BRPI0612944A2 - método de produção de substáncia alvo - Google Patents

Abstract

MéTODO DE PRODUçãO DE SUBSTáNCIA ALVO. Substâncias alvo foram produzidas utilizando biocatalisadores que são capazes de fermentar açúcares derivados de biomassa tratada. Os açúcares foram obtidos por meio do tratamento prévio de biomassa sob condições de altos sólidos e baixa amónia, seguida por sacarificação.

Description

"MÉTODO DE PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA ALVO"

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido ProvisórioNorte-Americano n° 60/670437, depositado em doze de abril de 2005.

Declaração de Direitos Governamentais

A presente invenção foi realizada com apoio do governo dosEstados Unidos com base no Contrato n° 04-03-CA-70224 concedido peloDepartamento de Energia. O governo detém certos direitos na presenteinvenção.

Campo da Invenção

São fornecidos métodos de produção de substâncias alvoutilizando açúcares fermentáveis derivados do tratamento de biomassa.Especificamente, açúcares obtidos por meio do tratamento prévio de biomassasob condições de alto teor de sólidos e baixa concentração de amônia, seguidapor sacarificação, são utilizados em fermentação por biocatalisadores queproduzem substâncias alvo.

Antecedentes da Invenção

Estoques de alimentação e resíduos celulósicos elignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos florestais,lodo de fabricação de papel e resíduos sólidos municipais e industriaisfornecem estoque de alimentação renovável potencialmente grande para aprodução de substâncias, plásticos, combustíveis e alimentos. Estoques dealimentação e resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos depolímeros de carboidrato que compreendem celulose, hemicelulose,glucanos e Iignina são geralmente tratados por uma série de meiosquímicos, mecânicos e enzimáticos para liberar principalmente açúcares dehexose e pentose, que podem ser fermentados em seguida em produtosúteis.

Métodos de tratamento prévio são utilizados para elaborar ospolímeros de carboidrato de materiais celulósicos e lignocelulósicos maisfacilmente disponíveis para enzimas de sacarificação. Os métodos detratamento prévio historicamente utilizaram principalmente ácidos fortes sobaltas temperaturas; devido aos altos custos de energia, altos custos deequipamento, altos custos de recuperação de catalisador de tratamento prévioe incompatibilidade com enzimas de sacarificação, entretanto, estão sendodesenvolvidos métodos alternativos, tais como tratamento prévio enzimático,ou o uso de ácido ou base sob temperaturas mais suaves, em que a reduçãoda hidrólise de polímeros de carboidrato de biomassa ocorre durante otratamento prévio, o que requer sistemas de enzimas aprimorados parasacarificar celulose e hemicelulose.

Uma série de métodos de tratamento prévio utilizando bases foiproposta. Gould (Biotech. and Bioenger. (1984) 26: 46-52) descreve método detratamento prévio para biomassa lignocelulósica utilizando peróxido dehidrogênio (H2O2). O tratamento é mais eficiente utilizando H2O2 em quantidadede pelo menos 0,25 peso/peso com relação ao substrato.

Teixeira, L. et al (Appl. Biochem. and Biotech. (1999) 77-79: 19-34) descreveram uma série de tratamentos prévios de biomassa utilizandoquantidades estequiométricas de hidróxido de sódio e hidróxido de amônio,com concentração de biomassa muito baixa. A razão entre a solução e abiomassa é de 14:1.

Elshafei, A. et al (Bioresource Tech. (1991) 35: 73-80)examinaram o tratamento prévio de forragem de milho utilizando NaOH.

Kim1 T. e Y. Lee (Bioresource Technology (2005) 96: 2007-2013)relatam o uso de altas quantidades de amônia aquosa para o tratamento préviode forragem de milho.

O Pedido de Patente n0 WO 2004/081185 discute métodos dehidrólise de lignocelulose, que compreendem o contato da Iignocelulose comsubstância; a substância pode ser base, tal como carbonato de sódio ouhidróxido de potássio, sob pH de cerca de 9 a cerca de 14, sob condiçõesmoderadas de temperatura, pressão e pH.

As Patentes Norte-Americanas n° 5.916.780 e 6.090.595descrevem processo de tratamento prévio em que razão especificada entrearabinoxilan e o total de polissacarídeos não de amido (AX/NSP) édeterminada e utilizada para selecionar o estoque de alimentação.

Para que seja processo economicamente competitivo, processocomercial de produção de substâncias a partir de biomassa de recursosrenováveis requer a hidrólise de carboidratos em biomassa lignocelulósica parafornecer altos rendimentos de açúcares em altas concentrações, utilizandobaixas quantidades de substâncias, para produzir fonte de açúcaresfermentáveis com baixa toxicidade que são utilizados por biocatalisadores queproduzem substâncias alvo com valor agregado.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção fornece métodos de produção desubstâncias alvo que utilizam biomassa. O processo de acordo com a presenteinvenção envolve o tratamento prévio de biomassa, sob concentraçãorelativamente alta, com baixa concentração de amônia com relação ao pesoseco de biomassa. Após o tratamento prévio, a biomassa é tratada comassociação de enzimas de sacarificação para produzir açúcares fermentáveis.

Os açúcares são colocados em contato em seguida com biocatalisador quepode fermentar os açúcares e produzir substância alvo. Em uma realização dapresente invenção, o método compreende:

a. contato de biomassa com solução aquosa que compreendeamônia, em que a amônia está presente em concentração pelo menossuficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa e amônia aquosa,mas em que a mencionada amônia está presente em menos de cerca de 12%em peso com relação ao peso seco da biomassa e, adicionalmente, em que opeso seco de biomassa encontra-se em alta concentração de sólidos de pelomenos cerca de 15% em peso com relação ao peso da mistura de biomassa eamônia aquosa;

b. contato do produto da etapa (a) com uma associação deenzima de sacarificação sob condições apropriadas para produzir açúcaresfermentáveis; e

c. contato do produto da etapa (b) com pelo menos umbiocatalisador apropriado para fermentar os açúcares para produzir asubstância alvo sob condições de fermentação apropriadas.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 exibe o crescimento de Zymomonas mobilis 8b(descrita no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2003/0162271A1, Exemplos IV, Vl e XII) na presença ou ausência de acetamida e ácidoacético.

Descrição Detalhada da Invenção

Os Depositantes incorporam especificamente o conteúdo integralde todas as referências mencionadas no presente relatório descritivo. Alémdisso, quando quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro forfornecido na forma de faixa, faixa preferida ou lista de valores preferíveissuperiores e valores preferíveis inferiores, deve-se compreender isso comodescrevendo especificamente todas as faixas formadas a partir de qualquer parde limite de faixa superior ou valor preferido e qualquer limite de faixa inferiorou valor preferido, independentemente de se as faixas são descritasseparadamente. Quando uma série de valores numéricos for indicada nopresente, a menos que informado em contrário, a faixa destina-se a incluir osseus pontos finais e todos os números inteiros e frações dentro da faixa. Nãose pretende que o escopo da presente invenção seja limitado aos valoresespecíficos indicados ao definir faixa.

A presente invenção fornece métodos de produção desubstâncias alvo que fazem uso de biomassa da forma a seguir: açúcares sãoderivados de biomassa, que são utilizados em seguida como fonte de carbonopara o crescimento de microorganismos que podem elaborar substâncias alvocomo produtos do seu metabolismo. Os açúcares são liberados da biomassapor meio de tratamento prévio da biomassa sob concentração relativamentealta, com concentração relativamente baixa de amônia com relação ao pesoseco da biomassa. A biomassa tratada com amônia é digerida em seguida comassociação de enzimas de sacarificação para produzir açúcares fermentáveis.Os açúcares são utilizados como substrato de fermentação para o crescimentode microorganismo ou biocatalisador que seja capaz de produzir substânciaalvo.

Definições:

No presente relatório descritivo, é utilizada uma série de termos.

São fornecidas as definições a seguir:

A expressão "açúcar fermentável" designa oligossacarídeos emonossacarídeos que podem ser utilizados como fonte de carbono pormicroorganismo em processo de fermentação.

O termo "lignocelulósico" designa composição que compreendelignina e celulose. Material lignocelulósico pode também compreenderhemicelulose.

O termo "celulósico" designa composição que compreendecelulose.

Por "peso seco" de biomassa, indica-se o peso da biomassa quepossui toda ou essencialmente toda a água removida. Peso seco é tipicamentemedido de acordo com o Padrão E1756-01 da Sociedade Norte-Americana deTestes e Materiais (ASTM) (Standard Test Method for Determination of TotalSolids in Biomass) ou o Padrão T-412 om-02 da Technical Association of thePulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) (Moisture in Pulp, Paper andPaperboard).

A expressão "substância alvo" indica substância produzida pormeio de fermentação. Substância é utilizada em sentido amplo e incluimoléculas tais como proteínas, incluindo, por exemplo, peptídeos, enzimas eanticorpos.

Substância alvo que é "derivável de biomassa" é substância alvoproduzida por processo por meio do qual biomassa é hidrolisada para liberaraçúcares fermentáveis e os açúcares fermentáveis são fermentados utilizandopelo menos um biocatalisador para produzir substância alvo desejada.

As expressões "plastificante" e "agente de amolecimento"designam materiais que causam redução das forças intermoleculares coesivasao longo das cadeias de polímeros ou entre elas. Esses materiais podem agir,por exemplo, para reduzir a cristalinidade ou romper uniões entre fibras decarboidrato de Iignina e não de Iignina (tais como celulose ou hemicelulose).

O termo "sacarificação" designa a produção de açúcaresfermentáveis a partir de polissacarídeos.

"Condições apropriadas de produção de açúcares fermentáveis"designa condições tais como pH, composição de meio e temperatura sob asquais as enzimas de sacarificação são ativas.

"Condições de fermentação apropriadas" designa condições quesustentam o crescimento e a produção de substâncias alvo por biocatalisador.Estas condições podem incluir pH, nutrientes e outros componentes de meios,temperatura, atmosfera e outros fatores.

A expressão "biomassa previamente tratada" indica biomassa quetenha sido submetida a tratamento prévio antes da sacarificação.

"Biomassa" indica qualquer material celulósico ou lignocelulósicoe inclui materiais que compreendem celulose, compreendendo aindaopcionalmente hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/oumonossacarídeos. Biomassa pode também compreender componentesadicionais, tais como proteína e/ou lipídio. Segundo o método do presente,biomassa pode ser derivada de uma única fonte, ou biomassa podecompreender mistura derivada de mais de uma fonte; biomassa poderácompreender, por exemplo, mistura de espigas de milho e forragem de milhoou mistura de grama e folhas. Biomassa inclui, mas sem limitar-se a safrasbioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduo sólidoindustrial, lodo de fabricação de papel, resíduos de jardins, resíduos demadeira e de florestas. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitar-se agrãos de milho, espigas de milho, resíduos de safras tais como cascas demilho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha decevada, feno, palha de arroz, brotos de grama, resíduos de papel, bagaço decana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos por meio do processamentode cereais, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem,arbustos e moitas, legumes, frutas, flores e esterco animal. Em uma realização,biomassa que é útil para o método do presente inclui biomassa que possuivalor de carboidrato relativamente alto, é relativamente densa e/ou de coleta,transporte, armazenagem e/ou manipulação relativamente fácil. Em umarealização da presente invenção, biomassa que é útil inclui espigas de milho,forragem de milho e bagaço de cana de açúcar.

Para os propósitos da presente invenção, "solução aquosa quecompreende amônia" designa o uso de gás amônia (NH3), compostos quecompreendem íons de amônio (NH4+) tais como hidróxido de amônio ou sulfatode amônio, compostos que liberam amônia mediante degradação tais comouréia e suas combinações em meio aquoso.

A concentração de amônia utilizada no método do presente éconcentração mínima suficiente para manter o pH da mistura de biomassa eamônia aquosa alcalina e no máximo menos de cerca de 12% em peso comrelação ao peso seco da biomassa. Esta baixa concentração de amônia ésuficiente para tratamento prévio e a baixa concentração pode também ser demenos de cerca de 10% em peso com relação ao peso seco de biomassa.

Concentração muito baixa de 6% de amônia com relação ao peso seco debiomassa, ou menos, pode também ser utilizada para tratamento prévio. Poralcalino, indica-se pH de mais de 7,0. Particularmente apropriado é pH damistura de biomassa e amônia aquosa que é maior que 8. Em uma realização,amônia está presente em menos de cerca de 10% em peso com relação aopeso seco de biomassa. É particularmente apropriada amônia a menos decerca de 6% em peso com relação ao peso seco de biomassa.

Amônia, da forma utilizada no processo do presente, fornecevantagens sobre outras bases. Amônia particiona-se em fase líquida e fase devapor. Amônia gasosa pode difundir-se mais facilmente através da biomassaque base líquida, resultando em tratamento prévio mais eficaz emconcentrações mais baixas. Amônia também é conhecida no presente noExemplo 11 por competir com a hidrólise, por meio de amonólise, de acetilésteres em biomassa para formar acetamida. Acetamida é menos tóxica queacetato a certos organismos de fermentação, tais como Zymomonas mobilis(conforme demonstrado no presente no Exemplo 12). Desta forma, aconversão de acetil ésteres em acetamida em vez de ácido acético reduz anecessidade de remoção de ácido acético. O uso de amônia também reduz anecessidade de suplemento de meio de crescimento utilizado durante afermentação com fonte de nitrogênio. Além disso, amônia é material de baixocusto e, desta forma, fornece processo econômico. Amônia pode também serreciclada para o reator de tratamento prévio durante o tratamento prévio ouapós o tratamento prévio, de forma a permitir processo mais econômico. Apóso tratamento prévio, por exemplo, à medida que a temperatura é reduzida àapropriada para sacarificação, gás amônia pode ser liberada, opcionalmente napresença de vácuo, e pode ser reciclada. Em processo contínuo, amônia podeser reciclada continuamente.

Segundo o método do presente, a solução aquosa quecompreende amônia pode compreender opcionalmente pelo menos uma baseadicional, tal como hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido depotássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio. Apelo menos uma base adicional pode ser adicionada em quantidade que écombinada com amônio para formar quantidade de base total que é de menosde cerca de 20% em peso com relação ao peso de biomassa.

Preferencialmente, o total de segunda base mais amônia encontra-se emquantidade que é de menos de cerca de 15% em peso. Pode(m) serutilizada(s) base(s) adicional(is), por exemplo, para neutralizar ácidos embiomassa, fornecer íons metálicos para as enzimas de sacarificação oufornecer íons metálicos para o meio de crescimento de fermentação.

No método do presente, o peso seco de biomassa encontra-seem concentração inicial de pelo menos cerca de 15% a cerca de 80% do pesoda mistura de biomassa e amônia aquosa. Mais adequadamente, o peso secode biomassa encontra-se em concentração de cerca de 15% a cerca de 60%do peso da mistura de biomassa e amônia aquosa. O percentual de biomassana mistura de biomassa e amônia aquosa é mantido alto para minimizar anecessidade de concentração de açúcares resultantes da sacarificação dabiomassa previamente tratada, para uso em fermentação. A alta concentraçãode biomassa também reduz o volume total de material de tratamento prévio,tornando o processo mais econômico.

A biomassa pode ser utilizada diretamente conforme obtido dafonte, ou pode-se aplicar energia à biomassa para reduzir o tamanho, aumentara extensão exposta e/ou aumentar a disponibilidade de celulose, hemicelulosee/ou oligossacarídeos presentes na biomassa para amônia e para enzimas desacarificação utilizadas na segunda etapa do método. Meios de energia úteispara reduzir o tamanho, aumentar a extensão exposta e/ou aumentar adisponibilidade de celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes nabiomassa para amônia e para enzimas de sacarificação incluem, mas semlimitar-se a moagem, fragmentação, quebra, retalhamento, corte, refino emdisco, ultrassom e microondas. Esta aplicação de energia pode ocorrer antesou durante o tratamento prévio, antes ou durante a sacarificação, ou qualquerde suas combinações.

O tratamento prévio de biomassa com solução de amônio éconduzido em qualquer recipiente apropriado. Tipicamente, o recipiente podesuportar pressão, possui mecanismo de aquecimento e possui mecanismo demistura do conteúdo. Os recipientes disponíveis comercialmente incluem, porexemplo, o reator Zipperclave® (Autoclave Engineers, Erie1 PA), o reator Jaygo(Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ) e reator de pistola de vapor (descritoem Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA). Reatores em escala muitomaior com capacidades similares podem ser utilizados. Alternativamente, asolução de amônia e biomassa pode ser combinada em um recipiente etransferida em seguida para outro reator. Além disso, biomassa pode serpreviamente tratada em um recipiente e processada adicionalmente emseguida em outro reator, tal como reator de pistola de vapor (descrito emMétodos Gerais, Autoclave Engineers, Erie, PA).

Antes do contato da biomassa com solução aquosa quecompreende amônia, pode-se aplicar vácuo ao recipiente que contém abiomassa. Ao evacuar ar dos poros da biomassa, pode-se atingir melhorpenetração da amônia na biomassa. O período de tempo para aplicação devácuo e a quantidade de pressão negativa que é aplicada à biomassadependerá do tipo de biomassa e pode ser determinado empiricamente, deforma a atingir o tratamento prévio ideal da biomassa (conforme medido pelaprodução de açúcares fermentáveis após a sacarificação).

O contato da biomassa com solução aquosa que compreendeamônia é conduzido sob uma temperatura de cerca de 4 0C a cerca de 200 0C.Concluiu-se que contato inicial da biomassa com amônia a 4 0C1 permitindo aimpregnação a esta temperatura, aumenta a eficiência de sacarificação sobrebiomassa nativa não tratada previamente. Em outra realização, o mencionadocontato da biomassa é conduzido sob uma temperatura de cerca de 75 0C acerca de 150 0C. Em ainda outra realização, o mencionado contato dabiomassa é conduzido sob uma temperatura de mais de 90 0C a cerca de 1500C.

O contato da biomassa com solução aquosa que compreendeamônia é conduzido por período de tempo de até cerca de vinte e cinco horas.

Períodos mais longos de tratamento prévio são possíveis, mas período detempo curto pode ser preferível por razões econômicas práticas. Tipicamente,período de tratamento por contato de amônia é de cerca de oito horas oumenos. Períodos mais longos podem fornecer o benefício de redução danecessidade de aplicação de energia para romper a biomassa, portanto,período de tempo de até cerca de 25 horas pode ser preferível.

Em uma realização, o processo de tratamento prévio pode serrealizado sob temperatura relativamente alta por período de temporelativamente curto, tal como temperatura relativamente alta por período detempo relativamente curto, tal como cerca de 100 0C a cerca de 150 0C porcerca de cinco minutos a cerca de duas horas. Em outra realização, o processode tratamento prévio pode ser realizado sob temperatura mais baixa porperíodo de tempo relativamente longo, tal como cerca de 75 0C a cerca de 1000C por cerca de duas horas a cerca de oito horas. Em ainda outra realização, oprocesso de tratamento prévio pode ser realizado à temperatura ambiente(cerca de 22 a 26 0C) por período de tempo ainda mais longo de cerca de 24horas. Outras combinações de tempo e temperatura intermediárias a estaspodem também ser utilizadas.

Para o processo de tratamento prévio, a temperatura, tempo detratamento prévio, concentração de amônia, concentração de uma ou maisbases adicionais, concentração de biomassa, tipo de biomassa e tamanho departículas de biomassa são relatados; estas variáveis podem ser ajustadasconforme o necessário, portanto, para obter produto ideal a ser colocado emcontato com associação de enzimas de sacarificação.

Plastificante, agente de amolecimento ou sua combinação, taiscomo polióis (por exemplo, glicerol, etileno glicol), ésteres de polióis (porexemplo, monoacetato de glicerol), glicol éteres (por exemplo, dietileno glicol),acetamida, etanol e etanolaminas, podem ser adicionados no processo detratamento prévio (ou seja, etapa (a)). Plastificante pode ser adicionado comocomponente da solução de amônia aquosa, como solução separada ou comocomponente seco.

A reação de tratamento prévio pode ser realizada em qualquerveículo apropriado, tal como reator em bateladas ou reator contínuo. Ostécnicos no assunto reconhecerão que, sob temperaturas mais altas (acima de100 0C), é necessário recipiente sob pressão. O recipiente apropriado pode serequipado com meios, tais como impulsores, para agitar a mistura de biomassae amônia aquosa. Projetos de reator são discutidos em Lin, K.-H. e Van Ness,H. C. (em Perry, R. H. e Chilton1 C. H. (eds.), Chemical EngineeijS Handbook,quinta edição (1973), Capítulo 4, McGraw-HiII, NY). A reação de tratamentoprévio pode ser conduzida na forma de processo em bateladas ou processocontínuo.

Os técnicos no assunto sabem bem que é necessário fonte denitrogênio para o crescimento de microorganismos durante a fermentação;desta forma, o uso de amônia durante o tratamento prévio fornece fonte denitrogênio e reduz ou elimina a necessidade de suplemento do meio decrescimento utilizado durante a fermentação com fonte de nitrogênio. Caso opH do produto de tratamento prévio exceda aquele em que as enzimas desacarificação são ativas, ou exceda a faixa apropriada para crescimentomicrobiano em fermentação, podem ser utilizados ácidos para reduzir o pH. Aquantidade de ácido utilizada para atingir o pH desejado pode resultar naformação de sais em concentrações que são inibidoras das enzimas desacarificação ou do crescimento microbiano. A fim de reduzir a quantidade deácido necessária para atingir o pH desejado e reduzir o custo de matéria primade NH3 no processo de tratamento prévio do presente, gás amônia pode serevacuado do reator de tratamento prévio e reciclado. Tipicamente, pelo menosuma parte da amônia é removida, o que reduz o pH mas deixa algum nitrogênioque fornece esse nutriente para uso em fermentação subseqüente.

A fim de obter quantidades suficientes de açúcares de biomassa,a biomassa pode ser previamente tratada com solução de amônia aquosa umavez ou mais de uma vez. De forma similar, reação de sacarificação pode serrealizada uma ou mais vezes. Os dois processos de tratamento prévio e desacarificação podem ser repetidos se desejado para obter rendimentos deaçúcares mais altos. Para determinar o desempenho dos processos detratamento prévio e sacarificação, separadamente ou juntos, o rendimentoteórico de açúcares que podem ser derivados da biomassa inicial pode serdeterminado e comparado com rendimentos medidos.

Sacarificação:

Após o tratamento prévio, o produto compreende mistura deamônia, biomassa parcialmente degradada e açúcares fermentáveis. Antes doprocessamento adicional, amônia pode ser removida da biomassa previamentetratada por meio de aplicação de vácuo. A remoção de amônia reduz o pH e,desta forma, menos ácido neutralizante é utilizado para obter o pH desejadopara sacarificação e fermentação. Isso resulta em carga de sal mais baixa namistura de tratamento prévio. Tipicamente, alguma amônia permanece, o que édesejado para fornecer fonte de nitrogênio para fermentação.

A mistura de tratamento prévio é hidrolisada em seguida napresença de uma associação de enzimas de sacarificação para liberaroligossacarídeos e/ou monossacarídeos em hidrolisado. Enzimas desacarificação e métodos de tratamento de biomassa são analisados em Lynd,L. R. et al (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66: 506-577). Em realizaçãopreferida, toda a mistura de tratamento prévio que compreende fraçõessolúveis e insolúveis é utilizada na reação de sacarificação.

Em outra realização, antes da sacarificação, a fração aquosa quecompreende amônia e açúcares solubilizados pode ser separada departiculados insolúveis restantes na mistura. Métodos de separação dasfrações solúveis das insolúveis incluem, mas sem limitar-se a decantação efiltragem. Os particulados insolúveis podem ser reciclados para o reator detratamento prévio. Os particulados insolúveis podem ser opcionalmentelavados com solvente aquoso (tal como água) para remover açúcaresadsorvidos antes da reciclagem para o reator de tratamento prévio. A fraçãoinsolúvel pode ser submetida em seguida a tratamento adicional com soluçãode amônia aquosa conforme descrito acima para tratamento prévio, seguidapor sacarificação com associação de enzimas de sacarificação. A fraçãosolúvel pode também ser concentrada antes da sacarificação utilizandoprocesso apropriado, tal como evaporação.

Antes da sacarificação, o produto de tratamento prévio pode sertratado para alterar o pH, a composição ou a temperatura, de tal forma que asenzimas da associação de enzimas de sacarificação sejam ativas, de forma afornecer condições apropriadas para produzir açúcares fermentáveis. O pHpode ser alterado por meio da adição de ácidos em forma sólida ou líquida.Alternativamente, dióxido de carbono (CO2)1 que pode ser recuperado dafermentação, pode ser utilizado para reduzir o pH. CO2 pode ser recolhido, porexemplo, de fermentador e alimentado, tal como por meio de borbulhamento,para o produto de tratamento prévio ao mesmo tempo em que o pH émonitorado, até atingir-se o pH desejado. A temperatura pode ser trazida parauma temperatura que seja compatível com a atividade de enzimas desacarificação, conforme indicado abaixo. Quaisquer cofatores necessários paraa atividade de enzimas utilizadas em sacarificação podem ser adicionados.

A associação de enzimas de sacarificação compreende uma oumais enzimas selecionadas principal mas não exclusivamente a partir do grupode "glicosidases" que hidrolisam as ligações éter de di, oligo e polissacarídeose são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x (EnzymeNomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com o Suplemento 1(1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) eSuplemento 5 (em Eur. J. Biochem. (1994) 223: 1-5, Eur. J. Biochem. (1995)232: 1-6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1-5, Eur. J. Biochem. (1997) 250: 1-6 eEur. J. Biochem. (1999) 264: 610-650, respectivamente)) do grupo geral"hidrolases" (EC 3). As glicosidases úteis no método do presente podem sercategorizadas pelo componente de biomassa que hidrolisam. As glicosidasesúteis para o método do presente incluem glicosases hidrolisantes de celulose(tais como celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, p-glicosidases), glucosidases hidrolisantes de hemicelulose (tais como xilanases,endoxilanases, exoxilanases, p-xilodases, arabinoxilanases, manases,galactases, pectinases, glucuronidases) e glicosidases hidrolisantes de amido(tais como amilases, a-amilases, p-amilases, glucoamilases, a-glucosidases,isoamilases). Além disso, pode ser útil adicionar outros aditivos à associaçãode enzimas de sacarificação tais como peptidases (EC 3.4.x.y), lípases (EC3.1.1.x e 3.1.4.x), Iigninases (EC 1.11.1.x) e esterases de feruloíla (EC3.1.1.73) para ajudar a liberar polissacarídeos de outros componentes dabiomassa. Sabe-se bem na técnica que microorganismos que produzemenzimas hidrolisantes de polissacarídeos exibem freqüentemente atividade, talcomo degradação de celulose, que é catalisada por várias enzimas ou umgrupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato. Destaforma, "celulase" de microorganismo pode compreender grupo de enzimas,todas as quais podem contribuir com a atividade degradante de celulose.

Preparações de enzimas comerciais ou não comerciais, tais como celulase,podem compreender numerosas enzimas, dependendo do esquema depurificação utilizado para obter a enzima. Desta forma, a associação deenzimas de sacarificação de acordo com o método do presente podecompreender atividade enzimática, tal como "celulase", mas reconhece-se queesta atividade pode ser catalisada por mais de uma enzima.

Enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, taiscomo celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) exilanase Multifect® (Genencor). Além disso, enzimas de sacarificação podemser produzidas biologicamente, incluindo utilizando microorganismosrecombinantes.

Os técnicos no assunto saberiam como determinar a quantidadeeficaz de enzimas para uso na associação e ajustar condições para atividadeenzimática ideal. Os técnicos no assunto também saberiam como otimizar asclasses de atividades enzimáticas necessárias na associação para obtersacarificação ideal de um dado produto de tratamento prévio sob as condiçõesselecionadas.

Preferencialmente, a reação de sacarificação é realizada àtemperatura ou pH ideais para as enzimas de sacarificação ou perto deles. Atemperatura ideal utilizada com a associação de enzimas de sacarificação nométodo do presente varia de cerca de 15 0C a cerca de 100 0C. Em outrarealização, a temperatura ideal varia de cerca de 20 0C a cerca de 80 0C. O pHideal pode variar de cerca de 2 a cerca de 11. Em outra realização, o pH idealutilizado com a associação de enzimas de sacarificação no método do presentevaria de cerca de 4 a cerca de 10.

A sacarificação pode ser realizada por tempo de cerca de váriosminutos a cerca de 120 horas e, preferencialmente, de cerca de vários minutosa cerca de 48 horas. O tempo da reação dependerá da concentração deenzimas e da atividade específica, bem como do substrato utilizado e dascondições ambientais, tais como temperatura e pH. Os técnicos no assuntopodem determinar facilmente condições ideais de temperatura, pH e tempo aserem utilizadas com substrato específico e associação de enzima(s) desacarificação.

A sacarificação pode ser realizada em bateladas ou comoprocesso contínuo. A sacarificação pode também ser realizada em uma etapaou em uma série de etapas. Enzimas diferentes necessárias parasacarificação, por exemplo, podem exibir diferentes pHs ou temperaturasideais. Tratamento primário pode ser realizado com enzima(s) em umatemperatura e pH, seguido por tratamentos secundário ou terciário (ou mais)com diferente(s) enzima(s) em diferentes temperaturas e/ou pH. Além disso,tratamento com enzimas diferentes em etapas seqüenciais pode ocorrer aomesmo pH e/ou temperatura, ou diferentes pHs e temperaturas, tais comoutilizando semicelulases estáveis e mais ativas sob pHs e temperaturas maisaltas, seguido por celulases que são ativas em pHs e temperaturas maisbaixas.

O grau de solubilização de açúcares a partir de biomassa após asacarificação pode ser monitorado medindo-se a liberação demonossacarídeos e oligossacarídeos. Métodos de medição demonossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos na técnica. Aconcentração de açúcares redutores, por exemplo, pode ser determinadautilizando o teste de ácido 1,3-dinitrossalicílico (DNS) (Miller, G. L., Anal. Chem.(1959) 31: 426-428). Alternativamente, açúcares podem ser medidos por meiode HPLC utilizando coluna apropriada conforme descrito no presente nocapítulo Métodos Gerais.

Açúcares fermentáveis liberados de biomassa podem serutilizados por microorganismos apropriados para produzir substâncias alvo.Após a sacarificação, mas antes da fermentação, a mistura de sacarificaçãopode ser concentrada por meio de evaporação, tal como para aumentar aconcentração de açúcares fermentáveis. Opcionalmente, líquido no produto desacarificação pode ser separado de sólidos em método contínuo ou debateladas. Opcionalmente, o líquido ou todo o produto de sacarificação podeser esterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s) microorganismo(s)utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizado durante a sacarificação, opH pode ser ajustado ao apropriado para fermentação. Além disso, a misturade sacarificação pode ser suplementada com nutrientes adicionais necessáriospara crescimento microbiano. Os suplementos podem incluir, por exemplo,extrato de levedura, aminoácidos específicos, fosfato, fontes de nitrogênio, saise traços de elementos. Podem também ser incluídos componentes necessáriospara a fabricação de produto específico elaborado por biocatalisadorespecífico, tal como antibiótico para manter plasmídeo ou cofator necessárioem reação catalisada por enzimas. Além disso, açúcares adicionais podem serincluídos para aumentar a concentração total de açúcar. A mistura desacarificação pode ser utilizada como componente de caldo de fermentação,por exemplo, compondo cerca de 100% a cerca de 10% do meio final.Condições de fermentação apropriadas são atingidas por meio de ajustedesses tipos de fatores para o crescimento e produção de substâncias alvo porbiocatalisador.

Temperatura e/ou gás no espaço superior podem também serajustados, dependendo de condições úteis para o(s) microorganismo(s) defermentação. A fermentação pode ser aeróbica ou anaeróbica. A fermentaçãopode ocorrer após a sacarificação, ou pode ocorrer simultaneamente com asacarificação por meio de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). SSFpode manter baixos os níveis de açúcar produzidos por meio de sacarificação,de forma a reduzir a potencial inibição de produto das enzimas desacarificação, reduzir a disponibilidade de açúcar para microorganismoscontaminantes e aumento da conversão de biomassa previamente tratada emmonossacarídeos e/ou oligossacarídeos.

Substâncias alvo que podem ser produzidas por meio defermentação incluem, por exemplo, ácidos, álcoois, alcanos, alquenos,aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, peptídeos,aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos. Álcoois incluem,mas sem limitar-se a metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol e sorbitol. Os ácidosincluem ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3-hidroxipropiônico,ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico eácido levulínico. Os aminoácidos incluem ácido glutâmico, ácido aspártico,metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Substânciasalvo adicionais incluem metano, etileno, acetona e enzimas industriais.

A fermentação de açúcares em substâncias alvo pode serconduzida por um ou mais biocatalisadores apropriados em fermentações deetapa única ou múltiplas. Biocatalisadores podem ser microorganismosselecionados a partir de bactérias, fungos filamentosos e leveduras.Biocatalisadores podem ser microorganismos do tipo selvagem oumicroorganismos recombinantes e incluem Escherichia, Zymomonas,Saccharomyces, Candida, Piehia, Streptomyees, Baeillus, Lactobacillus eClostridium. Em outra realização, biocatalisadores podem ser selecionados apartir do grupo que consiste de Escherichia coli recombinante, Zymomonasmobilis, Baeillus stearothermophilus, Saccharomyces eerevisiae, Clostridiathermoeellum, Thermoanaerobaeterium saeeharolytieum e Piehia stipitis.

Muitos biocatalisadores utilizados em fermentação para produzirsubstâncias alvo foram descritos e outros podem ser descobertos, produzidospor meio de mutação ou elaborados por meios recombinantes. Qualquerbiocatalisador que utiliza açúcares fermentáveis produzidos no método dopresente pode ser utilizado para elaborar a(s) substância(s) alvo cuja produçãoseja conhecida, por meio de fermentação no método do presente.

A fermentação de carboidratos em acetona, butanol e etanol(fermentação ABE) por Clostridia solventogênico é bem conhecida (Jones eWoods (1986), Mierobioi Rev. 50: 484-524). Processo de fermentação para aprodução de altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol,utilizando linhagem mutante de Clostridium aeetobutylieum, é descrito em US5.192.673. O uso de linhagem mutante de Clostridium beijerinekii para produziraltos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, é descrito em US6.358.717. Linhagens geneticamente modificadas de E. coli também vêmsendo utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol (Underwoodet al (2002), Appi Environ. Microbioi 68: 6263-6272). Linhagem geneticamentemodificada de Zymomonas mobilis que possui produção aprimorada de etanolé descrita em US 2003/0162271 A1.

Ácido láctico foi produzido em fermentações por linhagensrecombinantes de E. coli (Zhou et al (2003), Appl. Environ. Microbiol. 69: 399-407), linhagens naturais de Baeillus (US 20050250192) e Rhizopus oryzae (Taye Yang (2002), Biotechnoi Bioeng. 80: 1-12). Linhagens recombinantes de E.coli vêm sendo utilizadas como biocatalisadores em fermentação para produzir1,3-propanodiol (US 6.013.494, US 6.514.733) e ácido adípico (Niu et al (2002),Biotechnoi Prog. 18: 201-211). Ácido acético foi fabricado por meio defermentação utilizando Clostridia recombinante (Cheryan et al (1997), Adv.Appl. Microbiol. 43: 1-33) e linhagens de levedura recém identificadas (Freer(2002), World J. Microbiol. Biotechnol. 18: 271-275). A produção de ácidosuccínico por E. coli recombinante e outras bactérias é descrita em US6.159.738 e por E. coli recombinante mutante em Lin et al (2005), Metab. Eng.7: 116-127). Ácido pirúvico foi produzido por levedura Torulopsis glabratamutante (Li et al (2001), Appl. Microbiol. Technoi 55: 680-685) e por E. colimutante (Yokota et al (1994), Biosci. Biotech. Biochem. 58: 2164-2167).Linhagens recombinantes de E. coli vêm sendo utilizadas comobiocatalisadores para a produção de ácido para-hidroxicinâmico (US20030170834) e ácido quínico (US 20060003429).

Mutante de Propionibacterium acidipropionici vem sendo utilizadoem fermentação para produzir ácido propiônico (Suwannakham e Yang (2005),Biotechnol. Bioeng. 91: 325-337) e ácido butírico foi elaborado por Clostridiumtyrobutyricum (Wu e Yang (2003), Biotechnol. Bioeng. 82: 93-102). Propionatoe propanol foram elaborados por meio de fermentação a partir de treonina porClostridium sp. linhagem 17cr1 (Janssen (2004), Arch. Microbiol. 182: 482-486). Aureobasidium pullulans similar a levedura foi utilizado para elaborarácido glucônico (Anantassiadis et al (2005), Biotechnol. Bioeng. 91: 494-501)por mutante de Aspergillus niger (Singh et al (2001), Indian J. Exp. Bioi 39:1136-43). Ácido 5-ceto-D-glucônico foi elaborado por mutante deGluconobacter oxydans (Elfari et al (2005), Appl. Microbiol. Biotech. 66: 668-674), ácido itacônico foi produzido por mutantes de Aspergillus terreus (Reddye Singh (2002), Bioresour. Technol. 85: 69-71), ácido cítrico foi produzido porlinhagem mutante de Aspergillus niger (Ikram-UI-Haq et al (2005), Bioresour.Technol. 96: 645-648) e xilitol foi produzido por Candida guilliermondii FTI20037 (Mussatto e Roberto (2003), J. Appl. Microbiol. 95: 331-337).Biopoliésteres que contêm 4-hidroxivalerato, também contendo quantidadessignificativas de ácido 3-hidroxibutírico e ácido 3-hidroxivalérico, foramproduzidos por Pseudomonas putida e Ralstonia eutropha recombinantes(Gorenflo et al (2001), Biomacromolecules 2: 45-57). L-2,3-butanodiol foielaborado por E. coli recombinante (Ui et al (2004), Lett. Appi Microbiol. 39:533-537).

A produção de aminoácidos por meio de fermentação foi realizadautilizando linhagens auxotróficas e linhagens resistentes a análogos deaminoácidos de Corynebacterium, Brevibacterium e Serratia. A produção dehistidina utilizando linhagem resistente a análogo de histidina, por exemplo, édescrita na Patente Japonesa Publicada n° 8596/81 e utilizando linhagemrecombinante é descrita em EP 136.359. A produção de triptofan utilizandolinhagem resistente a análogo de triptofan é descrita nas Patentes JaponesasPublicadas n° 4505/72 e 1937/76. A produção de isoleucina utilizando linhagemresistente a análogo de isoleucina é descrita nas Patentes JaponesasPublicadas n° 38995/72, 6237/76 e 32070/79. A produção de fenilalaninautilizando linhagem resistente a análogo de fenilalanina é descrita na PatenteJaponesa Publicada n° 10035/81. A produção de tirosina utilizando linhagemque requer fenilalanina para crescimento, resistente a tirosina (Agr: Chem. Soe.Japan 50 (1) R79-R87 (1976) ou linhagem recombinante (EP 263515, EP332234) e a produção de arginina utilizando linhagem resistente a análogo deL-arginina (Agr: Biol. Chem. (1972) 36: 1675-1684, Patentes JaponesasPublicadas n° 37235/79 e 150381/82) foram descritas. Fenilalanina também foiproduzida por meio de fermentação em Escheriehia coli linhagens ATCC31882, 31883 e 31884. A produção de ácido glutâmico em bactéria corineformerecombinante é descrita em US 6.962.805. A produção de treonina porlinhagem mutante de E. coli é descrita em Okamoto e Ikeda (2000), J. Biosci.Bioeng. 89: 87-79. Metionina foi produzida por linhagem mutante deCorynebacterium Iilium (Kumar et al (2005), Bioresour. Technoi 96: 287-294).

Peptídeos, enzimas e outras proteínas úteis também foramelaborados por biocatalisadores (por exemplo em US 6.861.237, US 6.777.207,US 6.228.630).

O tratamento prévio e sacarificação de biomassa em açúcaresfermentáveis, seguido por fermentação dos açúcares em substância alvo, éexemplificado no Exemplo 9 do presente para a produção de etanol a partir deespigas de milho previamente tratadas utilizando Z. mobilis como biocatalisadorpara a fermentação de açúcares em etanol. O método do presente podetambém ser utilizado para a produção de 1,3-propanodiol a partir de biomassa.A biomassa sofre tratamento prévio e sacarificação de acordo com o métododo presente; após (ou durante) a sacarificação, E. coli é utilizado para produzir1,3-propanodiol conforme descrito no Exemplo 10 do presente.

Substâncias alvo produzidas em fermentação por biocatalisadorespodem ser recuperadas utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Osprodutos podem ser separados de outros componentes de fermentação pormeio de centrifugação, filtragem, microfiltragem e nanofiltragem. Os produtospodem ser extraídos por meio de troca de íons, extração com solvente oueletrodiálise. Agentes floculantes podem ser utilizados para auxiliar naseparação de produtos. Como exemplo específico, 1-butanol bioproduzidopode ser isolado do meio de fermentação utilizando métodos conhecidos natécnica para fermentações de ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol.Biotechnoi 49: 639-648 (1998), Groot et al, Process. Biochem. 27: 61-75(1992) e suas referências). Sólidos, por exemplo, podem ser removidos domeio de fermentação por meio de centrifugação, filtragem, decantação ousimilares. Em seguida, o 1-butanol pode ser isolado do meio de fermentaçãoutilizando métodos tais como destilação, destilação azeotrópica, extração delíquidos em líquidos, adsorção, extração de gás, evaporação de membrana oupervaporação. A purificação de 1,3-propanodiol a partir de meios defermentação pode ser realizada, por exemplo, submetendo-se a mistura dereação a extração com solvente orgânico, destilação e cromatografia de coluna(US 5.356.812). Solvente orgânico particularmente bom para este processo éciclohexano (US 5.008.473). Aminoácidos podem ser recolhidos do meio defermentação por meio de métodos tais como adsorção de resina de troca deíons e/ou cristalização.

Exemplos

Métodos gerais e materiais:

São utilizadas as abreviações a seguir:

"HPLC" é Cromatografia de Líquidos de Alto Desempenho, "C" écentígrado, "kPa" é quiloPascal, "m" é metro, "mm" é milímetro, "kW" équilowatt, >m" é micrômetro, "|a,l" é microlitro, "ml" é mililitro, "I" é litro, "min" éminuto, "mM" é milimolar, "cm" é centímetro, "g" é grama, "kg" é quilograma,"wt" é peso, "h" é hora, "temp." ou "T" é temperatura, "teór." é teórico, "pretreat"é tratamento prévio, "DWB" é peso seco de biomassa.

Ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida,extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), fosfato depotássio, glicose, xilose, triptona, cloreto de sódio e ácido cítrico foram obtidospor meio da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reatores de tratamento prévio:

Reator Zipperclave®:

O reator Zipperclave® de quatro litros (Autoclave Engineers, Erie1PA) é recipiente sob pressão de bateladas equipado com balde Hastelloy® de2,5 litros para a carga de biomassa e agitador para misturar a biomassa. Orecipiente do reator é circulado por aquecedor elétrico controlado natemperatura de tratamento prévio desejada. Injeção de vapor direto também éutilizada para trazer rapidamente a biomassa até a temperatura de tratamentoprévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada para manter a temperaturade tratamento prévio desejada. Condensado de vapor formado por meio deaquecimento da placa superior do reator Zipperclave®, recipiente e fora dobalde é drenado para reservatório formado entre o balde e a parede interna doreator para evitar diluição excessiva da calda previamente tratada.

Reator Jaygo :

O reator Jaygo é reator do tipo pás horizontais de 130 litros (cercade 51 cm de diâmetro por 91 cm de comprimento) (Jaygo Manufacturing, Inc.,Mahwah, NJ) fabricado com liga Hastelloy® C-22. O reator é equipado comcamisa de vapor capaz de aquecimento até cerca de 177 0C (862 kPa). Injeçãode vapor direto também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa para atemperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controladapara manter a temperatura de tratamento prévio desejada. Numerosas portaspermitem a injeção de outros solventes e líquidos quentes.

Sistema de digestão em bateladas de reator de pistola de vapor:

O reator de pistola de vapor de quatro litros (Autoclave Engineers1Erie1 PA) é reator de camisa de vapor que consiste de cano de Hastelloy® comcomprimento de 102 mm programação 80 fechado por duas válvulas de bolas.

Aquecedores elétricos adicionais são colocados sobre todas as superfíciesexpostas sem camisas do reator e controlados até a temperatura de ponto deajuste de tratamento prévio. A injeção de vapor direto também é utilizada paratrazer rapidamente a biomassa para a temperatura de tratamento prévio. Apressão de vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura detratamento prévio desejada. O fundo do reator é estreitado para 51 mm. Todo omaterial tratado previamente sai através de molde substituível no fundo doreator e é recolhido em saco de nylon (Hotfill®) de 0,21 m3 sustentado emtanque de ignição pesado com paredes, com camisa e resfriado.

Refinador de disco:

O refinador de disco é refinador de 30,5 cm modelo SproutWaldron (Andritz, Inc., Muncy, PA) equipado com motor elétrico de 11 kW. Oespaço entre as placas estacionárias e giratórias é variável. A velocidade dotrado de alimentação também é variável, de O a 88 rpm. A entrada do refinadorfoi modificada com seis portas de injeção para permitir a introdução de vapor,água quente ou outros gases varridos e líquidos pouco à frente da placarefinadora giratória. O refinador foi equipado com placas (Durametal, Corp.,Tulatin, OR) em qualquer padrão D2A506 em Ni-Hard ou padrão 18034-A emNi-Hard.

Tratamento prévio e reator de hidrólise enzimática (PEHR):

O reator PEHR 9L (construído na NREL, Golden, CO; vide opedido de patente norte-americano co-pendente n0 CL 3447) possui recipientede reação de aço inoxidável de 15 cm x 51 cm com lança de injeção paraintrodução de reagentes de processamento. A lança de injeção é conectadautilizando junta giratória a porta em cobertura sobre uma extremidade dorecipiente, que possui porta adicional para acesso ao recipiente. Quatromembranas correm pelo comprimento da parede do recipiente e são fixadasperpendicularmente à parede. As membranas e 22 cilindros de meios de atritocerâmicos de 3,2 cm x 3,2 cm (E. R. Advanced Ceramics1 East Palestine1 OH),livre flutuação no veículo, aplicação de mistura mecânica de biomassa ereagente à medida que o recipiente é girado, promovendo a assimilação dereagente à biomassa O reator PEHR é colocado sobre Aparelho Rolante de

Produção Celular Bellco (Bélico Technology, Vineland, NJ) que fornecemecanismo de rotação e o reator com aparelho rolante é abrigado em câmaracom temperatura controlada que fornece calor. Pode-se aplicar vácuo epressão ao recipiente de reação fixando-se fontes externas à porta conectada alança na tampa.

Métodos analíticos:

Quantificação de celulose:

A quantidade de celulose em cada amostra de biomassa inicial foideterminada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, tais como ASTME1758-01, Standard Method for the Determination of Carbohydrates by HPLC.

Medição do teor de açúcar, acetamida. ácido láctico e ácido acético:

Açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose, arabinosee manose), acetamida, ácido láctico e ácido acético em líquido de sacarificaçãoforam medidos por meio de HPLC (Agilent Modelo 1100, Agilent Technologies,Palo Alto, CA) utilizando colunas Bio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com colunas de guarda apropriadas. O pH daamostra foi medido e ajustado em 5-6 com ácido sulfúrico se necessário. Aamostra passou em seguida através de filtro de seringa de 0,2 jxm diretamentepara ampola de HPLC. As condições de condução de HPLC foram asseguintes:

Biorad Aminex HPX-87P (para carboidratos):

Volume de injeção: 10 a 50 ^il1 dependendo daconcentração e dos limites do detector.

- Fase móvel: HPLC grau água, 0,2 |am filtrado e com gasesretirados.

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto.

Temperatura da coluna: 80-85 0C, temperatura da colunade guarda < 60 0C.

- Temperatura do detector: o mais perto possível datemperatura da coluna principal.

Detector: índice de refração.

Tempo de condução: 35 minutos de coleta de dados maisquinze minutos após a condução (com possível ajuste para compostoseluentes posteriores).

Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos, acetamida, ácidoláctico, ácido acético e etanol):

Volume de injeção: 5 a 10 μΙ, dependendo da concentração e doslimites do detector.

Fase móvel: 0,01 N ácido sulfúrico, 0,2 μηι filtrado e seus gasesretirados.

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto.

Temperatura da coluna: 55 0C.

Temperatura do detector: o mais perto possível da temperatura dacoluna.

Detector: índice de retração.

Tempo de condução: 25 a 75 minutos de coleta de dados.

Após a condução, as concentrações da amostra foramdeterminadas a partir de curvas padrão para cada um dos compostos.

Exemplo 1

Tratamento Prévio de Forragem em Alta Concentração de Biomassa. Alta

Temperatura ε Comparação de Concentrações de Amônia

O recipiente do reator Zipperclave® e a placa superior forampreviamente aquecidos à temperatura de tratamento prévio alvo antes daintrodução da carga de biomassa por meio de ciclização de vapor no reator eventilação por várias vezes. O condensado formado durante o aquecimentoprévio foi removido por meio de aspiração a vácuo antes do tratamento prévio.

O balde de Hastelloy® foi carregado com forragem moída a 0,635 cm (100 g,com base em peso seco) e inserido no reator previamente aquecido. O agitadordo reator foi ajustado em 20 rpm mediante aplicação de vácuo (cerca de 85kPa) ao interior do recipiente e carga de biomiassa. Solução de hidróxido deamônio com a resistência necessária para gerar peso seco de concentração debiomassa de 30% em peso com relação ao peso da mistura de biomassa eamônia aquosa, bem como a concentração de amônia desejada relacionada naTabela 1, foi injetada perto do fundo do recipiente com bocal do tipopulverização. Amostras de teste possuíam concentração final de amônia de12% com relação ao peso seco de biomassa, enquanto amostras comconcentração final de amônia de 35% com relação ao peso seco de biomassaforam utilizadas como comparação. Quando a temperatura da carga debiomassa atingiu 50 0C1 introduziu-se vapor perto do fundo do reator parafluidificar e elevar a temperatura da carga de biomassa para 140 0C ou 170 0C.

Ao final do tratamento prévio, o reator foi despressurizado por meio decondensador de ventilação e aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) por trêsminutos para reduzir a temperatura e remover amônia adicional da caldapreviamente tratada antes da abertura do reator e recuperação da biomassapreviamente tratada.

Calda de tratamento prévio integral não lavada contendo 0,5 g decelulose (com base na composição de estoque de alimentação inicial) foiadicionada em volume final de 50 ml a frasco de agitação de 125 ml.

Adicionou-se ácido acético (10 a 100 μΙ) para titular o pH da biomassapreviamente tratada com amônia em 5,0 antes da adição de enzima devido àsensibilidade das enzimas a ambientes com alto pH. O pH foi controlado em5,0 durante a sacarificação por meio da adição de 50 mM de tampão de citratoe a temperatura foi mantida a 50 0C. Celulase Spezyme® CP (GenencorInternational, Rochester1 NY) foi adicionada à concentração relacionada paracada amostra na Tabela 1. O teor de açúcar do líquido de sacarificaçãoresultante foi determinado após 96 horas de sacarificação de acordo com oprotocolo de medição de açúcar descrito nos Métodos Gerais. A liberação deaçúcar após 96 horas é exibida na Tabela 2. Controles para este experimentoforam 1) forragem de milho não tratada, que gerou 23% do rendimento teóricode glicose (utilizando 56 mg de celulase por grama de celulose) e 2) forragemde milho previamente tratada com vapor (140 0C), que gerou 40% dorendimento teórico de glicose (utilizando 56 mg de celulase por grama decelulose); xilose não foi medida para os controles.

Tabela 1

Liberação de Açúcar de Forragem de Milho Previamente Tratada comSacarificacão por 96 HorasDWB: peso seco de biomassa.

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Estes resultados indicam que tratamento prévio utilizando amôniaa 12% por quinze minutos a 140 0C1 seguido por sacarificação, libera maisglicose e xilose que ao utilizar-se tratamento prévio com 35% de amônia porcinco minutos a 140 0C. Desta forma, as vantagens do uso de amônia inferiorpodem ser incorporadas por pequeno aumento do tempo de tratamento prévio.

Exemplo 2

Tratamento Prévio em Alta Concentração de Biomassa. Baixa

Temperatura ε Amônia Muito Baixa

O reator Jaygo foi carregado com forragem moída a 0,635 cm (13kg, base de peso seco). Aplicou-se vácuo (67,7 kPa) ao recipiente e injetou-sesolução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de6,2 g de amônia por 100 g de peso seco de biomassa e peso seco deconcentração de biomassas 30% em peso com relação ao peso total damistura de biomassa e amônia aquosa. O vácuo foi liberado e aplicou-se vaporà camisa para aquecer a forragem a 100 0C. A forragem embebida foi mantidasob uma temperatura por oito horas com mistura constante a 32 rpm e mantidaem seguida em resfriamento por uma noite com mistura contínua da caldaresultante.

Calda de tratamento prévio não lavada integral contendo 0,5 g decelulose (com base na composição de estoque de alimentação inicial) foiadicionada em volume final de 50 ml a frasco de agitação de 125 ml.Adicionou-se ácido acético (10 a 100 μΙ), se necessário, para titular o pH dabiomassa previamente tratada com amônia em 5,0 antes da adição de enzimasdevido à sensibilidade das enzimas a ambientes com alto pH. O pH foicontrolado em 5,0 durante a sacarificação por meio da adição de 50 mM detampão de citrato e a temperatura foi mantida a 50 0C. Celulase Spezyme® CP(Genencor International, Rochester, NY) foi adicionada a 56 mg/g de celulose.O teor de açúcar do líquido de sacarificação resultante foi determinado após 96horas de sacarificação de acordo com o protocolo de medição de açúcardescrito nos Métodos Gerais e é exibido na Tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 32</column></row><table>Os resultados indicam que estas concentrações de amônia muitobaixas e condições de tratamento prévio sob baixa temperatura (por período deoito horas) são tão eficazes quanto o uso de 12% de amônia a 140 0C porquinze minutos.

Exemplo 3

Tratamento Prévio de Espigas com Alta Concentração de Biomassa, BaixaTemperatura ε Concentração de Amônia Muito Baixa Seguido porSacarificacão com Alta Concentração de Biomassa

Espigas de milho inteiras ou fraturadas (cerca de 13 kg, com baseem peso seco) foram carregadas no reator Jaygo. Espigas foram fraturadas pormeio de passagem através do refinador de disco (General Methods) equipadocom placas C-2975. As espigas fraturadas resultantes foram passadas atravésde peneira de 1,27 cm. Quaisquer pedaços retidos passaram novamenteatravés do refinador de disco com espaço menor de 0,5 cm. Aplicou-se vácuoao reator e injetou-se solução diluída de hidróxido de amônio para gerar aconcentração de amônia final desejada (2% ou 6%) e concentração debiomassa seca (30% ou 40%), conforme fornecido na Tabela 3. O vácuo foiliberado e aplicou-se vapor à camisa para aquecer as espigas medianteembebimento até uma temperatura de 93 0C para a amostra de espiga inteira e85°C para amostras de espiga fraturadas. Curtos períodos de velocidade deagitador mais alta (até 96 rpm) foram aplicados em esforço para aumentar avelocidade de aquecimento. As espigas embebidas foram mantidas sob umatemperatura por quatro ou oito horas com mistura constante a 32 rpm emantidas em resfriamento em seguida por uma noite com mistura contínua.

Antes da remoção da biomassa previamente tratada do reator, oreator foi colocado a vácuo a 90 0C para extrair amônia da biomassapreviamente tratada. Antes da sacarificação, o pH da biomassa de espigapreviamente tratada foi ajustado em 5,5 com ácido cítrico sólido. Cerca de 10kg de espiga inteira previamente tratada foram sacarificados no reator Jaygo a50 0C. Cerca de 1400 g de espiga fraturada previamente tratada foramadicionados ao reator PEHR1 junto com 22 cilindros de atrito cerâmicos(diâmetro de 3,2 cm χ comprimento de 3,2 cm; E. R. Advanced Ceramics, EastPalestine, OH) para sacarificação. Mistura de enzimas de 28 mg de SpezymeCP®/g de celulose em forragem não tratada mais 28 mg/g de celulose MultifectXylanase® foi utilizada para cada reação de sacarificação. O peso seco final deconcentração de biomassa no início de cada sacarificação foi de 30% comrelação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação debiomassa previamente tratada. O reator PEHR girou axialmente a 19 rpm,mantendo, ao mesmo tempo, uma temperatura de 50 0C. O teor de açúcar dolíquido de sacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolode medição de açúcar nos Métodos Gerais. A liberação de açúcar após 96horas é exibida na Tabela 3.

Tabela 3

Liberação de Açúcar de Espigas de Milho Tratadas Previamente UtilizandoAlta Concentração de Biomassa (em Peso Seco) Durante a SacarificaçãoDWB: peso seco de biomassa (o percentual é calculado comrelação ao peso total da mistura).

<table>table see original document page 34</column></row><table>Exemplo 4

Tratamento Prévio de Espigas com Alta Concentração de Biomassa. AltaTemperatura ε Concentração de Amõnia Muito Baixa Seguido porSacarificacão com Alta Concentração de Biomassa

Espigas de milho fraturadas (13 kg, base seca) foram carregadasno reator Jaygo. Após puxar vácuo sobre o reator, solução de hidróxido deamônio com a resistência adequada para gerar 2% de amônia e 30% de pesoseco de concentração de biomassa foi bombeada no reator com mistura a 32rpm à temperatura ambiente. O conteúdo do reator foi aquecido em seguida a95 0C utilizando vapor de camisa sob baixa pressão. Após o reator atingir 950C, injeção de vapor direto foi utilizada para aquecer o conteúdo do reator a145 0C. Quando o reator atingiu 145 0C, o conteúdo do reator foi mantidonaquela temperatura por vinte minutos utilizando vapor de camisa e algumainjeção de vapor direto. Após vinte minutos, vácuo foi puxado sobre aventilação para o reator e o motor retalhador foi ligado por cinco minutos. Apósuma hora, a água de resfriamento para a camisa foi ligada. O conteúdo doreator Jaygo foi resfriado a 33 0C até 37 0C; em seguida, utilizou-se CO2 parapressurizar o reator a 138 kPa. A atmosfera de CO2 pressurizado foi mantidapor trinta minutos. A temperatura final do conteúdo do reator foi de 27 0C a 310C. O pH da biomassa embebida/previamente tratada foi de cerca de 7,5.

Biomassa previamente tratada foi removida do reator Jaygo etransferida para o reator PEHR para sacarificação em peso seco final deconcentração de biomassa no início para sacarificação de 30% com relação aopeso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassapreviamente tratada. O pH foi ajustado em seguida em 5,5 com ácido cítricosólido e o material digerido com 28 mg de Spezyme CP®/g de celulose e 28mg de Multifect Xylanase®/g de celulose em espiga não tratada conformedescrito no Exemplo 3. O teor de açúcar do líquido de sacarificação resultantefoi determinado de acordo com o protocolo de medição de açúcar nos MétodosGerais. A liberação de açúcar após 96 horas de digestão é exibida na Tabela 4.

Tabela 4

Liberação de Açúcar de Espigas de Milho Tratadas Previamente Utilizando

Exemplo 5

Tratamento Prévio com Adição de Plastificante

Espiga inteira foi previamente tratada conforme descrito noExemplo 3 em peso seco de concentração de biomassa de cerca de 30% comrelação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa, 2% em pesode amônia com relação ao peso seco de biomassa, 100 0C1 por oito horas noreator Jaygo com 3% em peso com relação ao peso seco de biomassa deglicerol adicionada para agir como plastificante. Após o tratamento prévio, o pHdo material resultante foi ajustado em 5 com ácido cítrico sólido. Espigapreviamente tratada foi digerida em seguida conforme descrito no Exemplo 3.Utilizou-se mistura de enzimas de 28 mg de Spezyme CP®/g de celulose emforragem não tratada mais 28 mg/g de celulose Multifect Xylanase® em espiganão tratada. Após 96 horas de digestão, a concentração de glicose foi de 92,3g/l e a concentração de xilose foi de 54,4 g/l.

Exemplo 6

Refino de Disco de Biomassa Previamente tratadaForragem foi previamente tratada da forma descrita no Exemplo 1,

Alta Concentração de Biomassa (em Peso Seco) Durante a Sacarificacão

<table>table see original document page 36</column></row><table>com amostras diferentes que possuem baixas concentrações de amônia (12%)ou amônia comparativa (35%) e temperatura, tempo e condições de enzimaconforme relacionado na Tabela 5. Espiga inteira foi previamente tratadaconforme descrito no Exemplo 3 com diferentes amostras que contêm amôniamuito baixa (3% ou 6%) e outras condições conforme relacionado na Tabela 5.Após o tratamento prévio, as amostras passaram através de refinador de discoSprout Waldron. O espaço entre a placa estacionária e a placa giratória foidefinido em 0,254 mm e a velocidade do trado de alimentação em 7 rpm.Material refinado foi sacarificado conforme descrito no Exemplo 2 e o teor deaçúcar do líquido de sacarificação resultante foi determinado de acordo com oprotocolo de medição de açúcar nos Métodos Gerais. Os resultados dasacarificação após 96 horas são exibidos na Tabela 5. Os resultadosdemonstraram que, com refino de disco antes da sacarificação, atingiu-semelhor digestibilidade ou o uso de concentrações mais baixas de enzimas foieficaz.

Tabela 5

Digestibilidade de Material Tratado Previamente que Foi Refinado comDisco Antes da Sacarificação

<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>

Exemplo 7

Tratamento de Biomassa Previamente tratada com Pistola de VaporForragem foi previamente tratada conforme descrito no

Exemplo 1 utilizando condições de 30% em peso seco de biomassa comrelação ao peso total de biomassa e mistura de amônia aquosa, 6% empeso de amônia com relação a DWB1 100 0C1 oito horas, no reator Jaygo.Espiga foi previamente tratada conforme descrito no Exemplo 3 utilizandocondições de 40% em peso seco de biomassa com relação ao peso totalde mistura de biomassa e amônia aquosa, 6% em peso de amônia comrelação a DWB1 93 0C, oito horas, no reator Jaygo. Amostras de cadabiomassa previamente tratada foram carregadas separadamente em reatorde pistola de vapor de quatro litros. Material tratado previamente foisubmetido a 170 0C por cinco minutos, ou 140 0C por vinte minutos antesda liberação através de molde. O material resultante foi sacarificadoconforme descrito no Exemplo 2. Os resultados são fornecidos na Tabela 6abaixo. Os resultados demonstraram que o tratamento com pistola devapor antes da sacarificação aumentou a liberação de glicose.Tabela 6

Digestibilidade de Material Tratado Previamente Após Tratamento comPistola de Vapor

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Exemplo 8

Modelo de Tratamento Prévio com Reciclagem de Amônia

Vantagens da reciclagem de amônia foram examinadas commodelos Aspen (Aspen Technologies, Cambridge1 MA, versão 12.1) para doisesquemas de tratamento prévio: baixa temperatura (85 0C), longo tempo depermanência (quatro horas) e alta temperatura (130 0C), curto tempo depermanência (vinte minutos). Em cada modelo, houve uma série de trêstanques de ignição operando sob pressões sucessivamente mais baixas após oreator previamente determinado para fornecer meios de reciclagem de amônia.À medida que o fluxo de alimentação entrava em cada tanque, ele se dividiaem frações de vapor e líquido devido à redução da pressão. A fração de vaporfoi reciclada para tratamento prévio, enquanto a fração líquida seguiu para afase seguinte no processo. Considerando 2% em peso de amônia com relaçãoa DWB e cerca de 27% em peso seco de biomassa com relação ao peso totalda mistura de biomassa e amônia aquosa em tratamento prévio, amôniafornecida fresca e dos fluxos de reciclagem para cada processo é exibida naTabela 7. Nos dois modelos, os tanques de ignição operaram de forma similar,de forma que a reciclagem de amônia foi similar. Para os dois cenários, maisda metade da amônia necessária foi fornecida por meio de reciclagem,reduzindo a necessidade e o custo da amônia fresca.

Tabela 7

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Exemplo 9

Produção de Etanol a Partir de Biomassa de Milho Previamente tratadacom Baixa Amônia ε Sacarificada ε Comparação com ForragemPreviamente tratada com Alta Amônia ε Sacarificada

Hidrolisado de espiga foi gerado por meio de tratamento prévio deespigas inteiras no reator Jaygo por oito horas a 93 0C com 6% em peso deamônia com relação ao peso seco de biomassa em peso seco de concentraçãode biomassa de 40% em peso com relação ao peso total da mistura debiomassa e amônia aquosa, conforme descrito no Exemplo 3. Após otratamento prévio, amônia foi removida por meio de aquecimento do reator a 90°C a vácuo. O pH da biomassa previamente tratada foi ajustado em seguida em5 com ácido sulfúrico. A biomassa previamente tratada foi sacarificada noreator Jaygo a 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total damistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa tratadapreviamente com 28 mg/g de celulase Spezyme® de celulose e 28 mg/g dexilanase Multifect® de celulose por 168 horas a 50°C e pH 5. O hidrolisadoresultante foi utilizado para fermentação de Zymomonas mobilis 8b emfermentadores Sixfors (INFORS AG1 Suíça). Zymomonas mobilis 8b é linhagemde Zymomonas mobilis que foi geneticamente elaborada para promover aprodução de etanol aprimorada sobre o tipo selvagem e é descrita no Pedidode Patente Norte-Americano publicado n° 2003/0162271 A1 (Exemplos IV, Vl eXII). O hidrolisado de espiga compreendeu 78 g/l de glicose, 51 g/l de xilose, 6g/l de acetamida e 7 g/l de ácido acético. O hidrolisado de espiga foi utilizado a40% e 80% de resistência, em que o saldo do meio é meio aquoso concentradoque consiste de extrato de levedura e KH2PO4 em quantidades tais que as suasconcentrações na calda final fossem de cerca de 5 g/l e 2 g/l, respectivamente.Além disso, na calda de hidrolisado a 40%, glicose e xilose foram adicionadasem quantidades suficientes para trazer as suas concentrações para os mesmosníveis da calda de hidrolisado a 80%. A fermentação foi conduzida a 37 0C. Aagitação nos fermentadores foi de 100 rpm e o pH foi mantido em 5,5 por meioda adição de 2 N KOH. Os resultados são exibidos na Tabela 8. Açúcares eetanol foram analisados conforme descrito nos Métodos Gerais.

Para comparação, hidrolisado de forragem foi gerado por meio dotratamento prévio de forragem com 35% em peso de amônia com relação ao pesoseco de biomassa em peso seco de concentração de biomassa de cerca de 30%em peso com relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa a170 0C por cinco minutos no reator Zipperclave®, conforme descrito no Exemplo1. A biomassa previamente tratada foi digerida enzimaticamente a 30% em pesoseco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação deenzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada com 224 mg/g decelulase Spezyme CP® de celulose a 50 0C e pH 5 para gerar hidrolisado com altaconcentração de açúcar para testes de fermentação. O hidrolisado resultantecompreendeu 88 g/l de glicose, 52 g/l de xilose, 9 g/l de ácido acético e 15 g/l deácido láctico. Para a produção de etanol, Zymomonas mobilis 8b foi fermentadosobre calda de hidrolisado a 40% ou 80% (v/v). O volume restante foi composto demeio aquoso concentrado que consiste de extrato de levedura, KH2PO4 e tampãoMES em quantidades tais que as suas concentrações na calda final seriam decerca de 10 g/l, 2 g/l e 0,1 M, respectivamente. Além disso, na calda de hidrolisadoa 40%, glicose e xilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazeras suas concentrações para os mesmos níveis da calda de hidrolisado a 80%. Afermentação foi realizada a 30 0C e pH 6 em frascos de agitação de 25 ml comvolume de trabalho de 20 ml. A agitação foi mantida a 150 rpm. Análise foirealizada para a amostra de fermentação de hidrolisado de espiga e os resultadossão fornecidos na Tabela 8.

Tabela 8

<table>table see original document page 42</column></row><table>Estes resultados demonstraram que a fermentação paraproduzir etanol a partir de hidrolisado de espiga previamente tratado combaixa amônia foi mais eficiente que de forragem previamente tratada comalta amônia.

Exemplo 10

Produção de 1 .3-Propanodiol a Partir de Biomassa de Espiga Sacarificadaε Previamente Tratada com Muito Baixa Amônia

Hidrolisado gerado a partir do tratamento prévio e sacarificaçãode espiga foi fermentado para produzir 1,3-propanodiol. Hidrolisado foi geradopor meio de tratamento prévio de pedaços de espiga no reator de pistola devapor. Primeira biomassa de espiga foi carregada no reator PEHR (descrito emMétodos Gerais), aplicou-se vácuo e solução diluída de hidróxido de amônio foiinjetada para gerar concentração de amônia de 4 g de amônia/100 g debiomassa em peso seco e peso seco de concentração de biomassa de 30 g depeso seco de biomassa/100 g de mistura de biomassa e amônia aquosa total.

O recipiente do reator carregado com amônia e espiga foi girado a 4 0C portrinta minutos. O conteúdo foi transferido para o reator de pistola de vapor(descrito em Métodos Gerais), a temperatura aumentou para 145 0C e amistura foi mantida sob uma temperatura por vinte minutos. O material dapistola de vapor foi descarregado em tanque de ignição e manteve-se vácuosobre o tanque de ignição para auxiliar na remoção de amônia. Após o ajustedo pH, a biomassa previamente tratada foi sacarificada a 30 g de peso seco debiomassa/100 g de mistura de associação de enzimas de sacarificação debiomassa previamente tratada com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP® decelulose e 10,1 mg de proteína ativa por grama de associação de enzimas decelulose que consiste de β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase earabinofuranosidase por 72 horas a 50 0C e pH 5,5. O hidrolisado resultante foiutilizado como fonte de açúcar fermentável para conversão em 1,3-propanodiolpor Ε. coli recombinante linhagem RJ8n pBE93-k1. A construção de linhagemRJ8n pBE93-k1 é descrita em detalhes no Pedido PCT n0 WO 2004/018645(Exemplo 7) e é derivado da linhagem RJ8n, descrita em US 6.358.716. Ohidrolisado foi utilizado a 10% com o saldo sendo meio aquoso que consiste de7,5 g/l de KH2PO4, 2,0 g/l de ácido cítrico*H20, 4,0 ml/l de 28% NH4OH, 3,0 g/lde (NH4)2SO4, 2,0 g/l de MgS04*7H20, 0,2 g/l de CaCI2*2H20, 0,33 g/l de'citrato de amônio férrico, 0,5 g/l de extrato de levedura, 0,1 mg/l de vitaminaB12, 1,0 mg/l de FeS04*7H20, 1 mg/l de ZnS04*7H20, 0,1 g/l de CuS04*5H20,1 mg/l de CoCI2*6H20, 0,3 mg/l de MnSO4VH2O, 0,1 g/l de H3BO4, 0,10 g/l deNaMo04*2H20, 10 mg/l de NaCI com o pH final ajustado em 6,8. Os cultivosforam iniciados a partir de estoques congelados (15% glicerol comocrioprotetor) em 50 ml de meio em frasco com membrana de 250 ml. Oscultivos foram incubados a 34 0C e 300 rpm de agitação por 24 horas. Aquantidade de 1,3-propanodiol produzida foi medida por meio de HPLC sob ascondições a seguir:

Coluna: Showdex SH1011.

Volume de amostra: 20 μΙ.

Fase móvel: 0,01 N H2SO4.

Velocidade de fluxo: 0,5 ml/min.

Temperatura da coluna: 50 0C.

Detector: conjunto de fotodiodos Waters 996.

Temperatura do detector: 40 0C.

Tempo de condução: 40 minutos.

Os resultados são exibidos na Tabela 9 abaixo. Produtos defermentação de glicose pela linhagem RJ8n pBE93-k1 de E. coli incluemglicerol (metabólito intermediário) e 1,3-propanodiol. Foram conduzidosexperimentos em frascos duplicados e testados após 24 horas. Neste sistema,glicose no hidrolisado foi convertida em glicerol e 1,3-propanodiol.Tabela 9

Utilização de Substrato ε Formação de Produto por Meio de Fermentaçãocom E. COU

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Exemplo 11

Formação de Acetamida Durante o Tratamento Prévio

Amostras derivadas de espigas tratadas previamente de acordocom os processos descritos no Exemplo 3 e no Exemplo 4 foram analisadaspara determinar o destino dos grupos acetila na biomassa. Os líquidos dotratamento prévio (mistura de tratamento prévio com sólidos insolúveisremovidos) foram testados para determinar o teor de ácido acético e acetamidaconforme segue. O pH de cada amostra foi ajustado em cerca de 3 com H2SO4(72%). Para a medição de acetamida, a amostra passou através de filtro de 0,2μηι e foi analisada por meio de HPLC de acordo com as condiçõesrelacionadas abaixo. Para medição de acetato total (inclui acetato presente naforma de ácido acético e acetamida), a amostra acidificada foi colocada emautoclave por uma hora a 121 0C; acetamida foi convertida quantitativamenteem ácido acético durante esta etapa. Após o autoclave, a amostra foi mantidaem resfriamento. A amostra foi passada em seguida através de filtro de 0,2 μίτιpara recipiente de amostra e analisada de acordo com as condiçõesrelacionadas abaixo. As concentrações de ácido acético e acetamida foramdeterminadas a partir de curvas padrão geradas para cada um.

Fase móvel: 0,01 N H2SO4, 0,2 μιτι filtrado e com gases retirados.

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/min.Temperatura da coluna: 55 a 65 0C.

Temperatura do detector: o mais perto possível da temperatura dacoluna.

Detector: índice de refração.

Tempo de condução: 60 minutos.

Coluna: coluna Biorad Aminex HPX-87H com coluna de guardacorrespondente.

Os resultados das três condições de tratamento prévio diferentestestadas são exibidos na Tabela 10. Em cada caso, todos os grupos acetilaforam solubilizados em ácido acético ou acetamida.

Tabela 10

Conversão de Grupos Acetila em Biomassa em Acetamida Durante oTratamento Prévio

DWB1 peso seco de biomassa (o percentual é calculado comrelação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa).

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Utilizando concentração de amônia de 6%, cerca da metade dosgrupos acetila foi convertida em acetamida, que não é inibidora para ocrescimento de biocatalisador conforme exibido no Exemplo 12.

Exemplo 12

Efeito de Acetamida ε Ácido Acético Sobre o Crescimento de Zymomonas

Para testar a toxicidade de acetamida e ácido acético, Z. mobilislinhagem 8b (descrita no Exemplo 9) foi cultivado em meio de fermentação sobpH 6,0 com e sem acetamida ou ácido acético. O meio de fermentação eracomposto de 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 70 g/l de glicose,40 g/l de xilose e 0,1 M tampão MES. Z. mobilis 8b foi cultivado em frascos deagitação Erlenmeyer com membrana de 25 ml girando a 150 rpm a 30 0C emmeio não suplementado (controle), meio suplementado com 6 g/l de acetamidaou meio suplementado com 7,2 g/l de ácido acético. Conforme exibido naFigura 1, a presença de acetamida não apresentou influência sobre avelocidade de crescimento ou densidade final de Z. mobilis, enquanto apresença de ácido acético resultou em redução da velocidade de crescimento erendimento celular mais baixo (conforme medido pela massa de células secas).

Exemplo 13

Tratamento Prévio de Bagaço em Alta Concentração de Biomassa. AltaTemperatura ε Amônia Muito Baixa ε Sacarificacão em Alta ε Baixa

Concentração

O reator PEHR (descrito em Métodos Gerais), sem meios deatrito, foi carregado com bagaço moído a 1,27 cm (370 g, base de peso seco).Este bagaço de cana de açúcar foi o Material de Referência NIST RM8491, apartir do clone de cana de açúcar H65-7052, obtido originalmente por meio daAssociação de Plantadores de Açúcar do Havaí, subestação de Kunia, Oahu,Hl. Ele foi moído em moinho Wiley para passar através de tela de 2 mm, comos finos (+74 mesh) removidos. O recipiente do reator PEHR foi resfriado a 40C por meio de rotação em contato com gelo sobre a superfície externa.Aplicou-se vácuo ao recipiente do reator e solução diluída de hidróxido deamônio, que foi resfriada previamente em quarto frio a 4 0C e passada atravésde tubulação imersa em banho de água com gelo, foi injetada para gerarconcentração de amônia de 4 g/100 g de peso seco de biomassa e peso secode concentração de biomassa de 45 g/100 g de mistura de biomassa e amôniaaquosa total. O recipiente do reator carregado com amônia e bagaço foiresfriado a 4 0C por meio da aplicação de gelo à superfície do recipiente dereator giratório e girado a 4 0C por trinta minutos. Nesse momento, o conteúdofoi transferido para o reator de pistola de vapor que é descrito nos MétodosGerais. Após o carregamento do reator de pistola de vapor com a mistura debagaço e amônia, a temperatura aumentou para 145 0C e a mistura foi mantidanessa temperatura por vinte minutos. Ao final do tempo de tratamento prévio, obagaço foi descarregado do reator de pistola de vapor através de moldecircular de 2,54 cm em tanque de ignição. Amostra de bagaço previamentetratado foi sacarificada em seguida em frasco de agitação e outra amostra(cerca de 163 g de peso seco) foi sacarificada no reator PEHR. A sacarificaçãodo frasco de agitação foi conduzida a 5% em peso seco de biomassa comrelação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação debiomassa previamente tratada, enquanto a sacarificação do reator PEHR foiconduzida a 30% de peso seco de biomassa com relação ao peso total damistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamentetratada. A temperatura foi mantida em 50 0C.

Para a sacarificação do reator PEHR, cerca de 476 g (cerca de136 g de peso seco) de biomassa previamente tratada e 22 cilindros de atritocerâmicos foram adicionados ao recipiente do reator. O pH foi ajustado em 5,0-5,5 com ácido cítrico sólido. O recipiente do reator foi mantido no interior decâmara incubadora controlada a 50 0C e girada axialmente a 19 rpm. Bagaçonão tratado previamente também foi sacarificado a 5% em peso seco debiomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas desacarificação de biomassa previamente tratada em frasco de agitação. Todasas sacarificações foram realizadas com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP®de celulose e 28,4 mg/g de xilanase Multifect® de celulose a 50 0C e pH 5,5 por96 horas. Os rendimentos fornecidos na Tabela 11 abaixo são a liberação naforma de percentual de rendimento teórico.

Tabela 11

Rendimentos Após o Tratamento Prévio ε Sacarificação de Bagaço

<table>table see original document page 49</column></row><table>

ND: não determinado.

Os resultados demonstram que o tratamento prévio de bagaçocom amônia muito baixa permite liberação substancial de açúcar emcomparação com o controle não tratado previamente e que sacarificação emalta concentração de biomassa seca no reator PEHR é muito eficaz naliberação de açúcares.

Exemplo 14

Tratamento Prévio de Serragem de Álamo Amarelo com AltaConcentração de Biomassa. Alta Temperatura ε Amônia Muito Baixa εSacarificação em Concentração Baixa ε Alta

O reator PEHR, sem meios de atrito, foi carregado comserragem de álamo amarelo (596 g, base de peso seco; adquirido daSawmiller, Inc., Haydenville, OH). Aplicou-se vácuo ao recipiente do reator einjetou-se solução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentraçãode amônia de 6 g/100 g de peso seco de biomassa e peso seco deconcentração de biomassa de 44 g/100 g de mistura total de biomassa eamônia aquosa. O recipiente do reator carregado com amônia e serragemde álamo amarelo foi trazido para 4 0C conforme descrito no Exemplo 13 egirado a 4 0C por trinta minutos. Nesse momento, o conteúdo foi transferidopara o reator de pistola de vapor. Após o carregamento do reator de pistolade vapor com a mistura de álamo e amônia, a temperatura aumentou para145 0C e a mistura foi mantida sob uma temperatura por vinte minutos. Aofinal do tempo de tratamento prévio, a serragem de álamo amarelo foidescarregada do reator de pistola de vapor através de molde circular de2,54 cm em tanque de ignição. Amostra de serragem de álamo amarelopreviamente tratada foi sacarificada em seguida conforme descrito noExemplo 13 em frasco de agitação e outra amostra foi sacarificada no reatorPEHR. A sacarificação do frasco de agitação foi conduzida a 5% em pesoseco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação deenzimas de sacarificação e biomassa previamente tratada (utilizando cercade 279 g em peso seco de serragem previamente tratada) foi conduzida a30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura deassociação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada.Serragem de álamo amarelo não tratada previamente também foisacarificada a 5% em peso seco de biomassa com relação ao peso total damistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassapreviamente tratada em frasco com agitação. Todas as sacarificações foramrealizadas com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP® de celulose e 28,4mg/g de xilanase Multifect® de celulose a 50 0C e pH 5,5 por 96 horas. Osrendimentos fornecidos na Tabela 12 abaixo são a liberação ou cada açúcarcomo percentual de rendimento teórico.Tabela 12

Rendimentos Após o Tratamento Prévio ε Sacarificacão de Serragem deÁlamo Amarelo

<table>table see original document page 51</column></row><table>

ND: não determinado.

Os resultados demonstram que o tratamento prévio de serragemde álamo amarelo com amônia muito baixa permite liberação substancial deaçúcar em comparação com o controle não tratado previamente e que asacarificação em peso seco alto de biomassa no reator PEHR é mais eficaz naliberação de açúcares que o frasco de agitação.

Exemplo 15

Produção de Etanol por Meio de Fermentação de Levedura SobreHidrolisado de Biomassa de Espigas Sacarificadas ε Tratadas Previamentecom Amônia Muito Baixa

O mesmo hidrolisado utilizado para produzir 1,3-propanodiol noExemplo 10 também foi utilizado para produzir etanol por meio de fermentaçãode levedura. Este hidrolisado foi utilizado como fonte de açúcar fermentávelpara conversão em etanol por Saccharomyces cerevisiae do tipo selvagem emfrascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado em resistência de 10% (v/v), emque o saldo é meio aquoso que consiste de 10 g/l de extrato de levedura e 2020 g/l de peptona. Levedura foi cultivada em 50 ml de meios em frasco commembrana de 250 ml. Os cultivos foram incubados a 30 0C com agitação a 250rpm por 24 horas. A quantidade de etanol produzida foi medida por meio deHPLC conforme descrito no Exemplo 9 e os resultados de frascos duplicadosencontram-se relacionados na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Exemplo 16

Produção de Ácido Láctico por Meio da Fermentação de LactobacilosSobre Hidrolisado ε Biomassa de Espigas Sacarificadas ε PreviamenteTratadas com Amônia Muito baixa

O mesmo hidrolisado utilizado para a produção de 1,3-propanodiol no Exemplo 10 também foi empregado para produzir ácido lácticopor meio de fermentação com Lactobacillus brevis em frascos de agitação. Ohidrolisado foi utilizado a 10% (v/v), em que o saldo é meio aquoso queconsiste de 5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 2 g/l de citrato deamônio, 5 g/l de acetato de sódio, 0,1 g/l de MgSO4, 0,05 g/l de MnSO4 e 2 g/lde KaHPO4 e 1 g/l de Tween. Os Iactobacilos foram cultivados em 50 ml decaldo em frascos com membrana de 250 ml. Cultivos duplicados foramincubados a 34 0C com agitação a 150 rpm por 24 horas. A quantidade deácido láctico produzida foi medida por meio de HPLC conforme descrito noExemplo 10 e encontra-se relacionada na Tabela 14. As duas amostras doFrasco 2 são testes duplicados do mesmo cultivo.Tabela 14

Utilização de Substrato ε Formação de Produto por Meio de Fermentaçãocom Lactobacillus brevis

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Exemplo 17

Tratamento Prévio de Espigas em Concentração de Biomassa Seca Mais

Alta com Amônia Muito Baixa

Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordente de cerca de 0,95cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston,NJ), seguido por peneiramento com peneira Sweco equipada com peneirapadrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 805 g de espigas fraturadasforam carregadas no reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cercade 7%. A atmosfera no recipiente do reator recebeu fluxo por cinco vezes comnitrogênio antes do carregamento. O reator, sem meios de atrito, foi aquecidopreviamente a 75 0C antes do início do experimento, sem rotação. Quando atemperatura no interior do recipiente do reator estabilizou-se a 75 0C, omecanismo de rolamento no incubador foi ligado e a rotação ajustada em 19rpm. A quantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio paragerar concentração de amônia de 6 g de amônia/100 g de peso seco debiomassa e concentração de sólidos de 50 g de peso seco de biomassa/100 gde peso seco de mistura de biomassa e amônia foi bombeada em seguida parao reator. Etanol a 1 g/100 g de peso seco de biomassa também foi adicionadoà solução. A solução de amônia foi bombeada através de circuito aquecido embanho de água aquecido a cerca de 75 0C1 fabricado utilizando reator Parr dedois galões. A solução de hidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada pormeio de lança de injeção no recipiente do reator e pulverizada sobre as espigasfraturadas em rotação e tombamento no reator. O reator foi mantido a 75 0C porduas horas mediante rotação a 19 rpm. Ao final daquele período, aplicou-sevácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator por trinta minutos para removeramônia e reduzir a temperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 0C.Dióxido de carbono foi injetado em seguida no reator para liberar o vácuo e oreator foi pressurizado até pressão medida de CO2 de 103 kPa e mantido sobpressão por trinta minutos a 50 0C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e foramadicionados meios de atrito. O pH do conteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 pormeio de injeção de 1 M tampão ácido cítrico sob pH 4,8 utilizando a lança deinjeção, para aumentar a resistência de tampão ácido cítrico para cerca de 75mM, mais adição de monoidrato de ácido cítrico. Nem toda a amônia foiextraída na etapa de vácuo nem neutralizada com CO2. O tampão de ácidocítrico foi injetado no reator após aquecimento a 50 0C e, em seguida, permitiu-se o equilíbrio do conteúdo por meio de incubação do reator a 50 0C e 19 rpmpor uma hora. A injeção do tampão de ácido cítrico ao girar o reator utilizando alança de injeção permitiu pulverização e distribuição mais regular do tampãosobre as partículas de milho tratado previamente. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de maisde 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foiincubado com mistura a 50 0C por uma hora adicional. Este processo foirepetido até que o pH fosse de cerca de 5,5. Ao atingir-se o pH desejado, 12,9mg/g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por gramade associação de enzimas de celulose que consiste de β-glucosidase, xilanase,β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. O reatorpermaneceu no incubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Após essetratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de62,0% e o rendimento de xilose de monômero foi de 31,0%. O rendimento deglicose total foi de 75,2% e xilose total foi de 80,3%.

Exemplo 18

Tratamento Prévio de Espigas em Concentração de Sólidos Mais Alta comAmônia Muito Baixa ε Condições Alternadas

Espigas de milho inteiras foram processadas com moinho martelo(moinho martelo de 25,4 cm, Glen Mills Inc., Clifton1 NH) para passar atravésde tela de 1,27 cm. Cerca de 805 g de espigas fraturadas foram carregados noreator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. Vinte e doiscilindros de atrito cerâmicos (diâmetro de 3,2 cm χ comprimento de 3,2 cm; E.R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) também foram adicionados aoreator. O reator foi previamente aquecido a 95 0C antes do início doexperimento, sem rotação. Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente doreator antes do início e o recipiente foi vedado. Quando a temperatura nointerior do recipiente do reator estabilizou-se em 95 0C, o mecanismo derolamento no incubador foi ligado e a rotação foi ajustada em 19 rpm. Aquantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio para gerarconcentração de amônia de 6 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa econcentração de sólidos de 50 g de peso seco de biomassa/100 g de peso totalde mistura de biomassa e amônia foi bombeada em seguida para o reator. Asolução de amônia foi bombeada através de circuito aquecido em banho deágua fervente fabricado utilizando reator Parr de dois galões. A solução dehidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada por meio de lança de injeçãono recipiente do reator e pulverizada sobre as espigas fraturadas em rotação etombamento no reator. O reator foi mantido em 95 0C por duas horas enquantogira a 19 rpm. Ao final daquele tempo, aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) aorecipiente do reator por trinta minutos para remover amônia e reduzir atemperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 0C. Dióxido de carbono foiinjetado em seguida no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizadoaté pressão medida de 103 kPa e mantido sob pressão por trinta minutos a 50°C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio da injeção de 1 M tampão deácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-se monoidrato de ácidocítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado no reator após aquecimento a 50°C e, em seguida, permitiu-se que o conteúdo se equilibrasse por meio deincubação do reator a 50 0C e 19 rpm por uma hora. Injeção do tampão deácido cítrico mediante rotação do reator utilizando a lança de injeção permitiupulverização e distribuição mais regular do tampão sobre as partículas deespigas previamente tratadas. O reator foi removido do incubador, aberto e opH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de mais de 5,5, agregou-semonoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foi incubado com misturaa 50°C por uma hora adicional. Este processo foi repetido até que o pH fossede cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 12,9 mg/g de celuloseSpezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por grama de associação deenzimas de celulose que consiste de β-glicosidase, xilanase, β-xilosidase earabinofuranosidase foram carregados no reator. O reator permaneceu noincubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Após esse tratamento prévio esacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de 50,7% e orendimento de xilose de monômero foi de 35,7%. Os rendimentos totais deglicose e xilose foram de 71,7% e 89,8%, respectivamente.

Exemplo 19

Tratamento Prévio de Espigas com Amônia Muito Baixa ε Base Adicional

Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordentes de cerca de 0,95cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguidopor peneiramento com peneira Sweco equipada com peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 460 g de espigas fraturadas foram carregadasno reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. O reatorfoi aquecido previamente a 95 0C antes do início do experimento, sem rotação.

Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator antes do início e orecipiente foi lacrado. Quando a temperatura no interior do recipiente sereestabilizou em 95 0C, o mecanismo de rolamento no incubador foi ligado e arotação foi ajustada em 19 rpm. A quantidade apropriada de solução dehidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de 3,2 g deamônia/100 g de peso seco de biomassa e NaOH para gerar concentração de1,9 g de NaOH/IOO g de peso seco de biomassa, mantendo ao mesmo tempoconcentração de sólidos de 30 g de peso seco de biomassa/100 g de peso totalde mistura de biomassa e amônia foram bombeados em seguida no reator. Aamônia e solução base adicional foi bombeada através de circuito aquecido embanho de água fervente fabricado utilizando reator Parr de dois galões. Asolução de hidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada por meio de lançade injeção para o recipiente o reator e pulverizada sobre as espigas fraturadasem rotação e tombamento no reator. Após a injeção, o vácuo sobre o recipientefoi liberado até pressão atmosférica. O reator foi mantido a 95 0C por trintaminutos e, em seguida, a temperatura foi reduzida para 85 0C, que foi mantidapor quatro horas. Ao final desse período, aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa)ao recipiente do reator por trinta minutos para remover amônia e reduzir atemperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 0C. Injetou-se em seguidadióxido de carbono no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizado atépressão medida de 103 kPa e mantido sob pressão por trinta minutos a 50 0C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado a cerca de 5,5 por meio de injeção de cerca de 75 ml de1 M tampão de ácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-semonoidrato de ácido cítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado no reatorapós aquecimento a 50 0C e o conteúdo foi mantido em seguida até o equilíbriopor meio de incubação do reator a 50 0C e 19 rpm por uma hora. Injeção dotampão de ácido cítrico mediante rotação do reator utilizando a lança deinjeção permitiu pulverização e distribuição mais regular do tampão sobre aspartículas de espigas previamente tratadas. O reator foi removido do incubador,aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de mais de 5,5,agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foi incubadocom mistura a 50 0C por uma hora adicional. Este processo foi repetido até queo pH fosse de cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 28,4 mg/g decelulose Spezyme CP (Genencor) e 28,4 mg/g de celulose Multifect foramcarregados no reator. O reator permaneceu no incubador a 50 0C e 19 rpm por72 horas. Após esse tratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicosede monômero foi de 56,1% e o rendimento de xilose de monômero foi de39,5%. Os rendimentos de glicose e xilose total foram de 82,8% e 84,2%,respectivamente. Estes valores são as médias de dois experimentos.

Exemplo 20

Tratamento Prévio Λ Temperatura Ambiente ε com Amónia Muito Baixa

Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordentes de cerca de 1cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguidopor peneiramento com peneira Sweco equipada com peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 460 g de espigas fraturadas foram carregadosno reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. Vinte edois cilindros de atrito cerâmicos (diâmetro de 3,2 cm χ comprimento de 3,2cm; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) também foram adicionadosao reator. Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator antes doinício e o recipiente foi vedado. Quando a temperatura no interior do reatorreestabilizou-se à temperatura ambiente (22 a 26 0C), o mecanismo derolamento no incubador foi ligado e a rotação foi ajustada em 19 rpm. Aquantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio para gerarconcentração de amônia de 4 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa,mantendo ao mesmo tempo concentração de sólidos de 30 g de peso seco debiomassa/peso total de mistura de biomassa e amônia foi bombeada emseguida para o reator. A solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada pormeio de lança de injeção para o recipiente do reator e pulverizada sobre asespigas fraturadas em rotação e tombamento no reator. Após a injeção, ovácuo sobre cada recipiente foi liberado até a pressão atmosférica. O reator foimantido à temperatura ambiente (22-26 0C) por 24 horas. Ao final daqueleperíodo, aplicou-se vácuo (cerca de 81 kPa) ao recipiente de reação por trintaminutos para remover amônia. Dióxido de carbono foi injetado em seguida noreator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizado até pressão medida de103 kPa com CO2 e mantido sob pressão por trinta minutos à temperaturaambiente.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio da adição de monoidrato deácido cítrico após aquecimento a 50 0C e mantido em seguida em equilíbrio pormeio de incubação do reator a 50 0C e 19 rpm. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de maisde 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foiincubado com mistura a 50 0C. Este processo foi repetido até que o pH fossede cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 12,9 mg por grama de celuloseSpezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por grama de associação deenzimas de celulose que consiste de β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase earabinofuranosidase foram carregados no reator. O reator permaneceu noincubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Após esse tratamento prévio esacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de 41,7% e orendimento de xilose de monômero foi de 25,4%. Os rendimentos totais deglicose e xilose foram de 50,1% e 53,2%, respectivamente. Estes valores foramas médias de dois experimentos.

Claims (37)

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA ALVO,derivável de biomassa, caracterizado pelo fato de que compreende:a. contato de biomassa com uma solução aquosa quecompreende amônia, em que a amônia está presente em uma concentraçãopelo menos suficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa eamônia aquosa, mas em que a mencionada amônia está presente em menosde cerca de 12% em peso com relação ao peso seco de biomassa e,adicionalmente, em que o peso seco de biomassa encontra-se em altaconcentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso com relação aopeso da mistura de biomassa e amônia aquosa;b. contato do produto da etapa (a) com uma associação deenzimas de sacarificação sob condições apropriadas para produzir açúcaresfermentáveis; ec. contato do produto da etapa (b) com pelo menos umbiocatalisador capaz de fermentar os açúcares para produzir a substância alvosob condições de fermentação apropriadas.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a substância alvo é selecionada a partir do grupo que consistede ácidos, álcoois, alcanos, alquenos, aromáticos, aldeídos, cetonas,biopolímeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos eprodutos farmacêuticos.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a substância alvo é selecionada a partir do grupo que consistede metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etileno glicol, propanodiol,butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol, sorbitol, ácido acético, ácido láctico, ácidopropiônico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácidoitacônico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido Ievulinico1 ácido glutâmico, ácidoaspártico, metionina, Iisina1 glicina, arginina, treonina, fenilalanina, tirosina,metano, etileno, acetona e enzimas industriais.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que a substância alvo é ácido láctico, propanodiol ou etanol.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que pelo menos um do mencionado biocatalisador é selecionado apartir do grupo que consiste de bactérias, fungos filamentos e levedura.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que pelo menos um do mencionado biocatalisador é selecionado apartir do grupo que consiste de Escherichia, Zymomonas, Candida,Saccharomyces1 Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium dotipo selvagem, mutante ou recombinante.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que pelo menos um do mencionado biocatalisador é selecionado apartir do grupo que consiste de Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillusstearothermophilus, Saceharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum,Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Pichia stipitis recombinante.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o pH da mistura de biomassa e amônia aquosa é de mais de 8.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que vácuo é aplicado à biomassa antes do contato da biomassacom uma solução aquosa que compreende amônia.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o mencionado peso seco de biomassa encontra-se em altaconcentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% a cerca de 80%.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o mencionado peso seco de biomassa encontra-se em altaconcentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% a cerca de 60%.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a mencionada amônia está presente em menos de cerca de 10% em peso com relação ao peso seco de biomassa.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a mencionada amônia está presente em cerca de 6% oumenos em peso com relação ao peso seco de biomassa.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste desafras de bioenergia, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduosólido industrial, resíduos de jardim, resíduos de madeira e florestais.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste debrotos de grama, resíduos de papel, lodo de fabricação de papel, grãos demilho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo,palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço de canade açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos por meio do processamento degrãos, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos emoitas, legumes, frutas, flores e esterco animal.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste deespigas de milho, forragem de milho, cascas de milho, bagaço de cana deaçúcar, serragem, brotos de grama, palha de trigo, feno, palha de cevada,palha de arroz e gramas.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste deespigas de milho, forragem de milho, serragem e bagaço de cana de açúcar.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a amônia é selecionada a partir do grupo que consiste de gásamônia, hidróxido de amônio, uréia e suas combinações.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que (a) é conduzida sob uma temperatura de cerca de 4 0C a cercade 200 0C.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que (a) é conduzida sob uma temperatura de cerca de 75 0C acerca de 150 0C.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que (a) é conduzida sob uma temperatura de mais de 90 0C acerca de 150 0C.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que (a) é conduzida por um período de tempo de até cerca de 25horas.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que (a) é conduzida por um período de tempo de até cerca de oitohoras.

25. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da amônia de (a) éremovida antes de (b).

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que a amônia de (a) é reciclada.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o contato de (b) é a um peso seco de concentração debiomassa de pelo menos cerca de 15%.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que (a), (b) ou (a) e (b) são repetidos pelo menos uma vez.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a adição, em (a), de pelo menos umplastificante, agente de amolecimento ou sua combinação.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o mencionado pelo menos um plastificante, agente deamolecimento ou sua combinação é selecionado a partir do grupo que consistede polióis, ésteres de polióis, glicol éteres, acetamida, etanol e etanolaminas.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente a aplicação de energia antes oudurante (a), antes ou durante (b), ou sua combinação.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a mencionada energia é selecionada a partir do grupo queconsiste de moagem, fragmentação, quebra, retalhamento, corte, refino emdisco, ultrassom e microondas.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o dióxido de carbono da fermentação é utilizado para ajustar opH da mistura de tratamento prévio antes da sacarificação.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a mencionada associação de enzimas de sacarificaçãocompreende pelo menos uma glicosidase.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a mencionada associação de enzimas de sacarificaçãocompreende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo queconsiste de glicosidases hidrolisantes de celulose, glicosidases hidrolisantes dehemicelulose, glicosidases hidrolisantes de amido, peptidases, lipases,ligninases e feruloil esterases.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a mencionada associação de enzimas de sacarificaçãocompreende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo queconsiste de celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glucosidases, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases,arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases, amilases,a-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases e isoamilases.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que (b) é realizado sob uma temperatura de cerca de 15 0C a cercade 100°C e sob um pH de cerca de 2 a cerca de 11.