BRPI0611194A2 - molÉculas de ligaÇço anti-cd16 - Google Patents

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Sergej Kiprijanov
Stefan Hans Joachim Knackmuss
Fabrice Le Gall
Melvyn Little
Uwe Reusch
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Abstract

A presente invenção se refere a moléculas de ligação que se ligam especificamente ao receptor Fc gama humano expressão sobre a superfície de células assassinas naturais (NK) e macrófagos (isto é, Fc<157>RIIIA) e, em particular, moléculas de ligação que se ligam especificamente à forma A de Fc<157>RIII, mas não se ligam à forma B de Fc<157>RIIIA, bem como ao uso de tais moléculas de ligação no diagnóstico e tratamento de doenças. A invenção ainda se estende a polinucleotídeos que codificam tais moléculas de inibição, células hospedeiras compreendendo tais polinucleotídeos e métodos de produção de moléculas de ligação da invenção usando tais células hospedeiras.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:"MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ANTI-CD16".
A presente invenção se refere a moléculas de ligaçãoque se ligam especificamente ao receptor Fc gama III humanoexpresso sobre a superfície de células assassinas naturais(NK) e macrófagos (isto é, FcyRIIIA) e, em particular,moléculas de ligação que se ligam especificamente à forma Ade FcyRIII, mas não se ligam ã forma B de FcyRIII, bem comoao uso de tais moléculas de ligação no diagnóstico etratamento de doenças. A invenção ainda se estende apolinucleotídeos que codificam tais moléculas de ligação,células hospedeiras compreendendo tais polinucleotídeos emétodos de produção de moléculas de ligação da invençãousando tais células hospedeiras.
CDl6 (também conhecido como FcyRIII) , um receptor debaixa afinidade pela porção Fc de algumas IgGs conhecidopor estar envolvido em citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC), é o receptor de membrana melhorcaracterizado responsável por disparar a Iise de célulasalvo por células NK (Mandelboim et al. , 1999, PNAS 96:5640-5644) . Células NK humanas compreendem aproximadamente15% de todos os linfócitos e são definidas fenotipicamentepor sua expressão de CD56 e falta de expressão de CD3(Robertson e Ritz, 1990, Blood 76: 2421-2438). A maioria(aproximadamente 90%) das células NK humanas expressam CD56em baixa densidade (CD56dim) e FcyRIII (CD16) em um altonível (Cooper et al., 2001, Trends Immunol. 22: 633-640).
FcyRIII humano existe como duas isoformas, FcyRIIIA eFcyRIIIB, que compartilham 96% de identidade de seqüênciaem suas regiões de ligação de imunoglobulina extracelulares(van de Winkel e Capei, 1993, Immunol. Today 14(5): 215-221).
FcyRIIIA é expresso sobre macrófagos, mastócitos ecélulas NK como um receptor transmembrana. Sobre célulasNK, a cadeia alfa do FcyRIIIA se associa com o motivo deativação de imunoreceptores baseados em tirosina (ITAM)contendo uma cadeia γ de FcsRI e/ou a cadeia ζ do receptorde células T (TCR)/CD3 para mediar a sinalização(Wirthmueller et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 1381-1390). Ainteração de FcyRIIIA com diferentes combinações de homo- ehetero-dímeros das cadeias y e ζ foi observada em célulasNK, oferecendo a possibilidade de diferentes vias desinalização através de variações do complexo de FcyRIIIA emcélulas NK (Anderson et al. , 1990, PNAS 87 (6): 2274-2278;Ackerly et al., 1992, Int. J. Câncer Suppl. 7: 11-14).
FcyRIIIB está presente sobre granulócitospolimorfonucleares (PMN) como um receptor ancorado emglicosil-fosfatidilinositol (GPI) (isoforma FcyRIIIB), aqual não pode disparar a morte de células tumorais (van deWinkel e Capei, 1993, supra). Além disso, FcyRIIIB existecomo um receptor solúvel no soro e, quando ligado aanticorpos, pode disparar efeitos colaterais através daformação de complexos imunes in vivo.
Foi mostrado que células efetoras expressando FcyRestão envolvidas na destruição de células tumorais viaADCC. Isso levou ao desenvolvimento de várias abordagensimunoterapêuticas à terapia do câncer, as quais envolvem ouso de atividades de FcyR, por exemplo, anticorposmonoclonais específicos a tumores podem mediar a destruiçãode células tumorais através de ADCC induzida via ligaçãoaos FcyRs, e moléculas biespecíficas com uma especificidadepor células tumorais e a outra especificidade por ou umFcyRI sobre granulócitos ou FcyRIII sobre células NK tambémforam desenvolvidas em esforços para melhorar orecrutamento de células efetoras (van Spriel et ai. , 2000Immunol. Today, 21: 391-397).
Como mediadores celulares de imunidade inata, célulasNK são assassinas celulares profissionais e, diferente dascélulas T, tendem a existir em estados constitutivamenteativados não requerendo (pré)estimulação adicional. Emcontraste, células T citotóxicas em repouso requeremativação através da ligação de um complexo de antígeno-MHCe subseqüente co-estimulação via CD28. Assim, dentre ascélulas efetoras imunes, a célula NK é um dos candidatosmais atraentes para uso em imunoterapia e anticorposbiespecificos com especificidade pelo CD16 (FcyRIII) e HER-2/neu ou CD16 e CD30 foram desenvolvidos (Arndt et al. ,1999 Blood 94: 2562-2568; McCall et al. , 2001 J. Immunol.166: 6112-6117).
A maioria dos anticorpos anti-CD16 que têm sidoproduzidos até o momento são incapazes de distinguir entreas duas isoformas de CD16, FcyRIIIA e FcyRIIIB, com asexceções sendo anticorpo monoclonal (MAb) 1D3, o qual seliga apenas à forma de CD16 expressa sobre neutrófilos,isto é, FcyRIIIB, e os anticorpos monoclonais os quaisreconhecem diferentes formas alotípicas de FcyRIIIB (Ory etal., 1989, J. Clin. Invest. 83: 1676-81; Huizinga et al. ,1990 Blood 75: 213-7; Tamm & Schmidt 1996, J. Immunol.1996, 157: 1576-1581). Contudo, até o momento, não existemexemplos de moléculas que se ligam especificamente aoFcyRIIIA, a forma expressa sobre células NK, e não ao FcyRIIIB.Um anticorpo específico para FcyRIIIA, contudo, seriaparticularmente útil como um componente de uma molécula deligação bi ou multiespecífica que é dirigida contra célulasassociadas à doença, uma vez que ele recrutariaprincipalmente células NK e não se ligaria ao FcyRIIIBsolúvel em circulação ou divergiria da ligação à célula NKpara ligação a neutrófilos ou eosinófilos ativados. Paramediar eficazmente a morte por células NK, o anticorpoFcyRIIIA-específico deve não apenas se ligar à células NK,mas também ativar as mesmas quando ligado a elas.
Nós identificamos vários novos scFvs anti-CD16, osquais exibem essa propriedade útil, isto é, eles têmespecificidade pelo FcyRIIIA, eles não se ligam comespecificidade ao FcyRIIIB e eles também são capazes deativar células NK quando ligados a elas.
Sabe-se também que FcyRIIIA exibe vários polimorfismosalélicos, em particular nas posições 48 e 158 do domínio deligação à IgG. Foi mostrado que anticorpos anti-CD16previamente descritos se ligam com diferentes afinidades àsdiferentes formas polimórficas de FcyRIIIA e o trabalho deKoene et al. (1997, Blood 90: 1109-1114) atribui adiferença na ligação de alguns desses anticorpos aopolimorf ismo na posição 158. Uma vez que as freqüênciasgenéticas do alelo FcyRIIIA158F e do alelo FcyRIIIA158v são deaproximadamente 0,6 e 0,4, respectivamente, seria vantajosopara qualquer anticorpo anti-CD16A reconhecer ambas asformas alélicas, para assegurar que, em qualquer dadopaciente, o anticorpo anti-CD16A seria capaz de se ligar eativar a população de células NK.
É descrito aqui um scFv anti-CD16A o qual reconheceambos FcyRIIIA158p e FcyRIIIA158v com afinidade aproximadamenteigual, mas o qual não se liga ao FcyRIIIB.
Os novos scFvs descritos aqui podem, assim, ser usadospara produzir novas moléculas de ligação, as quais podemser usadas como agentes terapêuticos. 0 termo "molécula deligação", conforme usado aqui, abrange anticorpos efragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, em que osreferidos anticorpos ou fragmentos de ligação a antigeno seligam especifica e seletivamente ao FcyRIIIA e não se ligamcom especificidade do FcyRIIIB, bem como proteínas de fusãode tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antigeno econjugados de proteína compreendendo tais anticorpos oufragmentos de ligação a antigeno.
Assim, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, éproporcionada uma molécula de ligação com especificidadepor pelo menos um antigeno, em que o pelo menos um antigenoé um FcyRIIIA e em que a molécula de ligação não se ligaespecificamente ao FcyRIIIB.
Em uma modalidade preferida, a especificidade peloFcyRIIIA é proporcionada por um anticorpo ou fragmento deligação a antigeno do mesmo. Conseqüentemente, moléculas deligação da invenção podem compreender ou, em determinadasmodalidades, consistir de pelo menos um anticorpo (ou umfragmento de ligação a antigeno do mesmo) o qual temespecificidade pelo FcyRIIIA, mas não pelo FcyRIIIB.
Anticorpos que conferem especificidade pelo FcyRIIIApodem ser anticorpos de ocorrência natural ou eles podemser anticorpos recombinantes. Anticorpos da invenção podemser de qualquer classe de imunoglobulina, por exemplo, elespodem ser um anticorpo de IgA, IgD, IgEf IgG ou IgM. Depreferência, o anticorpo será um anticorpo de IgG.Fragmentos de ligação a antigeno adequados para uso nainvenção podem ser de ocorrência natural ou recombinantes eincluem cadeias leves de imunoglobulina, cadeias pesadas deimunoglobulina, domínios VH, domínios VL, Fvs, anticorposcom cadeia simples (incluindo scFvs), Fabs, di-Fabs, Fab's,F(ab')2S e CDRs. Aqueles habilitados na técnica estarãomuito familiarizados com tais fragmentos de ligação aantigeno e seu preparo. Para evitar dúvida, o termoanticorpo com cadeia simples, conforme usado aqui, serefere a uma molécula com cadeia simples geneticamentemodificada compreendendo a região variável de uma cadeialeve e a região variável de uma cadeia pesada ligadas porum ligante polipeptídico flexível adequado. Exemplos deanticorpos com cadeia simples incluem um scFv e umdianticorpo.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligaçãoa anticorpo que confere especificidade para FcyRIIIAcompreenderá pelo menos uma CDR humana, de preferênciaselecionada das CDRs descritas na Tabela 1 abaixo.Tabela 1. Seqüências de aminoácido de CDRs humanas decadeias leves e pesadas a partir de scFvs que se ligamseletiva e especificamente ao FcyRIIIA e não se ligam comespecificidade ao FcyRIIIB
Cadeia CDRl CDR2 CDR3TSYYMH
IINPSGGSTSYA GSAYYYD FADY
1. Cadeia pesada (seq id no 17) QKFQG
(seq id no 19)
(seq id no 18)
SGDKLEEKYVS QDNKRPS
QVWDNYSVL
2. Cadeia leve
(seq id no 20) (seq id no 21) (seq id no 22)
GGNNIESRNVH RDNNRPS
QVWDNYTVL
3. Cadeia leve
(seq id no 23) (seq id no 24) (seq id no 25)Cadeia CDRl CDR2 CDR3
4. Cadeia leve GGNNIGSKNVH RDSNRPS QVWDNYIVL (SEQ ID NO 26) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28)5. Cadeia leve EGNNIGSKNVH DDSDRPS QVWDNYSVL (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) (SEQ ID NO 22)6. Cadeia leve GGNNIGSKNVH RDSSRPS QVWDDYIW (SEQ ID NO 26) (SEQ ID NO 31) (SEQ ID NO 32)7. Cadeia leve GANDIGKRNVH QDNKRPS QVWDNYSVL (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22)8. Cadeia leve GGHNIGS KNVH QDNKRPS QVWDNYSVL (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 22)
Aqueles habilitados na técnica apreciarão queanticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos,com exceção das CDRs simples, em geral compreendem trêsCDRs de cadeia leve e/ou três CDRs de cadeia pesada.
Conseqüentemente, em outras modalidades, o anticorpo oufragmento de ligação a antigeno com especificidade peloFcyRIIIA compreende três CDRs humanas de cadeia leve e/outrês CDRs humanas de cadeia pesada. De preferência, a CDR 1humana de cadeia leve terá uma seqüência de aminoácidoselecionada de SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 33 e SEQ ID NO 34, a CDR 2 humanade cadeia leve terá uma seqüência de aminoácido selecionadade SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 31 e SEQ ID NO 35 e a CDR 3 humana de cadeia leveterá uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO-22, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28 e SEQ ID NO 32. Depreferência, a CDRl humana de cadeia pesada terá aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO 17, a CDR2 humana decadeia pesada terá a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO18 e a CDR3 humana de cadeia pesada terá a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO 19.
Onde o anticorpo ou fragmento de ligação a antígenocompreende ou consiste do domínio variável de uma cadeialeve, ele pode ter uma das seguintes seqüências deaminoácido:
SEQ ID NO 10:
SYELMQPPSVSVSSGQTASIPCSGDKLEEKYVSWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL;SEQ ID NO 11:
SYELTQPLSESVAQGQTARITCGGNNIESRNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDNNRPSGIPE
RFSGSNSGNMATLTISRAQAGDAADYYCQVWDNYTVLFGGGTKLTVL;SEQ ID NO 12:
SYELTQPPSVAVAPGKTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADFYCQVWDNYIVLFGGGTKLTVL;SEQ ID NO 13:
QAVLTQPPSVSVAPGQTARIPCEGNNIGSKNVHWYRQKPGQVPVLVMYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL;SEQ ID NO 14:
QPVLTQPLSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSSRPSGIPERLSGSNSGDTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDDYIWFGGGTKLTVL;
SEQ ID NO 15:
SYELTQPPSVSVTPGQTATITCGANDIGKRNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL;
SEQ ID NO 16:
QPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQWDNYSVLFGGGTKLTVL.
Onde o anticorpo ou fragmento de ligação a antígenocompreende ou consiste do domínio variável de uma cadeiapesada, ele pode ter a seguinte seqüência de aminoácido(SEQ ID NO 9):
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS.
Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmentode ligação a antígeno que proporciona especificidade peloFcyRIIIA será totalmente humano.
Em outras modalidades preferidas, a molécula deligação da invenção será capaz de ativar células humanasexpressando FcyRIIIA quando ligado ao FcyRIIIA expressosobre tais células, isto é, a molécula de ligação serácapaz ou estimulará uma resposta biológica, em particularuma resposta de sinalização, quando ligado ao FcyRIIIA. Depreferência, a molécula de ligação também será capaz dedisparar a morte celular de uma maneira análoga àcitotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC), emvirtude de sua ligação a tais células.
De forma a testar se as moléculas de ligação dainvenção são capazes de ativar células humanas expressandoFcyRIIIA, elas podem ser testadas com relação à suacapacidade de estimular a mobilização de cálcio em célulasNK de sangue periférico, por exemplo, conforme descritoaqui nos Exemplos. A capacidade de moléculas de ligação dainvenção de disparar citotoxicidade mediada por células NKtambém pode ser testada conforme descrito aqui nos Exemplosusando, por exemplo, um ensaio de liberação de calceínapara detectar Iise celular redirecionada usando células NKrecentemente isoladas.
A presente invenção também proporciona moléculas deligação que não só têm especificidade pelo FcyRIIIAenquanto carece de especificidade pelo FcyRIIIB, mas asquais também têm especificidade por um ou mais antígenosadicionais. Assim, as moléculas de ligação da invençãopodem ser multiespecíficas. O termo multiespecíficas,conforme usado aqui, significa que uma molécula de ligaçãoda invenção, embora carece de especificidade pelo FcyRIIIB,tem pelo menos duas especificidades, uma das quais é peloFcyRIIIA. Moléculas de ligação multiespecíficas dainvenção, portanto, abrangem pelo menos moléculasbiespecíficas, triespecíficas e tetraespecíficas tais como,por exemplo, anticorpos biespecíficos, incluindodianticorpos com cadeia simples, (ScFv)2, dianticorposaleatórios (TandAbs); trianticorpos (anticorpotriespecífico); tetraanticorpos (anticorpotetraespecífico); e flexianticorpos (veja Le Gall et ai.,1999 FEBS Letts 453: 164-168 e WO 03/025018).
Em virtude de sua multi-especificidade, as moléculasde ligação de acordo com este aspecto da invenção podem tercomo alvos macrófagos ou células NK ao invés de outrosantígenos ou mesmo de células que trazem tais antígenos, demodo que o antígeno ou célula trazendo o antígeno possamser erradicados via fagocitose ou morte celular mediada porcélulas NK. Por exemplo, uma molécula de ligação dainvenção pode ter especificidade adicional por um ou maisantígenos específicos de um tumor e pode, assim, ter comoalvo as células NK ao invés da célula tumoral. Ativação dacélula NK causada pela ligação da molécula de ligação aoFcyRIIIA levará ã morte das células tumorais. Destamaneira, as moléculas de ligação da invenção podem serusadas para tratar e/ou eliminar células doentes e agentesinfecciosos (tais como, por exemplo, bactérias, fungos,micoplasmas, vírus, parasitas, prions), dependendo daespecificidade ou especificidades adicionais da molécula deligação.
Assim, em outro aspecto, a invenção proporciona umamolécula de ligação conforme descrito aqui antes, em que amolécula de ligação tem especificidade por pelo menos umantígeno adicional. Em uma modalidade, o pelo menos umantígeno adicional é um antígeno na superfície celular.
Exemplos dos antígenos na superfície celular pelos quais asmoléculas de ligação de acordo com essa modalidade dainvenção exibem especificidade são CD19, CD20, CD30, aproteína precursora do receptor de laminina (tambémconhecida como o receptor de laminina imaturo de antígenoonco-fetal OFA-iLR), EGFRl (também conhecido como HER-1,ErbBl), EGFR2 (também conhecido como HER-2, ErbB2, neu) ,EGFR3 (também conhecido como HER-3), Ep-CAM, PLAP(fosfatase alcalina placentária), antígeno de Thomsen-Friedenreich (TF), MUC-I (mucina), IGFR, IL4-R alfa, IL13-R, FcsRI e CD5.Em outra modalidade, o pelo menos um antígenoadicional é um antígeno de um agente infeccioso, porexemplo, o antígeno pode ser secretado de ou expresso sobrea superfície externa de uma célula hospedeira, célulainfectada, bactéria, fungo, micoplasma, parasita ou vírus,ou pode ser liberado quando ocorre a Iise de tal agenteinfeccioso. Por exemplo, uma molécula de ligação dainvenção pode ter especificidade adicional por uma proteínaviral, tal como gp34 ou gp68, sobre a superfície de célulasinfectadas com CMV ou pela hemaglutinina na presença dovírus da influenza e pode, assim, ter como alvo uma célulaviralmente infectada ou o vírus diretamente.
Alternativamente, onde o agente infeccioso é um prion, aproteína de prion per se pode ser o antígeno.
Em outra modalidade, o pelo menos um antígenoadicional é um alérgeno ou uma molécula envolvida naresposta do corpo a um alérgeno tal como, por exemplo, IgEem circulação ou o receptor de FcsRI sobre mastócitos (emparticular).
De preferência, nas moléculas de ligação de acordo comesse aspecto da invenção, a especificidade por pelo menosum antígeno adicional é proporcionada por um anticorpo ouum fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Conformedescrito acima, aqueles habilitados na técnica estarãofamiliarizados com os tipos de anticorpos (IgA, IgDf IgE,IgG e IgM) e com fragmentos de ligação a antígeno derivadosde tais anticorpos (por exemplo, cadeias leves deimunoglobulina, cadeias pesadas de imunoglobulina, domíniosVH, domínios Vl, Fvs, scFvs, Fabs, di-Fabs, Fab's, F(ab')2Se CDRs), os quais podem também ser usados nesse aspecto dainvenção. Em uma modalidade preferida, o anticorpo será umanticorpo de IgG.
Moléculas de ligação multiespecíficas e, emparticular, biespecíficas da invenção podem, assim, terqualquer um dos seguintes formatos: IgGs biespecíficas,IgG-ScFv2, (ScFv)4-IgG, (Fab')2, (ScFv)2, (dsFv)2, proteínasde fusão de Fab-scFv, (Fab-ScFv)2, (ScFv)2-Fab, (scFv-CH2-CH3-scFv)2, bicorpo, tricorpo, dianticorpo biespecífico,dianticorpo dissulfeto-estabilizado (ds), dianticorpo'knob-into-whole', dianticorpo com cadeia simples (scDb),dianticorpo aleatório (TandAb), flexicorpo, mini-anticorpoDiBi, [ (scFv) 2-Fc] 2 / (scDb-CH3) 2, (ScDb-Fc)2, Di-dianticorpo, Tandemab (revisto em Kipriyanov & Le Gall,2004, Curr. Opin. Drug Discov. Devei., 7: 233-242 e Marvine Zhu, 2005, Acta Pharmacol. Sin., 26: 649-658). Emmodalidades preferidas, a molécula de ligação será TandAbou Flexianticorpo. Diferente de muitos outros formatos deanticorpos biespecíficos, o TandAb é um homodímerocompreendendo apenas domínios variáveis de anticorpo e suaformação é determinada pela associação de domínios Vh e Vlcomplementares localizados sobre diferentes cadeiaspolipeptídicas. 0 TandAb tem duas vezes o tamanho dodianticorpo e do (scFv)2/ é capaz de se ligarbivalentemente às células efetoras e alvo e possuicaracterísticas farmacocinéticas aperfeiçoadas com relaçãoao dianticorpo e ao (scFv)2, por exemplo, ele tem maiorestabilidade e atividade biológica intensificada tanto invitro quanto in vivo (Kipriyanov et al. , 1999, J. Mol.Biol., 293: 41-56; Cochlovius et al., 2000, Câncer Res.,60: 4336-4341; Reusch et al. , 2004, Int. J. Câncer, 112:509-518). 0 emparelhamento entre cadeias dos domínios Vh eVl cognatos da mesma especificidade poderia também serusado para a formação de moléculas aleatórias de scFvB-diabody^-ScFvb bi-específicas, os assim denominados1 f lexicorpos1 (AeB podem ter a mesma ou umaespecificidade diferente). Dependendo da fixação deassociação de domínios complementares envolvidos noemparelhamento entre cadeias e do comprimento do liganteque separa as mesmas, dímeros, trímeros e mesmo tetrâmerosde moléculas com cadeia simples biespecíficas podem serformados.
Exemplos de anticorpos e fragmentos de ligação aantígeno os quais podem ser usados nesse aspecto dainvenção e os quais exibem especificidade pelo CD19, CD20,CD3 0, a proteína precursora do receptor de laminina, EGFRl,EGFR2, EGFR3, Ep-CAM, PLAP, antígeno de Thomsen-Friedenreich (TF), MUC-I (mucina), IGFR, CD5, IL4-R alfa,IL13-R, FcsRI e IgE, são descritos na técnica, assim comoanticorpos para agentes infecciosos (veja, por exemplo, EP-A-1314 741, Reff et al., 1994 Blood 83: 435-445, EP-A-1005870, WO 01/92340, US 6.033.876, WO 86/03223, Buto etal., 1997 Int. J. Biol. Markers 12: 1-5, US 6.699.473, WO98/50433, US 5.770.195, EP-A-0502812, Carter et al. , 1992PNAS 89: 4285-4289, US 5.968.511, WO 04/106383, Nouri etal., 2000 BJU Int. 86: 894-900, EP-A-0429242, Ravn et al.,2004 J. Mol. Biol. 343: 985-996, Dahlenborg et al. , 1997Int. J. Câncer 70: 63-71, WO 88/05054, WO 02/053596, WO04/071529, Studnicka et al., 1994 Protein Eng. 7: 805-814,Presta et al., 1993 J. Immunol. 151: 2623-2632). Onde essascitações proporcionam seqüências de aminoácido ouseqüências de ácido nucléico que codificam tais anticorposou fragmentos de ligação a antígeno, aqueles habilitados natécnica podem utilizar tais seqüências diretamente naprodução de moléculas de ligação da invenção. Onde essascitações descrevem hibridomas ou linhagens de célula queproduzem tais anticorpos ou fragmentos de ligação aantígeno, aqueles habilitados na técnica serão capazes deobter as seqüências de ácido nucléico que codificam oanticorpo desejado ou fragmento de ligação a antígeno dohibridoma ou linhagem de célula apropriada usando técnicasde biologia molecular padrões e, uma vez obtidas, asseqüências de ácido nucléico podem ser usadas na construçãode moléculas de ligação da invenção.
Um outro aspecto da invenção proporciona uma moléculade ligação de acordo com qualquer um dos aspectos oumodalidades antes aqui descritas, a qual é capaz de seligar ao alelo FcyRIIIA158p e ao alelo FcyRIIIA158v comaproximadamente a mesma afinidade, isto é, a afinidade damolécula de ligação pelos dois alelos 158 do FcyRIIIAdifere em não mais do que duas vezes. Em modalidadespreferidas de acordo com esse aspecto da invenção, aespecificidade pelo FcyRIIIA será proporcionada por umanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno derivado doscFv 4-LS21 descrito aqui. Em modalidades particularmentepreferidas, as moléculas de ligação de acordo com esseaspecto da invenção estarão em um formato TandAb ecompreenderão fragmentos de ligação a antígeno derivados doscFv 4-LS21 descrito aqui, bem como fragmentos de ligação aantígeno tendo especificidade pelo CD19 ou CD30.Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, onde épretendido que as moléculas de ligação da invenção sejamusadas no tratamento e/ou terapia de seres humanos, aimunogenicidade potencial da molécula de ligação deverá serminimizada. Conseqüentemente, onde a especificidade peloFcyRIIIA e/ou o(s) antígeno(s) adicional(is) éproporcionada por um anticorpo ou fragmento de ligação aantigeno, é preferido que o anticorpo ou fragmento deligação a antigeno seja quimérico, CDR-enxertado,humanizado ou totalmente humano. Mais preferivelmente, oanticorpo ou fragmento de ligação a antigeno seráhumanizado ou totalmente humano. O uso de técnicas debiologia molecular padrões para realizar a humanização deanticorpos é agora rotina na técnica e proporcionada comuma seqüência de anticorpo não-humana, aqueles habilitadosna técnica serão prontamente capazes de produzir uma versãohumanizada de tal anticorpo. O termo "totalmente humano",conforme usado aqui, na medida em que ele se refere a umanticorpo ou fragmento de ligação a antigeno, significa queas seqüências de aminoácido do anticorpo ou fragmento deligação a antigeno são derivadas de (isto é, originárias oupodem ser encontradas em) seres humanos.
Outra técnica a qual pode ser empregada como umaalternativa, ou adicionalmente, aos métodos descritos acimapara redução de imunogenicidade é aquela de desimunização.Tecnologia de desimunização envolve a identificação eremoção de epítopos de células T auxiliares (Th) doanticorpo e outros agentes terapêuticos biológicos deproteína. Epítopos de células Th compreendem seqüênciaspeptídicas curtas dentro de proteínas que têm a capacidadede se ligar às moléculas da classe II do MHC. Os complexospeptídeo-MHC de classe II podem ser reconhecidos porcélulas T e podem disparar a ativação e diferenciação decélulas Th, o que é requerido para iniciar e sustentarimunogenicidade através de interação com células B,resultando assim na secreção de anticorpos que se ligamespecificamente ao agente terapêutico biológicoadministrado. Para desimunização de anticorpo, os epítoposde célula Th são identificados dentro da seqüência doanticorpo, por exemplo, através de um método baseado emcomputador para previsão da ligação de peptídeos àsmoléculas da classe II do MHC humano (veja Altuvia et al. ,1995, J. Mol. Biol., 249: 244-2450 e Schueler-Furman etal., 2000, Protein Sci., 1838-1846). Para evitarreconhecimento por células T, os epítopos de células Thassim identificados são eliminados da seqüência de proteínaatravés de substituições de aminoácido. Isto pode seralcançado através de uso de técnicas de biologia molecularpadrões tal como, por exemplo, mutagênese sítio-dirigidapara alterar a seqüência de ácido nucléico que codifica oepítopo de células Th na proteína terapêutica. Dessa forma,um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode sermodificado de modo que a(s) resposta(s) HAMA (antigênicaanti camundongo humana) e/ou anti-idiotípicas seja(m)reduzida(s) ou evitada(s) (Bander et al. , 2003, Semin.Oncol., 30: 667-676; Nanus et al., 2003, J. Urol., 170:S84-S89). Assim, em outras modalidades, as moléculas deligação da invenção são modificadas para remover quaisquerepítopos de células Th presentes em sua seqüência. Taismoléculas de ligação são referidas aqui como moléculas deligação desimunizadas.
Em outro aspecto, as moléculas de ligação da invençãocompreendem um outro domínio funcional. Esse domíniofuncional pode conferir propriedades efetoras sobre amolécula de ligação, por exemplo, o domínio funcional podeser um peptídeo de ligação a FcR ou o domínio Fc de umanticorpo o qual, através de sua capacidade de se ligar areceptores de Fc, confere propriedades efetoras sobre amolécula de ligação. Alternativamente, o domínio funcionalpode ser uma enzima que é capaz de converter um pró-fármacoem um fármaco ativo. Dessa forma, as moléculas de ligaçãoda invenção podem ser usadas em terapia com pró-fármacoenzimático anticorpo-dependente (ADEPT). Em uma outramodalidade, o domínio funcional é uma proteína ou peptídeoque confere uma meia-vida aumentada no soro sobre amolécula de ligação. Um exemplo de tal proteína é albuminano soro ou a porção Fc de IgG, a qual pode aumentar a meia-vida no soro da molécula de ligação em virtude de suacapacidade de se ligar ao FcyRn (o receptor de Fcneonatal). Em outra modalidade, o domínio funcional podeser uma citocina.
Em outro aspecto, as moléculas de ligação da invençãopodem ser conjugadas a uma molécula de marcação ou umatoxina. Onde a molécula de marcação ou toxina é umaproteína, a conjugação à molécula de ligação pode ocorreratravés de uma ligação peptídica ou através de conjugaçãoquímica. Assim, uma molécula de ligação de acordo com esseaspecto da invenção pode estar na forma de uma proteína defusão onde a molécula de marcação ou toxina é ligada àmolécula de ligação através de uma ligação peptídica, depreferência através de um ligante peptídico, ou pode estarna forma de um conjugado químico. Para evitar dúvida, otermo conjugação é usado aqui para significar que doiscomponentes são fisicamente ligados juntos via uma ligaçãoquímica, a qual inclui uma ligação peptídica (assim,conjugados incluem proteínas de fusão), ligação de éster ouligação em ponte de dissulfeto.
Conjugação de uma molécula de ligação da invenção auma molécula de marcação, tal como um radio-marcador ou ummarcador fluorescente ou luminescente (incluindoquimioluminescente) permite que a molécula de ligação sejausada como um reagente de coloração imunológico. Talreagente pode ser usado na detecção, por exemplo, decélulas NK que se infiltram em tecidos, macrófagos oumastócitos expressando FcyRIIIA ou, onde a molécula deligação exibe especificidade por um antígeno adicional, nadetecção de complexos de antígeno adicional-molécula deligação-célula NK. Detecção do último pode serparticularmente útil no diagnóstico de doenças ou nomonitoramento de progressão ou remissão de doenças.
Onde uma molécula de ligação da invenção é conjugada auma molécula de toxina, tal como uma ribosil transferase,protease de serina, ativador de guanilciclase,adenilciclase calmodulina-dependente, ribonuclease, agentede alquilação de DNA ou inibidor de mitose (por exemplo,doxorubicina) e semelhantes, ela pode ser usada para tercomo alvo e matar células NK e macrófagos. Tal molécula deligação, assim, pode ser usada como um agenteimunossupressivo. Aqueles habilitados apreciarão que, nesseaspecto da invenção, é preferido que a moléculas de ligaçãoexibam especificidade por apenas um antígeno, isto é,FcyRIIIA. Supressão do sistema imune também pode seralcançada usando moléculas de ligação compreendendo ouconsistindo de um fragmento de ligação a antígenomonovalente o qual se liga seletiva e especificamente aoFcyRIIIA. Tais moléculas de ligação monovalentes sãopreferidas, uma vez que elas atuarão como moléculas quebloqueiam o receptor FcyRIIIA, não se ligarão cruzadamentee, assim, não ativarão a célula NK ou macrófago. Fragmentosde ligação a antígeno anti-FcyRIIIA monovalentes preferidosincluem scFv, Fab, Vh, Vl e uma CDR.
Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, comouma alternativa a ser marcada com uma molécula de marcaçãoou toxina via conjugação química, marcadores peptídicos outoxinas peptídicas podem também ser usadas. Por exemplo, amolécula de ligação da invenção pode ser expressa como umaproteína de fusão com uma etiqueta peptídica N- ou C-terminal, tal como uma etiqueta de tetra-, penta- ou hexa-histidina, uma etiqueta de c-myc ou semelhante.
As moléculas de ligação da invenção podem serproduzidas através de expressão de ácidos nucléicos quecodificam as mesmas em qualquer sistema de expressão deproteína adequado. Assim, em um outro aspecto, a invençãoproporciona polinucleotídeos que codificam moléculas deligação da invenção. Polinucleotídeos que sãoparticularmente adequados para uso nesse aspecto dainvenção codificarão as CDRs descritas na Tabela 1 acima.Em particular, aqueles habilitados, armados com a seqüênciade aminoácido das CDRs de cadeia leve e pesada da tabela 1,serão capazes de derivar seqüências de polinucleotídeo quecodificam as várias CDRs de cadeia leve e pesada a partirdas seguintes seqüências de ácido nucléico:
SEQ ID NO 1:
gaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggt
ttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacagg
cccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagc
tacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagt
ctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagag
gtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca;
SEQ ID NO 2:
tcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcaggacagacagccagcatcccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggtatcaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
SEQ ID NO 3:
tcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccagggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacactgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
SEQ ID NO 4:
tcctatgagctgacacagccaccctcagtggcagtggccccaggaaagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcatctatagggatagcaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgaggctgacttttattgtcaggtgtgggacaactatattgtgctgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctg
SEQ ID NO 5:
caggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccaggacagacggccaggattccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggtatcggcagaagccaggccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
SEQ ID NO 6:
cagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccgggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccctctgggatccctgagcgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatcagcagagcccaggccggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacattgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
SEQ ID NO 7:
tcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccaggacagacggccacgattacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggtaccaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
SEQ ID NO 8:
cagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgatctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
SEQ ID NO 1 codifica a região variável de cadeiapesada de um scFv humano que se liga seletiva eespecificamente ao FcyRIIIA, mas o qual não se liga comespecificidade ao FcyRIIIB. SEQ ID NOs 2-8 codificamregiões variáveis de cadeia leve de scFvs humanos que seligam seletiva e especificamente ao FcyRIIIA, mas os quaisnão se ligam com especificidade ao FcyRIIIB.Conseqüentemente, SEQ ID NOs 1 a 8 também são exemplos depolinucleotídeos da invenção e podem ser usadas na produçãode outras moléculas de ligação da invenção.
Polinucleotídeos que codificam moléculas de ligaçãomultiespecíficas da invenção, em particular moléculas deligação biespecífica, podem ser construídos conformedescrito no WO 03/025018, usando ácidos nucléicos quecodificam os domínios Vh e Vl de um anticorpo o qual se ligaseletiva e especificamente ao FcyRIIIA, mas o qual não seliga especificamente ao FcyRIIIB, em combinação com ácidosnucléicos que codificam os domínios Vh e Vl de um anticorpotendo especificidade pelo antígeno adicional.
De forma que uma molécula de ligação seja expressa emum sistema de expressão de proteína adequado, opolinucleotídeo que codifica a proteína de ligação seráoperavelmente ligado a um promotor adequado e,opcionalmente, um terminador de transcrição adequado. Issopode ser alcançado através da introdução de umpolinucleotídeo da invenção no genoma de um hospedeiro eutilizando um promotor presente dentro do genoma paraacionar a expressão do polinucleotídeo. Alternativamente,um polinucleotídeo da invenção pode ser introduzido emcélulas hospedeiras sobre um vetor compreendendo opolinucleotídeo operavelmente ligado ao promotor eopcionalmente uma região terminadora. Tais vetores formamainda outro aspecto da invenção.
Em geral, o promotor ao qual o polinucleotídeo quecodifica a molécula de ligação está operavelmente ligado novetor será qualquer promotor capaz de acionar a expressãoda molécula de ligação na célula hospedeira na qual opolinucleotídeo e o vetor têm de ser introduzidos. Assim,se é desejado que a molécula de ligação seja expressa emuma célula bacteriana, o promotor será operável nessacélula bacteriana. Similarmente, se é desejado que amolécula de ligação seja expressa em um sistema deexpressão fúngico, o promotor será operável em uma célulafúngica e a mesma lógica prevalece se a estrutura tem deser introduzida em um sistema de expressão de cultura decélulas de mamífero, um sistema de expressão de célula deinseto ou um sistema de expressão de planta. Onde ospolinucleotídeos da invenção são operavelmente ligados auma região terminadora de transcrição adequada, essa seráuma que media o término de transcrição na célula hospedeirana qual a molécula de ligação da invenção tem de serexpressa. Regiões terminadoras de transcrição adequadaspara essa finalidade são descritas na técnica.
Em modalidades preferidas, o polinucleotídeo dainvenção também será operavelmente ligado a uma seqüênciasinalizadora a qual é capaz de dirigir a expressão damolécula de ligação a uma localização celular ouextracelular desejada. Por exemplo, em algumas modalidades,pode ser desejável secretar a molécula de ligação da célulahospedeira na qual ela é expressa. Onde esse é o caso, aseqüência sinalizadora codificará um sinal de secreção.
Sinais de secreção bacterianos adequados são descritos natécnica e um de tais exemplos é a seqüência líder PelB. Emoutras modalidades, por exemplo, aquelas envolvendoexpressão em eucariotas, pode ser desejável reter aexpressão da molécula de ligação no retículo endoplásmico(ER). Nesse caso, a seqüência sinalizadora compreenderá umaseqüência de retenção no ER que codifica o motivo "KDEL"(SEQ ID NO 54) e, em particular, que codifica a seqüência"SEKDEL" (SEQ ID NO 55).
Polinucleotídeos da invenção também podem ter o códonotimizado de acordo com métodos prontamente disponíveis natécnica, com as tendências de códon sendo alteradas para seadequar ao hospedeiro de expressão escolhido em particular.
Polinucleotídeos e vetores da invenção podem serintroduzidos em células hospedeiras usando qualquermetodologia apropriada. Em células eucariotas, taistécnicas incluem transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrina, eletroporação, bombardeamento de partícula,transfecção ou transdução mediada por lipossoma usandoretrovírus, adenovlrus ou outros vírus, tais como varíolaou, para células de inseto, baculovírus. Em célulasbacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformaçãocom cloreto de cálcio, eletroporação ou transfecção usandobacteriófago. Em células de planta, técnicas adequadasincluem transformação mediada por Agrobacterium,eletroporação, microinjeção de células de planta eprotoplastas, bombardeamento de microprojétil,bombardeamento bacteriano, em particular o método em"fibra" ou "whisker", dependendo da espécie de planta queestá sendo transformada em particular. Assim, em um outroaspecto, a invenção proporciona células hospedeirascompreendendo polinucleotídeos ou vetores da invenção.Células hospedeiras dos organismos descritos abaixo e asquais compreendem polinucleotídeos ou vetores da invençãosão, assim, consideradas como modalidades específicas desseaspecto.
Sistemas de expressão adequados para expressão dasmoléculas de ligação da invenção incluem sistemas deexpressão microbianos, tais como sistemas bacterianos (porexemplo, sistemas de expressão de E. coli, Bacillus) efúngicos, por exemplo, levedos (tais como, por exemplo,Saccharomyces eerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,espécies de Piehia, espécies de Hanensula) e outrossistemas de expressão fúngicos (por exemplo, sistemas deexpressão de fungos filamentosos derivados de espécies deAspergillus, Triehoderma reesei e Neurospora crassa);
sistemas de expressão de mamíferos, por exemplo, célulasCHO, células NSO, células HEK 2 93; sistemas de expressão decélulas de insetos e sistemas de expressão de plantas.
Açafrão é particularmente preferido como um sistema deexpressão de planta. Aqueles habilitados na técnica estarãofamiliarizados com esses sistemas de expressão, os quaissão totalmente descritos na técnica.
A presente invenção também proporciona métodos para aprodução de moléculas de ligação da invenção. Assim, emoutro aspecto, é proporcionado um método para a produção deuma molécula de ligação conforme descrito aqui, em que oreferido método compreende introdução, em uma célulahospedeira, de um polinucleotídeo ou vetor da invenção ecultivar a referida célula hospedeira sob condições pelasquais a molécula de ligação é expressa. Condições para ocrescimento e manutenção de células hospedeiras e paramediação da expressão de moléculas de ligação da invenção apartir de tais células hospedeiras são totalmente descritasna técnica. Em uma modalidade, o método ainda compreenderáo isolamento e opcionalmente outra purificação da moléculade ligação.
Onde a molécula de ligação da invenção compreende umamolécula de marcação ou uma molécula de toxina que tenhasido quimicamente conjugada à molécula de ligação, amolécula de ligação conjugada pode ser produzida através daintrodução de um polinucleotídeo ou vetor da invenção emuma célula hospedeira, do cultivo da célula hospedeira sobcondições pelas quais uma molécula de ligação da invenção éexpressa, do isolamento da molécula de ligação expressa eda conjugação da molécula de ligação isolada com ummarcador ou toxina apropriada. Tipicamente, a etapa deconjugação envolverá o uso de agentes heterobifuncionais osquais resultam em ligações de dissulfeto ou tioéter,conforme descrito na técnica (veja, por exemplo, Hermanson,G.T. "Bioconjugate Techniques" Academic Press, Londres,1996, para metodologias padrões referentes ao uso dereagentes de ligação cruzada).
Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, comalgumas modalidades da invenção, pode ser desejávelaumentar a meia-vida circulatória da molécula de ligação nocorpo. Isso pode ser alcançado de várias formas, porexemplo, através de construção da molécula de ligação comouma proteína de fusão, por exemplo, com albumina, conformedescrito aqui antes. Outros métodos de aumento da meia-vidano soro de uma molécula são bem conhecidos e incluem, porexemplo, peguilação, sialilação e glicosilação.Conseqüentemente, a presente invenção abrange moléculas deligação conforme descrito aqui, as quais tenham sidopeguiladas, sialiladas ou glicosiladas.
A presente invenção também compreende composiçõescompreendendo uma molécula de ligação e pelo menos umcomponente adicional. Por exemplo, aqueles habilitados natécnica apreciarão que, no isolamento de moléculas deligação de células hospedeiras pós-expressão, podem serobtidas composições as quais compreendem a molécula deligação substancialmente purificada, mas as quais tambémcontêm uma impureza, um diluente, um tampão ou semelhante.
Tais composições intermediárias podem ser diretamenteadequadas para outro uso ou a molécula de ligação pode serainda purificada das mesmas.
As composições da invenção também podem compreenderuma molécula de ligação da invenção em combinação comqualquer veículo, excipiente, diluente e/ou estabilizantefarmaceuticamente aceitável adequado. Aqueles habilitadosna técnica estarão familiarizados com tais componentes, osquais estão descritos na arte. De preferência, talcomposição estará em qualquer forma adequada paraadministração a um paciente, em particular em uma formaadequada para administração parenteral, por exemplo,através de injeção ou infusão.
Onde a composição é para injeção ou infusão, ela podetomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em umveiculo oleoso ou aquoso e pode conter agentes deformulação, tais como agentes de suspensão, conservantes,de estabilização e/ou de dispersão. Alternativamente, amolécula de ligação ou composição pode estar em uma formaseca, para reconstituição antes de uso com um liquidoestéril apropriado.
Moléculas de ligação e composições da invenção, emparticular moléculas de ligação multiespecificas ecomposições contendo as mesmas, podem ser usadas nodiagnóstico e/ou tratamento de doenças tais como, porexemplo, doença autoimune, doença inflamatória, doençainfecciosa (incluindo doença enxerto-versus-hospedeiro),alergia ou câncer (por exemplo, linfoma não-Hodgkin;leucemia linfocitica crônica; Iinfoma/doença de Hodgkin;tumores sólidos, por exemplo, aqueles que ocorrem em câncerde mama, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer do rim oucâncer do duto biliar; doença residual mínima; tumoresmetastáticos, por exemplo, aqueles que sofrem metástasepara os pulmões, ossos, fígado ou cérebro).
Moléculas de ligação multiespecíficas da invenção emque a pelo menos uma especificidade adicional é com relaçãoao antígeno CD19 ou CD2 0 podem ser de uso particular notratamento de Iinfoma não-Hodgkin.
Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação ao EGFRlpodem ser de uso particular no tratamento de cânceres emque expressão de EGFRl é super-regulada ou alterada, porexemplo, em cânceres da mama, bexiga, cabeça e pescoço,próstata, rim, câncer de pulmão de células não-pequenas,câncer cólon-retal e glioma.
Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação aoantígeno TF podem ser particularmente úteis no tratamentode câncer de mama ou cólon e/ou metástases hepáticas.
Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação CD30 podemser particularmente úteis no tratamento de doença deHodgkin.
Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação à cadeiaalfa do receptor de IL4 (IL4R alfa) podem serparticularmente úteis no tratamento de tumores sólidos, emparticular carcinomas da mama, ovários, sistema renal,cabeça e pescoço, melanoma maligno e sarcoma de Kaposirelacionado à AIDS.
Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação EGFR3/HER3e/ou EGFR2/neu podem ser particularmente úteis notratamento de câncer de mama.
Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação IGFR podemser particularmente úteis no tratamento de câncer depróstata, câncer cólon-retal, câncer ovariano ou câncer demama.
Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação CD5 podemser particularmente úteis no tratamento de leucemialinfocitica crônica.
Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação MUC-Ipodem ser particularmente úteis no tratamento de câncergástrico e câncer ovariano.
Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação EpCAMpodem ser particularmente úteis no tratamento de carcinomasdo cólon, rim e mama.
Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação PLAP podemser de uso particular no tratamento de câncer ovariano outesticular.
Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelomenos uma especificidade adicional é com relação OFA-iLRpodem ser particularmente úteis no tratamento de tumoresmetastáticos.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona ouso de uma molécula de ligação, conforme aqui descrito, nafabricação de um medicamento para o tratamento de doençaautoimune, doença inflamatória, doença infecciosa, alergiaou câncer (por exemplo, linfoma não-Hodgkin; leucemialinfocitica crônica; linfoma de Hodgkin; tumores sólidos,por exemplo, aqueles que ocorrem em câncer de mama, câncerovariano, câncer de cólon, câncer do rim ou câncer do dutobiliar; doença residual mínima; tumores metastáticos, porexemplo, aqueles que sofrem metástase para os pulmões,ossos, fígado ou cérebro). Onde moléculas de ligaçãomultiespecifica especificadas foram descritas acima comotendo utilidade particular no tratamento de uma doençaespecificada, essas moléculas de ligação podem também serusadas na fabricação de um medicamento para essa doençaespecificada.
Em ainda outro aspecto, as moléculas de ligação dainvenção podem ser usadas como um reagente para corarcélulas expressando FcyRIIIA. Onde a molécula de ligaçãotem especificidade por pelo menos um outro antigeno, elaspodem ser usadas como o reagente pelo qual o complexo deantígeno-molécula de ligação-célula expressando FcyRIIIApode ser identificado. Moléculas de ligação da invençãotambém podem ser usadas para analisar e tipificar amostrasde pacientes ex vivo, como um biomarcador e para isolarcélulas NK para terapia ex vivo.
Assim, em outro aspecto, é proporcionado um kitcompreendendo uma molécula de ligação, conforme descritoaqui antes, e meios para detecção da molécula de ligaçãoquando ligada ao FcyRIIIA. Onde a molécula de ligação émarcada radioativamente ou marcada com um marcadorquimioluminescente, o meio de detecção pode compreender umfilme sensível ao marcador radioativo ouquimioluminescente. Onde a molécula de ligação é marcadacom uma etiqueta de histidina ou c-myc, o kit podecompreender um anticorpo o qual reconhece a etiqueta.
Vários aspectos e modalidades da presente invençãoserão agora ilustrados em maiores detalhes a guisa deexemplo. Será apreciado que modificação de detalhes podeser feita sem se desviar do escopo da invenção e aqueleshabilitados na técnica apreciarão que outros anticorpos efragmentos de ligação a antígeno para uso na invenção podemser obtidos conforme descrito aqui no Exemplo 2, e suaspropriedades com relação à ligação à diferentes isoformasde FcyRIII e mesmo a diferentes formas alélicas deFcyRIIIA, podem ser testadas conforme descrito aqui nosExemplos.
Para evitar dúvidas, os termos "FcyRIII" , "FcyIIIA" e"FcyRIIIB" são usados aqui permutavelmente com os termos"CD16", "CD16A" (denotando a isoforma A de CDl6) e "CD16B"(denotando a isoforma B de CD16), respectivamente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1: Resultados de ELISA demonstrando a ligação descFv 5ONI à CDl6-Fc capturada em estreptavidinaPlacas para ELISA foram revestidas com 500 ng deestreptavidina e 300 ng de IgG humana (Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Alemanha) por poço em 100 mM de NaHCO3, pH8,6. Subseqüentemente, 300 ng de CD16A-Fc biotinilada foramabsorvidos durante 3 0 min em temperatura ambiente em PBS.CD16A-Fc capturada em estreptavidina, estreptavidina e IgGhumana foram incubados com 1 μg/mLι de MAb A9 de murino ou50 μΐ de extrato periplásmico bruto do clone 50NI emPBS/TWEEN a 0,1%/leite em pó desnatado a 2%. A ligação deMAb A9 foi detectada com um conjugado de HRP-anticorpoanti-camundongo de cabra. A ligação de scFv 5 ONI foidetectada usando o conjugado HRP-anticorpo anti-Penta His.
A absorbância a 450 nm do HRP-substrato tetrametilbenzidina (TMB) foi medida após término da reação com 50 μΐde ácido sulfúrico a 0,5M.
Figura 2: scFv anti-CD16 humano maturado por afinidade seliga a transfectantes celulares expressando CD16A, mas nãoa células expressando CD16B. Células BW de murino e célulasBW estavelmente transfectadas com CD16A (BW/CD16A), célulasHEK-2 93 e células HEK-293 transfectadas com CD16B(293/CD16B), CD16A (293/CD16A) ou NKp46 (293/NKp46) foramcoradas com 10 μg/mL do MAb A9 (anti-CD16) ou MAb 195314(anti-NKp46), seguido por 15 μg/mL de IgG anti-camundongode cabra conjugada com FITC. O scFv anti-CD16 foi usado emuma concentração de 50 μg/mL e foi detectado com 10 μg/mLde MAb 13/45/31-2 (anti-Hexa His), seguido por IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC. As intensidadesmédias de fluorescência obtidas a partir de análise porcitometria de fluxo foram corrigidas subtraindo-se osvalores de fluorescência de colorações de células apenascom reagentes e plotados no diagrama.
Figura 3: ELISA sobre CD16A-Fc e CD16B recombinantes.
Proteínas CD16A-Fc e CD16B recombinantes foram revestidas a80 nM em 0,1 M de NaHCO3, pH de 8,8. Os poços forambloqueados com PBS, leite desnatado a 2%. A ligação do scFvàs proteínas recombinantes e à gp34-Fc (controle negativo)foi detectada usando um conjugado anti-c-Myc-HRP (10μg/ml) . Incubação com MAb A9 anti-CD16 (1 μg/mL) foiseguida por um conjugado HRP IgG anti-camundongo de cabra(0,5 /xg/mL) . CD16B recombinante revestida foi diretamentedetectada através da coloração com um anti-His-HRP (1μg/mL) e o revestimento das proteínas de fusão-Fc foitestado por um conjugado HRP-IgG anti-humano (0,5 μg/mL).
Como HRP-substrato, 50 μΐι de TMB foram usados. Após términoda reação com 50 μ!· de H2SO4 a 0,5 M, a absorbância foimedida a 450 nm.
Figura 4: Disparo de citotoxicidade redirecionada emcélulas NK recentemente isoladas através do scFv anti-CD16humano maturado por afinidade. Células NK foram isoladas eenriquecidas a partir de sangue periférico de um doadorsaudável e usadas como células efetoras em um ensaio decitotoxicidade com P815 marcado com calceína como célulasalvo. Células efetoras (E) e alvo (T) foram incubadasdurante 3 horas em uma proporção de E:T de 10:1 na presençade 1 μ9/πιΙι dos anticorpos indicados. 0 percentual de Iiseespecífica foi calculado a partir das contagens defluorescência medida da calcelna liberada no sobrenadante.
Os valores médios e desvios padrões a partir de triplicatasforam plotados.
Figura 5: Análise por citometria de fluxo de scFv anti-CD16maturado por afinidade sobre PMN e células NK. Célulaspolimorfonucleares (PMN) e células assassinas naturais (NK)foram isoladas de sangue periférico de um doador saudável eusadas para coloração e análise por citometria de fluxo. Ascélulas foram coradas com 10 /ig/mL do MAb A9 anti-CD16 eMAb B159 anti-CD56, seguido por 15 μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugado com FITC. Todos os scFvsforam usados em uma concentração de 50 μg/mL e foramdetectados com 10 μg/mL de anti-(His)6, seguido por 15μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugado com FITC.
As intensidades médias de fluorescência obtidas a partir deanálise de citometria de fluxo foram corrigidas subtraindo-se os valores de fluorescência das colorações de célulasobtidos usando apenas os reagentes secundários e foramplotados no diagrama.
Figura 6: Alinhamento de seqüência de aminoácido devariantes alélicas das isoformas CD16A e CD16B. Ospeptideos sinalizadores são mostrados como sombreado.Asteriscos e o texto em itálico marcam as diferenças dentrodas variantes alélicas de CD16B. Variações entre asisoformas CDl6A e CD16B são mostradas em negrito esublinhado. A posição do polimorfismo Val/Phe 158 na CD16Aé indicado pela caixa.
Figura 7: ELISA sobre diferentes isoformas de CD16. Poçosde uma placa Maxisorp™ foram revestidas com 100 mM deNaHCO3 contendo 200 ng de CD16A-Fc48R/158v, CD16A-Fc48r/158f,CD16B-Fcsh, CDl 6B- Fcnai , CD16B-FcNA2 e NKp46-Fc. Todos osantígenos foram incubados com [A] o scFv 4-LS21 seguido porum conjugado HRP anticorpo anti-His ou [B] com o MAb A9seguido por um conjugado HRP anti-camundongo de cabra(reatividade cruzada mínima com IgG humana). Um scFv anti-NKp4 6 usado como um anticorpo primário atuou como umcontrole negativo.
Figura 8: Morte alvo-específica através de células NKTandAb-ativadas. 1 χ IO4 da L54 0CY marcada com calceínaindicada (resultados mostrados no painel [A] ) ou célulasalvo JOK-I (resultados mostrados no painel [B] ) foramincubados durante 3 horas com 1 χ IO5 células NK napresença das concentrações indicadas de TandAb CD3 0xCD16(losangos cheios) ou TandAb CD19xCD16 (losangos abertos).Como um controle, células alvo foram incubadas com célulasNK sem anticorpo (quadrado cheio). A Iise específicapercentual foi calculada a partir das contagens defluorescência medida da calceína liberada e analisadaatravés de regressão não-linear usando o softwareGraphPadPrism.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Expressão transitória e purificação de umaproteína de fusão CD16A-Fc humana
Uma forma solúvel secretada da proteína de fusãoCD16A-Fc foi produzida em células HEK-293 após transfecçãotransitória com plasmídeo pCDM-CD16-Fc que codifica CD16Ahumana fundida à porção Fc da IgGl humana (Mandelboim etal., 1999, supra).
Células HEK-2 93 (número de acesso ATCC CRL-1573) foramcultivadas em meio DMEM completo (meio DMEM suplementadocom soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 10% (FCS),2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica e 100/xg/mL de sulfato de estreptomicina; todos da Invitrogen,Karlsruhe, Alemanha) a 37°C em uma atmosfera umidificadacom 5% de CO2. Transfecção mediada por fosfato de cálciodessas células foi realizada como segue.
Um dia antes da transfecção, 1,5 χ IO6 células HEK-293foram usadas para cultivar 10 mL de meio DMEM completo emuma placa de cultura de células de 10 cm de diâmetro. 10 ^gde DNA de plasmídeo foram misturados com 500 μL de CaCl2 a250 mM, o qual foi, então, adicionado gota a gota a 500 /xLde tampão de 2xHEBS (280 mM de NaCl, 1,5 m de Na2HPO4, 50mM de HEPES, pH 7,05) e incubados durante 15 min emtemperatura ambiente. 9 mL de meio DMEM completo foramadicionados a esse coquetel de transfecção, misturados etransferidos para um disco de células HEK-293, das quais omeio de cultura tinha sido removido. No dia seguinte, omeio de transfecção foi trocado por meio DMEM isento desoro (meio DMEM suplementado com 2 mM de L-glutamina , 100ü/mL de penicilina G sódica e 100 pig/mL de sulfato deestreptomicina e 1 χ suplemento de Insulina-Transferrina-Selênio-A (todos da Invitrogen). Os sobrenadantes contendoa proteína de fusão CD16A-Fc secretada foram coletados duasvezes em um período de dois a seis dias após transfecção,dependendo da viabilidade das células. Após cada coleta,meio fresco isento de soro foi adicionado às células.Sobrenadantes coletados foram centrifugados para removercélulas ou restos celulares e armazenados a -800C atéusados para purificação da proteína de fusão. Transfecçõesforam repetidas até ser coletado aproximadamente 1,2 L desobrenadante contendo proteínas de fusão CD16A-Fc.
Purificação da proteína de fusão CD16A-Fc recombinantefoi realizada sobre uma coluna de Proteína A de 2 mL(Protein A Sepharose™ Fast Flow, Amersham Pharmacia). Acoluna foi equilibrada com dez volumes de DMEM, pH 7(Invitrogen; suplementada com 100 μg/mL de Estreptomicina,100 u/ml de Penicilina, 1 χ Insulina-Transferrina-Selênio-Ae 2 mM de L-glutamina) . Antes do carregamento dosobrenadante de cultura de célula (1200 ml) sobre a coluna,ele foi passado através de um filtro estéril de 0,2 μιη eajustado para pH 7 através da adição de 0,1 M deglicina/HCl, pH 2,7. A coluna foi operada através de fluxopor gravidade a 4°C. Subseqüentemente, a coluna foi lavadacom 10 volumes de DMEM, pH 7. Eluição foi realizada com 6volumes de 0,1 M de glicina/HCl, pH 2,7. Frações de 1 mlforam coletadas diretamente em 55 μΐ de Tris/HCl a 1 M, pHde 8,8.
Análise das frações número 1-10 em um gel de PAA a 12%mostrou que a vasta maioria da proteína de fusão está nasfrações 2-7. Essas frações foram reunidas e submetidas àdiálise contra 5 L de PBS, pH 7,0. A determinação daconcentração de proteína de acordo com Bradford (Bradford,1976, Anal. Biochem. 72: 248-254) revelou um rendimentototal de 21 mg de proteína de fusão-Fc CD16A, isto é, 17,5mg de proteína de fusão foram produzidos por litro desobrenadante de cultura.
Exemplo 2: Identificação e isolamento de um anticorpoespecífico a CD16-AA proteína de fusão CD16A-Fc foi usada para fazer umavarredura de uma grande biblioteca de "Phage Display" descFv derivada de IgM humana, a qual tinha sido produzidausando métodos similares àqueles descritos anteriormente(Dõrsam et al. , 1997 FEBS Letts 414: 7-13, Little et al. ,1999 J. Immunol. Methods 231: 3-9, Schwarz et al., FASEB J.18: 1704-6). Os clones nessa biblioteca continhamseqüências de nucleotídeo entre a seqüência de codificaçãode scFv e o gene pIII do fago M13, o qual codificava umaetiqueta de hexa-histidina, um códon terminal âmbar e umepítopo de c-myc.
500 μg de proteína de fusão-Fc CD16A forambiotinilados usando o módulo de biotinilação de proteínaECL (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) e usadosnos três ciclos de seleção contra a biblioteca de "PhageDisplay". Antes da seleção, a biblioteca foiconsecutivamente pré-adsorvida a poliestireno revestido deestreptavidina e ã IgG humana (Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Alemanha) de forma a remover ligantes potenciais a essasproteínas. Aproximadamente IO12 fagos da biblioteca foramresuspensos em PBS, Tween a 0,1%, leite desnatado a 2%,foram incubados com proteína de fusão-Fc CD16A biotiniladasolúvel. Complexos de fago/antígeno foram capturados porglóbulos magnéticos revestidos de estreptavidina usando umseparador magnético (Dynal, Oslo, Norway). Fagos que não seligaram especificamente ao antígeno alvo foram removidosatravés de dez etapas de lavagem com PBS, Tween a 0,1%. Asentidades ligadas foram eluídas usando glicina-HCl, pH 2,2e, após neutralização com 2 M de Tris/HCl, pH 8,0, oeluato foi usado para injeção de células de E. coli XLlBlue recentemente crescidas na fase exponencial mediana(OD60O de 0,2-0,5). Células que tinham sido transformadascom sucesso com fagemídeos que codificam os scFvs humanosforam selecionados com relação à resistência à ampicilina eforam subseqüentemente infectadas com fago auxiliar M13K07para gerar a prole de fago mostrando scFv para a próximaseleção in vitro. Após o 3o ciclo de seleção, colôniasindividuais foram crescidas em meio LB contendo 100 μg/mLde ampicilina e 20 μg/mL de tetraciclina a 30°C em um PP-Masterblock de 2 mL (Greiner, Frickenhausen, Alemanha). Ascélulas foram coletadas através de centrifugação eresuspensas em 200 μί de Tris-HCl a 200 mM, pH 7,5,sacarose a 20%, 1 mM de EDTA. Durante uma incubação de 1hora sobre gelo, a membrana externa foi destruída e asproteínas periplásmicas solúveis, incluindo o scFv, foramliberadas no meio de cultura. Após eliminação deesferoplastos e restos celulares através de centrifugação,os extratos periplásmicos brutos foram testados em ELISAcom relação à ligação de scFv à proteína de fusão CD16A-Fc.Um clone (50NI) foi encontrado em três ocasiões distintas.
Uma vez que a seleção por afinidade desse clone apartir da biblioteca de "Phage Display" foi realizada sobreuma proteína de fusão-Fc humana, foi necessário demonstrarespecificidade do clone 50NI pela porção CD16 da molécula.
Um extrato periplásmico do clone 50NI foi preparadoconforme descrito acima e foi testado em ELISA com relaçãoà sua capacidade de se ligar à proteína de fusão CD16A-Fc eà IgG humana. Anticorpo monoclonal de murino anti-CD16 A9(Hombach et al., 1993 Int. J. Câncer 55: 830-836) foi usadocomo um controle. Uma placa para ELISA Maxisorb™ foi pré-revestida com 500 ng de Estreptavidina e 3 00 ng de IgGhumana (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) por poço em100 mM de NaHCO3, pH 8,6. Subseqüentemente, 3 00 ng deCD16A-Fc biotinilada foram capturados durante 3 0 min emtemperatura ambiente em PBS.
CD16A-Fc capturada em estreptavidina, estreptavidina eIgG humana foram incubadas com 1 ^g/mL de MAb A9 ou 50 μΐde extrato periplásmico bruto do clone 50NI em PBS/TWEEN a0,1%/leite desnatado em pó a 2%. Ligação de MAb A9 foidetectada com um conjugado HRP-anti-camundongo de cabra(0,5 μg/mL, Dianova, Hamburg, Alemanha), enquanto que aligação de scFv 5ONI foi detectada por um conjugado HRPanti-Penta His (1 μg/mL, Qiagen, Hilden, Alemanha) . 50 μΐ,de TMB (KPL, Maryland, EUA) foram usados como um substratoHRP e a cor deixada revelar. A reação foi cessada com 50 μΙ>de H2SO4 a 0f5M e a absorbância foi medida a 450 nm.
Os resultados são ilustrados na Figura 1. 0 MAb A9 e oscFv 50NI reconhece claramente a proteína de fusão CD16A-Fccapturada por estreptavidina biotinilada. 0 scFv 50NI nãorevela um sinal sobre a IgG humana e nem sobre aestreptavidina sozinha. 0 conjugado HRP anti-Penta Hisusado como um reagente secundário não revelou ligação não-específica aos antígenos. Contudo, o conjugado HRP anti-camundongo de cabra usado como um reagente secundário paradetecção do MAb A9 causou alguma coloração de base emvirtude de reatividade cruzada com a porção Fc humana daproteína de fusão de CD16 usada como um controle negativo.
Esses resultados são fortemente indicativos de que oscFv 50NI exibe especificidade pela porção CD16A daproteína de fusão e não pela porção Fc.
Exemplo 3: Testagem de scFv 50NI em FACS sobre diferenteslinhagens de células expressando estavelmente as isoformasCD16, PBMC humana e granulócitos
Para determinar se o scFv 50NI revela ligação ãproteína de CD16A nativo sobre a superfície celular, umextrato periplásmico bruto do scFv foi testado através decitometria de fluxo sobre duas linhagens de célulasdiferentes expressando CD16A ou CD16B, respectivamente.Para essa finalidade, a linhagem de células BW/CDl6Aexpressando CD16A (Mandelboim et al., 2001, Nature 409:1055-1060) e a linhagem de células 293-CD16 (células HEK-293 estavelmente transfectada com um plasmídeo que codificao alelo NA-2 da isoforma CD16B humana) foram usadas.
Para avaliar se o scFv 50NI tinha a capacidade de seligar ao CD16A expresso sobre a superfície de célulasassassinas naturais (NK) e/ou ao CD16B presente sobre asuperfície de granulócitos neutrofílicos (van de Winkel eCapei, 1993, supra; van Spriel et al., 2000, Immunol. Today21(8): 391-397), ele foi testado com relação à ligação àcélulas mononucleares de sangue periférico recentementeisoladas (PBMCs) consistindo de 10-20% de células NK esobre células polimorfonucleares (PMN) representando maisde 95% de granulócitos neutrofílicos CD16B-positivos,usando citometria de fluxo.
MAb A9 de murino e um extrato periplásmico do clonescFvig de murino A9 (um scFv derivado do MAb A9) foramusados como controles.
3.1 Crescimento de linhagens de células e isolamento dePBMC e PMNCélulas BW/CD16A foram cultivadas em meio DMEMsuplementado com soro de bezerro fetal inativado pelo calora 10% (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina Gsódica, 100 /zg/mL de sulfato de estreptomicina, aminoácidosnão essenciais a 1% e 5 mg/mL de G418. As células 293/CD16Bforam cultivadas em meio DMEM suplementado com soro debezerro fetal inativado pelo calor a 10% (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica, 100 /xg/mL desulfato de estreptomicina e 0,5 mg/mL de G418. As linhagensde células precursoras não transf ectadas BW e 293 foramcultivadas conforme descrito acima para os transformantesestáveis, mas em meio carecendo de G418.
PBMC e PMN foram isoladas de sangue periféricoheparinizado de um doador saudável através de centrifugaçãocom gradiente de densidade. O sangue foi diluído duas vezescom PBS, colocado em camadas sobre uma camada duplaconsistindo de 12 mL de Histopaque-1119™ (Sigma-Aldrich) euma camada superior de 12 mL de Histopaque-1077.Centrifugação foi realizada a 800 g durante 25 min. PBMCslocalizadas sobre a camada de Histopaque-1077™ (Sigma-Aldrich) superior e a PMN localizada sobre o chumaço deHistopaque-1119 ™ foram coletadas e lavadas 3 vezes com PBSantes do uso.
3.2 Isolamento de extratos periplásmicos contendo scFv50ΝΙ e scFVio A9
Extratos periplásmicos brutos contendo scFvs foramisolados de 5 mL de culturas bacterianas. As bactériasrecentemente inoculadas foram crescidas durante a noite a370C em meio LB contendo 50 mM de glicose, 100 ^g/mL deampicilina e 20 μg/mL de tetraciclina. As culturas noturnasforam diluídas para uma ODSoonm = 0,1 em meio LB comampicilina e tetraciclina e ainda crescidas a 37°C até umaOD60Onm = 0,8. As bactérias foram coletadas através decentrifugação e resuspensas em meio LB contendo 0,1 mM deisopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) , 100 μg/mL deampicilina e 20 μg/mL de tetraciclina. Após incubaçãodurante a noite de bactérias induzidas a 21°C, 300 ^L deextratos periplásmicos foram isolados conforme descritopara ELISA. Antes do uso em análise por FACS, os extratosperiplásmicos foram submetidos à diálise contra PBS durantea noite.
3.3 Citometria de fluxo
Para a análise por citometria de fluxo, 1 χ IO6células BW, BW/CD16A, HEK-293, 293/CD16B, PBMC e PMN foramcoradas com o anticorpo monoclonal A9 ou um extratoperiplásmico contendo scFv18A9 e 5 0NI.
1 χ IO6 células foram incubadas com 100 μL dosextratos periplásmicos submetidos à diálise ou com MAb A9(10 μ9/πι]1ι) durante 45 min sobre gelo. Incubações deanticorpo/scFv com PBMC e PMN foram suplementadas com IgGpoliclonal humana a lmg/mL para bloquear receptores Fcsobre a superfície das sub-populações de PBMC e PMN. Apóslavagem com tampão FACS (PBS suplementado com FCS inativadopelo calor a 2% e azida de sódio a 0,1%) e as células foramincubadas sobre gelo durante 45 minutos com 0,1 mL de 0,01mg/mL de MAb 13/45/31-2 anti-(His)6 de camundongo (Dianova,Hamburg, Alemanha) no mesmo tampão. Após um segundo ciclode lavagem, as células foram incubadas com 0,1 mL de 0,015mg/mL de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra conjugadoscom FITC (Dianova, Hamburg, Alemanha) sob as mesmascondições. As células foram, então, novamente lavadas eresuspensas em 0,5 mL de tampão FACS contendo 2 μg/mL deiodeto de propídio (Sigma-Aldrich) para excluir as célulasmortas. A f luorescência de 1 χ IO4 células coradas foimedida usando um citômetro de fluxo Beckman-Coulter EpicsXL. As intensidades médias de fluorescência foramcalculadas usando os softwares System-II e Expo32 (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha). A fluorescência causada pelacoloração de base das células com os agentes secundáriossozinhos foi subtraída dos resultados e histogramasplotados (não mostrados) para auxiliar na análise.3.4 ResultadosO anticorpo monoclonal anti-CD16 de murino A9 e oscFvie anti-CD16 derivado de A9 serviram como controlespositivos e revelaram ligação clara à BW/CD16A emcomparação com as células precursoras não transfectadas(BW). 0 scFv 50NI também mostrou coloração inequívoca dascélulas BW/CD16A em nível comparável ao A9.
Ambos os anticorpos monoclonais A9 e scFvi8 A9exibiram forte ligação aos transfectantes 293/CD16B, osquais expressam a isoforma CD16B sobre sua superfície,enquanto que o 50 NI não se liga a essa linhagem de célula.
0 anticorpo monoclonal A9 e o ScFv18 A9 revelaram umacoloração clara de uma pequena sub-população das PBMCs,representando a fração de células NK. 0 scFv 50NI,similarmente, exibiu ligação a essa sub-população.
Em contraste ao A9 e ao scFv derivado de A9, ambos osquais mostraram um forte sinal sobre os granulócitospurificados, o scFv 50NI falhou em se ligar à PMN.
Esses dados indicam que o scFv 50NI se ligaespecificamente à isoforma CD16A e não se liga à isoformaCD16B. 0 scFv 50NI também reconhece não apenas CD16Arecombinante, mas também o antígeno nativo, conformeexpresso sobre a superfície de células NK.
Exemplo 4: Ligação de scFv 50NI anti-CD16A humano àscélulas NK enriquecidasPara demonstrar que a sub-população de PBMC que foireconhecida pelo 50NI conforme mostrado no Exemplo 3compreende células assassinas naturais (NK), uma populaçãoenriquecida de células NK foi isolada de PBMC e analisadacom relação à ligação ao scFv 50NI através de citometria defluxo.
PBMCs foram isoladas de sangue periférico heparinizadode um doador saudável através de centrifugação em gradientede densidade. A amostra de sangue foi diluída duas vezescom PBS, colocada em camadas sobre uma camada deHistopaque-1077™ (Sigma-Aldrich) e centrifugada a 800 gdurante 25 min. PBMCs localizadas na interface foramcoletadas e lavadas 3 vezes com PBS. Para isolamento decélulas NK, as PBMCs foram resuspensas em FCS/PBS a 2% eforam submetidas a um ciclo de seleção negativa usando okit de enriquecimento de células NK EasySEP™ negativo(CellSystems) de acordo com as instruções dos fabricantes.Coloração das PBMC e células NK e análise por citometria defluxo foram realizadas essencialmente conforme descrito noExemplo 3 acima: 1 χ IO6 das células foram coradas com 10μg/mL do MAb A9 ou do anticorpo monoclonal anti-CD56 MAbB159 (BD Biosciences/Pharmingen) , seguido por 15 μΐι de IgGanti-camundongo de cabra conjugada com FITC. O ScFv18 A9 demurino e o scFv 5ONI humano foram usados para coloração emuma concentração de 50 μg/mL e o scFv ligado à célula foidetectado com 10 ^g/mL de MAb anti-(His)s, seguido por 15μΐϋ de IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC.Todas as colorações foram realizadas na presença de 1 mg/mLde IgG humana policlonal. Células mortas foram excluídasatravés de coloração com iodeto de propídio conformedescrito acima. Análise dos dados foi realizada conformedescrito no Exemplo 3 acima.
4.1 Resultados
Coloração de PBMC com os anticorpos anti-CD56 e anti-CD16 identificou claramente uma sub-população representandoa fração de células NK. O scFv 5ONI também reconheceu umapequena população de células, indicando ligação às célulasNK.
Após enriquecimento negativo das células NK, todos osquatro anticorpos/scFvs revelaram coloração inequívoca.Enquanto que o MAb anti CD56 exibiu ligação a toda apopulação de células NK, uma pequena fração das células nãofoi corada usando os anticorpos dirigidos contra CD16. Essepoderia refletir a presença de algumas células com umfenotipo CD16-negativo.
Exemplo 5: Medição do fluxo de Ca2+ após ligação ao scFv ONICD16A, o receptor de baixa afinidade pela IgG, éexpresso sobre a maioria das células NK do sangueperiférico em associação com o motivo de ativação deimunoreceptores baseados em tirosina (ITAM) contendo acadeia γ do FcsRI ou a cadeia ζ do complexo TCR/CD3.
Ligação de CD16A a anticorpos ou complexos imunes dispara acitotoxicidade de células NK e secreção de citocina. Aativação envolve fosforilação da cadeia γ ou da cadeia ζ,respectivamente, e subseqüente transdução de sinalintracelular, tal como mobilização de Ca2+.
Para testar se o scFv anti-CD16 50NI humano possuipropriedades de ativação de NK, medições do fluxo Ca2+ comcélulas NK recentemente isoladas foram realizadas apósligação de receptores de superfície com anticorposmonoclonais anti-CD16 ou scFv. Uma vez que algunsanticorpos anti-CD16 precisam de ligação cruzada através dereagentes secundários para evidenciar um claro aumento decálcio intracelular, anti-c-myc e anti-(His)s em combinaçãocom IgG anti-camundongo foram usados para ligarcruzadamente os anticorpos anti-CD16 ligados à célula.
Para preparo de NK, PBMCs foram isoladas de sangueperiférico heparinizado de um doador saudável através decentrifugação com gradiente de densidade. A amostra desangue foi diluída duas vezes com PBS, colocada em camadassobre uma camada de Histopaque-1077™ e centrifugada a 800 gdurante 25 min. PBMCs localizadas na interface foramcoletadas e lavadas três vezes com PBS. Para isolamento dascélulas NK, as PBMCs foram resuspensas em FCS/PBS a 2% esubmetidas a um ciclo de seleção negativa usando o kit deenriquecimento de células NK EasySEP™ negativo de acordocom as instruções do fabricante (Cell Systems). As célulasNK foram lavadas uma vez com HBSS e, então, marcadas com oindicador de cálcio Fluo-4-acetóximetil (AM) éster(Molecular Probes, Leiden, Países Baixos) em umaconcentração de 2 μΜ durante 3 0 min em temperatura ambienteno escuro. Após lavagem com HBSS, as células foramincubadas durante mais 20 min em HBSS para permitirdesesterificação completa de ésteres AM intracelulares elavadas novamente com HBSS. Para análise por citometria defluxo de alterações de cálcio intracelular, alíquotas decélulas NK marcadas foram primeiramente medidas semqualquer anticorpo sobre um citômetro de fluxo Beckman-Coulter Epics XL para determinar a fluorescência de base.Após aproximadamente 60 seg, anticorpos anti-CD16 (2 μg deMAb A9 ou 5 μg de scFvl8 A9 ou 5 μg de scFv 50NI) foramadicionados e a medição foi continuada. A 180 seg após oinício, 20 μg de anticorpos IgG anti-camundongo de cabrapoliclonais (GAM) foram adicionados à amostra de MAb A9para se ligarem cruzadamente ao A9 ligado ao CD16 sobre asuperfície de células NK. Para ligar cruzadamente os scFvs,2,5 μg de MAb 13/45/31-2 anti-(His)6 de camundongo e 2,5 μgde MAb 9E10 anti-c-myc foram aplicados antes de continuar amedição. No caso das amostras com os scFvs, 2 0 μg deanticorpos IgG anti-camundongo de cabra policlonais foramadicionados em pontos de tempo posteriores para ainda ligarcruzadamente MAbs anti-(His)6 e/ou anti-c-myc ligados aoscFv. As intensidades médias de fluorescência de intervalosde tempo curtos foram determinadas usando o software Expo32(Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) e plotados contra otempo (não mostrado).
Os traços de fluorometria obtidos com as células NKrecentemente isoladas mostraram claramente que o MAb A9evidencia um forte aumento na concentração de cálciointracelular quando ligado cruzadamente com anticorpos IgGanti-camundongo, o que é refletido por maiores sinais def luorescência. Em contraste ao MAb A9, o scFv derivado deA9 (ScFv18 A9) induziu pouco ou nenhum aumento de cálciointracelular mesmo após ligação cruzada com anticorpos IgGanti-(His)6, anti-c-myc e anti-camundongo. 0 scFv 50NIhumano, contudo, evidenciou um claro sinal de fluorescência(embora ligeiramente fraco) após ligação do scFv ligado àsuperfície celular com anticorpos de ligação cruzada. Issodemonstra que o scFv 5ONI humano possui características deligação que são adequadas para disparar atividade decélulas NK via CD16A.
Exemplo 6: Maturação por afinidade do scFv 50NI através deembaralhamento de cadeia leve
Para obter scFvs anti-CD16 com afinidade aumentada,uma biblioteca de cadeia embaralhada baseada no clone 50NIfoi gerada através do rearranjo da cadeia Vh do 5ONI com umrepertório de gene Vl .
Os repertórios de gene νλ e Vk foram excisados do DNAde pEXHAMl originário de uma grande biblioteca de scFvnaive humana previamente descrita (Schwarz et al. , supra,2004) . Esse repertório reflete aproximadamente IO5 cadeiasνλ e Vk individuais cada. 0 rearranjo com a cadeia pesadado 50NI através de clonagem nos sítios Mlu I e NotI dopEXHAMl e a transformação de 1 μg em E. coli XLl blue (1,8kV, cubeta com largura de 0,1 cm, 25μΡ, 200 Ώ) resultou emuma biblioteca com 2,6 χ IO6 (Vic) e 2,2 χ IO6 (νλ)elementos.
Análise de seqüência de 32 clones aleatoriamenteescolhidos após transformação mostrou que cada clonecontinha uma cadeia leve individual e 24 clones revelaramexpressão de scFvs de comprimento total detectável por umanticorpo anti-His (Qiagen, Hilden, Alemanha) em umaWestern Blot.
Quatro ciclos de seleção foram realizados sobre umaproteína de fusão CD16A-Fc biotinilada conforme descrito noExemplo 2. Pressão de seleção favorecendo ligações de altaafinidade foram criadas limitando-se sucessivamente àconcentração de antígeno (Io ciclo 20 nM, 2o ciclo 1 nM, 3ociclo 0,1 nM, 4o ciclo 0,01 nM) . As bibliotecas κ- e λrearranjadas foram mantidas separadamente.
Aproximadamente IO8 fagos de cada bibliotecaresuspensa em PBS/TWEEN a 0,1%/leite desnatado a 2% foramincubados com a proteína de fusão CD16A-Fc biotinilada.Complexos de fago/antígeno foram resgatados através daadição de glóbulos magnéticos revestidos com estreptavidinae fagos de ligação não específica a antígeno foramremovidos através de dez etapas de lavagem com PBS/TWEEN a0,1%. Em uma primeira etapa, as entidades ligadas forameluídas usando glicina-HCl, pH 2,2. Após neutralização comTris/HCl a 2 M, pH 8, E. coli XLl Blue recentementecrescida (fase exponencial mediana OD600 de 0,2-0,5) foramadicionados de forma a recuperar fagos os quais não puderamser removidos pelo baixo pH. As células que eluíram atravésde eluição ácida também foram misturadas com célulashospedeiras XLl em crescimento exponencial.Células transduzidas com sucesso com fagemídeo, quecodifica um scFv humano, foram selecionadas com relação àresistência à ampicilina e subseqüentemente infectadas como fago auxiliar M13K07 para gerar um fago apresentando scFvpara seleção posterior in vitro. Em ciclos subseqüentes deseleção, o fago recuperado através de eluição ácida einfecção de XLl blue foram manualmente separados. Após os30 e 40 ciclos de seleção por afinidade, as colôniasindividuais foram testadas em ELISA conforme descrito noExemplo 2.
Nenhum dos clones testados da κ-biblioteca rearranjadamostrou sinais significativos acima daquele do clone 50NIprecursor crescido como referência no mesmo bloco mestre.Contudo, vários clones foram seqüenciados e provaram seridênticos ao clone precursor, indicando que nenhuma K-cadeia adequada foi encontrada a qual aperfeiçoou aspropriedades de ligação.
Em contraste, análise de clones derivados da λ-biblioteca rearranjada revelou numerosos clones gerandosinais até cinco vezes mais com relação à referência. 30clones foram selecionados para seqüenciamento após o 3o e34 clones foram selecionados para seqüenciamento após o 4ociclo de "bio panning". Seqüenciamento foi realizado com oLong Read Tower (Visible Genetics, Toronto, Canadá) usandoo Deaza Kit (Visible Genetics, Toronto, Canadá) seguindo asdiretrizes dos fabricantes. Eluição ácida de partículas defago ligadas ou infecção direta das células hospedeiras nãoteve efeito óbvio sobre a distribuição posterior dosclones. Cinco diferentes grupos de clones enriquecidos evários individuais foram identificados. A Tabela 2proporciona uma visão geral dos diferentes grupos.
Tabela 2. Designações de clones que representam umdeterminado grupo em subseqüentes exemplos são realçadas em negrito
<table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table>
Clones que formam o grupo A representam o cloneprecursor 50NI, o qual também estava presente na bibliotecaembaralhada em virtude do vetor precursor re-ligado ou nãocortado ou em virtude do rearranjo durante a construção dabiblioteca. Essa descoberta se correlaciona com o fato deque os clones desses grupos proporcionaram os sinais maisfracos por ELISA.
Todos os outros grupos contêm cadeias levesrecentemente rearranjadas, revelando sinais aumentados porELISA, comparados com o clone precursor. Clones dos gruposCeD foram encontrados em números comparáveis após os 3o e4o ciclos de seleção.
Análise das seqüências usando um software dealinhamento de V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)revelou que todas as novas cadeias Vx pertencem à famíliaVL3, bem como a cadeia VL do clone precursor.
As seqüências de aminoácido da cadeia Vh comumcompartilhada por todos os clones é fornecida aqui como SEQID NO 9 e a cadeia Vl específica para os clones 50NI,3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 são fornecidasaqui como SEQ ID NOs 10-16, respectivamente. A seqüência deácido nucléico que codifica a cadeia VH comum é fornecidaaqui como SEQ ID NO 1 e as seqüências de ácido nucléico quecodificam as cadeias VL individuais para os clones 50NI,
3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 são fornecidasaqui como SEQ ID NOs 2-8, respectivamente. As seqüências deaminoácido das CDRs de cadeia pesada e leve individuais sãofornecidas na Tabela 1, com as CDRs de cadeia pesada comunsmostradas como a primeira entrada na tabela, seguido pelasCDRs de cadeia leve para 50NI, 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49,
4-LS14 e 4-LS21 (mostradas como entradas 2-8,respectivamente).Exemplo 7: Análise por FACS de scFv maturado por afinidadesobre linhagens de célula transfectadas com CD16A e CD16B
Uma análise por FACS preliminar com extratosperiplásmicos brutos de todos os clones individuais mostrouque todos os scFvs com cadeia embaralhada retinham suacapacidade de se ligar ao CD16A. Para esse teste, célulasHEK-293 transitoriamente transfectadas com CD16A foramusadas (dados não mostrados). Baseado nesse teste, osclones 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 foramselecionados para outra caracterização.
Ácidos nucléicos que codificam esses scFvs foramsubclonados no vetor de expressão pSKK2, onde eles foramclonados win-frame" com uma seqüência líder N-terminal PelBe etiquetas de hexa-histidina e c-myc C-terminais. Asseqüências de nucleotídeos desses sub-clones são comosegue:
pSKK2-5ONI (SEQ ID NO 36)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcaggacagacagccagcatcccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggtatcaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaapSKK2-3-LB3 (SEQ ID NO 37)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccagggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccctctgggatccctgagcgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatcagcagagcccaagccggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacactgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa
gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
pSKK2-3-LB5 (SEQ ID NO 38)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc
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gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
pSKK2-3-LB6 (SEQ ID NO 39)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacaggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccaggacagacggccaggattccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggtatcggcagaagccaggccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaapSKK2-3-LS49 (SEQ ID NO 40)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccgggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccctctgggatccctgagcgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatcagcagagcccaggccggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacattgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgcccccccggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaapSKK2-4-LS14 (SEQ ID NO 41)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccaggacagacggccacgattacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggtaccaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaapSKK2-4-LS21 (SEQ ID NO 42)
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgatctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaagaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa
A seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüêncialíder PelB é atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggccatggcg (SEQ ID NO 43).
A seqüência de nucleotídeos que codifica a regiãoligante entre os domínios variáveis das cadeias leve epesada de cada scFv é gaagaaggtgaattttcagaagca (SEQ ID NO 44).
A seqüência de nucleotídeos do c-myc e da etiqueta dehexa-histidina são gaacaaaagctgatctcagaagaagaccta (SEQ IDNO 45) e catcaccatcaccatcac (SEQ ID NO 46) ,respectivamente.
Os vetores compreendendo os sub-clones foramtransformados em E. coli RV3 08, expresso em culturas emfrasco de agitação de 2 litros e purificados através decromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados(IMAC) de acordo com Le Gall et al. (2004, J. Immunol.MethodS 285: 111-127).
Para avaliar se o scFv com cadeia embaralhada retinhasua especificidade pelo CD16A conforme indicado para 50NIno Exemplo 3, linhagens de célula transfectadas expressandoCD16A ou CD16B foram testadas com scFv purificado por IMAC.Para análise por citometria de fluxo, as seguinteslinhagens de célula foram usadas: transfectantes BW eBW/CD16A foram cultivados conforme descrito anteriormente.Células 293 e transfectantes 293-CD16B foram manipuladasconforme descrito anteriormente. 293-CD16A e 293-NKp46foram gerados através de transfecção transitória de células293 com plasmídeos que codificam os domínios extracelularesde CD16A ou NKp46, respectivamente, fundidos aos domíniostransmembrana e citoplásmico da cadeia 0Ό3ζ humana (pcDNA3-CD16A-zeta e pcDNA3-NKp4 6-zeta, obtidos do Dr. 0.Mandelboim, University of Jerusalem, Israel). Astransfecções transitórias foram realizadas usando o métodocom fosfato de cálcio, conforme descrito no Exemplo 1, eforam usadas para coloração e análise por citometria defluxo dois dias após transfecção transitória. Coloração eanálise por citometria de fluxo foram realizadas conformeessencialmente descrito acima. 1 χ IO6 das célulasindicadas foram coradas com 50 /xg/mL do scFv purificado,seguido por 10 μg/mL de MAb 13/45/31-2 (anti-hexa His) e 15μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC.
Para demonstrar que as células transfectadas expressamos antígenos correspondentes sobre sua superfície, célulasforam coradas em paralelo com 10 μg/mL de MAb A9 emonoclonal anti-NKp46, MAb 195314 (R&D Systems, Wiesbaden,Alemanha). MAbs A9 e 195314 foram detectados com 15 μg/mLde IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC. Asintensidades médias de fluorescência obtidas a partir deanálise por citometria de fluxo foram corrigidassubtraindo-se os valores de fluorescência de colorações comos reagentes secundários sozinhos e os resultados sãomostrados na Figura 2.
0 MAb A9, usado como um controle positivo, cora,conforme esperado, para todas as linhagens de célulastransfectadas com CD16, a despeito da isoforma. Nenhumaligação aos transfectantes NKp46 foi observada, enquantoque coloração com MAb 195314 dirigido contra NKp4 6 mostrouclaramente que as células foram transfectadas com sucessocom o plasmídeo de ctíntrole que codifica NKp46.
0 scFv 5ONI anti-CD16 humano precursor usado como umareferência revelou fraca coloração das duas linhagens decélula expressando CD16A sobre sua superfície (as célulasBW/CDl6 A e 293/CD16A). Em contraste, o scFv recentementeisolado com cadeias leves rearranjadas exibiu ligaçãoaltamente aperfeiçoada a essas células. Nenhuma das novasvariantes se ligou às células 293 estavelmentetransfectadas com CD16B, demonstrando especificidade pelaisoforma A de CD16.
Exemplo 8: Testagem de fragmentos de scFv maturados porafinidade sobre células NK enriquecidas e PMN recentementeisoladas
Para avaliar se o scFv aperfeiçoado retinha suacapacidade de se ligar especificamente ao CD16A expressosobre leucócitos, PMN recentemente isoladas e células NKenriquecidas de sangue de doador foram coradas conformedescrito anteriormente usando scFv purificado por IMAC.
Enriquecimento de células NK foi realizado através deseleção negativa, conforme descrito acima. As intensidadesmédias de fluorescência obtidas a partir de análise porcitometria de fluxo são mostradas na Figura 5.
Coloração da população de leucócitos enriquecida comum MAb A9 anti-CD16 e MAb B159 anti-CD56 demonstraclaramente que a população consiste de células NK de sangueperiférico CD16 + /CD56+. 0 MAb A9 e o scFv de murinoderivado de A9 corou a fração de células NK CD16A-positivase mostrou um sinal ainda mais forte sobre granulócitosCD16B-positivos.
MAb A9 reconheceu uma sub-população (18,5%) de PBMCscorrespondendo às células NK CD16-positivas. Forte ligaçãofoi observada sob células NK enriquecidas e granulócitosisolados (dados não mostrados).
O clone 50NI precursor revelou ligação fraca, masclara, às células NK enriquecidas, enquanto que nenhumacoloração dos granulócitos era visível. As variantesmaturadas por afinidade 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS4 9, 4-LS14e 4-LS21 revelaram padrões de coloração semelhantes àqueledo 50NI, mas com sinais de ligação aperfeiçoados. Essesdados proporcionam suporte adicional para o fato de que osscFvs maturados por afinidade são capazes de distinguirespecificamente entre as duas isoformas de CD16 e se ligamespecificamente ao CD16A.
Exemplo 9: ELISA sobre CD16A-Fc e CD16B recombinantes
De forma a gerar dados adicionais que sustentam aespecificidade dos scFvs por CD16A, um ELISA foi realizadousando a proteína de fusão CD16A-Fc (Exemplo 1) e CD16B-Fcrecombinante comercialmente disponível (Alelo NA-2; BSAfree; RD Systems). Uma proteína de fusão gp34-Fc foi usadacomo um controle negativo. As proteínas recombinantes foramrevestidas durante a noite em uma concentração de 80 nM em100 mM de NaHCO3 em um pH de 8,8.
Detecção do scFv ligado às proteínas recombinantes foirealizada usando um conjugado anti-c-myc-HRP (10 μg/ml). 0controle positivo compreendia MAb A9 (1 /xg/mL) , seguido porum conjugado de IgG-HRP anti-camundongo de cabra (0,5g/mL). Ligação ao CD16B recombinante foi testada atravésde coloração direta com anti-His-HRP (1 μg/mL) e ligação àsproteínas de fusão de Fc foi testada através de umconjugado de IgG-HRP anti-humano (0,15 μg/mL).
Todos os scFv mostraram forte ligação ao CD16A-Fc,enquanto que nenhuma ligação ao CD16B foi observada (Figura3) . Uma ligação de base ligeiramente aumentada foipercebida com gp34-Fc. Isso foi provavelmente em virtude deuma pequena quantidade de ligação não especifica à gp34-Fc,uma vez que todos os anticorpos secundários testadossozinhos também revelaram sinais de base ligeiramenteaumentados sobre essa proteína.
Conforme esperado, A9 reconheceu fortemente CD16A-Fc.Contudo, deve ser considerado que o anticorpo conjugado aoHRP anti-camundongo de cabra secundário mostra reatividadecruzada significativa com a fusão de Fc humana (vejacontrole com HRP anti-camundongo de cabra sozinho).Reprodução desse ensaio usando um conjugado de IgG-HRPanti-camundongo de cabra pré-adsorvido com reatividadecruzada mínima à IgG humana (dados não mostrados) nãorevelou redução significativa na ligação de base.
MAb A9 mostrou um sinal claro sobre CD16B, a qual nãofoi influenciada pelo reagente secundário.
Exemplo 10: Western Blot sobre CD16A-Fc recombinante sobcondições de redução e não redução
Para caracterização adicional, todos os scFvs anti-CD16A foram testados com relação à ligação em Western Blotsobre CD16A-FC e NKp46-Fc recombinantes.
CD16A-Fc e NKp4 6-Fc, servindo como um controlenegativo, foram separados através de SDS-gel a 12% sobcondições de redução e sobre um gel a 8% sob condições denão redução. As proteínas foram transferidas sobre umamembrana de nitrocelulose através de eletroblotting. Apóscoloração com Ponceau S, a membrana foi cortada em tiras de5 mm de largura. Cada tira de nitrocelulose foiindividualmente incubada com scFv (4 μg/ml) em PBS, Tween a0,1%, leite desnatado a 2%. Detecção foi realizada com oconjugado HRP anti-Penta His (1 ^g/mL) usandodiaminobenzidina (DAB) como um substrato de peroxidase.Tiras de controle foram incubadas com A9 (1 /ig/mL) ou anti-NKp46 195314, seguido por um conjugado HRP IgG anti-camundongo de cabra (0,2 /xg/mL, reatividade cruzadamínima). Como um controle positivo adicional, um conjugadoHRP IgG anti-humano de cabra (0,16 μg/mL) foi usado paradetecção da porção Fc das proteínas de fusão.
Os anticorpos monoclonais A9 e 195314 reconheceram seuantígeno sob condições de redução, bem como de não redução.
0 conjugado HRP-anti-camundongo de cabra usado como umreagente secundário para o MAb A9 revelou ligeirareatividade cruzada com a porção Fc da proteína de fusãoCD16A-Fc. Em contraste, a ligação dos scFvs anti-CD16 foiobservada apenas sob condições de não redução, indicandoque uma estrutura secundária estabilizada por ligações emponte de dissulfeto é requerida para reconhecimento. 0clone precursor 50NI mostra sinais mais fracos comparadocom os scFvs maturados por afinidade. Nenhuma ligação doscFv 3-LB6 pôde ser detectada e nenhum dos scFvs reveloureatividade cruzada com a proteína de controle NKp4 6-Fc,confirmando a especificidade por CDl6.
Exemplo 11: Análise do scFv através de cromatografia porexclusão de tamanho sobre uma coluna Superdex 2 00
Para determinar se as maiores afinidades das variantesde scFv são primariamente em virtude de ligação monovalenteaperfeiçoada, os preparados de proteína foram analisadoscom relação à sua composição oligomérica sobre uma colunade gel filtração Superdex 200. O LMW Gel FiltrationCalibration Kit (Amersham Pharmacia Biosciences, Freiburg,Alemanha) serviu como um padrão. A Tabela 3 proporciona umsumário das formas moleculares presentes nos preparados deproteína individuais.
Tabela 3. Formas moleculares de scFvs presentes empreparados de proteína individuais. 3-LB5 não foi analisadoem virtude da baixa concentração de proteína.
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Cromatografia por exclusão de tamanho demonstrouclaramente que os scFvs 3-LB6 e 4-LS21 eram unicamentemonoméricos.
Em contraste, o 3-LS4 9, 3-LB3 e 4-LS14 revelaramproporções significativas de moléculas diméricas, indicandoque as propriedades de ligação aperfeiçoada dessasmoléculas pode não ser apenas em virtude de maiorafinidade, conforme para 3-LB6 e 4-LS21, mas tambémrefletem um efeito de avidez em virtude da formação dedimero.
Exemplo 12: Determinação de afinidade do scFv através deressonância plasmônica de superfície (SPR)
As constantes de afinidade (valores de KD) do scFvforam determinadas através de SPR usando o sistemabiosensor BIAcore 2 000 (Amersham-Pharmacia) . A proteína defusão CD16A-Fc e BSA, usada como um controle negativo,foram imobilizados sobre um "chip" sensor revestido comcarbóximetildextrana CM5 usando química convencional comNHS/EDC para o procedimento de acoplamento de amina(BIAcore). scFvs purificados foram diluídos em tampão HBS-EP (BIAcore, Uppsala, Suécia). Os dados de ligação foramgerados passando várias concentrações dos anticorpos scFv(100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM e 1600 nM) sobre o antígenoimobilizado. 0 MAb A9 anti-CD16 serviu como um controlepositivo. Todas as medições por SPR foram realizadas em umataxa de fluxo constante de 20 ^L/min em tampão HBS-EP a25°C. Cada amostra injetada (100 μΐ) ficou em contato comantígeno durante 5 minutos. A dissociação foi acompanhadadurante 30 minutos. Após cada ciclo, a superfície do "chip"sensor foi submetida a fluxo com tampão HBS-EP. Os sinaisdo canal de controle revestido com BSA foramautomaticamente subtraídos. As constantes cinéticas foramcalculadas de acordo com o modelo de ligação de Langmuir1/1 usando o software BIAevaluation versão 3.0 (BIAcore).As constantes de taxa "off" e "on" calculadas e respectivosvalores de K0 são resumidos na Tabela 3. Para o MAb A9,usado como um controle, uma Kd de 1,75 χ IO"9 M foicalculada, com o valor de 1,55 χ IO"9 M descrito naliteratura (Renner et al. , 2001 Câncer Immunol. Immunother.50: 102-108). Adicionalmente, as constantes de dissociaçãoem equilíbrio foram deduzidas a partir de análise em estadouniforme para os scFvs 50NI, 4-LS21 e 3-LB6 a partir dosdados de SPR.
Tabela 4. Dados para a cinética de ligação de scFvsindividuais
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As constantes cinéticas calculadas independentementeatravés desses dois métodos se correlacionam bem ecomparação direta com o clone precursor 50NI revelou umaperfeiçoamento de mais de vinte vezes na afinidade atravésde embaralhamento de cadeia leve. Todos os três scFvsformam somente populações de proteína monomérica (compararTabela 3, Exemplo 11), indicando que as propriedades deligação aperfeiçoadas são em virtude de maior afinidadebaseado em otimização da interface antígeno/scFv e não porefeitos de avidez.
Os scFvs 3-LS4 9, 3-LB-3 e 3-LS14 revelam valores de Kdcomparáveis, mas mostram uma população de moléculas nãohomogênea compreendendo percentuais significativos demoléculas diméricas (comparar tabela 2, exemplo 13). Assim,as afinidades aperfeiçoadas desses anticorpos podem ser,pelo menos parcialmente, em virtude de ligaçãomultivalente.
Exemplo 13: Indução de fluxo de Ca2+ em células NK atravésde ligação do scFv anti-CD16 maturado por afinidade
Para avaliar se o scFv maturado por afinidade retinhasua capacidade de evidenciar a mobilização de Ca2+ emcélulas NK de sangue periférico, conforme mostrado para oscFv 50NI anti-CD16 precursor, células NK foram isoladas eenriquecidas a partir do sangue periférico e usadas paramedições do fluxo de Ca2+ através de citometria de fluxo,conforme descrito acima no Exemplo 5.
Os resultados demonstram claramente que a adição doMAb anti-(His)6, seguido pelos anticorpos IgG policlonaisanti-camundongo de cabra (GAM) sozinhos, não induz àalterações significativas na concentração de cálciointracelular em células NK recentemente isoladas. Contudo,um aumento claro no sinal de fluorescência foi observadoquando scFv 5ONI foi adicionado e ligado cruzadamente peloMAb anti-(His)6, seguido por GAM, conforme já mostrado noExemplo 5.
Quando o scFv anti-CD16 maturado por afinidade (3-LS49ou 4-LS21, usados como exemplos ilustrativos) foi aplicado,o aumento no sinal induzido após ligação cruzada pelo anti-(His)6, seguido por GAM, foi pelo menos tão forte quanto osinal disparado pelo 50NI. Assim, pode ser concluído quetodos os scFvs que são derivados do scFv 5 ONI humanoatravés de embaralhamento de cadeia retêm sua capacidade deativar células NK e disparar uma mobilização de cálciointracelular através de ligação ao CD16A.
Exemplo 14: Disparo de atividade citolítica em células NKrecentemente isoladas
CD16A está envolvido em citotoxicidade celularanticorpo-dependente (ADCC) mediada por células NK. Invitro, foi mostrado que a ativação de anticorposmonoclonais do isotipo IgG específico para CD16 podedisparar a morte de linhagens de células alvo FcR-positivas. Para determinar se o scFv anti-CD16A maturadopor afinidade, que induz à mobilização de cálcio em célulasNK, também é capaz de mediar a citotoxicidade por NK, essesscFvs foram testados em um ensaio de morte redirecionadacom células NK recentemente isoladas contra células P815FcR-positivas de murino. Uma vez que o scFv carece daporção Fc da IgG, eles foram usados junto com um anticorpomonoclonal anti-(His)6 de murino. A Iise celularredirecionada foi medida em um ensaio de liberação decalceína.
Células NK foram isoladas e enriquecidas a partir dePBMC de um doador saudável, conforme descrito acima.Análise por citometria de fluxo demonstrou que a populaçãode NK consiste de 81% de células CD16-positivas e 94% decélulas CD56-positivas; células CD3-positivas ou CD19-positivas não puderam ser detectadas em quantidadessignificativas (dados não mostrados). A linhagem de célulasP815 de murino (gentilmente fornecida pelo Dr. G.Moldenhauer, DKFZ, Heidelberg, Alemanha) foi cultivada emmeio RPMI 164 0 suplementado com soro fetal de bezerroinativado pelo calor a 10% (FCS) , 2 mM de L-glutamina, 100U/mL de penicilina G sódica, 100 μg/mL de sulfato deestreptomicina e 50 μΜ de β-mercaptoetanol. Para o ensaio,as células alvo P815 foram marcadas com Calceína AM a 10 μΜ(Molecular Probes) em meio RPMI 164 0 sem FCS durante 3 0 mina 37°C. Após lavar duas vezes com meio RPMI 1640, ascélulas P815 marcadas foram resuspensas em meio RPMI 164 0suplementado com FCS inativado pelo calor a 10%, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica, 100 μg/mL desulfato de estreptomicina, para uma densidade de 1 χ10s/mL. A partir dessa suspensão, 50 μL, correspondendo a 1χ IO4 células, foram cultivados em poços individuais de umaplaca de microtitulação de fundo redondo com 96 poços. 1 χIO5 células NK recentemente isoladas foram adicionadas em50 μL aos poços, proporcionando uma proporção de efetor-para-alvo de 10:1. Anticorpos anti-CD16 e anticorpos decontrole foram adicionados aos poços até uma concentraçãofinal de 1 μg/mL e, onde indicado, 1 μ9/πι1ι de MAb 13/45/31-2 anti-(His)6 de camundongo foi aplicado. Anticorposmonoclonais OKT3 (um MAb anti-CD3), A9 e 13/45/31-2 anti-(His)6 foram uma cortesia do Dr. G. Moldenhauer, DKFZ,Heidelberg, Alemanha. 0 anticorpo B159 anti-CD56 foiadquirido da BD Biosciences/Pharmingen (Heidelberg,Alemanha) e 195314 anti-NKp46 da R&D Systems (Wiesbaden,Alemanha). As placas foram incubadas durante 3 horas a 370Cem uma atmosfera umidifiçada com 5% de CO2. A alguns poços,Triton X 100 a 1% foi adicionado (Roth, Karlsruhe,Alemanha) para proporcionar Iise máxima de células alvo. Aliberação espontânea de calceína foi determinada através daincubação das células alvo sem células efetoras e semanticorpos. Após incubação, as placas de microtitulaçãoforam centrifugadas a 500 g durante 5 min e 100 μ!· dosobrenadante foram coletados para medir a fluorescência (F)da calceína liberada com um leitor Multilabel a 52 0 nm(Victor3, Perkin Elmer, Rodgau, Alemanha). 0 percentual deIise foi calculado de acordo com a fórmula:[f (amostra) " F (espontânea) ] / [F(máxima) ~ F (espontânea) 1 Xl00% . OS Valoresmédios e desvios padrões foram determinados a partir deamostras em triplicata e plotados na Figura 4.Conforme previsto, os MAbs OKT3 anti-CD3, B159 anti-CD56 e anti-(His)6 que foram usados como anticorpos decontrole induziram apenas à morte de base similar àquela deamostras sem qualquer anticorpo. Isso demonstra que aligação de um anticorpo a um receptor de não-ativação, talcomo CD56, não é suficiente para induzir ã citotoxicidadede células NK. Além disso, os anticorpos de controleexcluíram efeitos citotóxicos das IgGs que se ligam areceptores Fc sobre células alvo P815, mas não às moléculasefetoras sobre células NK. Em contraste, o MAb 195314(anti-NKp46) e A9 (anti-CD16), ambos objetivando a ativaçãode receptores NK, dispararam uma forte Iise dos alvos P815que estava na faixa de 35% e 65%, respectivamente. A Iisedas células alvo na presença do scFv anti-CD16 estava entre1,8% e 11,5%, indicando que o scFv sozinho não poderiaativar células NK. Contudo, a adição do MAb anti-(His)6,que facilita a ligação cruzada e a ligação às células alvoP815 FcR-positivas disparou uma forte Iise em todas asamostras. No caso do scFv 4-LS21 maturado por afinidade,quase 60% das células alvo foram submetidas à Iise. Emcomparação, o scFv 5ONI anti-CD16 parental, em combinaçãocom MAb anti-(His)6, induziu apenas a uma leveintensificação da morte redirecionada de alvos P815 porcélulas NK.Os resultados do ensaio de citotoxicidaderedirecionada com o scFv anti-CD16 maturado por afinidadedemonstram claramente que o scFv anti-CD16A não apenasevidencia a mobilização de cálcio em células NK, mas tambémdisparam a citotoxicidade de NK.
Exemplo 15: Geração de seqüências de ácido nucléico quecodificam a variante CD16A-Fc48r/158f humana e as trêsdiferentes variantes alélicas de CD16B-Fc humana
FcyRIII humano existe como duas isoformas, FcyRIIIA(proteína transmembrana) e FcyRIIIB (GPI-ancorada), quecompartilham 96% de identidade de seqüência em suas regiõesextracelulares de ligação à imunoglobulina (van de Winkel eCapei, 1993, Immunol. Today 14(5): 215-221). Para essa duasisoformas, diferentes variantes alélicas foram descritas(Koene et al. , 1997 Blood 90: 1109-1114; Koene et al., 1998Blood 91: 673-679) . A Figura 6 mostra um alinhamento dasseqüências de aminoácido das variantes alélicas dasisoformas AeB.
A proteína de fusão CD16A-Fc solúvel produzida emcélulas HEK-293 após transfecção transitória com oplasmídeo pCDM-CD16-Fc e descrita no Exemplo 1, é a CD16A-FC48R/158V Jlumana (Mandelboim et al., 1999, supra). Naposição 158 dessa isoforma, um polimorfismo bi-alélico(FcyRIII-A 158Val/Phe), ocorre em seres humanos, o qualinfluencia a afinidade do receptor FcyRIII-A de célulasassassinas naturais pela IgG. Para FcyRIII-A 158 Vai, umamaior afinidade pela IgG é descrita em comparação com aforma alélica 158 Phe (Koene et al., 1997 supra).
Para demonstrar a ligação do scFv 4-LS21 à variante dePhe, mutagênese sítio-dirigida do pCDM-CD16A-Fc48R/158v foirealizada para criar .o pCDM-CD16A-Fc48R/158F. 10 ng doplasmídeo pCDM-CD16A-Fc48R/158v foram incubados com 125 ngdos primers P41, 5' CTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTG 3' (SEQID NO 47) e P42, 51 CACATTTTTACTCCCAAAAAGCCCCCTGCAG 31 (SEQID NO 48), 25 mM de cada dNTP e 2,5 unidades da DNApolimerase PfuUltra HF (Stratagene). A reação foi realizadadurante 30 seg a 95°C, seguida por 16 ciclos com 30 seg a95°C, 60 seg a 66°C e 318 seg a 68°C. 0 produto foidigerido através da enzima de restrição DpnI durante 3horas e a reação foi cessada, finalmente, através deincubação a 80°C durante 20 min. Células TOP10/P3quimiocompetentes (Invitrogen) foram transformadas com 2 μΐda mistura de reação e 150 μΐ dispersos sobre placas LBcontendo 10 μg/ml de tetraciclina e 25 μg/ml de ampicilina.
A seqüência de ácido nucléico que codifica o pCDM-CD16A-pc48R/i58F confirmada através de seqüenciamento. CD16A-Fc48r/i58f expresso e purificado conforme descrito no
Exemplo 1.
0 receptor FcyRIIIB é expresso em seres humanos comotrês diferentes variantes alelicas designadas NAl, NA2 eSH, respectivamente (Koene et al., 1997 supra; Koene etal., 1998 supra). Três genes sintéticos que codificam odomínio extracelular humano das formas alélicas de CD16Bforam sintetizados pela Geneart (Regensburg, Alemanha). Asseqüências de ácido nucléico foram clonadas como umfragmento HindlXT/BarriHI no plasmídeo pSEC contendo aseqüência de ácido nucléico da região Fc do receptor.CD16B-Fcnai' CDl 6B-Fcna2 e CD16B-FcSH foram expressos epurificados conforme descrito no Exemplo 1.
Exemplo 16: Western-blot sobre diferentes variantesalélicas de CD16 humana
Para demonstrar a especificidade do scFv 4-LS21 pelaisoforma CD16A, análise de Western-Blot foi realizada sobreas diferentes variantes alélicas de CD16A e CD16B. 750 ngde cada de CD16A-Fc48R/158V, CD16A-Fc48R/158F, CD16B-Fcsh, CD16B-Fcnai, CDl 6B- Fcna2 e NKp46-Fc (controle negativo) foramcarregados sobre um gel de SDS a 8% sob condições de não-redução e blotted sobre uma membrana.
0 scFv A9 anti-CD16, o scFv 4-LS21 anti-CD16A e o scFvanti-NKp4 6 (controle negativo) foram incubados a 4 μg/mlcom a mancha. Detecção de scFv ligado às proteínasrecombinantes foi realizada usando um conjugado anti-His-HRP (1 μg/mL) . Como controles, conjugado HRP IgG anti-humano e conjugado anti-His-HRP (1 μg/mL) foram usados.
0 scFv 4-LS21 revelou forte ligação às formas alélicasde CD16A apenas: nenhuma ligação aos alelos de CD16B foiobservada. Isso demonstrou claramente a especificidade doscFv 4-LS21 humano pela isoforma A de CD16 e que o 4-LS21reconhecia ambas as variantes alélicas de CD16A. Emcontraste, o scFv A9 anti-CD16 de murino mostrou ligaçãouniforme a todas as variantes alélicas de CD16A e CD16B.
Exemplo 17: ELISA sobre diferentes variantes alélicas deCD16 humana
Para demonstrar ainda a especificidade do scFv 4-LS21pela isoforma CD16A, um ELISA foi realizado usando asdiferentes variantes alélicas. Poços de uma placa Maxisorp™foram revestidos com 100 mM de NaHCO3 contendo 200 ng deCD16A-Fc48R/158V, CD16A-Fc48r/158F, CD16B-Fcsh, CD16B-Fcna1,CDl6B-Fcna2 ou NKp46-Fc (controle negativo) ,respectivamente.
0 scFv 4-LS21 anti-CD16A e o scFv anti-NKp46 foramincubados com a placa em uma concentração de 4 μg/ml.Detecção de scFv ligado às proteínas recombinantes foirealizada usando um conjugado anti-His-HRP (1 ^g/ml). 0scFv 4-LS21 mostrou forte ligação a ambas as formasalélicas de CD16A, enquanto que nenhuma ligação aos alelosde CD16B foi observada (Figura 7A) , assim, demonstrandoclara especificidade do scFv 4-LS21 pela isoforma CD16A.
Em um ensaio paralelo (Figura 7B), MAb A9 anti-CD16 (1μg/ml) foi avaliado contra uma placa identicamenterevestida. A incubação do MAb A9 (1 μg/mL) foi seguida porum conjugado de HPR IgG anti-camundongo de cabra a 0,5^g/ml (reatividade cruzada mínima ao Fc humano). MAb A9 seligou fortemente a todas as variantes alélicas (CD16A eCD16B).
Exemplo 18: Comparação da afinidade do scFv 4-LS21 e do AbA9 monoclonal com diferentes formas alélicas de CD16 humanaatravés de ressonância plasmônica de superfície (SPR)
As constantes de afinidade (valores de KD) do scFv 4-LS21 e MAb A9 foram determinadas através de SPR para asvariantes alélicas CD16A-Fc48R/158V, CD16A-Fc48r/158f, CD16B-Fcsh, CD16B-Fcna1 e CD16B-Fcna2 usando o sistema de biosensorBIAcore 2000 (Amersham-Pharmacia) de acordo com o protocolodescrito no Exemplo 12. As constantes de taxa "off" e "on"e os respectivos valores de K0 são resumidos abaixo na Tabela 5.
Conforme esperado para o MAb A9 (usado como umcontrole) , uma Kd na faixa de 4-6 χ IO"9 M foi calculadapara todas as variantes alélicas, demonstrando ligaçãopromíscua do MAb A9 a todos os alelos de todas as formas.
Em contraste, o scFv 4-LS21 novamente provou ser altamenteespecífico para a isoforma CD16A. 0 scFv 4-LS21 exibiu umaKd na região de 6 χ IO-8M para CD16A-Fc48R/158V e na região deχ IO-8M para CD16A-Fc48r/158f, indicando que o scFv 4-LS21 seliga a todas as formas alélicas de CD16A com uma afinidadeaproximadamente igual. Em contraste, o 4-LS21 não exibiuligação a qualquer uma das formas alélicas de CD16B.
Tabela 5: Dados para a cinética de ligação do scFv 4-LS21 edo MAb A9 às variantes alélicas das isoformas CD16A eCD16B.
<table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table>CAGCTGGTACAGTCTGG 3' (SEQ ID NO 50), para introduzir aseqüência de ácido nucléico que codifica o ligante de 9aminoácidos (GlyGlySer)3 (SEQ ID NO 51) na extremidade 3'do produto de PCR. 0 fragmento de PCR resultante foidigerido com as enzimas de restrição Nco l/Eco RV e clonadono Nco l/Eco RV pHOG_scFv(G2s)3aCD3 0 (HRS-3) para criar oplasmídeo híbrido pHOG_VHaCD16LS21(G2s)3VLaCD3 0(G2S)3VHaCD3 0.
0 Vl do anticorpo anti-CD16A 4-LS21 foi amplificadoatravés de reação em cadeia de polimerase com os primersP35, 5' GGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTAGCGGCGGCTC CGGTGGTTCTTCCTATGTGCTGACTCAGCCATCCTC 3' (SEQ ID NO 52) e P37, 5'CCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGGGATCCTAGGACGGTCAG CTTGGTCCC3' (SEQ ID NO 53), para introduzir a seqüência de ácidonucléico que codifica o ligante de 9 aminoácidos(GlyGlySer)3 (SEQ ID NO 52) na extremidade 5' do produto dePCR. 0 fragmento de PCR resultante foi digerido com asenzimas de restrição Bsm Bi/Xba I e foi clonado noplasmídeo híbrido digerido com Bsm BI/Xba I linearizadopHOG_VHaCD16LS21(G2S)3VLaCD3 0(G2s)3VHaCD3 0, resultando noplasmídeo pHOG TandAb CD30xCD16LS21/(G2S) 3. Esse plasmídeofoi cortado por NcoI/XbaI e ligado no plasmídeo NcoI/XbaIlinearizado, pSKK3.
Exemplo 20: Construção dos plasmídeos pSKK3 TandAbCD19xCD16LS21/(G2S) 3 para expressão de moléculas de TandAb embactérias
Os genes que codificam os domínios variáveis Vh e Vldo anticorpo anti CD19 foram derivados do hibridoma HD3 7usando o plasmídeo pSKK3_scFv(G2s)3 aCD19 (HD3 7) .
0 plasmídeo pSKK3_scFv(G2s)3 aCD19 (HD3 7) foi cortadopor Nco τ/Bsm BI e o inserto foi purificado sobre um gel deagarose. 0 fragmento purificado foi, então, digerido com aenzima de restrição Eco RV. 0 fragmento digerido com EcoRV/ Bsm BI foi clonado no plasmídeo Eco RV/ Bsm BIlinearizado pHOG TandAb CD30xCD16LS21/ (G2S) 3, resultando noplasmídeo pHOG TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3. 0 plasmídeo pHOGTandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3 foi cortado por Ncol/Xba.1 eligado no plasmídeo NcoX/Xbal linearizado, pSKK3. 0plasmídeo resultante é pSKK3 TandAb CD19xCD16ALS21/ (G2S) 3 quecodifica o TandAb anti CD19 χ anti CD16A.
Exemplo 21: Expressão e purificação das moléculas de TandAbCD30xCD16ls21/ (G2S) 3 e TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3 em bactérias
Amostras de E. coli K12 cepa RV308 (Maurer et al. ,1980, J. Mol. Biol. 139: 147-161) transformadas com osplasmídeos de expressão pSKK3 TandAb CD30xCD16LS21/(G2S) 3 epSKK3 TandAb CD19xCD16LS21/(G2S) 3 foram crescidas durante anoite em meio 2xYT com 50 μg/ml de ampicilina e 100 mM deglicose (2xYTGA) a 28°C. Diluições (1:50) das culturasnoturnas em 2xYTGA foram crescidas como culturas em frascosa 28°C com agitação a 200 rpm. Quando as culturas atingiramuma OD60O de 0,8, as bactérias foram sedimentadas através decentrifugação a 9500 g durante 15 min e 20°C e resuspensasno mesmo volume de meio YTBS fresco (2xYT contendo 1 M desorbitol e 2,5 mM de betaína de glicina; Blacwell & Horgan,1991, FEBS Letters 295: 10-12) suplementado com 50 μg/ml deampicilina. IPTG foi adicionado até uma concentração finalde 0,2 mM e o crescimento foi continuado a 21°C durante 18-20 h. As células foram coletadas através de centrifugação a14000 g durante 20 min a 4°C. Para isolar as proteínasperiplásmicas solúveis, as bactérias sedimentadas foramresuspensas em 5% do volume inicial de 200 mM de Tris-HClgelado, sacarose a 20%, 1 mM de EDTA, pH 8,0. Após umaincubação de 1 hora sobre gelo com agitação ocasional, osesferoplastos foram centrifugados a 14000 g durante 60 mina 4°C, deixando o extrato periplásmico solúvel nosobrenadante e os esferoplastos bem como o materialperiplásmico insolúvel no precipitado. As fraçõesperiplásmicas foram submetidas à diálise contra tampão deiniciação (50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 50 mM deimidazol, pH 7,0) a 4°C. A solução submetida à diálisecontendo produto recombinante foi centrifugada a 14 000 gdurante 3 0 min a 4°C. Cromatografia de afinidade com metalimobilizado (IMAC) foi realizada a 40C usando uma coluna de1 ml Chelating Sepharose Fast Flow (GE HealthcareBiosciences, Freiburg, Alemanha) carregada com Cu2+ eequilibrada com 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, pH 7,0(tampão de iniciação). A amostra foi carregada passando aamostra sobre a coluna. Ela foi, então, lavada com vintevolumes de coluna de tampão de iniciação, seguido portampão de iniciação contendo 50 mM de imidazol, até que aabsorbância (280 nm) do efluente fosse mínima (cerca detrinta volumes de coluna). Material absorvido foi eluídocom 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 300 mM de imidazol, pH7,0. As frações eluídas contendo as moléculas de TandAbforam identificadas através de análise de Western-blotusando um Anticorpo Penta His™ sem BSA (Qiagen, Hilden,Alemanha), seguido por uma IgG anti-camundongo de cabramarcada com peroxidase de armorácia (Dianova, Hamburg,Alemanha).
As frações positivas foram juntadas e submetidas àtroca de tampão com 50 mM de imidazol, 50 mM de NaCl (pH6,0) ou 50 mM de MES, 50 mM de NaCl (pH 5,5) usando PD-IOpré-empacotada (GE Healthcare Biosciences, Freiburg,Alemanha) (TandAb CD30xCD16LS21/(G2S) 3 e TandAbCD19xCD16LS21/ (G2S) 3, respectivamente). A turvação da soluçãode proteína foi clarificada através de centrifugação. Apurificação final foi obtida através de cromatografia detroca iônica sobre uma coluna MonoS HR5/5 (GE HealthcareBiosciences, Freiburgf Alemanha) em 50 mM de imidazol, 50mM de NaCl (pH 6,0) ou 50 mM de MES, 50 mM de NaCl (pH 5,5)(TandAb CD30xCD16LS21/ (G2S) 3 e TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3,respectivamente), com um gradiente linear de NaCl de 0-1 M.
As frações eluídas contendo as moléculas de TandAb foramidentificadas através de SDS-PAGE de redução a 15%, seguidopor coloração com Coomassie. As frações positivas foramcoletadas e o tampão trocado por PBS contendo 50 mM deimidazol e 10 mM de trealose (pH 6,0 ou 7,0) (TandAbCD30xCD16LS21/(G2S) 3 e TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3 ,respectivamente) usando PD-IO pré-empacotada (GE HealthcareBiosciences, Freiburg, Alemanha).
Exemplo 22: Caracterização das moléculas de TandAbCD30xCD16 LS21/(G2S) 3 e TandAb CD19xCD16 LS21/ (G2S) 3 através decitometria de fluxo
Para medir a ligação ao CD16A, células HEK-293 foramtransitoriamente transfectadas usando o método com fosfatode cálcio com o plasmídeo pcDNA3-CD16A-zeta (Dr. 0.Mandelboim, University of Jerusalem, Israel) e coletadas 4 0horas depois para citometria de fluxo, conforme descrito noExemplo 7. A linhagem de células de leucemia de célulaspilosas JOK-I (Schwartζ-Albiez R, Dorken B, Monner DA,Moldenhauer G, (1991) Int Immunol 3: 623, uma cortesia doDr. G. Moldenhauer, DKFZ, Heidelberg) foi usada paradeterminar a ligação ao CD19. Para testagem da reatividadecom CD3 0, coloração foi realizada com a linhagem de célulasde Hodgkin humana L540CY (gentilmente fornecida pelo Dr. V.Diehl, University of Cologne, Alemanha; Kapp U, Wolf J, vonKalle C, Tawadros S, Rottgen A, Engert A, Fonatsch C, SteinH, Diehl V. (1992) Ann Oncol. 3 de Set; Supl 4: 21-3). Acoloração e análise de células foram realizadasessencialmente conforme descrito supra. Todos os anticorposrecombinantes foram detectados por 10 μg/mL de MAb anti-hexa His 13/45/31-2 (Dianova, Hamburg, Alemanha), seguidopor 15 μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugado aFITC (Dianova).
As análises por citrometria de fluxo demonstraramforte ligação dos anticorpos TandAb CD3 0xCD16LS21 e TandAbCD19xCD16LS21 às células expressando o antígenocorrespondente. Ambos os anticorpos TandAb se ligaram àscélulas expressando CD16A com afinidade aproximadamenteigual.
Exemplo 23: Medições de afinidade
Determinação dos valores de K0 do scFv 4-LS21 sobre asvariantes alélicas 48R/158V e 48R/158F do antígeno CD16Arevelou valores de Kd comparáveis de cerca de 5 χ IO-8M,conforme medido através de ressonância plasmônica desuperfície, indicando que ambas as variantes alélicas sãoreconhecidas com aproximadamente a mesma afinidade (vejaExemplo 12) . Essa descoberta foi confirmada com o TandAbCD30xCD16LS21 derivado de 4-LS21, o qual também mostrou seligar a ambas as variantes alélicas de CD16A com afinidadesquase idênticas. Em comparação com o scFv 4-LS21, umaperfeiçoamento na afinidade de um fator de mais de 10 foiobservado com o anticorpo TandAb em virtude da avidezaumentada.
Exemplo 24: Caracterização de moléculas de TandAbCD30xCD16ls21/ (G2S) 3 e TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3 através deensaios de citotoxicidade
Para determinar se os anticorpos TandAb CD3 0xCD16LS21 eCD19xCD16LS21 poderiam mediar a citotoxicidade celular invitro através de recrutamento de células NK às células alvoe ativação de células NK através de ligação cruzada areceptores de ativação, ensaios de citotoxicidade não-radioativos foram realizados essencialmente conformedescrito por T. Dreier et ai. (2002, Int J Câncer 100: 690-697) . Células NK que foram usadas como células efetorasforam enriquecidas a partir do PBMC conforme descritopreviamente. A pureza e expressão de antígeno das célulasNK enriquecidas foram verificadas através de citometria defluxo em cada caso (dados não mostrados).
Células alvo L540CY CD30+ ou JOK-I CD19+ ou célulasalvo de Raji foram cultivadas em meio RPMI 164 0suplementado com FCS a 10%, 2 mM de L-glutamina, 100 IU/mLde penicilina G sódica e 100 μg/mL de sulfato deestreptomicina (aqui referido como meio RPMI; todos oscomponentes da Invitrogen) . Para o ensaio decitotoxicidade, as células foram marcadas com calceína AM a10 μΜ (Molecular Probes/Invitrogen) durante 3 0 min em meioRPMI a 37°C. Após ligeira lavagem, as células marcadasforam resuspensas em meio RPMI para uma densidade de 1 χ105/mL. 1 χ IO4 células alvo foram, então, cultivadas juntocom 1 χ IO5 células NK enriquecidas com o TandAbCD30xCD16LS21 ou o TandAb CD19xCD16ALS21 em poços individuaisde uma placa de microtitulação com 96 poços de fundoredondo em um volume total de 2 00 μL/poço. Apóscentrifugação durante 2 min a 200 g, o ensaio foi incubadodurante 3 horas a 370C em uma atmosfera umidifiçada com 5%de CO2. 15 minutos antes do final da incubação, 20 μ!· deTriton X-100 a 10% em meio RPMI foram adicionados aos poçoscontendo apenas as células alvo. 20 μΐϋ de meio RPMI foramadicionados a todos os outros poços. 100 μΐϋ de sobrenadanteda cultura celular foram coletados de cada poço após umacentrifugação adicional durante 5 min a 500 g e afluorescência da calceina liberada foi medida a 52 0 nmusando um leitor de placa de fluorescência (Victor 3,Perkin Elmer) . Com base nas contagens medidas, a Iisecelular especifica foi calculada de acordo com a seguintefórmula: [fluorescência (amostra) - fluorescência(espontânea)]/[fluorescência (máxima) - fluorescência(espontânea)] χ 100%. A fluorescência (espontânea)representa as contagens de fluorescência das células alvona ausência de células efetoras e anticorpos e afluorescência (máxima) representa a Iise celular totalinduzida pela adição de Triton X-100. Curvas sigmoidais dedose-resposta foram plotadas usando o software Prism(GraphPad Software); veja Figura 8.
Os resultados demonstram a Iise específica de célulasalvo por células NK ativadas por TandAb. Em contraste,TandAb CD19xCD16LS21 não media a Iise de células alvo CD19-L540CY e vice-versa, o TandAb CD3 0xCD16LS21 não ativacélulas NK para matar células CD30" JOK-I. Na ausência decélulas NK, nem o TandAb CD3 OxCDl 6LS21, nem o TandAbCD19xCD16LS21, mostraram qualquer atividade citotóxicacontra as células alvo.

Claims (52)

1. Molécula de ligação tendo especificidade por pelomenos um antigeno caracterizada pelo fato de o pelo menosum antigeno ser FcyRIIIA e a molécula de ligação não seligar especificamente ao FcyRIIIB.
2. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de a especificidade peloFcyRIIIA ser proporcionada por um anticorpo ou fragmento deligação a antigeno do mesmo.
3. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-2, caracterizada pelo fato de a especificidade peloFcyRIIIA ser proporcionada pelo fragmento de ligação aantigeno.
4. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-3, caracterizada pelo fato de o fragmento de ligação aantigeno ser selecionado do grupo consistindo de uma cadeialeve de imunoglobulina, uma cadeia pesada deimunoglobulina, um domínio Vh , um domínio Vl , Fv, Fab, di-Fab, Fab', F(ab')2/ scFv e uma CDR.
5. Molécula de ligação, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de oanticorpo ou fragmento de ligação a antigeno compreenderpelo menos uma CDR humana.
6. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-5, caracterizada pelo fato de a CDR ter uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs-20, 23, 26, 29, 33, 34, 21, 24, 27, 30, 31, 35, 22, 25, 28,-32, 17, 18 e 19.
7. Molécula de ligação, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 6, caracterizada pelo fato de oanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendertrês CDRs de cadeia leve humana.
8. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-7, caracterizado pelo fato de a seqüência da CDRl de cadeialeve humana ser selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs 20, 23, 26, 29, 33 e 34, a seqüência de CDR2 de cadeialeve humana ser selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs 21, 24, 27, 30, 31 e 35 e a seqüência da CDR3 de cadeialeve humana ser selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs 22, 25, 28 e 32.
9. Molécula de ligação, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 8, caracterizada pelo fato de oanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendertrês CDRs de cadeia pesada humana.
10. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-9, caracterizada pelo fato de a seqüência da CDRl de cadeiapesada humana ser SEQ ID NO 17, a seqüência da CDR2 decadeia pesada humana ser SEQ ID NO 18 e a seqüência da CDR3de cadeia pesada humana ser SEQ ID NO 19.
11. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações 2 a 8, caracterizada pelo fato de oanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreenderuma região variável de cadeia leve humana.
12. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de a região variável de cadeialeve humana ter uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs 10-16.
13. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações 2 a 12, caracterizada pelo fato de oanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreenderuma região variável de cadeia pesada humana.
14. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de a região variável de cadeiapesada humana ter a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO 9.
15. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações 2 a 14, caracterizada pelo fato de oanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ser totalmentehumano.
16. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato deser capaz de ativação de células humanas expressandoFcyRI I ΙΑ.
17. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-16 caracterizada pelo fato de ser capaz de induzir à mortecelular mediada por células NK.
18. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-15 caracterizada pelo fato de inibir a ativação de célulashumanas expressando FcyRIIIA.
19. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato dea referida molécula de ligação ter especificidade por pelomenos um antigeno adicional.
20. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-19 caracterizada pelo fato de o pelo menos um antigenoadicional ser um antigeno na superfície celular.
21. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-20, caracterizada pelo fato de o antigeno na superfíciecelular ser selecionado do grupo consistindo de CD19, CD20,CD3 0, o Precursor do Receptor de Laminina, EGFRl, EGFR2,EGFR3, Ep-CAM, PLAP, antigeno de Thomsen-Friedenreich, MUC--1, IL4-R alfa, IL13-R, IGFR, FcyRI e CD5.
22. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-20 ou 21, caracterizada pelo fato de o antigeno nasuperfície celular ser CD19 ou CD30.CDl9 or CD30.
23. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de o pelomenos um antígeno adicional ser de um agente infeccioso.
24. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de o agente infeccioso ser umvírus, uma bactéria, um fungo, um micoplasma, um parasitaou um prion.
25. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações 19 a 24, caracterizada pelo fato de aespecificidade pelo antígeno adicional ser proporcionadapor um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno domesmo.
26. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de o anticorpo ser selecionadodo grupo consistindo de um anticorpo quimérico, umanticorpo CRD-enxertado, um anticorpo humanizado e umanticorpo totalmente humanizado.
27. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 25 ou a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de aespecificidade por o pelo menos um antígeno adicional serproporcionadas pelo fragmento de ligação a antígeno.
28. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de o fragmento de ligação aantígeno ser selecionado do grupo consistindo de uma cadeialeve de imunoglobulina, uma cadeia pesada deimunoglobulina, um domínio VH, um domínio VL, Fv, Fab, di-Fab, Fab', F(ab')2, scFv e uma CDR.
29. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com areivindicação 27 ou a reivindicação 28, caracterizada pelofato de a molécula de ligação ser um diacorpo ou um TandAb.
30. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato dea referida molécula de ligação ainda compreender um domíniofuncional.
31. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação-30, caracterizada pelo fato de o domínio funcional serselecionado do seguinte: um domínio Fc de anticorpo, umaenzima para uso na terapia de pró-fármaco com enzimaanticorpo-dependente, um peptídeo capaz de ligação areceptores Fc, uma proteína ou peptídeo para aumento dameia-vida no soro da molécula de ligação.
32. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato dea referida molécula de ligação ser capaz de ligação àvariante alélica FcyRIIIA158F com aproximadamente a mesmaafinidade com a qual ela se liga à variante alélicaFcyRI 11 A158v.
33. Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato dea molécula de ligação ser conjugada a uma molécula derotulação ou uma toxina.
34. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de a molécula de rotulação serum radio-rótulo, um rótulo fluorescente ou um rótuloluminescente.
35. Composição caracterizada pelo fato de compreenderuma Molécula de ligação, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, e pelo menos um componenteadicional.
36. Composição, de acordo com a reivindicação 35,caracterizada pelo fato de compreender um veiculo,excipiente, diluente e/ou estabilizante farmacêutico.
37. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato decodificar uma Molécula de ligação, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 34.
38. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento deligação a antígeno tendo especificidade pelo FcyRIIIAcompreender:a) uma região variável de cadeia leve humanacodificada por uma seqüência de ácido nucleico selecionadado grupo consistindo de SEQ ID NOs 2-8 e/ou;b) uma região variável de cadeia pesada humanacodificada pela seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO 1.
39. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 37ou a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de oreferido polinucleotídeo codificar: uma primeira regiãovariável de cadeia leve codificada por uma seqüência deácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs 2-8, uma primeira região variável de cadeia pesadacodificada por uma seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO-1, uma segunda região variável de cadeia leve e uma segundaregião variável de cadeia pesada, em que as referidassegundas regiões variáveis de cadeia leve e pesada teremafinidades pelo CD19.
40. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 37ou a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de oreferido polinucleotídeo codificar: uma primeira regiãovariável de cadeia leve codificada por uma seqüência deácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs 2-8, uma primeira região variável de cadeia pesadacodificada por uma seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO-1, uma segunda região variável de cadeia leve e uma segundaregião variável de cadeia pesada, em que as referidassegundas regiões variáveis de cadeia leve e pesada teremafinidades pelo CD30.
41. Vetor caracterizado pelo fato de compreender umpolinucleotídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37 a 4 0 operavelmente ligado a uma regiãopromotora e opcionalmente uma região de término detranscrição.
42. Vetor, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de o polinucleotídeo seroperavelmente ligado a uma região promotora e a umaseqüência sinalizadora.
43. Célula hospedeira caracterizada pelo fato decompreender um polinucleotídeo de acordo com qualquer umadas reivindicações 37 a 40 ou um vetor de acordo com areivindicação 41 ou a reivindicação 42.
44. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de a referida célula hospedeiraser selecionada do grupo consistindo de uma célulabacteriana, uma célula fúngica, uma célula de inseto, umacélula de mamífero ou uma célula de planta.
45. Método para a produção de uma molécula de ligaçãode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34caracterizado pelo fato de compreender introdução, em umacélula hospedeira, de um polinucleotídeo de acordo comqualquer uma das reivindicações 37 a 40 ou um vetor deacordo com a reivindicação 41 ou a reivindicação 42 ecultura da célula hospedeira sob condições pelas quais amolécula de ligação é expressa.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45,caracterizado pelo fato de ainda compreender o isolamento eopcionalmente ainda purificação da molécula de ligação.
47. Método para a produção de uma molécula de ligaçãode acordo com a reivindicação 33 caracterizado pelo fato decompreender:(a) introdução, em uma célula hospedeira, de umpolinucleotídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 3 7 a 40 ou um vetor de acordo com areivindicação 41 ou a reivindicação 42,(b) cultura da célula hospedeira sob condições pelasquais uma Molécula de ligação, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 32 é expressa,(b) isolamento da molécula de ligação expressa naetapa (b) e(c) conjugação da molécula de ligação isolada da etapa(b) com um rótulo ou uma toxina.
48. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 34 ou uma composição de acordo com areivindicação 35 ou a reivindicação 36 caracterizada pelofato de ser para uso no diagnóstico ou tratamento de umadoença autoimune, doença inflamatória, doença infecciosa,alergia ou câncer.
49. Molécula de ligação ou composição de acordo com areivindicação 48 caracterizada pelo fato de o câncer serselecionado do grupo consistindo de linfoma não-Hodgkin,leucemia linfocítica crônica, doença de Hodgkin, tumorsólido, doença residual mínima e tumor metastático.
50. Uso de uma molécula de ligação de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 34 ou uma composição deacordo com a reivindicação 35 ou a reivindicação 36caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de linfoma não-Hodgkin,leucemia linfocítica crônica, doença de Hodgkin, tumorsólido, doença residual mínima e tumor metastático.
51. Uso de uma molécula de ligação de acordo com areivindicação 33 ou a reivindicação 34 caracterizado pelofato de ser como reagente para: coloração de célulasexpressando FcyRIIIA, análise de perfis de células depacientes ex-vivo ou isolamento de células NK para terapiaex-vivo.
52. Kit caracterizado pelo fato de compreender umaMolécula de ligação, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 34 e meios para detecção da molécula deligação quando ligada ao FcyRIIIA.
BRPI0611194-7A 2005-05-26 2006-05-26 Moléculas de ligação anti-cd16 BRPI0611194B1 (pt)

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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 26/05/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.