RS54931B1 - Biljke suncokreta otporne na herbicide, polinukleotidi koji kodiraju acetohidroksikiselu sintazu velike podjedinice proteina otpornu na herbicide, i metodi upotrebe - Google Patents

Biljke suncokreta otporne na herbicide, polinukleotidi koji kodiraju acetohidroksikiselu sintazu velike podjedinice proteina otpornu na herbicide, i metodi upotrebe

Info

Publication number
RS54931B1
RS54931B1 RS20160409A RSP20160409A RS54931B1 RS 54931 B1 RS54931 B1 RS 54931B1 RS 20160409 A RS20160409 A RS 20160409A RS P20160409 A RSP20160409 A RS P20160409A RS 54931 B1 RS54931 B1 RS 54931B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
herbicide
plant
amino acid
plants
ahasl
Prior art date
Application number
RS20160409A
Other languages
English (en)
Inventor
Carlos Alberto Sala
Adriana Mariel Echarte
Mariano Bulos
Sherry R Whitt
Robert Ascenzi
Original Assignee
Basf Se
Nidera Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Se, Nidera Sa filed Critical Basf Se
Publication of RS54931B1 publication Critical patent/RS54931B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A01H6/1464—Helianthus annuus [sunflower]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8278—Sulfonylurea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Suncokretova polinukleotidna velika podjedinica acetohidroksikisele sintaze (AHASL), gde pomenuti AHASL polinukleotid kodira AHASL1protein koji je tolerntan na herbicid imidazolinon, koji obuhvata supstituciju iz alanina u treonin na poziciji 7 amino kiseline iz SEQ ID NO:2 ili, ekvivalentno, na poziciji 107 iz SEQ ID NO:12; gde pomenuti AHASL1 protein obuhvata polipeptid koji je najmanje 95% identičan sa SEQ ID NO:12; i gde pomenuti AHASL1 protein donosi biljci povećenu tolerantnost na herbicid imidazolinon u poređenju sa varijetetom divljeg tipa pomenute biljke.Prijava sadrži još 17 patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na područje poljoprivrdne biotehnologije, posebno na biljke suncokreta otporne na herbicide i nove polinukleotidne sekvence koje kodiraju acetohidroksikiselu sintazu velike podjedinice proteina suncokreta otpornu na herbicid.
POZADINA PRONALASKA
Acetohidroksikisđa sintaza (AHAS; EC 4.1.3.18. takođe poznata kao acetolaktatna sintaza ili Al.S). je prvi enzim koji katalizuje biohemijsku sintezu ni/granatog lanca amino kiselina valina. leucina i izoleucina (traži (1999) "Biosinteza valina. Icueina i izolcuana," u Biljna amino kiselina. Singh, B.K.. izd.. Marcel Dckker Inc. Ne\v York. Ne\v York. str. 227-247). AHAS jc mesto delovanja pet strukturno različiih porodica herbicida uključujući sulfonilurec ( l an i sar. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smilh i Rctzinger (2003) Wccd Technology 17:620-626; LaRossa i Faico (1984) Trends Bioiechnol. 2: 158-161). imidazoiinonc (Shaner i sar. (1984) Plant Phvsiol. 76:545-546). triazolopirimidine (Subramanian i Gervvick (1989) "Inhibicija sintaze acetolaktata sa triazolopirimidinima". u Biokataliza u poljoprivrednoj biotehnologiji. Whitakei\J.R. i Sonnet. P.E. izd.. ACS Symposium Series. American Chemical Society, Washington, D.C., str. 277-288). pirimidiniloksibenzoata (Subramanian i sar. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244) i sulfonilamino-karboniltriazolinona (Tan i sar. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith i Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626). Imidazolinon i sulfonilurea herbicidi sc široko koristeumodernoj poljoprivredi zahvaljujući njihovoj efikasnosti pri vrlo niskim stopama primene i zbog relativne ne toksičnosti kod životinja. Putem inhibiranja aktivnosti AHAS, ove porodice herbicida sprečavaju dalji rast i razvoj osetljivih biljaka uključujući mnoge vrste korova. Nekoliko primera komercijalno dostupnih imidazolinon herbicida su PURSUIT® (imazetapir). SCEPTER® (imazakvin) i ARSENAL® (imazapir). Primeri sulfonilurea herbicida su hlorsulfuron, metil metsulfuron, metil sulfometuron, etil hlorimuron, metil tifensulfuron, metil tribenuron, metil bensulfiron. nikosulfuron, metil etametsulfuron, rimsulfuron, metil triflusulfuron. triasulfiuron, metil primisulfuron, cinosulfuron. amidosulfuron. ilazasulfuron. imazosulfuron. etil piramsulfuron i halosulfluron.
Zahvaljujući njihovoj velikoj efektivnosli i niskoj toksičnosti, imidazolinon herbicidi su favorizovani za primenu putem sprejovanja prko vrha široke površine vegetacije. Sposobnost da se herbicid nanese sprejom preko vrha širokog raspona površine vegetacije smanjuje koštanje vezano sa ustanovljavanjem biljke i održavanjem i smanjenjem potrebe za pripremanjem mesta pre upotrebe takvih hemikalija. Sprejovanje preko vrha željene tolerantne vrste takođe rezultuje sposobnošću da se dostige potencijal maksimalnog prinosa željene vrste zahvaljujući odsustvu kompetitivnih vrsta. Međutim, sposobnost da se upotrebe takve tehnike sprejovanja preko je zavisna od prisustva vrste otporne na imidazolinon od željene vegetacije u području sprejovanja.
Među glavnim poljoprivrednim usevima. neke leguminozne biljke kao što je soja su prirodno otporne na imidazolinon herbicide sbog njihove otpornosti da brzo melabolišu herbicidna jedinjenja (Shaner i Robinson (1985) Weed Sci, 33:469-471). Drugi usevi kao što je kukuruz (Newhouse i sar. (1992) Plant Phvsiol. 100: 882-886) i pirinač (Barrctt i sar. (1989) Zaštitnici useva od herbicida. Aeademic Press, New York. str. 195-220) su nekad osetljivi na imidazolinon herbicide. Različita osctljivost na imidazolinon herbicide je zavisna od hemijske prirode određenog herbicida i različitog metabolizma jedinjenja od toksičnih do ne-ioksišnih oblika kod svake bijke (Shaner i sar. (1984) Plant Phvsiol. 76:545-546: Brovvn i sar.. (1987) Pestic. Biochcm. Physiol. 27:24-29). Druge biljne fiziološke razlike kao što je apsorpcija i translokacija takođe igraju važnu ulogu u oselljivosti (Shaner i Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471).
Biljke otporne na imidazolinon. sulfoniluree. triazolopirimidine. i pirimidiniloksibenzoale uspešno su produkovane koristeći seme. mikrospore. polen. i mutagenezu kalusa kodZca inay. s. Arabidopsis IhaHana, Brassica nupus(tj.. uljana repica)Glycine mux, Nicotiana tabacum,šećerne repe{ Bela vu/ garis)iOrvza satitva(Sebastian i sar (1989) Crop Sci. 29:1403-1408; Svvanson i sar., 1989 Theor Appl. Ganet. 78:525-530; Newhouse i sar. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan i sar. (1991) Plant Phvsiol. 97:1044-1050; Mourand i sar. (1993) J. Heredity 84:91-96: VVright i Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96:612-620: U.S. Patent br. 5.545,822). U svim slučajevima, pojedinačni, delimično dominantni jedami gen je obezbedio rezistenciju. Četiri biljke pšenice rezistentne na imidazolinon takođe su prvo izolovane nakon mutageneze semenaTriticum aeslivumI... cv. Fidel (Nevvhouse i sar. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886). Studije nasleđivanja su potvrdile da pojedinačni, delimično dominantni jedarni gen donosi rezistenciju. Na osnovu ispitivanja alela, autori su zaključili da su mutacije u četiri identifikovane linije bile locirane na istom lokusu. Jedan od gena rezistencije Fidel kultivara je označen kao FS-4 (Nevvhouse i sar. (1992) Plant Phvsiol. 100:882-886).
Populacije biljaka koje se javljaju u prirodi za koje je otkriveno da su otporne na herbicide imidazolinon i/ili sulfonilureu takođe su upotrebljcne da se razviju linije suncokreta za gajenje otporne na herbicide. Nedavno su razvijene dve linije suncokreta koje su otporne na sulfonilurea herbicid koristeći germplazmu poreklom od divlje populacije običnog suncokreta( IJelianlhus anmtus)kao izvor karakteristike otpornosti na herbicid (Miller i Al-Khatib (2004) Crop Sci. 44: 1037-1038). Prethodno su VVhite i sar. ((2002) Weed Sci. 50:432-437) izneli da su jedinke iz divlje populacije običnog suncokreta iz Južne Dakote. U.S.A bile unakrsno rezistentne na imidazolinon i herbicid sulfonilureu. Analiza dela kodirajućeg regiona gena velike podjedinice acetohidroksikisele sintaze( AHASL)jedinki iz ove populacije otkrila je lačkastu mutaciju koja rezultira supstitucijom Ala- u -Val amino kiseline AHASL proteina suncokreta koja odgovara Ala205kod divljeg tipaArabidopsis tha/ ianaAHASL proteina (White i sar. (2003) Weed Sci. 51: 845-853). Earlicr. Al-Khatib i Miller ((2000) Crop Sci 40:869) predstavili su produkciju četiri linije suncokreta za gajenje otporne na imidazolinon.
Modelovanje zasnovano na računaru tro dimenzionalne konformacije kompleksa AHAS-inhibitora predviđa nekoliko amino kiselina u predloženom džepu za vezivanje inhibitora kao mesta na kojima će indukovane mutacije \ rio verovatno obezbedili selektivnu otpornost na imidazolinon (Ott i sar. (1996) .1. Mol. Biol. 263: 359-368). Biljke duvana koje su produkovane sa nekim od tih racionalno dizajniranih mutacija na preloženim mestima vezivanja AHAS enzima u stvari su pokazale specifičnu otpornost na pojedinačnu klasu herbicida (Ott i sar.
(1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368).
Otpornost biljaka na imidazolinon herbicidelakode su iznete u jednom broju patenata. U.S. Patenti br. 4,761.373. 5.331.107. 5.304.732. 6.211.438. 6.211.439 i 6.222.100 generalno opisuju upotrebu izmenjenog AHAS gena da se izazove otpornost na herbicid kod biljaka, i specifično otkrivaju određene linije kukuruza otporne na imidazolinon. U.S. Patent br. 5,013.659 otkriva biljke koje pokazuju otpornost na herbicid zahvaljujući mutaciji u najmanje jednoj amino kiselini u jednom ili više konzerviranih regiona. Mutacije koje su tu opisane kodiraju ili unakrsnu otpornost na imidazolinone i sulfoniluree ili specifičnu otpornost na sulfonilureu. ali specifična otpornost na imidazolinon nije opisana. U.S. Patent br. 5.731.180 i U.S. Patent br. 5.767.361 diskutuju izolovani gen koji ima pojedinačnu supstituciju amino kiseline u divljem tipu monokotile sekvencu amino kiseline AHAS koja rezultira u specifičnoj otpornosti na imidazolinon. Sem toga, biljke pirinča koje su otporne na herbicide koji su u interferenciji sa AHAS razvijene su putem razmnožavanja mutacije i takode putem selekcije biljaka otpornih na herbicid iz grupe biljaka pirinča produkovanih putem kulture antera.Vidi.U.S. Patenta br. 5.545,822. 5,736,629, 5.773,703. 5.773,704. 5.952.553 i 6.274,796.
Kod biljaka, kao i kod drugih ispitivanih organizama. AHAS enzim obuhvata dve podjedinice: veliku podjcdinicu (katalitička uloga) i malu podjedinicu (regulatorna uloga)
(Dugglcby i Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33: 1-36). Velika podjedinica AHAS (takođe ovde označena kao AHASL) može biti kodirana sa pojedinačnim genom kao što je to u slučajuArabidopsis.i kod šećerne repe ili sa višestrukim članovima porodice gena kao što je kod kukuruza, uljane repice i pamuka. Specifične supstitucije pojedinačnih nukleotida u velikoj podjedinici obezbeđuju za enzim određeni stepen neosetljivosti na jednu ili više klasa herbicida (Chang i Dugglcbv (1998) Biochem J. 333: 765-777).
Na primer, hlebna pšenica,Triticum aeslivumL.. sadrži tri homeologna gena velike subjedinice acetohidroksikisele sinlaze. Svaki od ovih gena pokazuje značajnu ekspresiju zasnovanu na odgovoru na herbicide i na osnovu biohemijskih podataka od mutanata u svakom od tri gena (Ascenzi i sar. (2003) International Societv of Plant Molecular Biologists Congress. Barcelona, Spain. Ref. br. SI0-17). Kodirajuće sekvenec sva tri gena dele ekstenzivnu homologiju na nivou nukleotida (WO 03/014357). Putem sekvenciranjaAHASLgena iz nekoliko vaijeletaTri I kum aestivum.molekulska osnova otpornosti na herbicid kod većine IM I otpornih (imiđuzolinon-tolerantnih) linija je nađeno daje mutacija S653(.-1/)N. ukazujući na supstituciju seri na sa asparaginom na poziciji ekvivalentnoj serinu na amino dodatku 653 kodArabidopsis thalianu(WO 03/01436; WO 03/014357). Ova mutacija je zbog polimorfizma pojedinačnog nukleotida (SNP) u sekvenci DNK koja kodira AHASL protein.
Takođe je poznato da se višestrukiAHASLgeni javi jaju kod dikotiledonih biljnih vrsta. Neađavno su Kolkman i sar. ((2004) Theor. Appl. (ienel. 109: i 147-1 159) izneli identifikovanjc. kloniranje i sekvenciranje triAHASLgena( AHASLL AHASL2.iAHASL3)iz genotipova suncokreta otpornih na herbicid i divljeg tipa( Helu' mlhits aiimuisL.). Koikman i sar. izneli su da je otpornost na herbicid bila ili zbog Prol97Leu (koristećiArabidopsisAHASL nomenklaturu pozicije amino kiseline) supstitucije ili Ala205Val supstitucije u AHASL 1 proteinu i da je svaka od tih supstitucija obezbedila otpornost i na imidazolinon i na sulfonilurea herbicide.
Uzevši u obzir njihovu visoku efeklivnost i nisku toksičnost, herbicidi imidazolinona su faorizovani za poljoprivrednu upotrebu. Međutim, sposobnost herbicida imidazolinona u sistemu produkcije određenog useva zavisi od sposobnosti varijeteta otpornih na imidazolinone biljke iiscva za koju postoji zainteresovanost. Da se produkuju takvi varijeteti otporni na imidazolinon. odgajivači biljaka moraju da razviju linije za gajenje sa osobinom otpornosti na imidazolinon. Prema tome. potrebne su dodatne imidazolinon-otporne linije za gajenje i varijeteti biljaka useva, kao i metodi i kompozicije za proizvodnju i upotrebu linija i varijeteta za gajenje otpornih na imidazolinon.
SUŠTINA PRONALASKA
Predmetni pronalazak je definisan u zahtevima.
Kao što je to iznelo u zahtevu 1. poronalazak obezbedujc suncokretovu polinukleotidnu veliku podjedinicu acetohidroksikisele sintaze( AHASL),gde pomenutiAHASLpolinukleotid kodira protein AHASL 1 tolerantan na herbicid miđazolinon koji obuhvata podjedinicu od alanina do treonina na poziciji 7 amino kiseline od SHQ ID NO:2 ili. ekvivalentno, na poziciji 107 od SHQ ID NO: 12; gde pomenuti AHASL I protein obuhvata polipeptid koji je u najmanje 95% identičan sa SEQ ID NO: 12; i gde pomenuti AHASL1 protein obezbeđujc za biljku povećanu toleranciju na herbicid imidazolinon u poredenju sa varijetetom divljeglipa pomenutc biljke.
Dalji aspekti pronalaska su definisani u drugim zahtevima.
Sledeći opisi postavljaju detalje koji se odnose na oba ostvarenja pokrivena sa zahtevima i sa predmetom o kom je reč koji nije pokriven sa zahtevima. Opis predmeta o kojem je reč koji nije pokriven sa zahtevima je prikazan samo radi informacije.
Ovdc su otkrivene biljke suncokreta koje imaju povećanu otpornost na herbicide u poredenju sa biljkom suncokreta divljeg tipa. Određenije, biljke suncokreta iz prijave imaju povećanu otpornos; na imidazolinon herbicide. u poredenju sa biljkom suncokreta divljeg tipa. Biljke suncokreta otporne na herbicid prijave obuhvataju najmanje jednu kopiju gena ili polinukleotida koji kodira veliku podjedinicu otpornu na herbicid acetohidroksikisele sintaze (AHASL). Takav AHASL protein otporan na herbicid obuhvata treonin na poziciji 107 amino kiseline ili ekvivalentnoj poziciji. Biljka suncokreta iz prijave otporna na herbicid može sadržati jednu, dve. tri. četiri, pet. šest. ili više kopija gena ili polinukleotida koji kodira AHASL protein otporan na herbicid iz patentne prijave. Biljke suncokreta iz prijave takode uključuje semena i biljke potomke koje obuhvataju najmanje jednu kopiju gena ili polinukleotida koji kodira AHASL protein otporan na herbicid iz patentne prijave.
Predmetna prijava opisuje biljke suncokreta otporne na herbicid linija suncokreta koja je ovde označena kao S4897 i potomstvo i njegovi derivati koji obuhvataju karakteristike otpornosti na herbicid od S4897. Genetička linija ovde označena kao GM40 je izvedena iz. i ima karakteristike otpornosti na herbicid od S4897. Uzorak semena od GM40 linije je deponovan u American Type Culture Collection (ATCC) kao ATCC Patentni depozit br. PTA-6716. Prema tome, biljka suncokreta iz prijave koja obuhvata karakteristike otpornosti na herbicid od GM40 ili biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. PTA-6716 takođe obuhvata karakteristike otpornosti na herbicid od S4897. S4897 biljke suncokreta. GM40 biljke suncokreta, i biljke suncokreta koje imaju A TCC Patentni depozit br. PTA-6716 i potomstvo i njegovi derivati koji obuhvataju karakteristike otpornosti na herbicid od S4897. GM40. ili biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. PTA-6716. sadrži u svojim genomimaAHASLJgen koji obuhvata nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 1 i koji kodira AHASL I protein koji obuhvata, sekvencu amino kiseline dalu u SEQ ID NO: 2. Kada se poredi sa sekvencom amino kiseline od AHASL1 proteina (SEQ ID NO: 4) koji je kodiran saAHASL1genom (SEQ ID NO: 3) od divljeg tipa biljke suncokreta, sekvence amino kiseline date u SEQ ID NO: 2 ima razliku za pojedinačnu amino kiselinu od seklvence amino kiseline divljeg tipa. U sekvenci amino kiseline iznete u SEQ ID NO: 2, nalazi se treonin na poziciji 7 amino kiseline. Ta pozicija odgovara poziciji 107 u proteinu pune dužine od suncokreta AHASL1 proteina kodiranom sa nukleotidnom sekvencom datom u SEQ ID NO: 12 (prijavili br. AY54I451). U divljem tipu AHASL 1 sekvence amino kiseline prijave (SEQ ID NO: 4). ova ekvivalentna pozicija aminokiseline ima alanin. Scm ako je naglašeno drugačije, pozicije amino kiseline koje su ovde date za AIIASL proteine suncokreta odgovaraju pozicijama amino kiseline sekvence amino kiseline pune dužine date u SEQ ID NO: 12.
Predmenta prijava uključuje biljke suncokreta otporne na herbicid koje su linija suncokreta koja je ovde označena kao GM1606. Uzorak semena genetičkog materijala od GM1606 je deponovan sa ATCC kao ATCC Patentni depozit br. PTA-7606. Prema tome. predmetna prijava otkriva biljke suncokreta otporne na herbicid koje imaju ATCC Patentni depozit br. PTA-7606 i potomstvo i njegovi derivati koji obuhvataju karakteristike otpornosti na herbicid biijaka suncokreta od ATCC Patentni depozit br. PTA-7606. Kao i S4897 i M40 biljke suncokreta. Ml606 i potomstvo i njegovi derivati koji obuhvataju karakteristike otpornosti na herbicid GM1606 obuhvataju u svojim genomimaAHASL!gen koji kodira AHASL; protein koji obuhvata treonin na poziciji 107 AHASL1 proteina pune dužine suncokreta. Slično tome. suncokret, biljke koje imaju ATCC Patentni depozit br. PTA-7606, i potomstvo i njegovi derivati koji obuhvataju karakteristike otpornosti na herbicid biljaka suncokreta od ATCC Patentni depozit br. PTA-7606 obuhvataju u svojimgenomima AHASL!gen koji kodira AHASL 1 protein koji obuhvata trconinc na poziciji 107 AHASL1 proteina pune dužine suncokreta.
Predmetna prijava dalje opisuje izolovane polinukleotide i izolovane polipeptide za AHASL proteine suncokreta( Hc/ ian/ hus anmiiis).Polinukleotidi ovde obuhvataju nukleotidne sekvence koje kodiraju otpornost na herbicid i divlji tip AHASL proteina, uključujući ali bez ograničenja na. proteine koje su kodirani sa genima suncokretaAHASL1. AHASL2,iAHASL3.AHASL proteini suncokreta otpornog na herbicid uključuju AHASL! proteine olporene na imidazolinon koji obuhvataju treonin na poziciji 107 AHASL1 protein suncokreta pune dužine ili ekvivalentne pozicije.
Polinukleotidi prijave obuhvataju nukleotidne sekvence date u SEQ ID NOS: 1 i 3. nukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence amino kiseline date u SEQ ID NOS: 2 i 4, i fragmenti i varijante pomenutih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju proteine koji obuhvataju AHAS aktivnost.
Predmetna prijava opisuje ekspresione kasete za ekspresiju polinukleotida iz prijave: kod biljaka, biljnih ćelija, i drugih ćelija domaćina koje nisu humane. Ekspresione kasete obuhvataju promotor koji je ekspresibilan kod biljke, biljne ćelije, ili druge ćelije domaćine za koje postoji interes operativno vezane za polinukleotid prijave koji kodira ili divlji tip ili AHASL protein otporan na herbicid. Ako je neophodno za usmeravanje ekspresije na hloroplast, ekspresiona kaseta može takođe obuhvatati operativno vezanu ciljnu sekvencu usmercnu na hloroplast koja kodira tranzitni peptid hloroplasta da se usmeri eksprimirani AHASL protein na hloroplast. Ekspresione kasete prijave nalaze upotrebu u metodu za pojačavanje tolerancije na herbicid biljke i ćelije domaćina. Melod uključuje transformisanje biljke, ili ćelije domaćina sa ekspresionom kasetom iz prijave, gde ekspresiona kaseta obuhvata promotor koji se može eksprimirati kod biljke ili ćelije domaćina za koje postoji interes i promotor je operativno vezan za polinukleotid iz prijave koji kodira AHASL protein otporan na herbicid iz prijave. Metod dalje obuhvata regenerisanje transformisane bil jke iz transformisane biljne ćelije.
Predmetna prijava opisuje metod za povećanje aktivnosti AHAS kod biljke obuhvatajući transformisanje biljne ćeije sa polinukleoiidnim konstruktom koji obuhvata nukleotidnu sekvencu operativno vezanu za promotor koja vodi ekspresiju u biljnoj ćeliji i regenerisanje transformisane biljke od transformisane biljne ćelije. Nukleotidna sekvenca je odabrana od onih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju AHASL proteine otporne na herbicid ili proteina divljeg tipa AHASL iz prijave, posebno nukleotidne sekvence date u SEQ ID NOS: 1 i 3. i nukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence amino kiseline date u SEQ ID NOS: 2. i 4, i njihove fragmente i varijante. Biljka produkovana ovim metodom obuhvata povećanu AHAS aktivnost ili povećanu otpornost na herbicid ALAS aktivnosti u poredenju sa ne transformisanom biljkom.
Predmetna prijava opisuje metod za proizvodnju biljke otporne na herbicid koja obuhvata transformisanje biljne ćelije sa polinukleotidnim konstruktom koji obuhvata nukleotidnu sekvencu operativno vezanu za promotor koji vodi ekspresiju u biljnoj ćeliji i regeneraciju transformisane biljke iz pomenute transformisane biljne ćelije. Nukleotidne sekvence su odabrane od nukleotidnih sekvenci koje kodiraju AHASL proteine otporne na herbicid iz prijave, posebno nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 1. nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu amino kiseline datu u (SEQ ID NO: 2. i njegove fragmente i varijante. Biljka otporna na herbicid proizvedena ovim metodom obuhvata pojačanu otpornost na najmanje jedan herbicid. posebno na imidazolinon harbirid, kada se poredi sa netransformisanom biljkom.
Predmetna prijava opisuje metod za pojačavanje tolerancije na hericid kod biljke tolerantne na herbicid. Metodi nalaze upotrebu u pojačavanju otpornosti, biljke koja je već
otporna na nivo herbicida koji bi ubio ili značajno oštetio biljku divljeg tipa. Takva biljka tolerantna na herbicid može biti biljka tolerantna na herbicid koja je konstruisana genetičkim inženjeringom za toleranciju na herbicid ili biljka tolerantna na herbicid koja je razvijena putem načina koji ne uključuju rekombinantnu DNK kao što su. na primer. S4897, GM40, i CM 1606 biljke suncokreta predmetne prijave. Metod obuhvata transformisanje biljke tolerantne na herbicid sa polinukleotidnim konstruktom koji obuhvata nukleotidnu sekvencu operativno vezanu za promotor koji vodi ekspresiju u biljnoj ćeliji i regeneraciju transformisane biljke od transformisane biljne ćelije. Nukleotidna sekvenca je odabrana od onih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju AHASL proteine otporne na herbicid iz prijave posebno nukleotidnu sekvencu koja obuhvata nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 1. nukleotidne sekvence kodiraju sekvencu amino kiseline koja obuhvata sekvencu amino kiseline datu u SEQ ID NO: 2, i njegove fragmente i varijante.
Predmetna prijava opisuje transformacione vektore koji obuhvataju selektabilni marker gen iz prijave. Selektabilni marker gen obuhvata promotor koji vodi ekspresiju u ćeliji domaćinu operativno vezanu za polinukleotid koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira AHASL protein rezistentan na herbicid iz prijave. Tranasformacioni vektor može dodatno obuhvatati gen za koji postoji interes da bude eksprimiran u ćeliji domaćinu i može takođe. ako je poželjno, uključiti sekvencu koja je usmerena na hloroplast koja je operativno vezana za polinukleotid pronalaska.
Predmetna prijava dalje opisuje metode za korišćenje transformacionih vektora prijave da se odaberu ćelije transformisane sa genom za koji postoj: interes. Takvi metodi uključuju transformaciju ćelije domaćina sa transformacionim vektorom, izlaganje ćelije do nivoa imidazolinon herbicida koji bi ubio ili inhibirao rast ne-lransformisane ćelje domaćina i identifikovanje transformisane ćelje domaćina na osnovu njene sposobnosti da raste u prisustvu herbicida. Ccija domaćin može biti biljna ćelija i selektibilni marker gen obuhvata promotor koji vodi ekspresiju kod biljne ćelije.
Predmetna prijava dalje opisuje metod za kontrolisanje korova u blizini biljaka otpornih na herbicid iz prijave, uključujući biljke sucokreta otporne na herbicid opisane gore i biljaka transformisanih sa AHASL polinukleotidima otpornim na herbicid iz prijave. Takve transformisane biljke obuhvataju u svojim genomima najmanje jednu ekspresionu kasetu koja obuhvata promotor koji vodi ekspresiju gena u biljnoj ćeliji, gde je promotor operaivno vezan za AHASL polinukleotid iz prijave. Metod obuhvata primenu efektivne količine herbicida na korove i biljku otpornu na herbicid, pri čemu biljka otporna na herbicid ima povećanu otpornost na najmanje jedan herbicid. posebno herbicid imidazolinon. kada se poredi sa divljimlipom ili netransformisanom biljkom.
Biljke predmetne prijave mogu biti transgene ili ne-transgcne. Primer ne-transgene biljke suncokreta koja ima povećanu otpornost na imidazolinon i/ili herbicide sulfoniluree uključuje S4897. GM40, ili GM1606 biljke suncokreta i biljke suncokreta koje imaju ATCC Patentni depozit br. PTA-6716 ili PTA-7646; ili mutant, rekombinant, ili genetički konstruisan derivat i S4897, GM40. ili GM1606. biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. PTA-6716 ili PTA-7606. ili dva ili više od S4897. GM40. Ml606. biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. Pita-6716, i biljka suncokreta koja ima A TCC Patentni depozit br. PTA-7606: ili bilo koje potomstvo od S4897, GM40. ili GM1606. biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. PTA-6716 ili PTA-7606. ili dva ili više od S4897. GM40. GM1606. biljka suncokreta koja ima A TCC Patentni depozit br. PTA-6716. i biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. P TA-7606; ili biljka koja je potomstvo biljke bilo koje od tih biljaka: ili biljka koja obuhvata karakteristike otpornosti na herbicid od S4897. GM40. GM1606. biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. PTA-6716. i/ili biljka suncokreta koja ima ATCC Patentni depozit br. PTA-7606.
Predmetna prijava takođe uključuje biljke, biljne organe biljna tkiva, biljne ćelije, semena i ćeli je domaćine koje nisu humane koje su transformisane sa najmanje jednim polinukleotidom. ekspresionom kasetom ili transformacionim vektorom iz prijave. Takve transformisane biljke, biljni organi, biljna tkiva, biljne ćelije, semena i ćelije domaćina koje nisu humane imaju pojačanu toleranciju, ili otpornost na najmanje jedan herbicide. na nivoima herbicida koji ubijaju ili inhibiraju tast nelransformisanih biljaka, biljnih tkiva, biljnih ćelija ili ne humanih ćelija domaćina, respektivr.o. Transformisane biljke, biljna tkiva, biljne ćelije, i semena prijave mogu bitiArabidopsis llutliana.suncokret, i druge biljke usevi.
Predmetna prijava dalje opsuje izolovane polipeptide koji obuhvataju imidazolinon-otpornc i divljeglipa AHASL proteine suncokreta. Izolovani polipeptidi obuhvataju sekvence amino kiseline date u SEQ II) NOS: 2 i 4. sekvence amino kiseline kodirane sa nukleotidnim sekvencama datim u SKQ TOD NOS: 1 i 3. i fragmenti i varijante pomenutih sekvenci amino kiselina koje kodiraju proteine koji obuhvataju AHAS aktivnost.
KRATAK OPIS FIGURA
Figura 1 je poklapanje nukleotidne sekvence nukleotidnih sekvenci genaAHASL Isuncokreta otpornog na herbicide (SLQ ID NO: 1). genaAHASL 1divljeg tipa suncokreta (SFQ ID NO: 3). GenBank prijavni br. U16280 (SEO ID NO: 5). GcnBank prijavni br. AY541451 (SEQ ID NO: 11) i GenBank prijavni br. AY124092 (SHQ ID NO: 13). Mesto mutacije u (SEQ ID NO: 1) je naznačeno sa strelicom. Mutacija je G-u-A tranzicija na nukleotidnoj poziciji 21 od SBQ ID NO:
1. Figura 2 je poklapanje sekvence amino kiseline od proteina AHAS LI suncokreta otpornog na herbicid (SBQ ID NO: 2), proteina AHASL1 divljeg tipa suncokreta (SEQ ID NO: 4). GenBank prijavni br. U16280 (SBQ ID NO: 6). GenBank prijavni br. AY541451 (SEQ ID NO: 12). i GenBank prijavni br. AY124092 (SEQ ID NO: 14). Strelica označava mesto pojedinačne supstitucije amino kiseline (Ala-u-Thr) nađene kod AHASL 1 proteina suncokreta otpornog na herbicid. To mesto supstitucije odgovara poziciji 7 amino kiseline u parcijalnoj dužini AHASL 1 sekvence amino kiseline date u SBQ ID NO: 2. Ekvivalentna pozicija ove supstitucije kod AHASL1 sekvence amino kiseline pune dužine suncokreta iznetc u SEQ ID NO: 12 je 107. Figura 3 je fotografska ilustracija koja pokazuje povećanu toleranciju na herbicid za S4897 biljke suncokreta (desna strana) u poredenju sa IMISUN-1 biljkama suncokreta otpornim na herbicid (Al-Khatib i Miller (2000) Crop Sci. 40:869-870) u studiji u staklenoj bašti. S4897 i IMISUN-1 biljke suncokreta su tretirane sprejom sa imazamoksom u stopi od 200 g ai/ha. Kontrola, biljaka suncokreta divljeg tipa, nije preživela nakon tretmana sprejom sa imazamoksom. u stopi od bilo 100 ili 200 g ai/ha (nije prikazano). Fotografija je napravl jena nekoliko dana nakon što su biljke tretirane sa sprejom. Figura 4 je grafička ilustracija oštećenja od hebicida u testu u staklenoj bašti nakon tretmana sprejom IMISUN-1. divljeg tipa. i S4897 biljaka suncokreta sa imazamoksom. ili u 100 (svetle kolone) ili 200 g ai/ha (tamne kolone). Ova figura pokazuje da S4897 biljke suncokreta otporne na herbicid imaju značajno veću otpornost ili toleranciju na dve stope imazamoksa. kada se poredi bilo sa IMISUN-1 biljkama otpornim na herbicid i sa biljkama divljeg tipa. Oštećenje od herbicida je procenjeno 17 dana jiakon primene imazamoksa. IMISUN-1 biljke su pozr.aie po tome što poseduju alanin-u-valin supstituciju na poziciji amino kiseline 190 (Kolkman i sar.
(2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1 147-1 159). Figura 5 je fotografska ilustracija koja pokazuje povećanu toleranciju na herbicid S4897 biljaka suncokreta (desna strana) u poredenju sa IMISUN-1 biljkama suncokreta tolerantnim na herbicid u trijalu u staklenoj bašti opisanom u Primeru 4. Figure 6 je fotografska ilustracija koja pokazuje povećanu tolerancijuna herbicid S4897 biljaka suncokreta u poredenju sa Clearfieldvarijetetom A biljaka suncokreta u trijalu u staklenoj bašti opisanom u Primeru 5. Figure 7 je grafička ilustracija poređenja inhibicije AHAS sa Raptor ze ne-Clearfield varijetet. Clearfield varijetet i S4897 biljke suncokreta su kao sto je opisano u Primeru 5. Figura 8 je grafička ilustracija poređenja inhibicije AHAS sa Glean za ne-Clearfield varijetet. Clearfield varijetet i S4897 biljke suncokreta su kao što je opisano u Primeru 5. Figura 9 je grafička ilustracija efekta lisne primene imazapira na visinu biljke 14 dana nakon tretmana za dva mutanta suncokreta. Srednje vrednosti visine (% ne tretiranih plotova) su predstavljene sa kvadratima i barovi greške predstavljaju standardnu devijaciju srednjih vrednosti. Figura 10 je grafička ilustracija efekta lisne primene imazapira na indeks fitotoksičnosli (PI) 14 dana nakon tretmana za dva mutanta suncokreta. Srednje vrednosti Pl su predstavljene sa kvadratima i barovi greške predstavljaju standardnu devijaciju srednjih vrednosti. Figura 11 je grafička ilustracija efekta lisne primene imazapira na akumuliranu biomasu 14 dana nakon tretmana za dva mutanta suncokreta. Srednje vrednosti suve biomase (% ne tretiranih plotova) su predstavljene sa kvadratima i barovi greške predstavljaju standardnu devijaciju srednjih vrednosti. Figura 12 je grafička ilustracija efekta lisne primene imazapira na biomasu korena 14 dana nakon tretmana za dva mutanta suncokreta. Srednje vrednosti suvc mase (% ne tretiranih plotova) su predstavljene sa kvadratima i barovi greške predstavljaju standardnu devijaciju srednjih vrednosti.
LISTINO SEKVENCI
Sekvence nukleotida i amino kiselina dalih u pratećem listingu sekvence prikazane su koristeći standardne slovne skraćenice za nukleotidne baze i i njihov kod od tri slova za amino kiseline. Nukleotidne sekvence slede standardne konvencije započinjanja na 5" kraju od sekvence i produžavanja prema napred (//. s leva prema desno u svakoj liniji) prema 3<*>kraju. Prikazan je samo jedan lanac sekvence svake nuklcinske kiseline, ali se pođrazumeva da je komplementarni lanac uključen kada se iznosi prikazani lanac. Sekvence amino kiseline slede standardnu konvenciju započinjanja na amino kraju sekvence i produžavanja unapred (//. s leva prema desno u svakoj liniji) prema karboksi terminusu.
SEQ ID NO: 1 daje nukleotidnu sekvencu delimično dužine koja kodira AHASL 1 protein otporan na herbicid iz linije suncokreta S4897.
SEQ ID NO: 2 daje sekvencu amino kiseline delimične dužine od AHASL 1 proteina otpornog na herbicid kodiranog sa nukleotidnom sekvencom dalo u SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 daje nukleotidnu sekvencu delimične dužine koja kodira divlji tip AHASL 1 proteina iz linije suncokreta BTK47.
SEQ ID NO: 4 daje sekvencu amino kiseline delimične dužine od divljeg tipa AIIASL1 proteina koji kodira nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 je nukleotidna sekvenca iz GenBank prijavni br. U16280.
SEQ ID NO: 6 je sekvenca amino kiseline kodirana sa nukleotidnom sekvencom iz GenBank prijavni br. U16280.
SEQ ID NO: 7 daje nukleotidnu sekvencu od 1IA1U409 prajmera koji je opisan u Primeru 2.
SEQ ID NO: 8 daje nukleotidnu sekvencu od I iAIL 1379 prajmera koji je opisan u Primeru 2. SEQ ID NO: 9 daje nukleotidnu sekvencu od HA 1U1313 prajmera koji je opisan u Primeru 2. SEQ ID NO: 10 daje nukleotidnu sekvencu od HA1L2131 prajmera koji je opisan u Primeru 2. SEQ ID NO: 11 je nukleinska kiselina iz GenBank prijavni br. AY541451.
SEQ ID NO: 12 je sekvenca amino kiseline kodirana sa nukleotidnom sekvencom iz GenBank prijavni br. AY541451.
SEQ ID NO: 13 jc nukleotidna sekvenca iz GenBank prijavni br. AY124092.
SEQ ID NO: 14 je sekvenca amino kiseline kodirana sa nukleotidnom sekvencom iz GenBank prijavni br. AY124092.
DETALJNI OPIS
Predmetna prijava odnosi se na biljke suncokreta koje imaju povećanu otpornost na herbicide kada se uporede sa biljkama suncokreta divljeglipa. Biljke suncokreta otporne na herbicid proizvedene su kao što je ovde dole opisano izlaganjem divljeg tipa (u odnsou na otpornost na herbicid) biljaka suncokreta mutagenu. omogućujući biljkama da sazru i da se reprodukuju. i odabirajući biljke iz potomstva koje su pokazale pojačanu otpornost na herbicid imidazolinon. u odnosu na otpornost biljaka suncokreta divljeg :ipa. Prijava opisuje linije biljaka suncokreta otporne na herbicid koje su ovde označene kao S4897. GM40, i GM1606.
Od S4897 biljaka suncokreta otpornih na herbicid i BTK47 biljaka suncokreta divljeg tipa. kodirajući region gena velike subjedinice acetohidroksikisele sintaze (označen kao AH ASU) je izolovan putem amplifikacijc sa polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) i sekvenciran. Poređenjem sekvenci polinukleotida biljaka suncokreta otpornih na herbicid i divljeglipa. otkriveno je da se kođirajkući region AHASL 1 sekvence polinukleotida biljke suncokreta otporne na herbicid razlikovao od AI1ASL1 sekvence polinukleotida biljke divljeg tipa za jedan pojedinačni nukleotid. G-u-A tranzicija na nukleotidu 21 (SEQ ID NO: 1). ta G-u-A tranzicija u AIIASL1 sekvenci polinukleotida rezultira supstitucijom alanin-u-treonin na amino kiselini 7 (SEQ ID NO: 2) u konzerviranom regionu predviđene sekvence amino kiseline proteina suncokreta otpornog na herbicid AHASL1 (SEQ ID NO: 2). u odnosu na ekvivalentnu poziciju amino kiseline divljeg tipa AHASL] proteina iz linije suncokreta BTK47 (tj.. amino kiselina 7 od SEQ ID NO: 4).
Pošlo nukleotidna sekvenca data u SHQ ID NO: I ne odgovara punoj dužini kodirajućeg regiona AHASL proteina, sekvenca amino kiseline koja je sa njom kodirana koja je data u SEQ ID NO: 2 je takode manja od pune dužine. Da se olakša poređenje sa drugim AHASL sekvencama amino kiseline suncokreta, pozicije amino kiseline AHASL proteina suncokreta koje su ovde date. sem ako je naznačeno drugačije ili je očigledno iz konteksta u kojem se takvoj poziciji javlja, odgovara pozicijama amino kiseline sekvence amino kiseline suncokreta pune dužine AHASL1 proteina kodiranog sa sekvencom nukleotida koja ima GenBank prijavni br. AY541451 (SEQ ID NO: 12). Shodno tome. supstitucija alanin-u-treonin na poziciji 7 amino kiseline od of SEQ IDNO: 2 odgovara poziciji 107 amino kiseline sekvence iz SEQ ID NO: 12.
Prema tome, predmetna prijava uključuje supstituciju amino kiseline koja se može upotrebiti da se proizvedu AHASL proteini suncokreta otporni na herbicid. polinukleotidi koji kodiraju takve proteine, i biljke otporne na herbicid. biljna tkiva, biljne ćelije, i seme. Posto je alanin koji se nalazi na poziciji 107amino kiseline u divljem tipu. AHASL I proteini suncokreta pune dužine ili ekvivalentne pozicija jc u okviru regiona amino kiseline koja je konzervirana širom biljnih vrsta, očekivano je da će supstitucija trconina. za taj isti konzervirani alanin u drugim AHASL proteinima iz suncokreta (npr.. AHASL2 i AHASL3) takođe doneti tolerantnost na herbicid. Prema tome, polinukleotid koji kodira AHASL protein suncokreta može biti muti ran sa bilo kojim metodom koji je poznat u oblasti kao što je. na primer. mutageneza usmerena na mesto da se proizvede polinukleotid suncokreta koji kodira AHASL protein sa treoninom na poziciji 107 ili ekvivalentnoj poziciji. Polinuklcotidne sekvence i sekvence amino kiseline koje su tako kodirane odgovaraju suncokretovimAHASL!. AHASL2.iALL4SL3genima dale su u GenBank prijavni br. AY541451 (SEQ ID NOS: 11 i 12). AY541452. AY541453. AY541454. AY541455. AY541456. AY541457 i AY541458.
Shodno tome. takvi polinukleotidi i AHASL proteini otporni na herbicid kodirani na taj način našli su upotrebu u proizvodnji biljaka otpornih na herbicid. biljnih ćelija, biljnih tkiva, i semena pomoću metoda koji su ovde otkriveni.
Predmetna prijava dodatno obuhvata izolovani sucokret AHASL2 i AIIASL3 poiinukleotide koji kodiraju AHASL2 i AHASL3 proteine otporne na herbicid. respektivno.
U takvim A1IASL2 i AHASL3 proteinima otpornim na herbicid. amino kiselina na pozicji 1 07 ili ekvivalentnoj poziciji jc treonin.
Prijava se dalje odnosi na izolovane polinuklcotidne molekule koji obuhvataju nukleotidne sekvence koje kodiraju veliku podjedinicu proteina acetohidroksikisele sintaze (AHASL) proteina i takve odgovarajuće AHASL proteine. Prijava otkriva izolaciju nukleotidne sekvence polinukleotida koja kodira AHASL 1 protein suncokreta otporan na herbicid iz biljke suncokreta otporne na herbicid koja je produkovana hemijskom mutagenezom biljaka suncokreta divljeg tipa.
AHASL 1 proteini suncokreta otpornog na herbicid iz prijave imaju alanin-u-treonin supstituciju na poziciji 107 ili ekvivalentnoj poziciji u njihovim respektivnim sekvencama amino kiseline, kada se porede sa odgovarajućim divljim tipom sekvence amino kiseline. Prijava dalje otkriva izolaciju i nukleotidnu sekvencu molekula polinukleotida koji kodira AHASL1 protein suncokreta divljeg tipa.
Predmetna prijava opisuje izolovane polinukleotidne molekule koji kodiraju AHASL proteine iz suncokreta( He/ ianthus annuusL.). Specifično, prijava uključuje izolovane polinukleotidne molekule koji obuhvataju: nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NOS: 1 i 3. nukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL proteine koji obuhvataju sekvence amino kiseline date u SEQ ID NOS: 2 i 4. i fragmente i varijante takve nukleotidne sekvence koja kodira funkcionalne AHASL proteine.
Izolovani AHASL polinukleotidni molekuli otporni na herbicide iz prijave obuhvataju nukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL proteine otporne na herbicide. Takvi polinukleotidni molekuli mogu se upotrebiti u polinukleotidnim konstruktima za transformaciju biljaka, posebno biljaka useva, da se pojača otpornost biljaka na herbicide. posebno herbicide za koje je poznato da inhibiraju aktivnost AHAS. još posebnije imidazolinon herbicide. Takvi polinukleotidni konstrukti mogu se upotrebiti u ekspresionim kasetama, ekspresionim vektorima, transformacionim vektorima, plazmiđima i tome slično. Transgene biljke dobijene nakon transformacije sa takvim polinukleotidnim konstruktima pokazuju povećanu otpornost na AI IAS-inhibirajuće herbicide kao što su, na primer. imidazolinon i sulfonilurea herbicidi.
Kompozicije prijave uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL proteine. Specifično, predmetna prijava otkriva izolovane polinukleotidne molekule koji obuhvataju nukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence amino kiseline prikazane u SEQ ID NOS: 2 i 4. i njihove fragmente i varijante koje kodiraju polipeptide koji obuhvataju aktivnost AHAS. Dalje su obezbedeni polipeptidi koji imaju sekvencu amino kiseline koja je kodirana sa polinukleotidnim molekulom ovde opisanim, na primer one prikazane u SEQ ID NOS: 1 i 3. i njihove fragmente i varijante koje kodiraju polipeptide koji obuhvataju aktivnost AHAS.
Prijava obuhvata izolovane ili gotovo u potpunosti prečišćene nukleinske kiseline ili proteinske kompozicije, „izolovani" ili ..prečišćeni" polinukleotidni molekul ili protein, ili njegov biološki aktivni deo. je gotovo u potpunosti ili u osnovi bez komponenti koje normalno prate ili interreaguju sa polinukleotidnim molekulom ili proteinom kao što je nađeno u njegovoj sredini koja se javlja prirodno. Prema tome. izolovani ili prečišćeni polinukleotidni molekul ili protein je gotovo u potpunosti bez drugih ćelijskih materijala, ili medijuma za kulturu kada se produkuje sa rekombinantnim tehnikama, ili gotovo u potpunosti bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan...Izolovana" nukleinska kiselina može biti bez sekvenci (poželjno sekvenci koje kodiraju protein) kjc se prirodno kače na nukleinsku kiselinu (tj., sekvence locirane na 5<;>i 3' krajevima nukleinske kiseline) u genomskoj DNK organizma iz kojeg je nukleinska kiselina izvedena. Na primer. izolovani polinukleotidni molekul može sadržati manje od oko 5 kb. 4 kb. 3 kb, 2 kb. 1 kb. 0.5 kb. ili 0.1 kb od nukleotidne sekvence koja se prirodno kaci na polinukleotidni molekul u genomskoj DNK ćelje iz koje je nukleinska kiselina izvedena. Protein koji jc gotovo u potpunosti bez ćciijskog materijala uključuje preparacije proteina koji ima manje od 30%. 20%. 10%. 5%. ili 1% (prema suvoj težini) od kontaminirajućeg proteina. Kada je protein iz prijave ili njegov biološki aktivan dco proizveden rckombinantno. poželjno medij um za kulturu čini manje od oko 30%. 20%, 10%. 5%. ili 1%
(prema suvoj težini) ili hemijskih prekursora ili hemikalija koje nisu protein od interesa.
Predmetna prijava opisuje izolovane polipeptide koji obuhvataju AHASL proteine. Izolovani polipeptidi obuhvataju sekvencu amino kiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci amino kiselina datih u SEQ ID NOS: 2 i 4. sekvenci amino kiseline kodirane sa nukleotidnim sekvencama datim u SF^Q ID NOS: 1 i 3. i funkcionalni fragmenti i varijante od pomenutih sekvenci amino kiseline koje kodiraju AHASL polipeptid koji obuhvata aktivnost AHAS. pod „funkcionalnim fragmentima i varijantama" podrazumevaju se fragmenti i varijante primernih polipeptida koji obuhvataju aktivnost AIIAS.
Metodi koji su ovde otkriveni mogu uključiti upotrebu biljaka tolerantnih na herbicide ili otpornih na herbicide. Pod biljka ..tolerantna na herbicide" ili ..otporna na herbicide". smatra se da je biljka tolerantna ili otporna na najmanje jedan herbicid u nivou koji bi normalno ubio ili inhibirao rast normalne ili biljke divljeg tipa.
Biljke iz prijave tolerantne na herbicid mogu obuhvatati AHASL protein tolerantan na herbicide ili otporan na herbicide. Pod ..A11AS1 protein tolerantan na herbicide" ili ..AHASL protein otporan na herbicide". podrazumeva se da takav AHASL protein pokazuje višu AHAS aktivnost, u odnosu na AIIAS aktivnost divljeg tipa AHASL proteina, kada je u prisustvu najmanje jednog herbicida za koji je poznalo da je u interferenciji sa AHAS aktivnosti i u koncentarciji ili nivou herbicida za koji je poznato da inhibira AHAS aktivnost divljeg tipa AHASL proteina. Sem toga. AHAS aktivnost takvog na herbicid tolerantnog ili na herbicid otpornog AHASL proteina može se ovde označili kao ..herbicid-tolerantna" ili ..herbicid-otpoma" AIIAS aktivnost.
Ovde. termini ..herbicid-tolerantna" i ..herbicid-otporna" se koriste naizmenično i namenjeni su da imaju ckvivlentno značenje i ekvivalentan domet. Slično tome, termini „toleranca na herbicid" i ..otpornost na herbicid" se koriste naizmenično i namenjeni su da imaju ekvivlentno značenje i ekvivalentan domet. Takođe, termini „otporan na imidazolinon" i ..otpornost na imidazolinon" se koriste naizmenično i namenjeni su da imaju ekvivlentno značenje i ekvivalentan domet kao i termini „tolerantan na imidazolinon" i ..tolerancija na imidazolinone". respektivno.
Prijava obuhvata AHASL polinukleotide otporne na herbicid i AHASL proteine otporne na herbicid. Pod „AHASL polinukleotid otporan na herbicid" podrazumeva se polinukleotid koji kodira protein koji obuhvata AHAS aktivnost otpornu na herbicid. Pod ..AHASL protein otporan na herbicid" podrazumeva se protein ili polipeptid koji obuhvata AIIAS aktivnost otpornu na herbicid.
Dalje je prepoznato da na herbicide tolerantan ili otporan na herbicid AHASL protein može biti uveden u biljku putem transformisanja biljke ili njenog potomka sa nukleotidnom sekvencom koja kodira na herbicid tolerantan ili na herbicid otporan AHASL protein. Takvi na herbicide toleranti ili na herbicide otporni AHASL proteini su kodirani sa AHASL polinuleotidima tolerantnim na herbicid ili otpornim na herbicid. Alternativno, na herbicid tolerantan ili na herbicid otporan AHASL protein može se javiti kod biljke kao rezultat prirodnog javljanja ili inđukovanog sa mutacijom u endogenomAHASLgenu u genomu biljke ili njenim predcima.
Predmetna prijava opisuje biljke, biljna tkiva, biljne ćelije, i ćelije domaćine sa povećanom otpornosti ili tolerancijom na najmanje jedan herbicid. posebno na herbicide imidazoiinon ili sulfonilureu. Količina ili koncentracija herbicida može biti ..efektivna količina" ili ..efektivna koncentracija". Pod ..efektivnom količinom" i ..efektivnom koncentracijom" je predviđena količina i koncentraija. respektivno. koja jc dovoljna da ubije ili inhibira rast slične, divljeg tipa, biljke, biljnog tkiva, biljne ćelije, ili ćelije domaćina, ali da pomenuta količina ne ubija ili inhibira lako snažno rast biljaka otpornih na herbicid. biijnih tkiva, biljnih ćelija, i ćelija domaćina predmetne prijave. Tipično, efektiv na količina herbicida je količina koja je rutinski upotrebljena u poljoprivrednim proizvodnim sistemima da se ubiju korovi za koje postoji interes. Takva količina je poznala stručnjacima iz oblasti.
Pod „sličan, divlji tip, biljka, biljno tkivo, biljna ćelija ili ćelija domaćin" podrazumeva se biljka, biljno tkivo, biljna ćelija ili ćelija domaćin, respektivno. kojima nedostaju karakteristike otpornosti na herbicide i/ili određeni polinukleotid iz prijave koji su otkriveni ovde. Upotreba termina"divlji tip" nije, prema tome. namenjena da označi da biljka, biljno tkivo, biljna ćelija ili drugi domaćin nemaju rekombinantnu DNK u svom genomu. i/ili ne poseduju karakteristike otpornosti na herbicid koje su različite od onih koje su ovde otkrivene.
Onako kako se ovde koristi sem ako je jasno naznačeno drugačije, termin „biljka" je namenjen da podrazumeva na bilo kom stupnju razvoja, kao i bilo koji deo ili delove biljke koji mogu biti pričvršćeni ili odvojeni od cele intaktne biljke. Takvi delovi biljke uključuju, ali nisu ograničeni na, organe, tkiva, i ćelije biljke. Primeri određenih biljnih dolova uključuju odrđene biljne delove, određeni biljni delovi uključuju stablo, list, koren, cvast, cvet. klas, plod, drška, peteljka, prašnik. antera, stigma, tučak. ovarijum. Čašica, krunica, tučak. vrh korena. korenova kapa. korenova dlaka, lisna dlaka, dlaka semena. zrno polena, mikrospora. koliledon, hipokotil, epikolih ksilem, flocm, parenhim. endosperm. prateća ćelija, zaštitna ćelija, i bilo koji drugi poznati organi, tkiva, i ćelije biljke. Sem toga. prepoznato je da je seme biljka.
Biljke predmetne prijave uključuju i nc-lransgene biljke i transgene biljke. Za ,.ne-transgena biljka" predviđeno je da označava biljku koja nema rekombinantnu DNK u svom genomu. Za „transgcna biljka" predviđeno je da označava biljku koja obuhvata rekombinantnu DNK u svom genomu. Takva transgena biljka može se proizvesti uvođenjem rekombinantne DNK u genom biljke. Kada je takva rekombinantna DNK inkorporirana u genom transgene biljke, potomstvo biljke može takode saržati rekombinantnu DNK. Biljka potomak koja obuhvata najmanje jedan deo rekombinantne DNK od najmanje jedne predačke transgene biljke je takođe transgena biljka.
Predmetna prijava opisuje liniju suncokreta otpornu na herbicid koja je ovde prikazana kao S4897 i potomstvo i njegove derivate koji obuhvataju karakteristike otpornosti na herbicid od S4897. Depozit semena GM40 suncokreta koja su izvedena od linije suncokreta S4897 i obuhvata karakteristike otpornosti na herbicid od S4897 napravljen je od Patentnog depozitorijuma kolekcije američkih tipova kultura (ATCC). Mansassas. VA 20110 USA i prijavljena 17 maja. 2005. ATCC Patent broj depozita PTA-6716. Depozit linije suncokreta GM40 je napravljen za vreme od najmanje 30 godina i najmanje 5 godina nakon najskorijih zahteva za popunu uzorka sa depozita je primljen u ATCC. Sem loga. prijavioci su zadovoljili sve zahteve iz 37 C.l.R. ^ 1.801-1.809. uključujući obezbedivanje pokazatelja vijabilnosti uzorka.
Predmetna prijava dalje opisuje liniju suncokreta otpornu na herbicid koja je ovde označena kao GM1606. Depozit semena suncokreta Ml606 napravljen je za Patentni đepozitorijum kolekcije američkih tipova kultura (ATCC), Mansassas. VA 20110 USA 19 maja. 2006 i označen ATCC Patentni depozit broj PTA- 7606. Depozit suncokreta GM1606 je napravljen za vreme trajanja od najmanje 30 godina i najmanje 5 godina nakon najskorijeg zahteva primljenog od A TCC za isporuku uzorka iz depozita. Sem toga, prijavilac je zadovoljio sve zahteve od 37 C.l .R. §§ 1.801-1.809. uključujući obezbedivanje pokazatelja vijabilnosti uzorka.
Predmetna prijava opisuje biljke suncokreta otporne na herbicide koje su proizvedene mutacionim gajenjem. Biljke suncokreta divljeg tipa su mutagenizovane putem izlaganja biljaka mutagenu. posebno hemijskom mulagenu. još određenije etil metansuifonatu (EMS). Međutim, predmetna prijava nije ograničena na biljke suncokreta otporne na herbicide koje su proizvedene metodom mutageneze uključujući hemijski mutagen EMS. Bilo koji metod mutageneze koji je poznat u oblasti može se upotrebiti da se proizvedu biljke suncokreta otporne na herbicid koje su ovde otkrivene. Takvi metodi mutageneze mogu uključiti, na primer. upotrebu jednog ili više od sledećih mutagena: zračenje, kao što su X-zraci. Gama zraci (npr.. kobalt 60 ili cezijum 137). neutrone, (npr.. produkt nuklearne fisije sa uranijumom 235 u atomskom reaktoru), beta zračenje (npr.. cmitovano sa radioizotopima kao što su fosfor 32 ili ugljenik 14), ultravioletnim zračenjem (poželjno od 2500 do 2900 nm), i hemijskim mitagenima kao što su analozi baza (npr.. 5-bromo-uracil). srodna jedinjenja (npr.. 8-etoksi kafein). antibiotici (npr.. streptonigrin), alkilirajući agensi (npr.. sumporne boje, azotne boje, epoksidi, etilenamini, sulfati, sulfonati, su!foni, laktoni), azid, hidroksilamin. azolasta kiselina, ili akridini. Biljke otporne na herbicide mogu se takođe proizvesti upotrebom metoda kulture tkiva da se obavi selekcija za ćelije biljke koje obuhvataju mutacije otporne na herbicide i zatim regenerisanja biljaka otpornih na herbicide iz njih. Vidi. na primer, U.S. Patente br. 5.773.702 i 5.859.348.
Dalji detalji mutacionog gajenja mogu se naći u ..Principi razvitka kultivara" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Companv.
AnalizaAHASL1gena biljke suncokreta iz S4897 i GM1606 linija otkrila je da mutaciju koja kao rezultat ima supstituciju treonin umesto alanina koji se nalazi na poziciji 7 amino kiseline u divljem tipu AHASL 1 sekvence amino kiseline za SLQ ID NO: 4. Pozicija amino kiseline 7 u SEQ ID NOS: 2 i 4 odgovara poziciji amino kiseline 107 u sekvenci amino kiseline A1IASL1 proteina pune dužine suncokreta date u SLQ ID NO: 12. Prema tome. supstitucija treonin umesto alanina na poziciji 107 amino kiseline, ili na ekvivalentnoj poziciji, u AHASL proteinu može uzrokovali da biljka suncokreta ima pojačanu otpornost na herbicid. posebno herbicid imidazolinon i/ili sulfonilureu. Kao sto je otkriveno u Primeru 6 dole. alanin na pozieiji 107 amino kiseline javlja se u okviru konzerviranog regiona AHASL proteina. Slično tome otkriveno je da supstitucija amino kiseline u drugim konzervisanim regionima AHASL proteina donosi otpornost na biljku koja obuhvata takav AHASL protein. Shodno tome. biljke suncokreta iz prijave uključuju, one biljke suncokreta koje obuhvataju u svojim genomima najmanje jednu kopiju AIIASL polinukleotida koji kodira AHASL protein otporan na herbicid koji sadrži treonin na poziciji 107 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji.
Biljke suncokreta iz prijave dalje uključuju biljke koje obuhvataju. u odnosu na divlji tip AHASL proteina, treonin na poziciji 107 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji, i jednu ili više dodatnih supstitucija amino kiseline AHASL proteina u odnosu na divlji tip AHASL proteina, gde takva biljka suncokreta ima povećanu otpornost na najmanje jedan herbicid kada se poredi sa divljim tipom biljke suncokreta. Takve biljke suncokreta obuhvataju AHASL proteine koji obuhvataju treonin na poziciji 107 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji i najmanje jedan član odabran od grupe koja se sastoji od: glutamina. ili serina na poziciji 182 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji: izoleucin ili drugu amino kiselinu koja nije treonin na poziciji 188 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji: aspartat ili valin na poziciji 190 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji; lcucin na poziciji 559 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji: i asparagin. treonin. fenilalanin. ili valin na poziciji 638 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji.
Predmetna prijava opisuje AHASL proteine sa supstitucijama amino kiseline na određenim pozicijama amino kiseline u okviru konzerviranih regiona AHASL proteina suncokreta otkrivenih ovde. Sem toga. stručnjaci će prepoznati da takve pozicije amino kiseline mogu varirati u zavisnosti da li su amino kiseline dodane ili uklonjene od. na primer. N-terminalnog kraja sekvence amino kiseline. Tako. prijava obuhvata supstitucije amino kiseline na navedenoj poziciji ili na ekvivalentnoj poziciji (npr....pozicija 107 amino kiseline ili ekvivalentna pozicija"). Sa ..ekvivalentnom pozicijom" predviđeno je da znači poziciju koja je u okviru istog konzerveranog regiona što je potvrđeno pozicijom amino kiseline. Takvi konzervirani regioni su poznati u oblasti (vidi Tabelu 4 dole) ili se mogu odrediti sa višestrukim poklapanjima sekvence kao što je ovde otkriveno ili sa metodima poznatim u oblasti.
Sem toga, predmetna prijava opisuje AHASL polipeptide koji obuhvataju supstitucije amino kiseline za koje je poznato da donose otpornost biljke na najmanje jedan herbicid. posebno na herbicid imidazolinon. i/ili herbicid sulfonilureu. Takvi AHASL polipeptidi uključuju, na primer, one koji obuhvataju treonin na poziciji 107 amino kiseline i najmanje jedan elan odabran od grupe koja se satoji od: glutamina, ili serina na poziciji 182 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji: izoleucina ili drugu amino kiselinu koja nije treonin na poziciji 188 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji; aspartata ili valina na poziciji 190 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji; aspartata ili valina na poziciji 190 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji; leucina na poziciji 559 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji; i asparagina, trconina, fenilalanina. ili valina na poziciji 638 amino kiseline ili na ekvivalentnoj poziciji. Prijava dalje opisuje izolovane polinukleotide koji kodiraju takve AHASL polipeptide. kao i ekspresione kasete, transformacione vektore, transformisane ćelije domaćine, transformisane biljke, i metode koji obuhvataju takve polinukleotide.
Predmetna prijava opisuje metode za pojačavanje tolerancije ili otpornosti biljke, biljnog tkiva, biljne ćelije, ili druge ćelije domaćina na najmanje jedan herbicid koji interferira sa aktivnosti AHAS enzima. Takav herbicid može biti herbicid imidazolinon. herbicid sulfonilurea. herbicid triazolopirimiđin. herbicid pirimidiniloksibenzoat. herbicid sulfonilamino-karboniltriazolinon. ili njihovu mešavinu. Takav herbicid može biti herbicid imidazolinon. herbicid sulfonilurea, ili njihova mešavina. Imidazolinon herbicidi uključuju, ali nisu ograničeni na, PURSUIT® (imazetapir). CADRE® (imazapik). RAPTOR® (imazamoks). SCEPTER®
(imazakvin). ASSERT® (imazetabenz). ARSENAL® (imazapir). derivat bilo kog od gore pomenutih herbicida. i mešavinu dva ili više gore pomenutih herbicida. na primer. imazapir/imazamoks (ODYSSEY®).
Još spcifičnije, herbicid imidazolinon može se odabrati od, ali nije ograničen na, 2-(4-izopropiI-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-nikotinske kiseline. 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-iI)kvinoIin-3-karboksilične kiseline. 5-etil-2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-nikotiniske kiseline. 2- (4-izopropil- 4-metil-5-okso- 2-imidazolin-2-il)-5-(metoksimetil)- nikotiniskc kiseline. 2-(4-izopropil- 4-metil- 5-okso- 2-imidazolin-2-il)-5-metilnikotinskc kiseline, i mešavine od metil 6-{4-izopropil- 4-metil- 5-okso- 2-imidazonlin-2-il)-m-toluata i metil 2-(4-izopropil-4-metil-5- okso-2-imidazolin-2-il)-p-toluala. Upotreba 5-ctil-2-(4-izopropil- 4-metil- 5-okso- 2-imidazolin-2-il)-nikotinske kiseline i 2-(4-izopropil- 4-melil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-metoksimetilnikolinske kiseline je poželjna. Upotreba 2-(4-izopropil- 4-metil- 5-okso- 2-imidazolin-2-il)- 5-metoksimetilnikotinske kiseline je posebno poželjna.
/.a predmetnu prijavu, herbicidi sulfoniluree uključuju, ali nisu ograničeni na. hlorsulfuran. metil metsulfuron. metil sulfometuron. etil hlorimuron. metil tifensulfuron. metil tribenuron. metil bensulfuron. nikosulfuron. metil etameisulfuron. rimsulfuron. metil triflusulfuron. iiiasulllnon. metil primisulfuron. cinosulltiron. tmiidosulfuron. flazasulfuron. imazosulfuron. etil pirazosulfuron. halosulfuron. azimsulfuron. ciklosulfuron, etoksisulfuron. flazasull'uron. metil llupirsulfuron. foramsulfuron. jodosulfuron. oksasulfuron. mezosulfuron. prosulfuron, sulfosulfuron, tritloksisulluron, tritosulfluron. derivat bilo kog od gore pomenutih herbicida, i mešavine dva ili više od gore pomenutih herbicida. Triazolopirimidin herbicidi uključuju, ali nisu ograničeni na, kloransulam, diklosulam. florasulam. flumetsulam. metosulam, i penoksulam. Pirimidiniloksibenzoat herbicidi uključuju, ali nisu ograničeni na. bispiribak. piritiobak. piriminobak. piribenzoksim i piriftalid. Sulfonilaminokarboniltriazolinon herbicidi uključuju, ali nisu ograničeni na. flukarbazon i propoksikarbazon.
Prepoznato je da su pirimidiniloksibenzoat herbicidi blisko srodni sa pirimiđiniltiobenzoat herbicidima i generalizovani su pod zaglavljem sa velikim imenom slova od strane Weed Science Societv of America. Shodno tome. herbicidi predmetne prijave dalje uključuju pirimiđiniltiobenzoat herbicide. uključujući. ali bez ograničenja na, pirimidiniloksibenzoat herbicide opisane gore.
Predmetna prijava opisuje metode za pojačavanje AHAS aktivnosti kod biljke koji obuhvataju transformisanje biljke sa polinukleotidnim konstruktom koji obuhavata promotor operativno vezan za nukleotidnu sekvencu AHASL 1 iz prijave. Metodi uključuju uvođenje polinukleotidnog konstrukta iz prijave u najmanje jednu biljnu ćeliju i regenerisanje transformisane biljke iz nje. Metodi uključuju upotrebu promotora koji je sposoban da vodi ekspresiju gena u biljnoj ćeliji. Takav promotor može biti konstitutivni promotor ili tkivno poželjan promotor. Metodi su našli upotrebu u pojačavanju ili povećanju otpornosti biljke na najmanje jedan herbicid koji interferira sa katalitičkom aktivnosti AIIAS enzima, posebno imidazolinon herbicida.
Predmetna prijava opisuje ekspresione kasete za ekspresiju polinukleotida prijave kod biljaka, biljnih tkiva, biljnih ćelija i drugih ćelija domaćina. Ekspresione kasete obuhvataju promotor koji se može eksprimirati u biljci, biljnom tkivu, biljnoj ćeliji, ili u drugim ćelijama domaćinima koje su od interesa i operativno je vezan za polinukleotid iz prijave koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira ili pune dužine (tj. uključujući tranzitni peptiđ hloroplasta) ili zreo AHASL1 protein (tj. bez tranzitnog peplida hloroplasta). Ako je ekspresija poželjna u plastidima ili hloroplaslima biljaka ili biljnim ćelijama, ekspresiona kaseta može takođe obuhvatati jednu operativno vezanu sekvencu usmerenu na hloroplast koja kodira tranzitni peptid hloroplasta.
Ekspresione kasete iz prijave našle su upotrebu u metodu za pojačavanje tolerancije na herbicide biljke ili ćelije domaćina. Metod uključuje transformisanje biljke ili ćelije domaćina sa ekspresionom klasetomizprijave, pri čemu ekspresiona kaseta obuhvata promotor koji se može eksprimirati kod biljke ili ćelije domaćina za koje postoji interes i promotor je operativno vezan za polinukleotid iz prijave koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira AHASL protein iz prijave otporan na herbicid.
Upotreba termina ..polinukleotidni konstrukti" ovde nije namenjena da ograniči predmetni pronalazak na polinukleotidne konstrukte koji obuhvataju DNK. Stručnjaci iz oblasti prepoznaće da polinukleotidni konstrukti, posebno polinukleotidi i oligonukleotidi, sastavljeni od ribonukleotida i kombinacija ribonukleotida i deoksiribonukleolida mogulakode da se upotrebe u metodima koji su ovde otkriveni. Prema tome, polinukleotidni konstrukti predmetne prijave obuhvataju sve polinukleotidne konstrukte koji se mogu upotrebiti u metodima predmetne prijave za transformisanje biljaka uključujući, ali bez ograničenja na. one sastavljene od deoksiribonukleotida, ribonukleotida. i njihovih kombinacija. Takvi deoksiribonukleotidi i ribonukleotidi uključuju i molekule koji se prirodno javljaju i sintetičke analoge. Polinukleotidni konstrukti iz prijave takođe obuhvataju sve oblike polinukleotidnih konstrukta uključujući, ali bez ograničenja na, jcdno-lančane oblike, dvo-lančane oblike, ukusnice, kalem-i-petlja strukture. i tome slično. Sem toga, shvaćeno je od strane stručnjaka u oblasti da svaka nukleotidna sekvenca koja je ovde obelodanjcna takođe obuhvata komplement nukleotidnih sekvenci datih primerom.
Sem loga, prepoznato je da metodi prijave mogu da upotrebe polinukleotidni konstrukt koji je u stanju da usmeri, kod transformisane biljke, ekspresiju najmanje jednog proteina, ili najmanje jedne RNK. kao što je, na primer. antisens RNK koja je komplementarna najmanje jednom delu mRNK. Tipično, takav polinukleotidni konstrukt je sastavljen od kodirajuće sekvence za protein ili RNK operativno vezanu za 5' i 3" transkripcione regulalorne regionc. Alternativno je takođe prepoznato da metodi iz prijave mogu upotrebiti polinukleotidni konstrukt koji nije sposoban za usmeravanje. kod transformisane biljke, ekspresije proteina ili RNK.
Dalje je prepoznato da. za ekspresiju polinukleotida iz prijave u ćeliji domaćinu za koju postoji interes, polinukleotid je tipično operativno vezan za promotor koji je u stanju da vodi ekspresiju gena u ćeliji domaćinu za koju postoji interes. Metodi iz prijave za ekspresiju polinukleotida u ćelijiama domaćina ne zavise od određenog promotora. Metodi obuhvataju upotrebu bilo kog promotora koji je poznat u oblasti i koji je sposoban da vodi ekspresiju gena u ćeliji domaćinu za koju postoji interes.
Predmetna prijava obuhvata molekule AHASL polinukleotida i njegovih fragmenata i varijanti. Polinukleotidni molekuli koji su fragmenti tih nukleotidnih sekvenci su takodc obuhvaćeni sa predmetnom prijavom. Pod ..fragmentima" je predviđen deo nukleotidne sekvence koja kodira AHASL protein iz prijave. Fragment nukleotidne sekvence AHASL iz prijave može kodirati biološki aktivni deo AHASL proteina, ili može biti fragment koji se može upotrebiti kao hibridizaciona proba ili PCR prajmer koristeći metode otkrivene dole. Bioioški aktivan deo AHASL proteina može se pripremili putem i/olovan ja dela jedne od nukleotidnih sekvenci AHASL iz prijave, eksprimiranjem kodirajućeg dela AHASL proteina (npr.. putem rekombinantne ekspresijein vilro).i procenjivanjem aktivnosti kodirajućeg dela AHASL! proteina. Polinukleotidni molekuli koji su fragmenti nukleotidne sekvence AHASL obuhvataju najmanje oko 15. 20. 50, 75, 100, 200, 300. 350, 400. 450. 500. 550. 600, 650. 700. 750. 800. 850. 900. 950, 1000, 1050. ili 1100 nukleotida. ili sve do broja nukleotida prisutnih u nukleolidnoj sekvenci pune dužine otkrivenoj ovde (na primer. 1178 nukleotida i za SEQ ID NOS: 1 i za 3) u zavisnosti od namenjene upotrebe.
Fragment nukleotidne sekvence AHASL koja kodira biološki aktivan deo AHASL proteina iz prijave kodiraće najmanje oko 15. 25. 30. 50, 75. 100. 125. 150. 175. 200. 250. 300, ili 350 kontinuiranih amino kiselina, ili sve do ukupnog broja amino kiselina prisutnih u AHASLI proteinu pune dužine iz prijave (na primer, 392 amino kiseline date u SEQ ID NOS: 2 i 4). Fragmenti nukleotidne sekvence AI1ASF1 koji su korisni kao hibridizacione probe za PCR prajmere generalno ne moraju biti kodirani biološki aktivnim delom AHASL1 proteina.
Polinukleotidni molekuli koji su varijante nukleotidne sekvence otkrivene ovde su takode obuhvaćeni sa predmetnom prijavom...Varijante" AHASL nukleotidne sekvence iz prijave uključuju one sekvence koje kodiraju AHASL proteine otkrivene ovde ali koji se razlikuju konzervativno zbog degeneracije genetičkog koda. Ove alelskc varijante koje se javljaju prirodno mogu se identifikovati putem upotrebe dobro poznatih tehnika molekularne biologije, kao Što su lančane reakcije polimeraze (PCR) i hibridizacione tehnike kao što je istaknuto dole. Varijante nukleotidnih sekvenci takođe uključuju sintetički izvedene nukleotidne sekvence koje su generisane. na primer. upotrtebom mutageneze usmerene na mesto kojom se još uvek kodira AHASL1 protein otkriven u predmetnoj prijavi kao sto je diskutovano dole. Generalno, varijante nukleotidnih sekvence iz prijave imaće najmanje oko 70%. 75%.. 80%. 85% 90%. 91%. 92%, 93%, 94%, 95%. 96%, 97%. 98%, ili 99% identičnosti sa određenom nukleotidnom sekvencom koja je ovde otkrivena. Varijanta nukleotidne sekvence AHASL kodiraće AHASL protein, respektivno. koji ima sekvencu amino kiseline koja ima najmanje 95%. identičnosti sa sekvencom amino kiseline od AFIASL proteina otkrivenog ovde.
Sem loga. stručnjak će dalje prihvatiti da da se promene mogu uvesti putem mutacije u nukleotidne sekvence iz prijave dovodeći tako do promena u sekvenci amino kiseline kodiranih AHASL proteina bez izmene u biološkoj aktivnosti AHASL proteina. Prema tome. izolovani molekul polinukleotida koji kodira AHASL protein koji ima sekvencu koja se razlikuje od one iz SLQ 11) NOS: 1 ili 3. respektivno. može se kreirali pniem uv ođenja jedne ili više supstitucija nukleotida. adicija. ili delecija u odgovarajuću nukleotidnu sekvencu koja je ovde otkrivena, tako da su jedna ili više supstitucija amino kiseline, adicija. ili delecija uvedene u kodirajući protein. Mutacije se mogu uvesti standardnim tehnikama, kao što je mutageneza usmerena na mesto. i mutageneza posredovana sa PCR. Takve varijantne nukleotidne sekvence su takođe obuhvaćene predmetnom prijavom.
Na primer. konzervativne supstitucije amino kiseline mogu biti napravljene na jednom ili više predviđenih, opciono neesencijalnih ostataka amino kiseline...Neesencijalni" ostatak amino kiseline je ostatak koji se može izmeniti od đivljg tipa sekvence AHASL proteina (npr.. sekvence (SEQ ID NOS: 2 i 4. respektivno) bez menjanja biološke aktivnosti, pošto je „esencijalni" ostatak amino kiseline neophodan za biološku aktivnost. Konzervativna susptitucija amino kiseline je ona u kojoj je ostatak amino kiseline zamenjen sa ostatkom amino kiseline koji ima sličan bočni lanac. Porodice ostataka amino kiseline koje imaju slične bočne lance su definisane u oblasti. Ove porodice uključuju amino kiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin. arginin. histidin), kiselim bočnim lancima (npr.. aspartička kiselina, glulaminska kiselina), ne naelektrisanim polarnom siranom bočnih lanaca (npr.. glicin, asparagin. glutamin. serin, treoninc tirozin, cistein). ncpolarnim bočnim lancima (npr.. alanin. valin. leucin. izoleucin. prolin. fenilalanin, mctionin, triptofan). beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr.. tirozin. fenilalanin. triptofan, histidin). Takve supstitucije neće biti napravljene za konzervirane ostatke amino kiselina ili za ostatke amino kiselina koji su smešteni unutar konzerviranog motiva.
Proteini iz prijave mogu se izmeniti na različite načine uključujući supstitucije amino kiseline, delecije. skraćivanja, i insercije. Metodi za takve manipulacije su generalno poznati u oblasti. Na primer. varijante sekvence amino kiseline AHASL proteina mogu se pripremiti pomoću mutacija u DNK. Metodi za mutagenezu i izmene nukleotidne sekvence dobro su poznati u oblasti. Vidi. na primer. Kunkel (1985) Proc. Nali. Acad Sci. USA. 82:488-492; Kunkel i sar. (1987) Methods in Kzvmol. 154: 367-382: U.S. Patent br. 4.873,192; Walker i Gaastra. izd. (1983) Tehnike u molekularnoj biologiji (MacMillan. Publishing Companv. New York) i reference koje su tu citirane. Uputstvo za odgovarajuće supstitucije amino kiseline koje ne pogađaju biološku aktivnost proteina za koji postoji interes može se naći u modelu Dayhoff i sar. (1978) Atlas sekvenci proteina i struktura (Natl. Biomed. Res. l ound.. Washington. D.C.).
Konzerv ativ ne supstitucije, kao sto je razmena jedne amino kiseline sa drugom koja ima slične karakteristike, mogu biti poželjne.
Alternativno, varijanta AHASL nukleotidnih sekvenci može se napraviti uvođenjem mutacija po principu slučajnosti duž cele ili dela AHASL kodirajuće sekvence. kao šio je putem zasićene mutageneze. i nastali mutanti mogu se pregledati ti odnosu na prisustvo AHAS aktivnosti da se identifikuju mutanti koji zadržavaju AHAS aktivnost, uključujući AHAS aktivnost otpornosti na herbicid. Nakon mutageneze. kodirani protein može se eksprimirati rckombinanlno. i aktivnost proteina može se odrediti koristeći standardne ogledne tehnike.
Prema tome, nukleotidne sekvence prijave uključuju sekvence otkrivene ovde kao i njihove fragmente i varijante.AHASLsekvence nukleotida iz prijave, i njihovi fragmenti i varijante mogu se upotrebiti kao probe i/ili prajmeri da se identifikuje i/ili kloniraju AHASL homolozi kod drugih biljaka. Takve probe se mogu upotrebiti da se detektuju transkripti ili genomske sekvence koje kodiraju iste ili identične proteine.
Na takav način, metodi kao što je PCR. hibridizacija. i tome slično mogu se upotrebiti da se identifikuju takve sekvence koje imaju gotovo potpunu identičnost sa sekvencama iz prijave. Vidi, na primer, Sambrook i sar. (1989) Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik (2. izd., Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Plainvievv. NY) i Innis. i sar. (1990) PCR protokoli: vodič za metode i primene (Academic Press. NY).AHASLnukleotidne sekvence izolovane na osnovu njihove sekvence identične sa AHASL 1 nukleotidnim sekvencama datim ovde ili sa njihovim fragmentima i varijantama su obuhvaćene predmetnom prijavom.
U hibridi/.acionom metodu, svi delovi poznale sekvenceAHASLnukleotida mogu se upotrbiti da se pregledaju cDNK ili genomske biblioteke. Metodi za konstrukciju takvih cDNK genomskih biblioteka su generalno poznati u oblasti i otkriveni su u Sambrook i sar. (1989) Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik (2d izd.. Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Plainvievv. NY). Takozvane hibridizacione probe mogu biti genomski fragmenti DNK. fragmenti cDNA, fragmenti RNK. ili drugi oligonukleotidi, i mogu se obeležiti sa đetektabilnom grupom kao što je<32>P, ili bilo kojim drugim detektabilnim markerom. kao što su drugi radioizotopi. fluorescentno jedinjenje. enzim, ili enzimski ko-faktor. Probe za hibridizaciju mogu se napraviti pulem obeleŽavanja sa sintetičkim oligonukleotidima zasnovanom na poznatoj nukleotidnojAHASLsekvenci koja je ovde otkrivena. Dodatno se mogu upotrebiti degenerativni prajmeri označeni na osnovu konzerviranih nukleotida ili ostataka amino kiseline u poznatoj nukleotidnojAHASLsekvenci ili sekvenci kodirane amino kiseline. Proba tipično obuhvata region nukleotidne sekvence kojac hibridizuju pod uslovima strogoće od najmanje oko 12. poželjno oko 25. još poželjnije oko 50. 75. 100, 125. 150. 175. 200. 250. 300. 350. 400, 500. 600. 700. 800. 900. 1000. 1100. ili 1178 uzastopnih nukleotidaAHASLnukleotidne sekvence iz prijave ili njihov fragment ili varijanta. Pripremanje proba za hibridizaciju je generalno poznato u oblasti i otkriveno je u Sambrook i sar. (1989) Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik (2. izd.. Cold Spring Harbor Laborator> Press. Plainvievv. New York).
Na primer. cei aAHASLsekvenca otkrivena ovde. ili jedan njen deo ili \ iše mogu se upotrebiti kao proba sposobna za specifičnu hibridizaciju za odgovarajućeAHASLsekvence i mesindžer RNK. Hibridizacione tehnike uključuju hibridizacioni skrining plejlovanih biblioteka DNK (bilo pločice ili kolonije: vidi. na primer. Sambrook i sar. (1989) Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik (2. izd.. Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Plainvievv. New York).
Hibridizacija takvih sekvenci može se obaviti pod uslovima strogoće. Pod ..uslovima strogoće" ili „uslovima strogoće hibridizacije" su predviđeni uslovi pod kojima će proba hibridizovati za svoju ciljnu sekvencu u detektabilno višem nivou nego za druge sekvence (npr.. najmanje 2-puta u odnosu na pozadinu). Uslovi strogoće su zavisni od sekvenci i biće različiti u različitim okolnostima.
Tipično će uslovi strogoće biti oni u kojima je koncentracija soli manja od oko 1.5 M Na jona. tipično oko 0.01 do 1.0 M Na koncentracije jona (ili drugih soli) pri pH 7.0 do 8.3 i temperatura je najmanje oko 30 °C za kratke probe (npr., 10 do 50 nukleotida) i najmanje oko 60 °C za duge probe (npr.. duže od 50 nukleotida). Uslovi strogoće mogu se takođe postići sa dodavanjem agensa za destabilizaciju kao što je formamid. Primerni uslovi niske strogoće uključuju hibridizaciju sa puferskim rastvorom od 30 do 35% formamida, 1 M NaCl. 1% SDS (natrijum dodecil sulfat) na 37 °C, i ispiranje je IX do 2X SSC (20X SSC - 3.0 M NaCl/0.3 M trinatrijum citrat) na 50 do 55 °C. Primerni uslovi umcrcne strogoće uključuju hibridizaciju u 40 do 45% formamidu, 1.0 M NaCl. 1% SDS na 37 °C. i ispiranje u 0.5X do IX SSC na 55 do 60 °C. Primerni uslovi visoke strogoće uključuju hibridizaciju u 50% formamidu. 1 M NaCl. 1% SDS na 37 °C. i ispiranje u 0.1X SSC na 60 do 65 °C. Opciono. pufcri za ispiranje mogu sadržati oko 0.1% do oko 1% SDS. Trajanje hibridizacije je generalno manje od oko 24 časa. obično oko 4 do oko 12 časova.
Specifičnost jc tipično funkcija post-hibridizacionih ispiranja, kritični faktori su jonska otpornost i temperatura konačnog rastvora za ispranje. Za DNK-DNK hibride. Tm može bili izračunato iz jeđnačine Mcinkoth-a i Wahl-a (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L: gde je M molarilet monovalentnih katjona. %GC je procenat guanin i citozin nukleotida u DNK. % oblik je procenat formamida u hibridizacionom rastvoru, i L je dužina hibrida u baznim parovima. Tmtemperatura (pod definisanom jonskom otpornosti i pll) pri kojoj 50% od komplementarne ciljne sekvence hibridizuje do probe koja se perfektno poklapa. Tmje redukovano za oko 1°C za svaki 1% pogrešnog poklapanja; prema tome. '\' m. bibriđizacija. i/ili ili uslovi ispiranja mogu se doterati da se hibridizuje za sekvence željenog identiteta. Na primer. ako su potrebne sekvence sa<>>90% identičnosti. Tmse može smanjiti za 10 °C. Generalno, uslovi strogoće odabrani su da budu oko 5 °C niži od termalne tačke topljrnja (Tm) za specifičnu sekvencu i njen komplement pri đefinisanoj jonskoj snazi i pH. Međutim, nekoliko uslova strogoće mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 1.2. 3. ili 4 °C niže od termalne tačke topljenja (Tm); umereni uslovi strogoće mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 6. 7. 8. 9. ili 10<C>C niže od termalne tačke topljenja (Tm); niski uslovi strogoće mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 11. 12. 13. 14, 15. ili 20 °C niže od termalne tačke topljenja (Tm). Koristeći jednaČinu. hibridizacija i ispiranje kompozicija, i željeni Tm, stručnjaci će shvatiti da varijacije u strogoći hibridizacije i/ili rastvorima za ispiranje su suštinski opisani. Ako željeni stepen pogrešnog spajanja rezultira u 1 m manjem od 45 °C (vodeni rastvor) ili 32 °C (rastvor formamida). poželjno je da se poveća koncentracija SSC tako da se može upotrebiti viša temperatura. Sveobuhvatan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina je nađen u Tijsscn (1993) Laboratorijske tehnike u biohemiji i molekularnoj biologiji hibridizacije sa probama nukleinskih kiselina. Deo I. Poglavlje 2 (Elsevier. New York); i Ausubel i sar.. izd. (1995) Tekući protokoli u molekularnoj biologiji. Poglavlje 2 (Greene Publishing i Wiley-Interscience. New York). Vidi Sambrook i sar. (1989) Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik (2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainvievv. New York).
Prepoznato je da polinukleotidni molekuli i proteini iz prijave obuhvataju polinukleotidne molekule i proteine koji obuhvataju nukleotid ili sekvencu amino kiseline koja je dovoljno identična nukleotidnoj sekvenci iz SLQ ID NOS: 1 i/ili 3. ili sekvenci amino kiseline iz SEQ ID NOS: 2 i/ili 4. Termin „dovoljno identična" se ovde koristi da označi prvu amino kiselinu ili nukleotidnu sekvencu koja sadrži dovoljan ili minimalan broj identičnih ili ekvivalentnih (npr., sa sličnim bočnim lancem) ostataka amino kiseline ili nukleotida prema drugoj amino kiselini ili sekvenci nukleotida tako da prva i druga amino kiselina ili sekvenca nukleotida imaju zajednički strukturni domen i/ili zajedničku funkcionalnu aktivnost. Na primer. amino kiselina ili sekvence nukleotida koje sadrže zajednički strukturni domen koji ima najmanje oko 45%. 55%. ili 65% identčnosti. 75% identčnosti. 85%. 95%. ili 98% identčnosti. su ovde definisani kao dovoljno identični.
Da se odredi procenat identičnosti sekvenci u dve amino kiseline ili dve nukleinske kiseline, sekvence su poklopljene radi namene optimalnog poređenja. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje deli sekvence (tj.. procenat identičnosti = broj identičnih pozicija/ukupni broj pozicija (npr.. preklapajućc pozicije) x 100). Dve sekvence mogu biti iste dužine. Procenat identičnosti između dve sekvence može se odrediti koristeći tehnike slične onim opsanim dole. sa ili bez doz\ oljavanja gapova. U izračunavanju procenta identičnosti, izbrojana su tipična egzaktna poklapanja.
Određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može biti obavljeno koristeći matematički algoritam. Poželjan, ne ograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje dve sekvence je algoritam od Kariir. i Aitschul (1990) Proc. Natl. Aead. Sci. USA 87:2264 modifikovan kao u Karlin i Aitschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Takav algoritam je inkorporiran u NBI.AST i XBLAST programe od Aitschul i sar. (1990) J. Mo/. Biol. 215:403. BLAST nukleotid pretraživanja mogu se obaviti sa NBLAST programom, rezultat = 100. dužina reči = 12. da se dobiju nukleotidne sekvence homologe sa molekulima polinukleotida iz prijave. BLAST protein pretraživanja mogu se obaviti sa XBLAST programom, rezultat = 50. dužina reči = 3, da se dobiju sekvence amino kiseline homologe sa molekulima proteina iz prijave. Da se dobiju poklapanja sa gapovima sa ciljem poređenja. Može se upotrebiti Oapped BLAST kao što je opisano u Aitschul i sar. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativno. PSI-Blast se može upotrebiti da se izvede ponovljeno pretraživanje koje detektuje udaljeno srodstvo između molekula. Vidi. Aitschul i sar. (1997) supra. Kada se koriste BLAST, Gapped BLAST, i PSI-Blast programi, mogu se upotrebiti standardni parametri respektivnih programa (npr., XBLAST i BLAST). Vidi hllp:/Av\vw.ncbi.nim.nih.gov. Drugi poželjni, ne-ograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam od Myers i Miller (1988) CABIOS 4:11-17. takav algoritam je inkorporiran u ALIGN program (verzija 2.0). koji je deo GCG softverskog paketa za poklapanje sekvence. Kada se koristi ALIGN program za za poređenje sekvenci amino kiseline, može se upotrebiti PAM120 tabela značenja ostataka, kazna dužine gapa od 12, i kazna gapa od 4. Poklapanje se takode može izvesti ručno pomoću pregleda.
Sem ako se tvrdi drugačije, identičnost/sličnost vrednosti sekvence obezbedene ovde odnosi se na vrednost dobijenu koristeći sekvence pune dužine iz prijave i koristeći višestruko poklapanje putem algoritma Clustal W (Nucleic Acid Research. 22{22):4673-4680. 1994) koristeći program AlignX uključen u softverski paket Vector NTI Suite Verzija 7 (JnforMax. Inc.. Bethesda. MD. USA) koristeći standardne parametre; ili bilo koji njegov ekvivalentni program. Pod „ekvivalentni program" podrazumeva se bilo koji program za poređenje sekvence koji, za bilo koje dve sekvence koje su u pitanju, generiše poklapanje koje ima identičan nukleotid ili poklapanja ostataka amino kiseline i identičan procenat identičnosti sekvence kada se poredi sa odgovarajućim poklapanjem generisanim sa AlignX u softverskom paketu Vector NTI Suite Verzija 7.
SekvenceAHASLnukleotida iz prijave uključuju i sekvence koje se prirodno javljaju kao i mutant ne oblike, posebno mutanlne oblike koji kodiraju AHASL proteine koji obuhvataju AHAS aktivnost otpornosti na herbicid. Slično tome. proteini iz prijave obuhvataju i proteine koji se prirodno javljaju kao i njihove varijacije i modilikovane oblike. Takve varijante će produžiti da poseđuju željenu AHAS aktivnost. Očigledno, mutacije koje će biti napravljene u DNK koja kodira varijantu ne treba da stave sekvencu izvan okvira čitanja i poželjno neće kreirali komplementarne regionc koji mogu produkovati sekundarnu strukturu mRNK. Vidi. EP
Patentnu prijavu publikcija br. 75.444.
Ne očekuje se da delecije. insercije. i supstitucije sekvenci proteina obuhvaćenih ovde produkuju radikalne promene u karakteristikama proteina. Međutim, kada je teško da se predvidi egzaktan efekat supstitucije, delecije. ili insercije unapređ. stručnjak će prihvatiti da će efekat bili procenjen rutinskim ogledima pregledanja. To znači, aktivnost se može proceniti pomoću ogleda AHAS aktivnosti. Vidi, na primer, Singh i sar. (1988) Anal. Biochem. 171:173-179.
Varijacije nukleotidnih sekvenci i proteina lak ode obuhvataju sekvence i proteine izvedene putem mulagenih rekombinogenih procedura kao što jc DNA mešanje. Sa takvom procedurom, jedna ili više različitihAHASLkodirajućih sekvenci se mogu manipulisati da se kreira novi AHAS protein koji ima željene karakteristike. Na taj način su generisane biblioteke rckombinantnih polinukleotida iz populacije srodnih sekvenci polinukleotida koje obuhvataju regione sekvence koji imaju znatnu identičnost sekvence i mogu biti homologo rekombinnovanein vi troiliin vivo.Na primer. koristeći ovaj pristup, motivi sekvence koji kodiraju domen za koji postoji interes mogu se mešati izmeđuAHASLgena iz ove prijave i drugih poznatihAHASLgena da se dobije novi gen koji kodira protein sa poboljšanom karakteristikom za koju postoji interes, kao što je povećanKmu slučaju enzima. Strategije za takvo mešanje DNK su poznate u oblasti. Vidi. na primer. Stemmer (1994) Proc. Nalt. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Cramcri i sar. (1997) Nature Biotcch. 15:436-438: Moore i sar. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang i sar. (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:4504-4509; Crameri i sar. (1998) Nature 391:288-291; i U.S. Patent br. 5.605,793 i 5.837.458.
Nukleotidne sekvence iz prijave mogu se upotrebiti da se izoluje odgovarajuća sekvenca iz drugog organizma, posebno drugih biljaka, još određenije drugih dikotila. na taj način, metodi kao Što su PCR. hibridizacija. i tome slično mogu se upotrebiti da se identifikuju takve sekvence na osnovu homologije te sekvence sa sekvencama iznetim ovde. Sekvence izolovane na osnovu njihove identičnosti sekvence u odnosu na celeAHASLpolinuklcotidne sekvence koje su date ovde ili njihove fragmente su obuhvaćene sa predmetnom prijavom. Prema tome. izolovane polinukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL protein i koje hibriđizuju pod uslovima strogoće za sekvencu koja je ovde otkrivena, ili za njene fragmente su obuhvaćene sa predmetnom prijavom.
U PCR pristupu, ojgonukleotidni prajmeri mogu se dizajnirati za upotrebu u PCR reakcijama da se umnože odgovarajuće DNK sekvence iz cDNK ili genomske DNK ekstrahovane iz bilo koje biljke za koju postoji interes. Metodi za dizajniranje PCR prajmera i PCR kloniranja su generalno poznati u oblasti i otkriveni su u Sambrook i sar. (1989) Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik (2. izd.. Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Plainvievv. Nevv York). Vidi takođe. Innis i sar.. izd. (1990) PCR protokoli: Uputstvo i metodi i primena (Academic Press. Nevv York); Innis i Gelfand. izd. (1995) PCR strategije (Academic Press. Nevv York); i Innis i Gelfand. izd. (1999) PCR ručni metodi (Academic Press. Nevv York). Poznati metodi PCR uključuju, ali nisu ograničeni na. metode koji koriste parove prajmera. ugnježdene prajmere. pojedinačne specifične prajmere, degenerisanc prajmere. gen-specifične prajmere. vektor-specifične prajmere. delimično-nepoklopljene prajmere. i tome slično.
AHASL polinukleotidne sekvence iz prijave su obezebedene u ekspresionim kasetama radi ekspresije u biljkama za koje postoji interes. Kaseta će uključili 5" i 3" regulatorne sekvence operativno vezane zaAHASLpolinukleotidnu sekvencu iz prijave. Za ..operativno vezana" je namenjena funkcionalna veza između promotora i druge sekvence. gde promotor sekvenca inicira i posreduje u transkripciji DNK sekvence koja odgovara drugoj sekvenci. Generalno, operativno vezana označava da su sekvence nukleinske kiseline vezane kontinuirano i. gde jc neophodno da se pridruže kodirajućim regionima proteina, u susedstvu ili u istom okviru čitanja. Kaseta može dodatno sadržati najmanje jedan dodatni gen da bude zajedno transformisana u organizmu. Alternativno, dodatni gen(i) se može obezbediti u ekspresionim kasetama.
Takva ekspresiona kaseta je obezbedena sa mnoštvom restrikcionih mesta za insercijuAHASLpolinukleotidne sekvence da bude pod transkripcionom regulacijom regulatomih regiona. Ekspresiona kaseta može dodatno sadržati selektabilne marker gene.
Elkspresiona kaseta će uključiti u 5"-3" pravcu transkripcije, transkripcioni i translaeioni region inicijacije (tj., promotor),AHASLpolinukleotidne sekvence iz prijave, i region transkripcione i translacione terminacije (tj.. terminacioni region) funkcionalan kod biljaka. Promotor može biti prirodan ili analog. ili strani ili heterolog. u odnosu na biljku domaćina i/ili naALLASLpolinukleotidnu sekvencu iz prijave. Sem toga. promotor može biti prirodna sekvenca ili alternativno sintetička sekvenca. Kada je promotor „strani" ili ..heterolog" u odnosu na biljku domaćina, predviđeno je da promotor nije nađen u prirodnoj biljci u koju je promotor uveden. Kada je promotor ..strani" ili ..heterolog" u odnosu naAHASLpolinukleotidnu sekvencu iz prijave, predviđeno je da promotor nije nativan ili promotor koji se javlja prirodno za operativno vezanuAHASLpolinukleotidnu sekvencu iz prijave. Onako kako se ovde koristi. himeriČni gen obuhvata kodirajuću sekvencu operativno vezanu za inicirajući region transkripcije koji je heterolog u odnosu na kodirajueu sekvencu.
I dok može biti poželjno da se eksprimirajuAHASLpolinukleotidi iz prijave koristeći heterologe promotore, mogu se upotrebi:i nalivne sekvence promotora. Takvi konstrukti će promeniti nivoe ekspresije AHASL proteina kod biljke ili biljne ćelije. Prema tome. fenolip biljke ili biljne ćelije je izmenjen.
Region terminacije može biti urođen sa transkripcionim regionom inicijacije, može bili urođen sa operativno vezanomAHASLsekvencom za koju postoji interes, može biti urođen sa biljkom domaćinom, ili može biti izveden iz drugog izvora (tj.. stranog ili heterolognog u odnosu napromotor. AHASLpolinukleotidna sekvenca za koju postoji inleres. biljka domaćin, ili bilo koja njihova kombinacija). Prigodni regioni terminacije su dostupni od Ti-plazmida odA.
( iimefacietis,ka što su terminacioni regioni oktopin sintaze i nopalin sintaze. Vidi takođe Guerineau i sar. (1991) Mo/. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon i sar. (1991) Genes Dev. 5: 141-149: Mogen i sar. (1990) Plant Cell 14: 1261-1272; Munroe i sar (1990) Gene 91: 151-158: Balias i sar. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; i Joshi i sar. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.
Tamo gde je odgovarajuće, gen(i) mogu biti optimizovani za povećanu ekspresiju kod transformisane biljke. A to znači da?geni mogu biti sintetisani koristeći kodone koji su preferirani kod biljke radi poboljšane ekspresije. Vidi, na primer, Campbell i Grovvri (1990) Plant Phvsiol. 92: 1-11 radi diskusije o upotrebi kodona poželjnog domaćina. Metodi su dostupni u oblasti za sintetizovanje poželjnih gena kod biljke. Vidi. na primer. U.S. Patent br. 5,380.831. i 5.436.39L i Murray i sar. (1989) Nucleic. Acids Res. 17:477-498.
Poznate su dodatne modifikacije sekvence koje povećavaju ekspresiju gena ćeliskom domaćinu. One uključuju eliminaciju sekvenci koje kodiraju poliadenilacione signale, egzon-intron upletena mesta signala, ponovke nalik transpozomima, i druge takve dobro-okarakterisane sekvence koje mogu bili Štetne za ekspresiju gena. Sadržaj G-C sekvence može biti doteran do nivoa koji jc prosečan za datog ćelijskog domaćina, kao što je izračunato sa pozivom na poznate gene eksprimirane u ćeliji domaćinu. Kada jc to moguće, sekvenca je modifikovana da se izbegne predviđena struktura ukosnice koja je sekundarna u odnosu na mRNK strukture.
Nukleotidne sekvence za pojačavanje ekspresije gena mogu se takode upotrebiti u biljnim ekspresionim vektorima. One uključuju intronc kukuruza Adbl. intron 1 gena (Callis i sar. Genes and Development 1: 1183-1200.1987). i lider sekvence. (W-sekvcnca) od Mozaičnog virusa duvana (TMV). Illorotičnog tačkastog virusa kukuruza i mozaičnog virusa detelinc (Gallie i sar. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711. 1987 i Skuzeski i sar. Plant Mol. Biol. 15:65-79.1990). Pokazano je da prvi intron iz skraćenja-1 lokusa kukuruza povećava ekspresiju gena u himeričnim genskim konstruktima. U.S. Pat br. 5,424.412 i 5.593.874 otkrivaju upotrebu specifičnih introna u genskih ekspresionim konstruktima, i Gallie i sar. (Plant Phvsiol. 106: 929-939.1994) su takođe pokazali da su introni korisni za regulaciju ekspresije gena na ikivno specifičnoj osnovi. Da se dalje pojača ili oplimizuje ekspresija velike subjediniee AIIAS gena. biljni ekspresioni vektori iz prijave mogu takođe sadržati DNK sekvence koje obuhvataju regione pričvršćene za matriks (MARove). Biljne ćelije transformisane sa takvim modi 11 kovanim ekspresionim sistemima, žalim, mogu pokazati prekornernu ekspresiju ili konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence iz prijave.
Ekspresione kasete mogu dodatno sadržati 5' lider sekvence u ekspresionoj kaseti konstrukta. Takve lider sekvence mogu da deluju tako da pojačaju translaciju. Lideri translacije su poznati u oblasti i uključuju: pikomavirus lidere, na primer, EMCV lider (Encefalomiokarditis 5' nekodirajući region) (Elrov-Stein i sar. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 6126-6130); poli vir us lideri, na primer, TEV lider (Tobacco Etch Virus)
(Gallie i sar. (1995) Gene 165(2): 233-238). MDMV lider (Maize Dvvarf Mosaic Virus)
(Virologv 154:9-20). i humani vezujući protein imunoglobulinskog teškog lanca (BiP)
(Maeejak i sar. (1991) Nature 353: 90-94); ne translacirani lider iz proteina omotača mRNK mozaičnog virusa deteline (AMV RNK 4) (Jobling i sar. (1987) Nature 325: 622-625); lider mozaičnog virusa duvana (TMV) (Gallie i sar. (1989) u Molekularna biologija RNK. izd. Cech (Liss, Nevv York). str. 237-256); i lider hlorotičnog tačkastog virusa kukuruza (MCMV) (Lommel i sar. (1991) Vitrology 81: 382-385). Vidi takođe. Della-Cioppa. i sar. (1987) Plant Physiol 84: 965-968. Drugi metodi za koje jc poznato da pojačavaju translaciju mogu takođe da se upotrebe, na primer. introni. i tome slično.
U pripremanju ekspresione kasete, različiti DNK fragmenti mogu biti manipulisani, tako da se obezbede DNK sekvence sa odgovarajućom orijentacijom i, kao prikladno, u odgovarajućem okviru čitanja. Sa tim ciljem, mogu se upotrebiti odgovarajući adapteri ili veznici da se spoje DNK fragmenti ili se mogu uključili druge manipulacije da se obezbede prigodna restrikciona mesta, uklanjanje suvišne DNK, uklanjanje restrikcionih mesta. ili slično. Radi tog cilja mogu se uključitiin vitromulagenza, reper prajmera, restrikcija, spajanje, resupstitucije. npr., tranzicije i transverzije.
Može se upolrebili jedan broj promotora u praksi ove prijave. Promotori se mogu odabrati na osnovu željenog rezultata. Nukleinske kiseline se mogu kombinovati sa konstitutivnim, tkivno-poželjnim. ili drugim promotorima za ekspresiju kod biljaka.
Takvi konstitutivni promotori uključuju, na primer. promotor jezgra od Rsyn7 promotora i druge konstitutivne promotore otkrivene u WO 99/43838 i U.S. Patent br. 6,072,050; jezgro CaMV 35S promotor (Odeli i sar. (1985) Nature 313: 810-812); aktin pirinča (Mehirov i sar. (1990) Plani Cell 2: 163-171); ubikvitin (Christensen i sar. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 i Christensen i sar. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689): pEMU (Lasl i sar. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588): MAS (Velten i sar. (1984) EMBO J. 3:2 723-2730): ALS promotor (U.S. Patent No. 5,659.026). ilome slično. Drugi konstitutivni promotori uključuju, na primer. U.S. Patent br. 5.608.149; 5.608.144; 5,604.121: 5.569.597: 5.466.785; 5.399.680: 5.268,463: 5.608.1 42; i 6.1 77.611.
Tkivno poželjni promotori mogu se upotrebiti da se usmeri pojačana AHASL 1 ekspresija unutar određenog biljnog tkiva. Takvi tkivno poželjni promotori uključuju, ali nisu ograničeni na. list-poželjne promotore, koren-poželjne promotore, sem-poželjne promotore, i stablo-poželjne promotore. Tkivno poželjni promotori uključuju Yamamolo i sar. (1997) Plant J. 12(2): 255-265: Kavvamata i sar. (1997) Plant Cell Phvsiol. 38(7): 792-803; Hansen i sar. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343: Russell i sar. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rineharl i sar. (1996) Plant Phvsiol. 112(3): 1331-1341: Van Camp i sar. (1996) Plant Phvsiol. 112(2): 525-535; Canevascini i sar. (1996) Plant Phvsiol. 112(2): 513-524; Yamamoto i sar. (1994) Plant Cell Phvsiol. 35(5): 773-778: Lam (1994) Rcsults Probi. Cell Differ. 20: 181.196; Orozco i sar. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1 129-1 138; Matsuoka i sar. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590; i Guevara-Garcia i sar. (1993) Plant J. 4(3): 495-505. Takvi promotori se mogu modifikovati, ako je neophodno, za slabu ekspresiju.
Nukleinske kiseline za koje postoji interes mogu biti usmerene na hloroplast za ekspresiju. Na taj način, gde nukleinska kiselina, za koju postoji interes, nije direktno ubačena u hloroplast. ekspresiona kaseta će dodatno sadržati hloroplast-usmerenu sekvencu koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira tranzitni peptid hloroplasta da usmeri produkt gena za koji postoji interes na hloroplaste. Takvi tranzitni peptidi su poznati u oblasti. U odnosu na hloroplast-usmerene sekvence...operativno vezane" znači da sekvenca nukleinske kiseline koja kodira tranzitni peptid (tj., hloroplasl-usmerena sekvenca) je vezanaza AHASLpolinukleotid iz prijave tako da su dve sekvence susedne i u istom okviru čitanja. Vidi. na primer. Von lleijne i sar. (1991) Plant Mol Biol. Rep. 9: 104-126; Clark i sar. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Dclla-Cioppa i sar.
(1987) Plant PIvsiol. 84: 965-968; Romer i sar. (1993) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 196: 1414-1421; i Shah i sar. (1986) Science 233: 478-481. I dok AHASL proteini iz prijave uključuju nativni tranzitni peptid hloroplasta, bilo koji tranzitni peptid hloroplasta poznat u oblasti može biti fuzionisan sa sekvencom amino kiseline zrelog AHASL proteina iz prijave putem operativnog vezivanja holoroplast-usmerene sekvence za 5'- kraj od nukleotidne sekvence koji kodira zreli AHASL protein iz prijave.
Holoroplast-usmerene sekvence su poznate u oblasti i uključuju maiu jedinicu hloroplasta ribuloza-1.5- bisfosfat karboksilaze (Rubisco) (de Častio Silva l ilho i sar.
(1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell i sar. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335-3342); 5-(enolpiiiivil)sikimat-3-fosiat sintat (EPSPS) (Archer i sar. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810): triptofan sintaza (Zhao i sar. (1995) J. Biol. Chem. 270(1 1): 6081-6087); plas-tocijanin (Lavvrence i sar. (1997) J. Biol. Chem. 272(33): 20357-20363); horizmal sintaza {Schmidl i sar. (1993) J. Biol. Chem. 268(36): 27447-27-57): i svelli hlorofill useva a/b vezujući protein (LHBP) (Lamppa i sar. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Vidi takođe Von Heijne i sar. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark i sar. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550: Della-Cioppa i sar. (1987) Plant Phvsiol. 84: 965-968: Romer i sar. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; i Shah i sar. (1986) Science 233: 478-481. Metodi za transformaciju hloroplasta su poznati u oblasti. Vidi. na primer. Svab i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530: Svab i Maliga(1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 913-917: Svab i Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. Metod se zasniva na isporuci pištoljem čestica DNK koje sadrže selektabilni marker i usineravanje DNK na genom plastida putem homolognih rekombinavija. Sem toga, transformacija plastida može se obaviti sa trans aktivacijom utišane od plastida nastale transgene putem tkivno-poželjne ekspresije jedarno-kodirane i plastid-usmerene RNK polimeraze. Takav sistem je iznet u McBride i sar. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.
Nukleinske kiseline za koje postoji interes da budu usmerene na hloroplast mogu biti optimizovane za ekspresiju u hloroplastu da se izračunaj u razlike u upotrebi kodona između jedra biljke u ovoj organeli. Na taj način, nukleinske kiseline za koje postoji interes mogu se sintetisati koristeći hloroplast-poželjne kodone. Vidi. na primer. U.S. patent br. 5,380.831.
Kao što je ovde otkriveno, AHASL nukleotidne sekvence iz prijave nalaze primenu u pojačavanju tolerancije na herbicide biljaka koje imaju u svojini genomima gen koji kodira AHASL protein tolerantan na herbicid. Takav gen može biti endogeni gen ili transgen. Sem toga, sekvence nukleinske kiseline predmetne prijave mogu biti skupljene sa bilo kojom kombinacijom od sekvenci polinukleotida za koje postoji interes sa ciljem da da se kreiraju biljke sa željenim lenolipom. Na primer, polinukleotidi predmetne prijave mogu biti zajedno sa bilo kojim drugim polinukleotidima koji kodiraju polipeptide koji imaju peslicidnu i/ili insekticidnu aktivnost, kao što su. na primer.Baciilus thiiringiensistoksin proteini (opisani u U.S. Patentu br. 5.366.892; 5.747.450; 5,737.514; 5.723,756; 5.593.881: i Geiser i sar. (1986) Gene 48:109). Generisane kombinacije mogu takođe uključiti višestruke kopije bilo kog od polinukleotida za koje postoji interes.
Prepoznato jc da nukleotidne sek\ence. antisens konstrukcije, komplementarne sa najmanje delom mesindžer RNK (mRNA) zaAHASLpolinukleolidne sekvence sc mogu konstruisati. Antisens nukleotidi su konstruisani tako da hibridizuju sa odgovarajućom mRNK. Modifikacije antisens sekvenci mogu sc napraviti sve dok sekvence hibridizuju sa i interferiraju sa ekspresijom odgovarajuće mRNK. Na taj način mogu se upotrebiti antisens konstrukcije koje imaju 70%. poželjno 80%. još poželjnije 85%> identičnosti sekvence sa odgovarajućim antisens sekvencama. Sem toga. se mogu upotrebiti delovi antisens nukleotida da prekinu ekspresiju ciljnog gena. Generalno se mogu upotrebiti sekvence od najmanje 50 nukleotida. 1 00 nukleotida. 200 nukleotida. ili više.
Nukleotidne sekvence predmetne prijave se mogu takođe upotrebiti u sens orijentaciji da uguše ekspresiju endogenih gena kod biljaka. Metodi za gušenje ekspresije gena kod biljaka koristeći nukleotidne sekvence u sens orijentaciji su poznale u oblasti. Metodi generalno uključuju transformisanje biljaka sa DNK konstruktom koji obuhvata promotor koji vodi ekspresiju kod biljke operativno vezanu za najmanje deo nukleotidne sekvence koja odgovara transkriptu endogenog gena. Tipično takva nukleotidna sekvenca ima značajnu identičnost sekvence sa sekvencom od transkripta od endogenog gena. npr. veću od oko 65% identičnosti sekvence, veću od oko 85% identičnosti sekvence, ili veću od oko 95% identičnosti sekvence. Vidi, U.S. Patent br. 5,283,184 i 5,034,323.
Idok AHASL1polinukleotidi iz prijave otporni na herbicid nalaze upotrebu kao selektabilni maker geni za transformaciju biljaka, ekspresione kasete iz prijave mogu uključiti drugi selektibilni marker gen za selekciju of transformisanih ćelija. Selektibilni marker geni, uključujući one iz predmetne prijave se koriste za selekciju transformisanih ćelija ili tkiva. Marker geni uključuju, ali nisu ograničeni na. gene koji kodiraju otpornost na antibiotik, kao što su oni koji kodiraju neomicin fosfotransferazu JI (NKO) i higromicin fosfotransferazu (HPT), kao i geni koji donose otpornost na herbicidna jedinjenja, kao Što su glufozinat amonijum, bromoksinil, imidazolinoni, i 2,4-dihlorofenoksiacetat (2.4-D). Vidi generalno, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson i sar.
(1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 6314-6318: Yao i sar. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422: Barkley i sar. (1980) u Opcron, str. 177-220; Hu i sar. (1987) Cell 48: 555-566; Brown i sar. (1987) Cell 49: 603-612; Figgc i sar.
(1988) Cell 52: 713-722; Deuschla i sar. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86: 5400-5404: Fuerst i sar. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549-2553; Deuschle i sar.
(1990) Science 248: 480-483: Gossen (1993) Doktorska disertacija. Universitv of Heidelberg: Reines i sar. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labovv i sar.
(1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356: Zambretti i sar. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Baim i sar. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076; Wyborski i sar. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653: llillenand- Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162: Degenkolb i sar. (1991) Antimicrob. Agcnts Chemother. 35: 1591-1595: Kleinschnidt i sar. (19S8) Bioehemistrv 27: 1094-1104; Bonin (1993) Doktorska disertacija. University of Heidelberg: Gossen i sar. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551: Oliva i sar. (1992) Antimicrob. Agcnts Chemother. 36: 913-919; Fllavka i sar. (1985) Priručnik eksperimentalne farmakologije. Vol. 78 (Springcr-Vcrlag, Berlin); Gill i sar (3988) Nature 334: 721-724.
Ne podrazumeva se da je gornja lista selektabilnih marker ograničavajuća. Može se upotrebiti bilo koji selektabilni marker gen.
Izolovani polinukleotidni molekuli koji obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja kodira AHASL proteine iz prijave mogu se upotrebiti u vektorima da translbrmišu biljke tako da kreirane biljke imaju povećanu otpornost na herbicide. posebno herbicid imidazolinon. Izolovani AHASL polinukleotidni molekuli iz prijave mogu se upotrebiti u vektorima sami ili u kombinaciji sa nukleotidnom sekvencom koja kodira malu podjedinicu AHAS (AHASS) enzima u obezbeđivanju otpornosti na herbicid kod biljaka.Vidi.U.S. Patent br. 6,348,643.
Prijava se takođe odnosi na biljni ekspresioni vektor koji obuhvata promotor koji vodi ekspresiju kod biljke i koji je operativno vezan za izolovane polinukleotidne molekule iz prijave. Izolovani polinukleotidni molekuli obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja kodira AHASL protein koji obuhvata sekvencu amino kiseline koja je data u SEQ ID NO: 2 ili 4. ili njen funkcionalni fragment i varijantu. Biljni ekspresioni vektor iz prijave ne zavisi od određenog promotora, takav promotor samo treba da bude sposobana da vodi ekspresiju gena u biljnoj ćeliji. Poželjni promotori uključuju konstitutivne promotore i tkivno-poželjne promotore.
Transformacioni vektori iz prijave mogu se upotrebiti da se proizvedu biljke transformisane sa genom za koji postoji interes. Transformacioni vektor će obuhvatati selektabilni marker gen iz prijave i gen za koji postoji interes da bude uveden i tipično eksprimiran u translbrmisanoj biljci. Takav selektabilni marker gen obuhvata AHASL polinukleotid iz prijave otporan na herbicid operativno vezan za promotor koji vodi ekspresiju u ćeliji domaćinu. Za upotrebu u biljkama ili biljnim ćelijama, transformacioni vektor obuhvata selektabilni marker gen koji obuhvata AHASL polinukleotid iz prijave otporan na herbicid operativno vezan za promotor koji vodi ekspresiju u biljnoj ćeliji.
Geni iz prijave za koje postoji interes variraju u zavisnosti od Željenog rezultata. Na primer, može postojati interes za različite promene u fenotipu uključujući modifikovanje kompozicije masne kiseline kod biljke, izmenu sadržaja amino kiseline kod biljke, izmenu mehanizma odbrane biljke od insekata i/ili patogena, ilome slično. Ovi rezultati se mogu postići obezbedivanjem ekspresije heterologih produkata ili povećavanjem ekspresije endogenih produkata kod biljaka. Alternativno se rezultati mogu postići obezbedivanjem redukcije ekspresije jednog ili više endogenih produkata, posebno enzima ili kofaktora kod biljke. Ove promene kao rezultat daju promenu fenotipa transformisane biljke.
Geni za koje postoji interes mogu uključiti gene otpornosti kao Što su. na primer, geniBacillus thuringiemistoksin proteina (U.S. Patent br. 5,366.892: 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593.881; i Geiser i sar. (1986) Gene 48: 109).
AI1AS1. proteini ili polipeptidi iz. prijave mogu se prečistiti od. na primer. biljaka suncokreta i mogu se upotrebiti u kompozicijama. Takode. izolovani polinukleotidni molekul koji kodira AHAS protein iz prijave može se upotrebiti da se eksprimira AHASL protein iz prijave kod microba kao što suE. col iili kvasac, Eksprimirani AHASL protein može se prečistiti iz ekstrakataE. coliili kvasca pomoću bilo kojeg metoda poznatog stručnjacima.
Prijava se takođe odnosi na metod za kreiranje transgene biljke koja je otporna na herbicide i koji obuhvata transformisanje biljke sa biljnim ekspresionim vektorom koji obuhvata promotor koji vodi ekspresiju kod biljke operativno vezan za izolovani polinukleotidni molekul iz prijave. Izolovani polinukleotidni molekul obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira AHASL protein iz prijave, posebno AHASL protein koji obuhvata: sekvencu amino kiseline koja je data u SEQ ID NO: 2, sekvencu amino kiseline koja je kodirana sa SEQ ID NO: 1. ili funkcionalni fragment i varijantu pomenutih sekvenci amino kiseline.
Prijava se takođe odnosi na ne-transgene biljke suncokreta, transgene biljke proizvedene putem metoda iz prijave, i potomstvo i druge potomke takvih ne-transgenih i transgenih biljaka, pri čemu biljke pokazuju pojačanu ili povećanu otpornost na herbicide koji interferiraju sa AIIAS enzimom, posebno herbicide imidazolinon i sulfonilureu.
AHASL polinukleotidi iz. prijave, posebno oni koji kodiraju AHASL proteine otporne na herbicid, nalaze upotrebu u metodima za pojačavanje otpornosti biljaka tolerantnih na herbicid. Biljke tolerantne na herbicid mogu obuhvalati AHASL protein tolerantan na herbicid ili otporan na herbicid. Biljke tolerantne na herbicid uključuju i biljke transformisane sa AHASL nukleotidnim sekvencama tolerantnim na herbicid i biljke koje sadrže u svojim genomima endogeni gen koji kodira AHASL protein tolerantan na herbicid. Nukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL proteine tolerantne na herbicid i biljke tolerantne na herbicid koje obuhvataju endogeni gen koji kodira AHASL protein tolerantan na herbicid uključuju polinukleotide i biljke iz predmetne prijave i one koje su poznate ti oblasti.Vidi.na primer. U.S. Patent br. 5.013.659. 5.731. 180. 5,767,361, 5,545. 822. 5.736.629. 5.773.703. 5,773.704. 5.952.553 i 6.274. 796.
Takvi metodi za pojačavanje otpornosti biljaka tolerantnih na herbicid obuhvataju transformisanje biljke tolerantne na herbicid sa najmanje jedenom polinukieotidnom konstrukcijom koja obuhvata promotor koji vodi ekspresiju kod biljne ćelije i koji je operativno vezan za AHASL polinukleotid iz prijave otporan na herbicid, posebno polinukleotid koji kodira AHASL protein otporan na herbicid dat u SEQ ID NO: 1. polinukleotide koji kodiraju sekvencu amino kiseline datu u SFiQ ID NO: 2. i fragmente i varijante pomenutih polinukleotida koji kodiraju polipeptide koji obuhvataju AEIAS aktivnost otpornosti na herbicid.
Dostupni su brojni biljni transformacioni vektori i metodi za transformaciju biljaka.Vidi.na primer. An„ G. i sar. (1986) Plant Pvsiol. 81: 301-305; Fry, J.. i sar. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, M. (1988) Theor, Appl Genet. 76: 767-774; Hinchee. i sar.
(1990) Stadler. Genet, Symp. 203212.203-212: Cousins, i sar. (1991) Aust. J. Plant Phvsiol. 18: 481-494; Chee, P. P. i Slightom. J. L. (1992) Gene. 118: 255-260; Christou, i sar. (1992) Trends. Biotechnol, 10: 239-246; D'Halluin. i sar. (1992) Bio/Technol. 10: 309-314; Dhir. i sar. (1992) Plant Phvsiol. 99: 81-88; Casas i sar. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90: 11212-11216; Christou. P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P: 119-124: Davies i sar. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180-183: Dong, J. A. i Mchughen, A
(1993) Plant Sci. 91: 139-148; Franklin. Cl. i Trieu. T. N. (1993) Plant. Phvsiol. 102: 167; Golovkin, i sar. (1993) Plant Sci. 90: 41-52; Guo Chin Sci. Bali. 38: 2072-2078; Asano, i sar. (1994) Plani Cell Rep. 13; Avcres N. M i Park. W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13: 219-239; Baroelo. i sar. (1994) Plant..i. 5: 583-592: Becker, i sar. (1994) Plant. J. 5: 299-307; Borkovvska i sar. (1994) Acta Phvsiol Plant. 16: 225-230: Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; F.apen i sar. (1994) Plant Cell Rep. 13: 582-586; Harrman. i sar. (1994) Bio-Technology 12: 919923: Ritaia. i sar, (1994) Plant. Mol. Biol. 24: 317-325; i Wan. Y. C. i Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104: 3748.
Metodi iz prijave uključuju uvođenje polinuklcotidnog konstrukta u biljku. Pod „uvođenjem" se podrazumeva izlaganje biljke polinukleotidnom konstruktu na takav način da konstrukt dobije pristup unutrašnjosti ćelije biljke. Metodi iz prijave ne zavise od određenog metoda za uvođenje polinuklcotidnog konstrukta u biljku, potrebno je samo da polinukleotidni konstrukt ude u unutrašnjost najmanje jedne ćelije biljke. Metodi za uvođenje polinuklcotidnog konstrukta u biljku su poznati u oblasti uključujući, ali bez ograničenja na. trajne transformacione metode, prolazne transformaeione metode, i metode posredovane sa virusima.
Pod „trajnim transformacijama" podrazumeva sc da sc polinukleotidni konstrukt koji je uveden u biljku integriše u genom biljke i da je sposoban da bude nasleđen od strane njenog potomstva. Pod „prolaznim transformacijama" podrazumeva se da se polinukleotidni konstrukt koji je uveden u biljku ne integriše u genom biljke.
Radi transformacije biljaka i biljnih ćelija, nukleotidne sekvence iz prijave su ubačene koristeći standardne tehnike u bilo koji vektor poznat u oblasti koji je pogodan za ekspresiju nukleotidnih sekvenci kod biljaka i biljnih ćelija. Odabiranje vektora zavisi od poželjne tehnike transformacije i ciljne biljne vrste koja treba da se Iransformišc. AHASL1 nukleotidna sekvenca može biti operativno vezana za biljni promotor koji jc poznat po visokom nivou ekspresije u biljnoj ćeliji, i ovaj konstrukt je zatim uveden u biljku koja je osetljiva na herbicid imidazolinon i transformisana biljka je regenerisana. Transformisana biljka je tolerantna na izlaganje nivou imidazolinona, herbicida koji bi ubio ili začajno oštetio netransformisanu biljku. Ovaj metod se može primeniti na bilo koju biljnu vrstu; međutim, on je najkorisniji ako se primeni na biljke useva.
Metodologije za konstruisanje biljnih ekspresionih kaseta i uvođenje stranih nukleinskih kiselina u biljke su generalno poznate u oblasti i opisane su prethodno. Na primer. strana DNK može se uvesti u biljke, koristeći plazmidne vektore koji indukuju tumor (Ti). Drugi metodi koji se koriste za isporuku strane DNK uključuju upotrebu PEG posredovane transformacije protoplasta. elektroporaciju, mikroinjekcione vlasi, i biolistike ili bombardovanje mikroprojektilima za direktno uzimanje DNK. Takvi metodi su poznati u oblasti. (U.S. Pat br. 5,405,765 do Vasil i sar.; Bilang i sar. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid i sar.. (1991) Mol. Gen. Genet.. 228: 104-112; Guerche i sar..
(1987) Plant Science 52: 111-116: Ncuhause i sar.. (1987) Theor. Appl Genet 75: 30-36; Klein i sar., (1987) Nature 327: 70-73: Hovvell i sar.. (1980) Science 208: 1265: Horsch i sar., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBIock i sar.. (1989) Plant Physiology 91: 694-701: Metodi za molekularnu biologiju biljaka (Weissbach i Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) i Metodi u molekularnoj biologiji biljaka (Schuler i Zielinski. eds.) Academic Press. Inc. (1989). Metod transformacije zavisi od biljne ćelije koja treba da se transformiše, stabilnosti upotrebljenih vektora, nivoa ekspresije produkata gena i drugih parametara.
Drugi pogodni metodi uvođenja nukleotidnih sekvenci u biljne ćelije i nakon loga insercije u biljni genom uključuju mikroni jeke iju kao kod Crossway i sar. (1986) Biotechniques 4: 320-334. elektroporaciju kao što su opisali Riggs i sar. (1986) Proc. Nali. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrohacieriian- posvcdovanutransformaciju kao što su opisali Tovvnsend i sar.. U.S. Patent br. 5.563.055. /.hao i sar.. U.S. Patent br. 5.981.840. direktni transfer gena kao što su opisali Paszkowski i sar. (1984) EMBO J. 3: 271 7-2722. i balističko ubrzavanje čestica kao što je opisano u, na primer. Sanford i sar.. U.S. Patent br. 4,945,050: Tomes i sar.. U.S. Patent br. 5,879.918: Tomes i sar., U.S. Patent br. 5.886,244; Bidncv i sar., U.S. Patent br. 5.932.782; Tomes i sar. (1995) „Direktni transfer DNK u intaktne biljne ćelije preko bombardovanja mikroprojektilima", u Biljna ćelija, tkiva, i kultura organa: Osnovni metodi, izd. Gamborg i Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe i sar. (1988) Biotechnology 6:923-926): i Leci transformacija (VVO 00/28058).Vidi takođe,Weissingcr i sar. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477: Sanford i sar. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (luk): Christou i sar. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja): McCabe i sar. (1988) Bio Tcchnology 6: 923-926 (soja); Finer i McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol, 27P: 1 75-182 (soja); Singh i sar. (1998) Theor. Appl Genet. 96:3 19-324 (soja); Datta i sar. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (pirinač); Klein i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (kukuruz): Klein i sar, (1988) Biotechnology 6: 559-563 (kukuruz); Tomes, U.S. Patent br. 5.240,855; Buising i sar.. U.S. Patent br. 5,322.783 i 5.324.646; Tomes i sar. (1995) „Direktni transfer DNK u intaktne biljne ćelije preko bombarđovanja mikroprojektilima" u Biljna ćelija, tkivo, i kultura organa: osnovni metodi, izd. Gamborg (Springer-Verlag. Berlin) (kukuruz); Klein i sar. (1988) Plant Phvsiol 91: 440-444 (kukuruz); Fromm i sar. (1990) Biotechnologv 8: 833-839 (kukuruz). Fiooykaas-Van Slogtereni sar. (1984) Nature (London) 311: 763-764: Bowen i sar.. U.S. Patent br. 5.736.369 (žita); Bvtebier i sar. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet i sar. (1985) u Eksperimentalna manipulacija tkivima ovuia, izd. Chapman i sar. (Longman. Nevv York). str. 197-209 (polen); Kaeppler i sar. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 i Kaeppler i sar. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (brkovima-posredovana transformacija); D'Haliuin i sar. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (eleklroporacija); Li i sar. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 i Christou i Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (pirinač): Osjoda i sar. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (kukuruzvici Agrobacteriitm lumefaciem).
Polinukleotidi iz prijave mogu se uvesti u biljke putem kontaktiranja biljaka sa virusom ili virusnom nukleinskom kiselinom. Generalno tak\ i metodi uključuju inkorporiranje polinuklcotidnog konstrukta iz prijave u virusni DNK ili RNK molekul. Prepoznato je da AHASL protein iz. prijave može biti inicijalno sintetisan kao deo virusnog pofiproteina. koji se može kasnije procesovati putem proteolizein vivoiliin vitroda se proizvede željeni rekombinantni protein. Sem toga je prepoznato da promotori iz prijave takode obuhvataju promotore koji su upotrebljeni za transkripciju virusnih RNK polimaraza. Metodi za uvođenje poiinukleotidnih konstrukata u biljke i ekspresija proteina koji je u njemu kodiran, uključujući virusne DNK ili RNK molekule su poznati u oblasti. Vidi. na primer. U.S. Patent br. 5,889.191. 5.889.190. 5.866.785. 5.589.367 i 5.316,93. Ćelije koje su bile transformisane mogu rasti u biljkama u skladu sa konvencionalnim načinima. Vidi. na primer, McCormick i sar. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Te biljke mogu zatim da rastu, i da budu oprašene sa istim transformisanim sojem ili sa različitim sojevima, i nastali hibrid koji ima konstitutivnu ekspresiju identifikovanih željenih fenotipskih karakteristika. Dveiliviše generacija može biti odgajeno da sc potvrdi da je ekspresija željenih fenotipskih karakteristika stabilno održavana i prcneta i zatim su semena sakupljena da se potvrdi da je postignuta ekspresija željenih fenotipskih karakteristika. Na taj način, predmetna prijava opisuje transformisano seme (takođe ovde označeno kao ..transgeno seme") koje ima polinukleotidni konstrukt iz prijave, na primer. ekspresionu kasetu iz prijave, stabilno inkorporiranu u njegov genom.
Predmetna prijava odnosi se na transformaciju bilo koje biljne vrste, uključujući, ali bez ograničenja na. monokotile i dikotile. Primeri biljnih vrsta za koje postoji interes uključuju, ali nisu ograničeni na. žito ili kukuruz(Zea mavs). Brassicasp. (npr.,B. nupus, B, rupa, B. juncea),posebno one vrsteBrassicakorisne kao izvori ulja iz semena, detelinu( Medicago sativa),pirinač( Oryza sativa).raž( Seca/ e cereale).sirak( Sorghum bicolor. Sorghum vulgare).proso (npr., biserni sirak( Pcnnisetum g/ aucitm),proso( Panicum miliaceum),lisičji sirak( Setaria italica).prstatsti sirak( Eleusine coracana)).suncokret( Helianthus anmms).egipatski čičak{ Carthumus lincforius),pšenica( Triticum aeslivum, T, Turgidum s. sp. durum).soja.( G/ vcinc max).duvan( Nicotiana tabacum),krompir( Solamim titberosum),kikiriki( Arachis hvpogaea).pamuk( Gossypiuin barbaden. se. Gossvpium hirsulum),slatki krompir( Jpomoea batatus),manioka( Manihof esculenta),kafa( Coffeespp.). kokos( Cocos micifera),ananas( Ananas comosus),citrus( Citrusspp.). kakao( Theohronia cacuo).čaj( Camellia sinensis).banana( Musiaspp.). avokado( Per. sea americana).smokva( f' icus casica).guava( Psidium guajava). mango ( Mangifcra indica).maslina( Olea. europaca).papa ja( Curica papava),tropski orah( Amacardiuni oceidenlale),makadamija[ Macadamia inlegrifolia).badem( Priimits amvgdaius).šećerna repa( Bela vulgaris).šećerna trska( Saccharumspp.). ovas, ječam, povrće, ornamnlalije. i četinari.
Biljke iz. predmetne prijave uključuju biljke useva (na primer. suncokret. Brassica sp.. pamuk, šećernu repu. soju. kikiriki, detelinu. egipatski čičak; duvan. žito. pirinač. pšenicu, raž, ječam, tritikale. sirak, proso. itd.).
Biljke iz prijave otporne na herbicid nalaze upotrebu metodima za kontrolisanje korova. Prema tome. predmetna prijava dalje opisuje metod za kontrolisanje korova u blizini biljke iz prijave otporne na herbicid. Metod obuhvata primenu efektivne količine herbicida na korove i biljku otpornu na herbicid. gde biljka ima povećanu otpornost na najmanje jedan herbicid. posebno na herbicide imidazolinon ili sulfonilureu. u poredenju sa biljkom divljeg tipa. U takvom metodu za kontrolu korova, biljke iz prijave otporne na herbicid mogu biti biljke useva. uključujući, ali bez ograničenja na, suncokret, detelinu,Brassica sp..soju. pamuk, egipatski čičak, kikiriki, duvan, paradaiz, krompir, pšenicu, pirinač, kukuruz, sirak. ječam, raž, proso, i sirak.
Obezbeđujući biljke koje imaju povišenu otpornost na herbicide, posebo herbicide imidazolinon i sulfonilureu, može se upotrebiti veliko mnoštvo formulacija za zaštitu biljaka od korova, kao Što je pojačavanje rasta biljaka i redukovanje kompeticije za hranjive sastojke. Herbicid sc može upotrebiti sam po sebi radi kontrole korova pre-izbijanja, nakom-izbijanja, pre-sađenja i pri sađenju u područjima koja okružuju biljke koje su ovde opisane ili se može upotrebiti formulacija herbicida imidazolinona koja sadrži druge aditive. Herbicid se takođe može upotrebiti da se tretira seme. Aditivi koji su nađeni u formulaciji herbicida imidazolinona ili sulfoniluree uključuju druge herbicide. deterdžente, adjuvase, agense za širenje, agense za lepljenje, agense za stabilizaciju ili tome slično. Herbicidna formulacija može biti vlažna ili suva preparacija i može uključiti, ali bez ograničavanja na, praškove koji se mogu duvati. emulzifilne koncenlrcije i tečne koncentrcije. Herbicid i formulacije herbicida mogu se pripremiti u skladu sa konvencionalnim metodima. na primer. putem sprejovanja. navodnjavanja, usisavanja prašine, ili slično.
Predmetna prijava opisuje ne-lransgena i transgena semena sa povećanom tolcrancijoim na najmanje jedan herbicid. posebno AHAS-inhibirajući herbicid, još poželjnije imidazolinon i sulfonilurea herbicide. Takva semena uključuju, na primer, ne-lransgena, seme suncokreta S4897 koje obuhvata karakterstikc tolerancije na herbicid. biljka suncokret GM40. biljka suncokreta GM1606. biljka suncokreta sa ATCC Patentni depozit broj P TA-6716. ili druga biljka suncokreta sa ATCC Patentni depozit broj PTA-7606. i transgena semena koja obuhvataju polinukleotidni molekul iz prijave koji kodira Al IASL protein otporan na herbicid.
Predmetna prijava opisuje metode za proizvodnju biljke otporne na herbicid. posebno biljke suncokreta otporne na herbicid. putem konvencionalnog gajenja biljke uključujući seksualnu reprodukciju. Metodi obuhvataju ukrštanje prve biljke koja je otporna na herbicid sa drugom biljkom koja nije otporna na herbicid. Prva biljka može biti bilo koja biljka otporna na herbicid iz predmetne prijave uključujući, na primer. transgene biljke koje obuhvataju najmanje jedan od polinukleotidnih molekula iz predmetne prijave koji kodiraju AHASL protein otporan na herbicid i ne-transgene biljke suncokreta koje poseduju karakteristike tolerantnosti na herbicid biljke suncokreta S4897. biljke suncokreta GM40, biljke suncokreta GM 1 606. biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozit brojem PTA- 6716, ili biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozit brojem PTA-7606. Druga biljka može biti bilo koja biljka koja je sposobna da proizvede vijabilne biljke potomke (tj.. semena) kada se ukrsti sa prvom biljkom. Tipično, ali ne neophodno, prve i druge biljke su od iste vrste. Metodi iz prijave mogu dalje uključiti jednu ili više generacija povratnog ukrštanja biljaka potomaka iz prvog ukrštanja sa biljkama iz iste linije ili genotipa bilo prve ili druge biljke. Alternativno, potomstvo prvog ukrštanja ili bilo kojeg uzastopnog ukrštanja može se ukrstiti sa trećom biljkom koja je iz različite linije ili genotipa bilo prve ili druge biljke. Metodi iz prijave mogu dodatno uključiti selekciju biljaka koje obuhvataju karakteristike tolerancije na herbicide od prve biljke.
Predmetna prijava dalje opisuje metode za povećanje otpornosti na herbicid kod biljke, posebno kod biljke suncokreta otporne na herbicid, putem konvencionalnog gajenja biljke uključujući seksualnu reprodukciju. Metodi obuhvataju ukrštanje prve biljke koja je otporna na herbicid sa drugom biljkom koja može biti ali ne mora biti otporna na herbicid ili može biti otporna na različit herbicid ili herbicide nego prva biljka. Prva biljka može biti bilo koja od biljaka otpornih na herbicid iz predmetne prijave uključujući, na primer. transgene biljke koje obuhvataju najmanje jedan od polinukleotidnih molekula iz predmetne prijave koji kodiraju AHASL protein otporan na herbicid i ne-transgene biljke suncokreta koje poseduju karakteristike tolerancije na herbicide biljke suncokreta S4897. biljke suncokreta GM40, biljke suncokreta GM1606. biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozit brojem PTA-6716, ili biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozit brojem PTA-7606. Druga biljka može biti bilo koja druga biljka koja je sposobna da proizvede vijabilne biljke potomke (tj., semena) kada se ukrsti sa prvom biljkom. Tipično, ali ne neophodno, prve i druge biljke su od iste vrste. Biljke potomci proizvedene ovim metodom iz predmetne prijave imaju povećanu otpornost na herbicid kada se porede bilo sa prvom ili sa drugom biljkom ili sa obc. Kada su prve i druge biljke otporne na različite herbicide. biljke potomci će imati karakteristike kombinovane tolerancije na herbicide od prvih i drugih biljaka. Metodi iz prijave mogu dalje uključiti jednu ili više generacija povratnog ukrštanja biljaka potomaka iz prvog ukrštanja sa biljkama iste linije ili genotipa bilo sa prvom ili sa drugom biljkom. Alternativno, potomstvo prvog ukrštanja ili bilo kojeg uzastopnog ukrštanja može se ukrstili sa trećom biljkom koja je iz različite linije ili genotipa koja jc bilo prva ili druga biljka. Metodi iz prijave mogu dodatno uključiti odabiranje biljaka koje sadrže karakteristike tolerancije od prve biljke, druge biljke ili i prve i druge biljke.
Biljke iz predmetne prijave mogu biti transgene ili nc-transgene. Primer ne-transgene biljke suncokreta koja ima povećenu otpornost na imidazolinon je biljka suncokreta S4897. biljka suncokreta GM40. biljka suncokreta GM1606. biljka suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem PTA-6716, ili biljka suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem PTA-7606, ili mutant, rekombinant, ili genetički konstruisan derivat biljke suncokreta S4897, biljke suncokreta GM40, biljke suncokreta GM1606, biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem PTA-6716. ili biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem PTA-7606: ili bilo koje biljke suncokreta S4897, biljke suncokreta GM40. biljke suncokreta GM1606, biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem P TA-6716. iii biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem PTA- 7606; ili biljke koja je potomstvo bilo koje od tih biljaka; ili biljke koja poseduje karakteristike tolerancije na herbicid biljke suncokreta S4897, biljke suncokreta GM40, biljke suncokreta GM1606. biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem PTA-6716. ili biljke suncokreta sa ATCC Patentnim depozitnim brojem PTA-7606.
Predmetna prijava dalje opisuje biljke, biljne organe, biljna tkiva, biljne ćelije, semena. i ne-humane ćelije domaćine koje su transformisane sa najmanje jednim polinukleotidnim molekulom, ekspresionom kasetom, ili transformaeionim vektorom iz prijave, takve transformisane biljke, biljni organi, biljna tkiva, biljne ćelije, semena, i ne-humane ćelije domaćini koje imaju pojačanu toleranciju ili otpornost na najmanje jedan herbicid, na nivou herbicida koji ubija ili inhibira rast netransformisanu biljku, biljno tkivo, biljnu ćeliju, ili ne-humanu ćeliju domaćina, respektivno. Transformisane biljke, biljna tkiva, biljne ćelije, i semena iz prijave mogu bitiArabidopsis thalianai biljke useva.
Predmetna prijava opisuje metode koje uključuju upotrebu najmanje jednog AHAS-inhibirajućeg herbicida odabranog od grupe koja obuhvata imidazolinon herbicide, sulfonilurea herbicide. triazolopirimidin herbicide. pirimidi-niloksibenzoat herbicide, sulfonilamino-karboniltriazolinon herbicide. i njihove mešavine. U ovim metodima. AHAS-inhibirajući herbicid može sc primeniti pomoću bilo kojeg metoda koji je poznat u oblasti uključujući, ali bez ograničenja na. treatman semena. irealman zemlje, i lisni treatman.
Pre primene, Al lAS-inhibirajući herbicid se može pretvoriti u uobičajene formulacije, na primer. rastvore, emulzije, suspenzije, prahove, praškove. paste i granule. Oblik upotrebe zavisi od određene namenjene svrhe: u svakom slučaju, on treba da potvrdi finu i pravilnu distribuciju jedinjenja prema prijavi.
Formulacije su pripremljene na poznati način (vidi npr. radi pregleda US 3,060,084. EP-A 707 445 (za tečne koncenlrcije), Brovvning, „Aglomeracije". Chemical Engineering, Dec. 4, 1957. 147-48. Perijev priručnik hemijskog inženjeringa. 4. izd.. McGravv-I lili. Nevv York 1963. stranice 8-57 i sledeće WO 91/13546. US 4,172.714. US 4.144,050, US 3.920,442, US 5,180.587, US 5,232.701. US 5.208,030, GB 2,095,558. US 3,299,566. Kiingman, Kontrola korova kao nauka. John Wiley i Sons, Inc., Nevv York, 1961, I lance i sar., Priručnik kontrole korova, 8th Ed.. Blackvvell Scientitlc Publications, Oxford, 1989 i Mollct. 1I„ Grubemann, A„ Tehnologija formulacija. Wiley VCT1 Verlag GmbH. Weinheim (NemaČka), 2001, 2. D. A. Knowles. Hernija i tehnologija agrohemijskih formulacija. Kluvver Academic Publishers. Dordrecht. 1998 (ISBN 0-7514-0443-8). na primer. proširivanjem aktivnog jedinjenja sa pomoćnim sredstvima pogodnim za formulaciju agrohemikalija, kao što su rastvarači i/ili nosači, ako je poželjno emulzifikatori. površinska sredstva i raspršivači. sredstva za čuvanje, agensi protiv pene, agensi protiv zamrzavanja, formulacije za tretman semena takođe po potrebi obojivači i/ili popunjivači i/ili gel agensi.
Primeri pogodnih rastvarača su voda, aromatični rastvarači (na primer Solvesso produkti, ksilen), parafini (na primer. frakcije mineralnih ulja), alkoholi (na primer. metanol, butanol, pentanol, benzil alkohol), ketoni (na primer. ciklobeksanon. gama-butirolakton), pirolidoni (NMP. NOP). aeetati (glikol diacetat), glikoli. dimetilamidi masne kiseline, masne kiseline i estri masne kiseline. U principu, mogu sc upotrebiti mešavine rastvarača.
Primeri pogodnih nosača su prirodni zemljani minerali (na primer. kaolini, gline, talk, kreda) i sintetički zemljani minerali (na primer, visoko rasprŠivi silika. silikati).
Pogodni emulzifikatori su ne jonski i anjonski emulzifikatori (na primer. etri polioksietilen masnog alkohola, alkilsulfonati i arilsulfonati).
Primeri sredstava za raspršivanje su lignin-sulfit otpadni likvor i metilceluloza.
Pogodna površinska sredstva koja se koriste us alkalni metal, alkalni zemni metal i amonijumove soli lignosumpome kiseline, naftalenesumporna kiselina, fenolsumporna kiselina, dibutilnaflalenesumporna kiselina, alkilarilsulfonati, alkil sulfati, alkilsulfonati. sulfati masnog alkohola, masne kiseline i sulfatirani masni alkohol glikol eteri, dalji kondenzati sulfoniranog naftalena derivati naftalena sa formaldehidom. kondenzati naftalena ili od naftalenesumporne kiseline sa fenolom i formaldehidom. polioksietilen oktilfenol ctar, etoksihrani izooktilfenol. oktilfenol. nonilfenol, alkilfenol poliglikol etri. tributilfenil poliglikol etar, tristearilfenil poliglikol etar, alkilaril poiietar alkoholi, alkohol i masni alkohol etilen oksid kondenzati, etoksilirano ulje dabra, polioksietilen alkil etri. etoksilirani polioksipropilen, laurii alkohol poliglikol etar acetal. sorbitol estri. lignosulfit otpadni likvor i metilceluloza.
Supstance koje su pogodne za pripremanje rastvora koji mogu direktno da se nanose sprejom. emulzije, paste ili uljane disperzije su frakcije mineralnih ulja sredneje do visoke tačke ključanja, kao što su kerozin ili dizel ulje. dalje ulja katrana uglja i ulja povrća ili životinjskog porekla, alifatični. ciklični i aromatični ugljovodonici, na primer toluen, ksilen, parafin, tctrahidronattalen, alkilirani naftaleni ili njihovi derivati, metanol. ctanol, propanol, butanol, cikloheksanol. cikloheksanon, izoforon. visoko polarni rastvarači, na primer, dimetil sulfoksid, N-metilpirolidon ili voda.
Takođe se formulaciji mogu dodati agensi protiv zamrzavanja kao što su glicerin, etilen glikol. propilen glikol i baktericidi.
Pogodni agensi protiv stvaranja pene su. na primer. agensi protiv pene zasnovani na silikonu ili magnezijum stearatu.
Pogodna sredstva za čuvanje su. na primer. dihlorofen i enzilalkoholhemilormal.
Formulacije za tretman semena mogu dodatno obuhvatati veziva i
opciona sredstva za bojenje.
Veziva se mogu dodati da se poboljša adhezija aktivnih materijala na semena nakon tretmana. Pogodna veziva su blok kopolimeri EO/PO površinska sredstva ali takođe i polivinilalkoholi, polivinilpirolidoni. poliakrilati, polimetakrilati. polibuteni. poliizobutileni, polistireni, polietileneamini. polictilcnamidi. polietileneimini (Eupasol®. Polimin®), polietri, poliuretani, polivinilacetati. tiloza i kopolimeri izvedeni iz tih polimera.
Po potrebi se takođe u formulaciju mogu uključiti obojivači. Pogodni obojivači ili boje za tretman formulacija semena su Khodamin B. CI. Pigment Red 112. CI. Solvent Red 1. pigment plavo 15:4. pigment plavo 15:3. pigment plavo 15:2, pigment plavo 15:1. pigment plavo 80, pigment žuto 1. pigment/uto 13. pigment crveno 1 12. pigment crveno 48:2, pigment crveno 48:1, pigment crveno 57:1. pigment crveno 53:1. pigment narandžasto 43. pigment narandžasto 34. pigment narandžasto 5. pigment zeleno 36. pigment zeleno 7, pigment belo 6. pigment braon 25. osnovno ljubičasto 10, osnovno ljubičasto 49, kiselo crveno 51. kiselo crveno 52. kiselo crveno 14. kiselo plavo 9. kiselo žuto 23. osnovno crveno 10, osnovno crveno 108.
Primer pogodnog agensa za stvaranje gela je karagen (Sauagel^).
Praškasti materijali za širenje, i prašinasti proizvodi mogu se pripremiti mešanjem ili zajedničkim mrvljenjem aktivnih supstanei sa čvrstim nosačem.
Granule, na primer, obavljene granule, impregnirane granule i homogene granule, mogu se pripremiti vezivanjem aktivnih jedinjenja za čvrste nosače. Primeri čvrstih nosača su mineralne zemlje kao što su silika gelovi, silikati, talk, kaolin, ataglina. krečnjak. kreč. kreda, deblo. les. glina, dolomit, dijatomezna zemlja, kalcijum sulfat, magnezijum sulfat, magnezijum oksid, zemljani sintetički materijali, fertilizatori. kao što su. na primer. amonijum sulfat, amonijum fosfat, amonijum nitrat, urec. i proizvodi poreklom od povrća, kao Što jc brašno žitarica, brašno kore drveta, drveno brašno i brašno orahove ljuske, celulozni praškovi i drugi čvrsti nosači.
Generalno, formulacije obuhvataju od oko 0.01 do 95% težinski, poželjno od 0.1 do 9()%o težinski, od AHAS-inhibirajućcg herbicida. U tom slučaju, AI IAS-inhibirajući herbicidi su se koriste u Čistoći od 90% do 100% težinski, poželjno 95%> do 100%o težinski (prema NMR spektru). Za namene tretmana semena, respektivne formulacije mogu se razblažiti 2-10 puta dovodeći do koncentracija u preparacijama spremnim za upotrebu od 0.01 do 60% težinski aktivnog jedinenja težinski, poželjno 0.1 do 40% težinski.
AHAS-inhibirajući herbicid može se upotrebiti kao takav, u obliku njegovih formulacija ili upotrebom oblika koji su pripremljeni od njega, na primer, u obliku rastvora koji sc mogu direktno naneli sprejom. praškova. suspenzija ili disperzija, emulzija, uljanih disperzija, pasta, praškastih proizvoda, materijala za širenje, ili granula, putem sprejovanja, atomiziranja, pretvaranja u prah. širenja ili izlivanja. Upotreba oblika zavisi u potpunosti od namerenih namena: one su u svakom slučaju namenjene da obezbede najfiniju moguću distribuciju AHAS-inhibirajućeg herbicida prema prijavi.
Vodeni oblici za upotrebu mogu se pripremiti od emulzionih koncentrata, pasta ili praškova koji sc mogu vlažiti (sprejabilnih praškova, uljanih disperzija) putem dodavanja vode. Da se pripreme emulzije, paste ili uljane disperzije, supstanee. kao takve ili rastvorene u ulju ili rastvaraću, mogu se homogenizovali u vodi pomoću ovlaživača, pričvršeivaea. disperzanta ili emulzifikatora. Međutim,lakode je moguće da se pripreme koncentrati sastavljeni od aktivne supstanee, ovlaživača, pričvršeivaea. disperzanta ili emulzifikatora i. ako je to odgovarajuće, rastvarača ili ulja, i takvi koncentrati su pogodni za razblaživanje sa vodom.
Koncentrati aktivnih jedinjenja u preparacijama spremnim za upotrebu mogu se varirati u okviru relativno širokih raspona. Generalno, oni su od 0.0001 do 10%, npr. od 0. 01 do 1% po težini.
AHAS-inhibirajući herbicid može se takode upotrebiti uspešno u procesu ultra-niske-zapremine (ULV), moguće je bilo primeniti formulaci je koje obuhvataju preko 95% težinski aktivnog jedinjenja. ili čak da sc primeni aktivno jedinjenje bez aditiva.
Ono što sledi su primeri formulacija:
1. Proizvodi za razblaživanje sa vodom za lisne primene. Za namene tretiranja semena. takvi proizvodi se mogu primeniti na seme razblaženi ili nerazblaženi.
A) Koncentrati rastvorljivi u vodi (SL. LS)
Deset đelova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je rastvoreno u 90 delova težinski od vode ili u vodi rastvorljivom rastvaraču. Kao alternativa dodani su ovlaživači ili druga pomoćna sredstva. AHAS-inhibirajući herbicid rastvara se nakon razblaživanja sa vodom, čime se dobija formulacija sa 10 % (w/w) AHAS-inhibirajućeg herbicida.
B) Disperzibilni koncentrati (DC)
Dvadeset delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je rastvoreno u 70 delova težinski cikloheksanona sa dodavanjem 10 delova težinski disperzanta. na primer, polivinilpirolidona. Razblaživanje sa vodom dovodi do disperzije, čime je
dobijena formulacija sa 20% (vvAv) AI lAS-inhibirajućeg herbicida.
C) Emulzilikabilni koncentrati (KC)
Petnaest delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida jc rastvoreno u 7 delova težinski ksilena pomoću dodavanja kaicijum dodeeilbenzensulfonata i etoksilata dabrovog ulja (u svakom slučaju 5 delova težinski). Razblaživanjcm sa vodom daje emulziju. Čime jc dobijena formulacija sa 15% (w/w) AHAS-inhibirajućeg
herbicida.
D) Emulzije (EW, KO. ES)
Dvadeset pet delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je rastvoreno u 35 delova težinski ksilena pomoću dodavanja kaicijum dodeeilbenzensulfonata i etoksilata dabrovog ulja (u svakom slučaju 5 delova težinski). Ova mešavina je uvedena u 30 delova težinski vode pomoću mašine za emulzifikovanje {npr. Ultraturrax) i pretvorena u homogenu emulziju. Razblaživanjcm sa vodom daje
emulziju, čime je dobijena formulacija sa 25% (\\ \\) AHAS-inhibirajućeg herbicida.
E) Suspenzije (SC. OD. ES)
U kugličastom mlinu koji se mućka. 20 delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je usitnjeno dodavanjem 10 delova težinski disperzanta. ovlaživača i 70 delova težinski vode ili organskog rastvarača da se dobije fina suspenzija AHAS-inhibirajućeg herbicida. Razblaživanje sa vodom daje stabilnu suspenziju AHAS-inhibirajućeg herbicida, čime je dobijena formulacija sa 20% (w/w) AIIAS-inhibirajućeg herbicida.
F) Granule raspršive u vodi i granule rastvorljive u vodi (WG. SG). Pedeset delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je fino smrvljeno sa dodavanjem 50 delova težinski disperzanta i ovlaživača i učinjeno raspršljivim ili u vodi rastvorljivim granulama primenom tehničkog sredstva (na primer, istiskivanjem, sprej tornjem, tečnim ležajem). Razblaživanje sa vodom daje stabilnu disperziju ili rastvor AHAS-inhibirajućeg herbicida. čime jc dobijena formulacija sa 50%
(w/w) AHAS-inhibirajućeg herbicida.
G) Praškovi raspršljivi u vodi i praškovi rastvorljivi u vodi (WP. SP, SS. WS)
Sedamdeset pet delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je samleveno u rotor-stator mlinu sa dodavanjem 25 delova težinski disperzanta i ovlaživača i silika gela. Razblaživanje sa vodom daje stabilnu disperziju ili rastvor AHAS-inhibirajućeg herbicida, čime je dobijena formulacija sa 75% (w/w) AHAS-inhibirajućeg herbicida.
I) Gel-Formulacija (GF)
U kuglicastom mlinu sa mućkanjem. 20 delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je smrvljeno dodavanjem 10 delova težinski disperzanta. 1 dela težinski agesa za dobijanjc gela ovlaživača i 70 delova težinski vode ili organskog rastvarača da se dobije fina suspenzija AHAS-inhibirajućeg herbicida. Razblaživanje sa vodom daje stabilnu suspenziju AI lAS-inhibirajućeg herbicida, čime je dobijena formulacija sa 20% (w/w) Al lAS-inhibirajućeg herbicida. Ova gel formulacija je pogodna za upotrebu za tretman semena. 2. Proizvodi koji treba da se primene nerazblaženi za lisne primene. Za tretman semena. takvi proizvodi mogu se primeniti na seme razblaženi.
A) Praškasti prahovi (DP. DS)
Pet delova težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je fino smrvljeno i intimno pomešano sa 95 delova težinski fino izdeljene gline. To daje praškasti proizvod koji ima 5% (w/w) AHAS-inhibirajućeg herbicida.
B) Granule (GR. FG. GG. MG)
Jedna polovina dela težinski AHAS-inhibirajućeg herbicida je fino smrvljena i vezana sa 95.5 delova težinski nosača, čime je dobijena formulacija sa 0.5%
(w/w) AHAS-inhibirajućeg herbicida. Tekući metodi su istiskivanje, sušenje sprejom i tečna platforma. To daje granule koje treba da se primene nerazblažene za lisnu upotrebu.
Konvencionalne formulacije za tretman semena uključuju, na primer. tekuće koncentrate FS. rastvore LS, praškove za suvi tretman DS. praŠkove koji se raspršuju u vodi za kašasti treatment WS, praŠkove rastvorljive u vodi SS i emulziju FS i EC i gel formulacije GF. Ove formulacije mogu sc primeniti na seme razblažene ili nerazblažene. Primena na semena se obavlja pre sejanja, ili direktno na semena.
FS formulacija se koristi za tretman semena. Tipično, FS formulacija može obuhvatati 1-800 g/l aktivnog sastojka. 1-200 g/l površinskog sredstva, 0 do 200 g/l agensa protiv zamrzavanja, 0 do 400 g/l veznika. 0 do 200 g/l pigmenta i sve do 1 litra rastvarača, npr. vode.
Predmetna prijava nc-transgenna i transgena semena biljaka otpornih na herbicid iz predmetne prijave. Takva semena uključuju, na primer. semena ne-transgenog suncokreta koji ima karakteristike tolerancije na herbicid biljke sa NCIMB prijavnim brojem NCIMB 41262, i transgena semena obuhvataju polinukleotidni molekul iz prijave koji kodira IMI protein.
Za tretman semena, semena biljaka otpornih na herbicid prema predmetnoj prijavi su tretirana sa herbicidima. npr. herbicidima odabranim iz grupe koja se sastoji od AHAS-inbibirajućih herbicida kao Što su amidosulfuron, azimsulfuron. bensulfuron. hlorimuron. hlorsulluron, cinosulfuron, ciklosulfamuron. elametsulfuron, etoksisulfuron. flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron. halosulfuron, imazosulfuron, jođosulfuron. mezosulfuron. melsulfuron. nikosulfuron, oksasulf uron. primisulfuron, prosulfuron. pirazosulfuron, rimsulfuron. sulfometuron. su I fo su lfuron. tifensulfuron. triasulfuron. tribenuron. trifloksisulfuron, triflusulfuron. tritosulfuron. imazametabenz, imazamoks, imazapik, imazapir, imazakuin, imazetapir, hlorantsulam. diklosulam, florasulam. flumetsulam. matosulam. penoksisulam. bispiribak, piriminobak. propoksikarbazon, fiukarbazon. piribenzoksim, piriftalid. piritiobak. i njiho\ih mešavina. ili sa formulacijom koja obuhvata AHAS-inhibirajući herbicid.
Termin tretman semena obuhvata sve pogodne tehnike tretmana semena poznate u oblasti, kao što je oblačenje semena. obavijanje semena. prašenje semena. potapanje semena. tableliranje semena.
Ovde je takodc otkriven melođ za tretiranje zemljišta putem primene. posebno u bušotine za seme: bilo sa granularnom formulacijom koja sadrži AHAS-inhibirajući herbicid kao kompoziciju/formulaciju (npr, granularna Ibrmulacija. sa opciono jednim ili više čvrstih ili tečnih, poljoprivredno prihvatljivih nosača i/ili opciono sa jednim ili više poljoprivredno prihvatljivih površinskih sredstava. Ovaj metod ima prednost korišćenja, na primer. u semenskim perlicama žitarica, kukuruza, pamuka, i suncokreta.
Predmetna prijava takodc obuhvata semena obavijena sa iii koja sadrže u okviru formulacije za tretman semena najmanje jedan AHAS-inhibirajući herbicid odabran od grupe koja sc sastoji od amidosulfurona, azimsulfurona. bensulfurona. hlorimurona, hlorsulfurona, cinosulfurona, ciklosulfamurona. elametsulfurona, etoksisullurona. flazasulfurona, flupirsulfurona, foramsulfurona. halosulfurona, imazosulfurona. jodosulfurona. mezosulfurona, metsulfurona. nikosulfurona, oksasulfurona, primisulfurona. prosulfurona. pirazosulfurona, rimsulfurona, sulfometurona. sulfosulfurona. thifensulfuroa, triasulfurona, tribenurona, trifloksisulfurona, triflusulfuroan, tritosulfurona. imazametabenza. imazamoksa. imazapika, imazapira. imazakvina, imazetapira, hloransulama, diklosulama, florasulama, flumelsulama. metosulama. penokssulama. bimpiribaka. piriminobaka. propoksikarbazona, flukarbazona. piribenzoksima, piriffalida i piritiobaka.
Termin seme obuhvata semena i propagule biljke svih vrsta uključujući, ali bez ograničenja na, prava semena, delove semena, adventivne izdanke, čenove. lukovice, plodove, tubere, zrna, otsečke, otsečene izdanke i tome slično i načine u poželjnim oblicima pravih semena.
Termin ..obavijen sa i/ili sadržeći" generalno znači da je aktivni sastojak većim delom na površini propagacionog produkta u vreme primene, i ako veći ili manji deo sastojka može prodreti u propagacioni produkt, u zavisnosti od metoda primene. Kada je pomenuti propagacioni produkt (ponovo) zasađen, on može apsorbovati aktivni sastojak.
Primcna tretmana semena sa AHAS-inhibirajućim herbicidom ili sa formulacijom koja obuhvata AHAS-inhibirajući herbicid obavljena je sa sprejovanjem ili prašnjavljenjem semena pre sejanja biljaka i pre izbijanja biljaka.
1' tretmanu semena, odgovarajuće formulacije su primenjene putem tretiranja semena sa efektivnom količinom AHAS-inhibirajućeg herbicida ili formulacijom koja obuhv ata AHAS-inhibirajući herbicid. Ovde su aplikacione slope generalno od 0.10 g do 10 kg od a.i. (ili od mešavine a.i. ili od formulacije) na 100 kg semena. poželjno od 1 g do 5 kg na 100 kg semena, posebno od 1 g do 2.5 kg na 100 kg semena. Za specifične uscve kao što je salata stopa može biti viša.
Predmetna prijava opisuje metod za bitku sa neželjenom vegetacijom ili kontrolisanje korova koje sadrži semena otpornih biljaka prema predmetnoj prijavi pre sejanja i/ili nakon pregerminacije sa AHAS-inhibirajućim herbicidom. Metod može dalje obuhvatiti usporavanje semena. na primer. u zemlji u polju ili u medijumu u saksiji u staklenoj bašti metod nalazi određenu primenu u borbi sa neželjenom vegetacijom ili u kontroli korova u neposrednoj blizini semena.
Kontrola neželjene vegetacije je shvaćena tako da znači ubijanje korova i/ili na drugi način retardiranja ili inhibiranje normalnog rasta korova, korovi, u najširem smislu, su shvaćeni lako da označavaju sve biljke koje rastu na lokaciji na kojoj su nepoželjne.
Korovi iz predmetne prijave uključuju, na primer, dikotiledone i monokotiledone korove. Dikoliledoni korovi uključuju, ali nisu ograničeni na. korove iz. rodova: Sinapis, Lcpidium. Galium, Stellaria. Matricaria. Anthemis. Galinsoga, Chenopodium. Urtica, Senecio. Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polvgonum, Sesbania, Ambrosia, Ciraium. Carduus. Sonchus. Solanum, Rorippa, Rolala. Lindernia. Lamium. Veronica, Abutilon, Kmcks, Datum, Viola, Galeopsis, Papaver, Cenlaurea, Trifolium. Ranunculus, i Taraksacum. Monokotilcđoni korovi uključuju alo nisu ograničeni na, korove iz roda: Echinochloa. Selaria, Panicum, Digitaria, Phleum. Poa, Festuca. Eleusine, Brachiaria, Lolium. Bromus, Avena, Cvperus, Sorghum. Agropyron. Cvnodon, Monochoria. Fimbristyelis, Sagittaria. Eleocharis. Scirpus. Paspalum. Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium. Agrostis, Alopecurus. i Apera.
Sem toga. korovi iz predmetne prijave mogu uključiti, na primer, biljke useva koje rastu na neželjenoj lokaciji. Na primer, volonterska biljka kukuruza koja jc na polju koje predominantno obuhvata biljke soje može se smatrati korovom, ako je biljka kukuruza nepoželjna na polju sa biljkama soje.
Određeni i neodređeni Članovi ovde se koriste tako da označe jedan ili više od jednog (tj., najmanje jedan) gramatički objekt člana. Na primer, ..izvestan element." znači jedan ili više elemenata.
Onako kako se ovde koristi, reč „obuhvata." ili varijacije kao što su „obuhvataju" ili „obuhvatajući," biće shvaćene tako da podrazumevaju inkluziju dalog elementa, celine ili koraka, ili grupe elemenata, celina ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog elementa, celine ili koraka, ili grupe elemenata, celina ili koraka.
PRIMER 1: Mutageneza linije BTK47Helianthus cinnuusi selekcija biljaka otpornih na imidazolinon
BTK47. linija za odgajanjeHelianthus cinnuusL.. je hemijski imitirana na
način koji sledi. Šesto hiljada semena BTK.47 linije je tretirano sa rastvorom etil metansulfbnata (EIMS) tokom 15 časova. Tretirana semena su zatim posejana pod uslovima za polje 16. decembra, 2002 u Nidera eksperimentalnoj stanici Venado Tuerto, Santa Fe. Argentina. Približno 30.000 Ml biljaka je cvetalo i pokrivene su
sa vrećicamas sa ciljem da se svaka biljka samooplodi. Muška biljka je sakupljena i ručno protresana. 10. maja, 2003 u Nidera eksperimentalnoj stanici u Formosa. 20
M2semena iz svakog kapituluma je posejano u uslovima staklene bašte. Približno 590,000 bil jaka je sprejovano na V2-V4 stupnju sa imazapirom u stopi od 80 g ai/ha. Osam biljaka je preživelo tretman sa herbicidom i one su samooprašene i požnjevene. M3semena od svake od tih osam biljaka su procenjena na otpornost na imazapir. Izvan tih osam M3porodica, jedna porodica (S4897) sc izdvojila na osnovu otpornosti na herbicid u stopi od 1 otporan (tj., koji donosi tolerantnost u komercijalnoj stopi za imidazolinon herbicide): 2 intermedijeran (tj., delimično otporan): 1 suspektan. Potpuno fertilne otporne biljke su samooprašene i požnjevene sa ciljem da se propargira linija S4897.
Tkiva lista od M3 S4897 biljaka i od otpornih i intcrmedijernih klasa upolrebljena su kao izvor DNK za analizu sekvence AHASL 1 gena kao što je opisano u Primeru 2.
PRIMER 2: PCR Amplifikacija i sekvenciranje polinukleotida suncokreta koji kodiraju AHASL 1 proteine divljeg tipa otporne na imidazolinon
AHASUgen je amplifikovan sa PCR iz DNK izolovane od M3S4897 i BTK47 (divlji-tip) biljke suncokreta kao dva preklapajuća fragmenta. PCR amplifikacija je obavljena sa Ilotstart Taq DNA polimerazom i vezanim reagensima(Qiagcn Inc. Valencia. California, USA; Cat. No. 203205) koristeći standardne metode. PCR prajmeri za dva fragmenta su izncti u Tabeli 1 i u Listingu sekvenci. HA1U409 (SEQ ID NO: 7) je prajmer za unapred za prvi fragment i odgovara baznom paru 409 iz GenBank prijavnog br. AY124092. HA1L1379 (SEQ ID NO: 8) je reverzni prajmer za prvi fragment i odgovara baznom paru 1379 iz GenBank prijavnog br. AY124092. HAUJ1313 (SLQ ID NO: 9) je prajmer za unapred za drugi fragment i odgovara baznom paru 1313 iz GenBank prijavnog br. AY124092. HA1L2131 (SEO ID NO: 10) je reverzni prajmer za drugi fragment i odgovara baznom paru 2131 iz GenBank prijavnog br. AY124092. Prajmcrski par HA1 U409-IIA1 LI379 produkovao je fragment baznog para od 970 baznih parova. Prajmcrski par HA 11 i 1313-HA1L2131 produkovao je fragment baznog para od 818 baznih parova.
Nastali PCR produkti su sekvencirani da se produkuju AHASL I sekvence za S4897
i BTK47. Poklapanje ovih nukleotidnih sekvenci i nukleotidna sekvenca odXanthhtm sp.ALS gena (GenBank prijavni br. U16280; SEQ ID NO: 5) je data na Figuri 1. Poklapanje je otkrilo daAHASUgen od S4897 ima pojedinačnu mutaciju u odnosu na AIIASL1 od BTK47. Mesto mutacije jc naznačeno sa strelicom na Figuri 1. Ova mutacija je G-u-A tranzicija koja odgovara nukleotidu 21 iz SEO ID NO: 1.
Poklapanje predviđenih sekvenci amino kiselineod AHASL]nukleotidnih sekvenci od S4897, BTK47. iXanthium sp.je dato u Figuri 2. U odnosu na AIIASL1 dodana amino sekvenca od BTK47. AEIASL1 amino acid sekvenca od S4897 ima alanin-u-treonin supstituciju na poziciji 7 amino kiseline (SEQ ID NO: 2). Ova pozicija amino kiseline iz SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 107 amino kiseline u sekvenci amino kiseline pune dužine kodirane sa AHASL 1 nukleotidnom sekvencom suncokreta GenBank prijavni br. AY541451 (SEQ ID NO:l 1) i na poziciji amino kiseline 122 u sekvenci amino kiseline pune dužine kodirane saArabidopsis thalianaAHASL nukleotidnom sekvencom iz GenBank prijavnog br. X51514.
PRIMER 3: Proizvodnja linije suncokreta koja je homozigotna za karakteristike otpornosti na herbicid od S4897
Linija suncokreta koja je homozigotna za osobinu otpornosti na herbicid je produkovana od S4897 putem samoprasivanja i pregleda na otpornost na imazapir. Ova linija suncokreta i njene biljake su označene kao GM40. Nakon potvrđivanja homogenosti potomstva za otpornost na herbicid. biljke iz GM40 linije suncokreta su presađene pod uslovima staklene bašte i samo-oprašene za produkciju semena.
PRIMER 4: Otpornost S4897 na imazapik
U trijalima u polju u Argentini, S4897 bil jke su testirane na otpornost na imazapik. Otpornost na imazapik je bila jasno superiorna /a IMISUN-1 {Ala]9()-u-Val mutaciju: ekv ivalentna pozicija kodArabidopsis thalianaje 205: vidi Tabelu 4 niže). Ovaj trija! je imao rx>vršine od po jednog reda i tertiranje je obavljeno u vetrovitom danu, tako da je stvarna doza herbicida koja je stigla do biljaka bila verovalno manja od one koja je primenjena. Ipak. S4897 je pokazao superiornu toleranciju na imazapik u odnosu na A!ai9Q-u-VaI supstitucija, nismo prikazali podatke iz tog trijala u polju.
Biljke iz S4897 i IMISUN-1 bile su podvrgnute tretmanu sa imazapikom u uslovima staklene bašte. Fotografija na Figuri 5 prikazje to poređenje kada su biljke tretirane sa 100 g ai/ha imazapika.
PRIMER 5: Sažetak tolerancije na AHAS aktivnost za liniju suncokreta S4897 i druge Clearfield® varijetete suncokreta otpornog na herbicid
Metodi: linije suncokreta S4897, Clearfield® varijeteti suncokreta A. B. C i konvencionalni ne-Clearfield varijetet su sprejovam sa tri rate imazamoksa (Raptor™).
100. 200 i 300 gm ai/ha plus 0.5% Sun It U i dve rate imazapira (Arsenal™) 160 i 360 gm ai/ha plus 0.5%> Sun IIII kada su biljke bile na stupnju od dva do tri lista. Procene su obavljene 14 dana nakon primene (DAT) na povrede. Povrede su procenjene na skali od 0 do 9 gde jc 0 = nema povrede do 9 = mrtva biljka. Dvanaest biljaka je sprejovano u herbicid/rata tretmanu. Statistička analiza je izvedena sa STATGRAPHICS Plus 5.0 koristeći ANO VA i LSD procedure.
Analiza AHAS aktivnosti je takođe izvedena odabiranjem aktivno rastućih mladih listova od biljaka koje nisu sprejovane sa herbicidom približno Četiri nedclje nakon sađenja.
Rezultati: Nakon što su biljke bile sprejovane, shvaćeno je da će razlika u visini između S4897 i drugih varijeteta suncokreta imati uticaj na stvarnu dozu herbicida koja je isporučena. Visina mlaznice sprejovanja je kalibrisana u odnosu na S4897 i pošto su drugi varijeteti bili visi i bliži mlaznici oni bi primili veću dozu herbicida. Rate su ponovo kalibrisane za druge varijetete da se odredi približna doza koju su oni primili. Procene su napravljene kao što je predstavljeno u Tabeli 2 pošlo nije bilo moguće da se naprave direktna poređenja rate zbog efekta visine. Na primer. rezultati povreda su upoređeni za S4897 tretirane imazamoksom u stopi od 100 gm ai/ha prema drugim varijetetima tretiranim sa 75 gm ai/ha. Doza tretmana od 300 gm ai ha za liniju S4897 bila je ekvivalentna tretmanu od 200 gm ai/ha za druge varijetete, što je približno bilo 300 gm ai/ha.
Linija S4897 imala je značajno manje oštećenja u svim tretmanima sa herbicidom (Tabela 3). U stvari, zapaženo je vrlo malo oštećenja pri najvišoj stopi bilo imazamoksa ili imazapira. Drugi varijeteti su pokazali povećana oštećenja u odnosu na stope herbicida kao sto je bilo očekivano. Figura 6 pokazuje poređenje oštećenja pri 200/150 gm ai/ha za liniju S4897, Clearfield® varijetet A. i ne-Clearfield kontrolu. Vrh rasta S4897 je pokazao malo ili ništa oštećenja dok je Clcar- field® varijetet A bio značajno oštećen i prestao je da raste.
Rezultati AIIAS aktivnosti takođe su pokazali manje inhibicije pri višim koncentracijama imazamoksa u poredenju sa Clearfield® suncokretom i konvencionalnim ne Clearfield varijetetom (Figura 7). Inhibicija sa Glean™ bila je slična za sva tri varijeteta suncokreta (Figura 8). Povratna sprega nije prikazana pošto potencijalna roditeljska pozadina linije S4897 nije bila dostupna. Pošto su obe mutacije na istomAHASLJlokusu i svi testirani varijeteti su bili bomozigotni. postoji kvalitativna razlika u toleranciji obezbedenoj sa supstitucijom amino kiseline u AHASL 1 proteinu od S4897. Prema tome, ista količina AHAS enzima sa tom novom supstitucijom (tj.. Ala]Q7-u-Tr) je sposobna da katalizuje formiranje više produkta u prisustvu herbicida nego AHAS sa supstitucijom Alaj90-u-Val. Ovo ukazuje da supstitucija AHAS Ala]()7-u-Tr ima superiornu toleranciju na imidazolinon herbicide nego AHAS sa Alai9fj-u-Val supstitucijom.
PRIMER 6: AHASL proteini suncokreta otporni na herbicid
Ovde su otkriveni i nukleoti i sekvence amino kiseline za divlji tip i AHASL polipeptide suncokreta otporne na herbicid. Biljke koje obuhvataju AHASL polipeptide otporne na herbicid bile su prethodno identifikovane. i opisan je jedan broj konzerviranih regiona AHASL polipeptida koji su mesta supstitucija amino kiseline koja donose otpornost na herbicide. Vidi, Devine i Eberlein (1997) „Fiziološki, biohemijski i molekularni aspekti otpornosti na herbicid zasnovani na izmenjenim ciljnim mestima". U: Aktivnost herbicida: Toksikologija, biohemija i molekularna Biologija, Roe i sar. (izd.), str. 159-185, IOS Press, Amsterdam: i Devine i Shukla, (2000) Crop Protection 19: 881-889.
Koristeći AHASL sekvence pronalaska kao Što je definisano u zahtevima i metode poznate stručnjacima, neko može proizvesti dodatne polinukleotide koji kodiraju AHASL polipeptide otporne na herbicid koji imaju jednu. dve. tri, ili više supstitucija amino kiselina na identifikovanim mestima u tim konzerviranim regionima. Tabela 4 obezbedujc konzervirane regione AF1ASL proteina, supstitucije amino kiseline za koje je poznato da obezbeduju otpornost na herbicid u okviru tih konzerviranih regiona, i odgovarajuće amino kiseline AHASL 1 proteina suncokreta date u SEQ ID NO: 4.
PRIMER 7: Proizvodnja GM1606 linije suncokreta
Druga linija suncokreta otporna na herbicid je proizvedena pomoću mutageneze semena suncokreta koja su divlji tip u odnosu na otpornost na herbicid putem metoda koji je u osnovi kao stoje opisano gore u Primeru 1. Nova linija i biljke su ovde označeni kao GM1606. GM1606 linija suncokreta obuhvata istu mutaciju u AHASL 1 genu kao i S4897 linija suncokreta. Ova mutacija u GM1606 je G-u-A tranzicija koja odgovara nukleotidu 21 iz SEQ ID NO: I. Takva mutacija dovodi do alanin-u-treonin supstitucije na poziciji 7 amino kiseline od (SEQ ID NO: 2). Ta pozicija amino kiseline u SE]Q ID NO: 2 odgovara poziciji 107 amino kiseline u sekvenci amino kiseline pune dužine kodiranoj sa AIIASL1 nukleotidnom sekvencom suncokreta iz GenBank prijavnog br. AY541451 (SEQ ID NO: 11) i poziciji 122 sekvence amino kiseline pune dužine kodirane sa AHASL nukleotidnom sekvencomArabidopsis thaiianaiz GenBank prijavnog br. X51 514.
PRIMER 8: Odgovor mutantnih događaja A122T i A205V na imazapir
Ispitivanje u staklenoj bašti je izvedeno da se kvantifikuje i uporedi senzitivnost mutanata A122T i A205V na imazapir u različitim genetičkim pozđinama na nivou cele biljke kod suncokreta. Semena različitih linija suncokreta koje su upotrebljene u studiji su dobijena pod uslovima u polju. Linije upotrebljene u studiji su nabrojane u Tabeli 5.
Metodi
Semena su posejana u Petri šoljama i, nakon germinacije, izdanci su presađeni u saksije od 10 cm u precniku u medijumu za saksije koji sc sastojao od jednakih delova glistenjaka. zemlje i peska. Biljke su gajene u staklenoj bašti pod uslovima prirodnog svetla snabdevene sa natrijum halidnim lampama od 400 W da se obezbedi 16 časova dužine dana. Dan/noć temperature bile su 25 i 20 °C. respektivno. U V2 stadij um u 10 biljaka od svakog genotipa je po principu slučajnosti dodcljcno svakom tretmanu koji se sastojao od sedam doza imazapira (0. 40. 80. 160. 240. 320. 400 i 480 g ai/ha) i nultog-vremena određivanja biomase. Eksperiment je aranžiran kao blok dizajn po principu slučajnosti sa potpunim faktorijalom (linija suncokreta x tretman) aranžmana tretmana i 10 ponavljanja.
Na dan primene herbicida, deset biljaka od svakog genotipa je isečeno na čvoru sa kotiledonima i osušeno na 60 °C tokom 48 časova i određeno je nulto-vreme suve mase. Preostale biljke su održavane tokom 10 dana nakon tretmana sa imazapirom (DAT) i zabeleženi su njihova visina, korenovi i suva biomasa iznad zemlje. Visina je određena kao distanca između čvora koiileđona i vrha svake biljke. Za određivanje biomase korena. svaka biljka je izvađena iz saksije i medijum za saksije je ispran sa korenova. Biomasa iznad zemlje iz svake linije je pretvorena u biomasu akumuliranu nakon primene putem oduzimanja odgovarajuće prosečne biomase nultog-vremena za svaki uzorak. Podaci o suvoj masi su pretvoreni u procente od netretiranih kontrolnih biljaka u okviru svake linije da se omogući direktno poređenje medu grupama.
Rezultati
1. Visina
Visina linija suncokreta koje su nosile A205V mutaciju nije se razlikovala od netretiranih kontrola kada je primenjena stopa od 0.5KS ili 1 KS imazapira. Od 2KS do 6KS, te linije su pokazale značajnu redukciju u visini koja je dostigla 68.9% +/- 3.1 od netretiranih kontrola (Tabela 6 i Eigura 9). Nasuprot tome, linije suncokreta koje su nosile A122T mutaciju pokazale su manju redukciju visine (od 0.6 do 15.8%) od ne tretiranih kontrola za 0.5KS i 6KS rate imazapira, respektivno). Obe grupe linija pokazale su značajnu razliku među sobom u njihovom odgovoru na povećanu ratu herbicida od 2KS do 6KS ( Tabela 6 i Eigura 9).
2. Indeks filotoksičnosli
Obe mutacije su pokazale velike razlike u njihovom odgovoru na povećanu stopu herbicida od 0.5KS do 6KS (Figura 10). Linije suncokreta koje su nosile A122T mutaciju pokazale su neznatnu redukciju u veličini lista, svetliju zelenu boju nego kontrolne biljke kako je rasia stopa herbicida (Tabela 7). Nasuprot tome. biljke koje su nosile A205V mutaciju nisu pokazale bilo kakvo oštećenje pri 0.5KS ili 1KS stopi herbicida. ali je nivo oštećenja (žutoća, deformacija lista i nekroza lista) brzo porastao od 2KS do 6KS (Tabela 7). Obe mutacije su se međusobno razlikovale značajno u odnosu na indeks fitotoksičnosti od 2KS do 6KS (Table 7).
3. Suva težina biomase iznad zemlje
Krive doznog odgovora za težinu suve mase mutanata A122T i A205V prikazane su na Figuri 11. Težina biomase događaja A122T je redukovana u odnosu na kontrolne biljke od 4KS, 5KS i 6KS stope, i ova redukcija je dostigla 25 za višu dozu. U međuvremenu, suva težina događaja A205V je redukovana u odnosu na kontrolne biljke od 0.5KS (40 gai./ha) do 6KS. Oba mutanta su pokazala značajne razlike među sobom u odnosu na tu varijablu od 0.5KS do 6KS (Tabela 8). Isti trendovi su dobijeni za akumulaciju suve materije (nije prikazano) ali bez zbunjujućih efekata početnih razlika među genotipovima za njihovu suvu težinu u nultom-vremenu.
4. Biomasa korena
Kako su rasle doze imazapira. suve biomase korena od oba mutanta su bile redukovane u odnosu na kontrolne biljke, ali stopa redukcije je bila vrlo različita između A122T i A205V (Figura 12). U stvari. A205V je pokazao značajnu redukciju suve težine biomase korena od 12.8% na 0.5KS (40 g.a.i/ha) do 75.6% na 6KS (Tabela 9), Nasuprot tome. A122T nosioci su pokazali značajno smanjenje suve težine biomase korena od 3KS do6KS. i u višoj dozi redukcija je dostigla 38.3% (Tabela 9). Oba mutanta su pokazala značajne razlike medi; sobom u suvoj težini korena u odgovoru na stope herbicida od 0.5KS do 6KS (Tabela 9 i Figura 1 2).

Claims (18)

1. Suncokretova polinukleotidna velika podjedinica acetohidroksikisele sintaze( AHASL). gde pomenutiAHASLpolinukleotid kodira AHASL1 protein koji je tolerntan na herbicid imidazolinon, koji obuhvata supstituciju iz alanina u treonin na poziciji 7 amino kiseline iz SEQ ID NO:2 ili. ekvivalentno, na poziciji 107 iz SEQ ID NO: 12; gde pomenuti AHASL 1 protein obuhvata polipeptid koji je najmanje 95% identičan sa SEQ ID NO: 12; i gde pomenuti AHAS LI protein donosi biljci povećenu tolerantnost na herbicid imidazolinon u poredenju sa varijetetom divljeg tipa pomenute biljke.
2. AHASLpolinukleotid prema zahtevu 1. pri čemu pomenuti AHASL1 protein obuhvata: a) sekvencu amino kiseline datu u SEQ ID NO:2 sa supstitucijom iz alanina u treonin na poziciji 7 amino kiseline iz SEQ ID NO:2 ili. ekvivalentno, na poziciji 107 iz SEO ID NO: 12. koja po potrebi sadrži najmanje jedan član odabran iz grupe koja se sastoji od: (i) supstituciju iz prolina u glutamin ili serin na poziciji 182 amino kiseline ili ekvivalentnoj poziciji u odnosu na sekvencu amino kiseline date u SI O ID NO:12: (ii) supstituciju iz alanina u aspartat iii valin na poziciji 190 amino kiseline ili ekvivalentnoj poziciji u odnosu na sekvencu amino kiseline date u SEO ID NO:12; (iii) supstituciju iz triptofana u leucin na poziciji 559 amino kiseline ili ekvivalentnoj poziciji u odnosu na sekvencu amino kiseline date u SE:Q ID NO: 12; i (iv) supstituciju iz alanina u bilo koji od asparagin. treonin, fenilalanin, ili valin na poziciji 638 amino kiseline ili ekvivalentnoj poziciji u odnosu na sekvencu amino kiseline date u SEQ ID NO: 12.
3. Ekspresiona kaseta koja obuhvata promotor operativno vezan za polinukleotid prema zahtevu 1 ili 2.
4. Metod za proizvodnju biljke koja jc tolerantna na herbicid imidazolinon, koji metod obuhvata (i) transformisanje ćelije biljke sa polinukleotidnim konstruktom koji obuhvata polinukleotid prema zahtevu 1 ili 2 operativno vezan za promotor koji pokreće ekspresiju u biljnoj ćeliji: i (ii) regenerisanje biljke iz pomenute transformisane biljne ćelije.
5. Biljka koja obuhvata najmanje jednu kopiju polinukleotida kao što je definisano u zahtevima 1 ili 2.
6. Metod za odabiranje iz transformisane biljne ćelije, koji metod obuhvata: (i) obezbedivanje biljne ćelije koja obuhvata transformacioni vektor biljke koji obuhvata promotor i operativno vezani polinukleotid prema zahtevu 1 ili 2; (ii) izlaganje pomenute transformisane biljne ćelije herbicidu imidazolinonu u koncentraciji koja inhibira rast ne transformisane biljne ćelije; i (iii) identi ti kovanje pomenute transformisane biljne ćelije u odnosu na njenu sposobnost da raste u prisustvu pomenutog herbicida.
7. Metod za rast biljke prema zahtevu 5 dok sc kontrolišc rast korova u blizini pomenute biljke, gde pomenuti metod obuvala (i) rast biljke u polju prema zahtevu 5: i (ii) kontaktiranje pomenute biljke i korova u polju sa efektivnom količinom formulacije AHAS-inhibirajućeg herbicida koja obuhvata herbicid imidazolinon, herbicid sulfonilureu. herbicid triazolopirimidin. herbicid pirimidiniloksibenzoat. herbicid sulfonilamino-karboniltriazolinon. ili njihovu mešavinu koju biljka toleriše i koja će inhibirati rast varijeteta biljke divljeg tipa. pri čemu formulacija herbicida ne inhibira rast pomenute biljke tako jako da bi inhibirala rast varijeteta biljke divljeg tipa.
8. Metod prema bilo kom od zahteva 4. 6 i 7. gde pomenuti herbicid imidazolinon obuhvata jedan ili više od imazetapira. imazapika. imazamoksa. imazakvina, imazetabenza, i imazapira. ili mešavinu bilo kog od gore pomenutih.
9. Metod prema zahtevu 7. gde pomenuti herbicid sulfonilurea obuhvata hlorsulfuron. metil metsulfuron. metil sulfometuron. etil hlorimuron. metil tifensulfuron. metil iribenuron, metil bensulfuron, nikosulfuron. metil etametsulfuron. rimsulfuron, metil triflusulfuron. iriasulfuron, metil primisulfuron. ci nosu lfuron. amidosulfuron. flazasulfuron. imazosulfuron, etil pirazosulfuron, halosulfuron. ili mešavinu bilo kog od gore pomenutih.
10. Organ, tkivo ili ćelija biljke prema zahtevu 5.
11. Seme koje obuhvata najmanje jednu kopiju polinukleotida kao što je definisan u zahtevima I ili 2.
12. Seme prema zahtevu 11. gde je pomenulo seme tretirano sa efektivnom količinom Al lAS-inhibirajućeg herbicida.
13. Seme prema zahtevu 12, gde pomenuti AHAS-inhibirajući herbicid obuhvata herbicid imidazolinon, herbicid sulfonilureu. herbicid triazolopirimidin. herbicid sulfonilamino-karbonillriazolinon. ili mešavinu bilo kog od gore pomenutih.
14. Seme prema zahtevu 13, gde pomenuti AHAS-inhibirajući herbicid je imidazolinon herbicid.
15. Metod za tretiranje semena. gde metod obuhvata tretiranje semena prema bilo kom od zahteva 11-14 sa efektivnom količinom AHAS-inhibirajućeg herbicida.
16. Metod prema zahtevu 15. gde pomenuti AHAS-inhibirajući herbicid obuhvata herbicid imidazolinon, herbicid sulfonilureu. herbicid triazolopirimidin, herbicid sulfonilamino-karboniltriazolinon, ili mešavinu bilo kog od gore pomenutih.
17. Metod prema zahtevu 16. gde je pomenuti AIlAS-inhibiraiući herbicid imidazolinon herbicid.
18. Metod za delektovanjeAHASUsuncokreta, gde pomenuti metod obuhvata: (i) dobijanje genomske DNK iz biljke; (ii) upotrebu pomenute DNK kao matrice za amplifikaciju polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) obuhvatajućiAHASLlprajmer za napred koji obuhvata sekvencu prikazanu kao SHQ ID NO:7 i reverzniAllASLlprajmer koji obuhvata sekvencu prikazanu kao SfiQ ID NO:8: i (iii) sekvenciranje produkata pomenute PCR amplifikacije.
RS20160409A 2005-07-01 2006-06-29 Biljke suncokreta otporne na herbicide, polinukleotidi koji kodiraju acetohidroksikiselu sintazu velike podjedinice proteina otpornu na herbicide, i metodi upotrebe RS54931B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69595205P 2005-07-01 2005-07-01
EP12183100.2A EP2532750B1 (en) 2005-07-01 2006-06-29 Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS54931B1 true RS54931B1 (sr) 2016-10-31

Family

ID=37605027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160409A RS54931B1 (sr) 2005-07-01 2006-06-29 Biljke suncokreta otporne na herbicide, polinukleotidi koji kodiraju acetohidroksikiselu sintazu velike podjedinice proteina otpornu na herbicide, i metodi upotrebe

Country Status (21)

Country Link
US (4) US20110209232A1 (sr)
EP (3) EP1902136B1 (sr)
JP (2) JP5265356B2 (sr)
CN (2) CN101287836B (sr)
AR (2) AR058429A1 (sr)
AT (1) ATE541939T1 (sr)
AU (1) AU2006265984C9 (sr)
BR (1) BRPI0612384B1 (sr)
CA (2) CA2613087C (sr)
EA (2) EA201301103A1 (sr)
ES (2) ES2581478T3 (sr)
HR (1) HRP20120294T2 (sr)
HU (2) HUE035307T2 (sr)
PL (1) PL1902136T3 (sr)
PT (1) PT1902136E (sr)
RS (1) RS54931B1 (sr)
SI (1) SI1902136T1 (sr)
TR (2) TR200907590T2 (sr)
UA (1) UA99091C2 (sr)
WO (1) WO2007005581A2 (sr)
ZA (1) ZA200800947B (sr)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12570965B2 (en) 2005-03-02 2026-03-10 Instituto Nacional De Technologia Agropecuaria Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
EA201301103A1 (ru) * 2005-07-01 2014-02-28 Басф Се Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов
ES2641088T3 (es) 2006-12-07 2017-11-07 Kansas State University Research Foundation Sorgo resistente a herbicidas de acetolactato sintetasa
UA108733C2 (uk) 2006-12-12 2015-06-10 Толерантна до гербіциду рослина соняшника
UA102223C2 (ru) * 2007-04-04 2013-06-25 Басф Агрокемикал Продактс Б.В. Стойкое к гербицидам растение подсолнуха с множественными стойкими к гербицидам аллелями ahasl1
US10017827B2 (en) 2007-04-04 2018-07-10 Nidera S.A. Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of AHASL1 and methods of use
CA2682349C (en) * 2007-04-04 2017-08-22 Basf Plant Science Gmbh Ahas mutants
AU2013270631C1 (en) * 2007-04-04 2016-09-29 Basf Plant Science Gmbh AHAS mutants
KR20100016165A (ko) * 2007-04-04 2010-02-12 바스프 에스이 제초제-저항성 브라시카 식물 및 사용 방법
CN108130336A (zh) * 2007-10-05 2018-06-08 赛布斯欧洲公司 芸苔属中突变的乙酰羟酸合酶基因
US8889951B2 (en) * 2008-05-06 2014-11-18 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Herbicide resistant barley expressing mutant acetohydroxy acid synthase
HRP20160529T1 (hr) * 2008-07-31 2016-07-29 Anglo Netherlands Grain Bv Biljke suncokreta rezistentne na herbicide
CN102216453B (zh) * 2008-09-26 2014-02-05 巴斯夫农化产品有限公司 除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法
WO2011076345A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant plants
RS57062B1 (sr) * 2010-03-17 2018-06-29 Basf Agrochemical Products Bv Biljke tolerantne na herbicide
UA113721C2 (uk) * 2010-10-15 2017-03-10 Баєр Інтеллекчуел Проперті Гмбх Толерантний до інгібуючого als гербіциду мутант буряку звичайного
PL2627183T5 (pl) † 2010-10-15 2024-02-05 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Zastosowanie herbicydów inhibitorów ALS do kontroli niechcianej roślinności w roślinach Beta vulgaris z tolerancją herbicydów inhibitorów ALS
RU2014126423A (ru) * 2011-11-29 2016-01-27 Агридженетикс, Инк. Высокопроизводительный анализ однонуклеотидных полиморфизмов
IN2014CN04928A (sr) * 2011-12-05 2015-09-18 Basf Agrochemical Products Bv
MX366944B (es) 2012-04-05 2019-07-31 Advanta Int Bv Plantas de sorgo que tienen un polinucleotido mutado que codifica una subunidad mayor de la proteina sintasa acetohidroxiacida mutada y tiene resistencia incrementada a herbicidas.
RS57806B2 (sr) * 2012-12-13 2022-07-29 Bayer Cropscience Ag Upotreba als inhibitora herbicida za kontrolu neželjene vegetacije kod beta vulgaris biljaka tolerantnih na als inhibitore herbicida
US20150148235A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Nidera S.A. Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of ahasl1 and methods of use
WO2015189409A1 (en) * 2014-06-12 2015-12-17 Sesvanderhave N.V. Transformation method of sugar beet protoplasts by talen platform technology
EA201790048A1 (ru) * 2014-06-26 2017-05-31 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Обработка семян ингибиторами ацетолактатсинтазы (als)
CN105746255B (zh) * 2016-03-22 2019-01-11 北京大北农科技集团股份有限公司 除草剂耐受性蛋白质的用途
JP2017118878A (ja) * 2017-01-16 2017-07-06 アドヴァンタ・ホールディングス・ベスローテン・フェンノートシャップ 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物
JP2019141045A (ja) * 2019-03-04 2019-08-29 アドヴァンタ・ホールディングス・ベスローテン・フェンノートシャップ 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物
KR102147381B1 (ko) * 2019-11-22 2020-08-24 씨제이제일제당 주식회사 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물
CN111996204B (zh) * 2020-08-24 2023-04-18 浙江师范大学 烟草GSNOR1a/1b在植物抗逆中的应用

Family Cites Families (129)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3060084A (en) 1961-06-09 1962-10-23 Du Pont Improved homogeneous, readily dispersed, pesticidal concentrate
US3299566A (en) 1964-06-01 1967-01-24 Olin Mathieson Water soluble film containing agricultural chemicals
US4144050A (en) 1969-02-05 1979-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Micro granules for pesticides and process for their manufacture
US3920442A (en) 1972-09-18 1975-11-18 Du Pont Water-dispersible pesticide aggregates
US4172714A (en) 1976-12-20 1979-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Dry compactible, swellable herbicidal compositions and pellets produced therefrom
US4443971A (en) * 1979-10-16 1984-04-24 Cornell Research Foundation, Inc. Herbicide-tolerant plants
HU187284B (en) * 1980-12-11 1985-12-28 Mta Koezponti Kemiai Kutato In Herbicide compositions containing antitoxines of aldehyde- and ketone-derivatives
GB2095558B (en) 1981-03-30 1984-10-24 Avon Packers Ltd Formulation of agricultural chemicals
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4774381A (en) * 1983-09-30 1988-09-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicide resistant tobacco
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US5304732A (en) 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5331107A (en) * 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US6211439B1 (en) * 1984-08-10 2001-04-03 Mgi Pharma, Inc Herbicide resistance in plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5605011A (en) * 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5013659A (en) * 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5378824A (en) * 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5821126A (en) * 1986-11-19 1998-10-13 The Regents Of The University Of California Method for clonal propagation of gymnosperms by somatic polyembryogenesis
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
FR2617167B1 (fr) * 1987-06-25 1989-11-24 Rhone Poulenc Agrochimie Herbicides de type sulfonyluree, leur preparation, les compositions les contenant et leur utilisation
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
IE61148B1 (en) * 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5180587A (en) 1988-06-28 1993-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tablet formulations of pesticides
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5084082A (en) * 1988-09-22 1992-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean plants with dominant selectable trait for herbicide resistance
GB8825402D0 (en) * 1988-10-31 1988-11-30 Cambridge Advanced Tech Sulfonamide resistance genes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
DK0777964T3 (da) 1989-08-30 2002-03-11 Kynoch Agrochemicals Proprieta Fremgangsmåde til fremstilling af et doseringssystem
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
PL167613B1 (pl) 1990-03-12 1995-09-30 Du Pont Granulowana kompozycja rozpuszczalna lub dyspergowalna w wodzie PL
ATE225853T1 (de) 1990-04-12 2002-10-15 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische promotoren
PL295547A1 (sr) 1990-04-26 1992-10-05 Plant Genetic Systems Nv
US5198599A (en) * 1990-06-05 1993-03-30 Idaho Resarch Foundation, Inc. Sulfonylurea herbicide resistance in plants
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
DE69122201T2 (de) 1990-10-11 1997-02-06 Sumitomo Chemical Co Pestizide Zusammensetzung
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
DE4038430A1 (de) * 1990-12-01 1992-06-04 Basf Ag Herbizide n-((1,3,5-triazin-2-yl)-aminocarbonyl) benzolsulfonamide
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5767366A (en) * 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
EP0508161B1 (en) * 1991-04-08 2000-05-10 American Cyanamid Company Use of AHAS inhibiting herbicide resistant wheat and method for selection thereof
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
US5731180A (en) * 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
DE69227911T2 (de) 1991-08-02 1999-05-12 Kubota Corp., Tokio/Tokyo Neuer mikroorganismus und insektizid
US5405765A (en) 1991-08-23 1995-04-11 University Of Florida Method for the production of transgenic wheat plants
US5604121A (en) 1991-08-27 1997-02-18 Agricultural Genetics Company Limited Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
TW261517B (sr) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
DE4206146A1 (de) * 1992-02-28 1993-09-02 Basf Ag Herbizide n-((1,3,5-triazin-2-yl)aminocarbonyl)benzolsulfonamide
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
JP2952041B2 (ja) 1992-07-27 1999-09-20 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法
US5545822A (en) 1992-08-21 1996-08-13 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
FR2696190B1 (fr) * 1992-09-25 1994-12-09 Agronomique Inst Nat Rech Acide nucléique codant pour une alpha-acétolactate synthase et ses applications.
US5539092A (en) * 1992-10-02 1996-07-23 Arch Development Corporation Cyanobacterial and plant acetyl-CoA carboxylase
DE4238175A1 (de) * 1992-11-12 1994-05-19 Basf Ag Herbizide Sulfonylharnstoffe, Verfahren zur Herstellung und ihre Verwendung
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
DE4322211A1 (de) 1993-07-03 1995-01-12 Basf Ag Wäßrige, mehrphasige, stabile Fertigformulierung für Pflanzenschutz-Wirkstoffe und Verfahren zu ihrer Herstellung
JP3339655B2 (ja) * 1993-10-04 2002-10-28 花王株式会社 水素化反応用触媒前駆体、その製造法、及びアルコールの製造法
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5633437A (en) * 1994-10-11 1997-05-27 Sandoz Ltd. Gene exhibiting resistance to acetolactate synthase inhibitor herbicides
CA2160529A1 (en) 1994-10-14 1996-04-15 Toshihiko Iizuka Bacillus strain and harmful organism controlling agents
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US6576455B1 (en) * 1995-04-20 2003-06-10 Basf Corporation Structure-based designed herbicide resistant products
US5853973A (en) * 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
DE19518505A1 (de) * 1995-05-19 1996-11-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Genexpressionsanalyse
DE19534910A1 (de) * 1995-09-20 1997-03-27 Basf Ag Herbizide Mischungen mit synergistischer Wirkung
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US5773704A (en) * 1996-04-29 1998-06-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5773702A (en) 1996-07-17 1998-06-30 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
US5859348A (en) 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
US6114116A (en) * 1996-12-02 2000-09-05 Lemieux; Bertrand Brassica polymorphisms
US6358686B1 (en) * 1996-12-02 2002-03-19 Affymetrix, Inc. Brassica polymorphisms
DE19650955A1 (de) * 1996-12-07 1998-06-10 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel mit N- [(4,6-Dimethoxypyrimidin-2-yl)aminocarbonyl] -5-methylsulfonamidomethyl-2-alkoxycarbonylbenzolsulfonamiden
AU6024598A (en) * 1997-01-10 1998-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Hybridization-based genetic amplification and analysis
US5866766A (en) * 1997-01-17 1999-02-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred sunflower line PHA262
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US6207425B1 (en) * 1997-09-11 2001-03-27 City Of Hope Bidirectional PCR amplification of specific alleles
AR014072A1 (es) 1998-02-26 2001-01-31 Pioneer Hi Bred Int Molecula de acido nucleico aislada que tiene una secuencia nucleotidica para un promotor que es capaz de iniciar una transcripcion constitutiva en unacelula de planta, construccion adn, vector, celula huesped, metodo para expresar en forma constitutiva una secuencia nucleotidica heteroloca en una
US6696294B1 (en) * 1998-06-19 2004-02-24 Northwest Plant Breeding Co. Methods for generating and identifying mutant polyploid plants, and uses therefor
US6348643B1 (en) * 1998-10-29 2002-02-19 American Cyanamid Company DNA sequences encoding the arabidopsis acetohydroxy-acid synthase small subunit and methods of use
US7019196B1 (en) * 1998-11-05 2006-03-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
WO2000028058A2 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator lec1 nucleic acids, polypeptides and their uses
US6175065B1 (en) * 1999-04-14 2001-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred sunflower line PHA344
GB9917307D0 (en) * 1999-07-23 1999-09-22 Sec Dep Of The Home Department Improvements in and relating to analysis of DNA
US20010044939A1 (en) * 2000-01-04 2001-11-22 Abell Lynn M. Small subunit of plant acetolactate synthase
US6613963B1 (en) * 2000-03-10 2003-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Herbicide tolerant Brassica juncea and method of production
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AU2001261358B2 (en) * 2000-05-10 2006-07-13 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Resistance to acetohydroxyacid synthase-inhibiting herbicides
US6475736B1 (en) * 2000-05-23 2002-11-05 Variagenics, Inc. Methods for genetic analysis of DNA using biased amplification of polymorphic sites
CA2326283C (en) * 2000-11-17 2008-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica napus with early maturity (early napus) and resistance to an ahas-inhibitor herbicide
CA2326285C (en) * 2000-11-17 2008-05-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica with resistance to an ahas-inhibitor herbicide and blackleg disease
US20030097692A1 (en) * 2000-12-21 2003-05-22 Georg Jander Plants with imidazolinone-resistant ALS
US6627401B2 (en) * 2000-12-28 2003-09-30 Council Of Scientific And Industrial Research Method for detecting a single nucleotide polymorphism in p21waf1/cip1 gene as an indicator of risk of esophageal cancer
US6492582B2 (en) * 2001-01-11 2002-12-10 California Cooperative Rice Research Foundation, Inc. Rice cultivar M-205
USRE48254E1 (en) * 2001-05-14 2020-10-13 University Of Saskatchewan Lentil plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
WO2003001436A1 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Paul Peterson Methods and apparatus for generating a multiple composite image
WO2003014356A1 (en) * 2001-08-09 2003-02-20 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
ES2417012T3 (es) * 2001-08-09 2013-08-05 Northwest Plant Breeding Co. Plantas de trigo que exhiben resistencia aumentada a los herbicidas de imidazolinona
AU2002319037B2 (en) * 2001-08-09 2008-05-29 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
WO2003020983A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-13 Virginia Commonwealth University Allele specific pcr for genotyping
WO2003048319A2 (en) * 2001-11-30 2003-06-12 Syngenta Participations Ag Nucleotide sequences encoding proteins conferring abiotic stress tolerance in plants
EP1551218B1 (en) * 2002-07-10 2017-05-17 The Department of Agriculture, Western Australia Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
AU2003275859A1 (en) * 2002-10-29 2004-05-25 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods for identifying plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
US7595177B2 (en) * 2002-10-29 2009-09-29 Advanta Canada, Inc. Assay for imidazolinone resistance mutations in Brassica species
US6953880B2 (en) * 2003-02-28 2005-10-11 University Of Arkansas, N.A. Rice cultivar ‘Francis’
PL1633875T3 (pl) * 2003-05-28 2012-12-31 Basf Se Rośliny pszenicy o zwiększonej tolerancji na herbicydy imidazolinonowe
MXPA06002155A (es) * 2003-08-29 2007-01-25 Inst Nac De Technologia Agrope Plantas de arroz que tienen una tolerancia incrementada a los herbicidas de imidazolinona.
US7432082B2 (en) * 2004-03-22 2008-10-07 Basf Ag Methods and compositions for analyzing AHASL genes
MXPA06014761A (es) * 2004-06-16 2007-03-26 Basf Plant Science Gmbh Polinucleotidos que codifican las proteinas ahasl maduras para crear plantas tolerantes a la imidazolinona.
US7355098B2 (en) * 2004-06-22 2008-04-08 Saskatchewan Wheat Poo1 Brassica AHAS genes and gene alleles that provide resistance to imidazolinone herbicides
TR200900517T2 (tr) * 2004-07-30 2009-03-23 Basf Agrochemical Products B.V. Herbisitlere dayanıklı ayçiçeği bitkileri herbisitlere dayanıklı asetohidroksiasit sintaz geniş altünite proteinlerini kodla yan polinükleotidler ve kullanma metotları.
AR051690A1 (es) * 2004-12-01 2007-01-31 Basf Agrochemical Products Bv Mutacion implicada en el aumento de la tolerancia a los herbicidas imidazolinona en las plantas
EA201301103A1 (ru) * 2005-07-01 2014-02-28 Басф Се Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов
US7786360B2 (en) * 2005-09-09 2010-08-31 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Rice cultivar designated ‘CL131’
US20070118920A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-24 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
US7642434B2 (en) * 2007-05-02 2010-01-05 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, N.A. Rice cultivar CL171-AR

Also Published As

Publication number Publication date
AU2006265984A1 (en) 2007-01-11
BRPI0612384B1 (pt) 2021-10-13
CA3006126A1 (en) 2007-01-11
AR097201A2 (es) 2016-02-24
EA201301103A1 (ru) 2014-02-28
UA99091C2 (ru) 2012-07-25
CA2613087C (en) 2018-06-19
EP1902136B1 (en) 2012-01-18
US20160222403A1 (en) 2016-08-04
AU2006265984B2 (en) 2012-08-16
JP2013121349A (ja) 2013-06-20
BRPI0612384A2 (pt) 2009-01-27
EP2532750A1 (en) 2012-12-12
CN101287836A (zh) 2008-10-15
AU2006265984C1 (en) 2013-02-28
EP2400022B1 (en) 2017-06-14
AR058429A1 (es) 2008-02-06
EP1902136A2 (en) 2008-03-26
TR200709185T2 (tr) 2008-02-21
HRP20120294T2 (hr) 2024-06-07
HUE029181T2 (en) 2017-02-28
EP2400022A1 (en) 2011-12-28
CA3006126C (en) 2022-04-19
PL1902136T3 (pl) 2012-08-31
ZA200800947B (en) 2010-06-30
AU2006265984C9 (en) 2013-04-11
TR200907590T2 (tr) 2010-06-21
ES2380867T3 (es) 2012-05-21
CN103484531B (zh) 2015-10-21
ATE541939T1 (de) 2012-02-15
WO2007005581A2 (en) 2007-01-11
WO2007005581A3 (en) 2007-08-02
CA2613087A1 (en) 2007-01-11
HRP20120294T1 (hr) 2012-05-31
ES2581478T3 (es) 2016-09-06
JP5265356B2 (ja) 2013-08-14
JP5789249B2 (ja) 2015-10-07
EA200800174A1 (ru) 2008-08-29
CN103484531A (zh) 2014-01-01
US20180016593A1 (en) 2018-01-18
CN101287836B (zh) 2013-02-20
WO2007005581A8 (en) 2007-12-13
US20160230184A1 (en) 2016-08-11
HUE035307T2 (en) 2018-05-02
JP2009504137A (ja) 2009-02-05
PT1902136E (pt) 2012-04-13
US20110209232A1 (en) 2011-08-25
SI1902136T1 (sl) 2012-05-31
EP2532750B1 (en) 2016-04-27
EA020462B1 (ru) 2014-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210340507A1 (en) Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
US7807882B2 (en) Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
US20180016593A1 (en) Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
KR20150023919A (ko) 제초제-저항성 브라시카 식물 및 사용 방법
EP1948801B1 (en) Herbicide-resistant sunflower plants with a novel mutation in the gene encoding the large subunit of acetohydroxyacid synthase, isolated polynucleotides, and methods of use
US20150181873A1 (en) Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide=resistant aceto hydroxy acid synthase large subunit proteins, and methods of use
US20190032029A1 (en) Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
US20150176022A1 (en) Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide=resistant aceto hydroxy acid synthase large subunit proteins, and methods of use
AU2012244165B2 (en) Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
AU2011250844A1 (en) Herbicide-resistant sunflower plants, plynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxy acid synthase large subunit proteins, and methods of use