BRPI0612939A2 - métodos de tratamento de biomassa composta de matérias-primas integradas - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE TRATAMENTO DE BIOMASSA COMPOSTA DE MATéRIAS-PRIMAS INTEGRADAS. A presente invenção fornece um método de tratamento de biomassa composta de matérias-primas integradas para produzir açúcares fermentáveis. Um aspecto dos métodos descritos no presente inclui uma etapa de pré-tratamento em que a biomassa é integrada com um fluxo de alimentação alternativo e a matéria-prima integrada resultante, em concentrações relativamente altas, é tratada com baixa concentração de amónia com relação ao peso seco de biomassa. Em outro aspecto, uma alta concentração de sólidos de biomassa previamente tratada é integrada com um fluxo de alimentação alternativo para sacarificação.

Description

"MÉTODOS DE TRATAMENTO DE BIOMASSA COMPOSTA DE MATÉRIAS-PRIMAS INTEGRADAS"

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido ProvisórioNorte-Americano n° 60/670437, depositado em doze de abril de 2005.

Declaração de Direitos Governamentais

A presente invenção foi realizada com apoio do governo dos EstadosUnidos com base no Contrato n° 04-03-CA-70224 concedido pelo Departamento deEnergia. O governo detém certos direitos na presente invenção.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo geral de processamentode biomassa. Especificamente, são fornecidos métodos de integração de fluxosde alimentação alternativos que incluem co-produtos de baixo valor e fluxosresiduais de processamento industrial, tais como processamento de grãos eoutras sementes, em biomassa para o tratamento e utilização em processos deprodução de produtos com alto valor.

Antecedentes da InvençãoMatérias-primas e resíduos celulósicos e lignocelulósicos, taiscomo resíduos agrícolas, madeira, resíduos florestais, lodo de fabricação depapel e resíduos sólidos municipais e industriais fornecem matéria-primarenováveis potencialmente grande para a produção de substâncias químicas,plásticos, combustíveis e alimentos. Matérias-primas e resíduos celulósicos elignocelulósicos, compostos de polímeros de carboidrato que compreendemcelulose, hemicelulose, glucanos e lignina, são geralmente tratados por umasérie de meios químicos, mecânicos e enzimáticos para liberar principalmenteaçúcares de hexose e pentose, que podem ser fermentados em seguida emprodutos úteis.

São utilizados métodos de pré-tratamento para fabricar ospolímeros de carboidrato de materiais celulósicos e lignocelulósicos maisfacilmente disponíveis para enzimas de sacarificação para essa hidrólise. Osmétodos de pré-tratamento padrão historicamente utilizaram principalmenteácidos fortes em altas temperaturas, entretanto, devido a altos custos deenergia, altos custos de equipamento, altos custos de recuperação decatalisador de pré-tratamento e incompatibilidade com enzimas desacarificação, métodos alternativos estão sendo desenvolvidos, tais como pré-tratamento enzimático ou o uso de ácido ou base em temperaturas maissuaves em que hidrólise reduzida de polímeros de carboidratos de biomassaocorre durante o pré-tratamento, que necessita de sistemas de enzimasaprimorados para sacarificar celulose e hemicelulose.

Práticas atuais de utilização de biomassa são geralmente dirigidasao fornecimento de fluxo de biomassa, freqüentemente de uma fonte, e pré-tratamento do fluxo de biomassa por meio dos métodos padrão descritosacima. Estas práticas não se utilizam da integração de diversos fluxos debiomassa, tal como em fluxos em processo ou fluxos residuais, em diferentesetapas de processamento, e não incluem processos de tratamentoeconomicamente robustos para os mencionados fluxos de biomassaintegrados.

A fim de atingir um processo economicamente robusto queincorpora o uso de fluxos de alimentação de biomassa integrados, é necessárioum processo comercial que inclui hidrólise de carboidratos em Iignocelulose defluxos de alimentação de biomassa integrados. Para atingir a viabilidadeeconômica, este processo deve também fornecer altos rendimentos deaçúcares em altas concentrações, utilizando baixas quantidades desubstâncias e produzem fonte de açúcares fermentáveis com baixa toxicidadepara organismos fermentativos que convertem açúcares em substâncias devalor agregado e combustíveis.

Os métodos descritos no presente abordam meios deincorporação dos mencionados fluxos de alimentação integrados em processoseconomicamente robustos que atendem aos critérios necessários acima para aprodução de substâncias com valor agregado e combustíveis.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção fornece um método de tratamento debiomassa composta de matérias-primas integradas para produzir açúcaresfermentáveis.

Um aspecto dos métodos descritos no presente inclui uma etapade pré-tratamento em que a biomassa é integrada com um fluxo dealimentação alternativo e a matéria-prima integrada resultante, emconcentrações relativamente altas, é tratada com baixa concentração deamônia com relação ao peso seco de biomassa. Em outro aspecto, uma altaconcentração de sólidos de biomassa previamente tratada é integrada com umfluxo de alimentação alternativo para sacarificação.

Em uma realização, a biomassa é tratada em um método quecompreende:

a. fornecimento de biomassa;

b. adição à biomassa de a) de pelo menos um fluxo dealimentação alternativo para produzir uma matéria-prima integrada ;

c. contato da matéria-prima integrada de b) com uma soluçãoaquosa que compreende amônia para formar uma mistura de matéria-primaintegrada e amônia aquosa, em que a amônia está presente em concentraçãopelo menos suficiente para manter pH alcalino da mistura de matéria-primaintegrada e amônia aquosa, mas em que a mencionada amônia está presenteem menos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco de matéria-prima integrada e, adicionalmente, em que o peso seco de matéria-primaintegrada encontra-se em uma alta concentração de sólidos de pelo menoscerca de 15% em peso com relação ao peso da mistura de matéria-primaintegrada e amônia aquosa, para gerar um produto de matéria-prima integradapreviamente tratado; e

d. contato do produto de c) com uma associação de enzimasde sacarificação sob condições apropriadas;

para produzir um produto de açúcar fermentável.

Em outra realização, matérias-primas integradas são tratadas esacarificadas em um método que compreende:

a. fornecimento de biomassa;

b. submissão da biomassa de a) a um processo de pré-tratamento para fabricar um produto de biomassa previamente tratado;

c. adição ao produto de biomassa previamente tratada de b)de pelo menos um fluxo de alimentação alternativo para produzir uma primeiraou segunda matéria-prima integrada ; e

d. contato da primeira ou segunda matéria-prima integradade c) com uma associação de enzimas de sacarificação sob condiçõesapropriadas;

para produzir um produto de açúcar fermentável. Em um aspectodo presente método, o processo de pré-tratamento de b) inclui o contato dabiomassa com solução aquosa que compreende amônia para formar umamistura de biomassa e amônia aquosa, em que a amônia está presente emconcentração pelo menos suficiente para manter pH alcalino da mistura debiomassa e amônia aquosa, mas em que a mencionada amônia está presente emmenos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco de biomassa e,adicionalmente, em que o peso seco de biomassa encontra-se em altaconcentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso com relação aopeso da mistura de biomassa e amônia aquosa. Em aspecto adicional do presentemétodo, o fluxo de alimentação alternativo que é adicionado ao produto debiomassa previamente tratada de b) compreende destilação produzida durante oprocessamento de sementes. Em ainda outro aspecto, a biomassa de a) pode ounão ser matéria-prima integrada conforme descrito no presente.

Os açúcares fermentáveis resultantes dos métodos descritos nopresente podem ser utilizados em seguida para a produção de substânciascom valor agregado, combustíveis ou outros produtos com alto valor.

Descrição Detalhada da Invenção

Os depositantes incorporam especificamente o teor completo detodas as referências mencionadas no presente relatório descritivo. Além disso,quando quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro for fornecido naforma de faixa, faixa preferida ou relação de valores preferíveis superiores e valorespreferíveis inferiores, deve-se compreender isso como descrevendoespecificamente todas as faixas formadas a partir de qualquer par de qualquer limitede faixa superior ou valor preferido e qualquer limite de faixa inferior ou valorpreferido, independentemente de se as faixas são descritas separadamente.

Quando uma série de valores numéricos for indicada no presente, a menos queinformado em contrário, a faixa destina-se a incluir os seus pontos finais e todos osnúmeros inteiros e frações dentro da faixa. Não se pretende que o escopo dapresente invenção seja limitado aos valores específicos indicados ao definir faixa.

A presente invenção fornece métodos de tratamento de biomassae fluxos de alimentação alternativos, denominados coletivamente "matérias-primas integradas", para produzir açúcares fermentáveis. Os açúcaresfermentáveis podem ser utilizados em seguida para a produção de substânciascom valor agregado, combustíveis ou outros produtos com alto valor.

Os fluxos de alimentação alternativos incluem pelo menos um co-produto com baixo valor, fluxo de processamento e/ou fluxo de resíduos deprocessamento industrial.

A biomassa e fluxos de alimentação alternativos podem sercombinados para formar matéria-prima integrada para o processamento depré-tratamento para atingir pré-tratamento concorrente de biomassa e o fluxode processo ou co-produto. Alternativamente, biomassa não integrada pode serpreviamente tratada, o fluxo de processo ou co-produto adicionado à biomassapreviamente tratada, formando segunda matéria-prima integrada parasacarificação. Nos dois casos, é incluída etapa de pré -tratamento em quebiomassa não integrada ou matéria-prima integrada em concentraçãorelativamente alta é tratada com concentração relativamente baixa de amôniacom relação ao peso seco do material inicial e o produto tratado com amônia édigerido em seguida com uma associação de enzimas de sacarificação paraproduzir açúcares fermentáveis. Os açúcares fermentáveis são convertidos porbiocatalisadores em produtos alvo com alto valor, tais como substâncias,plásticos e combustíveis.

Definições:

No presente relatório descritivo, é utilizada uma série de termos.

São fornecidas as definições a seguir:

A expressão "açúcar fermentável" designa oligossacarídeos emonossacarídeos que podem ser utilizados como fonte de carbono pormicroorganismo em processo de fermentação.

O termo "lignocelulósico" designa composição que compreendelignina e celulose. Material lignocelulósico pode também compreenderhemicelulose.

O termo "celulósico" designa composição que compreendecelulose.

Por "peso seco" de biomassa, indica-se o peso da biomassa quepossui toda ou essencialmente toda a água removida. Peso seco é tipicamentemedido de acordo com o Padrão E1756-01 da Sociedade Norte-Americana deTestes e Materiais (ASTM) (Standard Test Method for Determination of TotalSolids in Biomass) ou o Padrão T-412 om-02 da Technical Association of thePulp and Paper Industry1 Inc. (TAPPI) (Moisture in Pulp, Paper andPaperboard).

A expressão "substância alvo" designa substância produzida pormeio de fermentação. Substância é utilizada em sentido amplo e incluimoléculas tais como proteínas, que incluem, por exemplo, peptídeos, enzimase anticorpos.

Substância alvo que "pode ser derivada de biomassa" ésubstância alvo produzida por processo por meio do qual biomassa éhidrolisada para liberar açúcares fermentáveis e os açúcares fermentáveis sãofermentados utilizando pelo menos um biocatalisador para produzir substânciaalvo desejada.

As expressões "plastificante" e "agente amolecedor" designammateriais que causam redução das forças intermoleculares coesivas ao longodas cadeias de polímero ou entre elas. Esses materiais podem agir, porexemplo, para reduzir a cristalinidade ou romper uniões entre fibras decarboidrato de Iignina e não de Iignina (tais como celulose ou hemicelulose).

O termo "sacarificação" designa a produção de açúcaresfermentáveis a partir de polissacarídeos.

A expressão "biomassa previamente tratada" indica biomassa quetenha sido submetida a pré-tratamento antes da sacarificação.

"Biomassa" indica qualquer material celulósico ou lignocelulósicoe inclui materiais que compreendem celulose, compreendendo aindaopcionalmente hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/oumonossacarídeos. Biomassa pode também compreender componentesadicionais, tais como proteína e/ou lipídio. Segundo a presente invenção,biomassa pode ser derivada de uma única fonte, ou biomassa podecompreender mistura derivada de mais de uma fonte; biomassa poderácompreender, por exemplo, mistura de espigas de milho e forragem de milhoou mistura de grama e folhas. Biomassa inclui, mas sem limitar-se a safrasbioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduo sólidoindustrial, lodo de fabricação de papel, resíduos de jardins, resíduos demadeira e de florestas. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitar-se agrãos de milho, espigas de milho, resíduos de safras tais como cascas demilho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha decevada, palha de arroz, brotos de grama, resíduos de papel, bagaço de canade açúcar, sorgo, soja, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira,serragem, arbustos e moitas, legumes, frutas, flores e esterco animal. Em umarealização, biomassa que é útil para a presente invenção inclui biomassa quepossui valor de carboidrato relativamente alto, é relativamente densa e/ou decoleta, transporte, armazenagem e/ou manipulação relativamente fácil. Emrealização da presente invenção, biomassa que é útil inclui espigas de milho,forragem de milho e bagaço de cana de açúcar.

"Fluxo de alimentação alternativo" ou "matéria-prima alternativo" incluiuma série de materiais que poderão beneficiar-se do processo geral de conversãode biomassa em açúcares fermentáveis para a produção de substâncias com valoragregado e/ou combustíveis. Estes fluxos de alimentação podem ser produzidospor meio de processamento industrial, incluindo processamento de grãos ousementes, processamento de alimentos, processamento de papel e polpa etc. Umtipo desse material inclui co-produtos e resíduos do processamento de grãos ououtras sementes, que incluem processamento por moagem seca de milho, moagemseca de milho e moagem úmida de milho. Conforme descrito no presente, emalgumas realizações, processamento industrial e/ou de resíduos agrícolas fornecemateriais fibrosos que podem ser incorporados a processamento de pré-tratamento.Em outras realizações, fluxos de processamento industrial ou outros fluxos dealimentação (tais como fluxos de resíduo ou com baixo valor) podem serincorporados a biomassa após o pré-tratamento para beneficiar-se de etapas deprocessamento de biomassa adicionais que incluem sacarificação e fermentação.Fontes não limitadoras de fluxos de resíduos e de baixo valor que podem comporfluxo de alimentação alternativo incluem resíduos agrícolas, tais como cascas demilho e outras safras, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, lododa fabricação de papel, resíduos de jardins, resíduos de madeiras e florestas.

"Matérias-primas integradas" ou "fluxos de alimentaçãointegrados" indica uma combinação de biomassa e pelo menos um fluxo dealimentação ou matéria-prima alternativo.

Para os propósitos da presente invenção, "solução aquosa quecompreende amônia" designa o uso de gás amônia (NH3), compostos quecompreendem íons de amônio (NH4+) tais como hidróxido de amônio ou sulfatode amônio, compostos que liberam amônia mediante degradação tais comouréia e suas combinações em meio aquoso.

Matéria-prima integrada para pré-tratamento:

Aspecto do método do presente inclui a combinação de qualquermatéria-prima de biomassa com pelo menos um fluxo de alimentaçãoalternativo que é compreendido de co-produto de baixo valor ou fluxo deprocessamento industrial, tal como fluxo de resíduos.

Conforme descrito acima, o processamento industrial para ageração de produtos com alto valor, tais como óleo, amido, proteína, xarope deaçúcar e etanol, freqüentemente gera co-produtos com baixo valor, fluxos noprocesso e fluxos residuais. Nos métodos do presente, estes co-produtos sãocapturados para reciclagem de volta para fluxos de processamento de produtoscom alto valor ou utilizados para beneficiar-se do processamento para aprodução de combustíveis e substâncias com valor agregado.

Em aspecto do método reivindicado, co-produto deprocessamento de grãos ou outras sementes ou fluxo de processo que incluifibra pode ser combinado com outra biomassa para fornecer matéria-primaintegrada que é tratada previamente.

Os materiais de interesse que compreendem a matéria-primaalternativa incluem co-produtos de baixo valor, fluxos em processo e fluxosresiduais; que, juntos, são denominados fluxos alternativos. Co-produto debaixo valor, por exemplo, é aquele que é vendido para ração animal. Exemplosde baixos fluxos de processo de sementes com baixo teor de amido ou alto teorde óleo incluem fluxos de cascas que são separados no processamento desojas, sementes de girassol, amendoins e sementes de algodão. Fluxosresiduais que contêm material fibroso podem também ser utilizados napreparação de matéria-prima integrada para pré-tratamento. As matérias-primas integradas para pré-tratamento podem incluir material que contém fibraproduzido no processamento de qualquer semente, tal como milho, aveia, trigo,cevada, arroz, canola, girassol, algodão, ervilha, soja e outros legumes.

Grãos de soja são tipicamente processados nos Estados Unidospor meio de extração de solvente com hexano para recuperar o óleo. Os grãossão limpos e podem ser secos e mantidos até o equilíbrio em umidade de ΙΟ-11% para facilitar a liberação do revestimento ou da casca de semente. Elessão partidos em seguida, descascados por meio de peneiramento ou aspiraçãoe condicionados por meio de tratamento com fluxo (qv) para facilitar a formaçãode flocos. As carnes condicionadas são transformadas em flocos e extraídascom hexano para remover o óleo. Hexano e o óleo na micela são separadospor meio de evaporação é o hexano é recuperado (Kirk-Othmer Encyclopediaof Chemical Technology, quarta edição, 1997). Os revestimentos ou cascas desementes removidos durante esse processamento podem ser utilizados comofluxo de alimentação integrado no método do presente.

O processamento de girassóis consiste de pressão de rosca,extração direta com hexano ou extração de solvente antes da pressão. Esteúltimo é mais comumente utilizado nos Estados Unidos. A primeira etapa élimpeza, seguida por descascamento. A semente descascada é condicionadapor meio de aquecimento e então segue para prensas de rosca ou étransformada em flocos como no caso de extração direta de solvente comhexano. O aglomerado prensado por rosca é moído para uso em alimentaçõesou granulado e extraído por hexano para recuperar o óleo restante (Kirk-thmerEncycIopedia of Chemical Technology, quarta edição, 1997). As cascasremovidas durante esse processamento podem ser utilizadas como fluxo dealimentação integrado no método do presente.

O processamento de amendoins em óleo de amendoim éconduzido por meio de prensa por rosca ou prensa prévia, seguida porextração de solvente. Em pressão de rosca, os amendoins são descascados,cozidos e prensados para gerar óleo bruto mais aglomerado que contém cercade 5% de óleo residual. O aglomerado é moído e as cascas de amendoimmoídas são misturadas de volta para ajustar o teor de proteína. Em extração desolvente em processamento prévio, as carnes cozidas são prensadas comrosca sob baixa pressão para remover parte do óleo e extraídas em seguidacom hexano para reduzir o óleo residual para cerca de 1%. Hexano residual noalimento é recuperado por meio de aplicação de camisa ou fluxo vivo emretirador de solvente. Hexano na micela é recuperado por meio de evaporação(Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, quarta edição, 1997). Ascascas removidas durante esse processamento podem ser utilizadas comofluxo de alimentação integrado no método do presente.

Sementes de algodão nos Estados Unidos são processadas em óleoe massa por meio de pressão de rosca ou extração de solvente. Em pressão derosca, a semente é limpa, desfibrada, descascada, transformada em flocos e cozidaantes da prensa. Rendimentos de prensa de rosca geram aglomerado que contém2,5-4,0% de óleo residual. O aglomerado é moído em massa e cascas de sementede algodão moídas são misturadas de volta para ajustar teor de proteína empadrões de comercialização. No procedimento de extração de solvente, os flocossão freqüentemente processados por meio de expansor para cozinhar rapidamenteos flocos e formar aros, que são extraídos em seguida com hexano. A massaemergente dos extratores de solvente é liberada de hexano por meio deaquecimento (Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, quarta edição,1997). As cascas removidas durante esse processamento podem ser utilizadascomo fluxo de alimentação integrado no método do presente.

Fluxos de processamento de grãos incluem fluxo de fibrascomposto de cascas que é produzido durante a moagem seca, resíduos demoagem fibrosa de moagem úmida, fluxos de grãos exauridos produzidos emvários processos e os grãos secos e solúveis de destilador (DDGS) e grãossecos de destilador (DDG) resultantes dos processos de moagem seca. DDGSinclui fibra, óleo, proteína e levedura e é o material restante após a remoção deetanol da mistura de fermentação. Os sólidos são filtrados para produzir afração de DDG, que é vendida para ração animal. A fração líquida restante(destilação) pode ser reciclada de volta na forma de fluxo em processo ouevaporada e combinada com DDG para formar o co-produto DDGS.

Outro exemplo de fonte potencial para fluxos de alimentaçãoalternativos incluem processamento de raízes, tais como processamento debeterrabas, batatas (brancas ou doces) etc. No processamento de beterrabapara a produção de açúcar, o açúcar é removido por meio de extraçãocontracorrente com água. Os sólidos de beterraba residuais, ou polpa, quesaem do aparelho de extração são pressionados para remover água e reduzir onível de umidade para cerca de 75%. Esta polpa prensada pode ser vendidacomo se encontra para operações de alimentação local, mas é maiscomumente misturada com melaços, seca a cerca de 10% de umidade evendida como ração para gado. (Kirk-Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology, quarta edição, 1997). Esta polpa prensada pode ser utilizadacomo fluxo de alimentação integrado no método do presente.

Os fluxos de alimentação alternativos utilizados no método dopresente, além de material de processo fibroso, podem também conterquantidades menores de componentes que incluem proteína, óleo e/ou amido.

Os depositantes revelaram que a combinação de materiais desementes processados, amido e/ou óleo com biomassa que é tipicamenteutilizado em pré-tratamento, não apresenta impacto negativo sobre orendimento de açúcares fermentáveis produzidos no tratamento desacarificação a seguir do matéria-prima integrada e previamente tratadoutilizando o método do presente. Além disso, o rendimento de açúcar esperadoproduzido a partir da matéria-prima integrada no método do presente pode serbaseado no teor celulósico total (incluindo hemicelulósico) da matéria-primaintegrada. Desta forma, os fluxos de processamento de sementes podem seradicionados a outra biomassa para pré-tratamento e a fibra no fluxo deprocessamento é tratada previamente junto com a outra biomassa napreparação para sacarificação, para produzir açúcares fermentáveis. A eficáciado uso desta matéria-prima integrada para pré-tratamento fornece matéria-prima abundante, de baixo custo e continuamente disponível para instalaçõesde processamento de biomassa.

Pré-tratamento:

A concentração de amônia utilizada no pré-tratamento de matéria-prima integrada no método do presente é no mínimo concentração que ésuficiente para manter alcalino o pH da mistura de matéria-prima integrada eamônia aquosa e no máximo menos de cerca de 12% em peso com relação aopeso seco de matéria-prima integrada . Esta baixa concentração de amônia ésuficiente para pré-tratamento e a baixa concentração pode também ser demenos de cerca de 10% em peso com relação ao peso seco de matéria-primaintegrada . Concentração muito baixa de 6% de amônia com relação ao pesoseco de matéria-prima integrada ou menos pode também ser utilizada parapré-tratamento. Por alcalino, indica-se pH de mais de 7,0. É particularmenteapropriado pH da mistura de matéria-prima integrada e amônia aquosa que éde mais de 8. Em uma realização, amônia está presente em menos de cercade 8% em peso com relação ao peso seco de matéria-prima integrada . Emuma realização, amônia está presente em menos de cerca de 10% em pesocom relação ao peso seco de matéria-prima integrada . É particularmenteapropriada amônia a menos de cerca de 6% em peso com relação ao pesoseco de matéria-prima integrada .

Amônia, da forma utilizada no processo do presente, fornecevantagens sobre outras bases. Amônia particiona-se em fase líquida e fase devapor. Amônia gasosa pode difundir-se mais facilmente através da biomassaque base líquida, o que resulta em pré-tratamento mais eficaz emconcentrações mais baixas. Amônia também concorre com hidrólise, por meiode amonólise, de acetil ésteres em biomassa para formar acetamida (conformeexibido em CL2825, que é incorporado ao presente como referência, Exemplo11). Acetamida é menos tóxica que acetato para certos organismos defermentação, tais como Zymomonas mobilis (conforme exibido em CL2825,que é incorporado ao presente como referência, Exemplo 12). Desta forma, aconversão de acetil ésteres em acetamida em vez de ácido acético reduz anecessidade de remoção de ácido acético. O uso de amônia também reduz anecessidade de suplementar meio de crescimento utilizado durantefermentação com fonte de nitrogênio. Além disso, amônia é material de baixocusto e, desta forma, fornece processo econômico. Amônia pode também serreciclada para o reator de pré-tratamento durante pré-tratamento ou após pré-tratamento, de forma a permitir processo mais econômico. Após o pré-tratamento, por exemplo, à medida que a temperatura é reduzida para aapropriada para sacarificação, gás amônia pode ser liberado, opcionalmente napresença de vácuo, e pode ser reciclado. Em processo contínuo, amônia podeser continuamente reciclada.

Segundo o método do presente, a solução aquosa quecompreende amônia pode compreender opcionalmente pelo menos uma baseadicional, tal como hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido depotássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio. Apelo menos uma base adicional pode ser agregada em quantidade que écombinada com amônio para formar quantidade de base total que é de menosde cerca de 20% em peso com relação ao peso seco de biomassa.

Preferencialmente, a segunda base total mais amônia encontra-se emquantidade que é de menos de cerca de 15% em peso. Pode-se utilizar, porexemplo, base(s) adicional(is) para neutralizar ácidos em biomassa, parafornecer íons metálicos para as enzimas de sacarificação ou para fornecer íonsmetálicos para o meio de crescimento de fermentação.

No método do presente, o peso seco de matéria-prima integradaencontra-se em concentração inicial de pelo menos cerca de 15% até cerca de 80%do peso da mistura de matéria-prima integrada e amônia aquosa. Maisadequadamente, o peso seco de matéria-prima integrada encontra-se emconcentração de cerca de 15% a cerca de 60% do peso da mistura de matéria-prima integrada e amônia aquosa. O percentual de matéria-prima integrada namistura de matéria-prima integrada e amônia aquosa é mantido alto para minimizara necessidade de concentração de açúcares resultante da sacarificação da matéria-prima integrada previamente tratada, para uso em fermentação. A altaconcentração de matéria-prima integrada também reduz o volume total de materialde pré-tratamento, o que toma o processo mais econômico.

A matéria-prima integrada pode ser utilizada diretamenteconforme obtida por meio das fontes ou a energia pode ser aplicada à matéria-prima integrada para reduzir o tamanho, aumentar a extensão exposta e/ouaumentar a disponibilidade de celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeospresentes na matéria-prima integrada para amônia e enzimas de sacarificaçãoutilizadas na segunda etapa do método. Meios de energia úteis para reduçãodo tamanho, aumento da extensão exposta e/ou aumento da disponibilidade decelulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na matéria-primaintegrada para amônia e enzimas de sacarificação incluem, mas sem limitar-sea moagem, fragmentação, quebra, retalhamento, corte, refino em disco,ultrassom e microondas. Esta aplicação de energia pode ocorrer antes oudurante o pré-tratamento, antes ou durante a sacarificação ou qualquer de suascombinações.

O pré-tratamento de matéria-prima integrada com solução deamônia é conduzido em qualquer recipiente apropriado. Tipicamente, orecipiente é aquele que pode suportar pressão, possui mecanismo deaquecimento e possui mecanismo de mistura do conteúdo. Os recipientesdisponíveis comercialmente incluem, por exemplo, o reator Zipperclave®(Autoclave Engineers1 Erie, PA), o reator Jaygo (Jaygo Manufacturing, Inc.,Mahwah, NJ) e o reator de pistola de vapor (Autoclave Engineers1 Erie, PA).Reatores em escala muito maior com capacidades similares podem serutilizados. Alternativamente, a matéria-prima integrada e a solução de amôniapodem ser combinadas em um recipiente e transferidas em seguida para outroreator. Além disso, matéria-prima integrada pode ser previamente tratada emum recipiente e processada adicionalmente em seguida em outro reator talcomo o reator de pistola de vapor (Autoclave Engineers1 Erie, PA).

Antes do contato da matéria-prima integrada com solução aquosaque compreende amônia, pode-se aplicar vácuo ao recipiente que contém amatéria-prima integrada. Evacuando-se ar dos poros da matéria-primaintegrada, pode-se atingir melhor penetração da amônia na matéria-primaintegrada. O período de tempo para aplicação de vácuo e a quantidade depressão negativa que é aplicada à matéria-prima integrada dependerão do tipode matéria-prima integrada e podem ser determinados empiricamente, deforma a atingir pré-tratamento ideal da matéria-prima integrada (conformemedido por meio da produção de açúcares fermentáveis após a sacarificação).

O contato da matéria-prima integrada com solução aquosa quecompreende amônia é conduzido sob temperatura de cerca de 4 0C a cerca de200 0C. Foi revelado que contato inicial da matéria-prima com amônia a 4 0C1que permite a impregnação a esta temperatura, aumenta a eficiência desacarificação. Em outra realização, o mencionado contato da matéria-primaintegrada é conduzido sob temperatura de cerca de 75 0C a cerca de 150 0C.Em ainda outra realização, o mencionado contato da matéria-prima integrada éconduzido sob temperatura de mais de 90 0C a cerca de 150 0C.

O contato da matéria-prima integrada com solução aquosa quecompreende amônia é conduzido por período de tempo de até cerca de oitohoras. São possíveis períodos de pré-tratamento mais longos, mas período detempo mais curto é preferível por razões econômicas práticas.

Em uma realização, o processo de pré-tratamento pode serrealizado em temperatura relativamente alta por período de temporelativamente curto, tal como cerca de 100 0C a cerca de 150 0C por cerca decinco minutos a cerca de duas horas. Em outra realização, o processo de pré-tratamento pode ser realizado sob temperatura mais baixa por período detempo relativamente longo, tal como cerca de 75 0C a cerca de 100 0C porcerca de duas horas a cerca de oito horas. Em ainda outra realização, oprocesso de pré-tratamento pode ser realizado à temperatura ambiente (cercade 22-26 0C) por período de tempo ainda mais longo de cerca de 24 horas.Outras combinações de tempo e temperatura intermediárias a estas podemtambém ser utilizadas.

Para o processo de pré-tratamento, a temperatura, tempo de pré-tratamento, concentração de amônia, concentração de uma ou mais basesadicionais, concentração de matéria-prima integrada , tipo de matéria-primaintegrada e tamanho de partículas de matéria-prima integrada sãorelacionados; desta forma, estas variáveis podem ser ajustadas conforme onecessário para obter produto ideal a ser colocado em contato com umaassociação de enzimas de sacarificação.

Plastificante, agente amolecedor ou sua combinação, tal como polióis(por exemplo, glicerol, etileno glicol), ésteres de polióis (tais como monoacetato deglicerol), éteres de glicol (tais como dietileno glicol), acetamida, etanol eetanolaminas, podem ser adicionados no processo de pré-tratamento (ou seja,etapa (a)). Pode-se adicionar plastificante como componente da solução de amôniaaquosa, na forma de solução separada, ou como componente seco.

A reação de pré-tratamento pode ser realizada em qualquerrecipiente apropriado, tal como reator em bateladas ou reator contínuo. Ostécnicos no assunto reconhecerão que, sob temperaturas mais altas (acima de100°C), é necessário recipiente sob pressão. O recipiente apropriado pode serequipado com meios, tais como impulsores, para agitar a mistura de biomassae amônia aquosa. Projeto de reator é discutido em Lin, K-H. e Van Ness, H. C.(em Perry, R. H. e Chilton, C. H. (eds.), Chemical Engineer1S Handbook, quintaedição (1973), Capítulo 4, McGraw-HiII, NY. A reação de pré-tratamento podeser conduzida na forma de processo em bateladas ou processo contínuo.

Os técnicos no assunto sabem bem que fonte de nitrogênio énecessária para crescimento de microorganismos durante a fermentação; destaforma, o uso de amônia durante o pré-tratamento fornece fonte de nitrogênio ereduz ou elimina a necessidade de suplemento do meio de crescimentoutilizado durante a fermentação com fonte de nitrogênio. Caso o pH do produtode pré-tratamento exceda aquele em que as enzimas de sacarificação sãoativas ou exceda a faixa apropriada para crescimento microbiano emfermentação, podem ser utilizados ácidos para reduzir o pH. A quantidade deácido utilizada para atingir o pH desejado pode resultar na formação de sais emconcentrações que são inibidoras para enzimas de sacarificação oucrescimento microbiano. A fim de reduzir a quantidade de ácido necessáriapara atingir o pH desejado e reduzir o custo da matéria prima de NH3 noprocesso de pré-tratamento do presente, gás amônia pode ser evacuado doreator de pré-tratamento e reciclado.

A fim de obter quantidades suficientes de açúcares de matéria-prima integrada, a matéria-prima integrada pode ser previamente tratada comsolução de amônia aquosa uma vez ou mais de uma vez. De forma similar,reação de sacarificação pode ser realizada uma ou mais vezes. Processos depré-tratamento e sacarificação podem ser realizados uma ou mais vezes.

Processos de pré-tratamento e sacarificação podem ser repetidos se desejado,para obter rendimentos de açúcares mais altos. Para determinar odesempenho dos processos de pré-tratamento e sacarificação, separadamenteou em conjunto, o rendimento teórico de açúcares que podem ser derivados damatéria-prima integrada inicial pode ser determinado e comparado comrendimentos medidos.

Após o pré-tratamento, o produto compreende mistura de amônia,matéria-prima integrada parcialmente degradado e açúcares fermentáveis.

Antes de processamento adicional, amônia pode ser removida da matéria-prima integrada previamente tratado por meio de aplicação de vácuo. Aremoção de amônia reduz o pH e, desta forma, menos ácido neutralizante éutilizado para obter o pH desejado para sacarificação e fermentação. Issoresulta em carga de sal mais baixa na mistura de pré-tratamento. Tipicamente,permanece alguma amônia, que é desejada para fornecer fonte de nitrogêniopara fermentação.

Em realização preferida, toda a mistura de pré-tratamento quecompreende frações solúveis e insolúveis é utilizada em reação de sacarificação.

Em outra realização, antes de sacarificação, a fração aquosa que compreendeamônia e açúcares solubilizados pode ser separada de particulados insolúveis quepermanecem na mistura. Os métodos de separação das frações solúveis dasinsolúveis incluem, mas sem limitar-se a decantação e filtragem. Os particuladosinsolúveis podem ser reciclados para o reator de pré-tratamento. Os particuladosinsolúveis podem ser opcionalmente lavados com solvente aquoso (tal comoágua) para remover açúcares adsorvidos antes da reciclagem para o reator depré-tratamento. A fração insolúvel pode ser submetido em seguida a tratamentoadicional com solução de amônia aquosa conforme descrito acima para pré-tratamento, seguido por sacarificação com uma associação de enzimas desacarificação. A fração solúvel pode também ser concentrada antes dasacarificação utilizando processo apropriado, tal como evaporação.

Segunda Matéria-prima Integrada - combinação apóspré-tratamento:

Em outro aspecto do método do presente, fluxo de alimentaçãoalternativo, tal como fluxo de processamento de sementes, é combinado combiomassa previamente tratada para fornecer segunda matéria-prima integradaque é sacarificada. A biomassa previamente tratada é um material que tenhasido previamente tratado conforme descrito no presente, substituindo biomassapor matéria-prima integrada ou fluxo de alimentação alternativo, tal comomencionado acima, fluxo de processamento de sementes é combinado commatéria-prima integrada previamente tratada para fornecer uma segundamatéria-prima integrada que é sacarificada.

Para o fluxo de alimentação alternativo que é fluxo deprocessamento de sementes, o fluxo de processamento de sementes que podeser combinado com material previamente tratado inclui material que possuigeralmente baixo teor de fibras, tal como o fluxo de destilação descrito acima nopresente ou líquido de infusão de milho. É particularmente útil fluxo deprocessamento de sementes que forneça característica ou componente que sejabenéfico para a sacarificação e/ou produto de açúcar de fermentação. Benefícioque pode ser fornecido por fluxo de processamento de sementes é o ajuste do pHdo material previamente tratado. Fluxo de processamento de sementes que éácido é de uso específico quando o processo de pré-tratamento for conduzido sobpH alcalino. É geralmente útil reduzir o pH antes da sacarificação, para coincidircom o pH ideal da associação de enzimas de sacarificação. A destilação demoagem seca e fermentação de etanol descrita acima, por exemplo, possuitipicamente pH de cerca de 3 e 5. A adição de destilação a material previamentetratado reduzirá o pH do processo de sacarificação.

Neste método, em que fluxo de alimentação alternativo éintegrado a biomassa previamente tratada (a biomassa pode ou não serbiomassa integrada previamente tratada), o método de pré-tratamento não élimitador. A biomassa previamente tratada pode haver passado por outrosmétodos convencionais de pré-tratamento, tais como hidrólise ácida ou outrosmétodos de pré-tratamento conhecidos na técnica (vide, por exemplo, aPatente Norte-Americana n° 5.916.780).

Em um aspecto deste método, o fluxo de alimentaçãoalternativo é composto de resíduo de destilação. O resíduo de destilaçãotipicamente contém aminoácidos e outros nutrientes da fermentação delevedura que é benéfica em produto de açúcar de fermentação. Destaforma, o produto de açúcar de fermentação resultante da sacarificação dematéria-prima integrada pode conter açúcares fermentáveis, bem comooutros nutrientes derivados de fluxo de processamento de sementes. Apresença dos nutrientes pode resultar em necessidade reduzida paranutrientes adicionais no produto de sacarificação antes do seu uso emfermentações de biocatalisadores.Sacarificação:

No método do presente, as matérias-primas a seguir podem sersacarificadas: 1) matéria-prima integrada e previamente tratada; 2) matéria-prima integrada e previamente tratada que é combinada após o pré-tratamentocom pelo menos um fluxo de alimentação alternativo para formar uma segundamatéria-prima integrada que é sacarificada; ou 3) biomassa não integradapreviamente tratada que é combinada com pelo menos um fluxo dealimentação alternativo após o pré-tratamento para formar uma segundamatéria-prima integrada. No presente método, uma ou mais das matérias-primas integradas descritas acima, com numeração 1-3, é hidrolisada napresença da associação de enzimas de sacarificação para liberaroligossacarídeos e/ou monossacarídeos em hidrolisado. A sacarificação nométodo do presente é de matéria-prima integrada, caso a integração ocorraantes do pré-tratamento, após o pré-tratamento ou ambos. Enzimas desacarificação e métodos de tratamento de biomassa são analisados em Lynd,L. R. et al (Microbiol. Mol. Bioi Rev. (2002) 66: 506-577).

Em aspecto do método do presente, antes da sacarificação, afração aquosa que compreende amônia e açúcares solubilizados pode serseparada de particulados insolúveis restantes na mistura. Métodos deseparação das frações solúveis das insolúveis incluem, mas sem limitar-se adecantação e filtragem. Os particulados insolúveis podem ser reciclados parareator de pré-tratamento. Os particulados insolúveis podem ser opcionalmentelavados com solvente aquoso (tal como água) para remover açúcaresadsorvidos antes da reciclagem para o reator de pré-tratamento. A fraçãoinsolúvel pode ser submetida em seguida a tratamento adicional com soluçãode amônia aquosa conforme descrito acima para pré-tratamento, seguido porsacarificação com uma associação de enzimas de sacarificação. A fraçãosolúvel pode também ser concentrada antes da sacarificação utilizandoprocesso apropriado, tal como evaporação.

Antes da sacarificação, o produto de pré -tratamento pod e sertratado para alterar o pH, composição ou temperatura de tal forma que asenzimas da associação de enzimas de sacarificação sejam ativas. O pH podeser alterado por meio da adição de fluxo de alimentação alternativo, conformedescrito no presente acima ou de ácidos em forma sólida ou líquida.

Alternativamente, dióxido de carbono (CO2), que pode ser recuperado dafermentação, pode ser utilizado para reduzir o pH. CO2, por exemplo, pode serrecolhido de fermentador e alimentado, tal como por meio de borbulhamento,para o produto de pré-tratamento, monitorando ao mesmo tempo o pH, atéatingir-se o pH desejado. A temperatura pode ser trazida para temperatura queseja compatível com a atividade de enzimas de sacarificação, conformeindicado abaixo. Quaisquer co-fatores necessários para a atividade de enzimasutilizadas em sacarificação podem ser adicionados.

A associação de enzimas de sacarificação compreende uma oumais enzimas selecionadas principal, mas não exclusivamente, a partir dogrupo "glicosidases" que hidrolisam as ligações éter de di-, oligo- epolissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x(,Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA comSuplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento4 (1997) e Suplemento 5 (em Eur. J. Biochem. (1994) 223: 1-5, Eur; J.Biochem. (1995) 232: 1-6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1-5, Eur. J. Biochem.(1997) 250: 1-6 e Eur. J. Biochem. (1999) 264: 610-650, respectivamente)) dogrupo geral "hidrolases" (EC 3). Glicosidases úteis no método do presentepodem ser categorizadas pelas matérias-primas integradas que elashidrolisam. As glicosidases úteis para o método do presente incluemglicosidases hidrolisantes de celulose (tais como celulases, endoglucanases,exoglucanases, celobiohidrolases, β-glicosidases), glicosidases hidrolisantesde hemicelulose (tais como xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases,glucuronidases) e glicosidases hidrolisantes de amido (tais como amilases, a-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Além disso,pode ser útil adicionar outros aditivos à associação de enzimas desacarificação tais como peptidases (EC 3.4.x.y), Iipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x),Iigninases (EC 1.11.1.x) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73) para ajudar a liberarpolissacarídeos de outros componentes das matérias-primas integradas. Sabe-se bem na técnica que microorganismos que produzem enzimas hidrolisantesde polissacarídeos exibem freqüentemente atividade, tal como degradação decelulose, que é catalisada por várias enzimas ou grupo de enzimas quepossuem diferentes especificidades de substrato. Desta forma, "celulase" demicroorganismo pode compreender grupo de enzimas, todas as quais podemcontribuir com a atividade degradante de celulose. Preparações de enzimascomerciais ou não comerciais, tais como celulase, podem compreendernumerosas enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado paraobter a enzima. Desta forma, a associação de enzimas de sacarificação deacordo com o método do presente pode compreender atividade enzimática, talcomo "celulase", mas reconhece-se que esta atividade pode ser catalisada pormais de uma enzima.

Enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, taiscomo celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) exilanase Multifect® (Genencor). Além disso, enzimas de sacarificação podemser produzidas biologicamente, incluindo utilizando microorganismosrecombinantes.

Os técnicos no assunto saberiam como determinar a quantidadeeficaz de enzimas para uso no consórcio e ajustar condições para atividadeenzimática ideal. Os técnicos no assunto também saberiam como otimizar asclasses de atividades enzimáticas necessárias no consórcio para obtersacarificação ideal de um dado produto de pré-tratamento sob as condiçõesselecionadas.

Conforme indicado acima, fluxos de alimentação alternativos, taiscomo alto teor de fibra e outros fluxos de processamento de sementes quepodem ser utilizados para formar matérias-primas integradas, podem incluircomponente de amido. Este amido pode ser decomposto em açúcaresfermentáveis utilizando as glicosidases hidrolisantes de amido (tais comoamilases, β-amilases, α-amilases, glucoamilases, β-glucosidases, isoamilases).Desta forma, quando fluxo de alimentação alternativo que inclui amido éincorporado antes ou depois do pré-tratamento, é particularmente apropriadoincluir enzimas hidrolisantes de amido durante a sacarificação no processo dopresente para aumentar a produção de açúcar fermentável.

Os fluxos de alimentação alternativos que podem ser utilizadospara formar matérias-primas integradas nos métodos do presente podem incluircomponente de proteína. A proteína pode ser decomposta utilizandopeptidases. Desta forma, quando fluxo de processamento de grãos que incluiproteína for incorporado antes ou depois do pré-tratamento, pode serapropriado incluir enzimas hidrolisantes de proteínas durante a sacarificação noprocesso do presente para melhorar o produto de açúcar fermentável comaminoácidos.

Preferencialmente, a reação de sacarificação é realizada àtemperatura e pH ideais para as enzimas de sacarificação ou perto deles. Atemperatura ideal utilizada com a associação de enzimas de sacarificação nométodo do presente varia de cerca de 15 0C a cerca de 100 0C. Em outrarealização, a temperatura ideal varia de cerca de 20 0C a cerca de 80 0C. O pHideal pode variar de cerca de 2 a cerca de 11. Em outra realização, o pH idealutilizado com a associação de enzimas de sacarificação no método do presentevaria de cerca de quatro a cerca de dez.

A sacarificação pode ser realizada em tempo de cerca de váriosminutos a cerca de 120 horas e, preferencialmente, cerca de vários minutos acerca de 48 horas. O tempo de reação dependerá da concentração e atividadeespecífica de enzimas, bem como o substrato utilizado e as condiçõesambientais, tais como temperatura e pH. Os técnicos no assunto podemdeterminar facilmente condições ideais de temperatura, pH e tempo a seremutilizadas com substrato específico e associação de enzimas de sacarificação.

A sacarificação pode ser realizada em bateladas ou na forma deprocesso contínuo. A sacarificação pode também ser realizada em uma etapaou em uma série de etapas. Enzimas diferentes necessárias para sacarificaçãopodem exibir, por exemplo, pH ou temperatura ideal diferente. Tratamentoprimário pode ser realizado com enzima(s) em uma temperatura e pH, seguidopor tratamentos secundários ou terciários (ou mais) com enzima(s) diferentesem temperaturas e/ou pH diferentes. Além disso, tratamento com enzimasdiferentes em etapas seqüenciais pode ser realizado ao mesmo pH e/outemperatura, tal como utilizando hemicelulases seguidas por celulases.

O grau de solubilização de açúcares a partir das matérias-primasintegradas ou as segundas matérias-primas integradas após a sacarificaçãopode ser monitorado medindo-se a liberação de monossacarídeos eoligossacarídeos. Métodos de medição de monossacarídeos eoligossacarídeos são bem conhecidos na técnica. A concentração de açúcaresredutores pode ser determinada, por exemplo, utilizando o teste de ácido 1,3-dinitrossalicílico (DNS) (Miller, G, L., Anal. Chem. (1959) 31: 426-428).Alternativamente, açúcares podem ser medidos por meio de HPLC utilizandocoluna apropriada conforme descrito no presente no capítulo Métodos Gerais.

Açúcares fermentáveis liberados das matérias-primasintegradas ou as segundas matérias-primas integradas podem ser utilizadospor microorganismos apropriados para a produção de substâncias alvo.

Após a sacarificação, mas antes da fermentação, a mistura de sacarificaçãopode ser concentrada por meio de evaporação, por exemplo, para aumentara concentração de açúcares fermentáveis. Opcionalmente, líquido noproduto de sacarificação pode ser separado de sólidos em método contínuoou por bateladas. Opcionalmente, o líquido ou o produto de sacarificaçãocompleto pode ser esterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s)microorganismo(s) utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizadodurante a sacarificação, o pH pode ser ajustado ao apropriado parafermentação. Além disso, a mistura de sacarificação pode ser suplementadacom nutrientes adicionais necessários para o crescimento microbiano.

Suplementos podem incluir, por exemplo, extrato de levedura, aminoácidosespecíficos, fosfato, fontes de nitrogênio, sais e traços de elementos. Podemtambém ser incluídos componentes necessários para a fabricação deproduto específico elaborado por biocatalisador específico, tal comoantibiótico para manter plasmídeo ou co-fator necessário em reaçãocatalisada por enzimas. Além disso, açúcares adicionais podem serincluídos para aumentar a concentração total de açúcar. A mistura desacarificação pode ser utilizada como componente de caldo de fermentação,por exemplo, compondo cerca de 90% a cerca de 10% do meio final.

Temperatura e/ou gás no espaço superior podem também serajustados, dependendo de condições úteis para o(s) microorganismo(s) defermentação. A fermentação pode ser aeróbica ou anaeróbica. A fermentaçãopode ocorrer após a sacarificação, ou pode ocorrer simultaneamente com asacarificação por meio de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). SSFpode manter baixos os níveis de açúcar produzidos por meio de sacarificação,de forma a reduzir a potencial inibição de produto das enzimas desacarificação, reduzir a disponibilidade de açúcar para microorganismoscontaminantes e aumento da conversão de biomassa previamente tratada emmonossacarídeos e/ou oligossacarídeos.

Substâncias alvo que podem ser produzidas por meio defermentação incluem, por exemplo, ácidos, álcoois, alcanos, alquenos,aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, peptídeos,aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos. Álcoois incluem,mas sem limitar-se a metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol e sorbitol. Os ácidosincluem ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3-hidroxipropiônico,ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico eácido levulínico. Os aminoácidos incluem ácido glutâmico, ácido aspártico,metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Substânciasalvo adicionais incluem metano, etileno, acetona e enzimas industriais.

A fermentação de açúcares em substâncias alvo pode serconduzida por um ou mais biocatalisadores apropriados em fermentaçõesde etapa única ou múltiplas. Biocatalisadores podem ser microorganismosselecionados a partir de bactérias, fungos filamentosos e leveduras.Biocatalisadores podem ser microorganismos do tipo selvagem oumicroorganismos recombinantes e incluem Escherichia, Zymomonas,Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus eClostridium. Em outra realização, biocatalisadores podem serselecionados a partir do grupo que consiste de Escherichia colirecombinante, Zymomonas mobilis, Bacillus stearothermophilus,Saecharomyces eerevisiae e Pichia stipitis.

Muitos biocatalisadores utilizados em fermentação para produzirsubstâncias alvo foram descritos e outros podem ser descobertos, produzidospor meio de mutação ou elaborados por meios recombinantes. Qualquerbiocatalisador que utilize açúcares fermentáveis produzidos no método dopresente pode ser utilizado para elaborar a(s) substância(s) alvo cuja produçãoseja conhecida, por meio de fermentação no método do presente.

A fermentação de carboidratos em acetona, butanol e etanol(fermentação ABE) por Clostridia solventogênico é bem conhecida (Jones eWoods (1986), Microbiol. Rev. 50: 484-524). Processo de fermentação para aprodução de altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol,utilizando linhagem mutante de Clostridium acetobutylicum, é descrito em US5.192.673. O uso de linhagem mutante de Clostridium beijerinckii para produziraltos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, é descrito em US6.358.717. Linhagens geneticamente modificadas de E. coli também vêmsendo utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol (Underwoodet al (2002), Appl. Environ. Microbiol. 68: 6263-6272). Linhagem geneticamentemodificada de Zymomonas mobilis que possui produção aprimorada de etanolé descrita em US 2003/0162271 A1.

Ácido láctico foi produzido em fermentações por linhagensrecombinantes de E. coli (Zhou et al (2003), Appl. Environ. Microbiol. 69: 399-407),linhagens naturais de Bacillus (US 20050250192) e Rhizopus oryzae (Tay e Yang(2002), Biotechnol. Bioeng. 80: 1-12). Linhagens recombinantes de E. coli vêmsendo utilizadas como biocatalisadores em fermentação para produzir 1,3-propanodiol (US 6.013.494, US 6.514.733) e ácido adípico (Niu et al (2002),Biotechnol. Prog. 18: 201-211). Ácido acético foi fabricado por meio defermentação utilizando Clostridia recombinante (Cheryan et al (1997), Adv. Appl.Microbiol. 43: 1-33) e linhagens de levedura recém identificadas (Freer (2002),Worid J. Microbiol. Biotechnol. 18: 271-275). A produção de ácido succínico por E.coli recombinante e outras bactérias é descrita em US 6.159.738 e por E. colirecombinante mutante em Lin et al (2005), Metab. Eng. 7: 116-127). Ácido pirúvicofoi produzido por levedura Torulopsis glabrata mutante (Li et al <2001), Appl.Microbiol. Technol. 55: 680-685) e por E. coli mutante (Yokota et al (1994), Biosci.Biotech. Biochem. 58: 2164-2167). Linhagens recombinantes de E. coli vêm sendoutilizadas como biocatalisadores para a produção de ácido para-hidroxicinâmico(US 20030170834) e ácido quínico (US 20060003429).

Mutante de Propionibacterium acidipropionici vem sendo utilizadoem fermentação para produzir ácido propiônico (Suwannakham e Yang (2005),Biotechnol. Bioeng. 91: 325-337) e ácido butírico foi elaborado por Clostridiumtyrobutyricum (Wu e Yang (2003), Biotechnol. Bioeng. 82: 93-102). Propionato epropanol foram elaborados por meio de fermentação a partir de treonina porClostridium sp. linhagem 17cr1 (Janssen (2004), Arch. Microbiol. 182: 482-486).Aureobasidium pullulans similar a levedura foi utilizado para elaborar ácidoglucônico (Anantassiadis et al (2005), Biotechnol. Bioeng. 91: 494-501) pormutante de Aspergillus niger (Singh et al (2001), Indian J. Exp. Biol. 39: 1136-43).Ácido 5-ceto-D-glucônico foi elaborado por mutante de Gluconobacter oxydans(Elfari et al (2005), AppL Microbiol. Biotech. 66: 668-674), ácido itacônico foiproduzido por mutantes de Aspergillus terreus (Reddy e Singh (2002), Bioresour.Technol. 85: 69-71), ácido cítrico foi produzido por linhagem mutante deAspergillus niger (Ikram-UI-Haq et al (2005), Bioresour. Technol. 96: 645-648) exilitol foi produzido por Candida guilliermondii FTI 20037 (Mussatto e Roberto(2003), J. AppL Microbiol. 95: 331-337). Biopoliésteres que contêm 4-hidroxivalerato, também contendo quantidades significativas de ácido 3-hidroxibutírico e ácido 3-hidroxivalérico, foram produzidos por Pseudomonasputida e Ralstonia eutropha recombinantes (Gorenflo et al (2001),Biomacromolecules 2: 45-57). L-2,3-butanodiol foi elaborado por E. colirecombinante (Ui et al (2004), Lett. AppL Microbiol. 39: 533-537).

A produção de aminoácidos por meio de fermentação foi realizadautilizando linhagens auxotróficas e linhagens resistentes a análogos de aminoácidosde Corynebacterium, Brevibacterium e Serratia. A produção de histidina utilizandolinhagem resistente a análogo de histidina, por exemplo, é descrita na PatenteJaponesa Publicada n° 8596/81 e utilizando linhagem recombinante é descrita emEP 136.359. A produção de triptofano utilizando linhagem resistente a análogo detriptofano é descrita nas Patentes Japonesas Publicadas n° 4505/72 e 1937/76. Aprodução de isoleucina utilizando linhagem resistente a análogo de isoleucina édescrita nas Patentes Japonesas Publicadas n° 38995/72, 6237/76 e 32070/79. Aprodução de fenilalanina utilizando linhagem resistente a análogo de fenilalanina édescrita na Patente Japonesa Publicada n° 10035/81. A produção de tirosinautilizando linhagem que requer fenilalanina para crescimento, resistente a tirosina(Agr. Chem. Soe. Japan 50 (1) R79-R87 (1976) ou linhagem recombinante (EP263515, EP 332234) e a produção de arginina utilizando linhagem resistente aanálogo de L-arginina {Agr. Biol. Chem. (1972) 36: 1675-1684, Patentes JaponesasPublicadas n° 37235/79 e 150381/82) foram descritas. Fenilalanina também foiproduzida por meio de fermentação em Escherichia coli linhagens ATCC 31882,31883 e 31884. A produção de ácido glutâmico em bactéria corineformerecombinante é descrita em US 6.962.805. A produção de treonina por linhagemmutante de E. coli é descrita em Okamoto e Ikeda (2000), J. Biosci. Bioeng. 89: 87-79. Metionina foi produzida por linhagem mutante de Corynebacterium Iilium (Kumaret al (2005), Bioresour. Technoi 96: 287-294).

Peptídeos, enzimas e outras proteínas úteis também foram elaboradospor biocatalisadores (por exemplo, em US 6.861.237, US 6.777.207, US 6.228.630).

O pré-tratamento e sacarificação de biomassa em açúcaresfermentáveis, seguido por fermentação dos açúcares em substância alvo, éexemplificado em CL2825 (Exemplo 9), que é incorporado ao presente comoreferência, para a produção de etanol a partir de espigas de milho previamentetratadas utilizando Z. mobilis como biocatalisador para a fermentação deaçúcares em etanol. O método de acordo com a pres ente invenção podetambém ser utilizado para a produção de 1,3-propanodiol a partir de biomassa.A biomassa sofre pré-tratamento e sacarificação de acordo com a presenteinvenção; após (ou durante) a sacarificação, E. coli é utilizado para produzir1,3-propanodiol conforme descrito em CL2825 (Exemplo 10).

Substâncias alvo produzidas em fermentação por biocatalisadorespodem ser recuperadas utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Osprodutos podem ser separados de outros componentes de fermentação pormeio de centrifugação, filtragem, microfiltragem e nanofiltragem. Os produtospodem ser extraídos por meio de troca de íons, extração com solvente oueletrodiálise. Agentes floculantes podem ser utilizados para auxiliar naseparação de produtos. Como exemplo específico, 1-butanol bioproduzidopode ser isolado do meio de fermentação utilizando métodos conhecidos natécnica para fermentações de ABE (vide, por exemplo, Durre, Appi Microbiol.Biotechnol. 49: 639-648 (1998), Groot et al, Process. Biochem. 27: 61-75(1992) e suas referências). Sólidos, por exemplo, podem ser removidos domeio de fermentação por meio de centrifugação, filtragem, decantação ousimilares. Em seguida, o 1-butanol pode ser isolado do meio de fermentaçãoutilizando métodos tais como destilação, destilação azeotrópica, extração delíquidos em líquidos, adsorção, extração de gás, evaporação de membrana oupervaporação. A purificação de 1,3-propanodiol a partir de meios defermentação pode ser realizada, por exemplo, submetendo-se a mistura dereação a extração com solvente orgânico, destilação e cromatografia de coluna(US 5.356.812). Solvente orgânico particularmente bom para este processo écicloexano (US 5.008.473). Aminoácidos podem ser recolhidos do meio defermentação por meio de métodos tais como adsorção de resina de troca deíons e/ou cristalização.

Exemplos

Métodos Gerais ε Materiais:

São utilizadas as abreviações a seguir:

"HPLC" é Cromatografia de Líquidos de Alta E ficiência, "C" écentígrado, "kPa" é quiloPascal, "m" é metro, "mm" é milímetro, "kW" équilowatt, 'Vm" é micrômetro, "μΙ" é microlitro, "ml" é mililitro, "I" é litro, "min" éminuto, "mM" é milimolar, "cm" é centímetro, "g" é grama, "kg" é quilograma,"wt" é peso, "h" é hora, "temp." ou "T" é temperatura, "teór." é teórico, "pretreat"é pré-tratamento, "DWB" é peso seco de biomassa.

Ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida,extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), fosfato depotássio, glicose, xilose, triptona, cloreto de sódio e ácido cítrico foram obtidospor meio da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reator de hidrólise enzimática ε pré-tratamento (PEHR):

Aparelho de tratamento de biomassa com dimensões ecaracterísticas exibidas na Figura 2 e descritas no presente acima édenominado Reator PEHR e foi utilizado nos Exemplos a seguir.Resumidamente, reator PEHR de nove litros (construído na NREL, Golden,CO, descrito em detalhes no pedido copendente n° CL3447) possuirecipiente de reação de aço inoxidável de cerca de 15 cm χ 51 cm com lançade injeção para introdução de reagentes de processamento. A lança deinjeção é conectada utilizando junta giratória para porta em tampa sobreuma extremidade do recipiente, que possui porta adicional para acesso aorecipiente. Quatro pás correm no comprimento da parede de recipiente e sãofixadas perpendicularmente à parede. As pás e 22 cilindros de meios deatrito cerâmicos de 3,2 cm χ 3,2 cm (Advanced Ceramics, East Palestine,OH), em livre flutuação no recipiente, aplicam mistura mecânica debiomassa e reagente à medida que o recipiente gira, promovendoassimilação de reagente na biomassa. O reator PEHR é colocado sobreAparelho de Rolo de Produção Celular Bellco (Bélico Technology, Vineland,NJ), que fornece mecanismo de rotação e o reator com aparelho de rolo éabrigado em câmara com temperatura controlada que fornece calor. Acâmara com temperatura controlada consiste de quadro de alumínio parasustentar almofadas isolantes de cortiça em volta do Aparelho de ProduçãoCelular Bélico, ao qual é ligado aquecedor que é controlado por termoparesinseridos através do centro da lança de injeção. Pode-se aplicar vácuo epressão ao recipiente de reação fixando-se fontes externas à portaconectada a lança na tampa.

Métodos Analíticos:

Medição do teor de açúcar, acetamida. ácido láctico ε ácido acético:

Açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose, arabinosee manose) em líquido de sacarificação foram medidos por meio de HPLC(Agilent Modelo 1100, Agilent Technologies, Palo Alto CA) utilizando colunasBio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)com colunas de guarda apropriadas. O pH da amostra foi medido e ajustadoem 5-6 com ácido sulfúrico, se necessário. A amostra foi passada em seguidaatravés de filtro de seringa de 0,2 μηι diretamente para ampola de HPLC. Ascondições de condução de HPLC foram as seguintes:

HPX-87P (para carboidratos):

- Volume de injeção: 10 a 50 μΙ, dependendo da concentração edos limites do detectar.

- Fase móvel: HPLC grau água, 0,2 μητι filtrado e com gasesretirados.

- Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto.

- Temperatura da coluna: 80-85 0C, temperatura da coluna deguarda < 60 0C.

- Temperatura do detectar: o mais perto possível da temperaturada coluna principal.

- Detectar: índice de refração.

- Tempo de condução: 35 minutos de coleta de dados mais quinzeminutos após a condução (com possível ajuste para compostos eluentesposteriores).

Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos):

Volume de injeção: 5 a 10 μl, dependendo da concentração e doslimites do detector.

Fase móvel: 0,01 N ácido sulfúrico, 0,2 μm filtrado e seus gasesretirados.

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto.

Temperatura da coluna: 55 °C.

Temperatura do detector: o mais perto possível da temperatura dacoluna.

Detector: índice de retração.

Tempo de condução: 25 a 75 minutos de coleta de dados.

Após a condução, as concentrações da amostra foramdeterminadas a partir de curvas padrão para cada um dos compostos.

Exemplo 1

Pré-tratamento ε Sacarificacão de Biomassa Combinada que ContémEspigas de Milho ε Diferentes Amostras de Grãos Exauridos em ReatorPEHR

Amostras de grãos exauridos foram preparadas a partir de:

1. Grãos de milho-dente inteiros amarelos n° 2 (adquiridos daAgway).

2. Grãos de milho desgerminados por meio do processoQuick Germ desenvolvido na Universidade de Illinois (Singh e Eckoff (1996),Cereal Chem. 74: 462-466). O material de partida foi obtido por meio da VijaySingh na Universidade de Illinois.

3. Processamento de grãos de milho por meio do processo QuickFiber para remover o gérmen e a fibra da casca (US 6.254.914). O material departida foi obtido por meio da Vijay Singh da Universidade de Illinois.

4. Farinha de cerveja foi obtida por meio da Cargill(Mineápolis, MN).

Grãos exauridos designam sólidos residuais do processamento degrãos nos quais amido é convertido em açúcar. Grãos exauridos foramproduzidos essencialmente por meio de processo de uísque básico. Osmateriais de partida diferentes foram tratados com enzimas degradantes deamido para produzir açúcares e a massa resultante foi filtrada para recuperaros sólidos de aglomerado de filtragem ou grãos exauridos.

Os materiais de partida foram moídos em moinho de amostraFoss (sede norte-americana: Eden Prarie, MN) Cyclotec 1093 (materiais departida 1 e 2 acima) até 250 μηι ou em misturador (materiais de partida 3 e 4acima) e combinados em seguida com água e 200 mM de CaCl2*H20 emrecipiente de reação de vidro agitado encamisado de dois litros. O pH damistura foi ajustado em 6,5 com 1 N NaOH e adicionou-se a metade da a-amilase total (Spezyme ΗΡΑ, Genencor International, Palo Alto, CA). Orecipiente de reação foi aquecido em seguida a 95 0C e a α-amilase restante foiadicionada vinte minutos depois. Após permanecer a 95 0C pelo tempoespecificado, o recipiente foi resfriado a 70 0C e o pH da mistura foi ajustadoem 4,5 com 1 M HCI. Adicionou-se glucoamilase (Gzyme 480, Genencor) e atemperatura foi rebaixada adicionalmente a 50 0C e mantida por uma noite.

Nesse momento, o reator foi resfriado a < 40 0C e o conteúdo foi filtradoatravés de pano de filtro Dacron com tamanho de poro de 10 μηη. Oaglomerado de filtragem foi lavado com água e o aglomerado de filtragem final,ou grãos exauridos, foi seco a 105 0C por uma noite e armazenado àtemperatura ambiente até o uso em experimentos de pré-tratamento.

Condições de reação específicas para cada material de partida sãorelacionadas na Tabela 1 abaixo.Tabela 1

Processamento de Amostras de Grãos Exauridos

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Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordente de cerca de0,95 cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.,Livingston, NJ), seguido por peneiramento com peneira Sweco equipadacom peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Espigas fraturadas foramcarregadas com um tipo de grão exaurido, conforme relacionado na Tabela3, em reator PEHR. Os grãos exauridos foram de cerca de 10% do pesoseco total de biomassa no reator. A carga total de biomassa seca foi decerca de 473 g. Cada reator carregado foi previamente aquecido noincubador de rolo a 95 0C, sem rotação, antes do início do experimento.

Aplicou-se vácuo (pressão medida de cerca de 85 kPa) ao recipiente dereação e o recipiente foi vedado. Quando a temperatura em cada recipientede reação reestabilizou-se a 95 0C, iniciou-se a rotação a 19 rpm.

Adicionou-se solução diluída de hidróxido de amônio para gerarconcentração de amônia de 4 g de amônia/100 g de peso seco debiomassa e concentração de sólidos de 30 g de peso seco debiomassa/100 g de peso total de mistura de biomassa. Após a injeção, ovácuo sobre o recipiente foi liberado à pressão atmosférica. O reator foimantido a 95 0C por trinta minutos e a temperatura foi reduzida em seguidapara 85 0C1 onde foi mantida por quatro horas sem rotação. Ao finaldaquele período, aplicou-se vácuo (pressão medida de cerca de 85 kPa) aorecipiente de reação por trinta minutos para remover amônia e reduzir atemperatura do conteúdo de cada reator para cerca de 50 0C. Dióxido decarbono foi injetado em seguida em cada reator para liberar o vácuo e osreatores foram pressurizados até pressão medida com CO2 de 138 kPa egirado sob pressão por trinta minutos a 50 0C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio de injeção de 75 ml de 1 Mtampão ácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-se monoidratode ácido cítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado em cada reator apósaquecimento a 50 0C e, em seguida, permitiu-se o equilíbrio por meio deincubação dos reatores a 50 0C e 19 rpm por uma hora. Os reatores foramremovidos do incubador, abertos e o pH de amostra foi determinado. Caso opH fosse de mais de 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólidoadicional e os reatores foram incubados com rotação a 50 0C por uma horaadicional. Este processo foi repetido com a freqüência necessária para obterpH de cerca de -5,5 para cada reator. Ao atingir-se o pH desejado, 28,4 mg/gde celulose Spezyme® CP (Genencor) e 10,1 mg de proteína ativa por gramade coquetel Diversa D2 que contém β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase earabinofuranosidase foram carregados no reator. Os reatores permaneceramno incubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Após esse pré-tratamento esacarificação, os rendimentos de açúcar foram testados conforme descrito nos

Métodos Gerais. Os rendimentos de glicose e xilose, com base no total deglucano e xilano que vêm com as duas alimentações, são exibidos na Tabela 2.Os rendimentos das amostras de biomassa de combinação de espiga maisgrãos exauridos foram similares a rendimentos da amostra de espiga isolada.Tabela 2

Rendimentos de Açúcar Após o pré-tratamento ε Sacrificação deAlimentações de Biomassa Combinadas

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Exemplo 2

Pré-tratamento ε Sacarificação de Biomassa Combinada Contendo Espigas deMilho, Grãos Exauridos ε Componentes Adicionais no Reator PEHR

Espigas fraturadas e grãos esgotados em uísque, preparadosconforme descrito no Exemplo 1, foram combinados no reator PEHRconforme descrito no Exemplo 1. Além disso, foram adicionados outroscomponentes de grãos. Em uma amostra, amido (Sigma S4126, lote n°093K0033) foi adicionado a 5 g/100 g de peso seco total de biomassa. Emoutra amostra, óleo de milho (óleo de milho Sysco Classic1 lote n°4119095) foi adicionado em nível de cerca de 2 g/100 g de biomassa secatotal. As amostras foram tratadas previamente e sacarificadas conformedescrito no Exemplo 1. Os resultados são exibidos na Tabela 3. Estesresultados também apresentam comparação favorável com os dados decontrole somente de espigas da Tabela 2.Tabela 3

Rendimentos de Açúcar Resultantes de pré-tratamento ε Sacarificação deEspigas, Grãos Esgotados ε Componentes de Grãos Adicionais

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Exemplo 3

Pré-tratamento ε Sacarificação de Biomassa Combinada que ContémEspigas de Milho ε Fibra de Milho no Reator PEHR

Espigas de milho fraturadas e fibra de milho Farelo Cargill 80 (Cargill,Minnetonka, MN) foram combinadas de tal forma que a fibra fosse de cerca de 10%da biomassa seca total. A biomassa combinada foi previamente tratada esacarificada conforme descrito no Exemplo 1. Os rendimentos de açúcar resultantessão exibidos na Tabela 4. Os rendimentos da biomassa de combinação de espigamais fibra de milho foram similares aos rendimentos da amostra de espiga isolada.

Tabela 4

Rendimentos de Açúcar Resultantes do pré-tratamento de Espigas deMilho Combinadas com Fibra de Milho

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Claims (39)

1. MÉTODO DE TRATAMENTO DE BIOMASSA COMPOSTADE MATÉRIAS-PRIMAS INTEGRADAS, caracterizado pelo fato de que omencionado método compreende:(a) fornecimento de biomassa;(b) adição à biomassa de (a) de pelo menos um fluxo dealimentação alternativo para produzir uma matéria-prima integrada;(c) contato da matéria-prima integrada de (b) com umasolução aquosa que compreende amônia para formar uma mistura dematéria-prima integrada e amônia aquosa, em que a amônia está presenteem uma concentração pelo menos suficiente para manter pH alcalino damistura de matéria-prima integrada e amônia aquosa, mas em que amencionada amônia está presente em menos de cerca de 12% em pesocom relação ao peso seco de matéria-prima integrada e, adicionalmente,em que o peso seco de matéria-prima integrada encontra-se em uma altaconcentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso comrelação ao peso da mistura de matéria-prima integrada e amônia aquosa,para gerar um produto de matéria-prima integrada previamente tratado; e(d) contato do produto de (c) com uma associação de enzimasde sacarificação sob condições apropriadas para produzir um produto deaçúcar fermentável.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o pH da mistura de matéria-prima integrada eamônia aquosa é maior do que 8.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o mencionado peso seco de matéria-primaintegrada encontra-se em concentração inicial de pelo menos cerca de-15% a cerca de 80%.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que o mencionado peso seco de matéria-prima integrada encontra-seem concentração inicial de pelo menos cerca de 15% a cerca de 60%.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a mencionada amônia está presente em menos cerca de 10%em peso com relação ao peso seco de matéria-prima integrada .

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a mencionada amônia está presente em cerca de 6% em pesoou menos com relação ao peso seco de matéria-prima integrada .

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa (c) é conduzida sob temperatura de cerca de 4 0C acerca de 200 0C.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a etapa (c) é conduzida sob temperatura de cerca de 75 0C acerca de 150 0C.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a etapa (c) é conduzida sob temperatura de mais de 90 0C acerca de 150 0C.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa (c) é conduzida por um período de tempo de até cercade oito horas.

11. MÉTODO DE TRATAMENTO DE BIOMASSA COMPOSTADE MATÉRIAS-PRIMAS INTEGRADAS, caracterizado pelo fato de que omencionado método compreende:(a) fornecimento de biomassa;(b) submissão da biomassa de (a) a um processo de pré-tratamento para gerar um produto de biomassa previamente tratado;(c) adição ao produto de biomassa previamente tratado de (b)de pelo menos um fluxo de alimentação alternativo para produzir uma primeiraou segunda matéria-prima integrada; e(d) contato da primeira ou segunda matéria-prima integradade (c) com uma associação de enzimas de sacarificação sob condiçõesapropriadas, para produzir um produto de açúcar fermentável.

12. MÉTODO, conforme a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que o processo de pré-tratamento em (b) inclui o contato da biomassacom solução aquosa que compreende amônia para formar uma mistura debiomassa e amônia aquosa, em que a amônia está presente em umaconcentração pelo menos suficiente para manter o pH alcalino da mistura debiomassa e amônia aquosa, mas em que a mencionada amônia está presenteem menos de cerca de 12% em peso com relação a peso seco de biomassa e,adicionalmente, em que o peso seco de biomassa encontra-se em uma altaconcentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso com relação aopeso da mistura de biomassa e amônia aquosa.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o pH da mistura de biomassa e amônia aquosa é maior do que 8.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o mencionado peso seco de biomassa encontra-se em umaconcentração inicial de pelo menos cerca de 15% a cerca de 80%.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o mencionado peso seco de biomassa encontra-se em umaconcentração inicial de pelo menos cerca de 15% a cerca de 60%.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a mencionada amônia está presente em menos de cerca de 10% em peso com relação a peso seco de biomassa.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a mencionada amônia está presente em cerca de 6% em pesoou menos com relação ao peso seco de biomassa.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) é conduzida sob temperatura de cerca de 4 0C acerca de 200 0C.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) é conduzida sob temperatura de cerca de 75 0C acerca de 150 0C.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) é conduzida sob temperatura de mais de 90 0C acerca de 150 0C.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) é conduzida por período de tempo de até cerca deoito horas.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a biomassa da etapa (a) é uma matéria-prima integrada .

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o fluxo de alimentação alternativo é composto de resíduo dedestilação.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que biomassa é selecionada a partir do grupo queconsiste de safras bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal,resíduo sólido industrial, resíduos de jardim, resíduos de madeira e florestais.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que biomassa é selecionada a partir do grupo queconsiste de brotos de grama, resíduos de papel, lodo de fabricação de papel,grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas,trigo, palha de trigo, feno, palha de arroz, bagaço de cana de açúcar, sorgo,soja, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos emoitas, legumes, frutas, flores e esterco animal.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo queconsiste de espigas de milho, forragem de milho, cascas de milho, bagaço de canade açúcar, brotos de grama, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha dearroz e gramas.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste deespigas de milho, forragem de milho e bagaço de cana de açúcar.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 12,caracterizado pelo fato de que a amônia é selecionada a partir do grupo queconsiste de gás de amônia, hidróxido de amônio, uréia e suas combinações.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 12,caracterizado pelo fato de que a mencionada solução aquosa que compreendeamônia compreende adicionalmente pelo menos uma base adicional.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 12,caracterizado pelo fato de que a amônia é reciclada.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que o fluxo de alimentação alternativo é selecionadoa partir do grupo que consiste de um co-produto, um fluxo em processo e umfluxo residual.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o fluxo de alimentação alternativo é um fluxo deprocessamento de sementes de milho, aveia, trigo, cevada, arroz, canola,girassol, algodão, ervilha ou soja e outros legumes.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que a mencionada associação de enzimas desacarificação compreende pelo menos uma glicosidase.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que a mencionada associação de enzimas desacarificação compreende pelo menos uma enzima selecionada a partir dogrupo que consiste de glicosidases hidrolisantes de celulose, glicosidaseshidrolisantes de hemicelulose, glicosidases hidrolisantes de amido, peptidases,lipases, Iigninases e feruloil esterases.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que a mencionada associação de enzimas desacarificação compreende pelo menos uma enzima selecionada a partir dogrupo que consiste de celulases, endoglucanases, exoglucanases,celobiohidrolases, β-glucosidases, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases,glucuronidases, amilases, a-amilases, β-amilases, glucoamilases, a-glucosidases, isoamilases.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é realizada sob temperatura de cercade 15°C a cerca de 100°C e sob pH de cerca de 2 a cerca de 11.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a biomassa de (a) é composta de pelo menos um fluxo dealimentação alternativo.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o mencionado resíduo de destilação é empregado para reduziro pH do material previamente tratado, tornando-o mais propenso asacarificação.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que os mencionados açúcares fermentáveis sãoutilizados para produzir substâncias com valor agregado, combustíveis ou outrosprodutos com alto valor.