BRPI0710187A2 - proteìnas de fusão enzimática e seu uso - Google Patents

Abstract

<B>PROTEìNAS DE FUSãO ENZIMáTICA E SEU US0.<D> São descritas proteínas de fusão de celulase compreendendo uma região de núcleo de endoglucanase e um domínio de ligação de celulose heterólogo. As proteínas de fusão podem ser produzidas por técnicas recombinantes usando polinucleotídeos apropriados, expressando vetores de células hospedeiras. As proteínas de fusão e preparações enzimáticas das mesmas são úteis para tratar material celulósico, tal como material têxtil, e são particularmente úteis em bioesmerilhamento de denim ou em bioacabamento de tecidos e vestuário. Além disso, as proteínas de fusão podem ser usadas na indústria de papel e polpa, em extração de óleo de plantas, composições de detergente, ou para melhorar a qualidade de ração animal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNASDE FUSÃO ENZIMÁTICA E SEU USO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a tecnologia enzimática, e maisprecisamente a proteínas de fusão de celulase compreendendo um domíniocatalítico e um domínio de ligação de celulose. As proteínas de fusão podemser produzidas por técnicas recombinantes usando polinucleotídeos apropri-ados, expressando vetores e células hospedeiras, as quais também são en-globadas pela invenção. As proteínas de fusão e preparações enzimáticasdas mesmas são úteis para tratar material celulósico, tal como material têxtil.Além das proteínas de fusão podem ser usadas na indústria de polpa e pa-pel, extração de óleo de plantas, composições de detergente, ou para me-lhorar a qualidade de ração animal. A invenção portanto refere-se adicional-mente a um processo para tratar material celulósico com a proteína de fu-são, e especialmente a processos para bioesmerilhamento ou bioacabamen-to de tecidos ou roupas, especialmente denim. A invenção ainda refere-seadicionalmente a composições de detergente e ração animal contendo asproteínas de fusão.

Antecedentes da Invenção

Celulose é o principal componente estrutural de plantas superio-res e ocorre naturalmente em forma quase pura somente em fibra de algo-dão. Proporciona células vegetais com elevada resistência à tração ajudan-do as mesmas a resistir à tensão mecânica e à pressão osmótica. Celuloseé um polissacarídeo linear de resíduos glicose conectados por 11-1,4-ligações. Na natureza celulose é geralmente associada com Iignina e hemi-celuloses. Material celulósico é degradado na natureza por uma série de vá-rios organismos incluindo bactérias e fungos. A conversão biológica de celu-lose para glicose geralmente requer três grupos importantes de enzimas:celobiohidrolases (CBH), endoglucanases (EG) e beta-glucosidases (BG).

Há um amplo espectro de aplicações industriais de celulases. Naindústria têxtil, celulases são usadas em acabamento de denim para criar umlavado a pedra da moda em tecidos de denim em um processo de bio-esmerilhamento. Celulases também são usadas, por exemplo, para limparfelpa e prevenir a formação de bolinhas sobre a superfície de roupas de al-godão. Na indústria de detergentes as celulases são usadas para dar brilhoàs cores e para prevenir o acinzentamento e a formação de bolinhas dasroupas. Adicionalmente as celulases são usadas na indústria de alimentos ena fabricação de ração animal, e têm um grande potencial na indústria depolpa e papel, por exemplo, em destintagem para liberar tinta de superfíciesde fibras e na melhora da drenagem da polpa.

Celulases industrialmente usadas são freqüentemente misturasde enzimas tendo uma variedade de atividades e especificidades de substra-tos. As preparações enzimáticas comerciais freqüentemente compreendemtodas as três atividades de celulase, isto é, CBH, EG e BG. Além disso aspropriedades únicas de cada celulase tornam algumas mais adequadas paraalguns propósitos do que outras, e portanto também têm sido esforços paraobter e usar celulases tendo somente as atividades desejadas. As celulasesde origem fúngica mais amplamente usadas são derivadas de Trichodermareesei. No entanto, também outras fontes fúngicas foram sugeridas, por e-xemplo, na Patente U.S. Ne U.S. 5.457.046.

Celulases aplicadas em tratamento de denim são geralmentedivididas em dois grupos principais: celulases ácidas e neutras. Celulasesácidas tipicamente operam em pH 4.0 a 5.5 e celulases neutras na faixa depH 6 a 8. Celulases tendo características tanto do grupo ácido quanto neutropodem ser denominadas celulases híbridas. Celulases ácidas usadas embioesmerilhamento se originam essencialmente de Trichoderma reesei (for-ma sexual Hypocrea jecorina) e as celulases neutras se originam de umavariedade de fungos, incluindo gêneros de Melanoearpus, Humieola, Myceli-ophthora, Fusarium, Aeremonium, e Chrysosporium (Haakana et al. 2004).Enzimas de T. reesei incluem, por exemplo, celulases da família 5 de glicosilhidrolase (endoglucanase II, EGII), família 7 (celobiohidrolase I, CBHI) e fa-mília 12 (endoglucanase III, EGIII; Ward et al. 1993), e as celulases neutras,o mais freqüentemente endoglucanases, da família 45 e família 7 (Henrissat,1991; Henrissat e Bairoch, 1993, 1996).A Patente dos U.S. Nq 5.874.293 revela uma composição de ce-Iulase aprimorada compreendendo quantidades elevadas de endoglucanaseEGII de T. reesei para tratar têxteis contendo celulose. A composição apri-morou propriedades de cor, aumentou a luminosidade e o aspecto visual ereduziu tendências a formação de bolinhas. A patente internacional N9 WO97/14804 revela uma celulase de 20 kDa e uma de 50 kDa com atividade deendoglucanase derivada de Melanocarpus sp. que são especialmente úteisna indústria têxtil e de detergentes. Proteínas de fusão contendo as proteí-nas de 20K ou de 50K encadeadas a um domínio de ligação de celulose pre-ferencialmente de Trichoderma reesei são sugeridas para criar novas propri-edades enzimáticas. Não são dados exemplos específicos, nem são as pro-periedades desejadas descritas.

No entanto, ainda há a necessidade de celulases aprimoradas,inclusive endoglucanases que sejam mais eficientes no tratamento de teci-dos e em outros campos, onde tradicionalmente são usadas celulases. Emparticular, há uma necessidade contínua de celulases mais eficientes paraaumentar a economia do processo. A presente invenção visa satisfazer es-tas necessidades.

Na indústria têxtil um aspecto lavado à pedra ou um aspectodesgastado tem sido de interesse dos produtores de denim nos últimos a-nos. A lavagem à pedra tradicional com pedras-pomes reduz a resistênciado tecido e sobrecarrega os aparelhos de lavar roupas. Há uma tendênciapara processos de acabamento de denim enzimáticos, e celulases têm subs-tituídos ou estão sendo usadas junto com pedras-pomes para dar ao tecidoseu aspecto "usado" desejado. Tratamentos enzimáticos controlados resul-tam em menor dano para as roupas e máquinas e eliminam a necessidadede remoção das pedras.

Um problema geral associado com lavagem à pedra enzimáticoé retropigmentação causado por redeposição de pigmento índigo removidodurante ou depois de abrasão. A redeposição de pigmento índigo reduz ocontraste desejado entre os fios brancos e tingidos de índigo e pode sermais facilmente observada sobre o lado reverso do denim e os bolsos interi-ores (como aumento do azulamento). Sobre o lado da face isto pode ser vis-to como contraste reduzido entre áreas tingidas e áreas das quais o pigmen-to foi removido durante o bioesmerilhamento. A retropigmentação pode serreduzida usando agentes anti-retropigmentação tais como álcoois etoxiladosnão-iônicos durante o tratamentou ou adicionando agentes alvejantes duran-te etapas de enxágüe. A natureza da enzima tem um impacto sobre a retro-pigmentação. Geralmente, celulases neutras retropigmentam menos do quecelulases ácidas.

A publicação de patente internacional N2 W097/09410 descreveque a adição de um certo tipo de celulase a outra celulase tendo atividadeabrasiva reduz a retropigmentação. A celulase adicional pertence à família 5ou 7, mas não tem efeito abrasivo significativo por si só. Preferencialmente,a referida celulase adicional se origina de Bacillusou Clostridium.

A Patente U.S. N2 5.916.799 revela composições de celulase con-tendo tanto celobiohidrolases quanto endoglucanases que foram submetidasà proteólise limitada para separar o núcleo e domínios de ligação das enzi-mas. Foi visto que as composições enzimáticas obtidas reduzem a retropig-mentação. A publicação de patente internacional N2 W094/07983 refere-se aoachado de que redeposição de colorante sobre tecido durante o processo delavagem à pedra pode ser reduzido empregando uma composição de celulasefúngica, a qual é substancialmente livre de componentes do tipo de celobiohi-drolase. A publicação de patente internacional N2 W096/23928 revela trata-mento de tecidos contendo celulose com enzimas celulases truncadas. Foivisto que as enzimas truncadas carecendo de domínio de ligação de celulose(CBD) reduzem redeposição de corante e aumentam abrasão.

A conclusão geral das três referências citadas acima pode serque o domínio de ligação de celulose tem um efeito negativo sobre a retro-pigmentação. No entanto, a presente invenção agora proporciona uma cons-trução de celulase com baixa propriedade de retropigmentação, apesar dapresença de um domínio de ligação de celulose.

Sumário da Invenção

A presente invenção baseia-se na descoberta surprendente deque o efeito da endoglucanases pode ser significativamente reforçado ligan-do a essa um domínio de ligação de celulose em particular sem prejudicar asproprtiedades de retropigmentação.

Um objetivo da presente invenção é proporcionar novas proteí-nas de fusão de endoglucanase tendo aprimoradas propriedades hidrolíticaspara uso em indústria têxtil, especialmente em lavagem à pedra de denim.

As proteínas de fusão da invenção têm a vantagem de serem ativas tantoem valores de pH ácidos quanto neutros, e têm performance altamente a-primorada em aplicações de bioesmerilhamento. Quando usadas no trata-mento de denim, as proteínas de fusão proporcionam um baixo efeito de re-tropigmentação. Com a aprimorada eficiência das endoglucanases da inven-ção, o uso das enzimas é significativamente mais econômico. Vantagensadicionais são obtidas também em termos de logística e do armazenamentodos produtos enzimáticos, porque são necessárias quantidades menores doproduto enzimático. As proteínas de fusão também são úteis em composi-ções de detergente, bem como em outros campos tais como indústria deração, extração de óleo de plantas, ou indústria de polpa e papel.

Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar poli-nucleotídeos codificando as novas proteínas de fusão de endoglucanase.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionarum método para produzir as proteínas de fusão.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionarnovos vetores de expressão contendo os referidos polinucleotídeos, úteispara a produção das proteínas de fusão endoglucanase, bem como novoshospedeiros transformados com os referidos vetores de expressão.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionarpreparações enzimáticas, as quais contêm uma ou mais novas proteínas defusão de endoglucanase.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionarmétodos para tratar material celulósico com a proteína de fusão, por exem-plo, para uso na indústria têxtil, de detergente, de ração animal, de extraçãode óleo de plantas, ou de polpa e papel, e particularmente para acabamentode têxteis, especialmente para bioesmerilhamento e bioacabamento de de-nim.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionarração animal ou composições detergentes contendo as proteínas de fusão.

A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão de celu-lase compreendendo uma primeira seqüência de aminoácidos de um núcleode endoglucanase, e uma segunda seqüência de aminoácidos compreen-dendo um encadeador e domínio de ligação de celulose (CBD) tendo no mí-nimo 75% de identidade com a SEQ ID NO: 15, ou uma variante ou fragmen-to da mesma tendo atividade de ligação de celulose.

A invenção refere-se adicionalmente a um polinucleotídeo isola-do selecionado entre o grupo consistindo de:

a) uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou 5, ouuma seqüência codificando uma proteína de fusão de celulase da reivindica-ção 1,

b) um filamento complementar de a),

c) uma seqüência que é degenerada em conseqüência do códi-go genético a qualquer uma das seqüências de a) ou b).

A invenção refere-se ainda adicionalmente a um vetor de ex-pressão compreendendo a referida seqüência de nucleotídeos, e a uma cé-lula hospedeira compreendendo o vetor de expressão, bem como a umapreparação enzimática compreendendo a proteína de fusão.

A invenção também engloba um método para produzir a proteínade fusão, compreendendo as etapas de transformar uma célula hospedeiracom um vetor de expressão codificando a referida proteína de fusão e culti-var a referida célula hospedeira sob condições possibilitando expressão dareferida proteína de fusão, e opcionalmente recuperar e purifcar a proteínade fusão produzida.

A invenção ainda engloba adicionalmente um processo para tra-tar material celulósico, em que o referido processo compreende contactar omaterial celulósico com a proteína de fusão.

A invenção também refere-se a um processo para bioesmeri-lhamento, cujo processo compreende a etapa de contactar a proteína defusão de celulase ou a preparação enzimática com tecido ou roupas de de-nim, e a um processo para bioacabamento, o qual compreende a etapa decontactar a proteína de fusão de celulase ou a preparação enzimática commateriais têxteis como tecidos ou roupas ou fio.

Eventualmente, a invenção refere-se a uma composição de de-tergente compreendendo a proteína de fusão e auxiliares detergentes, a ra-ção animal compreendendo a proteína de fusão, e a uma cepa de Eschrichiacoli tendo número de acesso de E. coli DSM 18159.

Modalidades específicas da invenção são determinadas nas rei-vindicações dependentes.

Outros objetivos, detalhes e vantagens da presente invenção setornarão evidentes a partir dos seguintes desenhos, descrição detalhada eexemplos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 ilustra uma esboço esquemático do cassete de ex-pressão usado na transformação de protoplastos de T. reesei para produçãode celulase de T. aurantiacus EG28 ou EG28+CtCBD. O gene ce/5A ouce/5A_Ct ce/7AlinkerCBD está sob controle do promotor de T. reesei cbhl(cbhl prom) e terminação de transcrição é assegurada com a adição do ter-minador cbhl (cbhl term). O gene amdS (amdS) é incluído para seleção detransformantes. O cassete de expressão para produção de EG28 eEG28+CtCBD foi isolado como um fragmento Notl de 8,6 kb de pALK1930ou como um fragmento Notl de 8,9 kb de pALK1948, respectivamente.

A Figura 2 ilustra a dependência de pH da celulase de T. auran-tiacus EG28 produzida de modo heterólogo determinando a partir do sobre-nadante da cultura usando CMC como substrato em uma reação de 10 min a50°C (A). A temperatura ótima da celulase EG28 foi determinada em pH óti-mo (6.0). A reação contendo CMC como substrato foi realizada por 10 min(B). O pH e temperatura ótimos da proteína de fusão EG28+CtCBD foramdeterminados para serem o mesmo que os da celulase EG28 selvagem.

A Figura 3 mostra o efeito de bioesmerilhamento de celulaseEG28, medindo a cor, em diferentes temperaturas e pH 6.

A Figura 4 mostra o efeito de bioesmerilhamento deEG28+CtCBD celulase, medindo a cor, em diferentes valores de pH a 50°C.

A Figura 5 mostra o efeito de bioesmerilhamento deEG28+CtCBD celulase, medindo a cor, em diferentes valores de pH a 60°C.

A Figura 6 mostra o efeito de bioesmerilhamento deEG28+CtCBD celulase, medindo a cor, em diferentes temperaturas (pH 6).

A Figura 7 mostra a Influência da temperatura de peletizaçãosobre a recuperação da atividade de betaglucanase de rações suplementa-das com celulase EG28.

A Figura 8 mostra a Influência da temperatura de peletizaçãosobre a recuperação da atividade de celulase de rações suplementadas comcelulase EG28+CtCBD.

Descrição Detalhada da Invenção

Celulases compreendem um domínio catalítico / núcleo (CD)expressando atividade de celulase. Além do domínio catalítico a molécula decelulase pode compreender um ou mais "domínios de ligação de celulose"("CBDs"), também denominados como domínios / moléculas de ligação decarboidrato (CBD/CBM), os quais podem estar localizados ou no N- ou no C-término do domínio catalítico. CBDs têm atividade de ligação de carboidratoe mediam a ligação da celulase a celulose cristalina mas têm pouco ou ne-nhum efeito sobre a atividade hidrolítica da enzima sobre substratos solú-veis. Estes dois domínios são tipicamente conectados através de uma regiãode encadeador flexível e altamente glicosilada, aqui, neste requerimento depatente, denominada "encadeador". Os constructos referidos são descritos,por exemplo, em Srisodsuk et al., 1993. Algumas das endoglucanases queocorrem naturalmente e celobiohidrolases têm um domínio de ligação decelulose (CBD), enquanto outras não.

Endoglucanases (EGs) são um dos três tipos de celulases g-eralmente necessários para a conversão biológica de celulose em glicose.Endoglucanases cortam ligações beta-1,4-glucosídicas internas, ao passoque celobiohidrolases cortam a dissacarídeo celobiose do fim da cadeia po-limérica de celulose e beta-1,4-glucosidases hidrolisam a celobiose e outroscelooligossacarídeos curtos para glicose. "Endoglucanase" ("EG") em rela-ção com a presente invenção refere-se a enzimas classificadas como E.C.3.2.1.4. São 1,4- beta-D-glucano 4-glucanohidrolases e catalisam endohidró-Iise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em polímeros de glicose tais comocelulose. Algumas endoglucanases também podem hidrolisar, por exemplo,1,4-ligações em beta-D-glucanos também contendo 1,3-ligações. Portantotambém podem ser classificadas como endo-1,3(4)-betaglucanases (E.C.3.2.1.6). Portanto, uma enzima pode catalisar reações sobre vários substra-tos e pode pertencer a múltiplas classes.

Celulases incluindo endoglucanases também podem ser classifi-cadas em várias famílias de glicosil hidrolase de acordo com sua seqüênciaprimária, suportadas por análise da estrutura tridimensional de alguns mem-bros da família (Henrissat 1991, Henrissat e Bairoch 1993, 1996). Por exem-plo, a família 45 (anteriormente celK) contém endoglucanases (EC 3.2.1.4),e a família 5 (anteriormente conhecida como celA) consiste essencialmentede endoglucanases (EC 3.2.1.4). A família 7 (anteriormente celulase famíliacelC) contém tanto endoglucanases quanto celobiohidrolases. Algumas gli-cosil hidrolases são enzimas multifuncionais que contêm domínios catalíticosque pertencem a diferentes famílias de glicosil hidrolase. Para os presentesfins a parte de endoglucanase da proteína de fusão preferencialmente per-tence à família 45 ou família 5 de glicosídeo hidrolase, e mais preferencial-mente à família 5.

De acordo com uma modalidade preferencial da invenção a par-te endoglucanase da proteína de fusão é derivada de um fungo, preferenci-almente do gênero Thermoascus, e mais preferencialmente de Thermoascusaurantiacus. Uma endoglucanase semelhante foi descrita, por exemplo, porHong et al. 2003. A patente internacional Ns WO 03/062409 sugere usar estaenzima para aplicações de ração, porque além de endoglucanase tambémtem atividade de beta-glucanase. O mais preferencialmente a endoglucana-se é derivada de T. aurantiacus cepa ALK04242 depositada como CBS116239. O gene de endoglucanase da referida cepa foi inserido no plasmí-deo pALK1926 e depositado como DSM 17326. A proteína codificada poreste gene é referida aqui, neste requerimento de patente, como "Ta EG28"ou simplesmente "EG28".

Alternativamenete, a parte endoglucanase da proteína de fusãopode ser obtida a partir de Acremonium sp. preferencialmente de A. thermo-philum, e mais preferencialmente de uma cepa tendo as características dacepa ALK04245 depositada como CBS 116240. A endoglucanase obtenívela partir desta cepa e codificada pelo gene ce/45A é referida aqui, neste re-querimento de patente, como "At EG40" ou simplesmente "EG40".

"Núcleo" de endoglucanase conforme usado aqui, neste reque-rimento de patente, significa o domínio catalítico / núcleo (CD) de uma enzi-ma expressando no mínimo atividade de endoglucanase. Um domínio catalí-tico semelhante pode estar em sua forma natural (isto é, intacto) ou pode sermodificado.

De acordo com uma modalidade da invenção, o núcleo de endo-glucanase tem no mínimo 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade com aSEQ ID NO: 2 (Ta EG28). Preferencialmente, o núcleo compreende no mí-nimo a proteína madura, a qual corresponde aos aminoácidos 19 a 334 daSEQ ID NO: 2. A previsão da seqüência de sinalização foi feita usando oprograma SignaIP V3.0 (Nielsen et ai, 1997; Bendtsen et aí., 2004); o valorde NN foi obtido usando redes neurais e o valor de HMM foi obtido usandomodelos de Markov oculto. Alternativamente, a parte endoglucanase da pro-teína de fusão tem no mínimo 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidadecom o núcleo de endoglucanase de At EG40, codificado por um polinucleotí-deo compreendido na SEQ ID NO: 8. Preferencialmente, o núcleo compre-ende no mínimo a proteína madura, a qual corresponde aos aminoácidos 22a 297 de EG40.

"Celobiohidrolase" ou "CBH" conforme usado aqui, neste reque-rimento de patente, refere-se a enzimas que clivam celulose da extremidadeda cadeia de glicose e produzem essencialmente celobiose. Também sãodenominadas 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolases ou celulose 1,4-beta-celobiosidases. Hidrolisam as ligações 1,4-beta-D-glucosídicas das extremi-dades redutoras ou não redutoras de um polímero contendo as referidas li-gações, tais como celulose, por meio do que é liberada celobiose.

O CBD incluindo o encadeador é preferencialmente derivado deChaetomium thermophilum, e especialmente do gene codificando celobiohi-drolase (CBHI/Cel7A) de cepa ALK04265, depositado como CBS 730.95.

Este CBD incluindo o encadeador é referido como "CtCBD". De acordo comuma modalidade preferencial da invenção, o encadeador mais o domínio deligação de celulose tem uma seqüência que tem no mínimo 80, 85, 90, 95,98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 15, (a qual corresponde aosaminoácidos 335 a 415 da SEQ ID NO: 4). De acordo com outra modalidadepreferencial a segunda seqüência de aminoácidos compreende os aminoá-cidos 335 a 379 de SEQ ID NO: 4.

O termo "derivado de" em relação com uma fonte de microorga-nismo significa que o polipeptídeo pode ser produzido naturalmente pela re-ferida fonte de microorganismo específico, ou o polinucleotídeo codificando opolipeptídeo pode ser isolado da referida fonte de microorganismo, ou o ter-mo significa uma célula hospedeira na qual o polinucleotídeo da referida fon-te de microorganismo codificando o polipeptídeo foi introduzido. No entanto,não exclui modificações menores da seqüência, por exemplo, por substitui-ção, eliminação, inversão e/ou inserção de um ou uns poucos aminoácidos /códons na medida que a atividade biológica da proteína codificada seja retida.

O núcleo, e o encadeador+CBD, respectivamente, também podeser um fragmento ou uma variante das referidas seqüências, em que o refe-rido fragmento ou variante tem atividade de celulase e/ou atividade de liga-ção de celulose. Por exemplo, a primeira seqüência de aminoácidos podecompreender um fragmento ou variante de uma seqüência de aminoácidostendo no mínimo 75% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou 8, e a segundaseqüência de aminoácidos pode compreender um fragmento ou variante deuma seqüência de aminoácidos tendo no mínimo 75% de identidade com aSEQ ID NO: 15.

No presente contexto "atividade de celulase" significa capacida-de catalítica para hidrolisar celulose ou derivados da mesma, tais como ati-vidade de endoglucanase ou betaglucanase. Além de atividade de endoglu-canase e/ou beta-glucanase, algumas das celulases podem ter adicional-mente atividade de hemicelulase e/ou xilanase.

Conforme usado no presente contexto o termo "identidade" refe-re-se à identidade global entre duas seqüências de aminoácidos compara-das umas com as outras a partir do primeiro aminoácido codificado pelo ge-ne correspondente até o último aminoácido. A identidade das seqüências deextensão total é medida usando programa de alinhamento global de Nee-dleman-Wunsch no pacote de programa EMBOSS (European Molecular Bio-logy Open Software Suite; Rice et al., 2000), versão 3.0.0, com os seguintesparâmetros: EMBLOSUM62, penalidade de Gap de 10,0, penalidade de Ex-tensão de 0,5. O algoritmo é descrito em Needleman e Wunsch (1970). Apessoa versada na técnica está ciente do fato que resultados usando o algo-ritmo de Needleman-Wunsch são comparativos somente ao alinhar domínioscorrespondentes da seqüência. Conseqüentemente comparação de, por e-xemplo, seqüências de celulase incluindo CBD ou seqüências de sinalizaçãocom seqüências carecendo destes elementos são excluídas como não sen-do significativas.

De acordo com uma modalidade da invenção a proteína de fu-são contém um núcleo de endoglucanase codificad por um gene equivalenteàquele incluído em E. coli DSM 17326. Preferencialmente, a proteína de fu-são é codifiada por um gene de fusão equivalente ao incluído em E. coliDSM 18159. "Equivalente" conforme usado aqui, neste requerimento de pa-tente, significa essencialmente similar ou similar. De acordo cm uma modali-dade específica da invenção a proteína de fusão contém um núcleo de en-doglucanase compreendendo a seqüência de SEQ ID NO:2 e um encadea-dor e CBD compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 15. Especialmentecompreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 6, ou umavariante ou fragmento da mesma tendo atividade de celulase e atividade deligação de celulose.

Um "fragmento" é entendido como sendo parte de uma seqüên-cia de aminoácidos específica que é suficientemente longa para ter a ativi-dade biológica desejada. Em outras palavras o fragmento pode ser, por e-xemplo, somente a parte madura da seqüência de aminoácidos ou aindauma subseqüência da parte madura. Por uma seqüência de aminoácidosque é uma "variante" de uma seqüência de aminoácidos específica se indicauma seqüência de aminoácidos que não é idêntica à seqüência de aminoá-cidos específica, mas ao invés contém no mínimo algumas alterações deaminoácidos, isto é, eliminações, substituições, inversões, inserções e etc.que não afetam essencialmente a atividade biológica da proteína comparadacom uma atividade similar da seqüência de aminoácidos específica, quandousada para o fim desejado. Atividade biológica neste contexto portanto refe-re-se uma atividade de celulase, atividade de ligação de celulose ou ambas.

A proteína de fusão da invenção pode ser preparada ficando aparte do núcleo de endoglucanase ao encadeador e parte de CBD no DNAcodificante apropriado usando técnicas de DNA recombinante conhecidas demodo geral para produzir a proteína recombinante desejada. Em resumo, ospolinucleotídeos codificando os parceiros de fusão são amplificados e clona-dos, nucleotídeos também podem ser sintetizados. O polinucleotídeo fundidoé inserido em um vetor de expressão, transformado em uma célula hospe-deira e expressado. Preferencialmente, o encadeador e CBD é fixado no C-término do núcleo de endoglucanase.

Um "vetor de expressão" é um plasmídeo ou vetor de clonagemcapaz de expressar DNA codificando as proteínas de fusão de endoglucana-se depois de transformação em um hospedeiro desejado. Quando se usa umhospedeiro fúngico, o gene de interesse é preferencialmente proporcionadoa um hospedeiro fúngico como parte de um veículo de clonagem ou expres-são que integra no cromossoma fúngico, ou permite que o gene de interesseintegre no cromossoma do hospedeiro. Outras seqüências que são parte doveículo de clonagem ou veículo de expressão também podem ser integradascom o DNA referido durante o processo de integração. Além disso, em fun-gos o vetor de expressão ou partes do mesmo podem ser direcionado/aspara dentro de Ioci predeterminados. Alternativamente, o gene de fusão de-sejado é proporcionado como um plasmídeo replicando autonomamente.

O DNA codificando as proteínas de fusão de endoglucanase épreferencialmente colocado sob o controle de (isto é, encadeado operavel-mente a) algumas seqüências de controle tais como seqüências promotorasproporcionadas pelo vetor. Na transformação estas seqüências de controleintegram no genoma hospedeiro com o gene de interesse. Alternativamente,as seqüências de controle podem ser aquelas no sítio de integração.

As seqüências de controle de expressão de um vetor de expres-são variarão dependendo de se o vetor é designado para expressar um de-terminado gene em um hospedeiro procariótico ou em um eucariótico (porexemplo, um vetor de vaivém pode proporcionar um gene para seleção emhospedeiros bacterianos). As seqüências de controle de expressão podemconter elementos regulatórios transcripcionais tais como promotores, ele-mentos reforçadores, e seqüências de terminação transcripcional, e/ou ele-mentos regulatórios transcripcionais, tais como sítios de iniciação e de ter-minação translacional.

Diz-se que uma molécula de polinucleotídeo, tal como DNA, écapaz de expressar um polipeptídeo, se contiver seqüências de controle deexpressão, as quais contêm informação regulatória transcricional e as se-qüências referidas são ligadas operavelmente à seqüência de nucleotídeos,a qual codifica o polipeptídeo.

Uma ligação operável é uma ligação na qual uma seqüência éconectada a uma seqüência regulatória (ou seqüências) de modo tal a por aexpressão da seqüência sob a influência ou o controle da seqüência regula-tória. Diz-se que duas seqüências de DNA (tais como uma seqüência de re-gião promotora encadeada à extremidade 5' da seqüência codificando prote-ína) são encadeadas operavelmente se a função do promotor resulta natranscrição.

Os vetores da invenção podem compreender adicionalmenteoutros elementos regulatórios encadeados operavelmente, tais como se-qüências reforçadoras.

Em uma modalidade preferencial, são construídos transforman-tes geneticamente estáveis, por meio dos quais o DNA codificando as prote-ínas de fusão é integrado no cromossoma hospedeiro por transformaçãocom um vetor, o qual pode portar seqüências promovendo integração doreferido vetor no cromossoma.

Células que têm DNA estavelmente integrado codificando asproteínas de fusão de endoglucanase em seus cromossomas podem serselecionadas, por exemplo, por um ou mais marcadores introduzidos, homó-logos ou heterólogos, os quais possibilitam seleção de células hospedeirasas quais contêm o vetor de expressão no cromossoma, por exemplo, o mar-cador pode proporcionar resistência a biocida, por exemplo, resistência aantibióticos, ou metais pesados, tais como cobre, ou marcadores comple-mentando uma mutação auxotrófica no cromossoma hospedeiro, e seme-lhantes. O marcador selecionável pode ser, por exemplo, um gene de sele-ção diretamente encadeado às seqüências genéticas de DNA a serem ex-pressadas, ou introduzido na mesma célula por co-transformação. Tambémpodem ser usados outros sistemas de seleção.

Uma vez que o vetor de expressão contendo o DNA codificandoa proteína de fusão é preparado, é introduzido em uma célula hospedeiraapropriada por qualquer um de uma variedade de meios adequados, incluin-do transformação conforme de conhecimento na técnica. Depois de trans-formação, células receptoras são cultivadas em um meio seletivo apropriado,o qual seleciona para o crescimento de células transformadas.

Sistemas hospedeiros de expressão e produção adequados são,por exemplo, o sistema de produção desenvolvido para hospedeiros fúngi-cos Trichoderma (patente européia EP N9 244 234), ou Aspergillus, tais co-mo A. oryzae ou A. niger (publicação de patente internacional Ns WO97/08325 e publicação de patente internacional Ne WO 95/33386, PatenteU.S. Ns 5.843.745, Patente U.S. N9 5.770.418), ou o sistema de produçãodesenvolvido para Fusarium, tais como F. oxysporum (Malardier et al.,1989). Sistemas de produção adequados desenvolvidos para bactérias in-cluem um sistema de produção desenvolvido para Bacillus, por exemplo, B.subtilis, B.licheniformis, B. amyloliquefaciens ou para E. coli, ou para um ac-tinomycete Streptomyces. Sistemas de produção adequados desenvolvidospara leveduras são sistemas desenvolvidos para Saccharomyces, Shizosac-charomyces ou Pichia pastoris. Também são possíveis sistemas de produ-ção em outros micróbios ou em células mamíferas ou em plantas.

Expressão de uma ou mais seqüências genéticas clonadas re-sulta na produção da proteína desejada, ou na produção de um fragmentodesta proteína. Esta expressão pode ocorrer em uma maneira contínua nascélulas transformadas, ou em uma maneira controlada.

Para obter as preparações enzimáticas da invenção, os hospe-deiros tendo as propriedades desejadas (isto é, hospedeiros capazes de ex-pressar quantidades economicamente viáveis das proteínas de fusão de en-doglucanase) são cultivados sob condições adequadas, e as enzimas dese-jadas são preferencialmente secretadas a partir dos hospedeiros no meio decultura, e opcionalmente recuperadas do referido meio de cultura por méto-1dos conhecidos na técnica. Preferencialmente o hospedeiro para semelhanteprodução é um fungo filamentoso, tal como Trichoderma ou Aspergilius, eespecialmente T. reesei.

Conforme usado no presente contexto a "preparação enzimáti-ca" refere-se a qualquer produto enzimático, o qual contém no mínimo umaproteína de fusão de endoglucanase da invenção. Portanto, uma preparaçãoenzimática semelhante pode ser um meio de cultura gasto ou filtrado. Meiode cultura gasto significa o meio de cultura do hospedeiro compreendendoas enzimas produzidas. Preferencialmente, as células hospedeiras são se-paradas do referido meio depois da produção. Caso desejado, as prepara-ções referidas podem ser Iiofilizadas ou a atividade enzimática de modo di-verso concentrada e/ou estabilizada para armazenamento. Caso requerido,uma enzima desejada pode ser adicionalmente purificada de acordo commétodos convencionais, tais como extração, precipitação, cromatografia,cromatografia por afinidade, eletroforese, ou semelhantes.

No entanto, é uma vantagem da invenção que o meio de culturacom ou sem células hospedeiras possa ser utilizado como uma preparaçãoenzimática como tal sem purificação adicional, porque as proteínas de fusãode endoglucanase podem ser secretadas no meio de cultura, e apresentamatividade nas condições ambiente do meio de cultura gasto. As preparaçõesenzimáticas são muito econômicas de proporcionar e usar, devido a serdesnecessário o isolamento de uma enzima específica do meio de cultura.

Além da proteína de fusão de endoglucanase, as preparaçõesenzimáticas podem compreender uma ou mais enzimas diferentes, as quaispodem ser, por exemplo, outras celulases, amilases, lipases, proteases, he-micelulases, xilanases, pectinases e/ou oxidases tais como Iacases e pero-xidases. Alternativamente, antes, durante ou depois do tratamento com aproteína de fusão de endoglucanase pode ser realizado outro tratamentoenzimático. O tratamento enzimático pode compreender, por exemplo, um oumais tratamentos com amilase (por exemplo, para desengomação do de-nim), um ou mais tratamentos com celulase e/ou um ou mais tratamentoscom peroxidase e/ou lacase. Depende da aplicação quais outras enzimassão incluídas na preparação enzimática ou usadas no tratamento enzimáti-co.

Além da proteína de fusão, a preparação enzimática pode conteraditivos, tais como estabilizantes, tampões, conservantes, tensoativos e/oucomponentes do meio de cultura. Aditivos preferenciais são semelhantes, osquais são comumente usados em preparações enzimáticas pretendidas paraa aplicação, onde a preparação enzimática é usada.

As preparações enzimáticas podem ser proporcionadas comoum líquido ou como um sólido, por exemplo, como um pó seco ou granular,especialmente grânulos não-empoeirantes, ou um líquido estabilizado. Éprevisto que as preparações enzimáticas podem ser adicionalmente enri-quecidas, ou tornadas parcialmente ou completamente deficientes em ativi-dades enzimáticas específicas, de modo a satisfazer os requisitos de umautilidade específica em várias aplicações, por exemplo, na indústria têxtil.Uma mistura de atividades enzimáticas secretadas por um hospedeiro podeser vantajosa em uma aplicação industrial em particular, por exemplo, embioacabamento e bioesmerilhamento.

As proteínas de fusão de endoglucanase e as preparações dasmesmas são úteis, por exemplo, na indústria têxtil, de ração, de óleos vege-tais, de detergentes, e de polpa e papel. Podem ser usadas para tratar qual-quer material celulósico, tal como material têxtil, plantas usadas em raçãoanimal, material vegetal para extração de óleo, ou polpa mecânica ou quími-ca ou fibra secundária derivada de madeiras. Também podem ser adiciona-das em detergentes, os quais normalmente contêm auxiliares, tais como a-gentes ativos na superfície, tensoativos, agentes alvejantes e/ou construto-res. No presente contexto "material celulósico" refere-se a qualquer materialcompreendendo celulose ou derivados da mesma como um componentesignificativo. O material celulósico é contactado com uma quantidade eficazda proteína de fusão sob condições adequadas, tais como pH e temperaturaapropriados, e a reação é deixada para continuar por um tempo suficientepara a reação enzimática ocorrer.

As enzimas de fusão são especialmente úteis no tratamento demateriais têxteis, tais como tecidos e roupas. O material têxtil pode ser fabri-cado de fibras contendo celulose natural ou fibras contendo celulose sintéti-ca ou misturas das mesmas, ou uma combinação de fibras sintéticas e fibrascontendo celulose. Preferencialmente, o material contendo celulose é algo-dão, especialmente denim. Por "denim" se indica, em relação com esta in-venção, tecido de denim, geralmente roupas de denim, particularmente je-ans. Vantajosamente o denim é denim tingido com índigo. Denim tambémpode ser tratado com derivados de índigo ou com índigo junto com algumoutro corante, por exemplo, denim tingido com índigo com fundo de enxofre.

As endoglucanases de fusão são especialmente úteis em bio-esmerilhamento e bioacabamento de têxteis.

A lavagem à pedra tem três etapas: desengomação, abrasão epós-tratamento. A primeira etapa, o processo de desengomação é normal-mente o primeiro tratamento a úmido do jeans e significa remoção de amidoe outros agentes de engomação geralmente aplicados aos fios de urdidurapara prevenir dano durante o processo de tecedura. Alfa-amilases são usa-das para remover agentes de engomação à base de amido para processa-mento a úmido aprimorado e uniforme. Depois de desengomar os jeans sãonormalmente enxaguados com água ou passados diretamente para a etapade abrasão.

A segunda etapa, abrasão, pode ser realizada com enzimas oupedras-pomes ou ambas. Em todos os casos é necessária ação mecânicapara remover o corante, e o tratamento é geralmente realizado em máquinasde lavar roupa, como lavadoras de tambor. O termo "desgastado" significa oaspecto do tecido de denim, quando foi tratado por enzimas celulase ou pe-dras, ou ambas. Expressões sinônimas são lavado à pedra ou "aspecto usa-do". Em conseqüência de remoção desigual do corante há contrastes entreáreas tingidas e áreas das quais o corante foi removido.

A abrasão é geralmente seguida pela terceira etapa, pós-tratamento que inclui etapas de lavagem e enxágüe durante as quais podemser usados detergentes, abrilhantadores óticos, agentes alvejantes ou ama-ciantes. Depois do tratamento enzimático a reação deve ser interrompida demodo a prevenir dano dos materiais tratados, por exemplo, pela temperaturae/ou inativação do pH, o último compreendendo uma enxágüe completo e/oulavagem de detergente. Isto assegura que a resistência mecânica da fibranão é adicionalmente comprometida pela presença contínua da enzima.

Conforme usado no presente contexto a expressão "bioesmeri-lhamento" de tecido ou roupa significa o uso de enzimas ao invés de, ou a-lém de, pedras-pomes para o tratamento de tecido ou roupa, especialmentedenim.

Conforme determinado acima, tratamento com celulase podesubstituir completamente tratamento com pedras-pomes (por exemplo, 1 kgde enzima comercial vs. 100 kg de pedras). No entanto, tratamento com ce-lulase também pode ser combinado com tratamento com pedras-pomes,quando se deseja produzir um acabamento fortemente desgastado. Um efei-to de pele de pêssego no qual se cria uma fina cobertura semelhante a pêlosse projetando também é obtido por uma lavagem combinando uma celulaseneutra com pedras-pomes. As proteínas de fusão descritas são especial-mente úteis para proporcionar de modo eficaz um aspecto desgastado e pa-ra minimizar a retropigmentação em bioesmerilhamento.Bioesmerilhamento é tipicamente realizado em cerca de pH 3.0a 8.0, e preferencialmente em pH 5.0 a 7.0. A temperatura da reação podevariar de cerca de 30°C a 80°C e é preferencialmente entre 50 a 60°C. Aproporção de solução (a proporção do volume de líquido por peso de tecido)pode variar de cerca de 3:1 a 20:1, preferencialmente 5:1 a 10:1. O tempode tratamento pode variar entre 15 min a 90 min e preferencialmente 30 mina 60 min. Deve ser enfatizado que a dosagem enzimática depende grande-mente do tipo dos tecidos, maquinaria, condições do processo (pH, tempera-tura, proporção de solução, tempo de tratamento, carga de denim, escala doprocesso) e do tipo de preparação enzimática e semelhantes. Caso deseja-do, pedras-pomes podem ser usadas em combinação com as proteínas defusão de endoglucanase. A dosagem enzimática requerida será então signi-ficativamente menor. Uma pessoa versada na técnica é capaz de definir do-sagens e condições adequadas.

As proteínas de fusão de endoglucanase da presente invençãoproporcionam vantagens inesperadas em que a performance enzimática éelevada e o retrotingimento é baixo resultando em contraste muito bom. A-lém disso, as proteínas de fusão são facilmente fabricadas, e podem ser u-sadas em uma faixa relativamente ampla de temperatura e pH.

Além disso, as proteínas de fusão de endoglucanase são úteisem bioacabamento de tecidos e roupas. "Bioacabamento" refere-se ao usode enzimas em uma hidrólise controlada de fibras celulósicas de modo amodificar a superfície do fio ou tecido em uma maneira que evita permanen-temente a formação de bolinhas, melhora o manuseio do tecido como maci-ez e lisura, clareia a estrutura superficial reduzindo o esfiapamento, o queresulta em clarificação das cores, melhora a drapabilidade do tecido, melho-ra a absorvência de umidade e que pode melhorar também a tingibilidade.

Depilling enzimático pode ser realizado em qualquer estágio du-rante processamento a úmido de têxteis, preferencialmente depois de opcio-nal desengomação e/ou branqueamento, e podem ser usadas condiçõessimilares como em bioesmerilhamento.

As proteínas de fusão de endoglucanase possuindo também ati-vidade de betaglucanase, hemicelulase ou xilanase são adicionalmente úteispara melhorar a qualidade de ração animal, por meio do que material vegetalé tratado com as enzimas.

Amido, proteínas e lipídeos podem ser facilmente degradadospelo sistema digestivo de animais monogástricos tais como aves domésticase porcos, ao passo que a principal parte de polissacarídeos não amido(NSP) incluindo beta-glucanos misturados-encadeados de, por exemplo, ce-vada e aveia permanecem intactas devido à falta de semelhantes atividadesenzimáticas dentro do animal. Além disso, a digestibilidade de outros com-ponentes, particularmente gorduras animais, é reduzida na presença deNSP.

Beta-glucanases têm sido usadas comercialmente para aliviarproblemas causados por beta-glucanos misturados-encadeados de cevada eaveia. Betaglucanases são conhecidas para reduzir a viscosidade intestinalcausada por betaglucanos solúveis bem como para liberar nutrientes encap-sulados por paredes celulares ricas em beta-glucanos. O uso de beta-glucanases melhora a performance animal, a qual pode ser vista como au-mento do ganho de peso e da proporção de conversão da ração. Além disso,são tipicamente reduzidas as incidências de excrementos viscosos em avesdomésticas.

Peletização a vapor é a principal tecnologia de processamentode ração em todo o mundo. Suas vantagens em relação à produção de ra-ções de farelo ensopado incluem manuseio mais fácil, redução de organis-mos e substâncias tóxicas, e acima de tudo aumentada eficiência da ração.A termotolerância e alta performance das proteínas de fusão descritas aqui,neste requerimento de patente, as tornam adequadas para aplicações deração.

A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.No entanto, deve ser entendido que as modalidades dadas na descrição a-cima e nos exemplos são para fins ilustrativos somente, e que são possíveisvárias alterações e modificações dentro do âmbito da invenção.Exemplo 1. Produção de celulase ALK04242 EG28 de Thermoascus auran-tiacus em Trichoderma reesei

Métodos de biologia molecular de rotina foram usados no isola-mento e tratamentos enzimáticos de DNA (plasmídeos, fragmentos de DNA),em transformações de E. coli, e etc. Os métodos básicos usados são descri-tos nos manuais de biologia molecular de rotina, por exemplo, Sambrook etal. (1989) e Sambrook e Russell (2001).

O gene de Thermoascus aurantiacus ce/5A (SEQ ID NO: 1) co-dificando celulase EG28 (SEQ ID NO: 2) foi amplificado por PCR diretamen-te a partir do DNA genômico de T. aurantiacus ALK04242, isolado pelo mé-todo de Raeder e Broda (1985). Os iniciadores dianteiro (SEQ ID NO: 9) ereverso (SEQ ID NO: 10) foram designados com base na seqüência de en-doglucanase de T. aurantiacus publicada (AF487830). O produto de 1,3 kbamplificado contendo o gene exato (do códon de START para STOP) foi clo-nado como um fragmento Sacll-Pstl no vetor pBluescript Il KS+. Dois clonesindependentes foram seqüenciados e um clone foi selecionado e designadocomo pALK1926. O número de depósito da cepa de E. coli contendopALK1926 na coleção de cultura Deutsche Sammlung von Mikroorganismenand Zellkulturen GmbH é DSM 17326.

Um plasmídeo de expressão (pALK1930, Fig. 1) foi construídopara produção de celulase EG28/Cel5A de T. aurantiacus recombinante(SEQ ID NO: 2). O gene ce/5A, incluindo sua própria seqüência de sinal, foiexatamente fundido ao promotor de T. reesei cbhl (cel7A) por PCR. O genepromotor cbhl, terminador cbhl e marcador amdS foram incluídos conformedescrito em Paloheimo et al. (2003). O cassete de expressão linear (Fig. 1)foi isolado da espinha dorsal do vetor por digestão por enzima de restrição,transformado em T. reesei A96, e transformantes foram selecionados comacetamida como única fonte de nitrogênio. A cepa hospedeira carece dequatro celulases endógenas principais: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, E-GI/Cel7B e EGII/Cel5A. Transformações foram realizadas de acordo comPenttila et al. (1987) com as modificações descritas em Karhunen et al.(1993). Os transformantes foram purificados sobre placas de seleção atravésde conídios únicos antes de os esporular sobre PD.A produção de celulase dos transformantes foi analisada a partirdos sobrenadantes da cultura de culturas de frasco agitado (50 ml). Trans-formantes foram cultivados por 7 dias em um meio indutor de complexo celu-lósico (Joutsjoki et al. 1993) tamponado com 5% de KhfePO4 em pH 5.5. Aatividade enzimática da proteína recombinante foi medida a partir do sobre-nadante da cultura como a liberação de açúcares redutores de carboximetil-celulose (2% de CMC) a 50°C em tampão Sitrate a 50 mM pH 4.8 essenci-almente conforme descrito por Bailey e Nevalainen 1981; Haakana et al.2004. A atividade contra beta-glucano de cevada (1%) também foi deter-minada medindo a liberação de açúcares redutores a 50°C em tampão deacetato a 50 mM pH 4.8 conforme descrito por St6lbrand et al. 1993. Produ-ção da proteína recombinante também foi detectada a partir do sobrenadan-te da cultura por eletroforese por gel de poliacrilamida SDS. Os genótiposdos transformantes escohidos foram analisados por Southern blotting usan-do o cassete de expressão como uma sonda.

O pH ótimo da celulase Ta EG28/Cel5A produzida heterologa-mente fgoi determinado no tampão de Mcllvaine universal dentro de umafaixa de pH de 4.0 a 8.0 usando carboximetilcelulose como substrato. Con-forme mostrado na Figura 2A o pH ótimo para atividade de celulaseEG28/Cel5A é em pH 6.0. A temperatura ótima para a atividade enzimáticade celulase EG28/Cel5A foi determinada para ser 75°C (Figura 2B).

O transformante escolhido (RF6188) foi cultivado em um biorrea-tor para obter material para os testes de aplicação (vide o Exemplo 4).Exemplo 2. Produção da proteína de fusão recombinante de Thermoascusaurantiacus ALK04242 EG28+CtCBD

Para produzir uma proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermo-ascus aurantiacus recombinante (SEQ ID NO: 4), o domínio de ligação decelulose (CBD) da celulase CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilumALK04265 foi encadeado à celulase EG28/Cel5A. O constructo contém odomínio catalítico de EG28 (aminoácidos 1-334 do polipeptídeo de extensãototal) ficado à região encadeadora e CBD de C. thermophilum CBHI/ Cel7ACtCBD (SEQ ID NO: 15).Métodos de biologia molecular de rotina foram usados conformedescrito no Exemplo 1. Primeiro, um único sítio de restrição SnaBI próximo àextremidade de C-terminal da seqüência EG28/Cel5A foi introduzido porPCR. Isto possibilita fusão direta de qualquer DNA "blunt-ended" depois do aminoácido Y334 do polipeptídeo EG28/Cel5A. O encadeador e região CBDdo gene codificando CBHI/Cel7A de C. thermophilum (ce/7A, SEQ ID NO: 7)foi amplificado por PCR usando iniciadores dianteiro (SEQ ID NO: 11) e re-verso (SEQ ID NO: 12) e DNA genômico de C. thermophilum ALK04265 co-mo modelo. O produto de 1,6 kb amplificado foi ligado ao gene ce/5A (depoisde Y334) para criar Ta ce/5A Ct ce/7AlinkerCBD (SEQ ID NO: 3). O plasmí-deo resultante foi designado como pALK1946. O número de depósito da ce-pa de E. coli contendo pALK1946 na coleção de cultura Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH é DSM 18159.

Um plasmídeo de expressão (pALK1948, Fig 1) para produçãoda celulase EG28+CtCBD foi construído conforme descrito no Exemplo 1. Ocassete de expressão de 8,9 kb linear (Figura 1) foi isolado da espinha dor-sal do vetor por digestão por enzima de restrição Notl, transformado em T.reesei A33 (a cepa tem os genes codificando as quatro celulases principaisCBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A eliminados), e transfor-mantes selecionados conforme descrito no Exemplo 1. O pH e temperaturaótimos da proteína de fusão foram determinados para serem os mesmos queos da proteína EG28 selvagem.

O transformante escolhido (RF6377) foi cultivado em um biorrea-tor para obter material para os testes de aplicação (vide os Exemplos 5 a10).

Exemplo 3. Produção da proteína de fusão recombinante de Acremoniumthermophilum ALK04245 EG40+CtCBD

Para produção de uma proteína de fusão EG40+CtCBD de A-cremonium thermophilum ALK04245 recombinante (SEQ ID NO: 6), o domí-nio de ligação de celulose de celulase EG40 é substituído com o da C-BHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum ALK04265. O constructo contém odomínio catalítico da celulase EG40 (aminoácidos 1 a 234 do polipeptídeode extensão total) fixado à região encadeadora e CBD de CBHI/Cel7A de C.thermophilum (CtCBD, SEQ ID NO: 15).

Métodos de biologia molecular de rotina são usados conformedescrito no Exemplo 1. O gene ce/45A de Acremonium thermophilum (SEQID NO: 8) é amplificado por PCR a partir do DNA genômico ALK04245 de A.thermophilum usando os iniciadores (SEQ ID NO: 13) e (SEQ ID NO: 14). Ofragmento de PCR de 1,1 kb é clonado como um fragmento Sacll-Pstl novetor pBluescript Il KS+. Depois disso, um único sítio de restrição Nrul pró-ximo à extremidade de C-terminal da seqüência EG40 é introduzido por P-CR. Isto possibilite fusão direta de qualquer DNA blunt-ended depois do a-minoácido S234 do polipeptídeo EG40. O encadeador mais região CBD dacelulase CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum (ce17A) é amplificadopor PCR conforme descrito no Exemplo 2 e um fragmento de restrição domesmo é ligado ao gene ce/45A (depois de S234) para criar At ce/45A_Ctcef7AlinkerCBD (SEQ ID NO: 5). Um plasmídeo de expressão para produ-ção da celulase EG40+CtCBD é construído e a proteína recombinante (SEQID NO: 6) é produzida em Trichoderma conforme descrito no Exemplo 1.Exemplo 4. Performance de celulase EG28 em acabamento de denim emdiferentes temperaturas

Celulase EG28 de Thermoascus aurantiacus produzida em Tri-choderma (cepa RF6188) conforme descrito no Exemplo 1 foi testada parasua capacidade para criar um aspecto desgastado similar ao proporcionadopor pedras-pomes em bioesmerilhamento de denim em diferentes tempera-turas. Uma enzima de acabamento de denim eficiente, uma preparação decelulase ácida enriquecida com EGII comercial produzida em Trichoderma(Patente U.S. Ne 5.874.293) foi usada como uma referência.

Jeans feitos de sarja de denim tingido com índigo foram usadoscomo material de teste depois de desengomação com alfa-amilase ECOS-TONΕ® A200. Os tratamentos com celulase foram realizados com Iavadora-extratora Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob condições descritas naTabela 1.

A atividade de endoglucanase (ECU) das preparações enzimáti-cas usadas foi medida como a liberalão de açúcares redutores de hidroxietilcelulose conforme previamente descrito (Bailey e Nevalainen, 1981). O con-centrado enzimático enriquecido com EGII e a preparação de EG28 foramdosados a 220 ECU/g e cerca de 380 ECU/g de tecido, respectivamente. Asenzimas foram testadas em sua faixa de pH ótimo, a preparação de EGII empH 5 e a preparação de EG28 em pH 6. Depois de drenagem, a enzima foiinativada (por 10 minutos a 40°C) aumentando o pH acima de 11 com hidró-xido de sódio. Os jeans foram então ensaguados três vezes com água e se-cados em uma secadora de tambor.

O efeito de bioesmerilhamento / nível de abrasão foi avaliadomedindo a cor como valores de reflectância com um espectrofotômetro Mi-nolta CM 2500 usando as coordenadas de espaço de cor L*a*b* (iluminanteD65/ 2o). A cor da face e do lado reverso do denim e dos bolsos foi medidadepois de desengomação (isto é, antes do tratamento com celulase) e de-pois do tratamento com celulase. Cada medição sobre o lado de face, ladoreverso ou bolsos foi a média de 40, 20, ou 12 medições aproximadas, res-pectivamente. Dois pares de jeans foram usados em cada teste e o resulta-do final foi a média das mesmas. Os resultados são mostrados na Tabela 2e na Figura 3.

Tabela 1. Condições de teste / parâmetros do processo usados em trata-mentos com celulase.

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Tabela 2. Medições da cor de denim tratado com celulase EG28 em di-ferentes temperaturas.

Como referência foi usado tratamento com preparação enrique-cida de EGII. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul, +b* é a dire-ção do amarelo.

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Os resultados na Tabela 2 e na Fig. 3 mostram que o melhorefeito de abrasão com a preparação EG28 (cepa RF6188) foi obtido na faixade 50 a 70°C. Usando uma dosagem de 380 ECU/g de tecido da preparaçãoEG28 a 70°C foi obtido um nível de abrasão similar (luminosidade L*) com-parado com usando a dosagem de 220 ECU/g de tecido de uma preparaçãoenriquecida de EGII a 60°C. No entanto, o efeito de retro-pigmentação (re-deposição de corante índigo) sobre o lado reverso do denim e bolsos foi me-nor com a preparação EG28 (maior luminosidade, menos azul) do que com apreparação EGII enriquecida. Além disso o contrasts sobre o lado de face dodenim teve aspecto melhor.

Exemplo 5. Performance de proteína de fusão EG28+CtCBD comparadacom celulase EG28 em acabamento de denim

Proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacusrecombinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) conforme descritono Exemplo 2 foi comparada com a preparação EG28 da cepa RF6188 embioesmerilhamento de denim em pH 6, 60°C. O denim e sistema de testepara bioesmerilhamento foram como no Exemplo 4, exceto que a quantidadede denim foi nivelada para 1430 g com uma peça extra de denim diferenteque não foi incluída nas medições. O efeito do tratamento com celulase foiavaliado como no Exemplo 4.

Os resultados na Tabela 3 mostram que o efeito de bioesmeri-Ihamento da preparação EG28+CtCBD foi muito bom em uma baixa dosage.Com a cepa RF6377 foi obtido um nível de abrasão similar (luminosidade L*)com dosagem 6,5 vezes menor comparada com RF6188. O encadeamentodo domínio de ligação de celulose (CBD) a celulase EG28 não aumentou oefeito de retropigmentação indesejável, mas aumentou muito a performancede lavagem desejada.

Tabela 3. Medições da cor de denim tratado com celulases EG28 e EG28+CtCBD a 60°C, pH 6.

L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul, +b* é a direção do amare-lo.<table>table see original document page 30</column></row><table>

Exemplo 6. Performance de celulase EG28+CtCBD comparada com celula-se EGII em acabamento de denim

Proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacusrecombinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) foi comparada coma preparação de celulase ácida enriquecida EGII comercial (Patente Nq U.S.5.874.293) em bioesmerilhamento de denim.

O sistema de teste para bioesmerilhamento foi como no Exem-plo 4, exceto que foram usadas peças (pernas) de vários tipos de Denim di-ferentes da Ukos Sport (Bélgica) e Vicunha (Brasil) (total de 1,2 kg). As con-dições para tratamento com EG28+CtCBD e EGII foram como na Tabela 4.O efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 4.

Os resultados dos experimentos realziados com quatro tecidosde denim diferentes são mostrados nas Tabelas 4 e 5. Usando uma dosa-gem enzimática de 500 ECU/g de tecido de preparação EG28+CtCBD foiobtido um nível de luminosidade similar comparado com o uso de uma do-sagem de 1000 ECU/g da preparação enriquecida com EGIL A performanceda preparação EG28+CtCBD necessitou em torno de somente metade daatividade de ECU daquela da celulase enriquecida com EGII. Além disso, omeio de cultura de EG28+CtCBD produzida pelo hospedeiro recombinante évolumetricamente cerca de duas vezes mais tão eficaz quanto o do hospe-deiro recombinante produtor de EGII em bioesmerilhamento. Foi observadoconsideravelmente menos retropigmentação sobre o lado reverso do denimquando foi usada a preparação EG28+CtCBD. A performance da preparaçãoEG28+CtCBD a 50°C foi melhor em pH 6 do que em pH 5.

Tabela 4. Medições da cor sobre o lado da face de denim tratado com celu-lase EG28+CtCBD em pH 5 e 6. Tratamento com preparação enriquecidacom EGII foi usado para comparação. L* indica a luminosidade, -b* é a dire-ção do azul, +b* é a direção do amarelo.

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Tabela 5. Medições de cor sobre o lado reverso de denim tratado com celulase

EG28+CtCBD em pH 5 e 6. Tratamento com preparação enriquecida com EGII foiusado para comparação. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul.

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Exemplo 7. Efeito do pH sobre a performance de preparação de celulaseEG28+CtCBD a 50°C e a 60°C

Proteína de fusão EG28+CBD de Thermoascus aurantiacus re-combinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) foi testada para suaperformance em bioesmerilhamento de denim em diferentes valores de pHem 50°C e em 60°C.

Sarja de denim tingida com índigo (diferente dos exemplos pré-vios) que foi desengomada e cortada em pedaços foi usada como materialde teste. Tratamentos com celulase foram realizados em LP-2 LaunderOmeter como se segue. Cerca de 7,2 g de tecido de denim (amostra de cer-ca de 12 cm χ 12 cm), 200 ml de tampão de fosfato de citrato de Mc llvaine,e 90 bolas de aço (diâmetro 0,6 cm) foram carregados em recipientes de 1,2litro. O Launder Ometer foi rodado por 120 min em diferentes valores de pHde 4 a 8 usando temperaturas de 50°C e de 60°C. Depois de remover asamostras dos recipientes eles foram enxaguados com água e embebidas emágua contendo NaOH (pH>11) por 10 min com misturação. Depois disso, asamostras foram embebidas em água quente contendo detergente líquido(OMO Color) e misturadas por 10 min, seguidos por cuidadoso enxágüe comágua quente por várias vezes. As amostras foram secadas em temperaturaambiente. O efeito de bioesmerilhamento foi avaliado medindo a cor comounidades de reflectância conforme descrito no Exemplo 4. Cada valor demedição sobre o lado de face da amostra de denim foi a média de no míni-mo 20 medições.

Os resultados mostrados nas Tabelas 6 e 7 e nas Figuras 4 e 5mostram que a faixa de pH mais ótimo para a celulase EG28+CtCBD em 50°é 5.5 a 6.5 e em 60°C é 5 a 7.

Tabela 6. Medições de cor sobre o lado de face de denim tratado com celu-lase EG28+CtCBD em diferentes valores de pH em Launder a 50°C.

L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul.

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Tabela 7. Medições de cor sobre o lado de face de denim tratado com celu-lase EG28+CtCBD em diferentes valores de pH em Launder a 60°C.L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul.

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Exemplo 8. Performance de preparação de celulase EG28+CtCBD em aca-bamento de denim em diferentes temperaturas

Proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacusrecombinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) conforme descritono Exemplo 1 foi testada para sua capacidade para criar um aspecto des-gastado similar ao proporcionado por pedras-pomes em bioesmerilhamentode denim em diferentes temperaturas. Enzimas de acabamento de denimeficientes, preparação de celulase ácida enriquecida com EGII comercial(patente Ne U.S. 5.874.293) e preparação de celulase neutra ECOSTONE®C1 foram usadas como referência.

O sistema de teste para bioesmerilhamento foi como no Exem-plo 4, exceto que foram usados sarja de denim diferente e um tempo de la-vagem de 55 min. A atividade enzimática (unidade de endoglucanase, ECU)das preparações enzimáticas enriquecidas com EG28+CtCBD e EGII foimedida como no Exemplo 4. A atividade (unidade de celulase neutra, NCU)da preparação de celulase neutra ECOSTONE® C1 foi medida como a libe-ração de açúcares redutores de carboximetil celulose conforme previamentedescrito (Bailey e Nevalainen, 1981; Haakana et al. 2004). As preparaçõesECOSTONE® C1, EG28+CtCBD, ou EGII enriquecidas foram dosadas a 250NCU/g, 500 ECU/g, ou 1000 ECU/g de tecido, respectivamente. O efeito dotratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 4.

A performance de EG28+CtCBD em temperaturas de 40 a 70°C,pH 6 é mostrada na Tabela 8 e na Figura 6. A faixa de temperatura prefe-rencial oara a enzima é 50 a 70°C. Temperaturas menores como 40°C po-dem ser usadas para obter um efeito de abrasão com menos retirada de corse for desejável um visual mais escuro.

Os resultados também estão de acordo com os obtidos no E-xemplo 6, onde foi mostrado que a performance de EG28+CtCBD em bio-esmerilhamento era cerca de duas vezes mais eficaz do que a da prepara-ção de celulase ácida enriquecida EGII comercial. Celulases ácidas geral-mente têm uma tendência de retropigmentação. Celulases neutras, comoECOSTONE® C1, tipicamente causam baixa retropigmentação portanto re-sultando em bom contraste. Os resultados obtidos aqui mostram que foi ob-tido um efeito similar com a celulase EG28+CtCBD como com as celulasesneutras (Tabela 8).

Tabela 8. Medições de cor de denim tratado com celulase EG28+CtCBD emdiferentes temperaturas.

Tratamento com celulase ácida enriquecida com EGII e preparação de celu-lase neutra ECOSTONE® C1 foi usada como referência. L* indica a Iumino-sidade, -b* é a direção do azul, +b* é a direção do amarelo.

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Exemplo 9. Performance de celulases EG28 e EG28+CtCBD em bioacaba-mento (depilling)

Foi testada a performance da celulase EG28 da cepa RF6188 eda preparação EG28+CtCBD da cepa RF6377 em depilling de artigos demalha de algodão. Os tratamentos com celulase foram realizados com lava-do ra-extratora Wascator FOM 71 CLS da Electrolux sob condições descritasna Tabela 9.

Pedaços de dois tipos de suéteres de gola Polo de baixa quali-dade com superfície esfiapada, feitos de tecido à base de 100% de jérsei dealgodão ou estrutura feita de 95% de algodão e 5% de Iycra foram usadoscomo material de teste com material de enchimento. Primeiro, as amostrasforam pré-lavadas por 10 min a 60°C com 1 ml/L de tensoativos / agentesumectantes (Sandoclean PCJ da Sandos e Imacol CN da Clariant) e enxa-guadas três vezes com água. Depois disso, as malhas de algodão foramtratadas com celulase a 60°C por 60 minutos, na presença dos mesmos au-xiliares têxteis conforme usado na pré-lavagem. A enzima foi inativada con-forme descrito no Exemplo 4, exceto pela temperatura, a qual foi de 60°Cdurante o enxágüe alcalino. Os pedaços de artigos de malha foram enxa-güados três vezes e depois disso secados na secadora de tambor.

Tabela 9. Condições de teste / parâmetros do processo usados em trata-mentos de bioacabamento.

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O efeito do tratamento com celulase foi avaliado visualmente aolho nu e com uma lupa. Uma amostra pré-lavada sem enzima foi usadacomo controle.

Os resultados mostraram que a preparação EG28+CtCBD au-mentaram as propriedades de depilling. O esfiapamento superficial do artigode malha foi consideravelmente reduzido depois de tratamento com a prepa-ração EG28+CtCBD comparado com o controle (tratamento sem enzima).Além disso, a preparação EG28 teve um efeito de depilling.Exemplo 10. Teste da estabilidade de peletização de ração

Duas preparações de celulose, EG28 (cepa RF6188) eEG28+CtCBD (cepa RF6377) foram testadas separadamente em um expe-rimento, o qual estimula um processo de produção de ração industrial. Antesde experimentação as preparações EG28 ou EG28+CtCBD secadas porpulverização foram trituradas com polvilho de trigo de modo a melhorar ahomogeneidade no nível da ração. Enzimas EG28 ou EG28+CtCBD pré-misturadas com polvilho foram adicionadas em uma dosagem de 200 g/t eem 500 g/t de ração, respectivamente. Foi usada superdosagem enzimáticapara facilitar análise de amostras peletizadas em altas temperaturas, onde aatividade pode ter sido substancialmente reduzida.

O moinho e misturador são usados para produzir misturas defarinha grossa como parte de uma planta de ração semi-industrial com umacapacidade de peletização nominal de 5 t/h. O moinho é um moinho de mar-telos Champion equipado com molde de □ 3,0 mm. A matéria-prima trituradaé misturada em um misturador horizontal de 2.500 litros a 27 rpm antes deser transferida para a miniplanta de moagem de ração. A planta compreendeum misturador horizontal (700 L de volume, velocidade de 48 rpm, lotes demistura de 300 kg), um dozing screw Skjold TR e um misturador de cascataKahl (extensão 130 cm, diâmetro 30 cm, velocidade 155 rpm, equipado com37 palhetas ajustáveis). O tempo de pausa para 300 kg/h é aprox. 30 seg.Montada sobre o lado do misturador de cascata está uma tubulação com umdescarregador de água e 3 válvulas de vapor a partir das quais o vapor éconduzido para a farinha grossa. O vapor é proporcionado por um boiler dealta pressão com uma capacidade máxima de 400 kg de vapor/h. Os testessão conduzidos com superpressão de 2 atmosferas e o vapor é conduzidoatravés de uma válvula de redução da pressão, a qual controla a adição devapor ao misturador de cascata. Três válvulas sobre a tubulação são usadaspara fino ajustamento da temperatura da farinha grossa desejada. A tempe-ratura da farinha grossa é medida por um termômetro digital colocado nasaída do misturador de cascata, logo antes da farinha grossa entrar no mol-de de pélete. A prensa de pélete é um Simon Heesen, tipo labor (monorrolo)com um molde de 0,3 mm * 35 mm e um motor de 7,5 kW. Diâmetro internodo molde: 173 mm, altura do rolo de pressão: 50 mm, diâmetro do rolo depressão: 140 mm, taxa de curso 500 rpm e capacidade nominal: 300 kg/h.As amostras são colhidas depois da prensa de pélete e resfriadas em umacaixa de refrigeração particionada com fundo perfurado, ventilador: 1500 m3de ar/ hora.

Foi produzido um lote de 300 kg de uma ração de farelo enso-pado à base de trigo. Uma pré-mistura foi produzida a partir de 10 kg destafarinha grossa e 200 g (ou 500 g) da enzima de teste em um misturadorcompulsório de de 70 litros. Velocidade do misturador: 45 rpm. Tempo demistura: 10 min. Esta pré-mistura foi adicionada com 290 kg da ração aomisturador horizontal na miniplanta de moagem de ração e foi misturada por10 minutos. Depois de amostragem da ração de farelo ensopado, a ração foipeletizada através da prensa de pélete (molde de □ 0,3 mm). A farinha gros-sa foi aquecida até temperatura alvo (65 a 90°C) ajustando adição de vaporao misturador de cascata. Para cada temperatura, uma amostra foi primeirocolhida 10 minutos depois de ser obtida a temperatura de peletização alvo(conforme medida na farinha grossa logo antes da peletização). Amostrasforam colhidas durante 1,0 min correspondendo a 5,0 kg de ração peletiza-da. A amostra foi colhida como subamostras de aproximadamente 500 gra-mas e colocada em uma caixa de refrigeração por 10 a 15 segundos depoisdas péletes terem deixado a prensa de pélete. Todas as amostras foram ae-radas e resfriadas em temperatura ambiente por 15 minutos. As amostrasforam homogeneamente sub-amostradas sobre um divisor de amostras dedispositivo de calha para retenção das mesmas e preenchidas em sacosplásticos.

As amostras foram analisadas como se segue: 2,5 g de amostrabem triturada e 20 ml de tampão de acetato (0,05 M, pH 5.0) foram agitadospor 30 min em temperatura ambiente, centrifugadas (10 min, 4000 rpm) ediluídas. 1,0 ml de amostra clareada em triplicata foi equilibrado por 5 minem um banho de água a 40°C. A reação foi iniciada por adição de um com-primido de Beta-Glucazyme (Megazyme, Irlanda) sem agitação. Depois deexatamente 30 min a reação foi interrompida adicionando 5,0 ml de TrizmaBase a 1% (peso/ vol) (Sigma-AIdrich) com vigorosa agitação sobre um mis-turador de vórtice. O tubo foi deixado em temperatura ambiente por cerca de5 min; a pasta semifluida foi agitada de novo e filtrada através de papel-filtroWhatman 1. A absorvência do filtrado foi medida a 590 nm. Os resultadosforam analisados usando uma curva padrão.

Recuperações da atividade enzimática antes e depois de peleti-zação são apresentadas na Tabela 10. A influência da temperatura de pele-tização sobre a recuperação da atividade de betaglucanase também foi a-presentada nas Figuras 7 e 8. As celulases EG28 e EG28+CtCBD foram es-táveis até 80°C. A celulase EG28+CtCBD tendeu a ser mais estável do queEG28 na temperatura de peletização de 90°C.

Tabela 10. Recuperações da atividade enzimática antes (farinha grossa demisturador horizontal) e depois de peletização em temperaturas variando de 65 a 90°C.

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Lista de organismos depositados

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% Centralbureau Voor Schimmelcultures em Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utre-cht, Países Baixos

(2) o Centralbureau Voor Schimmelcultures em Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Baixos(3)Deutsche Sammiung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSMZ), MascheroderWeg 1 b, D-38124 Braunschweig, AlemanhaReferências

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<110> AB Enzymes Oy

<120> Proteínas de Fusão Enzimática e seu Uso

<130> 2060570

<160> 15

<170> Patente em versão 3,2

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> Thermoascus aurantlacus

<220>

<221> gene<222> (1)..C1317)

<220>

<221> xntron<222> (107)..(161)

<220>

<221> mtron

<222> (221)..(280)

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<222> (434).,(492)

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<222> (558)..(631)

<220>

<22l> intron

<222> (730)..(790)

<400> 1

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aattcgtgga ccggggcatg gacctggacg aacgtgaacg ataacatgaa aagcctgacc 960

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ccggacaatg gcatcgcgta tcagcagata cttcctattt tgactccgta tctttga 1317

<210> 2<211> 335

<212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus<400> 2

Met Lys Leu Gly Ser Leu VaT Leu Ala Leu ser Ala Ala Arg Leu Thr15 10 15

Leu ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Glr» Glu Thr Lys Arg Ala Lys20 25 30

Val Phe Gln Trp Phe Gly Ser Asn Glu ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser35 40 45

Gln Asn Leu Pro Gly vai Glu Gly Lys Asp Tyr Ile Trp Pro Asp Pro50 55 60

Asn Thr He Asp Thr Leu Ile ser Lys Gly Met Asn Ile Phe Arg vai65 70 75 80

Pro Phe Met Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Ser Met Thr Gly ser Pro85 90 95

Asp Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu Ile Ala Thr vai Asn Ala Ile Thr100 10S 110

Gln Lys Gly Ala Tyr Ala Val vai Asp Pro His Asn TVr Gly Arg Tyr115 120 125

Tyr Asn ser Ile He Ser Ser pro ser Asp Phe Gln Thr Wie Trp Lys130 135 140

Thr Val Ala Ser Gln Phe Ala ser Asn Pro Leu vai Ile Phe Asp Thr145 150 155 160

Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Thr Leu Val Leu Asn Leu Asn165 170 175Gln Ala Ala Xle Asp Gly ile Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr180 185 190

ile Phe vai Glu Gly Asn ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn195 200 205

Val Asn Asp Asn Met Lys ser Leu Thr Asp Pro Ser Asp Lys lie ile210 215 220

Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala225 230 235 240

Thr Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Gln Glu Arg Ile Thr Ser Ala Thr245 250 255

Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu Phe Ala260 265 270

Gly Gly Ala Asn Asp Val cys Glu Thr Ala ile Thr Gly Met Leu Asp275 280 285

Tyr Met Ala Gln Asn Thr Asp vai Trp Thr Gly Ala ile Trp Trp Ala290 295 300

Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe ser Met Glu Pro Asp Asn305 310 315 320

Gly ile Ala Tyr Gln Glri Ile Leu Pro Ile Leu Thr Pro Tyr Leu325 330 335

<210> 3<211> 1621<212> DNA

<213> Thermoascus aurantiaeus<220>

<22l> gene<222> (1).·(1621)

<22Q>

<221> Intron<222> (107)..(161)

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<221> Intron

<222> (1549)..(1612)

<400> 3

atgaagctcg gctctctcgt gctcgctctc agcgcagcta ggcttacact gtcggcccct 60ctcgcagaca ggaagcagga gaccaagcgt gcgaaagtat tccaatgttc gtaacatcca 120cgtctggctt gctggcttac tggcaactga caatggcgaa gggttcggtt caaacgagtc 180cggtgctgaa ttcggaagcc agaaccttcc aggagtcgag gtcagcatgc ctgtactctc 240tgcattatat taatatctca agaggcttac tctttcgcag ggaaaggatt atatatggcc 300tgatcccaac accattgaca cattgatcag caaggggatg aacatctttc gtgtcccctt 360tatgatggag agattggttc ccaactcaat gaccggctct ccggatccga actacctggc 420agatctcata gcggtacatt tcaattccac catgtttgga gctgtcttcg ttgtgctgac 480atttaatggt agactgtaaa tgcaatcacc cagaaaggtg cctacgccgt cgtcgatcct 540cataactacg gcagatagtg aggtccccgg ttctggtatt gctgctgtat atctaagtag 600atatgtgttt ctaacatttc cacgatttca gctacaattc tataatctcg agcccttccg 660atttccagac cttctggaaa acggtcgcct cacagtttgc ttcgaatcca ctggtcatct 720tcgacactag taagctgaac acccgaaatt aactgagtct gagcatgtct gacaagacga 780tecatgaaag ataacgaata ccacgatatg gaccagacct tagtcctcaa tctcaaccag 840gccgctatcg acggcatccg ttccgccgga gccacttccc agtacatctt tgtcgagggc 900aattcgtgga ccggggcatg gacctggacg aacgtgaacg ataacatgaa aagcctgacc 960gacccatctg acaagatcat atacgagatg caccagtacc tggactctga cggatccggg 1020acatcagcga cctgcgtatc ttcgaccatc ggtcaagagc gaatcaccag cgcaacgcaa 1080tggctcaggg ccaacgggaa gaagggcatc atcggcgagt ttgcgggcgg agccaacgac 1140gtctgcgaga cggccatcac gggcatgctg gactacatgg cccagaacac ggacgtctgg 1200actggcgcca tctggtgggc ggccgggccg tggtggggag actacatatt ctccatggag 1260ccggacaatg gcatcgcgta tcagcagata cttcctattt tgactccgta cgtacctggc 1320cttgacggca gcaaccccgg caacccgacc accaccgtcg ttcctcccgc ttctacctcc 1380acctcccgtc cgaccagcag cactagctct cccgtttcga ccccgactgg ccagcccggc 1440ggctgcacca cccagaagtg gggccagtgc ggcggtatcg gctacaccgg ctgcactaac 1500tgcgttgctg gcaccacctg cactcagctc aacccctggt acagccaggt atgtttctct 1560tcccccttct agactcgctt ggatttgaca gttgctaaca tctgctcaac agtgcctgta 1620a 1621

<210^ 4

<211> 415

<212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus<400> 4

Met Lys Leu Gly Ser Leu vai Leu Ala Leu Ser Ala Ala Arg Leu Thr1 5 10 15

Leu ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Gln Glu Thr Lys Arg Ala Lys20 25 30

vai Phe Gln Trp Phe Gly Ser Asn Glu ser Gly Ala Glu Phe Gly ser35 40 45

Gln Asn Leu Pro Gly vai Gl μ Gly Lys Asp Tyr Ile Trp Pro Asp pro50 55 60

Asn Thr Ile Asp Thr Leu lie Ser Lys Gly Met Asn Ile Phe Arg Val65 70 75 80

Pro Phe Met Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Ser Met Thr Gly ser Pro85 90 95

Asp Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu ile Ala Thr vai Asn Ala Ile Thr100 105 110

Gln Lys Gly Ala TVr Ala Val vai Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr115 120 125

Tyr Asn Ser Ile lie Ser ser Pro Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Lys130 135 140

Thr vai Ala Ser Gln Phe Ala ser Asn Pro Leu Val Ile Phe Asp Thr145 150 155 160

Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Thr Lai vai Leu Asn Leu Asn165 170 175

Gln Ala Ala ile Asp Gly Ile Arg ser Ala Gly Ala Thr ser Gln Tyr180 185 190

Ile Phe vai Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn195 200 205

Val Asn Asp Asn Met Lys ser Leu Thr Asp Pro ser Asp Lys Ile Ile210 215 220

Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly ser Gly Thr ser Ala225 230 235 240

Thr Cys Val ser Ser Tt»r Ile Gly Gln Glu Arg Ile Thr ser Ala Thr245 250 255

Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu Phe Ala260 265 270Gly Gly Ala Asn Asp Val Cys Glu Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Asp275 280 285

Tyr Met Ala Gln Asn Thr Asp vai Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala290 295 300

Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe ser Met Glu Pro Asp Asn305 310 315 320

Gly lie Ala Tyr Gln Gln Ile Leu Pro Ile Leu Thr Pro Tyr Val Pro325 330 335

Gly Leu ASp Gly ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr vai vai Pro340 345 350

Pro Ala ser Thr Ser Thr Ser Arg Pro Thr Ser ser Thr Ser Ser Pro355 360 365

vai ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gln Lys Trp370 375 380

Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr Gly cys Thr Asn Cys Val Ala385 390 395 400

Gly Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn Pro Trp Tyr ser Gln Cys Leu405 410 415

<210> 5

<211> 1211

<212> ONA

<213> Acremoni um thermoph-nwm

<220>

<221> gene

<222> (13)..(1206)

<220>

<221> intron

<222> (96)..(154)

<220>

<221> intron

<222> (404)..(526)

<220>

<221> Intron

<222> (1134)..(1197)

<400> 5

ggactgcgca tcatgcgctc ctcacccttt ctccgcgcag ctctggctgc cgctctgcct 60

ctgagcgccc atgccctcga cggaaagtcg acgaggtatg ccaatcctcg tacctctgcc 120

ctctgtagaa acaagtgacc gactgcaaag acagatactg ggactgctgc aagccgtcct 180

gcggctgggc cggaaaggcc tcggtgaacc agcccgtctt ctcgtgctcg gccgactggc 240

agcgcatcag cgacttcaac gcgaagtcgg gctgcgacgg aggctccgcc tactcgtgcg 300ccgaccagac gccctgggcg gtcaacgaca acttctcgta cggcttcgca gccacggcca 360tcgccggcgg ctccgagtcc agctggtgct gcgcctgcta tgcgtgagtt ctctgcaagc 420cgcttcccac ccccgctttc tgtgcaggcc gcttcccccc tacccaccca cttccccccc 480cccgcctctg tgatcgggca tccgagctaa gttgcgtgtc gtccagactc accttcaact 540cgggccccgt cgcgggcaag accatggtgg tgcagtcgac cagcaccggc ggcgacctgg 600gcagcaacca gttcgacctc gccatccccg gcggcggcgt gggcatcttc aacggctgcg 660cctcccagtt cggcggcctc cccggcgccc agtacggcgg catcagcgac cgcagccagt 720gctcgtcctt ccccgcgceg ctccagecgg gctgccagtg gcgcttcgac tggttccaga 780acgccgacaa ccccaccttc accttccagc gcgtgcagtg cccgtccgag ctcacgtccc 840gcacgggctg taagcgcgac gacgacgcca gctatcccgt cttcaacccg cctagcgtcc 900ctggccttga cggcagcaac cccggcaacc cgaccaccac cgtcgttcct cccgcttcta 960cctccacctc ccgtccgacc agcagcacta gctctcccgt ttcgaccccg actggccagc 1020ccggcggctg caccacccag aagtggggcc agtgcggcgg tatcggctac accggctgca 1080ctaactgcgt tgctggcacc acctgcactc agctcaaccc ctggtacagc caggtatgtt 1140tctcttcccc cttctagact cgcttggatt tgacagttgc taacatctgc tcaacagtgc 1200ctgtaaetgc a 1211

<210> 6<211> 315<212> PRT

<213> Acremonium thermophlliun<400> 6

Met Arg ser ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro15 10 15

Leu Ser Ala m's Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys20 25 30

Cys Lys Pro ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro35 40 45

Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala50 55 60

Lys ser Gly Cys Asp Gly Gly ser Ala Tyr ser cys Ala ASp Gln Thr65 70 75 80

Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala85 90 95

lie Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu100 105 110Thr Phe Asn ser Gly Pro vai Ala Gly Lys Thr Met vai vai Gln ser115 120 125

Thr ser Thr Gly Gly asρ Leu Gly ser Asn Gln Phe ASp Leu Alá Ile130 135 140

Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly145 150 155 160

Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile ser Asp Arg ser Gln Cys165 170 175

ser ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe AspIBO 185 190

Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr phe Thr Phe Gln Arg vai Gln195 200 205

Cys Pro ser Glu Leu Thr ser Arg Thr Gly cys Lys Arg Asp Asp Asp210 215 220

Ala ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro ser vai Pro Gly Leu Asp Glv225 230 235 240

Ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr vai vai Pro Pro Ala Ser Thr

245 250 255

Ser Thr ser Arg Pro Thr Ser ser Thr ser ser Pro vai ser Thr Pro260 265 270

Thr Gly Gln Pro Gly Gly cys Thr Thr Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly275 280 285

Gly Ile Gly Tyr Thr Gly cys Thr Asn Cys Val Ala Gly Thr Thr cys290 295 300

Thr Gln Leu Asn Pro Trp Tyr ser Gln Cys Leu305 310 315

<210> 7

<211> 1663

<212> DNA

<213> ChaetoraiuiB thermoph-ilum<220>

<221> gene

<222> (l)..(1663)

<220>

<221> intron<222> (1591)..(1654)

<400> 7

atgatgtata agaagttcgc cgctctcgcc gccctcgtgg ctggcgcctc cgcccagcaggcttgctccc tcaccgctga gaaccaccct agcctcacct ggaagcgctg cacctctgge 120

ggcagctgct cgaccgtgaa cggcgccgtc accatcgatg ccaactggcg ctggactcac 180

accgtctccg gctcgaccaa ctgctacace ggcaaccagt gggatacctc cctxtgcact 240

gatggcaaga gctgcgccca gacctgctgc gtcgatggcg ctgactactc ttcgacctat 300

ggtatcacca ecagcggtga ctccctgaac ctcaagttcg tcaccaagca ccagtacggc 360

accaaegtcg gctcccgtgt ctatctgatg gagaacgaca ccaagtacca gatgttcgag 420

ctcctcggca acgagttcac cttcgatgtc gatgtctcca acctgggctg cggtctcaac 480

ggcgccctct acttcgttte catggatgct gatggtggca tgagcaaata ctctggcaac 540

aaggctggcg ccaagtacgg taccggctac tgcgatgctc agtgcccgcg cgacctcaag 600

ttcatcaacg gcgaggccaa cgttgggaac tggaccccct cgaccaacga tgccaacgcc 660

ggcttcggcc gctatggcag ctgctgctct gagatggatg tctgggaggc caacaacatg 720

gctactgcct tcactcctca cccttgcacc accgttggcc agagccgctg cgaggccgac 780

acctgcggtg gcacctacag ctctgaccgc tatgctggtg tttgcgaccc tgatggctgc 840

gacttcaacg cctaccgcca aggcgacaag accttctacg gcaagggcat gactgtcgac 900

accaacaaga agatgaccgt cgtcacccag ttccacaaga actcggctgg cgtcctcagc 960

gagatcaagc gcttctacgt ccaggacggc aagatcattg ccaacgctga gtccaagatc 1020

cccggcaacc ccggaaactc cattacccag gagtattgcg atgcccagaa ggtcgccttc 1080

agtaacaecg atgacttcaa ccgcaagggc ggtatggctc agatgagcaa ggccctcgca 1140

ggccccatgg tcctggtcat gtccgtctgg gatgaccact acgccaacat gctctggctc 1200

gactcgacct aecccatcga ccaggecggc gcccccggcg ccgagcgcgg tgcttgcccg 1260

accacctccg gtgtccctgc cgagatcgag gcccaggtcc ccaacagcaa cgtcatcttc 1320

tccaacatcc gtttcggccc catcggctcg accgtccctg gccttgacgg cagcaacccc 1380

ggcaacccga ccaccaccgt cgttcetccc gcttctacct ccacctcccg tccgaccagc 1440

agcactagct ctcccgtttc gaccccgact ggccagcccg gcggctgcac cacccagaag 1500

tggggccagt gcggcggtat cggctacacc ggctgcacta actgcgttgc tggcaccacc 1560

tgcactcagc tcaacccctg gtacagccag gtatgtttct cttccccctt ctagactcgc 1620

ttggatttga cagttgetaa catctgctca acagtgcctg taa 1663

<210> 8

<211> 1076

<232> DNA

<213> Acremoniura theneophilum<220>

<221> gene

<222> Cl)..(1076)

<220>

<221> Intron

<222> (84)..(142)<220>

<221> lntron

<222> (392)..(514)

<400> 8

atgcgctcct caccctttct ccgcgcagct ctggctgccg ctctgcctct gagcgcccat 60

gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac 120

aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctggccgg 180

gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg 240

acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc 300

cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct 360

ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc 420

ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tccccccccc cgcctctgtg 480

atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg 540

cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt 600

tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg 660

gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc 720

ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc 780

ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta 840

agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc tagcggtggc tcccccagca 900

ccaccagcac caccaccagc tccccgtccg gtcccacggg caaccctcct ggaggcggtg 960

gctgcactgc ccagaagtgg gcccagtgcg gcggcactgg cttcacgggc tgcaccacct 1020

gcgtctcggg caccacctgc caggtgcaga accagtggta ttçccagtgt ctgtga 1076

<210> 9<213> 45<212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus

<400> 9

attaaccgcg gactgcgcat catgaagctc ggctctctcg tgctc 45

<210> 10<211> 29<212> ONA

<213> Thermoascus aurajitlacus<400> 10

aactgaggca tagaaactga cgtcatatt 29

<210> 11<211> 28<212> ONA

<213> Chaetomlum thermophilum<400> 11

taatttacgt acctggcctt gacggcag 28<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Chaetomi um thermophilum

<400> 12

attaactgca gttacaggca ctgttgagca

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> Acremonium thermophiIum

<400> 13

attaaccgcg gactgcgcat catgcgctcc tcaccctttc tc

<210> 14

<211> 33

<212> ONA

<213> Ac reraoni um the rmophiIum

<400> 14

ttaatctgca gtcacagaca ctgggaatac cac

<210> 15

<211> 81

<212> PRT

<213> Oiaetoni um the rmophi Iunt

<400> 15

Val Pro Gly Leu Asp Gly ser Asn Pro GTy Asn Pro Thr Thr Ttir vai1 5 10 15

vai Fro Pro Ala ser Thr Ser Thr ser Arg Pro Thr Ser ser Thr ser20 25 30

Ser Pro vai Ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro Gly Gly cys Thr Thr Gln35 40 45

Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Asri cys50 55 60

Val Ala Gly Thr Thr cys Thr Gln Leu Asn Pro Trp Tyr Ser Gln cys65 70 75 80

Leu

Claims (26)

1. Proteína de fusão de celulase compreendendo uma primeiraseqüência de aminoácidos de um núcleo de endoglucanase, e uma segundaseqüência de aminoácidos compreendendo um encadeador e domínio deligação de celulose (CBD) tendo no mínimo 75% de identidade com a SEQID NO: 15, ou uma variante ou fragmento da mesma tendo afinidade de liga-ção de celulose.

2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que aendoglucanase pertence à família de glicosil hidrolase 5.

3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, emque o núcleo da endoglucanase é derivado de Thermoascus aurantiacus ouAcremonium thermophilum, especialmente de T. aurantiacus CBS 116239ou A. thermophilum CBS 116240.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que onúcleo da endoglucanase tem no mínimo 75% de identidade com a SEQ IDNO: 2, ou uma variante ou fragmento da mesma tendo afinidade de celulase.

5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 4, em que onúcleo da endoglucanase compreende os aminoácidos 19 a 334 da SEQ IDNO: 2.

6. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que onúcleo da endoglucanase tem no mínimo 75% de identidade com o núcleoda endoglucanase codificado pela seqüência compreendida na SEQ ID NO:-8, ou uma variante ou fragmento da mesma tendo afinidade de celulase.

7. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que oencadeador e CDB são derivados de celobiohidrolase de Chaetomium ther-mophilum, especialmente de C. thermophilum CBS 730.95.

8. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que onúcleo da endoglucanase compreende a seqüência de SEQ ID NO: 2 e oencadeador e CDB compreendem a seqüência de SEQ ID NO: 15.

9. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 compre-endendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 6, ou uma varian-te ou fragmento da mesma tendo afinidade de celulase e de ligação de celu-lose.

10. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em queo núcleo da endoglucanase é codificado por um gene equivalente ao incluídoem E. coli DSM 17326.

11. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, a qual écodificada por um gene de fusão equivalente ao incluído em E. coli DSM 18159.

12. Polinucleotídeo isolado selecionado entre o grupo consistin-do em:a) uma seqüência de nucleotídeos de SEW ID NO: 3 ou 5, ouuma seqüência codificando uma proteína de fusão da reivindicação 1,b) um filamento complementar de a), ec) uma seqüência que é degenerada em conseqüência do códi-go genético para qualquer uma das seqüências de a) ou b).

13. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 12, o qualcompreende um gene de fusão equivalente ao incluído na cepa de E. coliDSM 18159.

14. Vetor de expressão compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeos como definido na reivindicação 12.

15. Célula hospedeira compreendendo o vetor de expressãocomo definido na reivindicação 14.

16. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15, a qualé um fungo, preferencialmente do gênero Trichoderma.

17. Método para produzir uma proteína de fusão como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 11, compreendendo as etapas detransformar uma célula hospedeira com um vetor de expressão codificando areferida proteína de fusão e cultivar a referida célula hospedeira sob condi-ções que possibilitem a expressão da referida proteína de fusão, e opcio-nalmente recuperar e purificar a proteína de fusão produzida.

18. Preparação enzimática compreendendo a proteína de fusãocomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

19. Processo para tratar material celulósico, em que o referidoprocesso compreende contatar o material celulósico com a proteína de fusãocomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a preparaçãoenzimática como definida na reivindicação 18.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o mate-rial celulósico é material têxtil, plantas usadas em ração animal, ou polpaderivada de madeira ou fibra secundária.

21. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que se ex-trai óleo de material vegetal.

22. Processo para bioesmerilhamento, cujo processo compreen-de a etapa de contatar uma proteína de fusão de celulase como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou uma preparação enzimática co-mo definida reivindicação 18, com tecido ou vestuário de denim.

23. Processo para bioacabamento, o qual compreende a etapade contatar uma proteína de fusão de celulase como definida em qualqueruma das reivindicações 1 a 11, ou a preparação enzimática como definidaem reivindicação 18, com materiais têxteis como tecidos ou vestuário ou fio.

24. Composição de detergente compreendendo a proteína defusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e auxiliaresde detergente.

25. Ração animal compreendendo a proteína de fusão como de-finida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

26. Cepa de Escherichia coli tendo número de acesso DSM 18159.