sHASEGP não-tratada. Este é então o primeiro relato da geração de uma sHASEGP humana substancialmente sialada. Isto é muito valioso para ambos estabilidade e para aumentar a meia-vida no soro de sHASEGP humana como sHASEGP de esperma nativo de muitas espécies não têm sialação e não reagem com lectinas específicas de ácido siálico. Análise FACE de sHASEGP Análise de oligossacarídeos sHASEGP através de análise FACE permite determinação rápida de perfis de sHASEGP cataliticamente ativas.
Protocolo
[00668] Hi aluronidase purificada de clones de 3D3 5M foi avaliada usando FACE® N-Linked Oligossacharide Profiling (Prozyme). Oligossacarídeos foram clivados de 128,7 μg de glicoproteínas através de digestão enzimática com N-Glicanase (a.k.a. PNGase), marcados usando o fluorforo ANTS e separados através de eletroforese. As posições relativas das faixas de oligossacarídeo foram determinadas administrando a amostra e diluições da amostra ao longo de uma escala padrão de oligossacarídeo que designou a distância de migração em unidades de Grau de Polimerização (DP).
Resultados
[00669] O Perfil N para a amostra de Hialuronidase consiste em dez faixas das quais seis (operando concomitante com as faixas padrão de oligossacarídeo G - G12) tinham intensidades maiores do que 9%. Ainda. A faixa operando ao longo do padrão G9 era a mais intensa com intensidades de 35%-46%). Análise de oligossacarídeo sHASEGP
Figure img0011
EXEMPLO 11 DEPENDÊNCIA DE GLICOSILAÇÃO N-LIGADA DE sHASEGP PARA ATIVIDADE DE ENZIMA a. Protocolo
[00670] Amostras de sHASEGP HIS6 purificada foram misturadas com tampão contendo Neuraminidase e PNGASE com e sem 500 mM de Octilglicosídeo da noite para o dia a 37o C. Oligossacarídeos foram verificados ter sido removidos através de mudança de gel de análise Western Blot. b. Resultados
Figure img0012
EXEMPLO 12 ATIVIDADE DE sHASEGP COM RELAÇÃO A GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS E NÃO-SULFATADOS
[00671] Em adição ao ensaio baseado em microtitulação usando HA, a especificidade de substrato de sHASEGP com relação a outros glicosaminoglicanos e proteoglicanos pode ser testada usando um ensaio de mudança de gel com substratos purificados para determinar a atividade de sHASEGP com relação a outros glicosaminoglicanos. Muitos ensaios de Hialuronidase têm sido baseados na medição da geração de novos grupos N-acetilamino de redução (Bonner e Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966) ou perda de viscosidade (De Salegui e outros, Arch. Biochem. Biophys. 121:548-554, 1967) ou turbidez (Dorfman e Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948). Com substratos purificados todos esses métodos são suficientes para determinação da presença ou ausência de atividade endoglucosamídica. a. Protocolo
[00672] ENSAIO DE MUDANÇA DE GEL - Substratos purificados são misturados com sHASEGP recombinante para testar quanto à atividade de endoglicosidase que dá origem à mobilidade maior em substrato dentro do gel. Sulfato de condroitina A, Aggrecan e D eram da Calbiochem. Hialuronan (Cordão Umbilical Humano) Sulfato de Condroitina C, Dermatam sulfato e Heparan-sulfato são obtidos da Calbiochem. Hialuronan de cordão umbilical humano foi obtido da ICN. Cada substrato de teste é diluído para 0,1 mg/ml. Amostras de 10 μl de sHASEGP purificada ou meios condicionados de células expressando sHASEGP também são misturados com 90 ul de substrato de teste em tampão desejado e incubados por 3 horas a 37o C. seguindo a incubação, as amostras são neutralizadas com tampão de amostra (Tris EDTA pH 8,0, Bromophenol Blue e glicerol) seguido por eletroforese em géis de poliacrilamida a 15%. Glicosaminoglicanos são detectados através de tingimento dos géis em Alcian Blue a 5% em Ácido Acético Glacial a 3% da noite para o dia seguido por destingimento em Ácido Acético Glacial a 7%. A degradação é determinada através de comparação de mobilidade do substrato na presença e na ausência de enzima. b. Resultados
[00673] 100 Unidades de sHASEGP HIS6 em 10 ul foram incubadas com 90 ul de Tampão Hepes a 10 mM com 50 ug/ml de Albumina de Soro Humano por 2 horas a 37°C contendo 10 ug de vários glicosaminoglicanos e proteoglicanos. Análise eletroforética seguido por tingimento com Alcian blue revelou mudanças de mobilidade maiores para uma única espécie em Sulfato de Condroitina A, C e D, Aggrecan e Hialuronan mas não Heparan Sulfato nem Sulfato de Condroitina B. Enquanto os glicosaminoglicanos não-digeridos escorreram como uma mancha no meio do gel, os produtos digeridos mostraram a maioria de tingimento de Alcian blue escorrendo no tingimento frontal dye front com uma pequena quantidade de material escorrendo como um escala de aumento.
EXEMPLO 13 EFEITOS DE ÍONS DE METAL SOBRE ATIVAÇÃO DE sHASEGP
[00674] Em adição à necessidade de glicosilação para atividade de enzima ótima, sHASEGP humana foi verificada ser ativada com cátions para atividade de enzima ótima. No processo de purificação, sHASEGP foi verificada ter uma atividade específica baixa seguindo etapas de cromatografia sucessivas. A sHASEGP marcada com HIS6 foi verificada ter uma atividade específica muito baixa quando purificada para homogeneidade a partir de DEAE seguido por purificações de Ni-IMAC sucessivas. Como resinas IMAC podem quelar íons de metal, vários metais foram adicionados de volta à sHASEGP para determinar a atividade de enzima relativa. a. Protocolo
Figure img0013
[00675] SHASEGP purificada foi testada seguindo incubação com níquel (Ni) a 0,1 mM, Cobalto (co), Zinco (Zn), Cálcio (Ca) e Magnésio (Mg) por 2 horas em temperatura ambiente seguido pela determinação de atividade de hialuronidase em ensaio baseado em microtitulação. b. Resultados
Figure img0014
[00676] Um aumento significante na atividade de hialuronidase foi verificado seguindo incubação de sHASEGP com Cálcio a 0,1 mM ou Magnésio a 0,1 mM. Quaisquer tais ativações foram verificadas seguindo incubação com outros metais. A adição de cálcio à sHASEGP aumentou a atividade específica da enzima para aproximadamente 97.000 unidades por mg de proteína com base em uma medição de A280. Uma curva de dose resposta de metais de Cálcio e Magnésio foi então testada para determinar a concentração ótima de íons de metal para enzima.
Figure img0015
[00677] Ativação de sHASEGP foi verificada ocorrer na faixa micromolar. Concentrações acima de 10 mM eram inibidoras para ambos Cálcio e Magnésio. Para esgotar ativação não-específica de substrato em vez de enzima, Cloreto de cálcio em tampão de Hepes a 10 mM foi incubado com o substrato biotinilado imobilizado na placa de microtitulação seguido por lavagem. Nenhuma ativação foi verificada quando a enzima foi adicionada à placa pré- incubada com Cálcio que tinha sido lavada. A ativação foi também testada em sHASEGP nativa liberada de fosfolipase C que revelou uma ativação similar com Cálcio esgotando um artefato do marcador de epitopo HIS6 carbóxi terminal.
EXEMPLO 14 EFEITOS DA ALBUMINA SOBRE A ATIVIDADE DE sHASEGP
[00678] Foi verificado que a diluição de rHUPH20 recombinante e outras preparações de hialuronidases derivadas de teste de matadouro requeriam albumina em adição a Cálcio para atividade ótima. a. Protocolo
[00679] Albumina de Soro Humano (ICN) foi diluída em tampão de Hepes a 10 mM com Cálcio para determinar os efeitos da proteína albumina sobre a atividade enzimática. Ensaios de enzima com sHASEGP e preparações comerciais foram examinados usando ambos CaCl2 a 1mM e 1 mg/ml de Albumina de Soro Humano. b. Resultados
[00680] Ativação da atividade de hialuronidase foi verificada em diluições altas na presença de albumina. Não era claro se esta ativação era um resultado de prevenção de desnaturação ou se a albumina afetou disponibilidade do substrato. Uma formulação preferida de sHASEGP humana poderia então incluir Albumina e um sal de metal consistindo em Cálcio ou Magnésio.
EXEMPLO 15 ATIVIDADE DE ESPALHAMENTO DE sHASEGP PURIFICADA IN VIVO a. Protocolo
[00681] SHASEGP purificada em Hepes a 10 mM pH 7,4, NaCl a 150 mM, Pluronic a 0,1% foi diluída para 0,5 U/ul em água livre de pirogênio com NaCl a 0,15M. Uma série de diluições em 20 ul final de Solução salina foi feita para dar um total de 0,01, 0,05, 0,1 Unidade por injeção. 20 ul de solução de Trypan Blue foram adicionados para um volume final de 40 ul e injetados subcutaneamente na pele lateral de cada lado de camundongos balb Nu/Nu que tinham sido previamente anestesiados i.p. através de administração de cetamina/xilazina. Áreas de corante foram medidas em 2 dimensões com um microcompasso de calibre de t=0 a t=45 minutos. Área foi representada como mm2. Como um controle HYAL1 Humano recombinante que não tem atividade neutra mas é secretado foi incluído. b. Resultados
Figure img0016
a. Protocolo
[00682] SHASEGPHIS6 purificada recombinante foi separada em 2 alíquotas. Uma foi aquecida para 95°C por 15 minutos em um termociclizador com uma tampa aquecida. A outra permaneceu em temperatura ambiente. Inativação térmica de atividade enzimática foi verificada no ensaio de enzima baseado em microtitulação. Para análise cinética material inativado com calor versus nativo foi testado. 4 Unidades de sHASEGP purificada ou material inativado com calor equivalente foram injetadas subcutaneamente com corante trypan blue. Áreas foram testadas em vários pontos de tempo até 15 minutos. b. Resultados
Figure img0017
Figure img0018
EXEMPLO 17 RESTAURAÇÃO DA BARREIRA DERMAL QUEBRADA PELA sHASEGP a. Protocolo
[00683] P ara estabelecer o tempo de regeneração de poros abertos com sHASEGP seguindo administração subcutânea, 20 Unidades de sHASEGP purificada ou controle de solução salina foram injetadas em dois sítios laterais opostos subcutaneamente em animais em t=0 seguido por injeção com Trypan blue no mesmo sítio a 30 minutos, 60 minutos e 24 horas. A área de difusão do corante em t=15 minutos pós- injeção foi registrada para cada ponto de tempo comparado com o controle. b. Resultados
Figure img0019
[00684] Os resultados demonstram que a barreira dermal se reconstitui dentro de 24 horas de administração de 2 Unidades de enzima.
EXEMPLO 18 DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DE CANAIS ABERTOS PELA sHASEGP
[00685] Foi mostrado que sHASEGP humana abriu canais no espaço intersticial suficientes para permitir a difusão de uma molécula pequena, isto é, corante trypan blue. No entanto, não sabia-se quais os limites superiores estavam no tamanho de partículas que poderiam difundir na presença de sHASEGP. a. Protocolo
[00686] Moléculas fluorescentes de tamanhos variados foram usadas para determinar o tamanho dos canais abertos pela sHASEGP humana, Dextranos Fluoresceinados de Peso Molecular Médio de 4.400 e 2 milhões Da (Sigma) bem como contas marcadas com fluoresceína de diâmetros definidos de a partir de 20 nanometros a 500 nanometros (Molecular Probes), foram administradas subcutaneamente em um volume de 40 ul com a injeção de sHASEGP ou controle de solução salina que segue nos mesmos sítios. Área do dye front foi então medida em duas dimensões em 15 minutos pós-injeção. b. Resultados
Figure img0020
Figure img0021
[00687] Os resultados demonstram que moléculas de aproximadamente 1 kDa (Trypan Blue) para 50 nm de diâmetro (Latex Beads) mostraram difusão aumentada seguindo administração de sHASEGP. Embora albumina de soro bovino (66 kDa) mostrasse cinética similar de difusão de trypan blue, as contas de látex de 50 nm requeriam significantemente mais tempo para difundirem. Contas de 500 nm não mostraram nenhuma difusão até 480 minutos. EXEMPLO 19 PERFIS FARMACOCINÉTICOS NO SORO DE ANTICORPOS BIOTINILADOS SEGUINDO CO-INJEÇÃO SUBCUTÂNEA DE sHASEGP HUMANA a. Protocolo
[00688] Camundongos Balb/c fêmea foram anestesiados com uma mistura de cetamina/xilazina. Os camundongos foram então injetados subcutaneamente com 20 ul de 0,5 mg/ml de solução de IgG de camundongo biotinilado misturados com 20 ul ou de solução salina ou 20 ul de sHASEGP contendo 4 Unidades de atividade. b. Resultados
Figure img0022
[00689] Os resultados demonstram que sHASEGP aumenta a cinética de distribuição de soro de moléculas grandes em circulação. Onde nenhum IgG biotinilado pudesse ser detectado no grupo de controle por volta de 2 horas, 360 ng/ml estavam aparentes por 2 horas no grupo sHASEGP. EXEMPLO 20 ATIVIDADE DE ESPALHAMENTO DE MOLÉCULAS SUBCUTANEAMENTE INJETADAS SEGUINDO INJEÇÃO INTRAVENOSA DE sHASEGP HUMANA a. Protocolo
[00690] Quatro sítios para injeção de corante foram utilizados por dose de cada Artigo de Teste e controle de veículo. Injeção de corante foi 45 minutos após injeção i.v. Cada dose de artigo de teste ou controle foi injetada i.v. em 2 animais. Medição da área de dye front após 45 minutos da administração da enzima foi calculada em 2,5, 5, 10 e 15 minutos para cada dose ou controle de veículo. b. Resultados
[00691] Os resultados demonstraram que sHASEGP altamente purificada estava sistemicamente disponível para tecido distal quando da administração intravenosa. A atividade de espalhamento de sHASEGP sistemicamente administrada era dependente da dose, com uma injeção de 10 unidades sendo indistinguível do controle de veículo.
Figure img0023
Figure img0024
EXEMPLO 21 — USO ILUSTRATIVO DE PEGUILAÇÃO PARA GERAR sHASEGPs MODIFICADAS EXIBINDO FARMACOCINÉTICA APERFEIÇOADA
[00692] Como um exemplo ilustrativo do uso de peguilação para gerar formas modificadas de sHASEGP tendo farmacocinética aperfeiçoada, tal como meia-vida no soro maior, a requerente ligou porções de polietileno glicol lineares ou ramificadas (PEG) a uma sHASEGP exemplar, PH20 humana recombinante (rHuPH20) conforme acima descrito.
[00693] Vários grupos funcionalmente ativos diferentes podem ser usados para ligar porções de PEG a sHASEGPs tal como rHuPH20 (incluindo, a título de ilustração, aldeídos, succinimidas, maleimidas e outros). Vários reagentes de peguilação diferentes estão comercialmente disponíveis de várias fontes incluindo Nektar Therapeutics (www.nektar.com) bem como vários outros fornecedores (www.pharma.dow.com, www.nof.co.jp, www.sunbio.com, www.celares.com). Para propósitos de ilustração, rHuPH20 foi eficazmente peguilada conforme aqui descrito usando vários reagentes de PEG ilustrativos para gerar várias enzimas rHuPH20 PEGuiladas diferentes. Metodologias análogas têm sido também aplicadas a outras enzimas hialuronidase, incluindo uma hialuronidase derivada de animal ilustrativa (usando uma preparação de hialuronidase testicular de ovino disponível como Vitrase® da ISTA Pharmaceuticals), uma hialuronidase derivada de bactéria ilustrativa (usando uma preparação de hialuronidase bacteriana disponível como Hyaluronate Lyase da Sigma) e uma condroitinase derivada de bactéria ilustrativa tendo atividade de hialuronidase (usando uma preparação de condroitinase bacterian ABC disponível como Chrondoitinase ABC da Associates of Cape Cod, Inc./Seikagaku Corporation).
[00694] Em adição à variação do grupo funcional, PEGs de uma variedade de comprimentos e estruturas diferentes estão disponíveis, os quais podem ser aqui incorporados usando um grupo funcional particular. Para propósitos de ilustração, comprimento de PEG variando de 5 a 60 Kda (por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40 e 60 Kda) foi conjugado a rHuPH20. Novamente uma variedade de PEGs diferentes tendo comprimentos e estruturas diferentes estão prontamente disponíveis de fontes incluindo Nektar, da Dow Chemical Corporation (Dowpharma), NOF Corporation, Sunbio, Celares e outros. Um grande número de referências é conhecido na técnica relacionada com reagentes de PEG e métodos de proteínas de PEGuilação, incluindo várias revisões e artigos citados aqui; vide, por exemplo, Roberts, M.J. e outros, Advanced Drug Delivery Review, 2002, 54:459-476; Harris JM e Zalipsky, S (eds) de "Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680 (1997); Mehvar, R. e outros, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1): 125136 (2000); Harris, J.M., Nature Reviews 2: 215 et seq. (2003); Tsubery, H., J. Biol. Chem 279(37): 38118-24 (2004); e são descritas mais em várias referências descrevendo PEGuilação e vários reagentes e metodologias (vide, por exemplo, Monfardini, C. e outros, Bioconjugate Chem. 6: 6269 (1995); Veronese F.M. e outros, J. Bioactive Compatible Polymers 12: 197-207 (1997); e uma variedade de patentes e pedidos de patente U.S. e outros publicados incluindo US 5.672.662; US 5.932.462; US 6.495.659; e US 6.737.505; bem como Patentes U.S. Nos. 4.002.531; 4.179.337; 5.122.614; 5.183.550; 5.324.844; 5.446.090; 5.612.460; 5.643.575; 5.766.581; 5.795.569; 5.808.096; 5.900.461; 5.919.455; 5.985.263; 5.990.237; 6.113.906; 6.214.966; 6.258.351; 6.340.742; 6.413.507; 6.420.339; 6.437.025; 6.448.369; 6.461.802; 6.828.401; 6.858.736; Pedido de Patente US Publicado 20010021763; 20010044526; 20010046481; 20020052430; 20020072573; 20020156047; 20030114647; 20030143596; 20030158333; 20030220447; 20040013637; 2005000360; 20050114037; 20050171328 e 20050209416; e Publicações Européias EP 01064951; e EP0822199; e Publicações PCT WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; e WO 0187925 (cada uma de tais publicações é aqui incorporada título de referência). EXEMPLO 21-A: Versões ilustrativas PEGuiladas de Hialuronidases Recombinantes Humanas
[00695] Com uma ilustração exemplar da peguilação de uma sHASEGP ilustrativa, aldeídos de PEG, succinimidas e carbonatos foram cada um aplicados para conjugar porções de PEG à rHuPH20. Dessas três químicas, succinimidil PEGs têm sido tipicamente os mais convenientes para uso no caso de rHuPH20. Por exemplo, rHuPH20 foi conjugada com reagentes de succinimidil monoPEG (mPEG) exemplares incluindo mPEG-Succinimidil Propionatos (mPEG- SPA), Butanoatos de mPEG-Succinimidila (mPEG-SBA) e (para ligação de PEGs "ramificados") mPEG2-N-Hidroxilsuccinimida. Esses ésteres de succinimidila peguilados contêm estruturas principais de carbono de comprimento diferente entre o grupo PEG e o ligante ligado com reticulação ativada, e um grupo PEG ou simples ou ramificado. Essas diferenças podem ser usadas, por exemplo, para prover cinéticas de reação diferentes e para potencialmente restringir sítios disponíveis para ligação de PEG à rHuPH20 durante o processo de conjugação.
[00696] Succinimidil PEGs (conforme acima) compreendendo PEGs ou lineares ou ramificadas foram conjugadas à rHuPH20. Usando composições e técnicas conforme descritas no campo, succinimidil PEGs têm sido usadas para gerar rHuPH20 reproduzivelmente compreendendo uma combinação de moléculas tendo entre cerca de três a seis moléculas de PEG por sHASEGP. Tais composições de rHuPH20 peguiladas foram prontamente purificadas para dar composições tendo atividades específicas de aproximadamente 25.000 Unidades/mg de proteína de atividade de hialuronidase, e sendo substancialmente livre de rHuPH20 não-PEGuilada (menos do que 5% não-PEGuilados). Como é sabido na técnica, e descrito, por exemplo, em referências de PEGuilação incluindo aquelas citadas acima, uma variedade de reagentes e técnicas está também disponível para se obter produtos de PEG monodispersos conforme oposto a polidispersos (vide, por exemplo, as revisões e referências citadas na descrita detalhada acima relacionadas a monoPEGuilação específica de sítio e PEGguilação direcionada a sítio).
[00697] Aperfeiçoamentos em ambos farmacocinética e farmacodinâmica foram observados em modelos de animal seguindo administração de uma sHASEGP PEGuilada conforme comparado com a versão não-modificada da sHASEGP. Por exemplo, seguindo administração intravenosa a camundongos ou de 1.000 Unidades de uma rHuPH20 não- modificada ou 1.000 Unidades de rHuPH20 conjugada a PEGs tendo um peso molecular de aproximadamente 40 kDa (rHuPH20- PEG40), foi observado que a meia-vida no soro de atividade de hialuronidase ativa neutra (PH20) em soro de camundongos tratados com rHuPH20-PEG40 era significantemente mais longa (16-20 vezes) do que de camundongos tratados com rHuPH20 não-modificada. Ainda, a eficácia de rHuPH20-PEG40 foi comparada com rHu-PH20 não-peguilada em um modelo de derrame de rato. Resultados iniciais desses estudos demonstram maior eficácia de rHuPH20-PEG40 (maior do que 75-85% de sobrevivência, versus menos do que 50% em controles) em sobrevivência de rato 7 dias após indução do derrame.
[00698] Usando vários reagentes de PEG conforme disponível da Nektar, foram preparadas versões exemplares de hialuronidase recombinante humana (particularmente de preferência enzimas baseadas em rHuPH20) usando mPEG-SBA (30 kDa), mPEG-SMB (30 kD) e versões ramificadas baseadas em mPEG2-NHS (40 kd), mPEG2-NHS (60 kD). Esses reagentes e vários outros estão disponíveis em vários pesos moleculares (vide, por exemplo, 2005-06 Nektar Product Catalog que está disponível on line em http://www.nektar.com ou http://nektar.com/pdf/nektar_catalog.pdf, referências neles, catálogo e referências são aqui incorporados a título de referência). Vários outros reagentes de PEG e metodologias estão disponíveis de outros fornecedores e/ou são descritos na técnica. A título de ilustração, versões PEGuiladas de rHUPH20 foram geradas usando químicas NHS, bem como carbonatos, e aldeídos, usando cada um dos reagentes que seguem disponíveis da Nektar: mPEG2-NHS-40K ramificado (Nektar N° 2z3y0t01); mPEG-NHS- 10K ramificado (Nektar N° 2z3xOLol-10); mPEG-NHS-20K ramificado (Nektar N° 2z3xOLol- 20); mPEG-NHS-40K ramificado (Nektar N° 2z3x0Lo 1-40); mPEG2-NHS-60K ramificado (Nektar N° 2z3y0v01); mPEG-SBA-5K (Nektar N° 2m450h01); mPEG-SBA-20K (Nektar N° 2M450p01); mPEG-SBA-30K (Nektar N° 2M450r01); mPEG-SMB-20K (Nektar N° 2m4k0p01); mPEG-SMB-30K (Nektar N° 2m4k0r01); mPEG- butiraldeído-30K (Nektar No.072M0R01); mPEG-SPA-20K (Nektar N° 2m4m0p01); mPEG-SPA-30K (Nektar N° 2m4m0r01); e PEG-NHS- 5K-biotina (Nektar N° 0H4M0H02).
[00699] A requerente também gerou versões PEGuiladas de hialuronidase (por exemplo, rHUPH20) usando reagentes de PEG disponíveis da Dowpharma, uma divisão da Dow Chemical Corporation; incluindo hialuronidase PEGuilada com p-nitrofenil-carbonato PEG da Dowpharma (30 kDa) e com propionaldeído PEG (30 kDa). Reagentes da Nektar e Dowpharma e seus produtos resultantes foram usados e testados essencialmente conforme descrito abaixo para gerar uma grande variedade de composições de hialuronidase PEGuiladas. Outros reagentes, e suas hialuronidases, podem ser similarmente reagidos usando técnicas análogas.
[00700] P ara geração de versões PEGuiladas de rHuPH20, enzima purificada (em uma concentração entre cerca de 1 a 14 mg/ml) foi misturada com um excesso molar de cada reagente de PEG (geralmente em cerca de um excesso molar de 10:1 de PEG:enzima), e pH e outras condições conforme recomendado para cada um dos reagente ou químicas de PEG (geralmente reações aldeído foram realizadas em cerca de pH 4,5, reações NHS em pH neutro e reações carbonato em cerca de pH 9,5). Os componentes da reação foram reagidos com mistura por aproximadamente 16 horas a 4 graus C.
[00701] SDS-PAGE foi usada para inicialmente examinar produtos de reação. RHuPH20 geralmente não- modificada foi observada migrar como uma banda única de aproximadamente 63 kDa de peso molecular. As várias versões PEGuiladas de rHuPH20 geralmente compreendiam uma banda na faixa de cerca de 150-200 kDa (tipicamente cerca de 180 kDa) bem como várias faixas de mais do que 200 kDa.
[00702] A requerente então realizou filtragem em gel dos produtos de enzima modificados seguido por atividade de enzima de proteínas fracionadas. Resumidamente, seguindo técnicas conforme sabido no campo, separação de hialuronidases modificadas com PEG a partir de suas formas não-modificadas nativas respectivas foi realizada através de cromatografia de filtragem em gel, usando uma coluna Superose 6 (GE/Phamacia). Solução salina tamponada com fosfato foi usada como fase móvel para as separações, com uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto. A coluna foi calibrada usando Gel Filtration Calibration Standards da GE/Pharmacia. Frações contendo enzimas de degradação de hialuronan separadas foram ensaiadas quanto à atividade de hialuronidase relativa através de um ensaio de Turbidez USP modificado, realizado em um formiato de microtitulação. Volume de retenção de pico (tempo) para fracionamento de atividade de enzima hialuronidase rHuPH20 através de uma coluna de filtragem em gel Superose 6, mudada de cerca de 16 mL (aproximadamente 60 a 80 KD de peso molecular aparente) para a hialuronidase modificada, para cerca de 10 mL (maior do que 100.000 KD a aproximadamente 670.000 KD de peso molecular aparente) para a hialuronidase modificada com PEG. Modificação com PEG pode aparentemente, completamente mudar toda a atividade de enzima mensurável para as formas modificadas de peso molecular mais alto, quando PEG em excesso molar é reagida com a enzima.
[00703] A requerente então examinou a atividade enzimática de várias enzimas nativas e modificadas usando zimografia (análises de atividade de degradação de glicosaminoglicano através de eletroforese de gel de substrato). Resumidamente, géis de zimograma de SDS-PAGE contendo hialuronan foram fundidos e análises realizadas essencialmente de acordo com o procedimento anteriormente descrito por Miura, R.O. e outros. "Analysis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel electrophoresis (zymography)". Anal Biochem. 1995 Mar l;225(2):333-40.
[00704] H ialuronidase rHuPH20 nativa demonstrou atividade de degradação de hialuronan em géis de zimograma como uma banda única com um peso molecular aparente de aproximadamente 60 kDa. Modificações com PEG de hialuronidase rHuPH20 resultaram em uma mudança na atividade de degradação de hialuronan em géis de zimograma com sinais enzimativamente ativos em aproximadamente 180 kDa, e com pelo menos 2 bandas adicionais tendo atividade de enzima com massas moleculares maiores do que 200 kDa.
[00705] Esses resultados e outros descritos aqui demonstram que glicosaminoglicanases podem ser eficazmente modificadas através de PEGuilação (que pode ser usada para alterar sua farmacocinética e/ou outros perfis) usando qualquer um de uma variedade de reagentes de PEG, e que as enzimas resultantes podem reter atividade enzimática substancial tornando-as úteis em qualquer uma de uma variedade de aplicações diferentes - particularmente aplicações in vivo ou outras onde modificação da enzima para prolongar sua meia-vida pode ser útil. EXEMPLO 21 B: VERSÕES PEGUILADAS Ilustrativas DE HIALURONIDASES NÃO-HUMANAS
[00706] Embora hialuronidases recombinantes humanas sejam particularmente preferidas para aplicações onde a enzima está sendo usada em associação com células humanas, e ainda mais particularmente quando ela está sendo aplicada ao ou dentro do corpo humano, as técnicas ilustradas aqui podem ser também empregadas para gerar versões farmacocineticamente aperfeiçoadas de outras enzimas hialuronidase que podem ter aplicação adequada em certos contextos ou ambientes. Deste modo, através da aplicação de metodologias conforme aqui ilustrado e descrito e na técnica para outras enzimas hialuronidase, a requerente gerou várias enzimas modificadas que são PEGuiladas (que podem ser usadas para melhorar sua farmacocinética conforme ilustrado acima) e ainda retêm atividade enzimática substancial. Para propósitos de ilustração, metodologias conforme aqui descrito e ilustrado foram aplicadas a uma série de enzimas hialuronidase "não-humanas" exemplares diferentes, incluindo uma hialuronidase derivada de animal ilustrativa, uma hialuronidase derivada de bactéria ilustrativa e uma condroitinase derivada de bactéria ilustrativa tendo atividade de hialuronidase. Versões PEGuiladas de tais hialuronidases não-humanas, conforme aqui descrito, podem ser usadas para eficazmente prover meias-vidas prolongadas (tal como seguindo administração intravenosao ou outra in vivo).
[00707] Como um exemplo ilustrativo de uma hialuronidase derivada de animal não-humano, a requerente gerou versões PEGuiladas de hialuronidase testicular ovina (disponível como Vitrase® da ISTA Pharmaceuticals). Vitrase (hialuronidase para injeção, Liofilizada, Ovina NDC 67425001-01, 6200 USP Unidades/frasco), comprada da ISTA Pharmaceuticals, foi um presente de um oftalmologista. Soluções de vitrase foram preparadas através de reconstituição da Vitrase liofilizada com Injeção de Cloreto de Sódio a 0,9% USP (Baxter).
[00708] Como um exemplo ilustrativo de uma hialuronidaes derivada de bactéria não-humana, a requerente gerou versões PEGuiladas de hialuronidase bacteriana disponível como Hyaluronate Lyase da Sigma. Hyaluronate Lyase de Streptomyces hyalurolyticus ou outra espécie, Número CAS 9001-54-1, Número EC 4.2.2.1) (674 unidades/frasco) foi comprada da Sigma. Hyaluronate lyase foi reconstituída com solução salina tamponada de fosfato filtrada estéril. Vide, por exemplo, Ohya, T. e Kaneko, Y. Biochim. Biophys. Acta 198, 607 (1970).
[00709] Como um exemplo ilustrativo de uma condroitinase não-humana tendo atividade de hialuronidase, a requerente gerou versões PEGuiladas de condroitinase bacteriana ABC (disponível como Chondroitinase ABC from Associates of Cape Cod, Inc. Seikagaku Corporation). Chondroitinase ABC da Proteus vulgaris (Chondroitin ABC lyase, Chondroitin ABC eliminase, Número EC EC: 4.2.2.4, Número CAS: 9024-13-9, N° cat. 100330 ou 10033) foi comparada da Associates of Cape Cod Inc. soluções de Chondroitinase ABC foram preparadas em solução de BSA a 0,1%. Referências incluem: (1) Yamagata, T. e outros, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968); (2) Saito, H. e outros, J. Biol. Chem., 243, 1536 (1968); (3) Suzuki, S. e outros, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968); e (4) Oike, Y. e outros, J. Biol. Chem., 257, 9751 (1982).
[00710] Como um reagente de PEG ilustrativo, a requerente usou Butanoato de mPEG-Succinimidila (disponível como mPEG-SBA) (30 kD) da Nektar. Embora mPeg-SBA-30K (N- hidroxissuccinimidil éster de ácido metóxi poli(etileno glicol) butanóico, PM médio 30.000, N° de Cat. 2M450R01), foi usado para este exemplo, outros N-hidroxissuccinimidil éster de metóxi poli(etileno glicol) de qualquer peso molecular ou N-hidroxissuccinimidil ésteres de poli(etileno glicol) de qualquer peso molecular, ou peg-aldeídos de qualquer tamanho, ou peg-carbonatos de qualquer tamanho, ou outros reagentes de PEG Nektar, ou outros reagentes de peguilação podem ser também usados. Vide, por exemplo, Zalipsky, S. e C. Lee, "Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications," J.M. Harris, ed., Plenum, NY, 1992, cf. capítulo 21.
[00711] P ara a geração de versões PEGuiladas exemplares de hialuronidases derivadas de animal, um frasco de hialuronidase testicular ovina (Vitrase) foi reconstituído com 0,62 mL de solução salina a 0,9% (10 unidades/microlitro) e 0,3 mL da solução de enzima reconstituída foi transferido para um tubo estéril. O reagente de PEG exemplar, mPeg-SBA-30K (9,9 mg), foi adicionado ao tubo contendo a solução Vitrase, o tubo foi misturado até que todo mPeg parecesse entrar em solução, e então a mistura foi reagida por aproximadamente 16 horas a 4°C, com mistura.
[00712] P ara a geração de versões PEGuiladas exemplares de hialuronidases derivadas de bactéria, uma ampola de Sigma hyaluronate lyase foi reconstituída com 0,7 mL de solução salina tamponada com fosfato filtrada (~1 unidade/microlitro) e 0,3 mL da solução de enzima reconstituída foi transferido para um tubo estéril. O reagente de PEG exemplar, mPeg-SBA-30K (9,8 ml), foi adicionado ao tubo contendo a solução de hyaluronato lyase, o tubo foi então misturado até que todo o mPEg parecesse estar em solução, e a mistura foi reagida por aproximadamente 16 horas a 4oC, com mistura.
[00713] P ara a geração de versões PEGuiladas exemplares de crondoitinases derivadas de bactéria tendo atividade de hialuronidase, um frasco de condroitinase ABC (10 Unidades) foi reconstituído com 0,2 mL de solução salina a 0,9%, e reagente de PEG exemplar, mPeg-SBA-30K ( 12,4 mg), foi adicionado ao frasco contendo solução de Chondroitinase ABC, e misturado até que todo o mPeg parecesse estar em solução, e a mistura foi reagida por aproximadamente 11 horas a 4°C, com mistura.
[00714] Análises iniciais incluíam a aplicação de SDS-PAGE para examinar as enzimas modificadas comparado com controles não-modificados. Resumidamente, proteína total foi visualizada ou com tingimento com Coomassie Blue ou prata após separação através de géis de NuPage Tris/Acetato a 3 a 8% (Invitrogen). Pesos moleculares das bandas tingidas foram determinados através de comparação com proteínas padrão de massa conhecida administradas no mesmo gel.
[00715] Os resultados com Vitrase foram como segue: (A) Vitrase (não-modificada), 5 bandas aproximadamente dos pesos moleculares que seguem (kDa): 90, 80, 63, 50 e 40; (B) PEG-Vitrase, 7 bandas aproximadamente dos pesos moleculares que seguem (kDa): 150, 180 e cinco bandas de mais do que 200.
[00716] Os resultados com Chondroitinase ABC foram como segue: (A) Chondroitinase ABC (não-modificada), 6 bandas aproximadamente dos pesos moleculares que seguem (kDa): 100, 80, 50, 38, 33 e 30; (B) PEG-Chondroitinase ABC, 8 ou mais bandas aproximadamente dos pesos moleculares que seguem (kDa); uma a duas bandas entre 150-200 e seis ou mais bandas maiores do que 200.
[00717] Os resultados com Hyaluronato Lyase foram como segue: (A) Hyaluronato Lyase (não-modificada), uma banda aproximadamente do peso molecular que segue (kDa):35; (B) PEG-Hyaluronato Lyase, quatro ou mais bandas aproximadamente do peso molecular que segue (kDa): maior do que 200.
[00718] Conforme demonstrado, polietileno glicol ativado (por exemplo: mPeg-SBA-30K (N-hidroxissuccinimidil éster do ácido metóxi poli(etileno glicol) butanóico, PM médio 30.000), pode ser aplicado à hialuronidase ovina (por exemplo, Vitrase), Chondroitinases ABCs bacterianas (por exemplo, de Proteus vulgaris) ou hialuronato liases bacterianas (por exemplo, de Streptomyces hyalurolyticus), para induzir mudanças químicas nas preparações de enzima que produzem novas moléculas ou massa molecular média maior, conforme seria associado com a geração de versões PEGuiladas dessas enzimas. Caracterização adicional desses produtos proveu evidência adicional de que as enzimas não podem apenas ser eficazmente PEGuiladas mas que produtos de enzima resultantes podem exibir atividade enzimática substancial na degradação de hyaluronan - demonstrando que PEGuilação pode ser aplicada a esses vários tipos de enzima (que pode ser usada para alterar seus perfis farmacocinéticos enquanto ao mesmo tempo retendo atividade enzimática substancial).
[00719] A requerente então realizou filtragem em gel dos produtos de enzima modificados seguido por atividade de enzima de proteínas fracionadas. Resumidamente, seguindo técnicas conforme sabido no campo, separação de hialuronidases modificadas com PEG a partir de suas respectivas formas não-modificadas nativas foi realizada através de cromatografia de filtragem em gel, usando uma coluna Superose 6 (GE/Pharmacia). Solução salina tamponada com fosfato foi usada como fase móvel para as separações, com uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. A coluna calibrada usando Gel Filtration Calibration Standards da GE/Pharmacia. Frações contendo enzimas de degradação de hialuronan separadas foram ensaiadas quanto à atividade de hialuronidase relativa através de um ensaio de Turbidez USP modificado, realizado em um formiato de microtitulação. O pH e o tampão usados para ensaiar a atividade de cada uma das enzimas de degradação de hialuronan testadas eram conforme descrito na literatura, para cada enzima específica.
[00720] Volume de retenção de pico (tempo) para fracionamento da atividade de enzima hialuronidase ovina (por exemplo: Vitrase) através da coluna de filtragem de gel 6, mudada de 15,5 mL (aproximadamente 60 a 80 kDa de peso molecular aparente) para a hialuronidase ovina nativa para 9,5 mL (maior do que 100.000 KD para aproximadamente 670.00 KD de peso molecular aparente) para a hialuronidase ovina modificada com Peg. Modificação com Peg pode aparentemente completamente mudar toda a atividade da enzima mensurável para as formas modificadas de peso molecular maior, quando Peg de excesso molar é reagida com a enzima bovina.
[00721] Volume de retenção de pico (tempo) para atividade da enzima Hyaluronato Lyase bacteriana nativa era aproximadamente 16 mL (aproximadamente 50 a 70 KD de peso molecular aparente) após injeção. Hyaluronato Lyase modificada com Peg fracionada através de filtragem em gel não demonstrou nenhuma atividade de enzima em quaisquer frações. Falta de atividade de enzima mensurável incluía frações onde atividade de Hyaluronato Lyase é normalmente mensurável, sugerindo que modificação com Peg afetou negativamente o funcionamento da enzima.
[00722] Chondroitinase ABC modificada com Peg demonstrou atividade de enzima de pico em aproximadamente 11 mL e 13 mL após injeção (aproximadamente entre 200 e 600 KD de peso molecular aparente), e novamente em aproximadamente 16 mL após injeção (aproximadamente 50 a 80 KD de peso molecular aparente). Chondroitinase ABC nativa tem atividade de enzima em apenas aproximadamente 16 mL após injeção. Este dado sugere que a Chondroitinase ABC foi modificada com Peg, com manutenção da atividade enzimática mais alta do que moléculas de massa molecular nativas.
[00723] Filtragem em gel pode ser usada para estimar o grau de modificação de Peg em enzimas de degradação de hialuronan; e análise de atividade enzimática de preparações fracionadas pode ser usada para avaliar o efeito que modificação de Peg tem sobre a atividade enzimática das enzimas de degradação de hialuronan, com relação à atividade total e à massa molecular de constituintes demonstrando atividade enzimática.
[00724] A requerente então examinou a atividade enzimática de várias enzimas nativas e modificadas usando zimografia (análises de atividade de degradação de glicosaminoglicanos através de eletroforese de gel de substrato). Resumidamente, géis de zimogram de SDS-PAGE contendo hialuronan foram fundidos e análises realizadas essencialmente de acordo com o procedimento anteriormente descrito por Miura , R.O. e outros, Analysis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel electrophoresis (zymography). Anal. Biochem. 1995 1o de março; 225(2):333-40.
[00725] H ialuronidase ovina nativa demonstrou atividade de degradação de hialuronan em géis de zimograma, identificando principalmente 2 bandas de atividade em aproximadamente 60 KD e 90 KD com um pouco de degradação da atividade de enzima entre esses pesos moleculares. Nenhuma atividade de enzima é demonstrada maior do que 100 KD. Modificação com Peg de hialuronidase ovina demonstra uma mudança na atividade de degradação de hialuronan em géis de zimograma com sinais enzimaticamente ativos em aproximadamente 150 KD, e com pelo menos 2 bandas adicionais tendo atividade de enzima com massas moleculares maiores do que 200 KD.
[00726] Chondroitinase ABC neutra demonstrou uma banda única de atividade de degradação de hialuronan em géis de zimograma, demonstrando uma massa molecular de aproximadamente 80 a 90 KD. Modificação com Peg de Chondroitinase ABS demonstra uma mudança em atividade de degradação de hialuronan em géis de zimograma com sinais enzimaticamente ativos em aproximadamente 180 KD, e com pelo menos uma banda adicional de atividade com uma massa molecular maior do que 200 KD.
[00727] A análise de zimografia então confirmou que uma hialuronidase derivada de animal exemplar (Vitrase) e uma condroitinase derivada de bactéria exemplo tendo atividade de hialuronidase (Chrondoitinase ABC) podem ser modificadas através de PEGuilação (que pode ser usada para alterar seu perfil farmacocinético conforme ilustrado acima com relação à hialuronidase humana recombinante) e que as enzimas modificadas resultantes podem ainda exibir atividade enzimática substancial.
[00728] Como será compreendido por aqueles versados na técnica em vista dos exemplos acima, outras hialuronidases (ambas humana e outras recombinantes conforme aqui descrito, bem como outras animal não-humano ou bacteriana ou procariótica ou outras hialuronidases, bem como condroitinases) podem da mesma maneira ser modificadas usando qualquer um de uma variedade de reagentes de PEG como são conhecidos na técnica ou recém-encontrados, para gerar enzimas modificadas tendo perfis farmacocinéticos e/ou outros alterados que as tornam úteis para aplicações particulares. EXEMPLO 22 — USO ILUSTRATIVO DE UMA sHASEGP PARA PROMOVER ESPALHAMENTO DE AGENTE FARMACOLÓGICO DE MOLÉCULA PEQUENA IN VIVO
[00729] Como um exemplo ilustrativo do uso de composições de sHASEGP da presente invenção para promover espalhamento ou difusão de agentes farmacológicos no e dentro de órgãos e tecidos em um mamífero, foi avaliado o uso de rHuPH20 para promover penetração de dexametasona ("dex", um agente antiinflamatório usado como um farmacológico de molécula pequena exemplar) em tecidos do olho do mamífero in vivo.
[00730] P ara injeção de agentes tal como anestésicos a olho de mamífero, vias periorbitais geralmente usadas para atingir blocos anestéticos incluem injeções peribulbar, retrobulbar e sub-Tenon. Para este exemplo ilustrativo, foi comparada injeção de sub-Tenon de dex, com ou sem administração concomitante de sHASEGP, no espaço episcleral, e então examinadas as concentrações de dex dentro de tecidos da parte posterior do olho, particularmente as camadas do coróide e retinal, que são alvos de fármaco importantes mas freqüentemente difíceis de atingir eficientemente com agentes farmacológicos.
[00731] Coelhos machos vermelhos da Nova Zelândia (aproximadamente 2,1 a 3,2 kg) foram empregados e foram postos sob anestesia geral usando injeções intramusculares de cloridrato de cetamina (21 mg/kg) e cloridrato de xilazina (5,25 mg/kg). Proparacaína tópica foi usada para anestesiamento da superfície ocular. As pupilas foram dilatadas com tropicamida 1% e fenilefrina a 2,5%. Após abertura da conjuntiva do olho direito de cada coelho usando tesouras Vannas, a ponta da cânula anestésica triport Medez (Eagle Laboratories, Rancho Cucamonga, CA) foi inserida no espaço episcleral e 1,5 ml ou de dex sozinha (American Pharmaceutical Partners, n=18) ou dex mais sHASEGP (3000 unidades de rHuPH20, n=18) foi inserido adjacente ao pólo posterior do olho. Um aplicador com ponta de algodão foi posto no sítio de entrada conjuntival para prevenir saída de fluido.
[00732] Em 1, 2, 3 ou 6 horas após a injeção, os coelhos foram anestesiados conforme acima descrito e sacrificados através de injeção intracardíaca de pentobarbital sódico (120 mg/kg). Seguindo eutanásia, 1 ml de amostra de sangue foi obtido e ambos olhos foram enucleados de cada animal. Imediatamente após a enucleação, uma amostra de 2 ml de humor aquoso foi coletada através de parecentese da câmara anerior com seringa tuberculina de cada olho. Após remoção de segmento anterior dos olhos enucleados, 1 ml de amostra vítrea foi retirado e posto em tubos Eppendorb rotulados. O restante do olho foi dissecado e perfurador de ossos 6 mm (Fine Science Tools, Foster City, CA) foi usado para perfurar a amostra de tecido inferior ao nervo óptico onde fármaco foi injetado no lado extraescleral. A partir do tecido perfurado, a retina foi raspada com uma lâmina cega e posta em tubo rotulado como foi a coróide.
[00733] Espectrometria de massa foi usada para avaliar os níveis de dex em tecido com os limites quantificáveis mínimos sendo da ordem de 5 ng/ml. Para as amostras de coróide e retina, um tampão contendo base Tris a 50 mM, MgCl2 a 1mM, pH 9,0, foi adicionado ao tecido de modo que a concentração final era 20 mg/mL. O tecido foi rompido usando um homogeneizador ultrassônico (BioLogics, Inc, modelo 150 V/T) por 5-15 segundos. As amostras de homogenato de tecido, o fluido vítreo, fluido aquoso e plasma foram todas analisadas através dos procedimentos que seguem. Amostras tendo dexametasona e prednisolona como o padrão interno (I.S.) foram extraídas com metil t-butil éter através de mistura com vórtex por cinco minutos. As camadas orgânica e aquosa foram separadas através de centrifugação a 1.300 g por cinco minutos, a camada aquosa foi congelada a -70°C por quinze minutos, e a camada orgânica foi vertida em novos tubos e evaporada sob uma corrente de nitrogênio a 40o C. O resíduo foi reconstituído com água:acetonitrila (50:50 v/v). As amostras processadas foram analisadas através de cromatografia líquida de alta desempenho usando uma coluna Phenomenex Synery Polar RP mantida a 45o C. A fase móvel foi nebulizada usando nitrogênio aquecido em uma fonte/interface de spray Z e os compostos ionizados foram detectados usando um espectrômetro de massa de quatro pólos em tandem. Pesos de pico de dexametasona e prednisolona foram adquiridos e integrados usando software MassLynx®, Micromass, Beverly, MA. As curvas de calibragem foram obtidas ajustando as razões em peso de pico dos padrões ao padrão interno com uma equação de energia em MassLynx®. A equação da curva de calibragem foi então usada para interpolar a concentração de dexametasona nas amostras usando suas razões de altura de pico.
[00734] Os resultados de espec. de massa revelaram que os níveis de dexametasona coroidais, retinais e vítreos de coelhos tratados com dex sozinha atingiram concentrações de pico no primeiro ponto de tempo (isto é, 1 hora após injeção); enquanto as concentrações de dex coroidais e retinais de coelhos que receberam sHASEGP concomitante eram maiores e continuavam a aumentar para o segundo ponto de tempo (isto é, 2 horas após injeção). Concentrações coroidal, retinal e vítrea de pico eram aproximadamente 10 vezes, 5 vezes e 8 vezes maiores, respectivamente, em tecidos que tinham sido tratados com sHASEGP, e as áreas sob a curva (AUC) eram também pelo menos 50% maiores.
[00735] Esses resultados indicam que a administração de sHASEGP pode ser usada para substancialmente aumentar a aplicação de agentes farmacológicos tal como dex, mesmo a tecidos relativamente difíceis de atingir in vivo tal como segmentos na parte posterior do olho de mamífero. Ainda, uma vez que a camada escleral relativamente espessa forma uma barreira de tecido entre o espaço de injeção de sub-Tenon e as camadas coroidal e retinal alvo, os níveis altos de agente farmacocinético aplicados às últimas camadas indicam que sHASEGP pode ser usada para promover eficazmente aplicação de farmacológicos através de camadas de tecido dentro do corpo.
[00736] No caso de promoção de aplicação transescleral, sHASEGP pode ser então aplicada em um procedimento minimamente invasivo para promover a aplicação de agentes usados para tratar condições que afetam a parte posterior do olho são de interesse particular em várias situações de doença ocular. Isto pode prover, por exemplo, uma via de aplicação menos invasiva para o tratamento de neovascularização coroidal (por exemplo, através da administração de esteróides), degeneração macular e outras doenças que afetam esses tecidos que são tipicamente tratadas através de injeção intravítrea. Existe uma ampla variedade de agentes atualmente usados para essas condições, tal como, mas não limitado a, dexametasona, triamcinolona, Macugen® e antagonistas de VEGF.
[00737] Em adição às atividades enzimáticas de sHASEGP que contribuem para espalhamento no contexto de vias de aplicação tal como via injeção do sub-Tenon, acredita-se também que a introdução da sHASEGP em um volume de fluido que encha ou distenda eficazmente o espaço de tecido onde ela é injetada gere pressões hidrostáticas positivas que sirvam para direcionar mais a aplicação de fluidos, e os agentes compreendidos neles, nos tecidos circundantes (por exemplo, através da promoção de transporte convectivo). EXEMPLO 23 — USO ILUSTRATIVO DE UMA sHASEGP PARA REDUZIR PRESSÃO DE FLUIDO INTERSTICIAL DE TUMOR DESTE MODO PROMOVENDO A SUSCEPTIBILIDADE DE UM TUMOR A AGENTES FARMACOLÓGICOS ANTITUMOR
[00738] Conforme aqui descrito e ilustrado, sHASEGPs podem ser usadas para gerar canais intersticiais que podem aumentar o fluxo de fluido e facilitar a aplicação de farmacológicos e outros agentes a sítios de tecido desejados in vivo. Tumores apresentam uma questão alvo particularmente importante para vários agentes farmacológicos conhecidos e regularmente desenvolvidos, especialmente antineoplásticos, antimetabolitos, antiangiogênicos e vários agentes citotóxicos e citostáticos. Os desafios associados com direcionamento de tais farmacológidos a sítios de tumor in vivo são exacerbados pelo fato de que muitos tumores exibem pressões intersticiais elevadas que tendem a impedir infusão de farmacológicos administrados, particularmente a sítios profundos dentro de uma massa de tumor. Acredita-se que sHASEGPs possam reduzir esta impedância, e então facilitem a aplicação de qualquer um de uma variedade de agentes farmacologicos conhecidos e recém-desenvolvidos em tumores, deste modo tornando-os mais sensíveis e mais tratáveis por uma dada dose de um farmacológico. A esses respeitos, as sHASEGPs da presente invenção foram mostradas ser capazes de promover a formação de canais intersticiais e aumentar a dispersão de marcadores de vários tamanhos conforme acima descrito. Ainda, foi observado pela requerente que sHASEGPs podem ser usadas para aumentar a condutividade hidráulica de tecidos intersticiais mais de dez vezes.
[00739] Como confirmação desses princípios no contexto de células de tumor, aplicação de uma sHASEGP exemplar (rHuPH20, 50 Unidades) a células de tumor in vitro resultou em remoção substancial de matrizes pericelulares, que são acreditadas ser um contribuidor grande para pressão de fluido intersticial de tumor elevada.
[00740] Ainda, administração de rHuPH20 in vivo, em um modelo de tumor humano de xenoenxerto, resultou em uma redução significante na pressão de fluido intersticial de tumor dentro de uma hora de administração.
[00741] Conforme descrito na descrição detalhada da invenção acima, as sHASEGPs da presente invenção podem ser aplicadas em combinação com qualquer um de vários agentes antitumor conhecidos ou recém-desenvolvidos para uso no tratamento de vários cânceres. EXEMPLO 24 — USO ILUSTRATIVO DE UMA sHASEGP PARA AUMENTAR A FARMACOCINÉTICA DE UM MACROMOLECULAR APLICADO ATRAVÉS DE INJEÇÃO PARENTERAL NÃO-IV
[00742] Conforme acima discutido, sHASEGPs podem ser usadas para modular a farmacocinética de farmacológico conhecido ou recém-desenvolvido e outros agentes através de, por exemplo, facilitação de sua absorção e/ou distribuição com o corpo. Tais parâmetros farmacocinéticos aperfeiçoados podem por sua vez ser usados para melhorar a farmacodinâmica de um agente particular (por exemplo, redução da toxidez local através da diminuição da quantidade de um agente deixado próximo de um sítio de injeção e/ou aumentando a eficácia através do aumento da quantidade de um agente aplicado a (e/ou através) um alvo desejado). Alternativamente, uma vez que sHASEGPs podem ser usadas para direcionar eficazmente a dispersão de um agente farmacológico localmente administrado (por exemplo, através de um sítio de injeção e na corrente sangüínea), é também possível usar a sHASEGP para essencialmente melhorar a farmacocinética de absorção e atingir farmacodinâmicas similares com uma quantidade reduzida de agente aplicado.
[00743] Como um exemplo ilustrativo do uso de sHASEGPs para aumentar a farmacocinética de um fármaco macromolecular que é normalmente administrado através de injeção parenteral não-intravenosa, a requerente combinou PH20 recombinante (rHuPH20) com uma versão de peguilação de interferon alfa 2b (PEG-ÍNTRON® disponível da Schering- Plougn). PEG-ÍNTRON é uma macromolécula de aproximadamente 31 kD que é tipicamente administrada através de injeção subcutânea para o tratamento do vírus da Hepatite C (HCV) (geralmente em combinação com o fármaco de molécula pequena ribavirin). Tal como muitas macromoléculas administradas subcutaneamente, PEG-ÍNTRON é relativamente lentamente absorvida e uma porção substancial do agente nunca atinge a corrente sangüínea, com biodisponibilidade da ordem de 5060%. Ainda, uma fração substancial de pacientes (tipicamente mais da metade) desenvolvem várias reações de sítio de injeção, presumivelmente como um resultado de ou exacerbadas pelas concentrações locais retidas do farmacológico. Conforme compreendido por aqueles versados na técnica, as conseqüências de tais farmacocinéticas são várias; e incluem não apenas o "desperdício" de agente aprisionado próximo ao sítio de injeção, mas também reações ao composto localmente metabolizado.
[00744] A requerente administrou PEG-ÍNTRON marcado com Iodo-125 através de vias de administração diferentes, com ou sem administração concomitante de rHuPH20, para examinar os efeitos de rHuPH20 sobre os parâmetros farmacocinéticos do PEG-ÍNTRON. Para determinar a biodisponibilidade absoluta de rHuPH20, foram também medidos os parâmetros farmacocinéticos de PEG-ÍNTRON administrados através de administração intravenosa.
[00745] Resumidamente, dezoito ratos Sprague- Dawley (cada um pesando aproximadamente 225-250 gramas) foram divididos em três grupos de seis animais cada. Um primeiro grupo foi administrado com artigo de teste (isto é, PEG-ÍNTRON marcado com I-125) através da administração intravenosa (1,5 micrograma/kg em um volume de 100 microlitros através de injeção na veia da cauda). Atividade específica do interferon marcado com I-125 era 55 uCi/micrograma. Amostras de sangue (100 microlitros) foram coletadas pré-dose e em 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após dosagem e processadas para quantificação de fármaco marcado através de contagem gama (expressa como Contagens por Minuto (CPM) por grama de plasma). Um segundo grupo de seis animais foi administrado com dose e volume equivalentes de artigo de teste através de injeção intradermal em um ponto depilado e preparado na parte de trás do pescoço, e amostras de sangue foram processadas como para o primeiro grupo. Um terceiro grupo de seis animais foi administrado com uma dose equivalente do artigo de teste misturado com rHuPH20 (100 U.I.) em um volume combinação de 100 microlitros através de injeção intradermal como no grupo anterior, e amostras de sangue foram então processadas como para os grupos um e dois. Os resultados deste estudo são mostrados abaixo na Tabela 24-1. Tabela 24-1 Efeitos de sHASEGP sobre o perfil farmacocinético
Figure img0025
Figure img0026
Figure img0027
[00746] Como pode ser visto na Tabela 24-1, a biodisponibilidade de PEG-ÍNTRON farmacológico exemplar (conforme avaliado através da AUC) foi drasticamente melhorada quando a dosagem intradermal foi combinada com uma dose de sHASEGP. Na verdade, a biodisponibilidade absoluta atingida com uma dosagem intradermal em combinação com sHASEGP era estatisticamente indistingüível da administração intravenosa direta, onde todo o material é aplicado diretamente na corrente sangüínea. Deste modo, o uso de sHASEGP em combinação com um farmacológico que é introduzido através de administração parenteral não-IV pode prover níveis de aplicação comparáveis com administração diretamente na corrente sangüínea. Embora Tmax seja necessariamente mais longo seguindo administração ID (uma vez que um pouco de tempo é necessário para que o agente atinja a corrente sangüínea), dentro de várias horas após dosagem ID com sHASEGP, as concentrações de agente na corrente sangüínea essencialmente atingiram aqueles atingidos por dosagem IV, e em seguida aparentemente as excederam. EXEMPLO 25 — USO ILUSTRATIVO DE UMA sHASEGP PARA FACILITAR APLICAÇÃO INTRADERMAL DE UMA MACROMOLÉCULA NORMALMENTE APLICADA ATRAVÉS DE INJEÇÃO INTRAVENOSA
[00747] Conforme acima discutido, sHASEGPs podem ser usadas para facilitar a aplicação de agentes farmacológicos e outros conhecidos ou recém-desenvolvidos através de vias de administração diferentes que podem prover maior conveniência, segurança, custos reduzidos e/ou outros benefícios. Como um exemplo ilustrativo de tal reformulação, foi usada uma sHASEGP para facilitar a aplicação intradermal de um fármaco macromolecular que é normalmente administrado através de injeção intravenosa. Para este exemplo particular, a requerente combinou PH20 humana recombinante (rHuPH20) com um anticorpo monoclonal anti-TNFalfa humano- murino quimérico (Infliximab, disponível como REMICADE® da Centocor). REMICADE é uma macromolécula de aproximadamente 150 kD que é tipicamente administrada através de injeção intravenosa para o tratamento de artrite ou doença de Crohn. Administração de REMICADE então geralmente requer o envolvimento de acesso intravenoso e cuidado profissional e riscos concomitantes, e também requer da ordem de duas horas para cada dosagem.
[00748] REMICADE (20 mg/ml) foi marcado com 125I para uma atividade específica de 10 μCi/mg. Dezoito ratos foram divididos em três grupos de seis animais cada e foram administrados com uma mistura de REMICADE ratioativa e fria (combinados 10 mg/kg) em um volume final de 100μl (i) através de administração intravenosa, (ii) através de administração intradermal ou (iii) através de administração intradermal em combinação com 100 Unidades de sHASEGP (de um estoque de 100.000 U/ml); e então sangue e tecidos processados através de contagem gama em vários pontos após dosagem, essencialmente conforme descrito para o exemplo anterior. Os resultados são sumarizados na Tabela: Tabela 25 - Efeitos de sHASEGP sobre os Parâmetros
Figure img0028
[00749] Como pode ser visto na Tabela 5-1, a biodisponibilidade do farmacológico exemplar REMICADE (conforme avaliado através de AUC) foi drasticamente melhorada quando a dosagem intradermal foi combinada com uma dose de sHASEGP. Como foi observado com aplicação aumentada de PEG-ÍNTRON, os níveis gerais de biodisponibilidade de REMICADE atingidos com uma dosagem intradermal em combinação com sHASEGP foram estatisticamente similares àqueles de administração intravenosa quando todo o material foi aplicado diretamente na corrente sangüínea. Embora o Tmax de REMICADE seja necessariamente mais longo seguindo administração ID versus IV, dentro de vinte e quatro horas após dosagem ID com sHASEGP, as concentrações de agentes na corrente sangüínea excederam aquelas observadas com dosagem IV, em seguida se aproximaram ou excederam as concentrações IV. Comparado com dosagem IV sem sHASEGP, o Tmax observado foi atingido cerca de duas vezes mais rápido com sHASEGP (24 horas versus 48 horas); e a Cmax e biodisponibilidade (AUC) ambas aumentaram substancialmente (em cerca de 65% e 95%, respectivamente). EXEMPLO 26 — USO ILUSTRATIVO DE UMA sHASEGP PARA FACILITAR APLICAÇÃO INTERDERMAL DE UM COMPLEXO MACROMOLECULAR MAIOR NORMALMENTE APLICADO ATRAVÉS DE INJEÇÃO PARENTERAL NÃO-IV
[00750] Como um outro exemplo ilustrativo do uso de sHASEGPs para aumentar a farmacocinética de um fármaco macromolecular que é normalmente administrado através de injeção parenteral não-intravenosa, a requerente combinou PH20 humana recombinante (rHuPH20) com Fator VIII humano recombinante (RECOMBINATE® disponível da Baxter). Fator VIII é um complexo de glicoproteína grande compreendendo polipeptídeos múltiplos, e tem um molecular combinado de aproximadamente 280 kD. O Fator VIII é tipicamente apenas administrado através de injeção intravenosa para o tratamento de hemofilia. Tal como muitas macromoléculas administradas subcutaneamente, o Fator VIII é relativamente lentamente absorvido e uma porção substancial do agente nunca atinge a corrente sangüínea, com biodisponibilidade da ordem de 0,5-1%.
[00751] Dezoito ratos foram divididos em três grupos de seis animais cada e foram administrados com Fator VIII marcado com 125I (i) através de administração intravenosa, (ii) através de administração intradermal ou (iii) através de administração intradermal em combinação com sHASEGP; e então sangue e tecidos processados em vários pontos após dosagem para medir contagens por minuto (CPM) por grama de plasma, essencialmente conforme descrito para o exemplo precedente. Tabela 26-1 Efeitos de rHuPH20 sobre a farmacocinética do Fator VIII
Figure img0029
Figure img0030
[00752] Conforme mostrado na Tabela 26-1, co- administração de Fator VIII com rHuPH20 aumentou significantemente a biodisponibilidade sintética com relação ao Fator VIII sozinho (P<0,01). O uso de precipitação de TCA foi necessário para eliminar a contribuição de proteína Fator VIII marcada com I-125 completamente degradada que entra na corrente sanguínea. EXEMPLO 27 — USO ILUSTRATIVO DE UMA sHASEGP PARA MELHORAR RESULTADOS DE SOBREVIVÊNCIA E/OU COMPORTAMENTAIS SEGUINDO DERRAME
[00753] Em um primeiro conjunto de estudos, sHASEGPs foram avaliadas em um modelo de derrame de rato. Resumidamente, derrame foi cirurgicamente induzido em ratos Sprague-Dawley através de oclusão da artéria cerebral média, seguido em vários momentos pode administração intravenosa ou de uma solução de controle (solução salina) ou uma solução de teste (solução salina compreendendo uma sHASEGP). Os animais foram deixados se recuperarem e foram observados por um período de tempo para avaliar taxas de sobrevivência em grupos de controle versus teste. Ainda, os sobreviventes foram avaliados em uma faixa de pontos de tempo usando análises múltiplas de condições comportamentais tipicamente associadas com derrame. Apenas ratos que se comportaram normalmente em um teste de flexão do da pata dianteira de qualificação foram incluídos no estudo, e foram então aleatoriamente designados para um grupo de animais de controle ou de teste.
[00754] P rocedimentos cirúrgicos assépticos foram realizados pelo Zivic Laboratories essencialmente como segue. Os ratos foram anestesiados em uma câmara fornecida com halotano a 2,5%. Uma incisão de linha média central foi feita e a musculatura foi separada para expor a artéria carótida externa direita, que foi então isolada e duplamente ligada. Uma ligadura de poliamida 5/0 desatada mas constritiva foi então posta em torno do pedaço de tronco da carótida externo. Um pequeno furo foi cortado no lúmen do pedaço do tronco e um comprimento de 18-20 mm de sutura de material de microfilamento 4/0 foi inserido no lúmen e avançado para a artéria carótida interna. Quando completamente avançado, a ponta internalizada do monofilamento deve bloquear fluxo para a artéria cerebral média. A ligadura de poliamida constritiva foi então presa para segurar o monofilamento. Retração foi removida e a incisão da pele fechada com um grampo para ferida.
[00755] Procedimentos de injeção intravenosa foram realizados essencialmente como segue. Os ratos foram anestesiados em uma câmara fornecida com 2,5% de halotano. Uma incisão de pele ventral foi feita para expor a veia jugular. Uma seringa descartável de 1 ml foi provida com uma agulha de 30 gauge e carregada com material de injeção. Usando a clavícula para apoio, a seringa foi inserida da veia jugular (usando pressão negativa leve na seringa para puxar fluxo de sangue para a seringa e então confirmar localização apropriada para injeção IV) e então o material de injeção foi lentamente injetado na veia jugular. Após injeção, a agulha foi lentamente retirada (e qualquer sangramento controlado com um aplicador de algodão estéril) e então a incisão da pele foi fechada com um grampo de ferida.
[00756] Sobrevivênci a de animais nos vários grupos (aproximadamente 40 animais em cada grupo) foi monitorada seguindo indução de derrame, e o número de sobreviventes em cada dia foi então posto em gráfico contra dias seguindo derrame para gerar uma curva de derrame Kaplan- Meier. Diferenças substanciais entre os grupos eram aparentes por volta do 3 dia seguindo o derrame. Por volta de uma semana seguindo a indução de derrame, mais da metade dos animais de controle tinha morrido, enquanto quase três quartos dos animais tratados com sHASEGO tinham sobrevivido, o que era uma diferença estatisticamente significante (p=0,03).
[00757] Em adição às taxas de medição de sobrevivência seguindo derrame, os sobreviventes foram também testados (em 1, 2, 3 e 4 semanas seguindo o derrame) usando outras análises feitas para avaliar a incidência de certos problemas comportamentais associados com derrame. As condições comportamentais avaliadas incluíam flexão da pata dianteira, torção do torso, membro traseiro, distúrbios de modo de andar e caminhada na parece, que foram usados para gerar um escore comportamental PNEGS (escores maiores refletindo um aumento em problemas comportamentais associados com o derrame). Por volta da segunda semana seguindo a indução de derrame, os animais tratados com sHASEGP exibiram escores comportamentais significantemente mais altos (p=0,02), e diferenças relativas entre o grupo tratado e o de controle foram ainda maiores durante as semanas subsequentes (p=0,007 e p=0,003 para três e quatro semanas respectivamente).
[00758] Embo ra a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos acima, será compreendido que modificações e variações são compreendidas dentro do espírito e escopo da invenção. Deste modo, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações que seguem.

Claims (36)

1. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma glicoproteína hialuronidase humana solúvel PEGuilada em um veículo farmacêutico, em que: a composição farmacêutica é formulada para uso em administração intravenosa; a hialuronidase compreende três a seis frações PEG por polipeptídeo; a hialuronidase é neutra ativa; a hialuronidase é solúvel; e a hialuronidase é uma glicoproteína contendo de uma a seis frações de açúcar ligada por N, em que a fração de açúcar ligada por N é covalentemente ligada a um resíduo de asparagina do polipeptídeo.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase compreende uma sequência de aminoácidos que compreende no mínimo a sequência de aminoácidos apresentada como resíduos de aminoácidos 36-464 da SEQ ID NO: 1, e a hialuronidase é truncada no C-terminal do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 1.
3. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase consiste na sequência de aminoácidos apresentada como aminoácidos 36-482 ou 36-483 da SEQ ID NO: 1.
4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase compreende um resíduo de aminoácido C- terminal que é selecionado dentre os resíduos de aminoácido 477, 478, 479, 480, 481 e 482 na sequência de resíduos de aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 1.
5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase é codificada por uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos apresentada como nucleotídeos 106-1446 da SEQ ID NO: 6, ou uma porção desta que codifica um polipeptídeo cataliticamente ativo.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase compreende PH20 humano recombinante (rHuPH20) que é expresso e secretado de células CHO.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que as referidas frações PEG são ramificadas.
8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as referidas frações PEG resultam da reação com um reagente PEG selecionado dentre mPEG-SBA (5kDa), mPEG-SBA (20kDa), mPEG-SBA (30kDa), mPEG-SMB (20kDa) mPEG-SMB (30kDa), mPEG- butiraldeído (30kDa), mPEG-SPA (20kDa), mPEG-SPA (30kDa), mPEG2-NHS (10kDa ramificado), mPEG2-NHS (20kDa ramificado), mPEG2-NHS (40kDa ramificado), mPEG2-NHS (60kDa ramificado), PEG-NHS-biotina (5kDa biotinilado), PEG-p-nitrofenil- carbonato (30kDa) e PEG-propionaldeído (30kDa).
9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser para uso no aumento da liberação ou difusão de um agente farmacológico a um indivíduo.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente farmacológico é selecionado dentre um agente quimioterápico, um agente analgésico, um agente anti-inflamatório, um agente antimicrobiano, um agente amebicida, um agente tricomonocida, um agente antiparkinsoniano, um agente antimalárico, um agente anticonvulsivante, um agente antidepressivo, um agente antiartrítico, um agente antifúngico, um agente anti-hipertensivo, um agente antipirético, um agente antiparasitário, um agente anti- histamínico, um agente agonista alfa-adrenérgico, um agente bloqueador alfa, um agente anestésico, um agente dilatador brônquico, um agente biocida, um agente bactericida, um agente bacteriostático, um agente bloqueador beta adrenérgico, um agente bloqueador do canal de cálcio, um agente fármaco cardiovascular, um agente contraceptivo, um agente descongestionante, um agente diurético, um agente depressor, um agente de diagnóstico, um agente eletrolítico, um agente hipnótico, um agente hormonal, um agente hiperglicêmico, um agente relaxante muscular, um agente contratante muscular, um agente oftálmico, um agente parassimpaticomimético, um agente energizante psíquico, um agente sedativo, um indutor de sono, um agente simpatomimético, um agente tranquilizante, um agente urinário, um agente vaginal, um agente viricida, um agente vitamínico, um agente anti-inflamatório não esteroidal, um agente inibidor da enzima de conversão da angiotensina, um polipeptídeo, uma proteína, um ácido nucleico, um fármaco e uma molécula orgânica.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é selecionado dentre molécula detectável ou outro agente de diagnóstico, ou um agente farmacológico ou farmaceuticamente eficaz.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é um anticâncer ou um agente anti-infeccioso.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é um agente farmacológico modificador do sangue.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é uma molécula ou complexo macromolecular com um diâmetro entre 20 nm e 200 nm.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é selecionado dentre adalimumabe, agalsidase beta, aldesleucina, alefacept, ampicilina, anakinra, vacina antipoliomielítica, antitimócito, azitromicina, becaplermina, caspofungina , cefazolina, cefepima, cefotetan, ceftazidima, ceftriaxona, cetuximab, cilastatina, ácido clavulânico, clindamicina, darbepoetina alfa, deaclizumab, difteria toxóide, efalizumabe, epinefrina, eritropoietina alfa, ertanercept, filgrastima, fluconazol, hormônios folículo-estimulantes, como folitropena alfa e folitropina beta, fosfenitoína, fluconazol, gadodiamida, gadopentetato, gatifloxacina, glatirâmero, GM-CSF, goserelina, granissetron, haemophilus influenza B, haloperidol, vacina contra hepatite A, vacina contra hepatite B, ibritumomabe tiuxetan. Imunoglobulina, vacina contra vírus influenza, infliximabe, insulina, insulina glargina, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfacon-1, interferon alfa-n3, interferon beta, interferon beta-1a, interferon gama, iodixanol, iohexol, lopamidol, ioversol, cetorolac, laronidase, levofloxacina, lidocaína, linezolida, lorazepam, vacina contra sarampo, vacina viral contra sarampo-caxumba-rubéola, medroxiprogesterona, meropenem, metilprednisolona, midazolam, morfina, octreotida, omalizumabe, ondansetron, palivizumabe, pantoprazol, pegaspargase, pegfilgrastim, peg-interferon- alfa-2a, peg-interferon-alfa-2b, pegvisomante, vacina contra coqueluche, piperacilina, vacina pneumocócica e vacina conjugada pneumocócica, prometazina, reteplase, somatropina, sulbactam, sumatriptano, tazobactam, tenecteplase, toxóide purificado do tétano, ticarcilina, tositumomabe, acetonida de triancinolona, vancomicina e vacina contra varicela.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é um antibiótico ou combinação de agentes selecionados dentre aminoglicosídeos; anfenicóis; ansamicinas; carbacefemos; carbapenemos; cefalosporinas ou cefemos; cefamicinas; clavams; lipopeptídeos cíclicos; diaminopirimidinas; cetolídeos; lincosamidas; macrolídeos; monobactamas; nitrofuranos; oxacefemos; oxazolidinonas; penemos, tienamicinas e beta-lactamas diversos; penicilinas; antibióticos polipeptídeos; quinolonas; sulfonamidas; sulfonas; tetraciclinas; e outros antibióticos (tais como clofoctóis, ácidos fusídicos, hexedinas, metenaminas, nitrofurantoínas nitroxolinas, ritipenemos, taurolidinas, xibomóis).
17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é um agente anticâncer ou combinação de agentes selecionados dentre aclacinomicinas, actinomicinas, adriamicinas, ancitabinas, antramicinas, azacitidinas, azasserinas, 6- azauridinas, bisantrenos, bleomicinas, cactinomicinas, carmofures, carmustinas, carubicinas, carzinofilinas, cromomicinas, cisplatinas, cladribinas, citarabinas, dactinomicinas, daunorrubicinas, denopterinas, 6-diazo-5- oxo-L-norleucinaas, doxifluridinas, doxorrubicinas, edatrexatos, emitefurs, enocitabinos, fepirubicinas, fludarabinas, fluorouracils, gemcitabinas, idarubicinas, loxuridinas, menogarilas, 6-mercaptopurinas, metotrexatos, mitramicins, mitomicinas, ácidos micofenólicos, nogalamicinas, olivomicinas, peplomicinas, pirarubicinas, piritreximas, plicamicinas, porfiromicinas, pteropterinas, puromicinas, ácidos retinóicos, estreptonigrinas, estreptozocinas, tagafurs, tamoxifenos, tiamiprinas, tioguaninas, triancinolonas, trimetrexatos, tubercidinas, vinblastinas, vincristinas, zinostatinas e zorubicinas.
18. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por ser para uso no tratamento do câncer.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o câncer é um tumor invasivo.
20. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser para uso tratamento de um distúrbio do olho de mamífero por indução da liquefação do humor vítreo; para o tratamento de distúrbios envolvendo um excesso de glicosaminoglicanos por remoção de glicosaminoglicanos; ou para o tratamento de um mamífero que teve um acidente vascular cerebral ou outra lesão do SNC, melhorando as consequências do acidente vascular cerebral ou outra lesão do SNC.
21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é um anticorpo.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente é um anticorpo monoclonal.
23. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na formulação de um medicamento para aumentar a liberação ou difusão de um agente farmacológico a um indivíduo.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico é selecionado dentre um agente quimioterápico, um agente analgésico, um agente anti-inflamatório, um agente antimicrobiano, um agente amebicida, um agente tricomonocida, um agente antiparkinsoniano, um agente antimalárico, um agente anticonvulsivante, um agente antidepressivo, um agente antiartrítico, um agente antifúngico, um agente anti-hipertensivo, um agente antipirético, um agente antiparasitário, um agente anti- histamínico, um agente agonista alfa-adrenérgico, um agente bloqueador alfa, um agente anestésico, um agente dilatador brônquico, um agente biocida, um agente bactericida, um agente bacteriostático, um agente bloqueador beta adrenérgico, um agente bloqueador do canal de cálcio, um agente fármaco cardiovascular, um agente contraceptivo, um agente descongestionante, um agente diurético, um agente depressor, um agente de diagnóstico, um agente eletrolítico, um agente hipnótico, um agente hormonal, um agente hiperglicêmico, um agente relaxante muscular, um agente contratante muscular, um agente oftálmico, um agente parassimpaticomimético, um agente energizante psíquico, um agente sedativo, um indutor de sono, um agente simpatomimético, um agente tranquilizante, um agente urinário, um agente vaginal, um agente viricida, um agente vitamínico, um agente anti-inflamatório não esteroidal, um agente inibidor da enzima de conversão da angiotensina, um polipeptídeo, uma proteína, um ácido nucleico, um fármaco e uma molécula orgânica.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado dentre molécula detectável ou outro agente de diagnóstico, ou um agente farmacológico ou farmaceuticamente eficaz.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é um anticâncer ou um agente anti-infeccioso.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é um agente farmacológico modificador do sangue.
28. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula ou complexo macromolecular com um diâmetro entre 20 nm e 200 nm.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado dentre adalimumabe, agalsidase beta, aldesleucina, alefacept, ampicilina, anakinra, vacina antipoliomielítica, antitimócito, azitromicina, becaplermina, caspofungina , cefazolina, cefepima, cefotetan, ceftazidima, ceftriaxona, cetuximab, cilastatina, ácido clavulânico, clindamicina, darbepoetina alfa, deaclizumab, difteria toxóide, efalizumabe, epinefrina, eritropoietina alfa, ertanercept, filgrastima, fluconazol, hormônios folículo-estimulantes, como folitropena alfa e folitropina beta, fosfenitoína, fluconazol, gadodiamida, gadopentetato, gatifloxacina, glatirâmero, GM-CSF, goserelina, granissetron, haemophilus influenza B, haloperidol, vacina contra hepatite A, vacina contra hepatite B, ibritumomabe tiuxetan. Imunoglobulina, vacina contra vírus influenza, infliximabe, insulina, insulina glargina, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfacon-1, interferon alfa-n3, interferon beta, interferon beta-1a, interferon gama, iodixanol, iohexol, lopamidol, ioversol, cetorolac, laronidase, levofloxacina, lidocaína, linezolida, lorazepam, vacina contra sarampo, vacina viral contra sarampo-caxumba-rubéola, medroxiprogesterona, meropenem, metilprednisolona, midazolam, morfina, octreotida, omalizumabe, ondansetron, palivizumabe, pantoprazol, pegaspargase, pegfilgrastim, peg- interferon-alfa-2a, peg-interferon-alfa-2b, pegvisomante, vacina contra coqueluche, piperacilina, vacina pneumocócica e vacina conjugada pneumocócica, prometazina, reteplase, somatropina, sulbactam, sumatriptano, tazobactam, tenecteplase, toxóide purificado do tétano, ticarcilina, tositumomabe, acetonida de triancinolona, vancomicina e vacina contra varicela.
30. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é um antibiótico ou combinação de agentes selecionados dentre aminoglicosídeos; anfenicóis; ansamicinas; carbacefemos; carbapenemos; cefalosporinas ou cefemos; cefamicinas; clavams; lipopeptídeos cíclicos; diaminopirimidinas; cetolídeos; lincosamidas; macrolídeos; monobactamas; nitrofuranos; oxacefemos; oxazolidinonas; penemos, tienamicinas e beta- lactamas diversos; penicilinas; antibióticos polipeptídeos; quinolonas; sulfonamidas; sulfonas; tetraciclinas; e outros antibióticos (tais como clofoctóis, ácidos fusídicos, hexedinas, metenaminas, nitrofurantoínas nitroxolinas, ritipenemos, taurolidinas, xibomóis).
31. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é um agente anticâncer ou combinação de agentes selecionados dentre aclacinomicinas, actinomicinas, adriamicinas, ancitabinas, antramicinas, azacitidinas, azasserinas, 6- azauridinas, bisantrenos, bleomicinas, cactinomicinas, carmofures, carmustinas, carubicinas, carzinofilinas, cromomicinas, cisplatinas, cladribinas, citarabinas, dactinomicinas, daunorrubicinas, denopterinas, 6-diazo-5-oxo-L- norleucinaas, doxifluridinas, doxorrubicinas, edatrexatos, emitefurs, enocitabinos, fepirubicinas, fludarabinas, fluorouracils, gemcitabinas, idarubicinas, loxuridinas, menogarilas, 6-mercaptopurinas, metotrexatos, mitramicins, mitomicinas, ácidos micofenólicos, nogalamicinas, olivomicinas, peplomicinas, pirarubicinas, piritreximas, plicamicinas, porfiromicinas, pteropterinas, puromicinas, ácidos retinóicos, estreptonigrinas, estreptozocinas, tagafurs, tamoxifenos, tiamiprinas, tioguaninas, triancinolonas, trimetrexatos, tubercidinas, vinblastinas, vincristinas, zinostatinas e zorubicinas.
32. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na formulação de um medicamento para o tratamento do câncer.
33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor invasivo.
34. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na formulação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio do olho de mamífero por indução da liquefação do humor vítreo; para o tratamento de distúrbios envolvendo um excesso de glicosaminoglicanos por remoção de glicosaminoglicanos; ou para o tratamento de um mamífero que teve um acidente vascular cerebral ou outra lesão do SNC, melhorando as consequências do acidente vascular cerebral ou outra lesão do SNC.
35. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é um anticorpo.
36. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente é um anticorpo monoclonal.
BRPI0608314-5A 2005-02-23 2006-02-23 Composição farmacêutica compreendendo hialuronidase peguilada e seu uso BRPI0608314B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/065,716 US7871607B2 (en) 2003-03-05 2005-02-23 Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US11/065,716 2005-02-23
US11/238,171 2005-09-27
US11/238,171 US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2005-09-27 Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
PCT/US2006/006700 WO2006091871A1 (en) 2005-02-23 2006-02-23 Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0608314A2 BRPI0608314A2 (pt) 2009-12-29
BRPI0608314B1 true BRPI0608314B1 (pt) 2022-10-04

Family

ID=36927767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0608314-5A BRPI0608314B1 (pt) 2005-02-23 2006-02-23 Composição farmacêutica compreendendo hialuronidase peguilada e seu uso

Country Status (21)

Country Link
US (3) US20060104968A1 (pt)
EP (3) EP3045472A1 (pt)
JP (2) JP5366407B2 (pt)
KR (2) KR101179029B1 (pt)
CN (1) CN101163717B (pt)
AU (1) AU2006216545B2 (pt)
BR (1) BRPI0608314B1 (pt)
CA (1) CA2598823C (pt)
CY (1) CY1117104T1 (pt)
DK (1) DK1858926T3 (pt)
EA (1) EA011654B1 (pt)
ES (1) ES2557818T3 (pt)
HU (1) HUE028351T2 (pt)
IL (5) IL311178A (pt)
MX (2) MX2007010279A (pt)
NZ (1) NZ581233A (pt)
PL (1) PL1858926T3 (pt)
PT (1) PT1858926E (pt)
SG (2) SG164386A1 (pt)
SI (1) SI1858926T1 (pt)
WO (1) WO2006091871A1 (pt)

Families Citing this family (681)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7981420B2 (en) 2000-12-22 2011-07-19 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foederung Der Wissenschaften E.V. Therapeutic use of antibodies directed against repulsive guidance molecule (RGM)
CA2508948A1 (en) 2002-12-16 2004-07-15 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (chasegp), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
NZ542873A (en) 2003-03-05 2008-07-31 Halozyme Inc Soluble, neutral-active hyaluronidase activity glycoprotein (sHASEGP) that is produced with high yield in a mammalian expression system by introducing nucleic acids that lack a narrow region encoding amino acids in the carboxy terminus of the human PH20 cDNA
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
WO2004100966A1 (ja) * 2003-05-16 2004-11-25 Bbk Bio Corporation 病態起因物質の生体への接触防止用製剤
US20060004185A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-05 Leese Richard A Peptide antibiotics and peptide intermediates for their prepartion
ES2509872T3 (es) 2005-03-03 2014-10-20 Allergan, Inc. Procedimientos para obtener una toxina clostrídica
CN103145842A (zh) * 2005-06-30 2013-06-12 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2500355A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
NZ612578A (en) 2005-08-19 2014-11-28 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
HRP20140240T4 (hr) 2005-11-30 2017-02-24 Abbvie Inc. Monoklonalna antitijela protiv amiloidnih beta proteina i njihova upotreba
US20070259376A1 (en) * 2005-12-22 2007-11-08 Toru Yoshimura Homocysteine immunoassay
JP2010502224A (ja) * 2006-09-08 2010-01-28 アボット・ラボラトリーズ インターロイキン１３結合タンパク質
AU2007294731B2 (en) 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
US20080160003A1 (en) * 2006-10-31 2008-07-03 University Of Delaware Fertility Enhancement Using Lipid Carriers and Bioactive Molecules
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
CA2678038C (en) * 2007-02-15 2016-10-11 Allergan, Inc. Use of botulinum toxin and enzymes for treating bladder or prostate disorders, or hyperhydrosis
US8895004B2 (en) 2007-02-27 2014-11-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
PE20090329A1 (es) * 2007-05-30 2009-03-27 Abbott Lab Anticuerpos humanizados contra el globulomero ab(20-42) y sus usos
US20090232801A1 (en) * 2007-05-30 2009-09-17 Abbot Laboratories Humanized Antibodies Which Bind To AB (1-42) Globulomer And Uses Thereof
CA2688433A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
EP2033971A1 (de) * 2007-09-06 2009-03-11 Abbott GmbH & Co. KG Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung
KR101680906B1 (ko) 2007-09-26 2016-11-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
IL186598A0 (en) * 2007-10-11 2008-11-03 Mohammad Abdulrazik Composition and method for the treatment or prevention of glaucoma and ocular hypertension
PL2214699T3 (pl) * 2007-11-02 2017-05-31 Grifols Therapeutics Inc. Sposób, kompozycja i wyrób do dostarczania alfa1-antytrypsyny
JP2011517311A (ja) * 2007-11-06 2011-06-02 スチュアート エル ウェグ 麻酔薬組成物、製剤及び使用方法
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
SI4269578T1 (sl) 2008-03-06 2024-07-31 Halozyme, Inc. Sestava topne hialuronidaze
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
WO2009117553A2 (en) * 2008-03-20 2009-09-24 University Of Florida Research Foundation, Inc. Enhancing vessel lesion homing and repair potential of stem cells
BRPI0906261A2 (pt) * 2008-03-31 2015-07-07 Genentech Inc "métodos de diagnóstico de um subtipo de asma em uma amostra de paciente, usos de um agente terapêutico e kits de diagnóstico de um subtipo de asma em uma amostra de paciente"
AU2013201899B2 (en) * 2008-04-14 2015-08-27 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
KR20130116386A (ko) 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
CN101274921B (zh) * 2008-04-28 2010-06-02 长春迈灵生物工程有限公司 一种牛磺罗定的合成方法及药物制剂
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
EP2116556B1 (en) 2008-05-09 2016-03-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201006485A (en) 2008-06-03 2010-02-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2010005527A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-14 Angioblast Systems, Inc. Treatment of eye diseases and excessive neovascularization using a combined therapy
TW201014602A (en) 2008-07-08 2010-04-16 Abbott Lab Prostaglandin E2 binding proteins and uses thereof
CN102149825B (zh) 2008-07-08 2015-07-22 Abbvie公司 前列腺素e2双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2010009129A2 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Methods of treating autoimmune diseases using cd4 antibodies
JP2011528275A (ja) 2008-07-17 2011-11-17 ミセル テクノロジーズ，インク． 薬物送達医療デバイス
CN102239149B (zh) * 2008-10-06 2015-05-13 约翰·霍普金斯大学 喹啉化合物作为血管新生、人类甲硫氨酰氨肽酶、以及sirt1的抑制剂,以及治疗病症的方法
RU2011127198A (ru) * 2008-12-04 2013-01-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
EA022752B1 (ru) 2008-12-09 2016-02-29 Галозим, Инк. Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование
AU2013202000B2 (en) * 2008-12-09 2015-07-30 Halozyme, Inc. Extended soluble PH20 polypeptides and uses thereof
TW201035111A (en) 2008-12-23 2010-10-01 Biosource Pharm Inc Antibiotic compositions for the treatment of gram negative infections
TWI541021B (zh) 2009-03-05 2016-07-11 艾伯維有限公司 Ｉｌ－１７結合蛋白
EP2403523A1 (en) * 2009-03-06 2012-01-11 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloprotease 1 und uses thereof
US8283162B2 (en) 2009-03-10 2012-10-09 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKAII and uses thereof
CA2756386C (en) 2009-03-23 2019-01-15 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
NZ594343A (en) 2009-03-25 2013-10-25 Genentech Inc Novel anti-alpha5beta1 antibodies and uses thereof
SG175077A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
HUE027718T2 (en) * 2009-05-12 2016-10-28 Galenica Ab Oil-in-water emulsion containing mometasone and propylene glycol
WO2010138918A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Hyaluronidase as an adjuvant for increasing the injection volume and dispersion of large diameter synthetic membrane vesicles containing a therapeutic agent
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8263581B2 (en) 2009-07-03 2012-09-11 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
US8513259B2 (en) 2009-07-03 2013-08-20 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
US9345661B2 (en) * 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AR078161A1 (es) * 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
EP2478013B1 (en) 2009-09-16 2018-10-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
HUE028832T2 (en) 2009-09-17 2017-01-30 Baxalta Inc Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, as well as a process for its preparation
BR112012008833A2 (pt) 2009-10-15 2015-09-08 Abbott Lab imunoglobulinas de dominio variavel duplo e usos das mesmas
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011053707A1 (en) * 2009-10-31 2011-05-05 Abbott Laboratories Antibodies to receptor for advanced glycation end products (rage) and uses thereof
MX2012006560A (es) * 2009-12-08 2012-10-05 Abbott Gmbh & Co Kg Anticuerpos monoclonales contra la proteina rgm a para utilizarse en el tratamiento de degeneracion de capa de fibra de nervio retinal.
BR112012013093A2 (pt) 2009-12-21 2017-12-12 Genentech Inc ''formulação farmacêutica aquosa estável, artigo, métodos para estabilizar um anticorpo, para tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, para reduzir a agregação de um anticorpo monoclonal terapêutico e de fabricação de uma formulação farmaceutica, frasco e tanque de aço inoxidável
US9556249B2 (en) 2010-02-18 2017-01-31 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
AR080795A1 (es) 2010-03-24 2012-05-09 Genentech Inc Anticuerpos anti-lrp6 (proteina relacionada con el receptor ldl tipo 6)
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
AR081246A1 (es) 2010-05-14 2012-07-18 Abbott Lab Proteinas de union a il-1
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
RU2577986C2 (ru) 2010-06-18 2016-03-20 Дженентек, Инк. Антитела против axl и способы их применения
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
US8415307B1 (en) 2010-06-23 2013-04-09 Biosource Pharm, Inc. Antibiotic compositions for the treatment of gram negative infections
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2012007495A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies specifically binding to human tslpr and methods of use
WO2012012300A2 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
US8997136B2 (en) 2010-07-22 2015-03-31 Time Warner Cable Enterprises Llc Apparatus and methods for packetized content delivery over a bandwidth-efficient network
US9120862B2 (en) 2010-07-26 2015-09-01 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKA-II and uses thereof
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2013541937A (ja) 2010-08-05 2013-11-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｍｈｃ抗体−抗ウイルス性サイトカイン融合タンパク質
CA2808185A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Genentech, Inc. Antibodies to il-1.beta. and il-18, for treatment of disease
CA2806021C (en) 2010-08-13 2019-05-21 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
EP2603529A1 (en) 2010-08-13 2013-06-19 Roche Glycart AG Anti-tenascin-c a2 antibodies and methods of use
EP3533803B1 (en) 2010-08-14 2021-10-27 AbbVie Inc. Anti-amyloid-beta antibodies
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
KR101603001B1 (ko) 2010-08-25 2016-03-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 Il-18r1에 대한 항체 및 그의 용도
JP2013539364A (ja) 2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
JP6194248B2 (ja) 2010-10-28 2017-09-06 パシラ ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド 非ステロイド性抗炎症薬の徐放性処方物
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
KR20190120439A (ko) 2010-11-08 2019-10-23 제넨테크, 인크. 피하 투여용 항―ｉｌ―6 수용체 항체
WO2012064836A1 (en) 2010-11-10 2012-05-18 Genentech, Inc. Methods and compositions for neural disease immunotherapy
RU2578468C2 (ru) 2010-12-16 2016-03-27 Дженентек, Инк. Способы диагностики и лечения, связанные с ингибированием th2
BR112013014527A2 (pt) 2010-12-20 2017-03-07 Genentech Inc anticorpo isolado, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso do imunoconjugado, método para tratamento de um indivíduo que tem um câncer positivo para mesotelina, para inibição de proliferação de uma célula positiva para mesotelina, para detecção de mesotelina humana em uma amostra biológica e para detectar um câncer positivo para mesotelina
PE20141060A1 (es) 2010-12-21 2014-09-26 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual biespecificas de il-1 alfa y beta y su uso
CN103261230A (zh) 2010-12-22 2013-08-21 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗pcsk9抗体及使用方法
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CA2822481A1 (en) 2011-01-03 2012-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag A pharmaceutical composition of a complex of an anti-dig antibody and digoxigenin that is conjugated to a peptide
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US9602414B2 (en) 2011-02-09 2017-03-21 Time Warner Cable Enterprises Llc Apparatus and methods for controlled bandwidth reclamation
KR20130118941A (ko) 2011-02-10 2013-10-30 로슈 글리카트 아게 면역치료법
MX342034B (es) 2011-02-28 2016-09-12 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
AR085404A1 (es) 2011-02-28 2013-09-25 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno
JP6339371B2 (ja) 2011-03-03 2018-06-06 インペル ニューロファーマ インコーポレイテッド 経鼻薬物送達デバイス
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
CA2828890A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Genentech, Inc. Anti-fgfr4 antibodies and methods of use
RU2013150331A (ru) 2011-04-20 2015-05-27 Рош Гликарт Аг СПОСОБ И УСТРОЙСТВА ДЛЯ рН-ЗАВИСИМОГО ПРОХОЖДЕНИЯ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
EA030462B1 (ru) 2011-05-16 2018-08-31 Дженентек, Инк. Агонисты fgfr1 и способы их применения
US8623666B2 (en) 2011-06-15 2014-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for detecting erythropoietin (EPO) receptor using anti-human EPO receptor antibodies
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
NZ618331A (en) 2011-06-17 2016-04-29 Halozyme Inc Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
CA2839512C (en) 2011-06-17 2018-01-02 Halozyme, Inc. Continuous subcutaneous insulin infusion methods with a hyaluronan-degrading enzyme
CN103649125A (zh) 2011-06-22 2014-03-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 利用包含mhc i类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除靶细胞
SG10201505454SA (en) 2011-07-13 2015-09-29 Abbvie Inc Methods and compositions for treating asthma using anti-il-13 antibodies
MX2014001766A (es) 2011-08-17 2014-05-01 Genentech Inc Anticuerpos de neuregulina y sus usos.
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
JP6060162B2 (ja) 2011-08-23 2017-01-11 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
WO2013040433A1 (en) 2011-09-15 2013-03-21 Genentech, Inc. Methods of promoting differentiation
WO2013040501A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Pharmathene, Inc. Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and uses thereof
JP6041882B2 (ja) 2011-09-23 2016-12-14 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性抗ｅｇｆｒ／抗ｉｇｆ−１ｒ抗体
EP2766034B1 (en) 2011-10-14 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Zymogen activators
BR112014008862A2 (pt) 2011-10-14 2018-08-07 Genentech Inc anticorpo isolado que se liga à htra1, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos e usos
US9358250B2 (en) 2011-10-15 2016-06-07 Genentech, Inc. Methods of using SCD1 antagonists
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
HK1200322A1 (en) 2011-10-24 2015-08-07 Abbvie Inc. Immunobinders directed against sclerostin
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
RU2014121043A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Биспецифические иммуносвязывающие средства, направленные против tnf и il-17
MX2014004991A (es) 2011-10-28 2014-05-22 Genentech Inc Combinaciones terapeuticas y metodos para tratar el melanoma.
SG11201402485UA (en) 2011-11-21 2014-06-27 Genentech Inc Purification of anti-c-met antibodies
CA2855570A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
CA3204283A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
WO2013102144A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptede variants, formulations and uses thereof
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
JP2015506944A (ja) 2012-01-18 2015-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｇｆ１９修飾薬を使用する方法
US9200072B2 (en) 2012-01-18 2015-12-01 Genentech Inc. Anti-LRP5 antibodies and methods of use
EP3369746A1 (en) 2012-01-27 2018-09-05 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
CA2861124A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
KR102148303B1 (ko) 2012-02-11 2020-08-26 제넨테크, 인크. R-스폰딘 전위 및 그의 사용 방법
MX360352B (es) 2012-02-15 2018-10-30 Hoffmann La Roche Cromatografia de afinidad basada en receptores fc.
US9139863B2 (en) 2012-03-16 2015-09-22 Genentech, Inc. Engineered conformationally-stabilized proteins
RU2014141617A (ru) 2012-03-16 2016-05-10 Дженентек, Инк. Сконструированные конформационно-стабилизированные белки
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
CN108686203A (zh) 2012-04-04 2018-10-23 哈洛齐梅公司 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法
WO2013150043A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
US20130281355A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
US9056910B2 (en) 2012-05-01 2015-06-16 Genentech, Inc. Anti-PMEL17 antibodies and immunoconjugates
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
EP2861624A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
HK1209034A1 (en) 2012-06-21 2016-03-24 Indiana University Research And Technology Corporation Incretin receptor ligand polypeptide fc-region fusion polypeptides and conjugates with altered fc-effector function
WO2014001326A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the selection and production of tailor-made, selective and multi-specific therapeutic molecules comprising at least two different targeting entities and uses thereof
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
KR20150030744A (ko) 2012-06-27 2015-03-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 단위를 포함하는 항체 Ｆｃ－영역 접합체의 제조 방법 및 그의 용도
DK2869837T3 (en) 2012-07-04 2016-09-26 Hoffmann La Roche Anti-theophylline antibodies and methods of use
RU2684595C2 (ru) 2012-07-04 2019-04-09 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Ковалентно связанные конъюгаты антиген-антитело
EP2870180B1 (en) 2012-07-04 2024-08-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
CN104428007B (zh) 2012-07-09 2018-03-16 基因泰克公司 包含抗cd22抗体的免疫缀合物
AR091703A1 (es) 2012-07-09 2015-02-25 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-cd22
IN2014DN10652A (pt) 2012-07-09 2015-09-11 Genentech Inc
CN104411337A (zh) 2012-07-09 2015-03-11 基因泰克公司 包含抗cd79b抗体的免疫偶联物
UY34905A (es) 2012-07-12 2014-01-31 Abbvie Inc Proteínas de unión a il-1
SG11201408538PA (en) 2012-07-13 2015-02-27 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
PL2880170T3 (pl) 2012-08-02 2017-02-28 F.Hoffmann-La Roche Ag SPOSÓB WYTWARZANIA ROZPUSZCZALNEGO FcR JAKO FUZJI Fc Z OBOJĘTNYM REGIONEM Fc IMMUNOGLOBULINY I JEGO ZASTOSOWANIA
MY175687A (en) 2012-08-07 2020-07-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
RU2646159C2 (ru) 2012-09-14 2018-03-01 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения и отбора молекул, включающих по меньшей мере две различные группировки, и их применение
CA2884220A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell penetrating peptides which bind irf5
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
TW202037609A (zh) 2012-11-01 2020-10-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
MA38165A1 (fr) 2012-11-08 2018-07-31 Hoffmann La Roche Protéines de liaison à l'antigène her3 se liant à l'épingle à cheveux beta de her3
CN104968367B (zh) 2012-11-13 2018-04-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗血凝素抗体和使用方法
WO2014096015A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Disulfide-linked multivalent mhc class i comprising multi-function proteins
WO2014107745A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Halozyme, Inc. Metal sensitive mutants of matrix metalloproteases and uses thereof
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
JP2016509045A (ja) 2013-02-22 2016-03-24 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんを治療し、薬剤耐性を防止する方法
US20140242083A1 (en) 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
MX2015011428A (es) 2013-03-06 2016-02-03 Genentech Inc Metodos para tratar y prevenir la resistencia a los farmacos para el cancer.
IL225179A (en) * 2013-03-12 2017-01-31 Rogosnitzky Moshe Compounds for use in ocular disorders using dipyridamole
AR095398A1 (es) 2013-03-13 2015-10-14 Genentech Inc Formulaciones con oxidación reducida
AR095399A1 (es) 2013-03-13 2015-10-14 Genentech Inc Formulaciones con oxidación reducida, método
CN110538322A (zh) 2013-03-13 2019-12-06 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体配制剂
MX369671B (es) 2013-03-13 2019-11-15 Genentech Inc Formulaciones con oxidacion reducida.
RU2707550C2 (ru) 2013-03-13 2019-11-27 Дженентек, Инк. Составы со сниженным окислением
JP2016516046A (ja) 2013-03-14 2016-06-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの治療方法及びがん薬物耐性を阻止する方法
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
JP6436965B2 (ja) 2013-03-14 2018-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ４抗体及びイムノコンジュゲート
BR112015023120A2 (pt) 2013-03-15 2017-11-21 Genentech Inc método para identificar um indivíduo com uma doença ou disfunção, método para prever a responsividade de um indivíduo com uma doença ou disfunção, método para determinar a probabilidade de que um indivíduo com uma doença ou disfunção exibirá benefício do tratamento, método para selecionar uma terapia, usos de um antagonista de ligação do eixo pd-l1, ensaio para identificar um indivíduo com uma doença, kit de diagnóstico, método para avaliar uma resposta ao tratamento e método para monitorar a resposta de um indivíduo tratado
CA2905123A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
WO2014150877A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
WO2014145016A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use
KR20150131177A (ko) 2013-03-15 2015-11-24 제넨테크, 인크. 항-CRTh2 항체 및 그의 용도
SG11201507427QA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Genentech Inc Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
BR112015023119A2 (pt) 2013-03-15 2017-11-21 Constellation Pharmaceuticals Inc proteína de fusão, sequência de ácido nucleico, cassete de expressão, célula, método para determinar se um composto teste é um composto inibidor de bromodomínio e kit
WO2014161570A1 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Roche Glycart Ag Antibodies against human il17 and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
WO2014177459A2 (en) 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
MX364861B (es) 2013-04-29 2019-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento de tipo insulinico humano 1 (anti-igf-1r) con abolicion de la union al fcrn y su uso en el tratamiento de enfermedades oculares vasculares.
EP3594240B1 (en) 2013-05-20 2023-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
US10183988B2 (en) 2013-06-07 2019-01-22 Duke University Anti-Complement factor H antibodies
GB2515039B (en) 2013-06-11 2015-05-27 Cilag Gmbh Int Injection Device
GB2517896B (en) 2013-06-11 2015-07-08 Cilag Gmbh Int Injection device
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
WO2015002969A1 (en) * 2013-07-03 2015-01-08 City Of Hope Anticancer combinations
CN104342420B (zh) * 2013-07-30 2017-09-15 惠觅宙 一种重组长效人透明质酸酶、其编码基因、生产方法及应用
JP2016537399A (ja) 2013-09-17 2016-12-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｌｇｒ５抗体を使用する方法
MY175472A (en) 2013-09-27 2020-06-29 Genentech Inc Anti-pdl1 antibody formulations
JP2016537965A (ja) 2013-10-11 2016-12-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｓｐ４阻害剤及び使用方法
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
BR112016008477A2 (pt) 2013-10-18 2017-10-03 Genentech Inc Corpos, ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica e usos do anticorpo
AR098155A1 (es) 2013-10-23 2016-05-04 Genentech Inc Métodos para diagnosticar y tratar trastornos eosinofílicos
LT3071597T (lt) 2013-11-21 2020-10-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Antikūnai prieš alfa-sunukleiną ir jų naudojimo būdai
CA2931978A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Abbvie Inc. Compositions and methods for treating osteoarthritis
SG11201604784XA (en) 2013-12-13 2016-07-28 Genentech Inc Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
JP2017507900A (ja) 2013-12-17 2017-03-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及び抗ｈｅｒ２抗体を使用してｈｅｒ２陽性がんを治療する方法
AU2014364593A1 (en) 2013-12-17 2016-07-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using PD-1 axis binding antagonists and an anti-CD20 antibody
WO2015095423A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
AU2014368696A1 (en) 2013-12-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-Tau(pS422) antibodies and methods of use
EP3082847A1 (en) 2013-12-20 2016-10-26 Indiana University Research and Technology Corporation Lipidated incretin receptor ligand human immunoglobulin fc-region fusion polypeptides
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
EP3089758B1 (en) 2014-01-03 2021-01-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
BR112016014945A2 (pt) 2014-01-03 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugado, formulação farmacêutica e uso
CN105899540B (zh) 2014-01-03 2020-02-07 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及它们作为血脑屏障穿梭物的应用
CA2932547C (en) 2014-01-06 2023-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent blood brain barrier shuttle modules
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
EP3096797A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
EP3102230B1 (en) 2014-02-08 2021-04-28 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating alzheimer's disease
CA2938466C (en) 2014-02-08 2021-11-02 Genentech, Inc. Methods of treating alzheimer's disease
EA201691610A8 (ru) 2014-02-12 2018-05-31 Дженентек, Инк. Анти-jagged1 антитела и способы применения
UA117608C2 (uk) 2014-02-21 2018-08-27 Дженентек, Інк. Спосіб лікування еозинофільного захворювання у пацієнта шляхом застосування біспецифічного анти-il-13/il-17 антитіла
US20150250610A1 (en) * 2014-03-04 2015-09-10 DePuy Synthes Products, LLC Post-Operative Bone Grown Stimulant Introduction Method
BR112016019893B1 (pt) * 2014-03-05 2023-02-14 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Composição
US20150291689A1 (en) 2014-03-09 2015-10-15 Abbvie, Inc. Compositions and Methods for Treating Rheumatoid Arthritis
AR099812A1 (es) 2014-03-21 2016-08-17 Abbvie Inc Anticuerpos y conjugados de anticuerpo y fármaco anti-egfr
CN106103478B (zh) 2014-03-21 2020-04-03 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体体内半寿期的体外预测
WO2015140591A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
KR20160146747A (ko) 2014-03-31 2016-12-21 제넨테크, 인크. 항혈관신생제 및 ox40 결합 효능제를 포함하는 조합 요법
SG11201607969XA (en) 2014-03-31 2016-10-28 Genentech Inc Anti-ox40 antibodies and methods of use
WO2015179658A2 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Genentech, Inc. Anti-gpc3 antibodies and immunoconjugates
RU2016144405A (ru) 2014-05-23 2018-06-26 Дженентек, Инк. MiT БИОМАРКЕРЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US20160002326A1 (en) 2014-06-10 2016-01-07 Abbvie Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis
CN106459202A (zh) 2014-06-11 2017-02-22 豪夫迈·罗氏有限公司 抗LgR5抗体及其用途
CN107073121A (zh) 2014-06-13 2017-08-18 基因泰克公司 治疗及预防癌症药物抗性的方法
BR112016029935A2 (pt) 2014-06-26 2017-10-31 Hoffmann La Roche ?anticorpos anti-brdu, complexo, formulação farmacêutica e uso de anticorpo?
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
CN106488775A (zh) 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
DK4074735T3 (da) 2014-08-28 2025-07-14 Bioatla Inc Betinget aktive kimæriske antigenreceptorer til modificerede t-celler
PT3186281T (pt) 2014-08-28 2019-07-10 Halozyme Inc Terapia de combinação com uma enzima de degradação de hialuronano e um inibidor de pontos de verificação imunológica
MA40579A (fr) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech Inc Anticorps anti-cll-1 et immunoconjugués
SG11201701128YA (en) 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
LT3191135T (lt) 2014-09-12 2020-11-25 Genentech, Inc. Anti-her2 antikūnai ir imunokonjugatai
WO2016040724A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
CN106794247B (zh) 2014-09-15 2022-12-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体配制剂
MX2017003472A (es) 2014-09-17 2017-10-31 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-her2.
HUE049175T2 (hu) 2014-09-23 2020-09-28 Hoffmann La Roche Eljárás anti-CD79b immunkonjugátumok alkalmazására
BR112017007765B1 (pt) 2014-10-14 2023-10-03 Halozyme, Inc Composições de adenosina deaminase-2 (ada2), variantes do mesmo e métodos de usar o mesmo
JP2017536102A (ja) 2014-10-16 2017-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法
DK3215528T3 (da) 2014-11-06 2019-10-07 Hoffmann La Roche Fc-regionvarianter med modificeret FcRn-binding og anvendelsesfremgangsmåder
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
CA2960569A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-Laroche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
CR20170240A (es) 2014-11-10 2018-04-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y sus usos
CN107105632A (zh) 2014-11-10 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 肾病动物模型及其治疗剂
EP3224275B1 (en) 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
SG10201807625PA (en) 2014-11-17 2018-10-30 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
JP6859259B2 (ja) 2014-11-19 2021-04-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＢＡＣＥｌに対する抗体及び神経疾患免疫療法のためのその使用
US10508151B2 (en) 2014-11-19 2019-12-17 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
WO2016081640A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
ES2744540T3 (es) 2014-12-05 2020-02-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-CD79b y procedimientos de uso
KR20170085595A (ko) 2014-12-10 2017-07-24 제넨테크, 인크. 혈뇌 장벽 수용체 항체 및 사용 방법
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP3633371A1 (en) 2014-12-18 2020-04-08 F. Hoffmann-La Roche AG Assay and method for determining cdc eliciting antibodies
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
BR112017011235A2 (pt) 2014-12-19 2018-02-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpos anti-c5 e métodos de uso
CN113956354A (zh) 2015-01-22 2022-01-21 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
MX2017011486A (es) 2015-03-16 2018-06-15 Genentech Inc Métodos de detección y cuantificación de il-13 y sus usos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas a th2.
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
CN107810197B (zh) 2015-04-24 2022-10-25 豪夫迈·罗氏有限公司 鉴定包含结合多肽的细菌的方法
EP3288981A1 (en) 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
EP3097928A1 (fr) * 2015-05-28 2016-11-30 Organes Tissus Régénération Réparation Remplacement Composition pour le traitement des lesions cerebrales
CN107810198B (zh) 2015-05-29 2021-09-03 艾伯维公司 抗cd40抗体及其用途
HK1250723A1 (zh) 2015-05-29 2019-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag 人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法
HK1249016A1 (zh) 2015-06-02 2018-10-26 豪夫迈‧罗氏有限公司 使用抗il-34抗体治疗神经疾病的组合物和方法
NZ775762A (en) 2015-06-05 2025-02-28 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
MX2017015937A (es) 2015-06-08 2018-12-11 Genentech Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40 y antagonistas de unión al eje de pd-1.
JP2018521019A (ja) 2015-06-08 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体を使用して癌を治療する方法
WO2016202713A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Method of freezing protein solutions
CN108064246A (zh) 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
DK3310814T5 (da) 2015-06-16 2024-10-07 Hoffmann La Roche Humaniserede og affinitetsmodnede antistoffer mod FcRH5 og fremgangsmåder til anvendelse
KR102689256B1 (ko) 2015-06-17 2024-07-30 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 사용하여 국소적 진행성 또는 전이성 유방암을 치료하는 방법
CN107787331B (zh) 2015-06-17 2022-01-11 豪夫迈·罗氏有限公司 抗her2抗体和使用方法
HUE057952T2 (hu) 2015-06-24 2022-06-28 Hoffmann La Roche Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással
CN107531788B (zh) 2015-06-24 2022-06-21 豪夫迈·罗氏有限公司 对her2和血脑屏障受体特异性的三特异性抗体及使用方法
WO2016207245A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
CN108026180B (zh) 2015-08-28 2022-06-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗羟腐胺赖氨酸抗体及其用途
JP2018526404A (ja) 2015-09-11 2018-09-13 アッヴィ・インコーポレイテッド 再発型の多発性硬化症を治療するための方法
UA120981C2 (uk) 2015-09-18 2020-03-10 Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся Антитіло, що зв'язується з il-8, та його застосування
PE20181363A1 (es) 2015-09-23 2018-08-27 Genentech Inc Variantes optimizadas de anticuerpos anti-vegf
AU2016326689A1 (en) 2015-09-24 2018-03-22 Genentech, Inc. Methods for the treatment of epilepsy
JP6955487B2 (ja) 2015-09-24 2021-10-27 アブビトロ， エルエルシー Ｈｉｖ抗体組成物および使用方法
PE20181046A1 (es) 2015-09-25 2018-07-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-tigit y metodos de uso
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
TWI873952B (zh) 2015-10-02 2025-02-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 雙特異性抗‐人類cd20/人類轉鐵蛋白受體抗體及使用方法
ES2895034T3 (es) 2015-10-02 2022-02-17 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-PD1 y procedimientos de uso
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
AU2016334623A1 (en) 2015-10-07 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory TNF receptor
EP3365025B1 (en) 2015-10-20 2020-07-15 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
HRP20220064T1 (hr) 2015-10-30 2022-04-15 F. Hoffmann - La Roche Ag Zglobno modificirani fragmenti protutijela i postupci za pripravu
US10407510B2 (en) 2015-10-30 2019-09-10 Genentech, Inc. Anti-factor D antibodies and conjugates
ES2892972T3 (es) 2015-11-02 2022-02-07 Univ Texas Métodos de activación de CD40 y bloqueo de punto de control inmunitario
WO2017078839A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Bioatla, Llc Conditionally active polypeptides
CN118725134A (zh) 2015-11-08 2024-10-01 豪夫迈·罗氏有限公司 筛选多特异性抗体的方法
WO2017087851A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using b-raf inhibitors and immune checkpoint inhibitors
WO2017096363A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Reporter system for detecting and targeting activated cells
AR107078A1 (es) 2015-12-18 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo antimiostatina, polipéptidos que contienen regiones fc variantes así como métodos de uso
HUE065073T2 (hu) 2015-12-18 2024-04-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-C5 antitestek és alkalmazási eljárások
JP7046814B2 (ja) 2015-12-30 2022-04-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド タンパク質製剤のためのトリプトファン誘導体の使用
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
US20190016791A1 (en) 2016-01-20 2019-01-17 Genentech, Inc. High dose treatments for alzheimer's disease
KR102476846B1 (ko) 2016-02-05 2022-12-12 주식회사 헬릭스미스 항―ｃ―ＭＥＴ 항체 및 이의 용도
EP3423491A1 (en) 2016-03-01 2019-01-09 H. Hoffnabb-La Roche Ag Obinutuzumab variants having altered cell death induction
US11767362B1 (en) 2016-03-15 2023-09-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-GPC3 antibodies
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
US11324739B2 (en) 2016-03-31 2022-05-10 Jiangsu Yahong Meditech Co., Ltd. Combinational uses of nitroxoline and its analogues with chemotherapies and immunotherapies in the treatment of cancers
EP3865511A1 (en) 2016-04-14 2021-08-18 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-rspo3 antibodies and methods of use
SMT202600033T1 (it) 2016-04-15 2026-03-09 Bioatla Inc Anticorpi anti-axl, frammenti di anticorpo e loro immunoconiugati e loro utilizzi
KR102624967B1 (ko) * 2016-04-29 2024-01-16 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
JP7131773B2 (ja) 2016-04-29 2022-09-06 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ホルモン受容体に関連する転写活性の標的尺度
WO2017191101A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The contorsbody - a single chain target binder
WO2017194442A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
JP7089483B2 (ja) 2016-05-11 2022-06-22 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
PL3455261T3 (pl) 2016-05-13 2022-12-12 Bioatla, Inc. Przeciwciała anty-ror2, fragmenty przeciwciał, ich immunokoniugaty oraz ich zastosowania
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
EP3464372A1 (en) 2016-06-01 2019-04-10 AbbVie Inc. Anti-repulsive guidance molecule a (rgma) antagonistic antibodies for treating spinal cord injury and pain
WO2017214024A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
AU2017276604B2 (en) 2016-06-06 2020-02-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Fusion proteins for ophthalmology with increased eye retention
WO2017214322A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Abbvie Inc. Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
JP2019524651A (ja) 2016-06-08 2019-09-05 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ９８抗体及び抗体薬物コンジュゲート
AU2017279550A1 (en) 2016-06-08 2019-01-03 Abbvie Inc. Anti-B7-H3 antibodies and antibody drug conjugates
KR102376582B1 (ko) 2016-06-17 2022-03-18 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체 및 사용 방법
JP7133477B2 (ja) 2016-06-24 2022-09-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ポリユビキチン多重特異性抗体
WO2018007314A1 (en) 2016-07-04 2018-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel antibody format
US20190154648A1 (en) * 2016-07-20 2019-05-23 Chesapeake Therapeutics, Llc Methods of attenuating drug excipient cross reactivity
US20190185578A1 (en) 2016-07-29 2019-06-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody exhibiting increased alternative fviii-cofactor-function activity
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
WO2018029124A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
PT3528838T (pt) 2016-09-23 2023-09-04 Hoffmann La Roche Utilizações de antagonistas de il-13 para tratamento de dermatite atópica
EP3516396B1 (en) 2016-09-26 2024-11-13 F. Hoffmann-La Roche AG Predicting response to pd-1 axis inhibitors
WO2018081648A2 (en) 2016-10-29 2018-05-03 Genentech, Inc. Anti-mic antibidies and methods of use
MY200695A (en) 2016-11-03 2024-01-11 Bristol Myers Squibb Co Activatable anti-ctla-4 antibodies and uses thereof
EP3538112B1 (en) 2016-11-09 2026-02-25 Musc Foundation for Research Development Cd38-nad+ regulated metabolic axis in anti-tumor immunotherapy
JP7784795B2 (ja) 2016-11-15 2025-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
KR102771603B1 (ko) 2016-11-17 2025-02-24 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 Egfr 또는 her2 엑손 20 돌연변이를 갖는 암 세포에 대한 항종양 활성을 갖는 화합물
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
EP3541815A4 (en) 2016-11-18 2020-07-15 Pacira Pharmaceuticals, Inc. ZINC MELXICAM COMPLEX MICROPARTICLE MULTIVESICULAR LIPOSOME FORMULATIONS AND METHODS OF MAKING THE SAME
EP4015532A1 (en) 2016-11-21 2022-06-22 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
EP3544628A4 (en) 2016-11-23 2020-11-18 Immunoah Therapeutics, Inc. 4-1BB BINDING PROTEINS AND THEIR USES
KR20190091192A (ko) * 2016-12-01 2019-08-05 라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드 신경 손상의 병용 치료제
UA128383C2 (uk) 2016-12-07 2024-07-03 Дженентек, Інк. Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування
MX2019006330A (es) 2016-12-07 2019-09-26 Genentech Inc Anticuerpos anti-tau y metodos de uso.
EP3551663A1 (en) 2016-12-12 2019-10-16 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-pd-l1 antibodies and antiandrogens
WO2018112235A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a smad7 inhibitor
US20200253506A1 (en) 2016-12-14 2020-08-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
JP2020502126A (ja) 2016-12-14 2020-01-23 プロジェニティ， インコーポレイテッド 消化管疾病のｊａｋ阻害薬による治療
US11426566B2 (en) 2016-12-14 2022-08-30 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a TLR modulator
CN117045784A (zh) 2016-12-14 2023-11-14 比奥拉治疗股份有限公司 使用利用可摄入装置释放的il-12/il-23抑制剂治疗胃肠道疾病
WO2018112237A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-6r inhibitor
EP3554541B1 (en) 2016-12-14 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
JP2020513280A (ja) 2016-12-14 2020-05-14 プロジェニティ， インコーポレイテッド 消化管疾病の免疫抑制剤による治療
CN110430801B (zh) 2016-12-14 2024-04-30 比奥拉治疗股份有限公司 使用tnf抑制剂治疗胃肠道疾病
CA3046093A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-1 inhibitor
AU2017380981B2 (en) 2016-12-19 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1BB (CD137) agonists
KR102692708B1 (ko) 2016-12-20 2024-08-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체 및 4-1bb(cd137) 작용물질의 병용 요법
JP6931058B2 (ja) 2016-12-21 2021-09-01 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 抗体のインビトロ糖鎖工学における酵素の再使用
KR102317884B1 (ko) 2016-12-21 2021-10-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 항체의 시험관 내 당조작
CN117887794A (zh) 2016-12-21 2024-04-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于体外糖工程化抗体的方法
AU2017382281B2 (en) 2016-12-22 2024-07-11 Genentech, Inc. Methods and formulations for reducing reconstitution time of lyophilized polypeptides
WO2018127473A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
TW202508629A (zh) 2017-01-17 2025-03-01 美商建南德克公司 皮下her2抗體調配物
JP6995127B2 (ja) 2017-02-10 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トリプターゼ抗体、その組成物、及びその使用
MA49279A (fr) 2017-03-22 2020-02-05 Hoffmann La Roche Compositions d'anticorps optimisées pour le traitement de troubles oculaires
EP3601337A1 (en) 2017-03-28 2020-02-05 Genentech, Inc. Methods of treating neurodegenerative diseases
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
WO2018183941A2 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with live biotherapeutics
CA3054156A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with il-10 or an il-10 agonist
CA3054159A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chst15 inhibitor
WO2018183929A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
WO2018183932A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a il-13 inhibitor
JP6997209B2 (ja) 2017-04-04 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ４０およびｆａｐに特異的に結合することができる新規な二重特異性抗原結合分子
EP4516809A3 (en) 2017-04-05 2025-09-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
KR102294136B1 (ko) 2017-04-05 2021-08-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-lag3 항체
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CN110505883A (zh) 2017-04-13 2019-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 供治疗癌症的方法中使用的白介素-2免疫缀合物,cd40激动剂,和任选地pd-1轴结合拮抗剂
KR20200005540A (ko) 2017-04-14 2020-01-15 제넨테크, 인크. 암의 진단 및 치료 방법
SG11201909331UA (en) 2017-04-18 2019-11-28 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Antigen-specific immune effector cells
EP3624820A1 (en) 2017-04-21 2020-03-25 H. Hoffnabb-La Roche Ag Use of klk5 antagonists for treatment of a disease
SG11201909395TA (en) 2017-04-27 2019-11-28 Tesaro Inc Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
TWI797124B (zh) 2017-05-05 2023-04-01 香港商安立璽榮生醫(香港)有限公司 抗干擾素-γ之抗體及其應用
WO2018210898A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Reduction of application-related side reaction of a therapeutic antibody
EP3630827A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Administration routes for immune agonists
EP3418302A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 F. Hoffmann-La Roche AG Administration routes for immune agonists
CA3177086A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
MX2020000903A (es) 2017-08-11 2020-07-22 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd8 y usos de los mismos.
US20200306516A1 (en) 2017-08-14 2020-10-01 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with glatiramer or a pharmaceutically acceptable salt thereof
NZ762376A (en) 2017-09-19 2022-08-26 Scherrer Inst Paul Transglutaminase conjugation method and linker
WO2019059411A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha DOSAGE FOR POLYTHERAPY USING PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS AND GPC3 TARGETING AGENT
US11491212B1 (en) 2017-09-27 2022-11-08 Catalyst Biosciences, Inc. Subcutaneous administration of modified factor IX polypeptides and treatment of hemophilia B
PE20210005A1 (es) 2017-09-29 2021-01-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno multiespecifica que tiene actividad de sustitucion de la funcion de cofactor del factor viii de coagulacion de sangre (fviii) y formulacion farmaceutica que contiene tal molecula como ingrediente activo
AU2018352308B2 (en) 2017-10-16 2025-06-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-tau antibodies and uses thereof
JP7438942B2 (ja) 2017-10-30 2024-02-27 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 単一特異性抗体から多重特異性抗体をインビボ生成させるための方法
WO2019086394A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The compbody - a multivalent target binder
BR112020007630A2 (pt) 2017-11-01 2020-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpo biespecífico ox40, produto farmacêutico, composição farmacêutica e anticorpos biespecíficos anti-fap/ anti-ox40
MX2020004196A (es) 2017-11-01 2020-11-09 Hoffmann La Roche Trifab-contorsbody.
JP2021500902A (ja) 2017-11-01 2021-01-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規ｔｎｆファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
MY205342A (en) 2017-11-01 2024-10-16 Hoffmann La Roche Bispecific 2+1 contorsbodies
WO2019094360A1 (en) 2017-11-07 2019-05-16 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Targeting lilrb4 with car-t or car-nk cells in the treatment of cancer
EP4640703A3 (en) 2017-11-14 2026-04-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibodies and methods of use
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
US20190211098A1 (en) 2017-12-22 2019-07-11 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
EP3731864A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche SA Anti-vegf antibodies and methods of use
CN107957403B (zh) * 2017-12-30 2021-03-23 广东药科大学 一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法测定壳聚糖含量的方法
AU2019205090A1 (en) 2018-01-05 2020-08-06 Ac Immune Sa Misfolded TDP-43 binding molecules
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
EP3740505A1 (en) 2018-01-16 2020-11-25 Lakepharma Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
CN112020365A (zh) 2018-01-26 2020-12-01 豪夫迈·罗氏有限公司 组合物和使用方法
WO2019147824A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a pde4 inhibitor
CR20200327A (es) 2018-01-26 2020-11-05 Genentech Inc Proteínas de fusión fc il-22 y métodos de uso
JP7350756B2 (ja) 2018-02-14 2023-09-26 アバ セラピューティクス アーゲー 抗ヒトｐｄ－ｌ２抗体
KR20200123118A (ko) 2018-02-21 2020-10-28 제넨테크, 인크. IL-22 Fc 융합 단백질로 치료를 위한 투약
CN111836831A (zh) 2018-02-26 2020-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于抗tigit拮抗剂抗体和抗pd-l1拮抗剂抗体治疗的给药
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
EP3765489B1 (en) 2018-03-13 2024-10-16 F. Hoffmann-La Roche AG Therapeutic combination of 4-1bb agonists with anti-cd20 antibodies
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN112119090B (zh) 2018-03-15 2023-01-13 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
AU2019243738B2 (en) 2018-03-27 2024-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds with anti-tumor activity against cancer cells bearing HER2 exon 19 mutations
SG11202007961QA (en) 2018-04-13 2020-09-29 Hoffmann La Roche Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
CA3097396A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Baylor College Of Medicine Reprogramming cd4 t cells into cytotoxic cd8 cells by forced expression of cd8ab and class 1 restricted t cell receptors
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
CN108690119B (zh) * 2018-06-04 2022-04-19 莎穆(上海)生物科技有限公司 一种伊文思蓝修饰的多肽类前药及其制备和应用
WO2019235426A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 中外製薬株式会社 細胞質内での半減期が変化した抗原結合分子
US20210363233A1 (en) 2018-06-20 2021-11-25 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20230033021A1 (en) 2018-06-20 2023-02-02 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
US20230312700A1 (en) 2018-06-20 2023-10-05 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor
WO2019246273A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a jak or other kinase inhibitor
MY205645A (en) 2018-06-23 2024-11-02 Genentech Inc Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
WO2020007817A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific agonistic 4-1bb antigen binding molecules
WO2020018789A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
MX2021000745A (es) 2018-07-20 2021-03-26 Surface Oncology Inc Composiciones anti-cd112r y metodos.
MX2020009824A (es) 2018-07-25 2021-01-15 Alteogen Inc Nuevas variantes de hialuronidasa y composicion farmaceutica que comprende la misma.
KR102898177B1 (ko) 2018-08-08 2025-12-10 제넨테크, 인크. 단백질 제제를 위한 트립토판 유도체 및 l-메티오닌의 용도
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
KR102739487B1 (ko) 2018-09-21 2024-12-10 제넨테크, 인크. 3중-음성 유방암에 대한 진단 방법
WO2020070041A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212
CN112654641A (zh) 2018-10-01 2021-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 具有与cd40的三价结合的双特异性抗原结合分子
MY195550A (en) 2018-10-29 2023-01-31 Hoffmann La Roche Antibody Formulation
US20210388070A1 (en) 2018-10-30 2021-12-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions
CN113316590B (zh) 2018-11-16 2025-02-28 百时美施贵宝公司 抗nkg2a抗体及其用途
EP3883955A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Board of Regents, The University of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
JP7520008B2 (ja) 2018-11-23 2024-07-22 ビラ セラピューティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｖｓｖキメラベクター
US20220031628A1 (en) 2018-11-27 2022-02-03 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nanoparticles for preparing regulatory b cells
MX2021006208A (es) 2018-11-28 2021-10-01 Univ Texas Edición por multiplexación del genoma de células inmunitarias para mejorar la funcionalidad y resistencia al entorno supresor.
MX2021006393A (es) 2018-11-29 2021-10-13 Univ Texas Metodos para expansion ex vivo de celulas exterminadoras naturales y uso de las mismas.
EP4198057A1 (en) 2018-12-05 2023-06-21 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods and compositions for cancer immunotherapy
WO2020115108A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Sørlandet Sykehus Hf Egfr inhibitors and their use in the treatment of neuroathic pain
BR112021010908A2 (pt) 2018-12-06 2021-08-31 Genentech, Inc. Método para tratamento de linfoma difuso de grandes células b, kit e imunoconjugado
AR117453A1 (es) 2018-12-20 2021-08-04 Genentech Inc Fc de anticuerpos modificados y métodos para utilizarlas
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
EP3898671A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody that binds to vegf and il-1beta and methods of use
CA3120474A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
UA128001C2 (uk) 2018-12-21 2024-03-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Націлені на пухлину агоністичні cd28-антигензв'язувальні молекули
WO2020127628A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted superagonistic cd28 antigen binding molecules
US20220073630A1 (en) 2018-12-28 2022-03-10 Hoffmann-La Roche, Inc. A peptide-mhc-i-antibody fusion protein for therapeutic use in a patient with amplified immune response
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CA3123872A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Catalyst Biosciences, Inc. Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
AU2020208193A1 (en) 2019-01-14 2021-07-29 BioNTech SE Methods of treating cancer with a PD-1 axis binding antagonist and an RNA vaccine
BR112021014276A2 (pt) 2019-01-22 2021-09-28 Genentech, Inc. Anticorpos iga isolados, moléculas de fusão igg-iga isoladas, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, para tratar um indivíduo, para aumentar a expressão de dímeros, trímeros ou tetrâmeros, para aumentar a produção de polímeros, para aumentar a produção de dímeros, para aumentar a produção de um polímero, para diminuir a produção de polímeros, para aumentar a expressão transitória de um anticorpo, para expressar dímeros de moléculas de fusão, para expressar dímeros, trímeros ou tetrâmeros, para purificar um anticorpo, para purificar um estado oligomérico de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
WO2020153467A1 (ja) 2019-01-24 2020-07-30 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
GB2599228B (en) 2019-02-21 2024-02-07 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
WO2020176748A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-cd20 or anti-cd38 antibodies
CN113490682A (zh) 2019-02-28 2021-10-08 豪夫迈·罗氏有限公司 抗菌肽及其使用方法
CN113507942A (zh) 2019-03-05 2021-10-15 豪夫迈·罗氏有限公司 分子的细胞内靶向
EP3938403A1 (en) 2019-03-14 2022-01-19 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
CA3128571A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Paul Scherrer Institut Transglutaminase conjugation method with a glycine based linker
KR102650991B1 (ko) 2019-03-25 2024-03-27 (주)알테오젠 인간 히알루로니다제 ph20의 변이체와 약물을 포함하는 피하투여용 약학 조성물
JP7301155B2 (ja) 2019-04-12 2023-06-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト リポカリンムテインを含む二重特異性抗原結合分子
BR112021020867A2 (pt) 2019-04-19 2022-01-04 Genentech Inc Anticorpos, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, usos do anticorpo, método de tratamento de um indivíduo com câncer e método para reduzir a depuração
CN114269376A (zh) 2019-05-03 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用抗pd-l1抗体治疗癌症的方法
JP7556502B2 (ja) 2019-05-09 2024-09-26 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ヘパトサイトの作製方法
AU2020275415B2 (en) 2019-05-14 2026-01-15 Genentech, Inc. Methods of using anti-CD79B immunoconjugates to treat follicular lymphoma
EP4696320A2 (en) 2019-05-15 2026-02-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibody
AU2020278907A1 (en) 2019-05-23 2022-01-20 Ac Immune Sa Anti-TDP-43 binding molecules and uses thereof
KR20220025848A (ko) 2019-06-26 2022-03-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 Cea 및 4-1bbl에 결합하는 항체의 융합
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
MX2022000111A (es) 2019-07-10 2022-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moleculas de union a claudina-6 y usos de las mismas.
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
WO2021023289A1 (en) * 2019-08-07 2021-02-11 JelloX Biotech Inc. Composition and method for rendering biological material
JP7792330B2 (ja) 2019-09-03 2025-12-25 アムジエン・インコーポレーテツド Ｉｌ－２２の経口、直腸内、又は他の消化管関連の組成物及びそれを使用する方法
TWI873176B (zh) 2019-09-04 2025-02-21 美商建南德克公司 Ｃｄ８結合劑及其用途
EP4028048A1 (en) 2019-09-09 2022-07-20 F. Hoffmann-La Roche AG Glucocerebrosidase mutants
PH12022550646A1 (en) 2019-09-18 2023-04-03 Genentech Inc Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
JP2022548978A (ja) 2019-09-27 2022-11-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 薬抗ｔｉｇｉｔ及び抗ｐｄ－ｌ１アンタゴニスト抗体を用いた処置のための投薬
WO2021076196A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
US20220380765A1 (en) 2019-11-02 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
KR20220092580A (ko) 2019-11-06 2022-07-01 제넨테크, 인크. 혈액암의 치료를 위한 진단과 치료 방법
CA3159964A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
KR20220113414A (ko) 2019-12-09 2022-08-12 제넨테크, 인크. 항-pd-l1 항체 제제
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
AU2020403913B2 (en) 2019-12-18 2024-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-CCL2 antibodies
UA128549C2 (uk) 2019-12-27 2024-08-07 Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся Антитіло до ctla-4 та його застосування
AU2020416273A1 (en) 2020-01-03 2022-07-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
CN114929734A (zh) 2020-01-09 2022-08-19 豪夫迈·罗氏有限公司 新型含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021154414A2 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Catalyst Biosciences, Inc. Gene therapy for hemophilia b with a chimeric aav capsid vector encoding modified factor ix polypeptides
MX2022009391A (es) 2020-01-31 2022-09-26 Genentech Inc Metodos para inducir linfocitos t especificos para neoepitopo con un antagonista de union al eje de pd-1 y una vacuna de arn.
US20230190881A1 (en) 2020-02-17 2023-06-22 Biotest Ag Subcutaneous administration of factor viii
WO2021177980A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Genentech, Inc. Combination therapy for cancer comprising pd-1 axis binding antagonist and il6 antagonist
CN117551194A (zh) 2020-03-19 2024-02-13 基因泰克公司 同种型选择性抗TGF-β抗体及使用方法
AU2021242249A1 (en) 2020-03-24 2022-08-18 Genentech, Inc. Tie2-binding agents and methods of use
CN115397850A (zh) 2020-03-30 2022-11-25 豪夫迈·罗氏有限公司 与vegf和pdgf-b结合的抗体及其使用方法
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
CN111529685A (zh) * 2020-04-21 2020-08-14 厦门诺康得生物科技有限公司 抗呼吸道病毒感染的鼻腔喷雾制剂
CN115916822A (zh) 2020-04-24 2023-04-04 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物的方法
KR20230012539A (ko) 2020-05-13 2023-01-26 디스크 메디슨, 인크. 골수섬유증을 치료하기 위한 항-헤모주벨린 (hjv) 항체
WO2021243204A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 23Andme, Inc. Anti-cd200r1 antibodies and methods of use thereof
EP4157866A2 (en) 2020-06-01 2023-04-05 Genentech, Inc. Methods for making extracellular vesicles and uses thereof
PE20240080A1 (es) 2020-06-08 2024-01-16 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso
AU2021293038A1 (en) 2020-06-16 2023-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
KR20230024368A (ko) 2020-06-18 2023-02-20 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 pd-1 축 결합 길항제를 사용한 치료
WO2021259880A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Almirall, S.A. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
AU2021295549A1 (en) 2020-06-23 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic CD28 antigen binding molecules targeting Her2
JP2023532122A (ja) 2020-06-29 2023-07-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペルツズマブにトラスツズマブを加えた固定用量配合剤
CR20230076A (es) 2020-07-10 2023-03-13 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a células cancerosas y dirigen radionucleótidos a dichas células
JP2023533813A (ja) 2020-07-14 2023-08-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 一定用量配合剤のアッセイ
IL299205A (en) 2020-07-17 2023-02-01 Geron Corp Subcutaneous telomerase inhibitor preparations and methods of using them
CN111944059B (zh) * 2020-07-28 2022-03-01 中国农业大学 一种兼具抗菌、免疫调节、抗感染和抗炎活性的多功能杂合肽及其制备方法和应用
US12221638B2 (en) 2020-08-07 2025-02-11 Alteogen Inc. Method for producing recombinant hyaluronidase
TW202221026A (zh) 2020-08-14 2022-06-01 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途
CN111903668A (zh) * 2020-09-10 2020-11-10 黑龙江八一农垦大学 一种多功能猪精液稀释粉及其应用
IL301269A (en) 2020-09-14 2023-05-01 Ichnos Sciences S A Antibodies that bind to IL1RAP and their uses
KR20230069211A (ko) 2020-09-18 2023-05-18 아라리스 바이오테크 아게 아미노산-기반 링커를 사용한 트란스글루타미나제 접합 방법
KR20230104611A (ko) 2020-09-30 2023-07-10 드렌 바이오, 인크. 항-cd94 항체 및 이의 사용 방법
EP4229082A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 AC Immune SA Antibodies binding to alpha-synuclein for therapy and diagnosis
WO2022084210A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1 axis binding antagonists and lrrk2 inhitibors
WO2022084400A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof
KR20230096052A (ko) 2020-10-25 2023-06-29 아라리스 바이오테크 아게 항체-링커 접합체를 생성하기 위한 수단 및 방법
JP2023550596A (ja) 2020-11-02 2023-12-04 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 運動ニューロン神経変性障害の治療のための抗ｔｒｅｍ１中和抗体の使用
JP7716473B2 (ja) 2020-11-04 2025-07-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の皮下投薬
AU2021374594B2 (en) 2020-11-04 2026-03-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
MX2023007133A (es) 2020-12-17 2023-06-27 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de estos.
US20220233693A1 (en) 2020-12-28 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibody Compositions and Methods of Use Thereof
JP2024501029A (ja) 2020-12-28 2024-01-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｐｄ１／ｐｄ－ｌ１抗体の皮下投与
CA3204291A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
JP2024504493A (ja) 2021-01-28 2024-01-31 ヴァクスィーンヴェント ゲーエムベーハー Ｂ細胞媒介性免疫応答を調節するための方法及び手段
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
WO2022169872A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
WO2022192647A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
TW202305009A (zh) 2021-04-08 2023-02-01 美商默沙東有限責任公司 以皮下投予抗pd1抗體治療癌症之方法
US20220332822A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Tiziana Life Sciences Plc Subcutaneous administration of antibodies for the treatment of disease
CA3217028A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Baylor College Of Medicine Methods of engineering immune cells having reduced fratricidal activity
CN117242173A (zh) 2021-05-03 2023-12-15 安斯泰来再生医药协会 产生成熟角膜内皮细胞的方法
US20240191186A1 (en) 2021-05-05 2024-06-13 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods and compositions for ipsc-derived microglia
WO2022235869A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods of generating mature hepatocytes
TW202306994A (zh) 2021-06-04 2023-02-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ddr2抗體及其用途
TWI879694B (zh) 2021-06-25 2025-04-01 日商中外製藥股份有限公司 抗ctla-4抗體的用途
AR126220A1 (es) 2021-06-25 2023-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-ctla-4
EP4373859A1 (en) 2021-07-22 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Heterodimeric fc domain antibodies
CN117794953A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗体及使用方法
IL310550A (en) 2021-08-04 2024-03-01 Univ Colorado Regents LAT-activating chimeric antigen receptor T cells and methods of using them
WO2023034750A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
US20230183644A1 (en) 2021-09-10 2023-06-15 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Compositions of induced pluripotent stem cell-derived cells and methods of use thereof
KR20240055077A (ko) 2021-09-14 2024-04-26 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 히알루로니데이스를 이용한 농축된 항체 제형의 촉진된 전달
WO2023053282A1 (ja) 2021-09-29 2023-04-06 中外製薬株式会社 がんの治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
EP4413998A4 (en) 2021-10-08 2026-02-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR PREPARING A PRE-FILLED SYRINGE FORMULATION
WO2023072934A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Araris Biotech Ag Methods for producing antibody-linker conjugates
CA3235390A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Deepika Rajesh Dopaminergic neurons comprising mutations and methods of use thereof
US20250251400A1 (en) 2021-11-05 2025-08-07 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal Antibodies Against Carcinoembryonic Antigens, and Their Uses
TW202337494A (zh) 2021-11-16 2023-10-01 美商建南德克公司 用莫蘇妥珠單抗治療全身性紅斑狼瘡（ｓｌｅ）之方法及組成物
AU2022390134A1 (en) 2021-11-16 2024-05-16 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
KR20240116755A (ko) 2021-12-17 2024-07-30 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항-ox40 항체, 다중 특이적 항체 및 이의 사용 방법
CA3243689A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Ac Immune Sa Humanized Anti-TDP-43 Bonding Molecules and Their Uses
KR20240150807A (ko) 2022-02-22 2024-10-16 아라리스 바이오테크 아게 2개 이상의 페이로드를 포함하는 펩티드 링커
US20260043816A1 (en) 2022-04-08 2026-02-12 Ac Immune Sa Anti-TDP-43 Binding Molecules
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
US20250257123A1 (en) 2022-04-20 2025-08-14 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
JP2025517650A (ja) 2022-05-11 2025-06-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＦｃＲＨ５／抗ＣＤ３二重特異性抗体による処置のための投与
KR20250022071A (ko) 2022-06-02 2025-02-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항체 조성물 및 이의 이용 방법
US20250382354A1 (en) 2022-06-08 2025-12-18 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
CN120187452A (zh) 2022-06-13 2025-06-20 基因泰克公司 使用克瑞尼珠单抗延迟或预防阿尔茨海默病的发作的方法
EP4543546A1 (en) 2022-06-22 2025-04-30 Genentech, Inc. Methods for treatment of previously untreated follicular lymphoma with mosunetuzumab and lenalidomide
CN119452078A (zh) 2022-06-29 2025-02-14 富士胶片控股美国公司 Ipsc来源的星形胶质细胞及其使用方法
AU2023305619A1 (en) 2022-07-13 2025-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
KR20250040020A (ko) 2022-07-19 2025-03-21 제넨테크, 인크. 항-fcrh5/항-cd3 이중특이성 항체로 치료하기 위한 투약법
TW202417504A (zh) 2022-07-22 2024-05-01 美商建南德克公司 抗ｓｔｅａｐ１抗原結合分子及其用途
EP4581366A1 (en) 2022-09-01 2025-07-09 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
KR20250093374A (ko) * 2022-10-24 2025-06-24 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 인간 히알루로니다제 1 돌연변이체
EP4615580A1 (en) 2022-11-09 2025-09-17 CIS Biopharma AG Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
EP4588936A1 (en) 2022-12-08 2025-07-23 Changchun Bcht Biotechnology Co. Antibodies specifically binding to rsv
US20240269189A1 (en) 2022-12-19 2024-08-15 FUJIFILM Holdings America Corporation Extracellular vesicle-enriched secretome composition derived from induced pluripotent stem cell derived-microglia and methods of use thereof
CN120957747A (zh) 2023-01-20 2025-11-14 基因泰克公司 E3连接酶家族功能和相互作用
AR132043A1 (es) 2023-03-03 2025-05-21 Beigene Switzerland Gmbh Anticuerpos muc1 y métodos de uso
EP4676975A1 (en) 2023-03-03 2026-01-14 Beone Medicines I GmbH Muc1 and cd16a antibodies and methods of use
WO2024184812A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 antibodies and methods of use
EP4676596A1 (en) 2023-03-08 2026-01-14 AC Immune SA Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
AU2024270495A1 (en) 2023-05-05 2025-10-09 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
EP4709752A1 (en) 2023-05-08 2026-03-18 F. Hoffmann-La Roche AG Targeted interferon alpha fusion proteins and methods of use
WO2024246083A1 (en) 2023-06-01 2024-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies targeting bcma and cd28
TW202502811A (zh) 2023-06-01 2025-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｂｃｍａ特異性結合之免疫刺激性抗原結合分子
CN121568721A (zh) 2023-06-29 2026-02-24 广州百济神州生物制药有限公司 生物活性缀合物、其制备方法和其用途
AR133125A1 (es) 2023-06-29 2025-08-27 Beigene Switzerland Gmbh Conjugados bioactivos, método de preparación y uso de estos
CN121620524A (zh) 2023-08-09 2026-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 抗A-β蛋白抗体、方法及其用途
WO2025049818A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Enosi Therapeutics Corporation Tnfr1 antagonists lacking agonist activity and uses thereof
WO2025082990A1 (en) 2023-10-15 2025-04-24 Araris Biotech Ag Antibody-drug conjugates using two different types of topoisomerase i inhibitors
WO2025117848A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Genentech, Inc. Low-viscosity variants of antibodies
WO2025128434A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for the treatment of ven/aza resistant acute myeloid leukemia
WO2025155607A1 (en) 2024-01-16 2025-07-24 Genentech, Inc. Methods of treating urothelial carcinoma with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine
WO2025174933A1 (en) 2024-02-14 2025-08-21 Genentech, Inc. Methods for treatment of pancreatic cancer with anti-pd-l1 ab, anti-tigit ab, gemcitabine and nab-placlitaxel
WO2025191531A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cd19 targeting car nk cells in treating systemic lupus erythematosus and lupus nephritis
WO2025227129A2 (en) 2024-04-25 2025-10-30 Starrock Pharma Llc Delivery vehicles comprising proglucagon derived polypeptides and anabolic polypeptides and uses thereof
WO2025250969A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Anti-cd74 antibodies, conjugates and uses thereof
WO2025262427A1 (en) 2024-06-19 2025-12-26 Levicept Limited Injectable formulation
WO2025264960A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-13 and antibodies that bind ox40l
WO2025264972A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-4r alpha and antibodies that bind
JP2026009843A (ja) 2024-06-25 2026-01-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 単剤療法としてまたはレナリドミドと組み合わせたモスネツズマブの皮下投与を用いてがんを処置する方法
WO2026010946A1 (en) 2024-07-04 2026-01-08 Genentech, Inc. Zifibancimig for use in methods for treating ocular diseases via an ocular implant
WO2026010945A1 (en) 2024-07-04 2026-01-08 Genentech, Inc. Zifibancimig for use in methods for treating ocular diseases
WO2026013234A1 (en) 2024-07-10 2026-01-15 Araris Biotech Ag Triple-payload antibody-drug conjugates (adcs)
EP4684803A1 (en) 2024-07-25 2026-01-28 CeMM - Forschungszentrum für Molekulare Medizin GmbH Antibody conjugated chemical inducers of degradation of rbm39 and therapeutic uses thereof
NL2038589B1 (en) 2024-09-05 2026-03-24 Academisch Ziekenhuis Leiden An antibody molecule
WO2026060274A1 (en) 2024-09-16 2026-03-19 Albert Einstein College Of Medicine Therapeutic treatments for aging-associated neurodegenerative diseases and disorders
CN119185330B (zh) * 2024-09-30 2025-06-17 天津大学 卡巴匹林钙在制备治疗脑积水药物中的应用
WO2026085414A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind tslp and antibodies that bind interleukin 4 receptor alpha in combination with hyaluronidase or a variant thereof
WO2026085415A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-13 and antibodies that bind tslp in combination with hyaluronidase or a variant thereof
WO2026085417A2 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind interleukin 4 receptor alpha in combination with hyaluronidase or a variant thereof
WO2026085419A2 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-13 in combination with hyaluronidase or a variant thereof
CN120927942B (zh) * 2025-10-09 2025-12-05 上海基灵生物科技有限公司 高精度动物血球分析仪用抗凝剂及其在白细胞分类中的应用

Family Cites Families (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) * 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3710795A (en) * 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
US4044126A (en) * 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
USRE28819E (en) * 1972-12-08 1976-05-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Dialkylated glycol compositions and medicament preparations containing same
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4008719A (en) * 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
US4213765A (en) 1979-01-02 1980-07-22 Union Carbide Corporation Oxidative coal desulfurization using lime to regenerate alkali metal hydroxide from reaction product
US4328245A (en) * 1981-02-13 1982-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4410545A (en) 1981-02-13 1983-10-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4358603A (en) 1981-04-16 1982-11-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Acetal stabilized prostaglandin compositions
US4409239A (en) 1982-01-21 1983-10-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Propylene glycol diester solutions of PGE-type compounds
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4769027A (en) * 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
GB8504025D0 (en) * 1985-02-16 1985-03-20 Biopharm Ltd Hyaluronidase
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4687610A (en) * 1986-04-30 1987-08-18 E. I. Du Pont De Neumours And Company Low crystallinity polyester yarn produced at ultra high spinning speeds
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
WO1988002261A1 (fr) 1986-09-30 1988-04-07 Biochemie Gesellschaft M.B.H. Utilisation de hyaluronidase
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
JP2547556B2 (ja) 1987-02-06 1996-10-23 株式会社 ミドリ十字 ｒ−グロブリンの液状製剤
US5723147A (en) * 1987-02-23 1998-03-03 Depotech Corporation Multivesicular liposomes having a biologically active substance encapsulated therein in the presence of a hydrochloride
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
US5041292A (en) * 1988-08-31 1991-08-20 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5033352A (en) 1989-01-19 1991-07-23 Yamaha Corporation Electronic musical instrument with frequency modulation
US5116615A (en) * 1989-01-27 1992-05-26 Immunolytics, Inc. Method for treating benign prostatic hypertrophy
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE3921528A1 (de) * 1989-06-30 1991-01-10 Draegerwerk Ag Messzelle fuer den elektrochemischen gasnachweis
US5120548A (en) * 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
ZA912770B (en) * 1990-04-16 1992-01-29 Bethesda Eye Inst Enzymatic disinsertion of vitreous body
US5733566A (en) * 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5401629A (en) * 1990-08-07 1995-03-28 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal
CA2092323A1 (en) 1990-10-01 1992-04-02 George Y. Wu Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
US5721348A (en) * 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
EP0576592B1 (en) 1991-03-18 2000-05-31 The Scripps Research Institute Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compositions
CA2103064A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins
DK0587738T3 (da) 1991-06-05 2000-12-18 Univ Connecticut Destineret levering af gener, som koder for sekretionsproteiner
US5580578A (en) * 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
CH684164A5 (de) 1992-01-10 1994-07-29 Rotkreuzstiftung Zentrallab Intravenös anwendbare Immunglobulinlösung.
AU3434393A (en) 1992-01-17 1993-08-03 Regents Of The University Of Michigan, The Targeted virus
EP0633943A4 (en) 1992-04-03 1997-05-02 Alexander T Young GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS.
US5323907A (en) * 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
JP3980657B2 (ja) 1992-06-26 2007-09-26 生化学工業株式会社 コンドロイチナーゼａｂｃ、その製造法及び医薬組成物
US5496718A (en) * 1992-06-26 1996-03-05 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896
ES2157225T3 (es) 1992-10-09 2001-08-16 Advanced Tissue Sciences Inc Celulas hepaticas de reserva.
US5591767A (en) * 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5354566A (en) 1993-06-02 1994-10-11 Kraft General Foods, Inc. Preparation of yeast-leavened dough crusts
FR2706466B1 (fr) 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5766627A (en) * 1993-11-16 1998-06-16 Depotech Multivescular liposomes with controlled release of encapsulated biologically active substances
DE4344824C1 (de) 1993-12-28 1995-08-31 Immuno Ag Hochkonzentriertes Immunglobulin-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
IL112920A (en) * 1994-03-07 2003-04-10 Dow Chemical Co Composition comprising a dendritic polymer complexed with at least one unit of biological response modifier and a process for the preparation thereof
GEP20002180B (en) * 1994-03-31 2000-07-25 Amgen Inc Composition and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
DE4445969C1 (de) 1994-12-22 1996-03-14 Schott Glaswerke Spritzenzylinder für eine Zweikammer-Fertigspritze, Zweikammer-Fertigspritze und Verfahren zum Herstellen und Füllen derselben
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5747027A (en) 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
DE69734060T2 (de) 1996-05-24 2006-06-29 Angiotech Pharmaceuticals, Inc., Vancouver Zubereitungen und verfahren zur behandlung oder prävention von krankheiten der körperpassagewege
US5958750A (en) * 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
US5665069A (en) * 1996-07-19 1997-09-09 Cumer; Patricia Lynn Pressure-directed peribulbar anesthesia delivery device
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6193963B1 (en) * 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6103525A (en) * 1996-10-17 2000-08-15 The Regents Of The University Of California Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies that bind to human plasma hyaluronidase
US6123938A (en) * 1996-10-17 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Human urinary hyaluronidase
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
US6258351B1 (en) * 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
JP4270590B2 (ja) 1997-03-19 2009-06-03 田辺三菱製薬株式会社 免疫グロブリン製剤
GB9705810D0 (en) 1997-03-20 1997-05-07 Common Services Agency Intravenous immune globulin
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
JP4078032B2 (ja) * 1998-03-12 2008-04-23 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 近位の反応性基を持つポリ（エチレングリコール）誘導体
US6528286B1 (en) 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
CN1314992A (zh) 1998-07-03 2001-09-26 奈勒斯菲尔德控制有限公司 流体测量的方法和装置
US6153394A (en) 1998-09-18 2000-11-28 Board Of Trustees Operating Michigan State University Immunoassay for equine protozoal myeloencephalitis in horses
US6420339B1 (en) * 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
JP2002533473A (ja) * 1998-12-23 2002-10-08 イーデー ファーマ ゲーエムベーハー 微生物起源のヒアルロン酸分解酵素を含有する薬学的配合物
US6453170B1 (en) * 1998-12-31 2002-09-17 Nokia Corporation Mobile station user interface, and an associated method, facilitating usage by a physically-disabled user
US6342219B1 (en) * 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody compositions for selectively inhibiting VEGF
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
TWI248819B (en) * 1999-09-27 2006-02-11 Arp Biomed Ltd Pharmaceutical composition containing IVIG for use in treating lymphoma
HK1047109A1 (zh) 1999-10-15 2003-02-07 University Of Massachusetts 作为指定基因干预工具的rna干预轨迹基因
WO2001039765A2 (en) * 1999-12-03 2001-06-07 Ista Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the induction and treatment of retinal detachments
CA2394980C (en) * 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) * 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US20030212021A1 (en) * 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
JP2003534834A (ja) 2000-01-28 2003-11-25 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 投与量設定リミッター
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
IL152804A0 (en) 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
EP1345628B1 (en) 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US20040224012A1 (en) 2001-10-05 2004-11-11 Pichit Suvanprakorn Topical application and methods for administration of active agents using liposome macro-beads
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1446438A2 (en) * 2001-11-07 2004-08-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
US7368108B2 (en) * 2001-11-28 2008-05-06 Neose Technologies, Inc. Glycopeptide remodeling using amidases
US7192468B2 (en) 2002-04-15 2007-03-20 Fluor Technologies Corporation Configurations and method for improved gas removal
US7064110B2 (en) * 2002-05-13 2006-06-20 Enanta Pharmaceuticals, Inc. 6-11 bicycle ketolide derivatives
US6861236B2 (en) * 2002-05-24 2005-03-01 Applied Nanosystems B.V. Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way
US6682904B1 (en) * 2002-08-15 2004-01-27 Deliatroph Pharmaceuticals, Inc. Specific inhibitors of hyaluronidase 2, and methods of identifying and using same
KR20040040782A (ko) * 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
CA2508948A1 (en) * 2002-12-16 2004-07-15 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (chasegp), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
JP2004238392A (ja) 2003-01-14 2004-08-26 Nipro Corp 安定化された蛋白質性製剤
DK2236154T3 (en) 2003-02-10 2018-06-25 Biogen Ma Inc IMMUNOGLOBULIN INFORMATION AND METHOD OF PREPARING IT
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
NZ542873A (en) * 2003-03-05 2008-07-31 Halozyme Inc Soluble, neutral-active hyaluronidase activity glycoprotein (sHASEGP) that is produced with high yield in a mammalian expression system by introducing nucleic acids that lack a narrow region encoding amino acids in the carboxy terminus of the human PH20 cDNA
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
WO2004098500A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Trine Pharmaceuticals, Inc. CARBACEPHEM ss-LACTAM ANTIBIOTICS
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
EP1532983A1 (en) 2003-11-18 2005-05-25 ZLB Bioplasma AG Immunoglobulin preparations having increased stability
JP2010502224A (ja) 2006-09-08 2010-01-28 アボット・ラボラトリーズ インターロイキン１３結合タンパク質
RU2471867C2 (ru) * 2007-06-19 2013-01-10 Тамара П. Уваркина Гиалуронидаза и способ ее применения
SI4269578T1 (sl) 2008-03-06 2024-07-31 Halozyme, Inc. Sestava topne hialuronidaze
TWI489994B (zh) * 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
KR20130116386A (ko) * 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
EA022752B1 (ru) * 2008-12-09 2016-02-29 Галозим, Инк. Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование
WO2012012300A2 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012143241A (ja) 2012-08-02
CN101163717B (zh) 2014-06-25
KR20120105018A (ko) 2012-09-24
US10588983B2 (en) 2020-03-17
IL185497A (en) 2016-12-29
ES2557818T3 (es) 2016-01-28
US20060104968A1 (en) 2006-05-18
IL286802A (en) 2021-10-31
EP3943501A1 (en) 2022-01-26
PT1858926E (pt) 2016-02-08
KR20080004473A (ko) 2008-01-09
SG164386A1 (en) 2010-09-29
PL1858926T4 (pl) 2016-06-30
JP2008531017A (ja) 2008-08-14
NZ581233A (en) 2011-01-28
PL1858926T3 (pl) 2016-06-30
EP3045472A1 (en) 2016-07-20
DK1858926T3 (en) 2016-01-25
KR101363823B1 (ko) 2014-02-17
KR101179029B1 (ko) 2012-09-07
CY1117104T1 (el) 2017-04-05
IL286802B1 (en) 2024-04-01
EP1858926A4 (en) 2011-05-11
IL286802B2 (en) 2024-08-01
EA200701791A1 (ru) 2008-02-28
CA2598823A1 (en) 2006-08-31
CA2598823C (en) 2013-09-10
AU2006216545A1 (en) 2006-08-31
EA011654B1 (ru) 2009-04-28
EP1858926B1 (en) 2015-10-14
IL185497A0 (en) 2008-01-06
SI1858926T1 (sl) 2016-02-29
MX2007010279A (es) 2008-10-17
MX354157B (es) 2018-02-15
AU2006216545B2 (en) 2012-07-26
HUE028351T2 (en) 2017-02-28
CN101163717A (zh) 2008-04-16
EP1858926A1 (en) 2007-11-28
IL242673B (en) 2021-10-31
JP5654510B2 (ja) 2015-01-14
IL311178A (en) 2024-04-01
US20180185506A1 (en) 2018-07-05
IL220721A0 (en) 2012-08-30
HK1109162A1 (en) 2008-05-30
US20150165059A1 (en) 2015-06-18
JP5366407B2 (ja) 2013-12-11
WO2006091871A1 (en) 2006-08-31
SG178799A1 (en) 2012-03-29
BRPI0608314A2 (pt) 2009-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10588983B2 (en) Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US10016491B2 (en) Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
HK40065238A (en) Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
BR122021011883B1 (pt) Glicosaminoglicanases solúveis métodos para a sua preparação, seu uso e respectiva composição farmacêutica
HK1109162B (en) Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases

Legal Events

Date Code Title Description
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: HALOZYME, INC. (US)

Free format text: TRANSFERIDO DE: HALOZYME THERAPEUTICS, INC.

B15G Petition not considered as such [chapter 15.7 patent gazette]

Free format text: NAO CONHECIDA A PETICAO NO 020100024546/RJ DE 19/03/2010 EM VIRTUDE DO DISPOSTO NO ART. 219 INCISO II DA LPI.

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 23/02/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.