BRPI0612966A2 - mÉtodo para o tratamento da biomassa - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE BIOMASSA A presente invenção refere-se a biomassa que foi tratada previamente utilizando uma baixa concentração de amônia aquosa em alta concentração de biomassa. A biomassa tratada previamente é ainda hidrolisada com uma associação de enzima de sacarificação. Os açúcares fermentáveis liberados pela sacarificação podem ser utilizados para a produção de alvos químicos pela fermentação.

Description

"MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE BIOMASSA"

O presente pedido reivindica os benefícios do Pedido ProvisórioUS 60/670437, depositado em 12 de abril de 2005.

Declaração dos Direitos Governamentais

A presente invenção foi realizada com o suporte do governo dosEstados Unidos da América sob o Contrato de número 04-03-CA-70224concedido pelo Departamento de Energia. O governo possui certos direitossobre a presente invenção.

Campo da Invenção

São fornecidos os métodos para o tratamento da biomassa a fimde obter açúcares fermentáveis. Especificamente, os açúcares fermentáveissão obtidos pelo tratamento prévio da biomassa sob condições deconcentração alta de sólidos e baixa de amônia, seguido pela sacarificação.

Antecedentes da Invenção

As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos,taic <~r>mr> rocíHi me anrinniac madeira resíduos de silvicultura, lodo dafabricação de papel, e resíduos sólidos industriais e municipais, fornecem umamatéria-prima de grande potencial de renovação para a produção desubstâncias químicas, plásticos, combustíveis e suprimentos. As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos de polímeros decarboidratos que compreendem a celulose, hemicelulose, glucanos e Iigninasão, em geral, tratados por uma variedade de meios químicos, mecânicos eenzimáticos para liberar principalmente os açúcares de hexose e de pentose,que podem ser fermentados a produtos úteis.

Os métodos de tratamento prévio são utilizados para fabricar ospolímeros de carboidrato de materiais de celulose e lignocelulose, disponíveismais rapidamente para as enzimas de sacarificação. Os métodos detratamento prévio padrão têm utilizado historicamente e principalmente osácidos fortes em temperaturas elevadas; entretanto, devido aos altos custos deenergia, altos custo de equipamento, altos custos de recuperação docatalisador de tratamento prévio e incompatibilidade com as enzimas desacarificação, têm sido desenvolvidos métodos alternativos, tais comotratamento prévio enzimático ou o uso de ácido ou de base em temperaturasmais amenas onde a menor hidrólise dos polímeros de carboidrato dabiomassa ocorre durante o tratamento prévio, requerendo melhores sistemasenzimáticos para sacarificar ambas a celulose e a hemicelulose.

Uma série de métodos de tratamento prévio que utilizam base foiproposta. Gould (Biotech. and Bioengr. (1984) 26: 46-52) descreve um métodode tratamento prévio para a biomassa de Iignocelulose utilizando peróxido dehidrogênio (H2O2). O tratamento é mais eficiente utilizando H2O2 em umaquantidade de pelo menos 0,25 em peso/ peso com relação ao substrato.

Teixeira, L. et al., (Appl. Biochem. and Biotech. (1999) 77-79: 19-34) descreve uma série de tratamentos prévios de biomassa utilizandoquantidades estequiométricas de hidróxido de sódio e hidróxido de amônio,com uma concentração de biomassa muito baixa. A razão da solução e dabiomassa é de 14:1.

Elshafei, A. et al., (Bioresource Tech. (1991) 35: 73-80) examinouo tratamento prévio da forragem de milho utilizando NaOH.

Kim, TeY. Lee (Bioresource Technology (2005) 96: 2007-2013)relatou o uso de altas quantidades de amônia aquosa para o tratamento prévioda forragem de milho.

O documento WO 2004/081185 descreve os métodos parahidrolisar a lignocelulose, que compreende o contato da Iignocelulose com umasubstância química; a substância química pode ser uma base, tal como ocarbonato de sódio ou o hidróxido de potássio, em um pH de cerca de 9 acerca de 14, sob condições moderadas de temperatura, pressão e pH.As patentes US 5.916.780 e US 6.090.595 descrevem umprocesso de tratamento prévio em que uma razão especificada dearabinoxilano e de polissacarídeos totais de não amido (AX/ NSP) é avaliada eutilizada para selecionar a matéria prima.

A fim de ser um processo economicamente competitivo, umprocesso comercial para a produção de açúcares fermentáveis a partir umafonte de biomassa renovável requer a hidrólise de carboidratos na biomassalignocelulósica para fornecer altos rendimentos de açúcares em altasconcentrações, utilizando baixas quantidades de substâncias químicas, paraproduzir uma fonte de açúcares fermentáveis com baixa toxicidade com relaçãoaos organismos fermentadores que convertem açúcares a substânciasquímicas e combustíveis de valor agregado.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção fornece um método para o tratamento dabiomassa para produzir açúcares fermentáveis. O processo da presenteinvenção envolve uma etapa de tratamento prévio, em que a biomassa,concentrações relativamente altas, é tratada com uma baixa concentração deamônia com relação ao peso seco da biomassa. Seguindo o tratamento prévio,a biomassa é tratada com uma associação de enzima de sacarificação paraproduzir açúcares fermentáveis. Em uma realização da presente invenção, oprocesso compreende:

(a) colocar em contato a biomassa com uma solução aquosa quecompreende a amônia para formar uma mistura de amônia aquosa e biomassa,em que a amônia está presente em uma concentração pelo menos suficientepara manter o pH alcalino na mistura de amônia aquosa e biomassa, mas emque dita amônia está presente a menos do que cerca de 12% em peso comrelação ao peso seco da biomassa, e ainda em que o peso seco da biomassaestá em uma alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% empeso com relação ao peso da mistura de amônia aquosa e biomassa; e

(b) colocar em contato o produto da etapa (a) com umaassociação de enzima de sacarificação sob condições apropriadas paraproduzir açúcares fermentáveis.

A biomassa refere-se a qualquer material celulósico ou lignocelulósico,por exemplo, culturas de bioenergia, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais,resíduos sólidos industriais, resíduos de terrenos, madeira, resíduos de silvicultura esuas combinações. A solução aquosa que compreende amônia pode ser derivada apartir de gás amônia, hidróxido de amônia, uréia e suas combinações. De acordocom o processo da presente invenção, a solução aquosa que compreende amôniapode compreender pelo menos uma base adicional. Em adição, de acordo com oprocesso da presente invenção, pode ser aplicado vácuo à biomassa antes docontato da biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia. A amôniatambém pode ser removida antes da etapa (b); a amônia pode ser reciclada de voltaao reator de tratamento prévio. A amônia e a biomassa podem ser reagidas noDrocesso da Dresente invenção em uma temDeratura que está entre cerca de 4°C ecerca de 200°C. Um plastificante, agente amaciante ou suas combinações podem serutilizados no processo da presente invenção. Em adição, pode ser aplicada umaenergia à biomassa antes ou durante a etapa (a), antes ou durante a etapa (b), ouuma combinação das mesmas a fim de reduzir i tamanho, aumentar a área desuperfície exposta e/ou aumentar a acessibilidade de celulose, hemicelulose e/ouoligossacarídeos presentes na biomassa.

A associação de enzima de sacarificação pode compreender umaou mais glicosidases; as glicosidases podem ser selecionadas a partir do grupoque consiste em glicosidases hidrolisantes de celulose, glicosidaseshidrolisantes de hemicelulose e glicosidases hidrolisantes de amido. Outrasenzimas na associação de enzima de sacarificação podem incluir peptidases,lípases, Iigninases e esterases de feruloíla.Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o crescimento da Zymomonas mobilis 8b(descrita no pedido de patente US 2003/ 0162271 A1, exemplos IV, Vl e XII) napresença ou ausência de acetamida e ácido acético.

Descrição Detalhada da Invenção

Os Depositantes incorporam especificamente todo o conteúdo detodas as referências citadas nessa descrição. Ainda, quando uma quantidade,concentração ou outro valor ou parâmetro é dado como um intervalo, intervalopreferido ou uma lista de valores preferidos superiores e valor preferidosinferiores, isto deve ser entendido como descrevendo especificamente todos osintervalos formados a partir de qualquer par de qualquer limite de intervalosuperior ou valor preferido e qualquer limite de intervalo inferior ou valorpreferido, independentemente se os intervalos são descritos separadamente.Onde um intervalo de valores numéricos é citado no presente, a menos queespecificado de outra maneira, o intervalo pretende incluir suas extremidades,e todos os números inteiros e frações dentro do intervalo. Não é pretendido queo escopo da presente invenção seja limitado aos valores específicos citados nadefinição de um intervalo.

A presente invenção fornece um processo para o tratamento debiomassa para produzir os açúcares fermentáveis: o processo envolve umaetapa de tratamento prévio em que a biomassa, em concentraçãorelativamente alta, é tratado com uma concentração relativamente baixa deamônia com relação ao peso seco da biomassa. A biomassa tratada comamônia é então digerida com uma associação de enzima de sacarificação paraproduzir açúcares fermentáveis.

Definições

No presente relatório descritivo, uma série de termos é utilizada.As seguintes definições são fornecidas:O termo "açúcar fermentável" refere-se a oligossacarídeos emonossacarídeos que podem ser utilizados como uma fonte de carbono por ummicroorganismo em um processo de fermentação.

O termo "lignocelulósico" refere-se a uma composição quecompreende ambas a Iignina e a celulose. O material lignocelulósico tambémpode compreender a hemicelulose.

O termo "celulósico" refere-se a uma composição quecompreende a celulose.

Por "peso seco" de biomassa, entende-se o peso da biomassaque possui toda ou essencialmente toda a água removida. O peso seco étipicamente medido de acordo com a American Society for Testing andMaterials (ASTM) Padrão E1756-01 (Método de Teste Padrão para aDeterminação de Sólidos Totais na Biomassa) ou Technical Association of thePulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) Padrão T-412 om-02 (Umidade na Polpa,Papel e Cartolina).

O termo "alvo químico" refere-se a uma substância químicaproduzida pela fermentação. A substância química é utilizada em um sentidoamplo e inclui moléculas, tais como proteínas incluindo, por exemplo,peptídeos, enzimas e anticorpos.

Um alvo químico que é "derivado da biomassa" é um alvo químicoproduzido por um processo pelo qual a biomassa é hidrolisada para liberaraçúcares fermentáveis, e os açúcares fermentáveis são fermentados utilizandopelo menos um biocatalisador para produzir um alvo químico desejável.

Os termos "plastificante" e "agente amaciante" referem-se amateriais que causam a redução das forças intermoleculares coesivas ao longoou entre as cadeias poliméricas. Tais materiais podem agir, por exemplo, nadiminuição da cristalinidade ou na quebra de ligações entre as fibras decarboidrato de Iignina e de não Iignina (por exemplo, celulose ou hemicelulose).O termo "sacarificação" refere-se à produção de açúcaresfermentáveis a partir de polissacarídeos.

O termo "biomassa tratada previamente" significa biomassa quefoi submetida ao tratamento prévio antes da sacarificação.

O termo "biomassa" refere-se a qualquer material celulósico oulignocelulósico e inclui os materiais que compreendem celulose e,opcionalmente, compreendem ainda a hemicelulose, lignina, amido,oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa também podecompreender os componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. Deacordo com a presente invenção, a biomassa pode ser derivada a partir deuma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada demais de uma fonte; por exemplo, a biomassa pode compreender uma misturade espigas de milho e forragem de milho ou uma mistura de grama e folhas. Abiomassa inclui, mas não está limitada a, culturas bioenergéticas, resíduosagrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, lodo dafabricação de papel, resíduos de terrenos, resíduos de madeira e desilvicultura. Os exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados a,grãos de milho, espigas de milho, resíduos de plantação, tais como cascas demilho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha decevada, feno, palha de arroz, grama do gênero Panicum, resíduos de papéis,bagaço da cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos doprocessamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira,serragem, arbusto e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal. Em umarealização, a biomassa que é útil para a presente invenção inclui a biomassaque possui um valor de carboidrato relativamente alto, é relativamente denso,e/ou é relativamente fácil de coletar, transportar, armazenar e/ou manipular.Em uma realização da presente invenção, a biomassa que é útil inclui asespigas de milho, as forragens de milho e o bagaço da cana de açúcar.Para os propósitos da presente invenção, uma "solução aquosaque compreende amônia" refere-se ao uso de gás amônia (NH3)1 compostosque compreendem íons amônio (NH4+) tais como hidróxido de amônio ousulfato de amônio, compostos que liberam amônia na degradação tais comouréia, e as suas combinações em um meio aquoso.

A concentração de amônia utilizada no presente método é, demaneira mínima, uma concentração que é suficiente para manter o pH damistura de amônia aquosa e de biomassa alcalina e, de maneira máxima,menos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Estabaixa concentração de amônia é suficiente para o tratamento prévio, e a baixaconcentração também pode ser menos do que cerca de 10% em peso comrelação ao peso seco da biomassa. Uma concentração muito baixa de 6% deamônia com relação ao peso seco da biomassa, ou menos, também pode serutilizada para o tratamento prévio. Por alcalino entende-se um pH superior a7,0. Particularmente apropriado é um pH da mistura de amônia aquosa e debiomassa que é superior a 8. Em uma realização, a amônia está presente 3menos do que cerca de 10% em peso com relação ao peso seco da biomassa.

Particularmente apropriada é a amônia a menos do que cerca de 6% em pesocom relação ao peso seco da biomassa.

A amônia conforme utilizada no presente processo fornecevantagens sobre outras bases. A amônia se divide em uma fase líquida e umafase vapor. Os gases de amônia podem se difundir mais facilmente através dabiomassa do que uma base líquida, resultando em um tratamento prévio maiseficaz em baixas concentrações. A amônia também é mostrada no presente, noExemplo 11, para competir com a hidrólise, por meio de amonólise, dos acetilésteres na biomassa para formar a acetamida. A acetamida é menos tóxica doque o acetato para certos organismos fermentadores, tal como a Zymomonasmobilis (conforme demonstrado no presente, no Exemplo 12). Assim, a conversãodos acetil ésteres para a acetamida ao invés de para ácido acético reduz anecessidade de remover o ácido acético. O uso de amônia também reduz aexigência de suplementar o meio de crescimento utilizado durante a fermentaçãocom uma fonte de nitrogênio. Em adição, a amônia é um material de baixo custo eassim, fornece um processo econômico. A amônia também pode ser recicladapara o reator de tratamento prévio durante o tratamento prévio ou seguinte aotratamento prévio, permitindo assim um processo mais econômico. Por exemplo,seguindo o tratamento prévio, conforme a temperatura é diminuída àquelaapropriada para a sacarificação, o gás de amônia pode ser liberado,opcionalmente, na presença de vácuo, e pode ser reciclado. Em um processocontínuo, a amônia pode ser continuamente reciclada.

De acordo com o presente método, a solução aquosa quecompreende a amônia pode, opcionalmente, compreender pelo menos umabase adicional, tal como hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido depotássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio. Pelomenos uma base pode ser adicionada em uma quantidade que é combinadacom o amônio para formar uma quantidade de base total que é menos do quecerca de 20% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Depreferência, a segunda base total mais a amônia está em uma quantidade queé menos do que cerca de 15% em peso. A(s) base(s) adicional(is) pode(m) serutilizada(s), por exemplo, para neutralizar os ácidos na biomassa, para forneceríons metálicos para as enzimas de sacarificação, ou para fornecer íonsmetálicos para o meio de crescimento da fermentação.

No presente método, o peso seco da biomassa está em umaconcentração inicial de pelo menos cerca de 15% até cerca de 80% do peso damistura de amônia aquosa e biomassa. De maneira mais apropriada, o pesoseco da biomassa está em uma concentração de cerca de 15% a cerca de 60%do peso da mistura de amônia aquosa e biomassa. A porcentagem debiomassa na mistura de amônia aquosa e biomassa é mantida alta paraminimizar a necessidade pela concentração de açúcares resultante dasacarificação da biomassa tratada previamente, para o uso na fermentação. Aalta concentração de biomassa também reduz o volume total do material detratamento prévio, tornando o processo mais econômico.

A biomassa pode ser utilizada diretamente conforme ob tida apartir da fonte, ou a energia pode ser aplicada à biomassa para reduzir otamanho, aumentar a área de superfície exposta, e/ou aumentar adisponibilidade de celulose, hemicelulose, e/ou oligossacarídeos presentes nabiomassa para as enzimas de amônia e de sacarificação utilizadas na segundaetapa do método. Os meio de energia úteis na redução do tamanho, aumento aárea de superfície exposta, e/ou aumento da disponibilidade de celulose,hemicelulose, e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa para as enzimasde amônia e de sacarificação, incluem, mas não estão limitadas a, moagem,compressão, trituração, despedaçamento, corte, refinação em disco, ultra-some microondas. Esta aplicação de energia pode ocorrer antes ou durante otratamento prévio, antes ou durante a sacarificação ou qualquer combinaçãodos mesmos.

O tratamento prévio da biomassa com solução de amônia érealizado em qualquer recipiente apropriado. Tipicamente o recipiente é umque pode suportar a pressão, possui um mecanismo de aquecimento, e possuium mecanismo para a mistura de conteúdos. Os recipientes disponíveiscomercialmente incluem, por exemplo, o reator Zipperclave® (AutoclaveEngineers, Erie, PA), o reator Jaygo (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ),e um reator de pistola de vapor ((descrita nos Métodos Gerais; AutoclaveEngineers, Erie, PA). Os reatores de escalas muitos maiores com capacidadessimilares podem ser utilizados. Alternativamente, a biomassa e a solução deamônia podem ser combinadas em um recipiente, então, transferida a outroreator. Além disso, a biomassa pode ser tratada previamente em um recipiente,então, processada adicionalmente em outro reator, tal como o reator de pistolade vapor (descrito nos Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA).

Antes do contato da biomassa com uma solução aquosa quecompreende amônia, pode ser aplicado vácuo ao recipiente contendo abiomassa. Ao evacuar o ar dos poros da biomassa, pode ser obtida umamelhor penetração de amônia na biomassa. O período de tempo para aaplicação de vácuo e a quantidade de pressão negativa que é aplicada àbiomassa irá depender do tipo de biomassa e pode ser determinadoempiricamente de modo a atingir um tratamento prévio ótimo da biomassa(conforme medido pela produção de açúcares fermentáveis seguindo asacarificação).

O contato da biomassa com uma solução aquosa quecompreende a amônia é realizado em uma temperatura de cerca de 4°C acerca de 200°C. O contato inicial da biomassa com a amônia a 4°C, permitindoa impregnação a esta temperatura, foi descoberta por aumentar a eficiência desacarificação pela biomassa nativa não tratada previamente. Em outrarealização, dito contato da biomassa é realizado em uma temperatura de cercade 75°C a cerca de 150°C. Ainda em outra realização, dito contato da biomassaé realizado em uma temperatura superior a 90°C a cerca de 150°C.

O contato da biomassa com uma solução aquosa quecompreende a amônia é realizado por um período de tempo de até cerca de 25horas. Períodos mais longos de tratamento prévio são possíveis, entretanto,um menor período de tempo pode ser preferível por razões práticas eeconômicas. Tipicamente um período de tratamento de contato da amônia é decerca de 8 horas ou menos. Períodos mais longos podem fornecer o benefíciode reduzir a necessidade de aplicação de energia para a quebra da biomassa,portanto, um período de tempo de até cerca de 25 horas pode ser preferível.Em uma realização, o processo de tratamento prévio pode serrealizado em uma temperatura relativamente alta for um período de temporelativamente curto, por exemplo, de cerca de IOO0C a cerca de 150°C porcerca de 5 minutos e cerca de 2 horas. Em outra realização, o processo detratamento prévio pode ser realizado em uma temperatura inferior por umperíodo de tempo relativamente longo, por exemplo, de cerca de 75°C a cercade 100°C por cerca de 2 horas e cerca de 8 horas. Em ainda outra realização,o processo de tratamento prévio pode ser realizado na temperatura ambiente(cerca de 22 a 26°C) ou mesmo por um período de tempo mais longo de cercade 24 horas. Outras combinações intermediárias de temperatura e tempotambém podem ser utilizadas.

Para o processo de tratamento prévio, a temperatura, o tempopara o tratamento prévio, a concentração de amônia, a concentração de umaou mais bases adicionais, a concentração de biomassa, o tipo de biomassa e otamanho de partícula da biomassa são relacionados; assim estas variáveispodem ser ajustadas conforme o necessário para obter um produto ótimo paraser colocado em contato com uma associação de enzima de sacarificação.

Um ρIastificante, agente amaciante, ou as combinações dosmesmos, tais como os polióis (por exemplo, glicerol, etileno glicol), ésteres depolióis (por exemplo, monoacetato de glicerol), éteres de glicol (por exemplo,dietileno glicol), acetamida, etanol e etanolaminas, podem ser adicionados noprocesso de tratamento prévio (isto é, a etapa (a)). Um plastificante pode seradicionado como um componente da solução de amônia aquosa, como umasolução separada, ou como um componente seco.

A reação de tratamento prévio pode ser realizada em qualquerrecipiente apropriado, tal como um reator em batelada ou um reator contínuo.Um técnico no assunto irá reconhecer que, em maiores temperaturas (acima de100°C), será necessário um recipiente de pressão. Um recipiente apropriadopode ser equipado com os meios, tais como impulsores, para a agitação damistura de amônia aquosa e biomassa. O projeto do reator é discutido em Lin1K. H., e Van Ness1 H. C. (em Perry, R. H. e Chilton1 C. H. (eds), ChemicalEngineerjS Handbok, 5a edição (1973), capítulo 4, McGraw-HiII1 Nova Iorque). Areação de tratamento prévio pode ser realizada como um processo embatelada, ou como um processo contínuo.

É bem conhecido dos técnicos no assunto que uma fonte denitrogênio é necessária para o crescimento de microorganismos durante afermentação; assim o uso de amônia durante o tratamento prévio fornece umafonte de nitrogênio e reduz ou elimina a necessidade de suplementar o meio decrescimento utilizado durante a fermentação com uma fonte de nitrogênio. Se opH do produto do tratamento prévio exceder aquele a qual as enzimas desacarificação são ativas, ou exceder o intervalo apropriado para o crescimentomicrobiano na fermentação, os ácidos podem ser utilizados para reduzir o pH.

A quantidade de ácido utilizado para obter o pH desejado pode resultar naformação de sais em concentrações que são inibidoras das enzimas desacarificação ou do crescimento microbiano. A fim de reduzir a quantidade deácido necessário para obter o pH desejado e para reduzir o custo do materialbruto de NH3 no presente processo de tratamento prévio, o gás amônia podeser evacuado do reator de tratamento prévio e reciclado. Tipicamente, pelomenos um porção de amônia é removida, o que reduz o pH, mas deixa algumnitrogênio que fornece este nutriente para o uso na fermentação subseqüente.

A fim de obter quantidades suficientes de açúcar da biomassa, abiomassa pode ser tratada previamente com uma solução de amônia aquosauma vez ou mais de uma vez. Da mesma maneira, uma reação desacarificação pode ser realizada uma ou mais vezes. Ambos os processos detratamento prévio e de sacarificação podem ser repetidos se desejado paraobter maiores rendimentos de açúcares. Para avaliar o desempenho dosprocessos de tratamento prévio e de sacarificação, separadamente ou emconjunto, o rendimento teórico de açúcares derivados da biomassa de partidapode ser determinado e comparado para os rendimentos medidos.

Sacarificação

Seguindo o tratamento prévio, o produto compreende umamistura de amônia, biomassa parcialmente degradada e açúcaresfermentáveis. Antes do processamento adicional, a amônia pode ser removidada biomassa tratamento prévio pela aplicação de vácuo. A remoção da amôniadiminui o pH e, portanto, é utilizado um ácido menos neutralizante para obter opH desejado para a sacarificação e a fermentação. Isto resulta em uma menorcarga de sal na mistura do tratamento prévio. Tipicamente, permanece algumaamônia, que é desejada para fornecer uma fonte de nitrogênio para afermentação.

A mistura do tratamento prévio é então, hidrolisadaadicionalmente na presença de uma associação de enzima de sacarificaçãopara liberar os oligossacarídeos e/ou os monossacarídeos em um hidrolisado.As enzimas de sacarificação e os métodos para o tratamento da biomassa sãoanalisados por Lynd, L. R., et al., (Microbiol. Mol. Rev. (2002) 66: 506-577). Emuma realização preferida, toda a mistura de tratamento prévio que compreendeambas as frações solúveis e insolúveis é utilizada na reação de sacarificação.

Em outra realização, antes da sacarificação, a fração aquosacompreende a amônia e os açúcares solubilizados podem ser separados dosparticulados insolúveis permanecentes na mistura. Os métodos para aseparação das frações solúveis das insolúveis incluem, mas não estãolimitadas a, decantação e filtração. Os particulados insolúveis podem serreciclados no reator de tratamento prévio. Os particulados insolúveis podem,opcionalmente, ser lavados com um solvente aquoso (por exemplo, água) pararemover os açúcares adsorvidos antes de serem reciclados no reator detratamento prévio. A fração insolúvel pode então ser submetida ao tratamentoadicional com a solução de amônia aquosa conforme descrito acima para otratamento prévio, seguido pela sacarificação com uma associação de enzimade sacarificação. A fração solúvel também pode ser concentrada antes dasacarificação utilizando um processo apropriado, tal como a evaporação.

Antes da sacarificação, o produto de tratamento prévio pode sertratado para alterar o pH, a composição ou a temperatura tal que as enzimasda associação de enzima de sacarificação serão ativas. O pH pode ser alteradoatravés da adição de ácidos na forma sólida ou líquida. Alternativamente, odióxido de carbono (CO2), que pode ser recuperado da fermentação, pode serutilizado para diminuir o pH. Por exemplo, o CO2 pode ser coletado de umfermentador e alimentado, tal como por borbulhamento, dentro do produto detratamento prévio enquanto o pH é monitorado até o pH desejado ser obtido. Atemperatura pode ser trazida a uma temperatura que é compatível com aatividade da enzima de sacarificação, conforme registrado abaixo. Quaisquercofatores requeridos para a atividade das enzimas utilizadas na sacarificaçãopodem ser adicionados.

A associação de enzima de sacarificação compreende uma oumais enzimas selecionadas principalmente, mas não exclusivamente, do grupodas "glicosidases" que hidrolisam as ligações éter de di-, oligo-, epolissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x(Enzime Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com Supplement1 (1993), Supplement 2 (1994), Supplement 3 (1995), Supplement 4 (1997) eSupplement 5, [em Eur; J. Biochem. (1994) 223: 1-5, Eur. J. Biochem. (1995)232: 1-6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1-5, Eur. J. Biochem. (1997) 250: 1-6 eEur. J. Biochem. (1999) 264: 610-650, respectivamente]) do grupo geral das"hidrolases" (EC3.). As glicosidases úteis no presente método podem sercategorizadas pelo componente da biomassa que elas hidrolisam. Asglicosidases úteis para o presente método incluem as glicosidases quehidrolisam celulose (por exemplo, celulases, endoglucanases, exoglucanases,celobiohidrolases, β-glucosidases), glicosidases que hidrolisam hemicelulose(por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases,arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases), eglicosidases que hidrolisam amido (por exemplo, amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Em adição, pode serútil adicionar outras atividades à associação da enzima de sacarificação taiscomo peptidases (EC 3.4.x.y), Iipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), Iigninases (EC1.1.1.x), e estearases de feruloíla (EC 3.1.1.73), para auxiliar na liberação depolissacarídeos dos outros componentes da biomassa. É bem conhecido noestado da técnica que os microorganismos que produzem enzimashidrolisantes de polissacarídeos exibem freqüentemente uma atividade, talcomo a degradação da celulose, que é catalisada por diversas enzimas ou porum grupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato.Deste modo, uma "celulase" de um microorganismo pode compreender umgrupo de enzimas, todos os quais podem contribuir para a atividade degradanteda celulose. As preparações de enzimas comerciais e não comerciais, taiscomo celulase, podem compreender numerosas enzimas dependendo doesquema de purificação utilizado para obter a enzima. Portanto, a associaçãoda enzima de sacarificação do presente método pode compreender a atividadeda enzima, tal como a "celulase", entretanto, é reconhecido que esta atividadepossa ser catalisada por mais de uma enzima.

As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente,tal como a celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) exilanase Multifect® (Genencor). Em adição, as enzimas de sacarificação podemser produzidas biologicamente, incluindo a utilização de microorganismosrecombinantes.Um técnico no assunto saberia como determinar a quantidadeeficaz de enzimas para o uso nas associações e ajustar as condições para aatividade ótima da enzima. Um técnico no assunto também saberia comootimizar as classes de atividades de enzimas requeridas dentro da associaçãopara obter a sacarificação ótima de um dado produto de tratamento prévio sobas condições selecionadas.

De preferência, a reação de sacarificação é realizada na, oupróxima a, temperatura e pH ótimo para as enzimas de sacarificação. Atemperatura ótima utilizada na associação de enzima de sacarificação nopresente método varia de cerca de 15°C a cerca de 100°C. Em outrarealização, a temperatura ótima varia de cerca de 20°C a cerca de 80°C. O pHótimo pode variar de cerca de 2 a cerca de 11. Em outra realização, o pH ótimoutilizado na associação de enzima de sacarificação no presente método variade cerca de 4 a cerca de 10.

A sacarificação pode ser realizada por um período de tempo demuitos minutos a cerca de 120 horas e, de preferência, de cerca de muitosminutos a cerca de 48 horas. O tempo para a reação irá depender daconcentração da enzima e da atividade específica, bem como, do substratoutilizado e as condições ambientais, tais como temperatura e pH. Um técnicono assunto pode prontamente determinar as condições ótimas de temperatura,pH e tempo a serem utilizadas com um substrato particular e com a(s)associação(ões) de enzima(s) de sacarificação.

A sacarificação pode ser realizada em batelada ou como umprocesso contínuo. A sacarificação também pode ser realizada em uma etapa,ou uma série de etapas. Por exemplo, as diferentes enzimas requeridas para asacarificação podem exibir diferente pH ou temperatura ótima. Um primeirotratamento pode ser realizado com a(s) enzima(s) em uma temperatura e pH,seguida pelo segundo ou terceiro (ou mais) tratamentos com diferente(s)enzima(s) em diferente(s) temperatura(s) e/ou pH. Em adição, o tratamentocom as diferentes enzimas em etapas seqüenciais pode ser no mesmo pH e/outemperatura, ou diferentes pHs e temperaturas, tais como utilizando ashemicelulases estáveis e mais ativas em maiores pHs e temperaturas, seguidopelas celulases que são ativas em baixos pHs e temperaturas.

O grau de solubilização dos açúcares da biomassa seguida dasacarificação pode ser monitorado pela medida da liberação dosmonossacarídeos e oligossacarídeos. Os métodos para a medida demonossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos no estado datécnica. Por exemplo, a concentração de açúcares redutores pode serdeterminada utilizando o ensaio do ácido 1,3-dinitrosalicílico (DNS) (Miller, G.L., Anal. Chem. (1959) 31: 426-428). Alternativamente, os açúcares podem sermedidos por HPLC utilizando uma coluna apropriada conforme descrito abaixono presente, na seção de Métodos Gerais.

Os açúcares fermentáveis liberados da biomassa podem serutilizados pelos microorganismos apropriados para produzir alvos químicos.Seguindo a sacarificação, mas antes da fermentação, a mistura dasacarificação pode ser concentrada por evaporação, por exemplo, paraaumentar a concentração de açúcares fermentáveis. Opcionalmente, o líquidono produto de sacarificação pode ser separado dos sólidos em um métodocontínuo ou em batelada. Opcionalmente, o líquido ou todo o produto desacarificação pode ser esterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s)microorganismo(s) utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizado durantea sacarificação, o pH pode ser ajustado para aquele apropriado para afermentação. Em adição, a mistura de sacarificação pode ser suplementadacom nutrientes adicionais requeridos para o crescimento microbiano. Ossuplementos podem incluir, por exemplo, extrato de levedura, aminoácidosespecíficos, fosfato, fontes de nitrogênio, sais e elementos traços. Oscomponentes requeridos para a produção de um produto específico, feito porum biocatalisador específico, também podem ser incluídos, tais como umantibiótico para manter um plasmídeo ou um cofator requerido em uma reaçãocatalisada por enzima. Os açúcares adicionais também podem ser incluídospara aumentar a concentração total de açúcares. A mistura de sacarificaçãopode ser utilizada como um componente em um caldo de fermentação, porexemplo, perfazendo entre cerca de 100% e cerca de 10% do meio final.

A temperatura e/ou os gases de vapor (headspace) tambémpodem ser ajustados, dependendo das condições úteis para a fermentaçãodo(s) microorganismo(s). A fermentação pode ser aeróbia ou anaeróbia. Afermentação pode ocorrer subseqüente à sacarificação, ou pode ocorrerconcomitantemente à sacarificação pela sacarificação e fermentaçãosimultânea (SSF). A SSF pode manter os níveis de açúcar baixo, produzidospela sacarificação, reduzindo desta maneira a inibição potencial do produto dasenzimas de sacarificação, reduzindo a disponibilidade do açúcar para osmicroorganismos contaminantes, e melhorando a conversão da biomassatratada previamente para monossacarídeos e para oligossacarídeos.

Os alvos químicos que podem ser produzidos pela fermentaçãoincluem, por exemplo, ácidos, álcoois, alcanos, alquenos, aromáticos, aldeídos,cetonas, biopolimeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas,antibióticos e produtos farmacêuticos. Os álcoois incluem, mas não estãolimitados a, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenoglicol,propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol e sorbitol. Os ácidos incluem oácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, 3-hidroxipropiônico, ácidobutírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico e ácidolevulínico. Os aminoácidos incluem o ácido glutâmico, ácido aspártico,metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Os alvosquímicos adicionais incluem metano, etileno, acetona e enzimas industriais.A fermentação de açúcares a alvos químicos pode ser realizadapor um ou mais catalisadores apropriados em fermentações únicas ou emmúltiplas etapas. Os biocatalisadores podem ser microorganismosselecionados a partir da bactéria, fungos filamentosos e leveduras. Osbiocatalisadores podem ser os microorganismos do tipo selvagem oumicroorganismos recombinantes, e incluem a Escherichia1 Zymomonas,Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces1 Bacillus, Lactobacillus eClostridium. Em outra realização, os biocatalisadores podem ser selecionadosa partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Zymomonas mobilis,Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Clostridiathermocellum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Pichia stipitisrecombinantes.

Muitos biocatalisadores utilizados na fermentação para produziros alvos químicos foram descritos e outros podem ser descobertos, produzidosatravés de mutação ou manipulado através dos meios de recombinação.

Qualquer biocatalisador que utiliza os açúcares fermentáveis produzidos nopresente método pode ser utilizado para fabricar o(s) alvo(s) químico(s) que éconhecido por produzir, por fermentação no presente método.

A fermentação dos carboidratos a acetona, butanol e etanol(fermentação ABE) pelos solvotogênicos Clostridia é bem conhecida (Jonesand Woods (1986) Microbioi Rev. 50: 484-524). Um processo de fermentaçãopara a produção de altos níveis de butanol, e que também produz acetona eetanol, utilizando uma cepa mutante de um Clostridium acetobutylicum èdescrito no documento US 5.192.673. O uso de uma cepa mutante deClostridium beijerinckii para a produção de altos níveis de butanol, e quetambém produz acetona e etanol, é descrito no documento US 6.358.717. Ascepas modificadas geneticamente de E. coli também foram utilizadas comobiocatalisadores para a produção de etanol (Underwood et al., (2002) Appl.Environ. Microbioi 68: 6263-6272). Uma cepa modificada geneticamente deZymomonas mobilis que possui uma produção aprimorada de etanol é descritano documento US 2003/0162271 A1.

O ácido láctico foi produzido em fermentações pelas cepasrecombinantes de E. coli (Zhou et al., (2003) Appl. Environ. Microbioi 69: 399-407), cepas naturais de Bacillus (documento US 2005/0250192), e Rhizopusoryzae (Tay e Yang (2002) Biotechnol. Bioeng. 80: 1-12). As cepasrecombinantes de E. coli foram utilizadas como biocatalisadores nafermentação para produzir 1,3-propanodiol (documentos US 6.013.494, US6.514.733), e ácido adípico (Niu et al., (2002) Biotechnol. Prog. 18: 201-211). Oácido acético foi feito pela fermentação utilizando Clostridia recombinante(Cheryan et al., (1997) Adv. Appi Microbiol. 43: 1-33), e cepas de levedurasrecém identificadas (Freer (2002) World J. Microbiol. Biotechnol. 18: 271-275).A produção de ácido succínico pela E. coli recombinante e outra bactéria édescrita no documento US 6.159.738, e pelo mutante de E. coli recombinante(em Li net a!., (2005) Metab. Eng, 7: 116-127). O ácido pirúvico foi produzidopela levedura mutante Torulopsis glabrata (Li et al., (2001) Appl. MicrobiolTechnol. 55: 680-685) e pelo mutante E. coli (Yokota et al., (1994) Biosci.Biotech. Biochem. 58: 2164-2167). As cepas recombinantes de E. coliutilizadas como biocatalisadores para a produção de ácido para-hidroxicinâmico (documento US 2003/0170834) e ácido quínico (documento US2006/0003429):

Um mutante de Propionibacterium acidipropionici foi utilizado nafermentação para produzir ácido propiônico (Suwannakham e Yang (2205)Biotechnol. Bioeng. 91: 325-337), e ácido butírico foi utilizado pelo Clostridiumtyrobutyricum (Wu e Yang (2003) Biotechnol. Bioeng. 82: 93-102). O propionatoe o propanol foram feitos pela fermentação da treonina pela cepa deClostridium sp. 17cr1 (Janssen (2004) Arch. Microbiol. 182: 482-486). UmaAureobasidium pullulans do tipo levedura foi utilizada para fazer ácidoglucônico (Anantassiadis et al., (2005) Biotechnol. Bioeng. 91: 494-501), porum mutante de Aspergillis niger (Singh et al., (2001) Indian J. Exp. Biol. 39:1136-43). O ácido 5-ceto-D-glucônico foi feito por um mutante deGluconobacter oxydans (Elfari et al., (2005) Appl Microbioi Biotech. 66: 668-674), o ácido itacônico foi produzido pelos mutantes de Aspergillus terreus(Reddy e Singh (2002) Bioresour. Technol. 85: 69-71) o ácido cítrico foiproduzido por um mutante de cepa de Aspergillus niger (Ikram-UI-Haq et al.,(2005) Bioresour. Technol. 96: 645-648), e o xilitol foi produzido pela Candidaguilliermondii FTI 20037 (Mussatto e Roberto (2003) J. AppL MicrobioL 95: 331-337). Os biopoliésteres que contém 4-hidroxivalerato, e que também contémquantidades significativas de ácido 3-hidroxibutírico e ácido 3-hidroxivalérico,foram produzidos pelos Pseudomonas putida e Ralstonia eutropha (Gorenflo etal., (2001) Biomacromolecules 2: 45-57). O L-2,3-butanodiol foi feito pela E. eolirecombinante (Ui et al., (2004) Lett. AppL Mierobiol. 39: 533-537).

A produção de aminoácidos pela fermentação foi acompanhadautilizando cepas auxotróficas e cepas resistentes com aminoácidos análogosde Corynebacterium, Brevibacterium e Serratia. Por exemplo, a produção dehistidina utilizando uma cepa resistente a um análogo de histidina é descrita napatente JP 8596/81 e utilizando uma cepa recombinante é descrita nodocumento EP 136.359. A produção de triptofano utilizando uma ceparesistente a^üm análogo de triptofano é descrita nas patentes JP 4505/72 e JP1937/76. A produção de isoleucina utilizando uma cepa resistente a umaisoleucina análoga é descrita nas patentes JP 38995/72, JP 6237/76 eJP32070/79. A produção de fenilalanina utilizando uma cepa resistente a umafenilalanina análoga é descrita na patente JP 10035/81. A produção de tirosinautilizando uma cepa que requer fenilalanina para o crescimento, resistente àtirosina (Agr. Chem. Soe. Japan 50 (1) R79-R87 (1976), ou uma ceparecombinante (EP 263515, EP 332234)), e a produção de arginina utilizandouma cepa resistente a um análogo de L-arginina (Agr: Biol. Chem. (1972) 36:1675-1684, patentes JP 37235/79 e JP 150381/82) foram descritas. Afenilalanina também foi produzida pela fermentação em cepas de Eschericiacoli ATCC 31882, 31883 e 31884. A produção de ácido glutâmico em umabactéria corineforme recombinante é descrita no documento US 6.962.805. Aprodução de treonina por uma cepa mutante de E. coli é descrita em Okamotoe Ikeda (2000) J. Biosci Bioeng. 89: 87-79. A metionina foi produzida por umacepa mutante de Corynebacterium Iilium (Kumar et al., (2005) Bioresour.Technol. 96: 287-294).

Os peptídeos, as enzimas e outras proteínas úteis também foramfeitas por biocatalisadores (por exemplo, nos documentos US 6.861.237, US6.777.207 e US 6.228.630).

O tratamento prévio e a sacarificação da biomassa em açúcaresfermentáveis, seguidos pela fermentação de açúcares a alvo químico, éexemplificado no Exemplo 9 do presente, para a produção de etanol a partir deespigas de milho tratadas previamente utilizando o Z mobilis como obiocatalisador para a fermentação de açúcares a etanol. O método da presenteinvenção também pode ser útil para a produção de 1,3-propanodiol a partir dabiomassa. A biomassa é submetida ao tratamento prévio e à sacarificação, deacordo com a presente invenção; seguida (ou durante) da sacarificação, a E.coli é utilizada para produzir 1,3-propanodiol conforme descrito no Exemplo 10do presente.

O alvo químico produzido na fermentação por biocatalisadorespode ser recuperado utilizando diversos métodos conhecidos no estado datécnica. Os produtos podem ser separados dos outros componentes dafermentação pela centrifugação, filtração, microfiltração e nanofiltração. Osprodutos podem ser extraídos por trocas de íons, extração por solvente oueletrodiálise. Os agentes de floculação podem ser utilizados para auxiliar naseparação do produto. Como um exemplo específico, o 1-butanol bioproduzidopode ser isolado do meio de fermentação utilizando os métodos conhecidos noestado da técnica para as fermentações ABE (vide, por exemplo, Durre, AppiMicrobioi Biotechnol. 49; 639-648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27:61-75 (1992), e suas referências no presente). Por exemplo, os sólidos podemser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantaçãoou similares. Então, o 1-butanol pode ser isolado do meio de fermentaçãoutilizando os métodos, tais como destilação, destilação azeotrópica, extraçãolíquido-líquido, adsorção, esvaziamento de gás, evaporação de membrana oupervaporação. A purificação do 1,3-propanodiol dos meios de fermentaçãopode ser acompanhado, por exemplo, ao submeter a mistura de reação àextração com um solvente orgânico, destilação e cromatografia por coluna(documento US 5.356.812). Um solvente orgânico particularmente bom paraeste processo é o ciclo-hexano (documento US 5.008.473). Os aminoácidospodem ser coletados pelo meio de fermentação pelos métodos tais comoresina de adsorção de troca iônica e/ou cristalização.

Exemplos

Métodos Gerais ε Materiais

São utilizadas as seguintes abreviações:

"HPLC" é Cromatografia Líquida de Alta Performance, "C" écentígrado, "kPa"^ quiloPascal,""m" e metro, "mm" é milímetro,"kW" équilowatt, "pm" é micrometro, "pL" é microlitro, "mL" é milímetro, "L" é litro, "min"é minuto, "mM" é milimolar, "cm" é centímetro, "g" é grama, "kg" é quilograma,"p" é peso, "h" é hora, "temp" ou "T" é temperatura, "teori" é teórico, "trat. pr." étratado previamente, "DWB" é o peso seco da biomassa.

O ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida,extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossufônico (MES), fosfato depotássio, glicose, xilose, triptona, cloreto de sódio e ácido cítrico foram obtidospela Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reatores de Tratamento Prévio

Reator Zipperclave®

O reator Zipperclave® de 4 litros (Autoclave Engineers, Erie, PA) é umrecipiente de pressão por batelada equipado com um balde Hastelloy® de 2,5 litrospara o carregamento de biomassa e um agitador para misturar a biomassa. Orecipiente de reação é cercado por um aquecedor elétrico controlado em umatemperatura de tratamento prévio desejada. A injeção da corrente direta também éutilizada para trazer rapidamente a biomassa até a temperatura de tratamentoprévio. A pressão da corrente é ajustada e controlada para manter a temperatura detratamento prévio desejada. O condensado do vapor formado pelo aquecimento doprato cabeça, recipiente e exterior ao balde do reator Zipperclave®, drenam a umreservatório formado entre o balde e a parede interna do reator, para evitar adiluição excessiva da calda tratada previamente.

Reator Jaygo

O reator Jaygo é um reator do tipo palheta horizontal (JaygoManufacturing, Inc., Mahwah, NJ, EUA) de 130 litros (cerca de 51 cm dediâmetro χ 91 cm de comprimento), fabricado pela liga Hastelloy® C-22. Oreator é equipado com um revestimento de vapor capaz de aquecer a cerca de177°C (862 kPa). A injeção direta de vapor também é utilizada para trazerrapidamente a biomassa para a temperatura de tratamento prévio. A pressãode vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamentoprévio desejada. Numerosas interfaces de comunicação permitem a injeção deoutros solventes e líquidos quentes.

Reator de Pistola de Vapor no Sistema de Digestão em Batelada

O reator de pistola de vapor de 4 litros (Autoclave Engineers,Erie, PA) é um reator revestido por vapor que consiste em umcomprimento de 102 mm sincronizado com um cano Hastelloy® 80fechado por duas válvulas bola. Os aquecedores elétricos adicionais sãocolocados em toda a superfície exposta, não envolta do reator, econtrolada em um ponto fixado da temperatura de tratamento prévio. Ainjeção de vapor direta também é utilizada para trazer rapidamente abiomassa à temperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor éajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento préviodesejada. O fundo do reator é estreitado a 51 mm. Todo o materialtratado previamente sai através de um molde substituível no fundo doreator e é coletado em uma bolsa de náilon (Hotfill®) de 0,21 m3sustentada dentro de um tanque fortemente cercado, revestido eresfriado.

Disco de refinamento

O disco de refinamento é um refinador modelo Waldron Sprout de30,5 cm (Andritz, Inc., Muncy, PA) equipado com um motor elétrico de 11 kW.O intervalo entre os pratos estacionários e os giratórios é variável. A velocidadeda verruma de alimentação também é variável, de 0 a 88 rpm. A entrada dorefinador foi modificada com seis interfaces de conexão de injeção para permitira introdução do vapor, água quente ou outros gases e líquidos de varreduraexatamente à frente do prato giratório do refinador. O refinador era equipadocom pratos (Durametal, Corp., Tulatin, OR) no padrão D2A506 em Ni-Hard oupadrão 18034-A em Ni-Hard.

Reator de Tratamento Prévio ε de Hidrólise Enzimática (PEHR)

O PEH Reator de 9L (construído em NREL, Golden, CO; vide opedido de patente provisório US CL3447) possui um recipiente de reação deaço inoxidável de cerca de 15 cm χ 51 cm com uma lança de injeção para aintrodução dos reagentes de processamento. A lança de injeção é conectadautilizando uma junta giratória a uma interface de conexão em um revestimento,em uma extremidade do recipiente que possui uma interface de conexãoadicional para acessar o recipiente. Quatro septos percorrem o comprimento daparede do recipiente e são ligados perpendicularmente à parede. Os septos e22 cilindros dos meios de atrito de cerâmica de 3,2 cm χ 3,2 cm (E. R.Advanced Ceramics, East Palestine1 OH), que flutuam livremente no recipiente,aplicam a mistura mecânica à biomassa e ao reagente conforme o recipiente érotacionado, promovendo a assimilação do reagente na biomassa. OPEHReator é colocado em um Equipamento Bellco Cell-Production Roller(Bélico Technology, Vineland, NJ, EUA) que fornece um mecanismo para arotação, e o reator com o equipamento de cilindros é alojado em uma câmarade temperatura controlada que fornece calor. Pode ser aplicado vácuo epressão ao recipiente de reação ao ligar as fontes externas na interface deconexão da lança do revestimento.

Métodos Analíticos

Quantificação da Celulose

A quantidade de celulose em cada amostra de biomassa departida foi determinada utilizando os métodos bem conhecidos no estado datécnica, tais como ASTM E1758-01 "Método padrão para a determinação decarboidratos por HPLC".

Medidas do Teor de Acúcar. Acetamida, Ácido Láctico ε Ácido Acético

Os açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose,arabinose e manose), acetamidar ácido láctico e ácido áceticõ em caldo désacarificação foram medidos por HPLC (Agilent Model 1100, AgilentTechnologies, Palo Alto, CA) utilizando as colunas Bio-Rad HPX-87P e Bio-RadHPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com colunas guardaapropriadas. O pH amostra foi medido e ajustado a 5-6 com ácido sulfúrico, senecessário. A amostra foi então passada através de um filtro de seringa de 0,2μητι diretamente em uma ampola de HPLC. As condições da corrida de HPLCforam como segue:

- Biorad Aminex HPX-87P (para carboidratos):

- Volume de injeção: 10-50 μΙ_, dependente da concentração edos limites do detector

- Fase móvel: água de grau HPLC1 0,2 μιτι filtrado e degaseificado

- Velocidade de fluxo: 0,6 ml_/ minuto

- Temperatura da coluna: 80 a 85°C, temperatura da colunaguarda < 60°C

- Temperatura do detector: o mais próximo possível datemperatura da coluna principal

- Detector: índice de refração

- Tempo da Corrida: 35 minutos da coleta de dados mais 15minutos de pós corrida (com possíveis ajustes para os compostos eluídosposteriormente)

- Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos, acetamida, ácidoláctico, ácido acético e etanol):

- Volume de injeção: 5 - 10 μΙ_, dependente da concentração edos limites do detector

- Fase móvel: ácido sulfúrico a 0,01 N, 0,2 pm filtrado edegaseificado

- Velocidade de fluxo: 0,6 mL/ minuto

-Temperatura da coluna: 55°C

- Temperatura do detector: o mais próximo possível datemperatura da coluna

- Detector: índice de refração

- Tempo da Corrida: 25 a 75 minutos da coleta de dados

Após a corrida, as concentrações na amostra foram determinadasa partir das curvas padrão para cada um dos componentes.Exemplo 1

Tratamento Prévio da Forragem em Alta Concentração de Biomassa, AltaTemperatura ε Comparação das Concentrações de Amònia

O recipiente do reator Zipperclave® e o prato cabeça foram aquecidospreviamente a uma temperatura de tratamento prévio alvo antes da introdução dacarga de biomassa ao circular o vapor dentro do reator e ventilar diversas vezes. Ocondensado formado durante o aquecimento prévio foi removido por aspiração avácuo antes do tratamento prévio. O balde Hastelloy® foi carregado com 0,635 cm(1/4 de polegada) de forragem moída (100 g, com base em peso seco) e inseridodentro do reator pré aquecido. O agitador do reator foi fixado em 20 rpm enquanto umvácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente interno e a à carga de biomassa. Asolução de hidróxido de amônio de força necessária para fornecer um peso seco daconcentração de biomassa de 30% em peso com relação ao peso da mistura deamônia aquosa e biomassa, bem como a concentração de amônia desejada listadana Tabela 1, foi injetada próxima ao fundo do recipiente com um bocal do tipo spray.As amostras de teste possuíam uma concentração de amônia final de 12% comrelação ao peso seco da biomassa, enquanto as amostras com uma concentração deamônia final de 35% com relação ao peso seco da biomassa foram utilizadas comomeio de comparação. Quando a temperatura da carga de biomassa atingiu 50°C, ovapor foi introduzido próximo ao fundo do reator para fluidizar e aumentar atemperatura da carga de biomassa a 140°C ou 170°C. Ao final do tratamento prévio,o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação, e um vácuo(cerca de 85 kPa) foi aplicado por 3 minutos para diminuir a temperatura e remover aamônia adicional da calda tratada previamente antes da abertura do reator e darecuperação da biomassa tratada previamente.

Toda a calda não lavada, de tratamento prévio contendo 0,5 g decelulose (com base na composição inicial de matéria prima) foi adicionada em umvolume final de 50 ml_ a um frasco de agitação de 125 mL. O ácido acético (10 a 100μΙ_) foi adicionado, para titular o pH da biomassa tratada previamente com amônia a5,0 antes da adição de enzima por causa da sensibilidade das enzimas a ambientesde pH elevado. O pH foi controlado a 5,0 durante a sacarificação pela adição de 50mM de tampão citrato e a temperatura foi mantida a 50°C. A celulase Spezyme® CP(Genencor International, Rochester, NY, EUA) foi adicionada à concentração listadapara cada amostra na Tabela 1. O teor de açúcar no caldo da sacarificação resultantefoi determinado após 96 horas de sacarificação de acordo com a medida do protocolodescrito nos Métodos Gerais. A liberação de açúcar após 96 horas é mostrada naTabela 2. Os controles para este experimento foram (1) ferragem de milho nãotratado, que rendeu 23% do rendimento teórico de glicose (utilizando 56 mg decelulase/ g de celulose) e (2) vapor (140°C) de ferragem de milho tratadopreviamente, que rendeu 40% do rendimento teórico de glicose (utilizando 56 mg decelulase/ g de celulose); a xilose não foi medida para os controles.

Tabela 1

Liberação do Açúcar a Partir da Forragem de Milho Tratada Previamentecom 96 Horas de SacarificaçãoDWB: peso seco da biomassa.

<table>table see original document page 31</column></row><table>Estes resultados indicam que um tratamento prévio utilizandoamônia a 12% por 15 minutos a 140°C, seguido pela sacarificação, libera maisglicose e xilose do que o tratamento prévio na utilização de amônia a 35% por5 minutos a 140°C. Desse modo, as vantagens de utilizar baixa concentraçãode amônia pode ser incorporada por um pequeno aumento no tempo dotratamento prévio.

Exemplo 2

Tratamento Prévio da Forragem em Alta Concentração de Biomassa,Baixa Temperatura ε Concentração Muito Baixa de Amônia

O reator Jaygo foi carregado com 0,635 cm de forragem moída(13 Kg, base de peso seco). Um vácuo (67,7 kPa) foi aplicado ao vaso, e asolução de hidróxido de amônio diluída foi injetada para fornecer umaconcentração de amônia de 6,2 g de amônia/100 g de peso seco da biomassae um peso seco da concentração de biomassa de 30% em peso com relaçãoao peso total da mistura amônia aquosa e biomassa. O vácuo foi aliviado e ovapor foi aplicado ao revestimento para aquecer a forragem a 100°C. Aforragem encharcada foi mantida na temperatura por 8 horas com misturaconstante a 32 rpm, então deixada resfriar ao longo da noite com misturacontínua da calda resultante.

A calda de tratamento prévio não lavada e inteira contendo0,5 g de celulose (com base na composição de matéria prima inicial) foiadicionada em um volume final de 50 mL a um frasco de agitação de 125mL. O ácido acético (10-100 μΙ_) foi adicionado, caso necessário paratitular o pH da biomassa tratada previamente com amônia a 5,0 antes daadição da enzima por causa da sensibilidade das enzimas aos ambientesde pH elevado. O pH foi controlado a 5,0 durante a sacarificação pelaadição de 50 mM de tampão citrato, e a temperatura foi mantida a 50°C. Acelulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, Nova Iorque,EUA) foi adicionada a 56 mg/ g de celulose. O teor de açúcar do caldo desacarificação resultante foi determinado após 96 horas de sacarificaçãode acordo com os protocolos de medidas de açúcar descritos nosMétodos Gerais e é mostrado na Tabela 2.

Tabela 2

Liberação do Açúcar das Forragens de Milho Previamente Tratadas a 96 Horas

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Os resultados indicam que estas condições de tratamento préviode concentrações muito baixas de amônia e baixas temperaturas (por umperíodo de 8 horas) são tão eficazes quanto utilizar 12% de amônia a 140°Cpor 15 minutos.

Exemplo 3

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Alta Concentração de Biomassa,Baixa Temperatura, ε Concentração Muito Baixa de Amônia Seguida pelaSacarificação com Alta Concentração de Biomassa

As espigas de milho inteiras ou fracionadas (cerca de 13 kg, basede peso seco) foram colocadas no reator Jaygo. As espigas foram fracionadasao passar através do refinador em disco (Métodos Gerais) equipado compratos C-2975. As espigas de milho fracionadas resultantes foram passadasatravés de uma malha de 1,27 cm. Quaisquer pedaços retidos foram passadosatravés do refinador em disco novamente com uma fenda menor de 0,5 cm. Foiaplicado vácuo ao reator e a solução de hidróxido de amônia diluída foi injetadapara fornecer a concentração amônia final desejada (2% ou 6%), e aconcentração de biomassa seca (30% ou 40%) como dado na Tabela 3. Ovácuo foi aliviado e o vapor foi aplicado ao revestimento para aquecer asespigas de milho enquanto eram encharcadas a uma temperatura de 93°C paraa amostra de espiga inteira e 85°C para as amostras de espigas fracionadas.

Os períodos curtos de maiores velocidades do agitador (até 96 rpm) foramaplicados em uma tentativa de aumentar a velocidade de aquecimento. Asespigas encharcadas foram mantidas em uma temperatura por 4 ou 8 horascom agitação constante a 32 rpm e então deixadas resfriar ao longo da noitecom agitação contínua.

Antes da biomassa tratada previamente ter sido removida doreator, o reator foi colocado sob vácuo a 90°C para retirar a amônia dabiomassa tratada previamente. Antes da sacarificação, o pH da biomassade espiga de milho tratada previamente foi ajustado a 5,5 com ácidocítrico sólido. Cerca de 10 kg de espiga de milho inteira tratadapreviamente foi sacarificada em um reator Jaygo a 50°C. Cerca de 1.400g da espiga de milho fracionada tratada previamente foram adicionadosao PEHReator1 junto com 22 cilindros de atrito de cerâmica (3,2 cm dediâmetro χ 3,2 cm de comprimento; E. R. Advanced Ceramics, EastPalestine, OH) para sacarificação. Uma mistura de enzima de 28 mg decelulose Spezyme CP®/ g em forragem não tratada mais 28 mg/ g decelulose Multifect Xylanase® foi utilizada para cada reação desacarificação. O peso seco final da concentração de biomassa no iníciode cada sacarificação era 30% com relação ao peso total da mistura deassociação de enzima de sacarificação da biomassa tratada previamente.

O PEHReator foi rotacionado axialmente a 19 rpm enquanto manteve umatemperatura de 50°C. O conteúdo de açúcar do caldo de sacarificaçãoresultante foi determinado de acordo com o protocolo de medidas deaçúcar nos Métodos Gerais. A liberação do açúcar após 96 horas émostrada na Tabela 3.Tabela 3

Liberação de Açúcar das Espigas de Milho Previamente Tratadas Utiuzando umaAlta Concentração de Biomassa f em Peso Seco) Durante a SacarificaçãoDWB: peso seco de biomassa (a porcentagem é calculada comrelação ao peso total da mistura).

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Exemplo 4

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Alta Concentração de Biomassa,Baixa Temperatura, ε Concentração Muito Baixa de Amônia Seguida pelaSacarificação de Alta Concentração de Biomassa

As espigas de milho fracionadas (13 kg, base seca) foramcolocadas no reator Jaygo. Após aplicar um vácuo no reator, a solução dehidróxido de amônio de força apropriada para fornecer 2% de amônia e 30% depeso seco da concentração de biomassa foi bombeada dentro do reator a 32rpm de mistura na temperatura ambiente. Os conteúdos do reator foram entãoaquecidos a 95°C utilizando um revestimento de vapor de baixa pressão. Umavez que o reator atingiu 95°C, uma injeção de vapor direta foi utilizada paraaquecer os conteúdos do reator a 145°C. Quando o reator atingiu 145°C, osconteúdos do reator foram mantidos a essa temperatura por 20 min utilizando ovapor do revestimento e alguma injeção de vapor direta. Após 20 minutos, foiaplicado um vácuo na ventilação ao reator e o motor de desfibração foi ligadopor 5 minutos. Após 1 hora, a água fria foi ligada no revestimento. Os teores doreator Jaygo foram resfriados entre 33°C e 37°C; então foi utilizado CO2 parapressurizar o reator a 138 kPa. O CO2 pressurizado da atmosfera foi mantidopor 30 minutos. A temperatura final dos conteúdos do reator era entre 27°C e31°C. O pH da biomassa encharcada/ tratada previamente foi de cerca de 7,5.

A biomassa tratada previamente foi removida do reator Jaygo etransferido ao PEHReator para a sacarificação e um peso seco final daconcentração de biomassa no início da sacarificação de 30% com relação aopeso total da mistura de associação de enzima sacarificada de biomassa tratadapreviamente. O pH foi então ajustado a 5,5 com ácido cítrico sólido, e o materialdigerido com 28 mg de celulose Spezyme CP®/ g e 28 mg/ g de celuloseMultifect Xylanase®/ g em espiga não tratada conforme descrito no Exemplo 3.O teor de açúcar do caldo de sacarificação resultante foi determinado deacordo com o protocolo de medidas de açúcar nos Métodos Gerais. A liberaçãodo açúcar após 96 horas de digestão é mostrada na Tabela 4.

Tabela 4

Liberação de Açúcar das Espigas de Milho Tratadas Previamente Utilizando umaAlta Concentração de Biomassa (em Peso Seco) Durante a Sacarirçasão

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Exemplo 5

Tratamento Prévio com Adição de Plastificante

A espiga de milho inteira foi tratada previamente conformedescrito no Exemplo 3 em peso seco da concentração de biomassa de cercade 30% com relação ao peso total de mistura de amônia aquosa e biomassa,IOO0C1 por 8 horas no reator Jaygo com 3% em peso com relação ao pesoseco da biomassa de glicerol adicionado para agir como um plastificante. Apóso tratamento prévio o pH do material resultante foi ajustado a 5 com ácidocítrico sólido. A espiga tratada previamente foi então digerida conforme descritono Exemplo 3. Uma mistura de enzima de 28 mg de celulose Spezyme CP®/ gem forragem não tratada mais 28 mg/ g de celulose Multifect Xylanase® emespiga não tratada foi utilizada. Após 96 horas de digestão, a concentração deglicose era de 92,3 g/Lea concentração de xilose era de 54,4 g/ L.

Exemplo 6

Refinamento do Disco da Biomassa Tratada Previamente

A forragem foi tratada previamente da maneira conformedescrita no Exemplo 1, com amostras diferentes possuindo baixaconcentração de amônia (12%) ou concentrações comparativas de amônia(35%), e condições de temperatura, tempo e enzima conforme listado naTabela 5. As espigas inteiras foram tratadas previamente conforme descritono Exemplo 3 com diferentes amostras possuindo concentrações muitobaixas de amônia (3% ou 6%), e outras condições conforme listadas naTabela 5. Seguindo o tratamento prévio, as amostras foram passadasatravés de um refinador de disco Sprout Waldron. A fenda entre o pratoestacionário e o prato giratório foi fixada a 0,254 mm (0,010 polegadas) e avelocidade de alimentação da verruma a 7 rpm. O material refinado foisacarificado conforme descrito no Exemplo 2 e o teor de açúcar do caldo desacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolo demedida de açúcar nos Métodos Gerais. Os resultados da sacarificação a 96horas são mostrados na Tabela 5. Os resultados mostraram que com arefinação do disco antes da sacarificação, foi obtido uma melhordigestibilidade, ou foi eficaz o uso de menores concentrações de enzima.Tabela 5

Digestibilidade do Material Tratado Previamente que foi Refinado emDisco antes da Sacarificação

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Exemplo 7

Tratamento por Pistola de Vapor da Biomassa Tratada Previamente

A forragem foi tratada previamente conforme descrito noExemplo 1 utilizando as condições de 30% em peso seco de biomassacom relação ao peso total da mistura de amônia aquosa e biomassa, 6%em peso de amônia com relação ao DWB, IOO0C1 8 horas, no reatorJaygo. A espiga foi tratada previamente conforme descrita no Exemplo 3utilizando as condições de 40% em peso seco da biomassa com relaçãoao peso total da mistura de amônia aquosa e biomassa, 6% em peso deamônia com relação ao DWB, 93°C, 8 horas, no reator Jaygo. Asamostras de cada biomassa tratada previamente foram carregadas em umreator de pistola de vapor de 4 litros. O material tratado previamente foisubmetido a 170°C por 5 min ou 140°C por 20 min antes de ser liberadoatravés de um molde. O material resultante foi sacarificado conformedescrito no Exemplo 2. Os resultados são dados na Tabela 6 abaixo. Osresultados mostraram que o tratamento pela pistola de vapor antes dasacarificação aprimorou a liberação de glicose.

Tabela 6

Digestibilidade do Material Tratado Previamente Após o Tratamento porPistola de Vapor

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Exemplo 8

Modelagem do Tratamento Prévio com Amônia Reciclada

As vantagens da reciclagem da amônia foram examinadas comos modelos Aspen (Aspen Technologies, Cambridge1 MA, versão 12.1) paradois esquemas de tratamento prévio: baixa temperatura (85°C), tempo deresidência longo (4 horas) e alta temperatura (130°C), tempo de residênciacurto (20 min). Em cada modelo existiu uma série de 3 tanques flashoperando em pressões sucessivamente menores após o reator detratamento prévio para fornecer um meio para a reciclagem de amônia.

Conforme a corrente de alimentação entrava em cada tanque, ela se dividiaem vapor e frações líquidas devido a redução na pressão. A fração do vaporfoi reciclada para o tratamento prévio, enquanto a fração líquida foi para apróxima etapa no processo. Assumindo que 2% em peso de amônia comrelação ao DWB e cerca de 27% em peso seco da biomassa com relação aopeso total da mistura de amônia aquosa e biomassa no tratamento prévio, ofornecimento de amônia fresca e das correntes de reciclagem para cadaprocesso é mostrado na Tabela 7. Em ambos os modelos, os tanques flashoperaram de modo similar tal que a reciclagem da amônia foi similar. Emambos os cenários, mais da metade da amônia requerida foi fornecidaatravés de reciclagem, reduzindo a necessidade e o custo da amônia fresca.Tabela 7

Amônia Reciclada no Tratamento Prévio - Modelo de Resultados de Aspen

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Exemplo 9

Produção de Etanol a partir de Biomassa Tratada Previamente com BaixaConcentração Amônia ε Espiga de Milho Sacarificada ε Comparação àForragem Tratada Previamente com Muita Amônia ε Sacarificada

O hidrolisado de espiga foi gerado pelo tratamento prévio deespigas inteiras no reator Jaygo por 8 horas a 93°C com 6% em peso deamônia com relação ao peso seco da biomassa em uma concentração debiomassa em peso seco de 40% com relação ao peso total da mistura deamônia aquosa da biomassa, conforme descrito no Exemplo 3. Após otratamento prévio, a amônia foi removida por aquecimento do reator a90°C sob vácuo. O pH da biomassa tratamento prévio foi ajustado a 5com ácido sulfúrico. A biomassa tratamento prévio foi sacarificada noreator Jaygo a 30% em peso seco da biomassa com relação ao peso totalda mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassatratada previamente com 28 mg/g de celulose Spezyme® celulase e 28mg/g de celulose Multifect® xilanase por 168 horas a 50°C e pH 5. Ohidrolisado resultante foi utilizado para a fermentação de Zymomonasmobilis 8b em fermentadores Sixfors (INFORS AG, Suíça). A Zymomonasmobilis 8b é uma cepa de Zymomonas mobilis que foi modificadageneticamente para fornecer, em relação ao tipo selvagem, uma produçãomelhorada de etanol e é descrita no pedido de patente US 2003/0162271A1 (Exemplos IV, Vl e XII). O hidrolisado da espiga compreende 78 g/L deglicose, 51 g/L de xilose, 6 g/L de acetamida e 7 g/L de ácido acético. Ohidrolisado de espiga de milho foi utilizado a 40% e 80% de força, com obalanço do meio sendo o meio aquoso concentrado que consiste deextrato de levedura, e quantidades de KH2PO4 em quantidades tais quesuas concentrações na calda final foram cerca de 5 g/L e 2 g/Lrespectivamente. Adicionalmente, na calda 40% hidrolisada, a glicose e axilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer suasconcentrações ao mesmo nível que nas caldas 80% hidrolisadas. Afgrmgntaçgo foi realizada a 37°C. A agitação nos fermentadores era de100 rpm e o pH foi mantido a 5,5 por adição de KOH a 2N. Os resultadossão mostrados na Tabela 8. Os açúcares e o etanol foram analisadosconforme descrito nos Métodos Gerais.

Para fins de comparação, a forragem hidrolisada foi gerada pelotratamento prévio da forragem com 35% em peso de amônia com relação aopeso seco da biomassa em um peso seco da concentração de biomassa decerca de 30% em peso com relação ao peso total da mistura de amônia aquosae biomassa a 170°C por 5 minutos no reator Zipperclave®, conforme descrito noExemplo 1. A biomassa tratada previamente foi digerida enzimaticamente a30% em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura deassociação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente com224 mg/g de celulose Spezyme CP® celulase a 50°C e pH 5 para gerar umaalta concentração de açúcar hidrolisado para o teste de fermentação. Ohidrolisado resultante compreendeu 88 g/L de glicose, 52 g/L de xilose, 9 g/Lde ácido acético e 15 g/L de ácido láctico. Para a produção de etanol, aZymomonas mobilis 8b foi fermentada em calda hidrolisada de 40% ou 80%(v/v). O volume remanescente foi feito de meio aquoso concentrado queconsiste em extrato de levedura, KH2PO4 e tampão MES em quantidades taisque suas concentrações na calda final seria de cerca de 10 g/L, 2 g/L e 0,1 M,respectivamente. Adicionalmente, na calda hidrolisada a 40%, a glicose e axilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer suasconcentrações ao mesmo nível que a calda hidrolisada a 80%. A fermentaçãofoi feita a 30°C e a pH 6 em 25 ml de frascos de agitação com 20 ml de volumetrabalhado. A agitação foi mantida a 150 rpm. A análise foi com relação àamostra de fermentação do hidrolisado da espiga e os resultados são dados naTabela 8.

Tabela 8

Utilização do Açúcar ε Rendimentos do Etanol na Fermentação dosHidrolisados de Espiga de Milho ε de Forragem

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Estes resultados mostraram que a fermentação para produziretanol a partir de hidrolisado de espiga de milho de tratamento prévio combaixa concentração de amônia foi mais eficiente do que da forragem detratamento prévio com muita amônia.Exemplo 10

Produção do 1.3-Propanodiol da Biomassa de Espiga Sacarificada εTratada Previamente com Concentração Muito Baixa de Amónia

O hidrolisado gerado pelo tratamento prévio e pelasacarificação da espiga foi fermentado para produzir 1,3-propanodiol. Ohidrolisado foi gerado pelo tratamento prévio de pedaços de espiga noreator de pistola de vapor. A primeira espiga de biomassa foi carregadano PEHReator (descrito nos Métodos Gerais), foi aplicado o vácuo e foiinjetada a solução de hidróxido de amônio diluída para fornecer umaconcentração de amônia de 4 g de amônia/ 100 g de peso seco dabiomassa e um peso seco da concentração de biomassa de 30 g de pesoseco da biomassa/ 100 g da mistura de amônia aquosa e biomassa. Orecipiente do reator foi carregado com amônia e espiga e foi rotacionadoa 4°C por 30 minutos. Os teores foram transferidos para o reator depistola de vapor (descrito nos Métodos Gerais), a temperatura aumentoua 145°C, e a mistura foi mantida na temperatura por 20 minutos. Omaterial da pistola de vapor foi descarregado em um tanque flash e foimantido o vácuo no tanque flash para auxiliar na remoção de amônia.Após o ajuste do pH, a biomassa tratada previamente foi sacarificada a30 g em peso seco de biomassa/ 100 g de mistura de associação deenzima de sacarificação de biomassa tratada previamente com 28,4 mg/gde celulose Spezyme CP® celulase e 10,1 mg de proteína ativa/ g deassociação de enzima de celulose que consiste em β-glucosidase,xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase por 72 horas a 50°C e pH5,5. O hidrolisado resultante foi utilizado como uma fonte de açúcarfermentável para a conversão a 1,3-propanodiol pela cepa de E. colirecombinante RJ8n pBE93-k1. A construção da cepa RJ8n pBE93-k1 édescrita em detalhes no documento WO 2004/018645 (Exemplo 7), e éum derivado da cepa RJ8n, descrita no documento US 6.358.716. Ohidrolisado foi utilizado a 10% com o balanço sendo o meio aquoso queconsiste em 7,5 g/L de KH2PO4, 2,0 g/L de ácido cítrico*H20, 4,0 ml/L deNH4OH a 28%, 3,0 g/L de (NH4)2SO4, 2,0 g/L de MgS04*7H20, 0,2 g/L deCaCI2*2H20, 0,33 g/L de citrato de amônio férrico, 0,5 g/L de extrato delevedura, 0,1 mg/L de vitamina B12, 1,0 mg/L de FeS04*7H20, 1 mg/L deZnS04*7H20, 1 g/L de CuS04*5H20, 1 mg/L de CoCI2*6H20, 0,3 mg/L deMnS04*7H20, 1 g/L de H3BO4, 0,10 g/L de NaMo04*2H20, 10 mg/L deNaCI, com o pH final ajustado a 6,8. As culturas foram iniciadas a partirde reservas congeladas (15% de glicerol como crioprotetor) em 50mL de meio em um frasco embaçado de 250 mL. As culturas foramincubadas a 34°C e 300 rpm de agitação por 24 horas. A quantidade de1,3-propanodiol produzida foi medida por HPLC sob as seguintescondições:

- Coluna: Showdex SH1011

- Volume de amostra: 20 μΐ_

- Fase móvel: H2SO4 a 0,01 N

- Velocidade de fluxo: 0,5 mL/ minuto

- Temperatura da coluna: 50°C

- Detector: conjunto de fotodiodo Waters 996

- Temperatura do detector: 40°C

- Tempo da Corrida: 40 minutos

Os resultados são mostrados na Tabela 9 abaixo. Osprodutos da fermentação da glicose pela cepa RJ8n PBE93-k1 de E. coliincluem o glicerol (um metabólito intermediário) e o 1,3-propanodiol. Osexperimentos foram realizados em frascos duplicados e testados a 24horas. Neste sistema, a glicose no hidrolisado foi convertida a ambos oglicerol e o 1,3-propanodiol.Tabela 9

Utilização do Substrato ε Formação do Produto pela Fermentação comE. COLI

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Exemplo 11

Formação da Acetamida Durante o Tratamento Prévio

As amostras derivadas de espigas de milhos tratadas previamente deacordo com os processos descritos no Exemplo 3 e Exemplo 4 foram analisadas paradeterminar os destinos dos grupos acetila na biomassa. Os caldos do tratamentoprévio (mistura do tratamento prévio com sólidos insolúveis removidos) foramanalisados quanto ao teor de ácido acético e acetamida conforme segue. O pH decada amostra foi ajustado a cerca de 3 com H2SO4 (72%). Para as medidas deacetamida, a amostra foi passada através de um filtro de 0,2 pm e analisadas porHPLC de acordo com as condições listadas abaixo. Para as medidas de acetato total(inclui o acetato presente como ácido acético e acetamida), a amostra acidificada foiautoclavada por 1 hora a 1210C; a acetamida foi convertida quantitativamente a ácidoacético durante esta etapa. Após a autoclave, a amostra foi deixada para resfriar. Aamostra foi então passada através de um filtro de 0,2 pm em uma ampola de amostrae analisada de acordo com as condições listadas abaixo. As concentrações de ácidoacético e acetamida foram determinadas a partir das curvas padrão geradas paracada um.

- Fase móvel: H2SO4 a 0,01 N, 0,2 pm filtrado e degaseificado

- Velocidade de fluxo: 0,6 ml_/ minuto

- Temperatura da coluna: 55 a 65°C- Temperatura do detector: o mais próximo possível datemperatura da coluna

- Detector: índice de retração

- Tempo da Corrida: 60 minutos

- Coluna: coluna Biorad Aminex HPX-87H com coluna guardacorrespondente.

Os resultados para as 3 diferentes condições de tratamentoprévio analisadas são mostradas na Tabela 10. para cada caso, todos osgrupos acetila foram solubilizados para o ácido acético ou a acetamida.

Tabela 10

Conversão dos Grupos Acetila na Biomassa em Acetamida Durante oTratamento Prévio

DWB1 peso seco da biomassa. (a porcentagem é calculada comrelação ao peso total da mistura de amônia aquosa e biomasa)

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Utilizando uma concentração de amônia de 6%, próximo a metadedos grupos acetila foram convertidos a acetamida, o que é não inibitório para ocrescimento do biocatalisador conforme mostrado no Exemplo 12.

Exemplo 12

Efeito da Acetamida ε do Ácido Acético no Crescimento de ZymomonasPara testar a toxicidade da acetamida e do ácido acético, acepa de Ζ. mobilis 8b (descrita no Exemplo 9) foi cultivada na meio defermentação em pH 6,0 com e sem acetamida ou ácido acético. O meiode fermentação foi composto de 10 g/ L de extrato de levedura, 2 g/ L deKH2PO4, 70 g/ L de glicose, 40 g/ L de xilose e 0,1 M de tampão MES. OZ. mobilis 8b foi cultivado em frascos de agitação de Erlenmeyerembaçado de 25 mL rotacionados a 150 rpm a 30°C em meio nãosuplementado (controle), meio suplementado com 6 g/ L de acetamida oumeio suplementado com 7,2 g/ L de ácido acético. Conforme mostrado naFigura 1, a presença de acetamida não possui a influencia na taxa decrescimento ou na densidade final de Z. mobilis, enquanto que a presençade ácido acético resultou em uma taxa de crescimento reduzida e menorrendimento celular (conforme medido pela massa celular seca).

Exemplo 13

Tratamento Prévio do Bagaço em Alta Concentração de Biomassa. AltaTemperatura ε Concentração Muito Baixa de Amónia. ε Sacarificação emBaixa ε Alta Concentração

O PEHReator (descrito nos Métodos Gerais), com nenhummeio de atrito, foi carregado com 1,27 cm de bagaço moído (370 g, baseem peso seco). Este bagaço da cana de açúcar era a NIST ReferenceMaterial RM 8491, do clone da cana de açúcar H65-7052, originalmenteobtido pela Hawaii Sugar Planters Association, sub-estação Kunia, Oahu,HU. Ele foi moído em um moinho Wiley para passar através de umamalha de 2 mm, com as finas (+74 malha) removidas. O PEHReator foiresfriado a 4°C pela rotação em contato com gelo na superfície externa.Um vácuo foi aplicado ao recipiente de reação e foi injetada a solução dehidróxido de amônio diluído, que foi previamente resfriado em uma salafria a 4°C e passada através do tubo imerso em banho de água gelada,para fornecer uma concentração de amônia de 4 g/ 100 g de peso secoda biomassa e um peso seco da concentração da biomassa de 45g/100 gda mistura de amônia aquosa e biomassa total. O recipiente de reaçãocarregado com amônia e bagaço foi resfriado a 4°C pela aplicação degelo à superfície do recipiente do reator giratório, e rotacionado a 4°C por30 min. Neste tempo, os conteúdos foram transferidos para o reator depistola de vapor que é descrito nos Métodos Gerais. Uma vez que o reatorde pistola de vapor foi carregado com a mistura de bagaço e amônia, atemperatura foi aumentada a 145°C e a mistura foi mantida nestatemperatura por 20 min. No final do tempo de tratamento prévio, o bagaçofoi descarregado do reator de pistola de vapor através de um moldecircular de 1 polegada em um tanque flash. Uma amostra de bagaçotratado previamente foi subseqüentemente sacarificado em um frasco deagitação e outra amostra (cerca de 163 g de peso seco) foi sacarificadano PEHReator. A sacarificação no frasco de agitação foi realizada em 5%de peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura deassociação de enzima de sacarificação da biomassa tratada previamente,enquanto a sacarificação no PEHReatorfoi realizada a 30% do peso secoda biomassa com relação ao peso total da mistura de associação deenzima de sacarificação da biomassa tratada previamente. A temperaturafoi mantida a 50°C.

Para a sacarificação do PEHReator, cerca de 476 g (cerca de163 g de peso seco) de biomassa tratada previamente e 22 cilindros deatrito de cerâmica foram adicionados ao recipiente do reator. O pH foiajustado a 5,0 - 5,5 com ácido cítrico sólido. O recipiente do reator foimantido dentro de uma câmara de incubação controlada a 50°C erotacionada axialmente a 19 rpm. O bagaço não tratado previamentetambém foi sacarificado a 5% em peso seco da biomassa com relação aopeso total da mistura de associação de enzima de sacarificação dabiomassa tratada previamente em um frasco de agitação. Todas assacarificações foram feitas com 28,4 mg/g de celulose Spezyme CP®celulase e 28,4 mg/g de celulose Multifect® xilanase a 50°C e pH 5,5 por96 horas. Os rendimentos dados na Tabela 11 abaixo são a liberaçãocomo porcentagem do rendimento teórico.

Tabela 11

Rendimentos Seguindo o Tratamento Prévio ε a Sacarificação doBagaço

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ND: não determinado

Os resultados demonstraram que o tratamento prévio do bagaçocom concentração muito baixa de amônia permite a liberação substancial deaçúcar quando comparado ao controle não tratado previamente, e que asacarificação em alta concentração de biomassa seca no PEHReator é muitoeficaz na liberação de açúcares.

Exemplo 14

Tratamento Prévio da Serragem de Choupo Amarelo em AltaConcentração de Biomassa, Alta Temperatura ε Concentração MuitoBaixa de Amônia, ε Sacarificação a Baixa ε Alta Concentração

O PEHReator, sem o meio de atrito, foi carregado comserragem de choupo amarelo (596 g, base em peso seco; adquirido daSawmiller Inc., Haydenville1 OH). Foi aplicado um vácuo ao recipiente doreator e a solução de hidróxido de amônia diluída foi injetada parafornecer uma concentração de amônia de 6g/ 100 g em peso seco debiomassa e um peso seco de concentração de biomassa de 44 g/ 100 gda mistura de amônia aquosa e biomassa. O recipiente do reatorcarregado com amônia e serragem de choupo amarelo foi trazido a 4°Cconforme descrito no Exemplo 13, e rotacionado a 4°C por 30 min. Nestetempo, os conteúdos foram transferidos para o reator de pistola de vapor.

Uma vez que o reator de pistola de vapor foi carregado com a mistura deamônia e choupo, a temperatura foi aumentada para 145°C e a mistura foimantida nesta temperatura por 20 minutos. No final do tempo detratamento prévio, a serragem de choupo amarelo foi descarregada doreator de pistola de vapor através de um molde circular de 1 polegada emum tanque flash. Uma amostra de serragem de choupo amarelo tratadapreviamente foi sacarificada subseqüentemente conforme descrito noExemplo 13 em um frasco de agitação, e outra amostra foi sacarificada noPEHReator. A sacarificação do frasco de agitação foi realizada a 5% empeso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura deassociação de enzima de sacarificação de biomassa tratadapreviamente, enquanto que a sacarificação do PEHReator (utilizandocerca de 279 g em peso seco de serragem tratada previamente) foirealizada a 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total damistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratadapreviamente. A serragem de choupo amarelo não tratado previamentetambém foi sacarificada a 5% em peso seco da biomassa com relação aopeso total da mistura de associação de enzima de sacarificação debiomassa tratada previamente em um frasco de agitação. Todas assacarificações foram feitas com 28,4 mg/ g de celulose de Spezyme CP®celulase e 24,8 mg/ g de celulose Multifect® xylanase a 50°C e pH 5,5 por96 horas. Os rendimentos dados na Tabela 12 abaixo são a liberação oucada açúcar como uma porcentagem do rendimento teórico.

Tabela 12

Rendimentos Seguindo o Tratamento Prévio ε a Sacarificacão daSerragem de Choupo Amarelo

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ND: não determinado

Os resultados demonstraram que o tratamento prévio daserragem de choupo amarelo com concentração muito baixa de amôniapermite a liberação substancial de açúcar quando comparado ao controle nãotratado previamente, e que a sacarificação em alto peso seco de biomassa noPEHReator é mais eficaz na liberação de açúcares do que o frasco de mistura.

Exemplo 15

Produção de Etanol pela Fermentação de Levedura em Hidrolisado apartir de Biomassa de Espiga de Milho Sacarificada ε Tratada Previamentecom Concentração Muito Baixa de Amônia

O mesmo hidrolisado utilizado para produzir o 1,3-propanodiol noExemplo 10 também foi utilizado para produzir etanol pela fermentação dalevedura. Este hidrolisado foi utilizado como uma fonte de açúcar fermentávelpara a conversão a etanol pelo tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiaenos frascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado a 10% (v/v) de força, com obalanço sendo o meio aquoso consistindo em 10 g/ L de extrato de levedura e20 g/ L de peptona. As leveduras foram cultivadas em 50 mL de meio em umfrasco embaçado de 250 mL. As culturas foram incubadas a 30°C com agitaçãoa 250 rpm por 24 horas. A quantidade de etanol produzida foi medida porHPLC conforme descrito no Exemplo 9 e os resultados dos frascos emduplicata estão listados na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13

Utilização do Substrato ε Formação do Produto pela Fermentação comLevedura

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Exemplo 16

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior Concentração deBiQmASSA Seca com Concentração Muito Baíxa de Amônía

O mesmo hidrolisado utilizado para produzir o 1,3-propanodiolno Exemplo 10 também foi utilizado para produzir ácido Iactico comLactobacillus brevis em frascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado a10% (v/v) de força, com o balanço sendo o meio aquoso consistindo em 5g/ L de extrato de levedura e 10 g/ L de peptona, 2g/ L de citrato deamônia, 5 g/ L de acetato de sódio, 0,1 g/ L de MgSO4, 0,05 g/L de MnSO4e 2 g/L de K2HPO4 e 1 g/ L de Tween. Os Lactobacillus foram cultivadosem 50 mL de caldo em um frascos embaçados de 250 mL. As culturas emduplicata foram incubadas a 34°C com agitação a 150 rpm por 24 horas. Aquantidade de ácido láctico produzida foi medida por HPLC conformedescrito no Exemplo 10 e está listada na Tabela 14. As duas amostras doFrasco 2 são ensaios em duplicata da mesma cultura.Tabela 14

Utilização do Substrato ε Formação do Produto pela Fermentação comLactobacillus brevis

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Exemplo 17

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior Concentração deBiomassa Seca com Concentração Muito Baixa de Amónia

As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira demaxilas (motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston,NJ), seguido pela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de1,9 cm padrão US. Aproximadamente 805 g de espigas fracionadas foramcarregadas no PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%. Aatmosfera no recipiente do reator foi suprida 5 vezes com nitrogênio antes docarregamento. O reator, sem nenhum meio de atrito, foi aquecido previamentea 75°C antes do inicio do experimento, sem rotação. Quando a temperaturadentro do recipiente do reator estabilizou a 75°C, o mecanismo de rolamentoda incubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidadeapropriada de solução de hidróxido de amônia diluída para fornecer umaconcentração de amônia de 6 g de amônia/100 g em peso seco de biomassa euma concentração de sólidos de 50 g em peso seco da biomassa/ 100 g depeso total da mistura de biomassa e amônia foi então bombeada dentro doreator. O etanol a 1 g/100 g em peso seco de biomassa também foi adicionadona solução. A solução de amônia foi bombeada através de uma alça aquecida,em um banho de água aquecido a cerca de 75°C, fabricada utilizando umreator Parr de 2 galões. A solução de hidróxido de amônia diluída e aquecidafoi injetada por meio de uma lança de injeção dentro do recipiente do reator epulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator. O reator foimantido a 75°C por 2 horas enquanto girava a 19 rpm. No final deste tempo,um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30 min pararemover a amônia e diminuir a temperatura dos conteúdos do reator a cerca de50°C. O dióxido de carbono foi então injetado no reator para aliviar o vácuo e oreator foi pressurizado a 103 kPa de pressão de CO2 no indicador e mantido napressão por 30 min a 50°C.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado, aberto e foiadicionado o meio de atrito. O pH dos conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5pela injeção de tampão de ácido cítrico a 1 M a pH 4,8 utilizando a lança deinjeção, para aumentar a força do tampão de ácido cítrico a cerca de 75 mM,mais a adição de monohidrato de ácido cítrico. Nem toda a amônia foi retiradana etapa a vácuo, nem neutralizada com CO2. O tampão de ácido cítrico foiinjetado dentro do reator seguindo o aquecimento a 5Q0C e então os conteúdosforam deixados para equilibrar ao incubar o reator a 50°C e 19 rpm por 1 hora.A injeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando alança de injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniforme dotampão nas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removidodo incubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pHestivesse acima de 5,5, então o monohidrato de ácido cítrico sólido adicionalera adicionado e o reator era incubado com mistura a 50°C por 1 horaadicional. Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5.Uma vez que o pH desejado era atingido, 12,9 mg/ g de celulose Spezyme CP(Genencor) e 5 mg de proteína ativa/ g de associação de enzima de celuloseque consiste em β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidaseforam carregadas dentro do reator.O reator permaneceu na incubadora a 50°Ce 19 rpm por 72 horas. Seguindo esse tratamento prévio e sacarificação, orendimento do monômero de glicose era de 62,0% e o rendimento domonômero de xilose era de 31,0%. O rendimento de glicose total era de 75,2%e o de xilose total era de 80,3%.

Exemplo 18

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior Concentração de Sólidoscom Concentração Muito Baixa de Amônia ε Condições Alternadas

As espigas de milho inteiras processadas com um moinhomartelo (10 polegadas de moinho martelo, Glen Mills Inc., Clifton, NH)para passar através de uma malha de 1,27 cm. Cerca de 805 g de espigade milho foram carregadas dentro do PEHReator. O teor de umidade nasespigas era de cerca de-7%. Também foram adicionados 22 cilindros deatrito de cerâmica (3,2 cm de diâmetro χ 3,2 cm de comprimento; E. R.Advanced Ceramics, East Palestine1 OH), ao reator. O reator foi aquecidopreviamente a 95°C antes de iniciar o experimento, sem rotação. Umvácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reator antes deiniciar e o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro dorecipiente do reator estabilizou a 95°C, o mecanismo de rolamento naincubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidadeapropriada de solução de hidróxido de amônia diluída para fornecer umaconcentração de amônia de 6 g de amônia/ 100 g em peso seco debiomassa e uma concentração de sólidos de 50 g em peso seco debiomassa/ 100 g em peso total da mistura de amônia e biomassa foi entãobombeada dentro do reator. A solução de amônia foi bombeada atravésde uma alça aquecida em um banho de água aquecida utilizando umreator Parr de 2 galões. A solução de hidróxido de amônia diluída eaquecida foi injetada em uma lança de injeção dentro do recipiente doreator e pulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator.O reator foi mantido a 95°C por 2 horas enquanto girava a 19 rpm. Nofinal deste tempo, um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vaso doreator por 30 min para remover a amônia e diminuir a temperatura dosconteúdos do reator a cerca de 50°C. O dióxido de carbono foi entãoinjetado no reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103kPa de pressão no indicador e mantido na pressão por 30 min a 50°C.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e o pH dosconteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeção de tampão de ácidocítrico a 1 M a pH 4,8, em que o monohidrato de ácido cítrico foiadicionado e dissolvido. O tampão de ácido cítrico foi injetado dentro doreator seguindo o aquecimento a 50°C e então os conteúdos foramdeixados para equilibrar ao incubar o reator a 50°C e 19 rpm por 1 hora. Ainjeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando alança de injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniformedo tampão nas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foiremovido do incubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado.Se o pH estivesse acima de 5,5, então o monohidrato de ácido cítricosólido adicional era adicionado e o reator era incubado com mistura a50°C por 1 hora adicional. Este processo foi repetido até que o pHestivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido, 12,9mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa/ g deassociação de enzima de celulose que consistia em β-glucosidase,xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregadas dentro doreator. O reator permaneceu na incubadora a 50°C e 19 rpm por 72 horas.Seguindo esses tratamento prévio e sacarificação, o rendimento domonômero de glicose era de 50,7% e o rendimento do monômero dexilose era de 35,7%. Os rendimentos de glicose e xilose totais eram de71,7% e 89,8%, respectivamente.Exemplo 19

Tratamento Prévio da Espiga de Milho com Concentração Muito Baixa deAmónia ε Base Adicional

As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira demaxilas (motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguidopela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de 1,9 cmpadrão US. Aproximadamente 460 g de espigas fracionadas foram carregadasno PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%. O reator foiaquecido previamente a 95°C antes do inicio do experimento, sem rotação. Umvácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reator antes do início e orecipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do recipiente reestabilizou a95°C, o mecanismo de rolamento da incubadora foi ligado e a rotação foiajustada a 19 rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amôniapara fornecer uma concentração de amônia de 3,2 g de amônia/100 g em pesoseco de biornassa e NaOH para fornecer uma concentração de 1,9 g de NaOH/100 g em peso seco da biomassa enquanto mantém a concentração de sólidosde 30 g em peso seco de biomassa/ 100 g de peso total da mistura debiomassa e amônia foi então bombeada dentro do reator. A amônia e a soluçãode base adicional foram bombeadas através de uma alça aquecida em umbanho de água fervente fabricada utilizando um reator Parr de 2 galões. Asolução de hidróxido de amônia diluída e aquecida foi injetada por meio de umalança de injeção dentro do recipiente do reator e pulverizada nas espigasfracionadas que giram e rolam no reator. Seguindo a injeção, o vácuo norecipiente foi aliviado para pressão atmosférica. O reator foi mantido a 95°C por30 min, então a temperatura foi diminuída a 85°C onde ela foi mantida por 4horas. No final deste tempo, um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vasodo reator por 30 min para remover a amônia e diminuir a temperatura dosconteúdos do reator a cerca de 50°C. O dióxido de carbono foi então injetadono reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressãono indicador e mantido na pressão por 30 min a 50°C.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e o pH detodos os conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeção de cerca de 75 mLde tampão de ácido cítrico a 1 M a pH 4,8, no qual o monohidrato de ácidocítrico foi adicionado e dissolvido. O tampão de ácido cítrico foi injetado dentrodo reator seguindo o aquecimento a 50°C e então os conteúdos foramdeixados para equilibrar ao incubar o reator a 50°C e 19 rpm por 1 hora. Ainjeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando a lançade injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniforme do tampãonas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesseacima de 5,5, então o monohidrato de ácido cítrico sólido adicional eraadicionado e o reator era incubado com mistura a 50°C por 1 hora adicional.Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez queo pH desejado era atingido, 28,4 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e28,4 mg/ g de celulose Multifect foram carregados no reator. O reatorpermaneceu na incubadora a 50°C e 19 rpm por 72 horas. Seguindo essetratamento prévio e a sacarificação, o rendimento do monômero de glicose erade 56,1% e o rendimento do monômero de xilose era de 39,5%. Osrendimentos de glicose e xilose total eram de 82,8% e 84,2%, respectivamente.Esses valores são as médias dos dois experimentos.

Exemplo 20

Tratamento Prévio à Temperatura Ambiente ε com Concentração MuitoBaixa de Amõnia

As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira demaxilas (motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguidopela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de 1,9 cmpadrão US. Aproximadamente 460 g de espigas fracionadas foram carregadasno PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%. Tambémforam adicionados ao reator 22 cilindros de atrito cerâmico (3,2 cm de diâmetroχ 3,2 cm de comprimento; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH,EUA). Um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reator antes doinício e o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do reatorreestabilizou a temperatura ambiente (22 a 26°C), o mecanismo de rolamentoda incubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidadeapropriada de solução de hidróxido de amônia diluída para fornecer umaconcentração de amônia de 4 g de amônia/100 g em peso seco de biomassa eenquanto mantém uma concentração de sólidos de 30 g em peso seco debiomassa/ peso total da mistura de biomassa e amônia foi então bombeadadentro do reator. A solução de hidróxido de amônia diluída foi injetada por meiode uma alça de injeção em um recipiente do reator e pulverizada nas espigasfracionadas que giram e rolam no reator. Seguindo a injeção, o vácuo em cadarecipiente foi aliviado para pressão atmosférica. O reator foi mantido atemperatura ambiente (22 a 26°C) por 24 horas. No final deste tempo, umvácuo (cerca de 81 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30 min pararemover a amônia. O dióxido de carbono foi então injetado no reator paraaliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressão no indicadorcom CO2 e mantido na pressão por 30 min a temperatura ambiente.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado, aberto e o pH dosconteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela adição de monohidrato de ácidocítrico seguido por aquecimento a 50°C e então foram deixados para equilibrarao incubar o reator a 50°C e 19 rpm por. O reator foi removido do incubador,aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesse acima de5,5, então o monohidrato de ácido cítrico sólido adicional era adicionado e oreator era incubado com mistura a 50°C. Este processo foi repetido até que opH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido, 12,9mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por gramade associação de enzima de celulose que consistia em β-glucosidase, xilanase,β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregadas dentro do reator. O reatorpermaneceu na incubadora a 50°C e 19 rpm por 72 horas. Seguindo essetratamento prévio e sacarificação, o rendimento do monômero de glicose erade 41,7% e o rendimento do monômero de xilose era de 25,4%. Osrendimentos de glicose e xilose totais eram de 50,1% e 53,2%,respectivamente. Esses valores eram as médias dos 2 experimentos.

Claims (32)

1. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE BIOMASSA paraproduzir açúcar fermentável, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) colocar em contato a biomassa com uma solução aquosa quecompreende amônia para formar uma mistura de amônia aquosa e biomassa,em que a amônia está presente em uma concentração pelo menos suficientepara manter o pH alcalino da mistura de amônia aquosa e biomassa, mas emque dita amônia está presente a menos do que cerca de 12% em peso comrelação ao peso seco da biomassa, e ainda em que o peso seco da biomassaestá em uma alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% empeso com relação ao peso da mistura de amônia aquosa e biomassa, paraproduzir um produto de biomassa tratada previamente; e(b) colocar em contato o produto da etapa (a) com umaassociação de enzima de sacarificação sob condições apropriadas paraproduzir açúcares fermentáveis.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o pH da mistura de amônia aquosa e biomassa é superior a 8.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é aplicado o vácuo à biomassa antes do contato da biomassacom uma solução aquosa que compreende amônia.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dito peso seco da biomassa está em uma alta concentraçãode sólidos de pelo menos cerca de 15% a cerca de 80%.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que dito peso seco da biomassa está em uma alta concentraçãode sólidos de pelo menos cerca de 15% a cerca de 60%.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita amônia está presente a menos do que cerca de 10% comrelação ao peso seco da biomassa.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que dita amônia está presente a menos do que cerca de 6% comrelação ao peso seco da biomassa.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste emculturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduossólidos industriais, resíduos de terrenos, resíduos de madeira e de silvicultura.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste emgrama do gênero Panicum, resíduos de papéis, lodo da fabricação de papéis,grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas,trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço dacana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos do processamento de grãos,árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbustos emoitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste emespigas de milho, forragem de milho, cascas de milho, bagaço da cana deaçúcar, forragem, grama do gênero Panicum, palha de trigo, feno, palha decevada, palha de arroz e gramas.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consisteespigas de milho, forragem de milho, forragem e bagaço da cana de açúcar.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a amônia é selecionada a partir do grupo que consiste em gásamônia, hidróxido de amônio, uréia e suas combinações.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita solução aquosa que compreende amônia compreendeainda pelo menos uma base adicional.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que dita pelo menos uma base é selecionada a partirdo grupo que consiste em hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido depotássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperatura de cerca de 4°C acerca de 200°C.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperatura decerca de 75°C a cerca de 150°C.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperaturasuperior a cerca de 90°C a cerca de 150°C.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa (a) é realizada em um período de tempo de até cercade 25 horas.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em um período de tempode até cerca de 8 horas.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção de amônia de (a) éremovida antes de (b).

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a amônia de (a) é reciclada.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o contato de (b) é em peso seco da concentração de biomassade pelo menos cerca de 15%.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que as etapas (a), (b) ou (a) e (b) é(são) repetidas pelo menosuma vez.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a adição de pelo menos um plastificante,agente amaciante ou suas combinações na etapa (a).

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que pelo menos um plastificante, agente amacianteou suas combinações são selecionados a partir do grupo que consiste empolióis, ésteres de polióis, éteres de glicol, acetamida, etanol e etanolamina.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a aplicação de energia antes ou durante aetapa (a), antes ou durante a etapa (b), ou uma combinação dos mesmos.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que dita energia é selecionada a partir do grupo queconsiste em moagem, compressão, trituração, despedaçamento, corte,refinação em disco, ultra-som e microondas.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o dióxido de carbono da fermentação é utilizado para ajustar opH da mistura de tratamento prévio antes da sacarificação.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende pelomenos uma glicosidase.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende pelomenos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em glicosidasesde hidrólise de celulose, glicosidases de hidrólise de hemicelulose, glicosidasesde hidrólise de amido, peptidases, lipases, Iigninases e estearases de feruloíla.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende pelomenos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celulases,endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glucosidases, xilanases,endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases,galactases, pectinases, glucuronidases, amilases, a-amilases, β-amilases,glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que (b) é realizado em uma temperatura de cerca de 15°C a cercade 100°C e em um pH de cerca de 2 a cerca de 11.