BRPI0612384B1 - Método para controlar ervas daninhas na vizinhança de planta de girassol, molécula isolada de polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor de transformação, e, polipeptídeo isolado - Google Patents

Abstract

planta de girassol, semente de planta de girassol, métodos para controlar ervas daninhas na vizinhança de planta de girassol, para aumentar atividade de ahas em uma planta, para produzir uma planta resistente a herbicida, para estimular tolerância a herbicida em uma planta tolerante a herbicida, para selecionar por uma célula vegetal transformada, para aumentar a resistência a herbicida de uma planta e para combater vegetação indesejada, molécula isolada de polinucleotídeo, cas sete de expressão, célula hospedeira não humana, vetor de transformação, planta transformada, semente transformada da planta transformada, célula vegetal transformada, polipeptídeo isolado, e, planta resistente a herbicida. plantas de girassol resistentes a herbicida, polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (ahasl) resistentes a herbicida e tipo selvagem, e as seqúéneias de aminoácidos destes polipeptídeos, são descritas. cassetes de expressão e vetores de transformação compreendendo os polinucleotídeos da invenção, assim como plantas e células hospedeiras transformadas com os polinucleotídeos, são descritas. métodos de usar os polinucleotídeos para estimular a resistência de plantas a herbicidas, e métodos para controlar ervas daninhas na vizinhança de plantas resistentes a herbicida também são descritos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere ao campo de biotecnologia agrícola, particularmente a plantas de girassol resistentes a herbicida e novas seqüências de polinucleotídeos que codificam proteínas de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase tipo selvagem e resistentes a herbicida.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS), é a primeira enzima que catalisa a síntese bioquímica dos aminoácidos de cadeia ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine, " in Plant Amino Acid, Singh, B,K., ed., Marcel Dekker Inc.New York, New York, pp.227-247).AHAS é o sítio de ação de cinco famílias estruturalmente diversas de herbicida incluindo as sulfoniluréias (Tan et al.(2005) Pest Manag.Sci.61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626; LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol.2:158-161), as imidazolinonas (Shaner et al.(1984) Plant Physiol, 76:545546), as triazolopirimidinas (Subramanian and Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines," in Biocatalysis in Agricultural 5 Biotechnology, Whitaker, J.R.and Sonnet, P.E..eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp.277-288), os pirimidiniloxibenzoatos (Subramanian et al.(1990) Plant Physiol.94: 239244) e as sulfonilamino-carboniltriazolinonas (Tan et al.(2005) Pest Manag.Sci.61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology’ 10 17:620-626).

Herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia são amplamente usados em agricultura moderna devido a sua efetividade em taxas de aplicação muito baixas e relativa não toxicidade em animais.

Inibindo atividade de AHAS, estas famílias de herbicidas previnem crescimento adicional e desenvolvimento de plantas susceptíveis incluindo muitas espécies 15 de ervas daninhas.

Diversos exemplos de herbicidas de imidazolinona disponíveis comercialmente são PURSUIT@ (imazetapir), SCEPTER® (imazaquin) e ARSENAL® (imazapir).

Exemplos de herbicidas de sulfoniluréia são clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, ) clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, 20 nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil e halosulfuron.

Devido a sua alta efetividade e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são favorecidos para aplicação pulverizando sobre o topo de 25 uma ampla área de vegetação.

A capacidade de pulverizar um herbicida sobre o topo de uma ampla extensão de vegetação diminui os custos associados com estabelecimento e manutenção de plantação, e diminui a necessidade de preparação de sítio antes de uso de tais químicos.

Pulverizar sobre o topo de uma espécie tolerante desejada também resulta na capacidade de atingir potencial de rendimento máximo da espécie desejada devido à ausência de espécies competitivas.

Entretanto, a capacidade de usar tais técnicas de pulverização é dependente da presença de espécies resistentes a imidazolinona da vegetação desejada na área de pulverização.

Dentre os principais cultivos agrícolas, algumas espécies de leguminosas tal como soja são naturalmente resistentes a herbicidas de imidazolinona devido a sua capacidade de metabolizar rapidamente os compostos de herbicida (Shaner and Robinson (1985) Weed Sei.33:469-471).

Outros cultivos tal como milho (Newhouse et al.(1992) Plant Physiol.10 100:882-886) e arroz (Barrett et al.(1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, pp.195-220) são de alguma maneira susceptíveis a herbicidas de imidazolinona.

A sensibilidade diferencial para os herbicidas de imidazolinona é dependente da natureza química do herbicida particular e metabolismo diferencial do composto de uma forma tóxica para uma não tóxica em cada planta (Shaner et al.(1984) Plant Physiol.76:545-546; Brown et al., (1987) Pestic.Biochem.Physiol.27:24-29).

Outras diferenças fisiológicas de planta tal como absorção e translocação também desempenham um papel importante em sensibilidade (Shaner and Robinson I (1985) Weed Sci.33:469-471).

Plantas resistentes a imidazolinonas, sulfoniluréias, triazolopirimidinas, e pirimidiniloxibenzoatos foram produzidas com sucesso usando mutagênese de semente, micrósporo, pólen, e calo em Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (i.e., canola) Glycine max, Nicotiana tabacum.beterraba açucareira (Beta vulgaris) e Oryza sativa (Sebastian et al.25 (1989) Crop Sci.29:1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor.Appl.Genet.78:525-530; Newhouse et al.(1991) Theor.Appl.Genet.83:65-70; Sathasivan et al.(1991) Plant Physiol.97:1044-1050; Mourand et al.(1993) J.Heredity’ 84:91-96; Wright and Penner (1998) Theor.Appl.Genet.96:612620; Patente Norte-Americana No.5.545.822).

Em todos os casos, um único, gene nuclear parcialmente dominante conferiu resistência.

Quatro plantas de trigo resistentes a imidazolinona também foram previamente isoladas seguindo mutagênese de semente de Triticum aestivunz L.cv.Fidel (Newhouse et al.(1992) Plant Plzysiol.100:882-886).

Estudos de herança 5 confirmaram que um único, gene parcialmente dominante conferiu resistência.

Baseado em estudos alélicos, os autores concluíram que as mutações nas quatro linhagens identificadas foram localizadas no mesmo locus.

Um dos genes de resistência de cultivar Fidel foi designado FS-4 (Newhouse et al.(1992) Plant Physiol.100:882-886).

Populações naturalmente ocorrentes de plantas que foram descobertas serem resistentes a herbicidas de imidazolinona e/ou sulfoniluréia também foram usadas para desenvolver linhagens de girassol resistentes a herbicida.

Recentemente, duas linhagens de girassol que sào resistentes a um herbicida de sulfoniluréia foram desenvolvidas usando germoplasma se originando de uma população selvagem de girassol comum (Helianthus annuus) como a fonte da característica de resistência a herbicida (Miller and Al-Khatib (2004) Crop Sci.44:1037-1038).Previamente, White et al.((2002) Weed Sci.50:432-437) relataram que indivíduos de uma população selvage ) de girassol comum de South Dakota, U.S.A, tiveram resistência cruzada para um herbicida de imidazolinona e um de sulfoniluréia.

Análise de uma porção da região de codificação dos genes de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (AHASL) de indivíduos desta população revelou uma mutação pontual que resulta em uma substituição de aminoácido de Ala para Vai na proteína AHASL de girassol que corresponde a Ala2os na proteína AHASL de Arabidopsis thaliana tipo selvagem (White et al.(2003) Weed Sci.51:845-853).Anteriormente, Al-Khatib and Miller ((2000) Crop Sci.40:869) relataram a produção de quatro linhagens de girassol resistentes a imidazolinona.

Modelagem baseada em computador da conformação tridimensional do complexo AHAS-inibidor prediz diversos aminoácidos na área de ligação de inibidor proposta como sítios onde mutações induzidas iriam provavelmente conferir resistência seletiva para imidazolinonas (Ott et al.(1996) J.Mol.Biol.263:359-368).

Plantas de tabaco produzidas com 5 algumas destas mutações projetadas racionalmente nos sítios de ligação propostos da enzima AHAS exibiram de fato resistência específica para uma única classe de herbicidas (Ott et al.(1996) J.Mol.Biol.263:359-368).

Resistência vegetal a herbicidas de imidazolinona também foi relatada em diversas patentes.Patente Norte-Americana Nos.4.761.373, 10 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 e 6.222.100 geralmente descrevem o uso de um gene de AHAS alterado para obter resistência a herbicida em plantas, e especificamente descrevem certas linhagens de milho resistentes a imidazolinona.

Patente Norte-Americana No.5.013.659 descreve plantas exibindo resistência a herbicida devido a mutações em pelo menos um 15 aminoácido em uma ou mais regiões conservadas.

As mutações descritas nessa codificam ou resistência cruzada para imidazolinonas e sulfoniluréias ou resistência específica para sulfoniluréia, mas resistência específica para imidazolinona não é descrita.

Patente Norte-Americana No.5.731.180 e i* Patente Norte-Americana No.5.767.361 discutem um gene isolado tendo uma 20 única substituição de aminoácido em uma seqüência de aminoácidos de AHAS de monocotiledônea tipo selvagem que resulta em resistência específica para imidazolinona.

Em adição, plantas de arroz que são resistentes a herbicidas que interferem com AHAS foram desenvolvidas por criação de mutação e também pela seleção de plantas resistentes a herbicida a partir de 25 um conjunto de plantas de arroz produzidas por outra cultura.

Veja, Patente Norte-Americana Nos.5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796.

Em plantas, como em todos os outros organismos examinados, a enzima AHAS é compreendida de duas subunidades: uma subunidade grande (papel catalítico) e uma subunidade pequena (papel regulador) (Duggleby and Pang (2000) J.Biochem.Mol.Biol.33:1-36).

A subunidade grande de AHAS (também referida neste lugar como AHASL) pode ser codificada por um único gene como no caso de Arabidopsis e arroz ou por 5 múltiplos membros de família de gene como em milho, canola, e algodão.

• Substituições específicas de único nucleotídeo na subunidade grande • conferem na enzima um grau de insensibilidade para uma ou mais classes de herbicidas (Chang and Duggleby (1998) Biochenz J.333:765-777).

Por exemplo, trigo, Triticum aestivum L., contém três genes ^M0 homólogos de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase.

Cada um dos , genes exibe expressão significante baseada em resposta de herbicida e dados , bioquímicos de mutantes em cada um dos três genes (Ascenzi et al.(2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref.No.SI0-17).

As seqüências de codificação de todos os três genes 15 compartilham extensiva homologia no nível de nucleotídeo (WO 03/014357).

Através de seqiienciamento dos genes de AHASL de diversas variedades de Triticum aestivum, a base molecular de tolerância a herbicida nas linhagens mais IMl-tolerantes (imidazolinona-tolerantes) foi encontrada ser a mutação S653(At)N, indicando uma substituição de serina para asparagina em uma 20 posição equivalente a serina em aminoácido 653 em Arabidopsis thaliana (WO 03/01436; WO 03/014357).

Esta mutação é devida a um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP) na seqüência de DNA codificando a proteína AHASL.

Múltiplos genes de AHASL também são conhecidos por 25 ocorrerem em espécies de plantas dicotiledôneas.

Recentemente, Kolkman et al.((2004) Theor.AppL Genet.109: 1147-1159) relataram a identificação, clonagem, e seqiienciamento para três genes de AHASL (AHASL 1, AHASL2, e AHASL3) de genótipos resistentes a herbicida e tipo selvagem de girassol (Helianthus annuus L.).Kolkman et al.relataram que a resistência a herbicida foi devido ou à substituição Prol97Leu (usando a nomenclatura de posição de aminoácido AHASL de Arabidopsis) ou à substituição Ala205Val na proteína AHASL 1 e que cada uma destas substituições forneceu resistência tanto para herbicidas de imidazolinona como de sulfoniluréia.

Dado sua alta efetividade e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são favorecidos para uso agrícola.

Entretanto, a capacidade de usar herbicidas de imidazolinona em um sistema de produção de safra particular depende da disponibilidade de variedades resistentes a imidazolinona da planta cultivada de interesse.

Para produzir tais variedades 10 resistentes a imidazolinona, melhoristas de plantas necessitam desenvolver linhagens com a característica de resistência a imidazolinona.

Assim, linhagens resistentes a imidazolinona adicionais e variedades de plantas cultivadas, assim como métodos e composições para a produção e uso de linhagens e variedades resistentes a imidazolinona, são necessários.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece plantas de girassol tendo resistência aumentada para herbicidas quando comparadas com uma planta de girassol tipo selvagem.

Em particular, as plantas de girassol da invenção têm resistência aumentada para herbicidas de imidazolinona, quando comparadas 20 com uma planta de girassol tipo selvagem.

As plantas de girassol resistentes a herbicida da invenção compreendem pelo menos uma cópia de um gene ou polinucleotídeo que codifica uma subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (AHASL) resistente a herbicida.

Uma tal proteína AHASL resistente a herbicida compreende uma treonina em posição de aminoácido 107 ou 25 posição equivalente.

Uma planta de girassol resistente a herbicida da invenção pode conter uma, duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais cópias de um gene ou polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção.

As plantas de girassol da invenção também incluem sementes e plantas de progénie que compreendem pelo menos uma cópia de um gene ou polinucleotideo codificando uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção.

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece plantas de girassol resistentes a herbicida de uma linhagem de girassol que é 5 designada neste lugar como S4897 e progénie e derivados desta que compreendem as características de resistência a herbicida de S4897.

Uma linhagem genética designada neste lugar como GM40 foi derivada de, e possui as características de resistência a herbicida de S4897.

Uma amostra de sementes da linhagem GM40 foi depositada com a American Type Culture 10 Collection (ATCC) como No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716.

Assim, uma planta de girassol da invenção que compreende as características de resistência a herbicida de GM40 ou uma planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716 também compreende as características de resistência a herbicida de S4897.

Plantas de girassol S4897, 1 5 plantas de girassol GM40, e plantas de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716 e progénie e derivados desta compreendendo as características de resistência a herbicida de 54897, GM40, ou uma planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716, compreendem em seus genomas um gene de AHASLI que compreende a 20 seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1 e que codifica a proteína AHASLI compreendendo, a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2.

Quando comparadas com a seqüência de aminoácidos da proteína AHASLI (SEQ ID NO: 4) que é codificada por um gene de AHASLI (SEQ ID NO: 3) de uma planta de girassol tipo selvagem, a seqüência de 25 aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 tem uma única diferença de aminoácido da seqüência de aminoácidos tipo selvagem.

Na seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, existe treonina em posição de aminoácido 7.

Esta posição corresponde à posição 107 na proteína AHASL 1 de girassol de comprimento completo codificada pela seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 12 (No.de Acesso AY541451).

Na seqüência de aminoácidos de AHASL 1 tipo selvagem da invenção (SEQ ID NO: 4), esta posição de aminoácido equivalente tem uma alanina.

A menos que de outra maneira indicado, as posições de aminoácidos referidas neste 5 lugar para proteínas AHASL de girassol correspondem às posições de aminoácidos da seqüência de aminoácidos de comprimento completo apresentada em SEQ ID NO: 12.

Em outra forma de realização, a presente invenção fornece plantas de girassol resistentes a herbicida que são de linhagem de girassol que 10 é designada neste lugar como GM 1606.

Uma amostra de sementes de material genético de GM1606 foi depositada com a ATCC como No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606.

Assim, a presente invenção fornece plantas de girassol resistentes a herbicida que têm No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606 e progénie e derivados desta que compreendem as características 15 de resistência a herbicida das plantas de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606.

Como as plantas de girassol S4897 e GM40, GM1606 e progénie e derivados desta compreendendo as características de resistência a herbicida de GM1606 compreendem em seus genomas um gene de AHASL! que codifica uma proteína AHASLI compreendendo uma treonina 20 em posição 107 na proteína AHASL 1 de girassol de comprimento completo.

Similarmente, plantas de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606, e progénie e derivados desta compreendendo as características de resistência a herbicida das plantas de girassol tendo No.

de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606 compreendem em seus genomas um gene de 25 AHASL! que codifica uma proteína AHASLI compreendendo uma treonina em posição 107 na proteína AHASLI de girassol de comprimento completo.

A presente invenção fornece adicionalmente polinucleotídeos isolados e polipeptídeos isolados para proteínas AHASL de girassol (Helianthus annuus).

Os polinucleotídeos da invenção abrangem seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas AHASL resistentes a herbicida e tipo selvagem, incluindo, mas não limitado a, as proteínas codificadas pelos genes AHASL1, AHASL2, e AHASL3 de girassol.

As proteínas AHASL resistentes a herbicida de girassol da invenção são proteínas AHASL resistentes a 5 imidazolinona que compreendem um outro aminoácido do que alanina em posição 107 de uma proteína AHASL 1 de girassol de comprimento completo ou posição equivalente.

Preferivelmente, o aminoácido em posição 107 ou posição equivalente é uma treonina.

Os polinucleotídeos da invenção abrangem as seqüências de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NOS: 1 e 3, 10 seqüências de nucleotídeos codificando as seqüências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOS: 2 e 4, e fragmentos e variantes de ditas seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas compreendendo atividade de AHAS.

A presente invenção fornece cassetes de expressão para 15 expressar os polinucleotídeos da invenção em plantas, células vegetais, e outras células hospedeiras não humanas.

Os cassetes de expressão compreendem um promotor exprimível na planta, célula vegetal, ou outras células hospedeiras de interesse operavelmente ligadas a um polinucleotídeo ’ da invenção que codifica ou uma proteína AHASL tipo selvagem ou 20 resistente a herbicida.

Se necessário para direcionar expressão para o cloroplasto, o cassete de expressão também pode compreender uma seqüência tendo como alvo cloroplasto operavelmente ligada que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar uma proteína AHASL expressa para o cloroplasto.

Os cassetes de expressão da invenção encontram uso em um 25 método para estimular a tolerância a herbicida de uma planta e uma célula hospedeira.

O método envolve transformar a planta ou célula hospedeira com um cassete de expressão da invenção, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende um promotor que é exprimível na planta ou célula hospedeira de interesse e o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção.

O método compreende adicionalmente regenerar uma planta transformada a partir da célula vegetal transformada.

A presente invenção fornece um método para aumentar 5 atividade de AHAS em uma planta compreendendo transformar uma célula vegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que dirige expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir da célula vegetal transformada.

A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir 10 daquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL resistentes a herbicida ou tipo selvagem da invenção, particularmente as seqüências de nucleotídeos apresentadas em SEQ ID NOS: 1 e 3, e seqüências de nucleotídeos codificando as seqüências de aminoácidos apresentadas em SEQ 1D NOS: 2, e 4, e fragmentos e variantes destas.

Uma planta produzida 15 por este método compreende atividade de AHAS aumentada ou atividade de AHAS resistente a herbicida aumentada, quando comparada a uma planta não transformada.

A presente invenção fornece um método para produzir uma planta resistente a herbicida compreendendo transformar uma célula vegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que dirige expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célula vegetal transformada.

A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir daquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL resistentes a herbicida da invenção, particularmente a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, a seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, e fragmentos e variantes destas.

Uma planta resistente a herbicida produzida por este método compreende resistência aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona, quando comparada a uma planta nào transformada.

A presente invenção fornece um método para estimular tolerância a herbicida em uma planta tolerante a herbicida.

O método encontra 5 uso para estimular a resistência de uma planta que já é resistente para um nível de um herbicida que mataria ou lesionaria significantemente uma planta tipo selvagem.

Uma tal planta tolerante a herbicida pode ser uma planta tolerante a herbicida que foi geneticamente modificada para tolerância a herbicida ou uma planta tolerante a herbicida que foi desenvolvida por meios 10 que não envolvem DNA recombinante tal como, por exemplo, as plantas de girassol S4897, GM40, e GM1606 da presente invenção.

O método compreende transformar uma planta tolerante a herbicida com um construto de polinucleotideo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que dirige expressão em uma célula 15 vegetal e regenerar uma planta transformada a partir da célula vegetal transformada.

A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir daquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL resistentes a herbicida da invenção, particularmente uma seqüência de nucleotídeos > compreendendo a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, 20 seqüências de nucleotídeos codificando uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, e fragmentos e variantes destas.

A presente invenção fornece vetores de transformação compreendendo um gene marcador selecionável da invenção.

O gene 25 marcador selecionável compreende um promotor que dirige expressão em uma célula hospedeira operavelmente ligada a um polinucleotideo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção.

O vetor de transformação pode adicionalmente compreender um gene de interesse a ser expresso na célula hospedeira e também pode, se desejado, incluir uma seqüência tendo como alvo cloroplasto que é operavelmente ligada ao polinucleotídeo da invenção.

A presente invenção fornece adicionalmente métodos para usar os vetores de transformação da invenção para selecionar por células transformadas com o gene de interesse.

Tais métodos envolvem a transformação de uma célula hospedeira com o vetor de transformação, expondo a célula a um nível de um herbicida de imidazolinona que mataria ou inibiria o crescimento de uma célula hospedeira não transformada, e identificar a célula hospedeira transformada por sua capacidade de crescer na presença do herbicida.

Em uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira é uma célula vegetal e o gene marcador selecionável compreende um promotor que dirige expressão em uma célula vegetal.

A presente invenção fornece um método para controlar ervas daninhas na vizinhança das plantas resistentes a herbicida da invenção, incluindo as plantas de girassol resistentes a herbicida descritas acima e plantas transformadas com os polinucleotídeos AHASL resistentes a herbicida da invenção.

Tais plantas transformadas compreendem em seus genomas pelo menos um cassete de expressão compreendendo um promotor que dirige expressão gênica em uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo AHASL da invenção.

O método compreende aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida às ervas daninhas e à planta resistente a herbicida, caracterizado pelo fato de que a planta resistente a herbicida tem resistência aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona, quando comparada com uma planta tipo selvagem ou não transformada.

As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ou não transgênicas.

Um exemplo de uma planta de girassol não transgênica tendo resistência aumentada para herbicidas de imidazolinona e/ou sulfoniluréia inclui plantas de girassol 54897, GM40, ou GM1606 e plantas de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716 ou PTA- 7606; ou mutante, recombinante, ou um derivado geneticamente modificado de 54897, GM40, ou GM 1606, a planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716 ou PTA-7606, ou duas de mais de S4897, 5 GM40, GM 1606, a planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716, e a planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606; ou de qualquer progénie de 54897, GM40, ou GM 1606, a planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716 ou PTA-7606, ou duas de mais de S4897, GM40, GM 1606, a planta de girassol 10 tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716, e a planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606; ou uma planta que é uma progénie de qualquer destas plantas; ou uma planta que compreende as características de resistência a herbicida de S4897, GM40, GM1606, a planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-6716, e/ou a 15 planta de girassol tendo No.de Depósito de Patente de ATCC PTA-7606.

A presente invenção também fornece plantas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas que são transformadas com o pelo menos um polinucleotídeo, ' cassete de expressão, ou vetor de transformação da invenção.

Tais plantas 20 transformadas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas têm tolerância ou resistência aumentada para pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matam ou inibem o crescimento de uma planta não transformada, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira não humana, respectivamente.

Preferivelmente, as 25 plantas transformadas, tecidos vegetais, células vegetais, e sementes da invenção são Arabidopsis thaliana, girassol, e outras plantas cultiváveis.

A presente invenção fornece adicionalmente polipeptídeos isolados compreendendo proteínas AHASL de girassol resistentes a imidazolinona e tipo selvagem.

Os polipeptídeos isolados compreendem as seqüências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOS: 2 e 4, as seqüências de aminoácidos codificadas por seqüências de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NOS: 1 e 3, e fragmentos e variantes de ditas seqüências de aminoácidos que codificam proteínas compreendendo atividade 5 de AHAS.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Figura 1 é um alinhamento de seqüências de nucleotídeos das seqüências de nucleotídeos do gene AHASLI de girassol resistente a herbicida (SEQ ID NO: 1), o gene AHASLI de girassol tipo selvagem (SEQ ID NO: 3), 10 No.de Acesso de GenBank UI6280 (SEQ ID NO: 5), No.de Acesso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 11) e No.de Acesso de GenBank AY 124092 (SEQ ID NO: 13) O sítio da mutação em (SEQ ID NO: 1) é indicado por um asterisco.

A mutação é uma transição de G para A em posição de nucleotídeo 21 de SEQ ID NO: 1.

Figura 2 é um alinhamento de seqüências de aminoácidos da proteína AHASLI de girassol resistente a herbicida (SEQ ID NO: 2), proteína AHASLI de girassol tipo selvagem (SEQ ID NO: 4), No.de Acesso de GenBank UI6280 (SEQ ID NO: 6), No.de Acesso de GenBank AY541451 ) (SEQ ID NO: 12), e No.de Acesso de GenBank AY124092 (SEQ ID NO: 20 14).

O asterisco indica o sítio da única substituição de aminoácido (Ala para Thr) encontrada na proteína AHASLI de girassol resistente a herbicida.

Este sítio da substituição corresponde à posição de aminoácido 7 na seqüência de aminoácidos de comprimento parcial de AHASLI apresentada em SEQ ID NO: 2.

A posição equivalente desta substituição na seqüência de aminoácidos 25 de comprimento completo de AHASLI apresentada em SEQ ID NO: 12 é 107.

Figura 3 é uma ilustração fotográfica demonstrando a tolerância a herbicida aumentada de plantas de girassol S4897 (lado direito) se comparada com as plantas de girassol IMISUN-1 tolerantes a herbicida (Al-Khatib and Miller (2000) Crop Sci.40:869-870) em um estudo em casa de vegetação.

As plantas de girassol S4897 e IMISUN-1 foram tratadas por pulverização com imazamox em taxa de 200 g ai/ha.

Plantas de girassol tipo selvagem de controle não sobreviveram após o tratamento por pulverização 5 com imazamox em uma taxa de ou 100 ou 200 g ai/ha (não mostrado).

A fotografia foi tirada uns poucos dias depois das plantas terem sido tratadas por pulverização.

Figura 4 é ilustração gráfica de lesão por herbicida em um teste em casa de vegetação após o tratamento por pulverização de plantas de 10 girassol IMISUN-1, tipo selvagem, e S4897 com imazamox ou em 100 (colunas claras) ou 200 g ai/ ha (colunas escuras).

Esta figura demonstra que as plantas de girassol de resistência a herbicida S4897 têm uma resistência ou tolerância significantemente maior para duas taxas de imazamox quando comparadas tanto com as plantas IMISUN-1 resistentes a herbicida como 15 plantas tipo selvagem.

Lesão por herbicida foi avaliada 17 dias depois da aplicação de imazamox.

As plantas IMISUN-1 são conhecidas por possuírem uma substituição de alanina por valina em aminoácido 190 (Kolkman et al.(2004) Theor.Appl.Genet.109: 1147-1159).

Figura 5 é uma ilustração fotográfica demonstrando a 20 tolerância a herbicida aumentada de plantas de girassol S4897 (lado direito) se comparadas com as plantas de girassol IMISUN-1 tolerantes a herbicida no experimento em casa de vegetação descrito em Exemplo 4.

Figura 6 é uma ilustração fotográfica demonstrando a tolerância a herbicida aumentada de plantas de girassol S4897 se comparadas 25 com plantas de girassol de Variedade A de Clearfield® no experimento em casa de vegetação descrito em Exemplo 5.

Figura 7 é ilustração gráfica de uma comparação da inibição de AHAS por Raptor para uma variedade não de Clearfield, uma variedade de Clearfield e plantas de girassol S4897 como descrito em Exemplo 5. Figura 8 é ilustração gráfica de uma comparação da inibição de AHAS por Glean para uma variedade não de Clearfield, uma variedade de Clearfield e plantas de girassol S4897 como descrito em Exemplo 5.

Figura 9 é uma ilustração gráfica do efeito de aplicação foliar 5 de imazapir em altura de planta 14 dias depois de tratamento para dois mutantes de girassol.

Alturas médias (% de plots não tratados) são representadas por quadrados e barras de erro representam o desvio padrão das médias.

Figura 10 é uma ilustração gráfica do efeito de aplicação foliar ^^10 de imazapir em índice de Fitotoxicidade (PI) 14 dias depois de tratamento para dois mutantes de girassol.

PI médios são representados por quadrados e barras de erro representam o desvio padrão das médias.

Figura 11 é uma ilustração gráfica do efeito de aplicação foliar de imazapir em acumulação de biomassa 14 dias depois de tratamento para 15 dois mutantes de girassol.

Biomassas secas médias (% de plots não tratados) são representadas por quadrados e barras de erro representam o desvio padrão das médias.

Figura 12 é uma ilustração gráfica do efeito de aplicação foliar de imazapir em biomassa de raiz 14 dias depois de tratamento para dois 20 mutantes de girassol.

Massas secas de raiz médias (% de plots não tratados) são representadas por quadrados e barras de erro representam o desvio padrão das médias.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos listadas na 25 listagem de seqüências anexa são mostradas usando abreviações padrão de letras para bases de nucleotídeos, e código de três letras para aminoácidos.

As seqüências de nucleotídeos seguem a convenção padrão de começar na extremidade 5' da seqüência e seguindo adiante (i.e., da esquerda para direita em cada linha) para a extremidade 3'.

Apenas uma fita de cada seqüência de ácidos nucleicos é mostrada, mas a fita complementar é entendida estando incluída em qualquer referência è fita apresentada.

As seqüências de aminoácidos seguem a convenção padrão de começar no término amino da seqüência e seguindo adiante (i.e., da esquerda para direita em cada linha) para o término carbóxi.

SEQ ID NO: 1 apresenta a seqüência de nucleotídeos de comprimento parcial codificando uma proteína AHASL 1 resistente a herbicida da linhagem de girassol S4897.

SEQ ID NO: 2 apresenta a seqüência de aminoácidos de ^^10 comprimento parcial da proteína AHASL1 resistente a herbicida codificada pela seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 apresenta a seqüência de nucleotídeos de comprimento parcial codificando a proteína AHASL 1 tipo selvagem de linhagem de girassol BTK.47.

SEQ ID NO: 4 apresenta a seqüência de aminoácidos de comprimento parcial da proteína AHASL 1 tipo selvagem codificada pela seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 é a seqüência de nucleotídeos de No. de Acesso Φ de GenBank U16280.

SEQ ID NO: 6 é a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de nucleotídeos de No. de Acesso de GenBank UI6280.

SEQ ID NO: 7 apresenta a seqüência de nucleotídeos do iniciador HA1U409 que é descrito em Exemplo 2.

SEQ ID NO: 8 apresenta a seqüência de nucleotídeos do 25 iniciador HA 1 LI379 que é descrito em Exemplo 2.

SEQ ID NO: 9 apresenta a seqüência de nucleotídeos do iniciador HA1U1313 que é descrito em Exemplo 2.

SEQ ID NO: 10 apresenta a seqüência de nucleotídeos do iniciador HA1L2131 que é descrito em Exemplo 2. SEQ ID NO: 11 é a seqüência de nucleotídeos de No.de Acesso de GenBank AY541451.

SEQ ID NO: 12 é a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de nucleotídeos de No.de Acesso de GenBank AY541451.

SEQ ID NO: 13 é a seqüência de nucleotídeos de No.de Acesso de GenBank AY 124092, SEQ ID NO: 14 é a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de nucleotídeos de No.de Acesso de GenBank AY 124092.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a plantas de girassol tendo resistência aumentada para herbicidas quando comparadas com uma planta de girassol tipo selvagem.

Plantas de girassol resistentes a herbicida foram produzidas como descrito a seguir expondo plantas de girassol tipo selvagem (com respeito à resistência a herbicida) a um mutagene, permitindo que as 15 plantas amadureçam e se reproduzam, e selecionando plantas de progénie que apresentaram resistência aumentada para um herbicida de imidazolinona, em relação à resistência de uma planta de girassol tipo selvagem.

A invenção fornece as linhagens de girassol resistentes a herbicida que são referidas neste F lugar como S4897, GM40, e GM 1606.

A partir das plantas de girassol S4897 resistentes a herbicida e plantas de girassol BTK.47 tipo selvagem, a região de codificação de um gene de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (designada como AHASLI) foi isolada por amplificação com reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciada.

Comparando as seqüências de polinucleotídeos das 25 plantas de girassol resistentes a herbicida e tipo selvagem, foi descoberto que a região de codificação da seqüência de polinucleotideo AHASL 1 da planta de girassol resistente a herbicida diferiu da seqüência de polinucleotideo AHASLI da planta tipo selvagem por um único nucleotídeo, uma transição de G para A em nucleotídeo 21 (SEQ 1D NO: 1).

Esta transição de G para A na seqüência de polinucleotídeo AHASLI resulta em uma substituição de alanina para treonina em aminoácido 7 (SEQ ID NO: 2) em uma região conservada da seqüência de aminoácidos prevista da proteína AHASLI de girassol resistente a herbicida (SEQ ID NO: 2), em relação à posição de 5 aminoácido equivalente da proteína AHASLI tipo selvagem de linhagem de girassol BTK47 (i.e., aminoácido 7 de SEQ ID NO: 4).

Devido ao fato da seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1 não corresponder a uma região de codificação de comprimento completo de uma proteína AHASL, a seqüência de aminoácidos codificada 10 através desta que é apresentada em SEQ ID NO: 2 também é menor do que comprimento completo.

Para facilitar comparação com outras seqüências de aminoácidos de AHASL de girassol, as posições de aminoácidos de proteínas AHASL de girassol referidas neste lugar, a menos que de outra maneira indicado ou perceptível para o contexto no qual tais posições aparecem, 15 correspondem às posições de aminoácidos da seqüência de aminoácidos de comprimento completo da proteína AHASL 1 de girassol codificada pela seqüência de nucleotídeos tendo No.de Acesso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 12).

Por conseguinte, a substituição de alanina para treonina em ? posição de aminoácido 7 de SEQ ID NO: 2 corresponde à posição de 20 aminoácido 107 na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

Assim, a presente invenção descreve uma substituição de aminoácido que pode ser usada para produzir proteínas AHASL de girassol resistentes a herbicida, os polinucleotídeos codificando tais proteínas, e plantas resistentes a herbicida, tecidos vegetais, células vegetais, e sementes.

Devido ao fato da alanina que é encontrada em posição de aminoácido 107 em proteínas AHASLI de girassol de comprimento completo tipo selvagem ou posição equivalente estar dentro de uma região de aminoácidos que é conservada entre espécies de plantas, é esperado que a substituição de outro aminoácido, preferivelmente treonina, para esta mesma alanina conservada em outras proteínas AHASL de girassol (e.g., AHASL2 e AHASL3) também irá conferir tolerância a herbicida.

Assim, um polinucleotideo codificando uma proteína AHASL de girassol pode ser mutado por qualquer método conhecido na técnica tal como, por exemplo, mutagênese sítio dirigida para 5 produzir um polinucleotideo de girassol que codifica uma proteína AHASL com uma treonina em posição 107 ou posição equivalente.

Seqüências de polinucleotídeos e as seqüências de aminoácidos codificadas a partir destas correspondendo aos genes AHASLI, AHASL2, e AHASL3 de girassol são apresentadas em Nos.de Acesso de GenBank AY541451 (SEQ ID NOS: 11 e 10 12), AY541452, AY541453, AY541454, AY541455, AY541456, AY541457, e AY541458; todas as quais são neste lugar incorporadas por referência.

Por conseguinte, tais polinucleotídeos e as proteínas AHASL resistentes a herbicida codificadas a partir destes encontram uso na produção de plantas resistentes a herbicida, células vegetais, tecidos vegetais, e sementes pelos 15 métodos descritos neste lugar.

A presente invenção abrange adicionalmente polinucleotídeos AHASL2 e AHASL3 isolados de girassol que codificam proteínas AHASL2 e AHASL3 resistentes a herbicida, respectivamente.

Tais proteínas AHASL2 e • AHASL3 resistentes a herbicidas compreendem cada um outro aminoácido do 20 que alanina em posição 107 ou posição equivalente.

Preferivelmente em tais proteínas AHASL2 e AHASL3 resistentes a herbicidas, o aminoácido em posição 107 ou posição equivalente é treonina.

A invenção se refere adicionalmente a moléculas isoladas de polinucleotídeos compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam 25 proteínas de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (AHASL) e a tais proteínas AHASL.

A invenção descreve o isolamento e seqüência de nucleotídeos de um polinucleotideo codificando uma proteína AHASLI de girassol resistente a herbicida de uma planta de girassol resistente a herbicida que foi produzida por mutagênese química de plantas de girassol tipo selvagem.

A proteína AHASL 1 de girassol resistente a herbicidas da invenção possui uma substituição de alanina para treonina em posição 107 ou posição equivalente em suas respectivas seqüências de aminoácidos, quando comparada com a seqüência de aminoácidos tipo selvagem correspondente.

A invenção descreve adicionalmente o isolamento e seqüência de nucleotídeos de uma molécula de polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL 1 de girassol tipo selvagem.

A presente invenção fornece moléculas isoladas de polinucleotídeos que codificam proteínas AHASL de girassol (Helianthus 10 annuus L.).

Especificamente, a invenção fornece moléculas isoladas de polinucleotídeos compreendendo: as seqüências de nucleotídeos apresentadas em SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeos codificando proteínas AHASL compreendendo as seqüências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOS: 2 e 4, e fragmentos e variantes de tais seqüências de nucleotídeos 15 que codificam proteínas AHASL funcionais.

As moléculas isoladas de polinucleotídeo AHASL resistente a herbicida da invenção compreendem seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas AHASL resistentes a herbicida.

Tais moléculas de F polinucleotídeos podem ser usadas em construtos de polinucleotídeos para a 20 transformação de plantas, particularmente plantas cultiváveis, para estimular a resistência das plantas para herbicidas, particularmente herbicidas que são conhecidos por inibirem atividade de AHAS, mais particularmente herbicidas de imidazolinona.

Tais construtos de polinucleotídeos podem ser usados em cassetes de expressão, vetores de expressão, vetores de transformação, 25 plasmídeos e os semelhantes.

As plantas transgênicas obtidas após transformação com tais construtos de polinucleotídeos mostram resistência aumentada para herbicidas inibidores de AHAS tal como, por exemplo, herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia.

Composições da invenção incluem seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas AHASL.

Em particular, a presente invenção sustenta moléculas isoladas de polinucleotídeos compreendendo seqüências de nucleotídeos codificando as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ 1D NOS: 2 e 4, e fragmentos e variantes destas que codificam polipeptídeos 5 compreendendo atividade de AHAS.

São adicionalmente fornecidos polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos codificada por uma molécula de polinucleotídeo descrita neste lugar por exemplo aquelas apresentadas em SEQ ID NOS: 1 e 3, e fragmentos e variantes destas que codificam polipeptídeos compreendendo atividade de AHAS.

A invenção abrange composições de ácidos nucleicos ou proteínas isoladas ou substancialmente purificadas.

Uma molécula de polinucleotídeo ou proteína "isolada" ou "purificada", ou porção biologicamente ativa desta, é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a molécula de 15 polinucleotídeo ou proteína como encontrado em seu ambiente naturalmente ocorrente.

Assim, uma molécula de polinucleotídeo ou proteína isolada ou purificada é substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente ' livre de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizada 20 quimicamente.

Preferivelmente, um ácido nucleico "isolado" é livre de seqüências (preferivelmente seqüências codificando proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (i.e., seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado.

Por exemplo, em várias formas de 25 realização, a molécula isolada de polinucleotídeo pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de polinucleotídeo em DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado.

Uma proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante.

Quando a proteína da invenção ou porção biologicamente ativa desta é produzida recombinantemente, preferivelmente meio de cultura representa menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 5 1% (em peso seco) de precursores químicos ou químicos de não proteína de interesse.

A presente invenção fornece polipeptídeos isolados compreendendo proteínas AHASL.

Os polipeptídeos isolados compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo das 10 seqüências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOS: 2 e 4, as seqüências de aminoácidos codificadas por seqüências de nucleotídeos apresentadas em SEQ ID NOS: 1 e 3, e fragmentos e variantes funcionais de ditas seqüências de aminoácidos que codificam um polipeptídeo AHASL compreendendo atividade de AHAS.

Por "fragmentos e variantes funcionais" 15 é pretendido fragmentos e variantes dos polipeptídeos exemplificados que compreendem atividade de AHAS.

Em certas formas de realização da invenção, os métodos envolvem o uso de plantas tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida.

F Por uma planta "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida", é 20 pretendido que uma planta seja tolerante ou resistente à pelo menos um herbicida em um nível que iria normalmente matar, ou inibir o crescimento de, uma planta normal ou tipo selvagem.

Em uma forma de realização da invenção, as plantas tolerantes a herbicida da invenção compreendem uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida.

Por "proteína 25 AHASL tolerante a herbicida" ou "proteína AHASL resistente a herbicida", é pretendido que uma tal proteína AHASL apresente maior atividade de AHAS, em relação à atividade de AHAS de uma proteína AHASL tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida que é conhecido por interferir na atividade de AHAS e em uma concentração ou nível do herbicida 25 W $ que é conhecido por inibir a atividade de AHAS da proteína AHASL tipo selvagem.

Além disso, a atividade de AHAS de uma tal proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser referida neste lugar como atividade de AHAS "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida".

Para a presente invenção, os termos "tolerante a herbicida" e "resistente a herbicida" são usados permutavelmente e são pretendidos para terem um significado equivalente e um escopo equivalente.

Similarmente, os termos "tolerância a herbicida" e "resistência a herbicida" são usados permutavelmente e são pretendidos para terem um significado equivalente e 10 um escopo equivalente.

Da mesma maneira, os termos "resistente a imidazolinona" e "resistência a imidazolinona" são usados permutavelmente e são pretendidos serem de um significado equivalente e um escopo equivalente que os termos "tolerante a imidazolinona" e "tolerância a imidazolinona", respectivamente.

A invenção abrange polinucleotídeos AHASL resistentes a herbicida e proteínas AHASL resistentes a herbicida.

Por "polinucleotídeo AHASL resistentes a herbicida" é pretendido um polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida.

Por * "proteína AHASL resistente a herbicida" é pretendido uma proteína ou 20 polipeptídeo que compreende atividade de AHAS resistente a herbicida.

Ademais, é reconhecido que uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser introduzida em uma planta transformando uma planta ou ancestral desta com uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou 25 resistente a herbicida.

Tais proteínas AHASL tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida são codificadas pelos polinucleotídeos AHASL tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida.

Altemativamente, uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ocorrer em uma planta como um resultado de uma mutação naturalmente ocorrente ou induzida em um gene de AHASL endógeno no genoma de uma planta ou progenitor desta.

A presente invenção fornece plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e células hospedeiras com resistência ou tolerância aumentada para 5 pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia.

A quantidade ou concentração preferida do herbicida é uma "quantidade efetiva" ou "concentração efetiva”.

Por "quantidade efetiva" e "concentração efetiva" é pretendido uma quantidade e concentração, respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de uma 10 planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira tipo selvagem similar, mas esta dita quantidade não mata ou inibe tão severamente o crescimento das plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e células hospedeiras resistentes a herbicida da presente invenção.

Tipicamente, a quantidade efetiva de um herbicida é uma quantidade que é rotineiramente 15 usada em sistemas de produção agrícola para matar ervas daninhas de interesse.

Uma tal quantidade é conhecido por aqueles de habitual verso na técnica.

Por "planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira F tipo selvagem similar" é pretendido uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, 20 ou célula hospedeira, respectivamente, que carece das características de resistência a herbicida e/ou polinucleotídeo particular da invenção que são descritos neste lugar.

O uso do termo "tipo selvagem" não é, portanto, pretendido para implicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou outra célula hospedeira careça de DNA recombinante em seu genoma, e/ou 25 não possua características de resistência a herbicida que são diferentes daquelas descritas neste lugar.

Como usado neste lugar a menos que claramente indicado de outra maneira, o termo "planta" pretendeu significar uma planta em qualquer estágio de desenvolvimento, assim como qualquer parte ou partes de uma planta que pode ser acoplada a ou separada de uma planta intacta inteira.

Tais partes de uma planta incluem, mas não são limitadas a, órgãos, tecidos, e células de uma planta.

Exemplos de partes vegetais particulares incluem um caule, uma folha, uma raiz, uma inflorescência, uma flor, uma flor pequena, 5 uma fruta, um pedículo, a pedúnculo, um estame, uma antera, um estigma, um estilo, um ovário, uma pétala, uma sépala, um carpelo, uma ponta de raiz, uma coifa, um pêlo radicular, um pêlo foliar, um pêlo de semente, um grão de pólen, a micrósporo, um cotilédone, um hipocótilo, um epicótilo, xilema, floema, parênquima, endosperma, uma célula companheira, uma célula 10 guarda, e quaisquer outros órgãos, tecidos, e células conhecidos de uma planta.

Além disso, é reconhecido que uma semente é uma planta.

As plantas da presente invenção incluem tanto plantas não transgênicas e plantas transgênicas.

Por "planta não transgênica" é pretendido significar uma planta carecendo de DNA recombinante em seu genoma.

Por "planta transgênica" é pretendido significar uma planta compreendendo DNA recombinante em seu genoma.

Uma tal planta transgênica pode ser produzida introduzindo DNA recombinante no genoma da planta.

Quando tal DNA recombinante é incorporado no genoma da planta transgênica, progénie da " planta também pode compreender o DNA recombinante.

Uma planta de 20 progénie que compreende pelo menos uma porção do DNA recombinante de pelo menos uma planta transgênica progenitora também é uma planta transgênica.

A presente invenção fornece a linhagem de girassol resistente a herbicida que é referida neste lugar como 54897 e progénie e derivados 25 desta que compreende as características de resistência a herbicida de 54897.

Um depósito de sementes do girassol GM40 que é derivado de linhagem de girassol 54897 e compreende as características de resistência a herbicida de 54897 foi feito com o Depósito de Patente da American Type Culture Collection (ATCC), Mansassas, VA 20110 USA em 17 de Maio de 2005 e concedido Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716.

O depósito de linhagem de girassol GM40 foi feito para um termo de pelo menos 30 anos e pelo menos 5 anos depois do requerimento mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito ser recebido pela ATCC.

Adicionalmente, 5 Requerentes satisfizeram todos os requerimentos de 37 C.F.R. 1.8011.809, incluindo fornecer uma indicação da viabilidade da amostra.

A presente invenção fornece adicionalmente a linhagem de girassol resistente a herbicida que é referida neste lugar como GM1606.

Um depósito de sementes do girassol GM1606 foi feito com o Depósito de Patente 10 da American Type Culture Collection (ATCC), Mansassas, VA 20110 USA em 19 de Maio de 2006 e concedido Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606.

O depósito de girassol GM1606 foi feito para um termo de pelo menos 30 anos e pelo menos 5 anos depois do requerimento mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito ser recebido pela ATCC.

Adicionalmente, Requerentes satisfizeram todos os requerimentos de 37 C.F.R. §§ 1.801-1809, incluindo fornecer uma indicação da viabilidade da amostra.

A presente invenção fornece plantas de girassol resistentes a F herbicida que foram produzidas por uma indução de mutação.

Plantas de 20 girassol tipo selvagem foram mutagenizadas expondo as plantas a um mutagênico, particularmente um mutagênico químico, mais particularmente etil metanosulfonato (EMS).

Entretanto, a presente invenção não é limitada a plantas de girassol resistentes a herbicida que são produzidas por um método de mutagênese envolvendo o mutagênico químico EMS.

Qualquer método de 25 mutagênese conhecido na técnica pode ser usado para produzir as plantas de girassol resistentes a herbicida da presente invenção.

Tais métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, o uso de qualquer um ou mais dos seguintes mutagênicos: radiação, tal como raios-X, raios Gama (e.g., cobalto 60 ou césio 137), nêutrons, (e.g., produto de fissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação Beta (e.g., emitida de radioisótopos tal como fósforo 32 ou carbono 14), e radiação ultravioleta (preferivelmente de 2500 a 2900 nm), e mutagênicos químicos tal como análogos de base (e.g., 5-bromo- uracil), compostos relacionados (e.g., 8-etoxi cafeína), antibióticos (e.g., 5 estreptonigrina), agentes alquilantes (e.g., mostardas de enxofre, mostardas de nitrogênio, epóxidos, etilenoaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso, ou acridinas.

Plantas resistentes a herbicida também podem ser produzidas usando métodos de cultura de tecido para selecionar células vegetais compreendendo mutações de resistência a 10 herbicida e então regenerando plantas resistentes a herbicida a partir destas.

Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos.5.773.702 e 5.859.348, ambas as quais são neste lugar incorporadas em sua totalidade por referência.

Detalhes adicionais de indução de mutação podem ser encontrados em "Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing 15 Company a descrição da qual é incorporada neste lugar por referência.

Análise do gene AHASLI da planta de girassol das linhagens S4897 e GM1606 revelou que a mutação que resulta na substituição de uma treonina pela alanina que é encontrada em posição de aminoácido 7 na I seqüência de aminoácidos de AHASLI tipo selvagem para SEQ ID NO: 4.

Posição de aminoácido 7 em SEQ ID NOS: 2 e 4 corresponde a posição de aminoácido 107 na seqüência de aminoácidos de comprimento completo de uma proteína AHASLI de girassol apresentada em SEQ ID NO: 12.

Assim, a presente invenção descreve que substituir outro aminoácido pela alanina em posição de aminoácido 107, ou posição equivalente, em uma proteína AHASL 25 pode causar que uma planta de girassol tenha resistência aumentada para um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona e/ou sulfoniluréia.

Como descrito em Exemplo 6 abaixo, a alanina em posição de aminoácido 107 ocorre dentro de uma região conservada de proteínas AHASL.

Similarmente, foram descritas substituições de aminoácidos em outras regiões conservadas de proteínas AHASL que sào conferidas por conferirem resistência a herbicida em uma planta que compreende uma tal proteína AHASL.

Por conseguinte, as plantas de girassol resistentes a herbicida da invenção incluem, mas não são limitadas àquelas plantas de girassol que 5 compreendem em seus genomas pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo AHASL que codifica uma proteína AHASL resistente a herbicida que compreende uma treonina em posição de aminoácido 107 ou posição equivalente.

As plantas de girassol da invenção incluem adicionalmente ^10 plantas que compreendem, em relação à proteína AHASL tipo selvagem, uma treonina ou outro aminoácido outro do que alanina em posição de aminoácido 107 ou posição equivalente, e uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais na proteína AHASL em relação à proteína AHASL tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que uma tal planta de girassol tem resistência 15 aumentada para pelo menos um herbicida quando comparada com uma planta de girassol tipo selvagem.

Tais plantas de girassol compreendem proteínas AHASL que compreendem uma treonina ou outro aminoácido outro do que alanina em posição de aminoácido 107 ou posição equivalente e pelo menos ® um membro selecionado a partir do grupo consistindo de: uma alanina, 20 treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ou serina em posição de aminoácido 182 ou posição equivalente; uma isoleucina ou um outro aminoácido do que treonina em posição de aminoácido 188 ou posição equivalente; um aspartato ou valina em posição de aminoácido 190 ou posição equivalente; uma leucina em posição de aminoácido 559 ou posição 25 equivalente; e uma asparagina, treonina, fenilalanina, ou valina em posição de aminoácido 638 ou posição equivalente.

A presente invenção fornece proteínas AHASL com substituições de aminoácidos em particular posição de aminoácidos dentro de regiões conservadas das proteínas AHASL de girassol descritas neste lugar. Além disso, aqueles de habitual verso na técnica irào reconhecer que tais posições de aminoácidos podem variar dependendo se os aminoácidos são adicionados ou removidos de, por exemplo, a extremidade N-terminal de uma seqüência de aminoácidos.

Assim, a invenção abrange as substituições de 5 aminoácidos na posição referida ou posição equivalente (e.g., "posição de aminoácido 107 ou posição equivalente").

Por "posição equivalente" é pretendido significar uma posição que está dentro da mesma região conservada que a posição de aminoácido exemplificada.

Tais regiões conservadas são conhecidas na técnica (veja Tabela 4 abaixo) ou podem ser 10 determinadas por alinhamentos múltiplos de seqüências como descrito neste lugar ou por métodos conhecidos na técnica.

Em adição, a presente invenção fornece polipeptídeos AHASL compreendendo substituições de aminoácidos que são conhecidas por conferirem resistência em uma planta para pelo menos um herbicida, 15 particularmente um herbicida de imidazolinona e/ou um herbicida de sulfoniluréia.

Tais polipeptídeos AHASL incluem, por exemplo, aqueles que compreendem uma treonina em posição de aminoácido 107 e pelo menos um membro selecionado a partir do grupo consistindo de: uma alanina, treonina, F histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ou serina em posição de 20 aminoácido 182 ou posição equivalente; uma isoleucina ou outro aminoácido outro do que treonina em posição de aminoácido 188 ou posição equivalente; um aspartato ou valina em posição de aminoácido 190 ou posição equivalente; um aspartato ou valina em posição de aminoácido 190 ou posição equivalente; uma leucina em posição de aminoácido 559 ou posição 25 equivalente; e uma asparagina, treonina, fenilalanina, ou valina em posição de aminoácido 638 ou posição equivalente.

A invenção fornece adicionalmente polinucleotídeos isolados codificando tais polipeptídeos AHASL, assim como cassetes de expressão, vetores de transformação, células hospedeiras transformadas, plantas transformadas, e métodos compreendendo tais 5 10 15 20 25 polinucleotídeos.

A presente invenção fornece métodos para estimular a tolerância ou resistência de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou outra célula hospedeira para pelo menos um herbicida que interfere na atividade da enzima AHAS.

Preferivelmente, um tal herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou mistura destes.

Mais preferivelmente, um tal herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, ou mistura destes.

Para a presente invenção, os herbicidas de imidazolinona incluem, mas não são limitados a, PURSUIT’ (imazetapir), CADRE (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), um derivado de qualquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas acima mencionados, por exemplo, imazapir/imazamox (ODYSSEY').

Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado a partir de, mas não é limitado a, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-3-quinolinacarboxílico, ácido 5-etil-2- (4-isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de 6-(4-isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin“2-il) -mtoluato de metila e 2- (4-isopropil-4-metil- 5-oxo-2-imidazolin-2-il) -p-toluato de metila.

O uso de ácido 5-etil-2- (4- isopropil-4-metil-5-oxo- 2-imidazolin-2-il)-nicotínico e ácido 2- (4-isopropil- 4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2- il)-5- (metoximetil)-nicotínico é preferido.

O uso de ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5- (metoximetil)-nicotínico é particularmente preferido.

Para a presente invenção, os herbicidas de sulfoniluréia 5 10 15 20 25 incluem, mas não são limitados a, clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, flazasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, azimsulfuron, ciclosulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron metil, foramsulfuron, iodosulfuron, oxasulfuron, mesosulfuron, prosulfuron, sulfosulfuron, trifloxisulfuron, tritosulfuron, um derivado de qualquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas acima mencionados.

Os herbicidas de triazolopirimidina da invenção incluem, mas não são limitados a, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, e penoxsulam.

Os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato da invenção incluem, mas não são limitados a, bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim e piriftalid.

Os herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona incluem, mas não são limitados a, flucarbazona e propoxicarbazona.

É reconhecido que herbicidas de pirimidiniloxibenzoato são intimamente relacionados aos herbicidas de pirimidiniltiobenzoato e são generalizados sob o título do último nome pela Weed Science Society of America.

Por conseguinte, os herbicidas da presente invenção incluem adicionalmente herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluindo, mas não limitados a, os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato descritos acima.

A presente invenção fornece métodos para estimular atividade de AHAS em uma planta compreendendo transformar uma planta com um construto de polinucleotídeo compreendendo um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeos de AHASL 1 da invenção.

Os métodos envolvem introduzir um construto de polinucleotídeo da invenção em pelo menos uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir desta.

Os métodos envolvem o uso de um promotor que é capaz de dirigir expressão gênica em uma célula vegetal.

Preferivelmente, um tal promotor é um promotor constitutivo ou um promotor tecido-específico.

Os métodos encontram uso em estimular ou aumentar a resistência de uma planta para pelo menos um herbicida que interfere na atividade catalítica da enzima 5 AHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia.

A presente invenção fornece cassetes de expressão para expressar os polinucleotídeos da invenção em plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e outras células hospedeiras.

Os cassetes de expressão compreendem um promotor exprimível na planta, tecido vegetal, célula 10 vegetal, ou outras células hospedeiras de interesse operavelmente ligado a um polinucleotideo da invenção que compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando ou uma proteína AHASLI de comprimento completo (i.e.incluindo o peptídeo de trânsito de cloroplasto) ou madura (i.e.sem o peptídeo de trânsito de cloroplasto).

Se expressão é desejada nos plastídeos ou 15 cloroplastos de plantas ou células vegetais, o cassete de expressão também pode compreender uma seqüência tendo como alvo cloroplasto operavelmente ligada que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

Os cassetes de expressão da invenção encontram uso em um F método para estimulara tolerância a herbicida de uma planta ou uma célula 20 hospedeira.

O método envolve transformar a planta ou célula hospedeira com um cassete de expressão da invenção, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende um promotor que é exprimível na planta ou célula hospedeira de interesse e o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotideo da invenção que compreende uma seqüência de nucleotídeos 25 codificando uma proteína AHASL resistente a imidazolinona da invenção.

O uso do termo "construtos de polinucleotídeos" neste lugar não é pretendido para limitar a presente invenção a construtos de polinucleotídeos compreendendo DNA.

Aqueles de habitual verso na técnica irão reconhecer que construtos de polinucleotídeos, particularmente K^9 35 Φ polinucleotídeos e oligonucleotídeos, compreendidos de ribonucleotideos e combinações de ribonucleotideos e desoxiribonucleotideos também podem ser empregadas nos métodos descritos neste lugar.

Assim, os construtos de polinucleotídeos da presente invenção abrangem todos os construtos de 5 polinucleotídeos que podem ser empregados nos métodos da presente invenção para transformar plantas incluindo, mas não limitados a, aqueles compreendidos de desoxiribonucleotideos, ribonucleotideos, e combinações destes.

Tais desoxiribonucleotideos e ribonucleotideos incluem tanto moléculas naturalmente ocorrentes como análogos sintéticos.

Os construtos 10 de polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de construtos de polinucleotídeos incluindo, mas não limitadas a, formas de fita simples, formas de dupla fita, fornias de grampo de cabelo, estruturas de hastes e alças, e os semelhantes.

Além disso, é entendido por aqueles de habitual verso na técnica que cada seqüência de nucleotídeos descrita neste 15 lugar também abrange o complemento daquela seqüência de nucleotídeos exemplificada.

Além disso, é reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um construto de polinucleotídeo que é capaz de direcionar, em uma I planta transformada, a expressão de pelo menos uma proteína, ou pelo menos 20 um RNA, tal como, por exemplo, um RNA anti-sentido que é complementar a pelo menos uma porção de um mRNA.

Tipicamente um tal construto de polinucleotídeo é compreendido de uma seqüência de codificação para uma proteína ou RNA operavelmente ligado a regiões reguladoras transcricionais 5' e 3'.

Altemativamente, também é reconhecido que os métodos da invenção 25 podem empregar um construto de polinucleotídeo que não é capaz de direcionar, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou RNA.

Ademais, é reconhecido que, para expressão de um polinucleotídeo da invenção em uma célula hospedeira de interesse, o polinucleotídeo é tipicamente operavelmente ligado a um promotor que é capaz de dirigir expressão gênica na célula hospedeira de interesse.

Os métodos da invenção para expressar os polinucleotídeos em células hospedeiras não dependem de promotor particular.

Os métodos abrangem o 5 uso de qualquer promotor que é conhecido na técnica e que é capaz de dirigir expressão gênica na célula hospedeira de interesse.

A presente invenção abrange moléculas de polinucleotídeo AHASL e fragmentos e variantes destas.

Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos destas seqüências de nucleotídeos também são abrangidas 10 pela presente invenção.

Por "fragmento" é pretendido uma porção da seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL da invenção.

Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL da invenção pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL, ou ele pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de 15 hibridização ou iniciador de PCR usando métodos descritos abaixo.

Uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL pode ser preparada isolando uma porção de uma das seqüências de nucleotídeos de AHASL da invenção, expressando a porção codificada da proteína AHASL (e.g., por F expressão recombinante in vitro), e verificando a atividade da porção 20 codificada da proteína AHASL.

Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, ou 1100 nucleotídeos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma seqüência de nucleotídeos de 25 comprimento completo descrita neste lugar (por exemplo, 1178 nucleotídeos tanto para SEQ ID NOS: 1 como 3, respectivamente) dependendo do uso pretendido.

Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL da invenção irá codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, ou 350 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína AHASLI de comprimento completo da invenção (por exemplo, 392 aminoácidos para ambas as SEQ ID NO: 2 e 5 4).

Fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de AHASLI que são úteis como sondas de hibridização para iniciadores de PCR geralmente não necessitam codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASLI.

Moléculas de polinucleotideo que são variantes das seqüências ^^10 de nucleotídeos descritas neste lugar também são abrangidas pela presente invenção.

"Variantes" das seqüências de nucleotídeos de AHASL da invenção incluem aquelas seqüências que codificam as proteínas AHASL descritas neste lugar mas que diferem conservativamente por causa da degenerescência do código genético.

Estas variantes alélicas naturalmente ocorrentes podem 15 ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como esboçado abaixo.

Seqüências de nucleotídeos variantes também incluem seqüências de nucleotídeos derivadas sinteticamente que T foram geradas, por exemplo, usando mutagênese sítio dirigida mas que ainda 20 codificam a proteína AHASLI descrita na presente invenção como discutido abaixo.

Geralmente, variantes de seqüência de nucleotídeos da invenção terão pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma seqüência de nucleotídeos particular descrita neste lugar.

Uma seqüência de nucleotídeos 25 de AHASLI variante irá codificar uma proteína AHASLI, respectivamente, que tem uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL descrita neste lugar. Em adição, o artesão versado irá adicionalmente perceber que mudanças podem ser introduzidas por mutação nas seqüências de nucleotídeos da invenção levando com isso a mudanças na seqüência de aminoácidos das proteínas AHASL codificadas sem alterar a atividade 5 biológica das proteínas AHASL.

Assim, uma molécula isolada de polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL tendo uma seqüência que difere daquela de SEQ ID NOS: 1 ou 3, respectivamente, pode ser criada introduzindo uma ou mais substituições, adições, ou deleções de nucleotídeo na seqüência de nucleotídeos correspondente descrita neste lugar, de forma 10 que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos são introduzidas na proteína codificada.

Mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tal como mutagênese sítio dirigida e mutagênese mediada por PCR.

Tais seqüências de nucleotídeos variantes também são abrangidas pela presente invenção.

Por exemplo, preferivelmente, substituições de aminoácidos conservativas podem ser feitas em um ou mais previstos, preferivelmente resíduos de aminoácidos não essenciais.

Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência tipo * selvagem de uma proteína AFIASL (e.g., a seqüência de SEQ ID NOS: 2 e 4, 20 respectivamente) sem alterar a atividade biológica, ao passo que um resíduo de aminoácido "essencial" é requerido para atividade biológica.

Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar.

Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais 25 similares foram definidas na técnica.

Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-rami ficadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

Tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos 5 residindo dentro de um motivo conservado.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras incluindo substituições, deleções, truncamentos, e inserções de aminoácidos.

Métodos para tais manipulações geralmente são conhecidos na técnica.

Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácidos das proteínas 10 AHASL podem ser preparadas por mutações no DNA.

Métodos para mutagênese e alterações de seqüência de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica.

Veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492; Kunkel et al.(1987) Methods in En∑ymol.154:367-382; Patente Norte-Americana No.4.873.192; Walker and Gaastra, eds.(1983) Techniques 15 in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) e as referências citadas nestes.Orientação como para substituições de aminoácidos apropriadas que não afetam atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al.(1978) Atlas of Protein Sequence ' and Structure (Natl.Biomed.Res.Found., Washington, D.C.), neste lugar 20 incorporado por referência.

Substituições conservativas, tal como trocar um aminoácido por outro tendo propriedades similares, pode ser preferível.

Altemativamente, seqüências de nucleotídeos de AHASL variantes podem ser feitas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência de codificação de AHASL, tal como por 25 mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser monitorados para atividade de AHAS para identificar mutantes que retêm atividade de AHAS, incluindo atividade de AHAS resistente a herbicida.

Seguindo mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa recombinantemente, e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio padrão.

Aoò 40 Assim, as seqüências de nucleotídeos da invenção incluem as seqüências descritas neste lugar assim como fragmentos e variantes destas.

As seqüências de nucleotídeos de AHASL da invenção, e fragmentos e variantes destas, podem ser usadas como sondas e/ou iniciadores para identificar e/ou 5 clonar homólogos de AHASL em outras plantas.

Tais sondas podem ser usadas para detectar transcritos ou seqüências genômicas codificando as mesmas proteínas ou idênticas.

Desta maneira, métodos tal como PCR, hibridização, e os semelhantes podem ser usados para identificar tais seqüências tendo 10 identidade substancial com as seqüências da invenção.

Veja, por exemplo, Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) e Innis, et al.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

Seqüências de nucleotídeos de AHASL isoladas baseado na sua identidade de 15 seqüência com as seqüências de nucleotídeos de AHASLI apresentadas neste lugar ou com fragmentos e variantes destas são abrangidas pela presente invenção.

Em um método de hibridização, toda ou parte de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL conhecida pode ser usada para 20 monitorar cDNA ou bibliotecas genômicas.

Métodos para construção de tal cDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecido na técnica e são descritos em Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY).

As assim chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA 25 genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável tal como P, ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima.

Sondas para hibridização podem ser feitas marcando oligonucleotídeos sintéticos baseado na seqüência de nucleotídeos de AHASL conhecida descrita neste lugar.

Iniciadores degenerados projetados com base em nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácidos em uma seqüência de nucleotídeos de AHASL conhecida ou seqüência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser 5 usadas.

A sonda tipicamente compreende uma região de seqüência de nucleotídeos que hibridiza em condições estringentes com pelo menos cerca de 12, preferivelmente cerca de 25, mais preferivelmente cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, ou 1178 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeos de 10 AHASL da invenção ou um fragmento ou variante desta.

Preparação de sondas para hibridização é geralmente conhecida na técnica e é descrita em Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), neste lugar incorporado por referência.

Por exemplo, a seqüência inteira de AHASL descrita neste lugar, ou uma ou mais porções desta, pode ser usada como uma sonda capaz de especificamente hibridizar com seqüências de AHASL correspondentes e RNAs mensageiros.

Técnicas de hibridização incluem triagem por I hibridização de bibliotecas de DNA emplacadas (ou placas ou colônias; veja, 20 por exemplo, Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)).

Hibridização de tais seqüências pode ser realizada em condições estringentes.

Por "condições estringentes" ou "condições de 25 hibridização estringentes" é pretendido condições nas quais uma sonda irá hibridizar com sua seqüência alvo para um grau detectavelmente maior do que para outras seqüências (e.g., pelo menos 2 vezes sobre base).

Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes.

Tipicamente, condições estringentes serào aquelas nas quais a concentração de sal é menos do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., 10 a 5 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (e.g., maior do que 50 nucleotídeos).

Condições estringentes também podem ser atingidas com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida.

Condições de baixa estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato de ^^10 sódio) a 37°C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaC 1/0,3 M de citrato trissódico) a 50 a 55°C.

Condições de moderada estringência exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IX SSC a 55 a 60°C.

Condições de alta estringência exemplares incluem hibridização em 15 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,lX SSC a 60 a 65°C.

Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS.

A duração de hibridização é geralmente menos do que cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

Especificidade é tipicamente a função de lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da solução de lavagem final.

Para híbridos de DNA-DNA, a T., pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth and Wahl (1984) Anal.Biochem.138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) -0,61 (% de forma) - 500/L; onde 25 M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases.

A Tm é a temperatura (em força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente compatível.

Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de desigualdade; assim, Tm, condições de hibridização, e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com seqüências da identidade desejada.

Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm pode 5 ser diminuída 10°C.

Geralmente, condições estringentes são selecionadas para ser cerca de 5°C menor do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a seqüência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos.

Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C menor do que o ponto de fusão 10 térmica (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10°C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm); condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20°C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm).

Usando a equação, composições de hibridização e 15 lavagem, e Tm desejada, aqueles de habitual verso irão entender que variações na estringência de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas.

Se o grau desejado de desigualdade resulta em uma Tm de menos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferido F aumentar a concentração de SSC para que uma temperatura maior possa ser 20 usada.

Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry’ and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al., eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, 25 New York).

Veja Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

É reconhecido que as moléculas de polinucleotideo e proteínas da invenção abrangem moléculas de polinucleotideo e proteínas 44 .7 compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos que é suficientemente idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1 e/ou 3, ou à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 e/ou 4.

O termo "suficientemente idêntica" é usado neste lugar para se referir a uma primeira 5 seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (e.g., com uma cadeia lateral similar) a uma segunda seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos de forma que a primeira e segunda seqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos têm um domínio 10 estrutural comum e/ou atividade funcional comum.

Por exemplo, seqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos que contêm um domínio estrutural comum tendo pelo menos cerca de 45%, 55%, ou 65% de identidade, preferivelmente 75% de identidade, mais preferivelmente 85%, 95%, ou 98% de identidade são definidas neste lugar como suficientemente idênticas.

Para determinar a identidade percentual de duas seqüências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as seqüências são alinhadas para propósitos de comparação ótima.

A identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhado I pelas seqüências (i.e., identidade percentual = número de posições 20 idênticas/número total de posições (e.g., posições sobrepostas) x 100).

Em uma forma de realização, as duas seqüências são do mesmo comprimento.

A identidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir lacunas.

Ao calcular identidade percentual, compatibilidade tipicamente exatas são 25 contadas.

A determinação de identidade percentual entre duas seqüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático.

Um exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc.

Natl.Acad.Sci.USA 87:2264, modificado como em Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877.Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403.

Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o 5 programa NBLAST, escore = 100, extensão de palavra = 12, para obter seqüências de nucleotídeos homólogas às moléculas de polinucleotídeo da invenção.

Buscas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, extensão de palavra = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteínas da invenção.

Para obter 10 alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3389.

Altemativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas.

Veja Altschul et al.(1997) acima.Quando utilizando programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI- 15 Blast, os parâmetros padrão dos programas respectivos (e.g., XBLAST e NBLAST) podem ser usados.Veja http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Outro exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS I 4:11-17.m tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que 20 é parte do pacote de aplicativo computacional de alinhamento de seqüência GCG.

Quando utilizando o programa ALIGN para comparar seqüências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas.

Alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

A menos que de outra forma determinado, valores de identidade/similaridade de seqüência fornecidos neste lugar se referem ao valor obtido usando as seqüências de comprimento completo da invenção e usando alinhamento múltiplo por meio do algoritmo Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994) usando o programa AlignX incluído no pacote de aplicativo computacional Vector NT1 Suite Version 7 (InforMax, Inc., Bethesda, MD, USA) usando os parâmetros padrão; ou qualquer programa equivalente deste.

Por "programa equivalente" é pretendido qualquer programa de comparação de seqüências que, para quaisquer duas 5 seqüências em questão, fornece um alinhamento tendo compatibilidades idênticas de nucleotídeo ou resíduo de aminoácido e uma identidade de seqüência percentual idêntica quando comparado ao alinhamento correspondente gerado por AlignX no pacote de aplicativo computacional Vector NTI Suite Version 7.

As seqüências de nucleotídeos de AHASL da invenção incluem tanto as seqüências naturalmente ocorrentes assim como formas mutantes, particularmente formas mutantes que codificam proteínas AHASL compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida.

Da mesma maneira, as proteínas da invenção abrangem tanto proteínas naturalmente 15 ocorrentes assim como variações e formas modificadas destas.

Tais variantes continuarão a possuir a atividade de AHAS desejada.

Obviamente, as mutações que serão feitas no DNA codificando a variante não devem colocar a seqüência fora de quadro de leitura e preferivelmente não criarão regiões I complementares que poderiam produzir estrutura secundária de mRNA.Veja, 20 Publicação de Pedido de Patente Européia No.75.444.

As deleções, inserções, e substituições das seqüências de proteínas abrangidas neste lugar não são esperadas produzirem mudanças radicais nas características da proteína.

Entretanto, quando é difícil prever o efeito exato da substituição, deleção, ou inserção antecipadamente a fazê-lo, 25 alguém versado na técnica irá perceber que o efeito será avaliado por ensaios de triagem de rotina.

Isto é, a atividade pode ser avaliada por ensaios de atividade de AHAS.

Veja, por exemplo, Singh et al.(1988) Anal.Biocheni.171:173-179, neste lugar incorporado por referência.

Seqüências de nucleotídeos e proteínas variantes também abrangem seqüências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico tal como embaralhamento de DNA.

Com um tal procedimento, uma ou mais diferentes seqüências de codificação de AHASL podem ser manipuladas para criar uma nova proteína AHASL possuindo as 5 propriedades desejadas.

Desta maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de seqüência relacionada compreendendo regiões de seqüência que têm identidade de seqüência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo.

Por exemplo, usando esta abordagem, 10 motivos de seqüências codificando um domínio de interesse podem ser recombinados entre o gene AHASL da invenção e outros genes AHASL conhecidos para obter um novo gene codificando para uma proteína com uma propriedade melhorada de interesse, tal como um Km aumentado no caso de uma enzima.

Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na 15 técnica.

Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc.Natl.Acad.Sei.USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nature Biotech.15:436-438; Moore et al.(1997) J.Mol.Biol.272:336-347; Zhang et al.(1997) Proc.Natl.Acad.Sei.USA 94:4504-4509; Crameri et al.) (1998) Nature 391:288-291; e Patente Norte-Americana Nos.5.605.793 e 20 5.837.458.

As seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas para isolar seqüências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outras dicotiledôneas.

Desta maneira, métodos tal como PCR, hibridização, e os semelhantes podem ser usados para 25 identificar tais seqüências com base na sua homologia de seqüência com as seqüências apresentadas neste lugar.

Seqüências isoladas baseado na sua identidade de seqüência com as seqüências inteiras de AHASL apresentadas neste lugar ou com fragmentos destas são abrangidas pela presente invenção.

Assim, seqüências isoladas que codificam para uma proteína AHASL e que oól I Φ hibridizam em condições estringentes com a seqüência descrita neste lugar, ou com fragmentos desta, são abrangidas pela presente invenção.

Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar seqüências 5 de DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse.

Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Veja também Innis et al., 10 eds.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds.(1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis and Gelfand, eds.(1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York).

Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não são limitados a, métodos usando iniciadores pareados, pares de iniciadores, 15 iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores gene- específicos, iniciadores vetor-específicos, iniciadores parcialmente incompatíveis, e os semelhantes.

As seqüências de polinucleotídeos de AHASL da invenção são I fornecidas em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse.

O cassete irá incluir seqüências reguladoras 5' e 3' operavelmente ligadas a uma seqüência de polinucleotídeos de AHASL da invenção.

Por "operavelmente ligada" é pretendida uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência, caracterizado pelo fato de que a seqüência de promotor inicia e media transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência.

Geralmente, operavelmente ligadas significa que as seqüências de ácidos nucleicos sendo ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura.

O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional para ser co-transformado no organismo.

Altemativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode ser fornecido em múltiplos cassetes de expressão.

Um tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da seqüência de polinucleotídeos de AHASL estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.

O cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.

O cassete de expressão irá incluir na direção 5’-3* de transcrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (i.e., um promotor), uma seqüência de polinucleotídeos de AHASL da invenção, e uma 10 região de terminação transcricional e traducional (i.e., região de terminação) funcional em plantas.

O promotor pode ser nativo ou análogo, ou exógeno ou heterólogo, para o hospedeiro vegetal e/ou para a seqüência de polinucleotídeos de AHASL da invenção.

Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética.

Onde o 15 promotor é "exógeno" ou "heterólogo" para o hospedeiro vegetal, é pretendido que o promotor não seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido.

Onde o promotor é "exógeno" ou "heterólogo" para a seqüência de polinucleotídeos de AHASL da invenção, é pretendido que o I promotor não seja o promotor nativo ou naturalmente ocorrente para a 20 seqüência de polinucleotídeos de AHASL operavelmente ligada da invenção.

Como usado neste lugar, um gene quimérico compreende uma seqüência de codificação operavelmente ligada a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga para a seqüência de codificação.

Embora possa ser preferível expressar os polinucleotídeos 25 AHASL da invenção usando promotores heterólogos, as seqüências de promotor nativo podem ser usadas.

Tais construtos mudariam níveis de expressão da proteína AHASL na planta ou célula vegetal.

Assim, o fenótipo da planta ou célula vegetal é alterado.

A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a seqüência AHASL operavelmente ligada de interesse, pode ser nativa com o hospedeiro vegetal, ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., exógena ou heteróloga para o promotor, a seqüência de polinucleotídeos de AHASL de interesse, o 5 hospedeiro vegetal, ou qualquer combinação destes).

Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo-Ti de A.tuinefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase.

Veja também Guerineau et al.(1991) Mol.Gen.Genet.262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al.(1991) Genes Dev.5:141-149; Mogen et al.10 (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al.(1990) Gene 91:151-158; Bailas et al.(1989) Nucleic Acids Res.17:7891-7903; e Joshi et al.(1987) Nucleic Acid Res.15:9627-9639.Onde apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para expressão aumentada na planta transformada.Isto é, os genes podem ser 15 sintetizados usando códons preferidos de plantas para expressão melhorada.Veja, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol.92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferido de hospedeiro.Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferidos de plantas.Veja, por I exemplo, Patente Norte-Americana Nos.5.380.831, e 5.436.391, e Murray et 20 al.(1989) Nucleic Acids Res.17:477-498, neste lugar incorporados por referência.

Modificações adicionais de seqüência são conhecidas por estimular expressão gênica em um hospedeiro celular.

Estas incluem eliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilação artificiais, 25 sinais de sítio de corte de éxon-íntron, repetições tipo transposon, e outras tais seqüências bem caracterizadas que podem ser deletérias para expressão gênica.

O teor de G-C da seqüência pode ser ajustado para média de para um dado hospedeiro celular, quando calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira.

Quando possível, a seqüência é modificada para evitar estruturas secundárias de mRNA de grampo de cabelo previstas.

Seqüências de nucleotídeos para estimular expressão gênica também podem ser usadas nos vetores de expressão de plantas.

Estas incluem os introns do Adhl de milho, gene intronl (Callis et al.

Genes and 5 Development 1:1183-1200, 1987), e seqüências líder, (seqüência W) do Vírus do Mosaico de Tabaco (TMV), Vírus da Mancha Clorótica de Milho e Vírus do Mosaico de Alfafa (Gallie et al.Nucleic Acid Res.15:8693-8711, 1987 e Skuzeski et al.Plant Mol.Biol.15:65-79, 1990).O primeiro íntron do locus shrunken-1 de milho, foi mostrado aumentar expressão de genes em ^^10 construtos de gene quimérico.Patente Norte-Americana Nos.5.424.412 e 5.593.874 descreve o uso de introns específicos em construtos de expressão gênica, e Gallie et al.(Plant Physiol.106:929-939, 1994) também mostrou que introns são úteis para regular expressão gênica em uma base específica para tecido.

Para estimular adicionalmente ou para otimizar expressão gênica 15 de subunidade pequena de AHAS, os vetores de expressão de plantas da invenção também podem conter seqüências de DNA contendo regiões de interação com a matriz (MARs).

Células vegetais transformadas com tais sistemas de expressão modificados, então, podem exibir superexpressão ou expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos da invenção.

Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter seqüências líder 5' no construto de cassete de expressão.

Tais seqüências líder podem atuar para estimular tradução.

Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picomavírus, por exemplo, líder de EMCV (região não codificante 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al.(1989) 25 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus Etch do Tabaco) (Gallie et al.(1995) Gene 165(2):233- 238), líder de MDMV (Vírus do Mosaico do Nanismo de Milho) (Virology 154:9-20), e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al.(1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA de proteína de revestimento de virus do mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al.(1987) Nature 325:622-625); líder de virus do mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al.(1989) in Molecular Biology of RNA, ed.Cech (Liss, New York), pp.237-256); e líder de vírus da mancha clorótica de milho 5 (MCMV) (Lommel et al.(1991) Virology 81:382-385).Veja também, Della- Cioppa et al.(1987) Plant Physiol.84:965-968.

Outros métodos conhecidos por estimularem tradução também podem ser utilizados, por exemplo, introns, e os semelhantes.

Ao preparar o cassete de expressão, os vários fragmentos de 10 DNA podem ser manipulados, de forma a sustentar as seqüências de DNA na orientação apropriada e, se apropriado, no quadro de leitura apropriado.

Para este fim, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para sustentar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, 15 remoção de sítios de restrição, ou os semelhantes.

Para este propósito, mutagênese in vitro, reparo de iniciador, restrição, andamento, re- substituições, e.g., transições e transversões, podem estar envolvidos.

Diversos promotores podem ser usados na prática da invenção.

I Os promotores podem ser selecionados baseado no resultado desejado.

Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, tecido-preferidos, ou outros para expressão em plantas.

Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor do core do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descritos em WO 99/43838 e Patente Norte-Americana No.6.072.050; o 25 promotor do core CaMV 35S (Odell et al.(1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al.(1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al.(1989) Plant Mol.Biol.12:619-632 e Christensen et al.(1992) Plant Mol.Biol.18:675-689); pEMU (Last et al.(1991) Theor.AppL Genet.81:581-588); MAS (Velten et al.(1984) EMBO J.3:2723-2730); ^.IG T> promotor ALS (Patente Norte-Americana No.5.659.026), e os semelhantes.Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Patente Norte- Americana Nos.5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

Promotores tecido-específicos podem ser utilizados para direcionar expressão de AHASL 1 estimulada dentro de um tecido vegetal particular.

Tais promotores tecido-específicos incluem, mas não são limitados a, promotores preferidos por folha, promotores preferidos por raiz, promotores preferidos por semente, e promotores preferidos por caule.

Promotores tecido-específicos incluem Yamamoto et al.(1997) Plant J.12(2):255-265; Kawamata et al.(1997) Plant Cell Physiol.38(7):792-803; Hansen et al.(1997) Mol.Gen Genet.254(3):337-343; Russell et al.(1997) Transgenic Res.6(2): 157-168; Rinehart et al.(1996) Plant Physiol.112(3): 1331 -1341; Van Camp et al.(1996) Plant Physiol.112(2):525-535; 15 Canevascini et al.(1996) Plant Physiol.112(2):513-524; Yamamoto et al.(1994) Plant Cell Physiol.35(5):773-778; Lam (1994) Results ProbL Cell Differ.20:181196; Orozco et al.(1993) Plant Mol Biol.23(6): 1129-1138; Matsuoka et al.(1993) Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590; e I Guevara-Garcia et al.(1993) Plant J.4(3):495-505.

Tais promotores podem 20 ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos de interesse são direcionados para o cloroplasto para expressão.

Desta maneira, onde o ácido nucleico de interesse não é diretamente inserido no cloroplasto, O cassete de expressão irá adicionalmente conter uma seqüência tendo como 25 alvo cloroplasto compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar o produto de gene de interesse para os cloroplastos.

Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica.

Com respeito a seqüências tendo como alvo cloroplastos, "operavelmente ligadas" significa que a seqüência de ácidos nucleicos codificando um peptídeo de trânsito (i.e., a seqüência tendo como alvo cloroplasto) é ligada ao polinucleotideo AHASL da invenção de forma que as duas seqüências são contíguas e no mesmo quadro de leitura.

Veja, por exemplo, Von Heijne et al.(1991) Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126; Clark et al.(1989) J.Biol.Chem.264:17544-17550; Della-Cioppa et al.(1987) Plant Physiol.84:965-968; Romer et al.(1993) Biochem.Biophys.Res.Comnzun.196:1414-1421; e Shah et al.(1986) Science 233:478-481.

Embora as proteínas AHASL da invenção incluam um peptídeo de trânsito de cloroplasto nativo, qualquer peptídeo de trânsito de cloroplasto conhecido na técnica pode ser fusionado à seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL madura da invenção operavelmente ligando uma seqüência tendo como alvo cloroplasto à extremidade 5' de uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL madura da invenção.

Seqüências tendo como alvo cloroplasto são conhecidas na técnica e incluem a subunidade pequena de cloroplasto de ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al.(1996) Plant MoL Biol.30:769-780; Schnell et al.(1991)1 Biol.Chem.266(5):3335-3342); 5-(enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer et al.(1990) J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810); triptofano sintase (Zhao et al.(1995)1 Biol.Chem.270(11):6081-6087); plastocianina (Lawrence et al.(1997) Biol.Chem.272(33):20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al.(1993) J.Biol.Chem.268(36):27447-27457); e a proteína de ligação de clorofila coletora de luz a/b (LHBP) (Lamppa et al.(1988) J.Biol.Chem.263:14996-14999).Veja também Von Heijne et al.(1991) Plant MoL Biol.Rep.9:104126; Clark et al.(1989) J.Biol.Chem.264:17544-17550; Della-Cioppa et al.(1987) Plant Physiol.84:965-968; Romer et al.(1993) Biochem.Biophys.Res.COMMUll.196:1414-1421; e Shah et al.(1986) Science 233:478-481.Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica.Veja, por exemplo, Svab et al.(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913917; Svab and Maliga (1993) EMBO J.12:601-606.

O método se pauta em liberação por canhão de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e direcionando o DNA para o genoma de plastídeo através de 5 recombinação homóloga.

Adicionalmente, transformação de plastídeo pode ser realizada por transativação de um transgene silencioso gerado em plastídeo por expressão tecido-preferida de uma RNA polimerase nuclear- codificada e plastídeo-dirigida.

Um tal sistema foi relatado em McBride et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305.1 (T Os ácidos nucleicos de interesse a serem direcionados para o _ cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para considerar diferenças em uso de códon entre o núcleo vegetal e esta organela.

Desta maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos de cloroplasto.

Veja, por exemplo, Patente Norte- 15 Americana No.5.380.831, neste lugar incorporada por referência.

Como descrito neste lugar, as seqüências de nucleotídeos de AHASL da invenção encontram uso em estimular a tolerância a herbicida de plantas que compreendem em seus genomas um gene codificando uma F proteína AHASL tolerante a herbicida.

Um tal gene pode ser um gene 20 endógeno ou um transgene.

Adicionalmente, em certas formas de realização, as seqüências de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser sobrepostas com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeos de interesse a fim de criar plantas com um fenótipo desejado.

Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser sobrepostos com quaisquer 25 outros polinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo atividade de pesticida e/ou inseticida, tal como, por exemplo, as proteínas de toxina de Bacillus thuringiensis (descritas em Patente Norte-Americana Nos.5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al.(1986) Gene 48:109).

As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.

E reconhecido que com estas seqüências de nucleotídeos, construções anti-sentido, complementares a pelo menos uma porção do RNA mensageiro (mRNA) para as seqüências de polinucleotídeos de AHASL 5 podem ser construídas.

Nucleotídeos anti-sentido são construídos para hibridizar com o mRNA correspondente.

Modificações das seqüências anti- sentido podem ser feitas contanto que as seqüências hibridizem com e interfiram em expressão do mRNA correspondente.

Desta maneira, construções anti-sentido tendo 70%, preferivelmente 80%, mais 10* preferivelmente 85% de identidade de seqüência com as seqüências anti- sentido correspondentes podem ser usadas.

Além disso, porções dos nucleotídeos anti-sentido podem ser usadas para interromper a expressão do gene alvo.

Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, ou mais podem ser usadas.

As seqüências de nucleotídeos da presente invenção também podem ser usadas na orientação sentido para suprimir a expressão de genes endógenos em plantas.

Métodos para suprimir expressão gênica em plantas usando seqüências de nucleotídeos na orientação sentido são conhecidos na I técnica.

Os métodos geralmente envolvem transformar plantas com um 20 construto de DNA compreendendo um promotor que dirige expressão em uma planta operavelmente ligada à pelo menos uma porção de uma seqüência de nucleotídeos que corresponde ao transcrito do gene endógeno.

Tipicamente, uma tal seqüência de nucleotídeos tem identidade de seqüência substancial com a seqüência do transcrito do gene endógeno, preferivelmente maior do 25 que cerca de 65% de identidade de seqüência, mais preferivelmente maior do que cerca de 85% de identidade de seqüência, o mais preferivelmente maior do que cerca de 95% de identidade de seqüência.

Veja, Patente Norte- Americana Nos.5.283.184 e 5.034.323; neste lugar incorporadas por referência.

Embora os polinucleotídeos AHASLI resistentes a herbicida da invenção encontrem uso como genes marcadores selecionáveis para transformação vegetal, os cassetes de expressão da invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas.

Genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados.

Genes marcadores incluem, mas não são limitados a, genes codificando resistência a antibiótico, tal como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes conferindo 10 resistência a compostos de herbicida, tal como glufosinato de amónio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).

Veja geralmente, Yarranton (1992) Curr.Opin.Biotech.3:506-511; Christopherson et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6314-6318; Yao et al.(1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol.Microbiol.6:2419-2422; 15 Barkley et al.(1980) in The Operon, pp.177-220; Hu et al.(1987) Cell 48:555-566; Brown et al.(1987) Cell 49:603-612; Figge et al.(1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86:5400-5404; Fuerst et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549-2553; Deuschle et al.I (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D.Thesis, University of 20 Heidelberg; Reines et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1917-1921; Labow et al.(1990) Mol.Cell.Biol.10:3343-3356; Zambretti et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3952-3956; Bairn et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072-5076; Wyborski et al.(1991) Nucleic Acids Res.19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol.Struc.Biol.10:143 25 162; Degenkolb et al.(1991) Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595; Kleinschnidt et al.(1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D.Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551; Oliva et al.(1992) Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919; Hlavka et al.(1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al.(1988) Nature 334:721-724.

Tais descrições são neste lugar incorporadas por referência.

A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é pretendida para ser limitante.

Qualquer gene marcador selecionável pode ser 5 usado na presente invenção.

As moléculas isoladas de polinucleotideo compreendendo seqüência de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL da invenção podem ser usadas em vetores para transformar plantas de forma que as plantas criadas têm resistência estimulada para herbicidas, particularmente herbicidas lθ de imidazolinona.

As moléculas isoladas de polinucleotideo AHASL da invenção podem ser usadas em vetores apenas ou em combinação com uma seqüência de nucleotídeos codificando a subunidade pequena da enzima AHAS (AHASS) para conferir resistência a herbicida em plantas.

Veja, Patente Norte-Americana No.6.348.643; que é neste lugar incorporada por 15 referência.

A invenção também se refere a um vetor de expressão de planta compreendendo um promotor que dirige expressão em uma planta operavelmente ligada a uma molécula isolada de polinucleotideo da invenção.

I A molécula isolada de polinucleotideo compreende uma seqüência de 20 nucleotídeos codificando uma proteína AHASL, particularmente uma proteína AHASL compreendendo uma seqüência amino que é apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 4, ou um fragmento funcional e variante desta.

O vetor de expressão de planta da invenção não depende de um promotor particular, apenas que um tal promotor seja capaz de dirigir expressão gênica em uma célula vegetal.

Promotores preferidos incluem promotores constitutivos e promotores tecido- específicos.

Os vetores de transformação da invenção podem ser usados para produzir plantas transformadas com um gene de interesse.

O vetor de transformação irá compreender um gene marcador selecionável da invenção e um gene de interesse a ser introduzido e tipicamente expresso na planta transformada.

Um tal gene marcador selecionável compreende um polinucleotídeo AHASL resistente a herbicida da invenção operavelmente ligado a um promotor que dirige expressão em uma célula hospedeira.

Para 5 uso em plantas e células vegetais, o vetor de transformação compreende um gene marcador selecionável compreendendo um polinucleotídeo AHASL resistente a herbicida da invenção operavelmente ligado a um promotor que dirige expressão em uma célula vegetal.

Os genes de interesse da invenção variam dependendo do 19 resultado desejado.

Por exemplo, várias mudanças em fenótipo podem ser de interesse incluindo modificar a composição de ácidos graxos em uma planta, alterar o teor de aminoácidos de uma planta, alterar mecanismos de defesa contra inseto e/ou patógeno de uma planta, e os semelhantes.

Estes resultados podem ser atingidos fornecendo expressão de produtos heterólogos ou 15 expressão aumentada de produtos endógenos em plantas.

Alternativamente, os resultados podem ser atingidos sustentando uma redução de expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou cofatores na planta.

Estas mudanças resultam em uma mudança em fenótipo da planta I transformada.

Em uma forma de realização da invenção, os genes de interesse incluem genes de resistência a inseto tal como, por exemplo, genes de proteína de toxina de Bacillus thuringiensis (Patente Norte-Americana Nos.5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al.(1986) Gene 48:109).

As proteínas ou polipeptídeos AHASL da invenção podem ser purificadas a partir de, por exemplo, plantas de girassol e podem ser usadas em composições.

Também, uma molécula isolada de polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL da invenção pode ser usada para expressar uma proteína AHASL da invenção em um micróbio tal como E.coli ou uma levedura.

A proteína AHASL expressa pode ser purificada a partir de extratos de E.coli ou levedura por qualquer método conhecido por aqueles de habitual verso na técnica.

A invenção também se refere a um método para criar uma 5 planta transgênica que é resistente a herbicidas, compreendendo transformar uma planta com um vetor de expressão de planta compreendendo um promotor que dirige expressão em uma planta operavelmente ligada a uma molécula isolada de polinucleotideo da invenção.

A molécula isolada de polinucleotideo compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando uma 10 proteína AHASL da invenção, particularmente uma proteína AHASL compreendendo: uma seqüência amino que é apresentada em SEQ ID NO: 2, uma seqüência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional e variante de ditas seqüências de aminoácidos.

A invenção também se refere às plantas não transgênicas de 15 girassol, plantas transgênicas produzidas pelos métodos da invenção, e progénie e outros descendentes de tais plantas não transgênicas e transgênicas, cujas plantas exibem resistência estimulada ou aumentada para herbicidas que interferem na enzima AHAS, particularmente herbicidas de I imidazolinona e sulfoniluréia.

Os polinucleotídeos AHASL da invenção, particularmente aqueles codificando proteínas AHASL resistentes a herbicida, encontram uso em métodos para estimular a resistência de plantas tolerantes a herbicida.

Em uma forma de realização da invenção, as plantas tolerantes a herbicida compreendem uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a 25 herbicida.

As plantas tolerantes a herbicida incluem tanto plantas transformadas com uma seqüência de nucleotídeos de AHASL tolerante a herbicida como plantas que compreendem em seus genomas um gene endógeno que codifica uma proteína AHASL tolerante a herbicida.

Seqüências de nucleotídeos codificando proteínas AHASL tolerantes a herbicida e plantas tolerantes a herbicida compreendendo um gene endógeno que codifica uma proteína AHASL tolerante a herbicida incluem os polinucleotídeos e plantas da presente invenção e aqueles que são conhecidos na técnica.

Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos.5.013.659, 5 5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796; todas as quais são neste lugar incorporadas por referência.

Tais métodos para estimular a resistência de plantas tolerantes a herbicida compreendem transformar uma planta tolerante a herbicida com pelo menos uma construção de polinucleotídeo compreendendo um promotor que dirige 16 expressão em uma célula vegetal que é operavelmente ligado a um polinucleotídeo AHASL resistente a herbicida da invenção, particularmente o polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL resistente a herbicida apresentada em SEQ 1D NO: 1, polinucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, e fragmentos e variantes ditos 15 polinucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida.

Numerosos vetores de transformação vegetal e métodos para transformar plantas estão disponíveis.

Veja, por exemplo, An, G.et al.(1986) ) Plant Pysiol., 81:301-305; Fry, J, et al.(1987) Plant Cell Rep.6:321-325; 20 Block, M.(1988) Theor.Appl.Genet.76:767-774; Hinchee, et al.(1990) Stadler.Genet.Symp.203212.203-212; Cousins, et al.(1991) Aust.J.Plant Physiol.18:481-494; Chee, P.P.and Slightom, J.L.(1992) Gene.118:255- 260; Christou, et al.(1992) Trends.Biotechnol.10:239-246; D'Halluin, et al.(1992) Bio/Technol.10:309-314; Dhir, et al.(1992) Plant Physiol.99:81-88; 25 Casas et al.(1993) Proc.Nat.Acad Sci.USA 90:11212-11216; Christou, P.(1993) In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant; 29P:119-124; Davies, et al.(1993) Plant Cell Rep.12:180-183; Dong, J.A.and Mchughen, A.(1993) Plant Sci.91:139-148; Franklin, C.I.and Trieu, T.N.(1993) Plant.Physiol.102:167; Golovkin, et al.(1993) Plant Sci.90:41-52; Guo Chin Sci.Bull.38:2072- 2078; Asano, et al.(1994) Plant Cell Rep.13; Ayeres N.M.and Park, W.D.(1994) Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239; Barcelo, et al.(1994) Plant.J.5:583-592; Becker, et al.(1994) Plant.J.5:299-307; Borkowska et al.(1994) Acta.Physiol Plant.16:225-230; Christou, P.(1994) Agro.Food.Ind.Hi 5 Tech.5: 17-27; Eapen et al.(1994) Plant Cell Rep.13:582-586; Hartman, et al.(1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al.(1994) Plant.Mol.Biol.24:317-325; e Wan, Y.C.and Lemaux, P.G.(1994) Plant Physiol.104:3748.

Os métodos da invenção envolvem introduzir um construto de polinucleotídeo em uma planta.

Por "introduzir" é pretendido apresentar à 10 planta o construto de polinucleotídeo de uma maneira tal que o construto ganhe acesso ao interior de uma célula da planta.

Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir um construto de polinucleotídeo para uma planta, apenas que o construto de polinucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta.

Métodos para 15 introduzir construtos de polinucleotídeos em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transitória, e métodos mediados por vírus.

Por "transformação estável" é pretendido que o construto de I polinucleotídeo introduzido em uma planta se integre no genoma da planta e 20 seja capaz de ser herdado por progénie desta.

Por "transformação transitória" é pretendido que um construto de polinucleotídeo introduzido em uma planta não se integre no genoma da planta.

Para a transformação de plantas e células vegetais, as seqüências de nucleotídeos da invenção são inseridas usando técnicas padrão 25 em qualquer vetor conhecido na técnica que é adequado para expressão das seqüências de nucleotídeos em uma planta ou célula vegetal.

A seleção do vetor depende da técnica de transformação preferida e da espécie de planta alvo a ser transformada.

Em uma forma de realização da invenção, uma seqüência de nucleotídeos de AHASL 1 é operavelmente ligada a um promotor vegetal que é conhecido por expressão de alto nível em uma célula vegetal, e este construto é então introduzido em uma planta que é susceptível a um herbicida de imidazolinona e uma planta transformada é regenerada.

A planta transformada é tolerante a exposição a um nível de um herbicida de 5 imidazolinona que iria matar ou significantemente prejudicar uma planta não transformada.

Este método pode ser aplicado a qualquer espécie de planta; entretanto, ele é mais benéfico quando aplicado a plantas cultivadas.

Metodologias para construir cassetes de expressão de plantas e introduzir ácidos nucleicos exógenos em plantas são geralmente conhecidas 1Q na técnica e foram previamente descritas.

Por exemplo, DNA exógeno pode ser introduzido em plantas, usando plasmídeos vetores indutores de tumor (Ti).

Outros métodos utilizados para liberação de DNA exógeno envolvem o uso de transformação de protoplasto mediada por PEG, eletroporação, filmes de microinjeção, e biolísticas ou bombardeamento de microprojétil para 15 absorção direta de DNA.

Tais métodos são conhecidos na técnica.(Patente Norte-Americana No.5.405.765 para Vasil et al.; Bilang et al.(1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mol.Gen.Genet., 228: 104-112; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987) Theor.AppL ) Genet.75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., 20 (1980) Science 208:1265; Horsch et al..(1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc.(1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc.(1989).

O método de transformação depende da célula 25 vegetal a ser transformada, estabilidade de vetores usados, nível de expressão de produtos de gene e outros parâmetros.

Outros métodos adequados de introduzir seqüências de nucleotídeos em células vegetais e subseqüente inserção no genoma vegetal incluem microinjeção como Crossway et al.(1986) Biotechniques 4:320-334, 64 J> eletroporaçào como descrito por Riggs et al.(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium como descrito por Townsend et al..Patente Norte-Americana No.5.563.055, Zhao et al., Patente Norte-Americana No.5.981.840, transferência gênica direta como 5 descrito por Paszkowski et al.(1984) EMBO J 3:2717-2722, e aceleração de partícula balística como descrito em, por exemplo, Sanford et al., Patente Norte-Americana No.4.945.050; Tomes et al., Patente Norte-Americana No.5,879,918; Tomes et al., Patente Norte-Americana No.5.886.244; Bidney et al., Patente Norte-Americana No.5.932.782; Tomes et al.(1995) "Direct 10 DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed.Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al.(1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Led (WO 00/28058).Também veja, Weissinger et al.(1988) Ann.Rev.Genet.22:421-477; Sanford et al.(1987) 15 Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al.(1988) Plant Physiol.87:671-674 (soja); McCabe et al.(1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P: 175-182 (soja); Singh et al.(1998) Theor.Appl.Genet.96:319-324 ) (soja); Datta et al.(1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al.20 (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al.(1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); Tomes, Patente Norte-Americana No.5.240.855; Buising et al., Patente Norte-Americana Nos.5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al.(1995) 'Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: 25 Fundamental Methods, ed.Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (milho); Klein et al.(1988) Plant Physiol.91:440-444 (milho); Fromm et al.(1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., Patente Norte-Americana No.5.736.369 (cereais); Bytebier et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al.(1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.Chapman et al.(Longman, New York), pp.197-209 (pólen); Kaeppler et al.(1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al.(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566 (transformação 5 mediada por filme); D'Halluin et al.(1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al.(1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:40 7 -413 (arroz); Osjoda et al.(1996) Nature Biotechnology’ 14:745-750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são neste lugar incorporados por referência.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser introduzidos em plantas colocando em contato plantas com um vírus ou ácidos nucleicos virais.

Geralmente, tais métodos envolvem incorporar um construto de polinucleotídeo da invenção dentro de uma molécula de DNA ou RN A virai.

É reconhecido que a proteína AHASL da invenção pode ser inicialmente 15 sintetizada como parte de uma poliproteína virai, que pode ser depois processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada.

Ademais, é reconhecido que promotores da invenção também abrangem promotores utilizados para transcrição por RNA ) polimerases virais.

Métodos para introduzir construtos de polinucleotídeos em 20 plantas e expressar uma proteína codificada nesse, envolvendo moléculas de DNA ou RNA virai, são conhecidos na técnica.

Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos.5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; neste lugar incorporadas por referência.

As células que foram transformadas podem ser crescidas em 25 plantas em conformidade com meios convencionais.

Veja, por exemplo, McCormick et al.(1986) Plant Cell Reports 5:81-84.

Estas plantas podem então ser crescidas, e ou polinizadas com a mesma linhagem transformada ou linhagens diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada.

Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e então sementes coletadas para assegurar expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida.

Desta maneira, a presente invenção fornece semente transformada (também 5 referida como "semente transgênica") tendo um construto de polinucleotideo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado no seu genoma.

A presente invenção pode ser usada para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitada a, monocotiledôneas e 10 dicotiledôneas.

Exemplos de espécies de planta de interesse incluem, mas não são limitados a, cereal ou milho (Zea mays), Brassica sp.(e.g., B.napus, B.rapa, B.juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorgo bicolor.Sorgo vulgare), milheto (e.g., 15 milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto miúdo (Panicum tniliaceum), painço português (Setaria italica), capim pé-de-galinha (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivuin, T Turgidum ssp.durum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana I tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), 20 algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga 25 (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), castanha (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterrabas açucareiras (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveias, cevada, hortaliças, ornamentais, e coníferas.

Preferivelmente, plantas da presente invenção são plantas cultivadas (por exemplo, girassol, Brassica sp., algodão, beterraba açucareira, soja, amendoim, alfafa, açafrão, tabaco, milho, arroz, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, milheto, etc.).

As plantas resistentes a herbicida da invenção encontram uso 5 em métodos para controlar ervas daninhas.

Assim, a presente invenção fornece adicionalmente um método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta resistente a herbicida da invenção.

O método compreende aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida às ervas daninhas e à planta resistente a herbicida, caracterizado pelo fato de que a planta tem 10 resistência aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia, quando comparado a uma planta tipo selvagem.

Em um tal método para controlar ervas daninhas, as plantas resistentes a herbicida da invenção são preferivelmente plantas cultivadas, incluindo, mas não limitadas a, girassol, alfafa, Brassica sp., soja, algodão, 15 açafrão, amendoim, tabaco, tomate, batata, trigo, arroz, milho, sorgo, cevada, centeio, milheto, e sorgo.

Fornecendo plantas tendo resistência aumentada para herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia, uma I ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger plantas de 20 ervas daninhas, assim como para estimular crescimento vegetal e reduzir competição por nutrientes.

Um herbicida pode ser usado por si só para pré- emergência, pós-emergência, controle pré-plantio e em plantio de ervas daninhas em áreas circundando as plantas descritas neste lugar ou pode ser usada uma formulação de herbicida de imidazolinona que contém outros 25 aditivos.

O herbicida também pode ser usado como um tratamento de semente.

Aditivos encontrados em uma formulação de herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de adesão, agentes estabilizantes, ou os semelhantes.

A formulação de herbicida pode ser uma preparação úmida ou seca e pode incluir, mas não é limitada a, pós dispersáveis, concentrados emulsionáveis e concentrados líquidos.

O herbicida e formulações de herbicida podem ser aplicados em conformidade com métodos convencionais, por exemplo, pulverizando, irrigando, 5 polvilhando, ou os semelhantes.

A presente invenção fornece sementes não transgênicas e transgênicas com tolerância aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida inibindo AHAS, mais particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia.

Tais sementes incluem, por 10 exemplo, sementes não transgênicas de girassol compreendendo as características de tolerância a herbicida da planta de girassol S4897, a planta de girassol GM40, a planta de girassol GM1606, a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606, e sementes 15 transgênicas compreendendo uma molécula de polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína AHASL resistente a herbicida.

A presente invenção fornece métodos para produzir uma planta resistente a herbicida, particularmente uma planta de girassol resistente ) a herbicida, através de melhoramento vegetal convencional envolvendo 20 reprodução sexual.

Os métodos compreendem cruzar uma primeira planta que é resistente a um herbicida com uma segunda planta que não é resistente ao herbicida.

A primeira planta pode ser qualquer das plantas resistentes a herbicida da presente invenção incluindo, por exemplo, plantas transgênicas compreendendo pelo menos uma das moléculas de polinucleotídeos da 25 presente invenção que codificam uma proteína AHASL resistente a herbicida e plantas não transgênicas de girassol que compreendem as características de tolerância a herbicida da planta de girassol S4897, a planta de girassol GM40, a planta de girassol GM1606, a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606.

A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas de progénie viáveis (i.e., sementes) quando cruzadas com a primeira planta.

Tipicamente, mas nào necessariamente, a primeira e segunda planta são da mesma espécie.

Os 5 métodos da invenção podem envolver adicionalmente uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas de progénie do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo que ou a primeira ou segunda planta.

Altemativamente, a progénie do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subseqüente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de 1-0 uma linhagem ou genótipo diferente do que ou a primeira ou segunda planta.

Os métodos da invenção adicionalmente podem envolver selecionar plantas que compreendem as características de tolerância a herbicida da primeira planta.

A presente invenção fornece adicionalmente métodos para 15 aumentar a resistência a herbicida de uma planta, particularmente uma planta de girassol resistente a herbicida, através de melhoramento vegetal convencional envolvendo reprodução sexual.

Os métodos compreendem cruzar uma primeira planta que é resistente a um herbicida com uma segunda I planta que pode ou não ser resistente ao herbicida ou pode ser resistente a 20 herbicida ou herbicidas diferentes do que a primeira planta.

A primeira planta pode ser qualquer das plantas resistentes a herbicida da presente invenção incluindo, por exemplo, plantas transgênicas compreendendo pelo menos uma das moléculas de polinucleotídeos da presente invenção que codificam uma proteína AHASL resistente a herbicida e plantas de girassol não transgênicas 25 que compreendem as características de tolerância a herbicida da planta de girassol S4897, a planta de girassol GM40, a planta de girassol GM1606, a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA- 7606.

A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas de progénie viáveis (i.e., sementes) quando cruzada com a primeira planta.

Tipicamente, mas nào necessariamente, a primeira e segunda planta são da mesma espécie.

As plantas de progénie produzidas por este método da presente invenção têm resistência aumentada para um herbicida quando 5 comparadas com ou a primeira ou segunda planta ou ambas.

Quando a primeira e segunda planta são resistentes a herbicidas diferentes, as plantas de progénie terão as características de tolerância a herbicidas da primeira e segunda planta combinadas.

Os métodos da invenção podem envolver adicionalmente uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas de 10 progénie do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo que ou a primeira ou segunda planta.

Altemativamente, a progénie do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subseqüente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que ou a primeira ou segunda planta.

Os métodos da invenção podem 15 envolver adicionalmente selecionar plantas que compreendem as características de tolerância a herbicida da primeira planta, da segunda planta, ou tanto da primeira como da segunda planta.

As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ou não transgênicas.

Um exemplo de uma planta de girassol não transgênica 20 tendo resistência aumentada para imidazolinona é a planta de girassol S4897, a planta de girassol GM40, a planta de girassol GM1606, a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606; ou mutante, recombinante, ou um derivado geneticamente modificado da planta 25 de girassol S4897, a planta de girassol GM40, a planta de girassol GM1606, a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou a planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA- 7606; ou de qualquer progénie da planta de girassol S4897, da planta de girassol GM40, da planta de girassol GM1606, da planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou da planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606; ou uma planta que é uma progénie de qualquer destas plantas; ou uma planta que compreende as características de tolerância a herbicida da planta de girassol S4897, da planta 5 de girassol GM40, da planta de girassol GM1606, da planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou da planta de girassol com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606.

A presente invenção também fornece plantas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não 10 humanas que são transformadas com a pelo menos uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão, ou vetor de transformação da invenção.

Tais plantas transformadas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas têm tolerância ou resistência estimulada para pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matam 15 ou inibem o crescimento de uma planta não transformada, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira não humana, respectivamente.

Preferivelmente, as plantas transformadas, tecidos vegetais, células vegetais, e sementes da invenção são Arabidopsis thaliana e plantas cultivadas.) A presente invenção fornece métodos que envolvem o uso de 20 pelo menos um herbicida inibindo AHAS selecionado a partir do grupo consistindo de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfoniluréia, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona, e misturas destes.

Nestes métodos, o herbicida inibindo AHAS pode ser aplicado por qualquer método 25 conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a, tratamento de semente, tratamento de solo, e tratamento foliar.

Antes de aplicação, o herbicida inibindo AHAS pode ser convertido nas formulações habituais, por exemplo soluções, emulsões, suspensões, polvilhos, pós, pastas e grânulos.

A forma de uso depende do propósito pretendido particular; em cada caso, ela deve assegurar uma fina e igual distribuição do composto de acordo com a invenção.

As formulações são preparadas de uma maneira conhecida (veja e.g.para revisão Patente Norte-Americana 3.060.084, Patente Européia- A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec.4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 e et seq.WO 91/13546, Patente Norte-Americana 4.172.714, Patente Norte-Americana 4.144.050, Patente Norte-Americana 3.920.442, Patente Norte-Americana 5.180.587, Patente Norte-Americana 5.232.701, Patente Norte-Americana 5.208.030, Patente Britânica 2.095.558, Patente Norte-Americana 3.299.566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 e Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2.D.A.Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por exemplo estendendo o composto ativo com auxiliares adequados para a formulação de agroquímicos, tal como solventes e/ou carreadores, se desejado emulsificantes, surfactantes e dispersantes, conservantes, agentes antiespumantes, agentes anticongelantes, para formulação de tratamento de semente também opcionalmente corantes e/ou ligantes e/ou agentes geleificantes.

Exemplos de solventes adequados são água, solventes aromáticos (por exemplo produtos de Solvesso, xileno), parafinas (por exemplo frações de óleo mineral), álcoois (por exemplo metanol, butanol, pentanol, benzil álcool), cetonas (por exemplo ciclohexanona, gama- butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (glicol diacetato), glicóis, dimetilamidas de ácido graxo, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo.

Em princípio, misturas de solventes também podem ser usadas.

Exemplos de carreadores adequados são minerais naturais do solo (por exemplo caolinas, argilas, talco, giz) e minerais sintéticos do solo (por exemplo sílica altamente dispersa, silicatos).

Emulsificantes adequados são emulsificantes não iônicos e aniônicos (por exemplo éteres de álcool graxo de polioxietileno, alquilsulfonatos e arilsulfonatos).

Exemplos de dispersantes são licores residuais de lignina- sulfito e metilcelulose.

Surfactantes adequados são metal alcalino, metal alcalino terroso e sais de amônio de ácido lignosulfônico, ácido naftalenosulfônico, ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftalenosulfônico, alquilarilsulfonatos, alquil sulfatos, alquilsulfonatos, sulfatos de álcool graxo, ácidos graxos e glicol éteres de álcool graxo sulfatado, além disso condensados de naftaleno 15 sulfonado e derivados de naftaleno com formaldeído, condensados de naftaleno ou de ácido naftalenosulfônico com fenol e formaldeído, polioxietileno octilfenol éter, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, alquilfenol poliglicol éteres, tributilfenil poliglicol éter, tristearilfenil ) poliglicol éter, alquilaril poliéter álcoois, condensados de óxido de etileno de 20 álcool e álcool graxo, óleo de ricínio etoxilado, polioxietileno alquil éteres, polioxipropileno etoxilado, lauril álcool poliglicol éter acetal, sorbitol ésteres, licores residuais de lignosulfito e metilcelulose.

Substâncias que são adequadas para a preparação de soluções, emulsões, pastas ou dispersões oleosas pulverizáveis diretamente são frações 25 de óleo mineral de ponto de ebulição médio a alto, tal como querosene ou óleo diesel, além disso óleos de piche de carvão e óleos de origem vegetal ou animal, hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo tolueno, xileno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados ou seus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclohexanol, ciclohexanona, isoforona, solventes altamente polares, por exemplo dimetil sulfóxido, N- metilpirrolidona ou água.

Também agentes anticongelantes tal como glicerina, etilenoglicol, propilenoglicol e bactericidas tal como podem ser adicionados à 5 formulação.

Agentes antiespumantes adequados são por exemplo agentes antiespumantes baseados em silicone ou estearato de magnésio.

Conservantes adequados são por exemplo Diclorofeno e enzilalcoolhemiformal.

Formulações de tratamento de semente podem adicionalmente compreender ligantes e opcionalmente corantes.

Ligantes podem ser adicionados para melhorar a adesão dos materiais ativos nas sementes depois de tratamento.

Ligantes adequados são copolímeros de bloqueio EO/PO surfactantes mas também álcoois de polivinil, 15 polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietilenoaminas, polietilenoaminas, polietilenoiminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos, polivinilacetato, tilose e copolímeros derivados destes polímeros.) Opcionalmente, também corantes podem ser incluídos na 20 formulação.

Corantes ou tinturas adequadas para formulações de tratamento de semente são Rodamina B, C.I.Pigmento Vermelho 112, C.I.Solvente Vermelho 1, pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarelo 1, pigmento amarelo 13, pigmento vermelho 112, pigmento vermelho 48:2, pigmento 25 vermelho 48:1, pigmento vermelho 57:1, pigmento vermelho 53:1, pigmento laranja 43, pigmento laranja 34, pigmento laranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento branco 6, pigmento marrom 25, violeta básico 10, violeta básico 49, vermelho ácido 51, vermelho ácido 52, vermelho ácido 14, azul ácido 9, amarelo ácido 23, vermelho básico 10, vermelho básico 108. Um exemplo de um agente geleificante adequado é carragenano (Satiagel).

Pós, materiais para espalhamento, e produtos polvilháveis podem ser preparados misturando ou concomitantemente moendo as 5 substâncias ativas com um carreador sólido.

Grânulos, por exemplo grânulos revestidos, grânulos impregnados e grânulos homogêneos, podem ser preparados ligando os compostos ativos a carreadores sólidos.

Exemplos de carreadores sólidos são terras minerais mineral tal como géis de sílica, silicatos, talco, caolina, 10 “attaclay”, pedra calcária, cal, giz, fuste, limo argilo-calcário, argila, dolomita, terra diatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéticos do solo, fertilizantes, tal como, por exemplo, sulfato de amónio, fosfato de amónio, nitrato de amónio, uréias, e produtos de origem vegetal, tal como farelo de cereal, farelo de casca de árvore, farelo de 15 madeira e farelo de casca de noz, pós de celulose e outros carreadores sólidos.

Em geral, as formulações compreendem de 0,01 a 95% em peso, preferivelmente de 0,1 a 90% em peso, do herbicida inibindo AHAS.

Neste caso, os herbicidas inibindo AHAS são empregados em uma pureza de I a partir de 90% a 100% em peso, preferivelmente 95% a 100% em peso (de 20 acordo com espectro de NMR).

Para propósitos de tratamento de semente, respectivas formulações podem ser diluídas 2-10 vezes levando a concentrações nas preparações prontas para uso de 0,01 a 60% em peso de composto ativo em peso, preferivelmente 0,1 a 40% em peso.

O herbicida inibindo AHAS pode ser usado como tal, na forma 25 de suas formulações ou as formas de uso preparadas a partir destas, por exemplo na forma de soluções, pós, suspensões ou dispersões diretamente pulverizáveis, emulsões, dispersões oleosas, pastas, produtos polvilháveis, materiais para espalhamento, ou grânulos, por meio de pulverização, atomização, polvilhamento, espalhamento ou derramamento.

As formas de uso dependem inteiramente dos propósitos pretendidos; elas são pretendidas para assegurar em cada caso a melhor distribuição possível do herbicida inibindo AHAS de acordo com a invenção.

Formas de uso aquosas podem ser preparadas a partir de 5 concentrados de emulsão, pastas ou pós molháveis (pós pulverizáveis, dispersões oleosas) adicionando água.

Para preparar emulsões, pastas ou dispersões oleosas, as substâncias, como tal ou dissolvidas em um óleo ou solvente, podem ser homogeneizadas em água por meio de um umectante, taquificante, dispersante ou emulsificante.

Entretanto, também é possível 10 preparar concentrados compostos de substância ativa, umectante, taquificante, dispersante ou emulsificante e, se apropriado, solvente ou óleo, e tais concentrados são adequados para diluição com água.

As concentrações do composto ativo nas preparações prontas para uso podem ser variadas dentro de extensões relativamente amplas.

Em 15 geral, elas são de 0,0001 a 10%, preferivelmente de 0,01 a 1% em peso.

O herbicida inibindo AHAS também pode ser usado com sucesso no processo de volume ultra baixo (ULV), sendo possível aplicar formulações compreendendo mais de 95% em peso de composto ativo, ou ) mesmo aplicar o composto ativo sem aditivos.

Os seguintes são 20 exemplos de formulações: 1.

Produtos para diluição com água para aplicações foliares.

Para propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados à semente diluídos ou não diluídos.

A) Concentrados solúveis em água (SL, LS) 25 Dez partes em peso do herbicida inibindo AHAS são dissolvidas em 90 partes em peso de água ou um solvente solúvel em água.

Como uma alternativa, umectantes ou outros auxiliares são adicionados.

O herbicida inibindo AHAS dissolve com diluição com água, por meio do que uma formulação com 10 % (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

B) Concentrados dispersáveis (DC) Vinte partes em peso do herbicida inibindo AHAS são dissolvidas em 70 partes em peso de ciclohexanona com adição de 10 partes em peso de um dispersante, por exemplo polivinilpirrolidona.

Diluição com 5 água fornece uma dispersão, por meio do que uma formulação com 20% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

C) Concentrados emulsionáveis (EC) Quinze partes em peso do herbicida inibindo AHAS são dissolvidas em 7 partes em peso de xileno com adição de 10 dodecilbenzenosulfonato de cálcio e óleo de ricínio etoxilado (em cada caso 5 partes em peso).

Diluição com água fornece uma emulsão, por meio do que uma formulação com 15% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

D) Emulsões (EW, EO, ES) Vinte e cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS são 15 dissolvidas em 35 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenosulfonato de cálcio e óleo de ricínio etoxilado (em cada caso 5 partes em peso).

Esta mistura é introduzida em 30 partes em peso de água por meio de uma máquina emulsificante (e.g.Ultraturrax) e feita em uma emulsão I homogênea.

Diluição com água fornece uma emulsão, por meio do que uma 20 formulação com 25% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

E) Suspensões (SC, OD, FS) Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibindo AHAS são fracionadas com adição de 10 partes em peso de dispersantes, umectantes e 70 partes em peso de água ou de um solvente 25 orgânico para gerar uma suspensão fina do herbicida inibindo AHAS.

Diluição com água fornece uma suspensão estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com 20% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

F) Grânulos dispersáveis em água e grânulos solúveis em água (WG, SG) Cinqüenta partes em peso do herbicida inibindo AHAS são finamente moídas com adição de 50 partes em peso de dispersantes e umectantes e feitas como grânulos dispersáveis em água ou solúveis em água 5 por meio de ferramentas técnicas (por exemplo extrusão, torre de pulverização, cama fluidizada).

Diluição com água fornece uma dispersão ou solução estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com 50% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

G) Pós dispersáveis em água e pós solúveis em água (WP, SP, 10 SS, WS) Setenta e cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS são moídas em um moinho de rotor-estator com adição de 25 partes em peso de dispersantes, umectantes e gel de sílica.

Diluição com água fornece uma dispersão ou solução estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que 15 uma formulação com 75% (w/w) dc herbicida inibindo AHAS c obtida.

I) Formulação de Gel (GF) Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibindo AHAS são fracionadas com adição de 10 partes em peso de ) dispersantes, 1 parte em peso de umectantes de um agente geleificante e 70 20 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para gerar uma suspensão fina do herbicida inibindo AHAS.

Diluição com água fornece uma suspensão estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com 20% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

Esta formulação de gel é adequada para uso como um tratamento de semente 25 2.

Produtos para serem aplicados não diluídos para aplicações foliares.

Para propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados à semente diluídos.

A) Pós polvilháveis (DP, DS) Cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS são finamente moídas e misturadas intimamente com 95 partes em peso de caolina finamente dividida.

Isto fornece um produto polvilhável tendo 5% (w/w) de herbicida inibindo AHAS.

B) Grânulos (GR, FG, GG, MG) 5 Meia parte em peso do herbicida inibindo AHAS é fmamente moída e associada com 95,5 partes em peso de carreadores, por meio do que uma formulação com 0,5% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

Métodos atuais são extrusão, secagem por pulverizador ou a cama fluidizada.

Isto fornece grânulos para serem aplicados não diluídos para uso foliar.

Formulações convencionais de tratamento de semente incluem por exemplo concentrados dispersáveis FS, soluções LS, pós para tratamento seco DS, pós dispersáveis em água para tratamento pastoso WS, pós solúveis em água SS e emulsão ES e EC e formulação de gel GF.

Estas formulações podem ser aplicadas à semente diluídas ou não diluídas.

Aplicação às sementes é realizada antes de semear, ou diretamente nas sementes.

Em uma forma de realização preferida uma formulação FS é usada para tratamento de semente.

Tipicamente, uma formulação FS pode compreender 1-800 g/1 de ingrediente ativo, 1-200 g/1 de Surfactante, 0 a 200 | g/1 de agente anticongelante, 0 a 400 g/1 de ligante, 0 a 200 g/1 de um 20 pigmento e até 1 litro de um solvente, preferivelmente água.

As sementes não transgênicas e transgênicas da presente invenção das plantas resistentes a herbicida da presente invenção.

Tais sementes incluem, por exemplo, sementes de girassol não transgênicas compreendendo as características de tolerância a herbicida da planta com 25 Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, e sementes transgênicas compreendendo uma molécula de polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína IMI.

Para tratamento de semente, sementes das plantas resistentes a herbicida de acordo com a presente invenção são tratadas com herbicidas, preferivelmente herbicidas selecionados a partir do grupo consistindo de herbicidas inibindo AHAS tal como amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfiiron, flupirsulfiiron, foramsulfiiron, 5 halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfíiron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, 10 diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid, piritiobac, e misturas destes, ou com uma formulação compreendendo um herbicida inibindo AHAS.

O termo tratamento de semente compreende todas as técnicas 15 adequadas de tratamento de semente conhecidas na técnica, tal como tratamento de sementes, recobrimento de sementes, polvilhamento de sementes, embebição de sementes, e peletização de sementes.

Em conformidade com uma variante da presente invenção, um ) assunto adicional da invenção é um método de tratar solo pela aplicação, em 20 particular na semeadora: ou de uma formulação granular contendo o herbicida inibindo AHAS como uma composição/formulação (e.g.uma formulação granular, com opcionalmente um ou mais carreadores sólidos ou líquidos, agricolamente aceitáveis e/ou opcionalmente com um ou mais surfactantes agricolamente aceitáveis).

Este método é vantajosamente empregado, por 25 exemplo, em canteiros de cereais, milho, algodão, e girassol.

A presente invenção também compreende sementes revestidas com ou contendo com uma formulação de tratamento de semente compreendendo pelo menos um herbicida inibindo AHAS selecionado a partir do grupo consistindo de amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfiiron, ciclosulfamuron, etametsulfiiron, etoxisulfiiron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfiiron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, 5 sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosu Huron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid e piritiobac.

O termo semente inclui sementes e propágulos vegetais de todos os tipos incluindo mas não limitados a sementes verdadeiras, pedaços de semente, brotos secundários, cormos, bulbos, fruto, tubérculos, grãos, estacas, ramos cortados e os semelhantes e significa em uma forma de realização preferida sementes verdadeiras.

O termo "revestida com e/ou contendo" geralmente significa que o ingrediente ativo está para a maior parte na superfície do produto de propagação no momento de aplicação, embora uma parte maior ou menor do ingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do método I de aplicação.

Quando o dito produto de propagação é (re)plantado, ele pode 20 absorver o ingrediente ativo.

A aplicação de tratamento de semente com o herbicida inibindo AHAS ou com uma formulação compreendendo o herbicida inibindo AHAS é realizada pulverizando ou polvilhando as sementes antes de semeadura das plantas e antes de emergência das plantas.

No tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas tratando as sementes com uma quantidade efetiva do herbicida inibindo AHAS ou uma formulação compreendendo o herbicida inibindo AHAS.

Neste lugar, as taxas de aplicação são geralmente de 0,1 g a 10 kg do a.i.(ou da mistura de a.i.ou da formulação) por 100 kg de semente, preferivelmente de 1 g a 5 kg por 100 kg de semente, em particular de 1 g a 2,5 kg por 100 kg de semente.

Para cultivos específicos tal como alface a taxa pode ser maior.

A presente invenção fornece um método para combater 5 vegetação indesejada ou controlar ervas daninhas compreendendo colocar em contato as sementes das plantas resistentes de acordo com a presente invenção antes de semeadura e/ou depois de pré-germinação com um herbicida inibindo AHAS.

O método pode compreender adicionalmente semear as sementes, por exemplo, em solo em um campo ou em um substrato em casa de vegetação.

O método encontra uso particular para combater vegetação indesejada ou controlar ervas daninhas na vizinhança imediata da semente.

O controle de vegetação indesejada é entendido como significando o assassinato de ervas daninhas e/ou de outra maneira retardando ou inibindo o crescimento normal das ervas daninhas.

Ervas daninhas, no 15 sentido mais amplo, são entendidas como significando todas as plantas que crescem em localizações onde elas são indesejadas.

As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas.Ervas daninhas ) dicotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, ervas daninhas dos gêneros: 20 Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindemia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, 25 e Taraxacum.

Ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, e Apera.

Em adição, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas cultivadas que estão crescendo na localização indesejada.

Por exemplo, uma planta voluntária de milho que está em um 5 campo que compreende predominantemente plantas de soja pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho é indesejada no campo de plantas de soja.

Os artigos "um" e "uma" são usados neste lugar para se referir a um ou mais do que um (i.e., a pelo menos um) dos objetos gramaticais do 10 artigo.

Como forma de exemplo, "um elemento" significa um ou mais elementos.

Como usado neste lugar, a palavra "compreendendo," ou variações tal como "compreende" ou "compreendendo," serão entendidas para implicar a inclusão de um determinado elemento, número inteiro ou etapa, ou 15 grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos,, números inteiros ou etapas.

Os exemplos seguintes são oferecidos como forma de I ilustração e não como forma de limitação.

EXEMPLO 1: Mutagênese de Linhagem BTK47 de Helianthus annuus e Seleção de Plantas Resistentes a Imidazolinona BTK.47, uma linhagem de Helianthus annuus L., foi quimicamente mutada como segue.

Sessenta mil sementes da linhagem BTK47 foram tratadas com uma solução de etil metanosulfonato (EMS) por 25 15 horas.

As sementes tratadas foram então semeadas em condições de campo em 16 de Dezembro de 2002 em Estação Experimental de Nidera em Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina.

Aproximadamente 30.000 plantas M( floresceram e foram cobertas com sacos a fim de autopolinizar cada planta.

Cada planta foi coletada e trilhada manualmente.

Em de Maio de 2003 em Estação Experimental de Nidera em Formosa, 20 sementes M2 de cada capítulo foram semeadas em condições de casa de vegetação.

Aproximadamente 590.000 plantas foram pulverizadas em estágio V2-V4 com imazapir em uma taxa de 80 g ai/ha.

Oito plantas sobreviveram ao tratamento com herbicida e foram autopolinizadas e coletadas.

Sementes M3 de cada uma destas oito plantas foram avaliadas para sua resistência a imazapir.

Destas oito famílias de M3, uma família (S4897) segregou para resistência a herbicida em uma proporção de 1 resistente (i.e., conferindo tolerância a taxas comerciais de herbicidas de imidazolinona): 2 intermediária (i.e., parcialmente resistente): 1 susceptível.

Plantas resistentes completamente férteis foram autopolinizadas e coletadas a fim de propagar a linhagem S4897.

Tecido foliar das plantas M3 S4897 tanto da classe resistente como intermediária foram usadas como uma fonte de DNA para análise da seqüência do gene de AHASL 1 como descrito em Exemplo 2.

EXEMPLO 2: Amplificação por PCR e Seqüenciamento de Polinucleotídeos de Girassol Codificando Proteínas AHASL 1 Resistentes a Imidazolinona e Tipo Selvagem O gene de AHASL 1 foi amplificado por PCR a partir de DNA isolado de plantas de girassol M3 S4897 e BTK47 (tipo selvagem) como dois fragmentos sobrepostos.

Amplificação por PCR foi realizada com Hotstart Taq DNA polimerase e reagentes associados (Qiagen Inc, Valencia, California, USA; Cat.No.203205) usando métodos padrão.

Os iniciadores de PCR para os dois fragmentos são apresentados em Tabela 1 e na Listagem de Seqüências.HA1U409 (SEQ ID NO: 7) é o iniciador direto para o primeiro fragmento e corresponde a par de bases 254 de No.de Acesso de GenBank AY541451.

HA1L1379 (SEQ ID NO: 8) é o iniciador reverso para o primeiro fragmento e corresponde a par de bases 1215 de No.de Acesso de GenBank AY541451.

HA1U1313 (SEQ ID NO: 9) é o iniciador direto para o segundo fragmento e corresponde a par de bases 1149 de No.de Acesso de GenBank AY541451.

HA1L2131 (SEQ ID NO: 10) é o iniciador reverso para o segundo fragmento e corresponde a par de bases 1962 de No.de Acesso de GenBank AY541451.

O par de iniciadores HA1U409-HA1L1379 produziu um fragmento de 962 pares de bases.

O par de iniciadores HA1U1313- HA1L2131 produziu um fragmento de 814 pares de bases.

Os produtos de PCR resultantes foram seqüenciados para produzir as seqüências de AHASLI para S4897 e BTK47.

Um alinhamento destas seqüências de nucleotídeos e da seqüência de nucleotídeos do gene ALS de Xanthiwn sp.(No.de Acesso de GenBank UI6280; SEQ ID NO: 5) é fornecido em Figura 1.

O alinhamento revelou que o gene de AHASLI de S4897 teve uma única mutação em relação ao AHASLI de BTK47.

O sítio da mutação é indicado por um asterisco em Figura 1.

Esta mutação é uma transição de G para A que corresponde a nucleotídeo 21 de SEQ ID NO: 1.

Um alinhamento das seqüências de aminoácidos previstas das seqüências de nucleotídeos AHASLI de S4897, BTK47, e Xanthium sp.é fornecido em Figura 2.

Em relação à seqüência de aminoácidos de AHASLI de BTK47, a seqüência de aminoácidos de AHASLI de S4897 tem uma substituição de alanina para treonina em posição de aminoácido 7 (SEQ ID NO: 2).

Esta posição de aminoácido em SEQ ID NO: 2 corresponde à posição de aminoácido 107 na seqüência de aminoácidos de comprimento completo codificada pela seqüência de nucleotídeos de AHASLI de girassol de No.de Acesso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 11) e posição de aminoácido 122 na seqüência de aminoácidos de comprimento completo codificada pela seqüência de nucleotídeos de AHASL de Arabidopsis thaliana de No.de Acesso de GenBank X51514. 86 4) Tabela 1.

Iniciadores de PCR para Amplificar a Região de Codificação do Gene de AHASL1 de Girassol

EXEMPLO 3: Produção de uma Linhagem de Girassol que é Homozigota para as Características de Resistência a Herbicida de S4897 -5 Uma linhagem de girassol que é homozigota para as características de resistência a herbicida foi produzida a partir de 54897 autofecundando e triando resistência para imazapir.

Esta linhagem de girassol e plantas desta foram designadas como GM40.

Depois de confirmar a homogeneidade da progénie para resistência a herbicida, plantas da linhagem 10 de girassol GM40 foram transplantadas em condições de casa de vegetação e autopolinizadas para produção de semente.

EXEMPLO 4: Resistência de S4897 a Imazapic ' Em experimentos de campo na Argentina, plantas S4897 foram testadas para resistência a imazapic.

A resistência a imazapic foi 15 claramente superior a IMISUN-1 (mutação de Ala^o para Vai; posição equivalente em Arabidopsis thaliana é 205; veja Tabela 4 abaixo).

Este experimento teve plots em fileiras únicas e foi tratado em um dia com vento, de forma que a dose atual de herbicida atingindo as plantas foi provavelmente menor do que foi aplicado.

Contudo, S4897 apresentou uma tolerância 20 superior a imazapic do que a substituição de Ala^o por Vai, não é apresentado nenhum dado deste experimento de campo.

Plantas de S4897 e IMISUN-1 também foram sujeitas a tratamento com imazapic em condições de casa de vegetação.

A fotografia em Figura 5 mostra esta comparação quando as plantas foram tratadas com 100 g ai/ha de imazapic.

EXEMPLO 5: Resumo de Tolerância e Atividade de AHAS para Linhagem de Girassol S4897 e Outras Variedades de Clearfield® de Girassol Resistente 5 a Herbicida Métodos: Linhagens de girassol S4897, variedades de girassol A, B, C de Clearfield e uma variedade convencional não de Clearfield foram pulverizadas com três taxas de imazamox (Raptor1 M), 100, 200 e 300 gm ai/ha mais 0,5% Sun It 11 e duas taxas de imazapir (Arsenal1X1) 160 e 360 gm 10 ai/ha mais 0,5% Sun It II quando as plantas estavam no estágio de duas a três folhas.

Classificações foram adotadas em 14 dias depois de aplicação (DAT) para lesão.

Lesão foi classificada em uma escala de 0 a 9 onde 0 = nenhuma lesão a 9 = planta morta.

Doze plantas foram pulverizadas por tratamento com herbicida/taxa.

Análise estatística foi conduzida com STATGRAPBICS Plus 15 5.0 usando procedimentos ANOVA e LSD.

Análise de atividade de AHAS também foi conduzida selecionando folhas jovens crescendo ativamente de plantas que não foram pulverizadas com herbicida em aproximadamente quatro semanas depois de ) plantio.

Resultados: Depois de plantas terem sido pulverizadas, foi percebido que uma diferença de altura entre S4897 e outras variedades de girassol poderia ter impactado a dose atual de herbicida que foi liberada.

A altura de barragem de pulverização foi calibrada contra S4897 e uma vez que outras variedades eram mais altas e mais próximas da barragem elas teriam 25 recebido uma maior dose de herbicida.

Taxas foram recalibradas para as outras variedades para determinar a dose aproximada que elas teriam recebido.

Verificações foram feitas como apresentado em Tabela 2 uma vez que não foi possível fazer uma comparação direta das taxas devido ao efeito da altura.

Por exemplo escores de lesão foram comparados para S4897 tratadas com taxa de imazamox de 100 gm ai/ha com outras variedades tratadas a 75 gm ai/ha.

A dose de tratamento de 300 gm ai/ha para linhagem S4897 foi equivalente ao tratamento de 200 gm ai/ha para as outras variedades, que foi aproximadamente 300 gm ai/ha.

Tabela 2.Ajuste de dose recebida devido a herbicida

todos os tratamentos com herbicida (Tabela 3).

De fato muito pouca lesão foi observada na maior taxa de ou imazamox ou imazapir.

As outras variedades mostraram lesão crescente com taxa de herbicida como seria esperado.

Figura 10 6 mostra uma comparação da lesão na 200/150 gm ai/ha para linhagem S4897, variedade A de Clearfield01, e o controle de não Clearfield.

A extremidade de crescimento de S4897 mostrou pouca a nenhuma lesão ao passo que variedade A de Clearfield"1 foi significantemente lesionada e parou crescimento.

Tabela 3.Dados de lesão em 14 DAT para três linhagens de IMISUN1 e S4897 pulverizadas com imazamox ou imazapir.

Análise estatística foi conduzida com STATGRAPHICS Plus 5.0 Cada valor é a média de aproximadamente 12 observações 20 Resultados de atividade de AHAS também mostraram menos inibição na maior concentração de imazamox se comparados com um girassol de Clearfield'” e variedade convencional de não Clearfield (Figura 7).

Inibição por Glean™ foi similar entre as três variedades de girassol (Figura 8).

Retroalimentação não foi apresentada uma vez que a base parental de 5 linhagem S4897 não era disponível.

Uma vez que ambas as mutações estão no mesmo locus de AHASLI e todas as variedades testadas foram homozigotas, existe uma diferença qualitativa na tolerância conferida pela substituição de aminoácido na proteína AHASLI de S4897.

Assim, a mesma quantidade de enzima AHAS com esta nova substituição (i.e., AlajO? para Thr) é capaz de 10 catalisar a formação de mais produto na presença de herbicida do que faz AHAS com a substituição de AlaI90 por Vai.

Isto indica que AHAS a substituição de Alaio7 por Thr tem tolerância superior para herbicidas de imidazolinona do que AHAS com a substituição de Alajço por Vai.

EXEMPLO 6: Proteínas AHASL de Girassol Resistente a Herbicida 15 A presente invenção descreve tanto as seqüências de nucleotídeos como de aminoácidos para polipeptídeos AHASL de girassol tipo selvagem e resistente a herbicida.

Plantas compreendendo polipeptídeos AHASL resistentes a herbicida foram previamente identificadas, e diversas ) regiões conservadas de polipeptídeos AHASL que são os sítios de 20 substituições de aminoácidos que conferem resistência a herbicida foram descritas.

Veja, Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites".

In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al.(eds.), pp.159-185, IOS Press, Amsterdam; e Devine and Shukla, (2000) 25 Crop Protection 19:881-889.

Usando as seqüências de AHASL da invenção e métodos conhecidos por aqueles de habitual verso na técnica, alguém pode produzir polinucleotídeos adicionais codificando polipeptídeos AHASL resistentes a herbicida tendo uma, duas, três, ou mais substituições de aminoácidos nos sítios identificados nestas regiões conservadas.

Tabela 4 fornece as regiões conservadas de proteínas AHASL, as substituições de aminoácidos conhecidas por conferirem resistência a herbicida dentro destas regiões conservadas, e os aminoácidos correspondentes na proteína AHASL 1 de girassol apresentada em SEQ ID NO: 4.Tabela 4.

Mutações em regiões conservadas de polipeptídeos AHASL 1 conhecidas por conferirem resistência a herbicida e sua posição equivalente em AHASL 1 de girassol

'Regiões conservadas de Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites".

In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology’, Roe et al.(eds.), pp.159-185, IOS Press, Amsterdam and Devine and Shukla, (2000) Crop Protection 19:881-889.

"Numeração de aminoácidos corresponde à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo AHASL 1 de Arabidopsis thaliana.

As seqüências de aminoácidos de AHASL 1 de girassol apresentadas em SEQ 1D NOS: 2 e 4 não são de comprimento completo e começam com as seqüências de aminoácidos FAYPGGASMEIHQALTRS e FAYPGGTSMEIHQALTRS. respectivamente.

4AS seqüências de aminoácidos de AHASL de girassol apresentadas em SEQ 1D NOS: 2 e 4 possuem esta região conservada.

A região do AHASL 1 de girassol (No.de Acesso de GenBank AY541451) correspondendo a esta região conservada tem a seqüência IPAGG.Bemascome(1995) J.Biol.Chem.270(29):17381-17385.7Boutsalis et al.(1999) Pestic.Sci.55:507-516.’Guttieri et al.(1995) Weed Sci.43:143-178.9Guttieri et al.(1992) Weed Sci.40:670-678.10Hartnett et al. (1990) "Herbicide-resistant plants carrying mutated acetolactate synthase genes," In: Managing Resistance to Agrochemicals: Fundamental Research to Practical Strategies, Green et al.(eds.), American Chemical Soc.Symp., Series No.421, Washington, DC, USA "Simpson (1998) Down to Earth 53(l):26-35.l2Bruniard (2001) Inheritance of imidazolinone resistance, characterization of cross- resistance pattern, and identification of molecular markers in sunflower (Helianthus annuus L.).Ph.D.Thesis, North Dakota State University, Fargo, ND, USA, pp 1-78.13Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites".In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al.(eds.), pp.159-185, IOS Press, Amsterdam 14Wright and Penner (1998) Theor.Appl.Genet.96:612-620.15Ko 1kman e/ al.(2004) Theor.Appl.Genet.109: 1147-1159.16Whiteβtα/.(2003) WeedSci.51:845-853.17Chang and Duggleby (1998) Biochem 333:765-777.

EXEMPLO 7: Produção de uma Linhagem de Girassol GM 1606 Uma segunda linhagem de girassol resistente a herbicida foi produzida pela mutagênese de sementes de girassol que são tipo selvagem com respeito a resistente a herbicida por um método essencialmente como 5 descrito acima em Exemplo 1.

A nova linhagem e plantas desta linhagem são referidas neste lugar como GM1606.

A linhagem de girassol GM1606 compreende a mesma mutação no gene de AHASLI que na linhagem de girassol S4897.

Esta mutação em GM1606 é uma transição de G para A que corresponde a nucleotídeo 21 de SEQ ID NO: 1.

Uma tal mutação gera uma 10 substituição de alanina para treonina em posição de aminoácido 7 (SEQ ID NO: 2).

Esta posição de aminoácido em SEQ ID NO: 2 corresponde à posição de aminoácido 107 na seqüência de aminoácidos de comprimento completo codificada pela seqüência de nucleotídeos de AHASLI de girassol de No.de Acesso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 11) e posição de aminoácido 15 122 na seqüência de aminoácidos de comprimento completo codificada pela seqüência de nucleotídeos de AHASL de Arabidopsis thaliana de No.de Acesso de GenBank X51514.

EXEMPLO 8: Resposta de Eventos Mutantes A122T e A205V a Imazapir Um estudo em casa de vegetação foi conduzido para quantificar e contrastar a sensibilidade a imazapir dos mutantes A122T e A205V em diferentes bases genéticas no nível de planta total em girassol.

Sementes das diferentes linhagens de girassol que foram usadas neste estudo foram obtidas em condições de campo.

As linhagens usadas no estudo são listadas em Tabela 5.Tabela 5.Materiais de Girassol

Métodos 10 Sementes foram semeadas em placas de Petri e, depois de germinação, plântulas foram transplantadas para potes de 10 cm de diâmetro em um meio de envasamento consistindo de partes iguais de vermiculita, solo e areia.

Plantas foram crescidas em uma casa de vegetação em condições de luz natural suplementada com lâmpada de haleto de sódio de 400 W para 15 fornecer um comprimento de dia de 16 hrs.

Temperaturas de dia/noite foram 25 e 20 °C, respectivamente.

No estágio V2 10 plantas de cada genótipo w foram aleatoriamente designadas para cada tratamento consistindo de sete doses de imazapir (0, 40, 80, 160, 240, 320, 400 e 480 g ai/ha), e uma determinação de biomassa em tempo zero.

Experimento foi arranjado como um modelo de bloco aleatório com um arranjo de fatorial completo (linhagem 5 de girassol x tratamento) de tratamentos e 10 replicações.

No dia de aplicação de herbicida dez plantas de cada genótipo foram cortadas no nó cotiledonar e secas a 60°C por 48 hrs para determinação de peso seco em tempo zero.

O resto das plantas foi mantido por 10 dias depois de 10 tratamento com imazapir (DAT) e sua altura e raiz e biomassa seca acima do solo foram registradas.

Altura foi determinada como a distância entre o nó cotiledonar e o ápice de cada planta.

Para determinação de biomassa de raiz, cada planta foi tirada do pote e o meio de envasamento foi removido das raízes.

Dados de biomassa acima do solo de cada linhagem foram convertidos 15 para acumulação de biomassa depois de aplicação subtraindo a biomassa em tempo zero média apropriada de cada amostra.

Dados de biomassa seca foram convertidos para porcentagens das plantas de controle não tratadas dentro de cada linhagem para permitir comparações diretas entre grupos.k Resultados 20 1.

Altura Altura das linhagens de girassol carregando a mutação A205V não diferiu dos controles não tratados quando uma taxa de 0,5X ou IX de imazapir foi aplicada.

De 2X a 6X, estas linhagens mostraram uma redução significante em altura que atingiu 68,9% +/- 3,1 dos controles não tratados 25 (Tabela 6 e Figura 9).

Em contraste, linhagens de girassol carregando a mutação A122T mostraram uma menor redução de altura (de 0,6 a 15,8% dos controles não tratados para taxa de 0,5X e 6X de imazapir, respectivamente).

Ambos os grupos de linhagens mostraram uma diferença significativa entre eles para sua resposta a um aumento em taxa de herbicida de 2X a 6X (Tabela „ 6 e Figura 9).

Indice de Fitotoxicidade Ambos os mutantes mostraram grandes diferenças em sua resposta ao aumento em taxa de herbicida de 0,5X a 6X (Figura 10).

Linhagens de girassol carregando a mutação A122T mostraram uma suave redução em tamanho foliar e cor verde mais clara do que as plantas de controle na medida em que a taxa de herbicida aumenta (Tabela 7).

Em contraste, plantas carregando a mutação A205V não mostraram qualquer lesão em 0,5X ou lx de taxa de herbicida, mas o nível de lesão (amarelado, 10 deformação foliar e necrose foliar) aumentou rapidamente de 2X a 6X (Tabela 7).

Ambos os mutantes diferiram entre eles significantemente para o índice de Fitotoxicidade de 2X a 6X (Tabela 7).

Biomassa de Peso Seco Acima do Solo Curvas dose resposta para peso seco de mutantes A122T e 15 A205V são mostradas em Figura 11.

Peso de biomassa de evento A122T foi reduzido com respeito a plantas de controle em taxas de 4X, 5X e 6X, e esta redução atingiu 25% para a maior dose.

Por enquanto, peso seco de evento A205V foi reduzido com respeito às plantas de controle de 0,5X (40 gai/ha) a k 6X.

Ambos os mutantes mostraram diferenças significantes entre eles com 20 respeito a esta variável de 0,5X a 6X (Tabela 8).

As mesmas tendências foram obtidas para acumulação de matéria seca (não mostrado) mas sem os efeitos desconcertantes das diferenças iniciais entre genótipos para seu peso seco em tempo zero.

Biomassa de raiz 25 Na medida em que as doses de imazapir aumentaram, biomassa seca de raiz de ambos os mutantes foi reduzida com respeito a plantas de controle, mas a taxa de redução foi muito diferente entre A122T e A205V (Figura 12).

De fato, A205V mostrou uma redução significante em biomassa de raiz de peso seco de 12,8% em 0,5X (40 g.a.i/ha) a 75,6% em 6X w (Tabela 9).

Em contraste, carteadores A122T mostraram uma diminuição significativa em biomassa seca de raiz de 3X a 6X, e na maior dose a redução atingiu 38,3% (Tabela 9).

Ambos os mutantes mostraram diferenças significantes entre eles em sua resposta de peso seco de raiz a taxas de 5 herbicidas de 0,5X a 6X (Tabela 9 e Figura 12). Tabela 6. Efeito de diferentes doses de imazapir em altura de planta 14 dias depois de tratamento para seis genótipos de girassol carregando o evento de mutação AZOV e seis genótipos carregando o evento de mutação A122T.

Tabela 7- Efeito de diferentes doses de imazapir em índice de Fitotoxicidade 14 dias depois de tratamento para três genótipos de girassol carregando o evento de mutação A205V e três genótipos carregando o evento de mutação A122T.

Tabela 8- Efeito de diferentes doses de imazapir em acumulação de biomassa 14 dias depois de tratamento para seis genótipos de girassol carregando o evento de mutação A205V e seis genótipos carregando o evento de mutação A122T

Tabela 9.- Efeito de diferentes doses de imazapir em peso seco de raiz 14 dias depois de tratamento para seis genótipos de 'O girassol carregando o evento de mutação A205V e seis genótipos carregando o evento de mutação A122T

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório são indicativos do nível daqueles versados na técnica ao qual esta invenção pertence.

Todas as publicações e pedidos de patente são neste lugar incorporadas por referência no mesmo grau que se cada publicação ou pedido 5 de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplo para propósitos de claridade de entendimento, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser 10 praticadas dentro do escopo das reivindicações anexadas.

Claims (12)

1. Método para controlar ervas daninhas na vizinhança de planta de girassol, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida de imidazolinona, ou uma mistura de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, e/ou um herbicida de triazolopirimidina às ervas daninhas e a planta de girassol, em que dita planta de girassol é selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma planta de girassol compreendendo uma proteína de girassol AHASL resistente a herbicida compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; em que, como um resultado da em que, como resultado da mutagênese induzida, a proteína AHASL compreende uma treonina em posição 107 da SEQ ID NO: 2, em que dita planta tem resistência aumentada para um ou mais herbicidas se comparada com uma planta de girassol tipo selvagem. (b) S4897, GM40, GM1606, a planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou a planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606; (c) uma planta de girassol que é uma progênie de S4897, GM40, GM1606, da planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou da planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA- 7606, dita planta de girassol compreendendo as características de resistência a herbicida de S4897, GM40, GM1606, da planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou da planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606; e (d) uma planta de girassol que é uma progênie de uma ou mais das plantas de girassol de (b)-(c), dita planta de girassol compreendendo as características de resistência a herbicida de S4897, GM40, GM1606, da planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-6716, ou da planta com Número de Depósito de Patente da ATCC PTA-7606.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado a partir do grupo consistindo de: ácido [2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-] imidiazolin-2-i1) nicotínico, ácido 2- (4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il) -3- quinolinacarboxílico, ácido [5-etil-2- (4-isopropil-4-metil-] 5-oxo-2- imidazolin-2-i1) - nicotínico, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-5- (metoximetil)- nicotínico, ácido 2- (4-isopropil-4-metil- 5- oxo-2-imidazolin-2-i1)-5- metilnicotínico, e uma mistura de 6- (4-isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metila e [2- (4-] isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-i1)-p-toluato de metila, e mistura destes.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado a partir do grupo consistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, e misturas destes.

4. Molécula isolada de polinucleotídeo, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, em que, como resultado de mutagênese induzida, a sequência de nucleotídeos compreende uma transição de G para A em posição 21 de SEQ ID NO: 1.

5. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de compreender um promotor operavelmente ligado à molécula de polinucleotídeo como definida na reivindicação 4.

6. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dito promotor é capaz de dirigir expressão gênica em uma bactéria, uma célula fúngica, uma célula animal, ou uma célula vegetal.

7. Vetor de transformação, caracterizada pelo fato de que compreende um promotor operavelmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo, em que dito promotor dirige expressão em uma célula hospedeira e dita molécula de polinucleotídeo é a molécula de polinucleotídeo como definida na reivindicação 4.

8. Vetor de transformação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito promotor é exprimível em uma célula vegetal.

9. Vetor de transformação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que dito promotor é um promotor constitutivo.

10. Vetor de transformação de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma sequência operavelmente ligada tendo como alvo cloroplasto.

11. Vetor de transformação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito promotor é exprimível em uma bactéria ou uma levedura.

12. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO:2, em que, como resultado de mutagênese induzida, a sequência de polipeptídeo possui uma substituição de treonina em uma posição 7 da SEQ ID NO: 2.

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