BRPI0613805A2 - método de preparação de um produto comestìvel e produto comestìvel - Google Patents

Abstract

MéTODO DE PREPARAçãO DE UM PRODUTO COMESTIVEL E PRODUTO COMESTIVEL A presente invenção refere-se a um método de preparação de um produto comestível que compreende bactérias não viáveis que fornecem um benefício à saúde, o método compreende submeter a bactéria viável a pelo menos dois tratamentos sub-letais para obter a bactéria não viável fornecendo um benefício à saúde, cada tratamento sub-letal independentemente não sendo suficiente para obter a bactéria não viável, O método da presente invenção fornece bactéria não viável fornecendo benefícios à saúde, mas que podem ser convenientemente incorporadas em uma gama de produtoscomestíveis.

Description

"MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO COMESTÍVEL E PRODUTOCOMESTÍVEL"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a produtos comestíveis, emespecial, a produtos comestíveis e bebidas que compreendem bactérias quenão são viáveis, mas que quando administrada em quantidades apropriadas,fornecem um efeito benéfico, em particular, um benefício à saúde, para oindivíduo que a consome. Em particular, a presente invenção refere-se a ditosprodutos comestíveis que compreendem tal bactéria, que foi submetida a doisou mais tratamentos sub-letais para obter a bactéria em uma forma não viável,mas que ainda são capazes de fornecer os benefícios à saúde mencionadosacima.

Antecedentes da Invenção

A aplicação de bactéria probiótica em produtos alimentícios éfreqüentemente associada aos efeitos na saúde, vide, por exemplo, A. C.Ouwehand et al., em Int. Dairy Journal 8 (1998) 749-758. Em particular, aaplicação de bactéria probiótica é associada aos efeitos na saúde, vide, porexemplo, com relação ao bem-estar intestinal, tal como IBS (Síndrome doIntestino Irritável), IBD (Doenças Inflamatórias Intestinais), redução da madigestão da lactose, sintomas clínicos de diarréia, estimulação imune, atividadeanti-tumoral e intensificação da ingestão mineral. Em geral, acredita-se quealguns dos efeitos na saúde das bactérias probióticas estão relacionados àssuas propriedades imunomodulatórias e anti-inflamatorias nos locais demucosa. Estes efeitos à saúde são mais provavelmente iniciados pelos efeitosda bactéria probiótica no sistema imune das mucosas, no íleo e no jejuno.

Demonstrou-se que ditos efeitos modulatórios das bactérias probióticas afetamde maneira benéfica, por exemplo, resistência às infecções, doenças alérgicase doenças inflamatórias intestinais.É geralmente reconhecido no estado da técnica que a inclusão decertas bactérias em produtos comestíveis, tais como produtos alimentícios, édesejável para fornecer benefícios à saúde no consumo do produto comestível. Porexemplo, o documento WO 94/00019 descreve a adição de bactéria de ácido lácticoviável desejável em produtos assados para os propósitos da saúde.

Tradicionalmente, a bactéria probiótica tem sido empregada comomicroorganismos viáveis, a medida que se acreditava que as bactérias deviamestar no estado viável para que fornecessem seus efeitos benéficos à saúde.

Entretanto, utilizar apenas bactéria probiótica viável possui adesvantagem de seu uso ser limitado aos produtos comestíveis possuindocaracterísticas do produto que são apropriados para a bactéria viável e que sãoproduzidas pelas técnicas de processamento que são apropriadas para abactéria viável. Isto significa que os produtos comestíveis que compreendem abactéria viável são caros para preparar e que os métodos de armazenamentodas bactérias probióticas viáveis e os alimentos que as compreendem sãocomplicados, e, portanto, aumentam ainda os custos dos produtos comestíveis.

Além disso, um problema com o uso de bactéria probiótica viável nosprodutos alimentícios está no fato da formulação do produto precisar serfreqüentemente adaptada para assegurar que o caráter viável da bactéria probióticapossa ser mantido. Por exemplo, os baixos ou altos valores de pH para ó produtocomestível podem não ser apropriados, os altos teores de mineral podem não serpossíveis e/ou o produto pode precisar de uma atividade de água mínima. Isto limita aflexibilidade de formulação dos produtos comestíveis, o que é indesejável.

Outro possível problema com o uso de bactéria probiótica viávelnos produtos comestíveis é que freqüentemente os produtos irão requererarmazenamento em temperaturas relativamente baixas para assegurar queeles não sejam fermentados pela bactéria. Se o processo de fermentaçãoocorrer, isto pode acarretar em produtos que são muito ácidos ou que possuempropriedades organolépticas indesejáveis, tais como estrutura física fraca e/ouaroma ruim, devido a denominada pós-acidificação.

Foi sugerido que a bactéria probiótica não precisa estar em umestado viável a fim de conferir pelo menos alguns dos seus efeitos probióticos aum indivíduo que a consome. Por exemplo, A. C. Ouwehand et al., em Int.Dairy Journal 8 (1998) 749-758 discute os efeitos à saúde de produtos lácteostratados com bactéria viável e não-viável.

O documento WO 2004/069156 descreve as formulações quecompreendem bactérias probióticas inativadas. As bactérias são inativadas portratamentos por irradiação. O estudo pelos mesmos inventores "Tool-likereceptors 9 signalling mediates the anti-inflamatory effects of probiotics inmurine experimental colitis", por Rachmilewitz et al., Gastroenterology 2004,126: 520 - 528 descreve o que os inventores acreditam ser a teoria por detrásda inativação e do efeito probiótico remanescente.

As referências de Rachmilewitz indicam que algumas daspropriedades imunomodulatórias e anti-inflamatórias importantes dosmicroorganismos probióticos viáveis podem ser retidas em microorganismosnão viáveis se eles se tornarem não viáveis em certas condições. Estasreferências sugerem que quando microorganismos que se tornam não viáveisem vias convencionais, tais como pasteurização ou esterilização, suaintegridade estrutural é danificada, o que resulta na rápida desintegração dosmicroorganismos não viáveis nas partes proximais do trato intestinal. Emcontraste, os microorganismos não viáveis de Rachmilewitz que se tornam nãoviáveis pelo uso da radiação gama são relatados por reterem sua integridadeno trato intestinal proximal que permite a interação de padrões microbianosparticulares, neste caso o DNA não metilado, com receptores do tipo Toll nosistema imune das mucosas. Tais interações são então descritas comoresultando nos efeitos imunomodulatórios e anti-inflamatórios descritos.O documento WO 01/95741 descreve o uso de bactériaLactobacillus não viáveis em produtos alimentícios. As bactérias Lactobacillusse tornam não viáveis pela aplicação de uma única etapa de processamento eao prevenir que o produto alimentício sofra fermentação adicional na presençada bactéria.

Enquanto é sugerido no estado da técnica que certas bactériasnão viáveis possam fornecer pelo menos alguns benefícios à saúde úteis, atéagora as bactérias se tornaram não viáveis por uma única etapa doprocessamento.

O uso de tal etapa de processamento única pode possuir uma oumais das seguintes desvantagens:

- a única etapa do processamento pode ser difícil de controlar, talque não é sempre possível assegurar que a população confira não viáveisenquanto mantém a integridade estrutural da bactéria,

- diferentes condições de processamento podem ser aplicadasatravés do todo de um produto alimentício ou através de uma batelada de taisprodutos, tal que o tratamento é ineficaz ou irregular,

- as condições de processamento adversas de uma única etapapodem ser prejudiciais ao produto alimentício em si,

- as condições utilizadas podem limitar a flexibilidade daformulação alimentícia ou as condições de processamento a medida que aetapa de processamento única precisa atingir condições que são adversas osuficiente para se tornar bactérias não viáveis,

- onde a irradiação é utilizada como a única etapa deprocessamento, isto em geral possui baixa aceitabilidade pelo consumidor ouela pode não ser amplamente permitida ou aceita em diferentes regiões.

A presente invenção procura endereçar um ou mais dosproblemas acima.Em particular, a presente invenção procura fornecer um métodoconveniente e eficaz de fornecer um produto comestível que compreendebactérias não viáveis que fornecem benefícios à saúde. Em particular, apresente invenção procura fornecer um método que possa ser utilizado parapreparar uma ampla variedade de produtos comestíveis que compreendem ostipos de bactérias mencionados acima.

Descrição Resumida da Invenção

De modo surpreendente, foi inventado que quando pelo menosdois tratamentos são utilizados na bactéria, cada tratamento por si não sendosuficiente para gerar bactérias não viáveis, a bactéria se torna não viáveis pelotratamento combinado, mas ainda são capazes de fornecer benefícios à saúdepara a pessoa que consome a bactéria.

Assim, de acordo com um primeiro aspecto, a presente invençãofornece um método de preparação de um produto comestível que compreendebactéria não viável que fornece um benefício à saúde ao indivíduo queconsome a bactéria, em que o método compreende submeter a bactéria viávela pelo menos dois tratamentos sub-letais para obter a bactéria não viávelfornecendo um benefício à saúde.

É preferível que o produto comestível seja um produto alimentícioou uma bebida. É preferível que o benefício à saúde seja um efeito probiótico.

É ainda preferível que a bactéria que fornece dito benefício à saúdeseja a bactéria não patogênica. É ainda preferível que a bactéria que fornece ditobenefício à saúde seja substancialmente intacta na estrutura no produto comestível.

E ainda preferível que a bactéria retenha padrões microbianos conservados quepossam ser reconhecidos pelos receptores de reconhecimento padrão do sistemaimune, de preferência, que os padrões microbianos conservados compreendamDNA e/ou constituintes da parede celular.

É ainda preferido que a bactéria seja selecionada a partir dogênero Lactobacillus ou Bifidobacterium.

De preferência, o produto comestível contém entre 106 e 1011bactérias por porção.

De acordo com uma realização da presente invenção, ofabricante do produto comestível poderia realizar o primeiro tratamento sub-letal e o consumidor do produto comestível poderia realizar o segundotratamento sub-letal para o consumo do produto.

A presente invenção fornece diversas vantagens incluindo que asbactérias se tornem não viáveis, mas permanecem substancialmente intactasna estrutura e retêm sua capacidade de modular a função auto imune e asrespostas inflamatórias. Isto maximiza a retenção dos benefícios à saúde dabactéria. Uma ou mais das seguintes vantagens também podem ser obtidas deacordo com a presente invenção;

- os dois tratamentos sub-letais poderiam ser realizados emtempos diferentes durante a preparação do produto comestível conformerequerido e/ou por diferentes operadores, por exemplo, um pelo fabricante doproduto comestível e outro pelo consumidor do produto,

- o uso de pelo menos dois tratamentos sub-letais forneceflexibilidade na preparação do produto comestível a medida que não énecessário o uso de um único tratamento adverso. Isto leva em contadiferentes etapas a serem selecionadas dependentes do tipo de produtocomestível e tais etapas podem ser freqüentemente selecionadas a partir detécnicas de processamento convencionais. Além disso, estas podem fornecermelhores propriedades nutricionais e sensoriais para os produtos comestíveis,

- como diferentes tratamentos sub letais podem ser combinadospara gerar a bactéria não viável, não é necessário recorrer somente aostratamentos que possuem, em geral, baixa aceitação do consumidor, tal comoirradiação.Assim, de acordo com um segundo aspecto, a presente invençãofornece um produto comestível capaz de ser obtido de acordo com o primeiroaspecto da presente invenção.

De preferência, o produto comestível é um produto alimentício ouuma bebida.

"Bactéria probiótica" conforme utilizado no presente significa abactéria que quando administrada em quantidades apropriadas confere umbenefício à saúde de seu consumidor.

Pelo termo "benefício à saúde" conforme utilizado no presenteentende-se melhorar ou manter pelo menos um aspecto da saúde de umindivíduo.

Pelo termo "bactéria não viável" conforme utilizado no presenteentende-se uma população de bactéria que não é capaz de replicação emqualquer condição conhecida. Entretanto, deve ser entendido que devido àsvariações biológicas normais em uma população, uma pequena porcentagemda população (isto é, 5% ou menos) pode ainda ser viável e, assim, capaz dereplicação nas condições de crescimentos adequadas em uma população queé definida de outra maneira como não viável. A porcentagem de umapopulação que é viável pode ser determinada com o auxílio dos métodos decontagem de bactéria bem conhecidos no estado da técnica (vide osExemplos). Estes métodos empregam, de preferência, condições decrescimento (meio de crescimento, temperatura, etc) que são ótimos para ocrescimento da bactéria testada.

Pelo termo "bactéria viável" conforme utilizado no presenteentende-se uma população de bactéria que é capaz de replicação emcondições apropriadas sob as quais a replicação é possível.

Entretanto, deve ser entendido que devido às variaçõesbiológicas normais em uma população, uma pequena porcentagem dapopulação (isto é, 5% ou menos) pode ainda ser não viável e, assim, nãocapaz de replicação sob aquelas condições em uma população que é definida,de outra maneira, como viável.

Pelo termo "colocar em contato" conforme utilizado no presenteentende-se que a bactéria e o produto comestível ou pelo menos um de seusingredientes são colocados em contato direto entre si por qualquer meioapropriado.

Pelo termo "tratamento sub-letal" conforme utilizado no presenteentende-se um tratamento sob o qual uma população de bactéria é danificada,mas não perdeu completamente sua capacidade de replicação comopopulação, tal que isto é, pelo menos em parte, retida ou pode ser recuperadaem condições de crescimento apropriadas para aquele tipo de bactéria.

A combinação de dois ou mais tratamentos sub-letais de acordo coma presente invenção resulta em pelo menos 95% da população de bactéria sendotornada não viável. De preferência, a combinação mencionada acima detratamentos sub-letais resulta na população de bactéria sendo tornada não viável.

Pelo termo "condições de crescimento adequadas" conformeutilizado no presente entende-se as condições para uma dada cepa bacterianasob as quais a cepa bacteriana irá replicar e se refere a uma combinação depH, meio e temperatura onde normalmente uma versão diluída de dita cepa naforma viável (diz-se cerca de 106 bactérias por grama) iria crescer a umadensidade de pelo menos 108 bactérias por grama dentro de um períodonormal de crescimento.

Pelo termo "bactéria patogênica" conforme utilizado no presenteentende-se uma bactéria que é capaz de causar uma infecção em umhospedeiro imunocompetente ou que é capaz de intoxicar tal hospedeiro emcondições apropriadas.

Pelo termo "bactéria não patogênica" conforme utilizado nopresente entende-se uma bactéria que não é capaz de causar uma infecçãoem um hospedeiro imunocompetente ou que não é capaz de intoxicar talhospedeiro em condições apropriadas.

Pelo termo "substancialmente intacta na estrutura", conformeutilizado no presente entende-se uma bactéria não viável que ainda estásuficientemente intacta para evitar ou atrasar a desintegração no trato intestinaldistai, permitindo desta forma a interação (estruturas conservadas) da bactérianão viável com o sistema imune, em particular, o sistema imune da mucosa.

Pelo termo "por porção" conforme utilizado no presente entende-se a quantidade de um dado produto comestível e, em especial, a um produtoalimentício ou uma bebida, que é destinado a ser ou é embalado de modo a serconsumido em uma única ocasião. Portanto, o produto também pode serembalado como porções múltiplas.

Pelo termo "compreende" entende-se como não sendo Iimitante àquaisquer dos elementos subseqüentemente afirmados, mas de preferênciapara englobar elementos não especificados de maior ou menor importânciafuncional. Em outras palavras, as etapas, elementos ou opções listados nãoprecisam ser exaustivos. Toda vez que as palavras "incluindo" ou "possuindo"forem utilizadas, estes termos pretendem ser equivalentes a "compreende"conforme definido acima.

Exceto nos Exemplos operantes e Comparativos, ou ondeindicado explicitamente de outra maneira, todos os números neste relatóriodescritivo que indicam quantidades de material ou condições de reação,propriedades físicas de materiais e/ou uso devem ser entendidos comomodificados pela palavra "cerca de". Todas as quantidades estão em peso,com base no peso total do produto relevante, salvo indicação em contrário.

Salvo indicação em contrário, todas as porcentagens estão empeso, com base no peso total da composição.Para uma explicação mais completa do supracitado e outrascaracterísticas e vantagens da presente invenção, deve ser feito referência àseguinte descrição das realizações preferidas. As realizações preferidas se aplicama todos os aspectos da presente invenção e podem ser utilizadas conformeapropriado para cada aspecto a menos que o contexto exija outro contexto.

Descrição Detalhada da Invenção

Tratamentos Sub-letais

De acordo com a presente invenção, as bactérias que fornecemum benefício à saúde ao indivíduo que as consome são submetidas a pelomenos dois tratamentos sub-letais durante a preparação de um produtocomestível, cada tratamento sub-letal por si não sendo suficiente para gerarbactérias não viáveis. Estes tratamentos podem ocorrer antes da incorporaçãoda bactéria no produto comestível, por exemplo, ao tratar a bactéria ou umamistura de bactérias e um ou mais ingredientes alimentícios. Da mesma forma,é possível submeter a bactéria ao tratamento sub-letal durante os diferentesestágios do processo de preparação, por exemplo, ao primeiro tratar a bactériae subseqüentemente tratar o produto comestível contendo a bactéria tratada.

Qualquer tratamento sub-letal apropriado pode ser utilizado deacordo com a presente invenção. As referências Basic aspects of foodpreservation by hurdle technológy por Leistner., L. Int Journal of FoodMicrobiology 55 (2000) 181- 186 e Combined methods for food preservation,por Leistner., L. 1999 em Handbook of Food Preservation, Shafiur Rahman., M.(ed.) Mareei Dekker, Nova Iorque, EUA, 457-485, descreve tratamentos sub-letais apropriados que podem ser utilizados e são incorporados comoreferência no presente.

Tipicamente, o método emprega pelo menos dois tratamentossub-letais, em que pelo menos um tratamento sub-letal, quando aplicado comoum tratamento único de bactéria viável reduz a capacidade de replicação dedita bactéria viável em pelo menos 5%. Conseqüentemente, o presente métodocompreende vantajosamente submeter a bactéria viável a pelo menos doistratamentos sub-letal, pelo menos um dos tratamentos sub-letais é capaz dereduzir a capacidade de replicação da bactéria viável (original) em pelo menos5%, de preferência, em pelo menos 10%. A capacidade de replicação de umapopulação de bactéria é adequadamente determinada pelo método decontagem de bactéria conforme mencionado acima.

Os inventores inventaram de modo inesperado que a bactériapode se tornar efetivamente não viável ao submetê-las a um tratamento sub-letal que dificilmente (ou não) afeta a capacidade de replicação e outrotratamento que reduz a capacidade de replicação da bactéria viável (original)em pelo menos 5% (por exemplo, menos de 5 - 50%). Em particular, foiinventado que a bactéria pode se tornar não viável pela combinação de um pHbaixo que, em si, dificilmente afeta a capacidade de replicação com outrotratamento sub-letal que é capaz de reduzir a capacidade de replicação empelo menos 5%. De preferência, estes tratamentos sub-letais ocorrem pelomenos parcialmente de maneira simultânea.

De acordo com uma realização particularmente preferida, opresente método emprega pelo menos dois tratamentos sub-letal que cada umem si é capaz de reduzir a capacidade de replicação da bactéria viável(original) em pelo menos 5%, de preferência, em pelo menos 10%.

Em outra realização preferida, o presente método emprega doisou mais tratamentos sub-letais que, cada um em si reduz a capacidade dereplicação da bactéria viável em não mais do que 60%, de preferência, em nãomais do que 50%. Em uma outra realização preferida, o método utiliza dois oumais tratamentos sub-letais, em que a soma das porcentagens de redução nacapacidade de replicação observadas para cada tratamento sub-letal nãoexcede 60%, de maior preferência, não excede 50%. Um exemplo de ummétodo que satisfaz esta exigência é um método que emprega um tratamentosub-letal que gera em si uma redução na capacidade de replicação de, porexemplo, 10% e outro tratamento sub-letal que, per se, gera uma redução nacapacidade de replicação de, por exemplo, 5%. Enquanto que a soma dasporcentagens de redução da capacidade de replicação para estes doistratamentos sub-letais é apenas de 15%, a combinação de ditos tratamentos deacordo com a presente invenção gera uma redução geral na capacidade dereplicação de, por exemplo, 95% ou mais.

De acordo com outras realizações vantajosas da presenteinvenção, o presente método compreende:

(a) submeter a bactéria viável que fornece dito benefício à saúdea pelo menos dois tratamentos sub-letais e subseqüentemente colocar emcontato a bactéria não viável produzida, desta forma, com um produtocomestível ou pelo menos um de seus ingredientes, ou

(b) colocar em contato a bactéria viável que fornece dito benefícioà saúde com um produto comestível e subseqüentemente submeter o produtocomestível que compreende a bactéria viável a pelo menos dois tratamentossub-letais, ou

(c) colocar em contato a bactéria viável que fornece dito benefícioà saúde com pelo menos um ingrediente de um produto comestível esubseqüentemente submeter a mistura de bactéria viável e de ingrediente apelo menos dois tratamentos sub-letais.

É preferível que cada uma de duas ou mais etapas de tratamentosub-letal seja independentemente selecionada a partir de:

(i) aplicação de pressão,

(ii) ajuste de pH,

(iii) ajuste da pressão osmótica,

(iv) aquecimento,(ν) homogeneização,

(vi) ciclos de congelamento - descongelamento,

(vii) secagem por aspersão,

(viii) adição de um ou mais agentes que possuem um efeitobactericida,

(ix) aplicação de um campo elétrico pulsado.

As condições apropriadas alternativas para a realização de cadauma das etapas sub-letais serão conhecidas pelo técnico no assunto. Épreferível que os tratamentos sub-letais sejam independentementeselecionados a partir do seguinte:

(i) Aplicar uma pressão de 150 MPa a 400 MPa de -30° C a25° C por entre 20 a 60 segundos,

(ii) Ajustar o pH a um intervalo de pH 3 a 5, de preferência, depH 4 a 5 ou de pH 8 a 9,

(iii) Ajustar a pressão osmótica pela adição de uma quantidadeapropriada de um sal de metal alcalino ou alcalino terroso,

(vi) Aquecer a uma temperatura de 10° C a 25° C, depreferência, de 10° C a 15° C acima da temperatura de crescimento ótima paraa bactéria por entre 1 a 5 minutos,

(v) Homogeneizar de 20 a 30 bar de 10° C a 15° C acima datemperatura de crescimento ótima para a bactéria por entre 1 a 5 minutos,

(vi) Submeter a uma etapa de congelamento e subseqüenteetapa de descongelamento por entre 5 a 25 ciclos,

(vii) A adição de uma quantidade apropriada de um ou maisagente(s) que possuem um efeito bactericida e que são selecionados a partirdo sorbato de sódio, Iisozima e nisina,

(viii) Aplicação de um campo elétrico pulsado utilizando entre 15a 100 kV/ cm com um comprimento de pulso entre 1 a 10 ps de 10° C a 50° C.Outro tratamento sub-letal poderia ser utilizado para o uso dairradiação contanto que o tratamento de radiação fosse controlado, tal que umresultado sub-letal fosse obtido. As condições apropriadas para o tratamentode irradiação sub-letal incluem a irradiação de 0,1 a 1 Megarad, utilizando umafonte de 137Cs em uma taxa de 8 Gy/ min durante a noite. Entretanto, épreferível que os tratamentos sub-letais de acordo com a presente invençãonão incluam mais do que um tratamento de irradiação sub-letal.

Bactéria Benéfica

Qualquer bactéria que fornece um benefício à saúde ao indivíduoque a consome pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Estesefeitos benéficos incluem, de preferência, as propriedades modulatórias e anti-inflamatórias.

É preferível de acordo com a presente invenção que obenefício à saúde seja um efeito probiótico e, portanto, que a bactériaseja uma bactéria probiótica. É ainda preferível que a bactéria seja umabactéria não patogênica.

A bactéria probiótica utilizada de acordo com a presente invençãopode ser qualquer bactéria probiótica convencional. É preferível que a bactériaprobiótica seja selecionada a partir dos gêneros: Bifidobacteríum,Propionibacteríum, Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Bacillus,Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus e Lactobacillus,com o Lactobacillus e o Bifidobaeterium sendo as de maior preferência.

Os tipos apropriados de bactéria probiótica que podem serutilizados incluem: Bacillus natto, Bifidobaeterium adoleseentis, B. animalis, B.breve, B. bifidum, B. infantis, B. laetis, B. longum, Enterococcus faecium,Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L.casei, L. delbrueckii, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L.laetis, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L rhamnosus, L sakei, Lsalivarius, Lactococcus laetis, Lactococcus eremoris, Leueonostoemesenteroides, Leueonostoe laetis, Pedioeoeeus acidilactici, P. eerevisiae, P.pentosaeeus, Propionibaeterium freudenreiehii, Propionibacterium shermanii eStreptoeoeeus salivarius.

As cepas probióticas particulares que são apropriadas de acordocom a presente invenção são: Lactobacillus casei shirota, Lactobacillus caseiimmunitas, Lactobacillus casei DN-114 001, Lactobacillus rhamnosus GG(ATCC53103), Lactobacillus reuteri ATCC55730/SD2112, Lactobacillusrhamnosus HN001, Lactobacillus plantarum 299v (DSM9843), Lactobacillusjohnsonii La1 (1-1225 CNCM), Lactobacillus plantarum WCFS1, Lactobacillushelveticus CP53, Bifidobaeterium laetis HN019, Bifidobaeterium animalis DN-173010, Bifidobaeterium animalis Bb12, Bifidobaeterium infantis 35624,Laetobaeillus casei 431, Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus reuteriING1, Laetobaeillus salivarius UCC118, Propionibacterium freudenreiehii JS,Eseherichia coli Nissle 1917.

Deve ser entendido que qualquer uma das bactériasmencionadas acima pode ser uma bactéria geneticamente modificada oupodem ser uma bactéria de grau alimentício comumente utilizada nosprocessos industriais.

Vantajosamente, a quantidade de bactéria não viável quefornece um benefício à saúde (ao indivíduo que consome a bactéria) noproduto comestível é de 106 e 1011 por porção, de maior preferência, de107 a 1010 por porção, de maiòr preferência, de 108 a 1010 por porção oupor 100 g de produto. Os tamanhos as porções de diversos produtos sãodados na Tabela 1.

A bactéria utilizada de acordo com a presente invenção pode, deacordo com uma realização, ser uma bactéria que foi recuperada do fluxo deresíduos de outra operação de processamento alimentício.A bactéria pode ser colocada em contato com o produtocomestível ou um ou mais de seus ingredientes por quaisquer meiosapropriados, por exemplo, pela mistura com estes ou sendo aplicada comoum revestimento ao mesmo, ou sozinha ou com outro ingrediente, porexemplo, como uma solução. Por exemplo, no processo de fabricação deum produto de padaria, a bactéria não viável pode ser adicionada à massade farinha, seguida pelo cozimento da massa de farinha no forno parapreparar o produto final. Em outro exemplo, a bactéria não viável pode seradicionada à mistura prévia gelada seguida pela etapa de tratamento aquente (opcional) e pelo congelamento para produzir uma sobremesagelada. Alternativamente, e especialmente onde a bactéria foi tornada nãoviável antes de colocar em contato com o produto comestível ou um deseus ingredientes, a bactéria pode ser colocada em contato com o produto/ingrediente por meio de uma embalagem apropriada. Isto pode ser obtido,por exemplo, ao possuir a bactéria não viável presente em uma parte daembalagem do produto (tal como um canudo ou tampa do recipiente) talque o produto/ ingrediente entre em contato com a bactéria não viável noegresso do produto da embalagem.

Efeitos Benéficos da Bactéria

A bactéria não viável de acordo com a presente invençãoestá suficientemente intacta para evitar ou retardar a desintegração notrato intestinal distai, permitindo desta maneira a interação de seusdenominados padrões microbianos conservados, tal como constituintes daparede celular, tal como lipopolissacarídeos, ácido lipoteicóico,peptideoglicanos, e DNA não metilado, com os denominados receptoresde reconhecimento padrão do sistema imune (mucosa), tal comoreceptores do tipo Toll e receptores Nod. Estas interações podem resultarna modulação benéfica da função imune que poderia resultar em, porexemplo, maior resistência à infecções, supressão das respostasinflamatórias e alívio ou prevenção de alergias ou doenças auto imune.Uma explicação do papel dos receptores do tipo Toll é dada na referênciaAdv Exp Med Boil 2005; 560: 11 -8 por Pasare., C. et al.

Produtos Comestíveis

O produto comestível de acordo com a presente invenção podeser qualquer produto comestível incluindo os produtos alimentícios e asbebidas e suplementos alimentares (que são destinadas a serem tomadascomo suplemento com outros alimentos e não se destinam a seremconsumidas como o produto alimentício per se). Os exemplos de suplementosalimentares são os suplementos vitamínicos e minerais e similares. Épreferível, de acordo com a presente invenção que o produto comestível sejaum produto alimentício ou uma bebida.

Diferentes tipos de produtos alimentícios podem ser preparadosde acordo com a presente invenção, por exemplo, substituintes de refeições eoutros produtos a seres utilizados em um programa de perda de peso, sopa decarne com vegetais, macarrões, sorvetes, molhos, molhos para salada,temperos, espalháveis, tais como margarina, lanches, cereais incluindo osprodutos cereais, tais como mingau, bebidas incluindo bebidas contendo frutase/ou vegetais, doces ou decoração aromática, pão e produtos de pão, biscoitose outros produtos de padaria, doces, produtos em barra, chocolate, goma demascar e produtos lácteos. Os diferentes tipos de bebidas podem serpreparados de acordo com a presente invenção, por exemplo, sopas, bebidasprontas para beber e bebidas em pó. As bebidas podem ser com base emproteína, tal como produtos com base em soja e produtos lácteos, ou podemser refrigerantes que não são baseado em proteínas.

A Tabela 1 indica uma série de produtos, que podem ser preparadosde acordo com a presente invenção, e seu tamanho de porção típica.Tabela 1

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De acordo com uma realização em que o ajuste de pH é utilizadocomo um dos tratamentos sub-letais, a presente invenção é especialmenteapropriada para a preparação de produtos comestíveis que possuem um pH emque as bactérias que fornecem um benefício à saúde não são normalmenteestáveis. Em particular, a presente invenção pode ser utilizada vantajosamente paraa preparação de produtos comestíveis que possuem um pH de 4 ou menos, porexemplo, de 3,8 a 2,0, de maior preferência, de 3,5 a 2,5, de maior preferência,ainda, de 3,3 a 2,8. Os exemplos de tais produtos são as bebidas, por exemplo,alguns refrigerantes, por exemplo, do tipo cola ou sucos de fruta/ vegetais oubebidas com base em frutas/ vegetais, tais como limão ou suco de laranja.

Conseqüentemente, em outro aspecto a presente invenção serefere a um produto comestível que possui um pH de 4 ou menos e feito pelométodo da presente invenção.

Alternativamente, a presente invenção pode ser utilizadavantajosamente para a preparação de produtos alimentícios que possuem umpH de 5,0 ou mais, por exemplo, de 5,0 a 10,0, de maior preferência, de 5,1 a8,0, de maior preferência, ainda, de 5,2 a 7,0. Os exemplos de tais produtossão, por exemplo, molhos, leite, margarina, produtos de padaria, substituintesde refeições, sorvetes, etc.

Os produtos comestíveis podem compreender uma fonte defermentação. Por exemplo, o produto alimentício da presente invenção já pode serfermentado antes da adição da bactéria de acordo com a presente invenção, talcomo vegetais em salmoura ou uma variedade de alimentos nativos.

Margarinas ε Outros Espalháveis

Tipicamente, estas são emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo,também são abrangidos os espalháveis que são substancialmente livres degordura. Tipicamente, estes produtos são espalháveis e não são fluidos natemperatura de uso, por exemplo, de 2 a 10° C. Os níveis de gordura podemvariar dentro de um amplo intervalo, por exemplo, margarinas com muitagordura com 60 a 90% em peso de gordura, margarina com gordura média,com 30 a 60% em peso de gordura, produtos com pouca gordura com 10 a30% em peso de gordura e margarinas livres de gordura ou com muito poucagordura, com 0 a 10% em peso de gordura.

A gordura na margarina ou outro espalhável pode ser qualquergordura comestível, são freqüentemente utilizados o óleo de soja, o óleo decolza, o óleo de girassol e o óleo de palma. As gorduras podem ser utilizadascomo tal ou na forma modificada, por exemplo, hidrogenada, esterificada,refinada etc. Outros óleos apropriados são bem conhecidos no estado datécnica e podem ser selecionados conforme desejado.

O pH de uma margarina ou espalhável pode vantajosamente serde 5,0 a 6,5.

Os exemplos de espalháveis que não as margarinas são osespalháveis de queijo, espalháveis de doce, espalháveis de iogurte, etc.Os ingredientes adicionalmente opcionais de espalháveis podemser os emulsificantes, corantes, vitaminas, conservantes, emulsificantes,gomas, espessantes etc. O balanço do produto será normalmente a água.

Um tamanho típico para uma porção media de margarina ou outroespalhável é de 15 gramas.

Produtos de Confeitaria Congelados

Para o propósito da presente invenção, o termo produto deconfeitaria congelado inclui confeitos congelados que contêm leite, tal comosorvete, iogurte gelado, sorvete de frutas, sorbet, pudim gelado e sorvete deleite (ice milk), sorvete de água, granita e purês de fruta congelado.

De preferência, o nível de sólidos no confeito congelado (porexemplo, açúcar, gordura, aromatizante etc) é mais do que 3% em peso, demaior preferência, de 10 a 70% em peso, por exemplo, de 40 a 70% em peso.

O sorvete irá compreender tipicamente de 2 a 20% em peso degordura, de 0 a 20% em peso de adoçantes, de 2 a 20% em peso de componentesde leite sem gordura e componentes opcionais, tais como emulsificantes,estabilizantes, conservantes, ingredientes aromatizantes, vitaminas, minerais, etc,sendo o balanço de água. Tipicamente o sorvete será aerado, por exemplo, a umaexpansão de 20 a 400%, em geral, de 40 a 200% e congelado a uma temperaturade - 2 a - 200° C, em geral, de -10 a - 30° C. O sorvete compreende normalmentecálcio em um nível de cerca de 0,1% em peso.

Um tamanho típico de uma porção media de material deconfeitaria congelado é de 150 g.

Molhos para Salada ε Patê

Em geral, os molhos para salada (incluindo maionese) oupatês são emulsões de óleo-em-água. A fase óleo da emulsão compreendeem geral de 0 a 80% em peso do produto. O nível de gordura é tipicamentede 10 a 80% dependendo do tipo de molhos para salada ou patês. Osmolhos para salada com pouca ou nenhuma gordura podem, por exemplo,conter níveis de triglicerídeos de 0, 5, 10, 15% em peso.

Os molhos para salada e patês são, em geral, produtos de pHbaixo possuindo um pH preferido de 2 a 6.

Os molhos para salada ou patês podem conter,opcionalmente, outros ingredientes, tais como emulsificantes (por exemplo,gema de ovo), estabilizantes, acidificantes, biopolímeros, agentes devolume, flavorizantes, agentes corantes, etc. O balanço da composição é aágua que poderia vantajosamente estar presente em um nível de 0,1 a99,9% em peso, em geral, de 20 a 99% em peso, de maior preferência, de50 a 98% em peso.

Um tamanho típico para uma porção média de molhos parasalada ou patês é de 30 gramas.

Lanches ε Produtos em Barra Incluindo os Lanches Substituintes daRefeição ε as Barras

Estes produtos compreendem freqüentemente uma matriz dematerial comestível em que a bactéria pode ser incorporada. Por exemplo,a matriz pode ser a base de gordura (por exemplo, chocolate com manteigade cacau ou chocolate) ou pode ser a base em produtos de padaria (pão,massa de farinha, bolinhos, etc) ou podem ser a base de partículasaglomeradas (arroz, grão, nozes, passas, partículas de frutas).

Os ingredientes adicionais podem ser adicionados ao produtotal como os materiais flavorizantes, vitaminas, minerais, etc.Bebidas Substituintes de Refeição ε outras bebidas (Incluindo as Doses deBebidas

A bactéria não viável pode ser vantajosamente incluída nasbebidas, por exemplo, sopas, sucos de fruta e/ou vegetais, refrigerantes,bebidas com base láctea e bebidas com base em soja, etc. As bebidasvantajosas de acordo com a presente invenção são bebidas com base em cháe bebidas substituintes da refeição. Estes produtos serão descritos com maisdetalhes abaixo. Será evidente que níveis e composições similares se aplicama outras bebidas de acordo com a presente invenção.

Para o propósito da presente invenção, o termo "produtos combase em chá" refere-se a produtos que contém chá ou composiçõesfitoterápicas que substituem o chá, por exemplo, saquinhos de chá, folha dechá, saquinhos de chá fitoterápicos, infusões de chá, chá em pó, cháfitoterápico em pó, chá gelado, chá fitoterápico gelado, chá gelado com gás,infusões fitoterápicas com gás, etc.

Tipicamente, alguns destes produtos da presente invenção podemprecisar de uma etapa de preparação pouco antes do consumo, por exemplo, afabricação de chá corado dos saquinhos de chá, folha de chá, saquinhos de cháfitoterápicos ou infusões fitoterápicas ou a solubilização de chá em pó ou cháfitoterápico em pó. Para estes produtos, é preferível ajustar o nível de bactéria nãoviável no produto, tal que uma porção do produto final a ser consumido possui osníveis desejados de bactérias conforme descrito acima.

Para o chá gelado, chá fitoterápico gelado, chá gelado com gás,infusões fitoterápicas com gás, o tamanho típico de uma porção será de 200mL. Os produtos de doses de bebida são as bebidas que possuem um nívelconcentrado de pelo menos um ingrediente ativo tal que elas fornecem obenefício completo do ingrediente ativo em um menor volume de bebida, destaforma, eles são, em geral, providos em menores quantidades do que outrostipos de bebidas como uma porção única, uma porção de 100 mL é típica paraós produtos em doses.

As bebidas substituintes das refeições são tipicamente baseadasem uma base líquida que pode, por exemplo, ser espessada por meio degomas ou fibras e, na qual são adicionados coquetéis de minerais e vitaminas.A bebida pode ser aromatizada no sabor desejado, por exemplo, sabor de frutaou chocolate. Um tamanho de porção típica pode ser de 330 mL.

Para os produtos que são extraídos para obter o produto final, emgeral, o objetivo é assegurar que uma porção compreenda as quantidadesdesejadas conforme indicado acima. Neste contexto, deve ser avaliado quenormalmente, apenas parte da bactéria não viável presente no produto a basede chá a ser extraído será eventualmente extraído na bebida de chá final. Paracompensar este efeito, em geral, é desejável incorporar nos produtos a seremextraídos, cerca de 2 vezes a quantidade que é desejável obter no extrato.

Para a folha de chá ou os saquinhos de chá, tipicamente, de 1 a 5gramas de chá seria utilizado para preparar uma única porção de 200 mL.

Se os saquinhos de chá são utilizados, o Lactobacillus pode servantajosamente incorporado no componente de chá. Entretanto, será levadoem consideração que para algumas aplicações, pode ser vantajoso separar abactéria não viável do chá, por exemplo, pela incorporação da mesma em umcompartimento separado do saquinho de chá ou pela aplicação da mesmasobre o papel do saquinho de chá.

Biscoitos

Os biscoitos de acordo com a presente invenção podem ser dequalquer tipo conforme desejado. A bactéria não viável de acordo com apresente invenção pode ser incluída como parte dos biscoitos ou como umadecoração, revestimento ou preenchimento para tal. Um tamanho de porçãotípico para um biscoito é de 20 g.

Iogurte ε Outras Sobremesas com Base em Soja ou Produto Lácteo

O iogurte ou outras sobremesas com base em soja ou produto lácteo,de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer tipo conforme desejado.Estes produtos podem ser fermentados por outras bactérias do que a bactéria nãoviável de acordo com a presente invenção. Alternativamente, eles podem pelomenos em parte ser fermentados por bactérias benéficas de acordo com a presenteinvenção antes de eles se tornarem não viáveis. Um tamanho de porção típico paraestas sobremesas é de 150 g.

A presente invenção será agora ilustrada adicionalmente comreferência aos exemplos seguintes. Os exemplos adicionais dentro do escopoda presente invenção serão evidentes ao técnico no assunto.

Exemplos

Exemplo 1

O Lactobacillus reuterí SD2112 foi cultivado em 'MRS Especial'que foi preparado pelo seguinte procedimento. O meio MRS (Merck, Alemanha)foi acidificado ao pH 3,0 com HCI concentrado para precipitar as proteínas.Esta solução foi armazenada durante a noite a 5o C e centrifugada por 10minutos a 5.000 rpm. O sobrenadante foi filtrado utilizando um filtro no topo dagarrafa de 0,2 pm e o pH foi ajustado ao valor original de MRS (pH 5,7 ± 0,2).Esta solução foi esterilizada em filtro utilizando um filtro no topo da garrafa de0,1 pm conectado a uma garrafa estéril e armazenado (antes do uso) a 5°C.

10 mL de MRS Especial foi inoculado com 0,5% de uma culturade L. reuterí SD 2112 que foi armazenada a - 80° C como uma culturacompletamente desenvolvida em leite desnatado, diluída com glicerol estéril a10% a um volume final de 6% de glicerol. O L. reuterí SD2112 foi previamentecultivado durante a noite a 37° C. A cultura final foi realizada em um frasco de300 ml contendo 250 mL de MRS Especial. O frasco foi inoculado com 5 mL decultura prévia e incubado por 24 horas a 37°C.

Após a cultura, o meio foi centrifugado em tubos Falcon estéreisde 50 mL (5 minutos a 500 rpm), os pellets foram agrupados em um tubo elavados duas vezes com uma solução de Sal Fisiológico de Peptona (PPS,Tritium, Holanda, 0,1% de peptona, 0,85% de NaCI). Subseqüentemente opellet foi suspenso novamente em 5 mL de PPS. Este concentrado celular foiutilizado para tratamentos adicionais.

Os tubos de vidro de 5 mL esterilizados foram preenchidos com2,7 mL de PPS (ou 2,7 mL de uma solução de ácido acético no caso de umtratamento de pH). A solução de ácido acético (HAc, pH 3) foi preparado pelaadição de 13 μΙ de ácido acético (100%) em 40 mL de água desmineralizada. OpH da solução foi ajustado ao pH 3 com HCI concentrado e esterilizado emfiltro utilizando um filtro de 0,2 μιτι. A quantidade de ácido não dissociado nestasolução é de 0,3 g/L.

Foi adicionado ao PPS (ou HAc) 0,3 mL do concentrado celular.

As amostras foram misturadas e submetidas à diferentes tratamentos conformemostrado na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 26</column></row><table>

(1) TA = Temperatura Ambiente

(2) Amostras que foram submetidas ao aquecimento foram resfriadas em geloem fusão por 2 minutos, antes do tratamento adicional.

(3) 30 μΙ de Nisina foi adicionada a partir de uma solução estoque de nisinarecém preparada (100 ppm), preparada pela dissolução de 250 mg de nisina(Sigma, Alemanha, 2,5%, porcine) em 50 mL de PPS. A solução foi esterilizadautilizando um filtro de 0,2 pm e armazenada em 5o C.Todas as amostras foram diluídas em PPS diretamente após o(s)tratamento^), até 10"8 de diluição para todas exceto a amostra de 100° C (até10"3 de diluição). Para todas as amostras as diluições de 10"5 até 1Ò"8 foramcolocadas em uma placa de Petri (de 10"1 a 10"3 para a amostra de 100° C) eagar MRS de 50° C foi adicionado aos pratos (método de poro). Após acoagulação do agar, os pratos foram encubados anaerobicamente a 37° C porpelo menos 2 dias.

A diluição a 10"3 (em PPS) de todos os tratamentos foi utilizadapara as medidas fluxocitométricas. Foi adicionado 1 mL de cada uma destasamostras de 10"3 a 5 μΙ_ de iodeto propidium (PI) em um tubo plástico estéril de4 mL, misturado e incubado por 5 minutos antes da medida fluxocitométrica serrealizada. Pl apenas entrará em células perfuradas e, portanto, é uma medidado dano que os probióticos sofreram. Os resultados do plaqueamento, aquantidade de células vivas nas Unidades Formadoras de Colônias por mL e aporcentagem de células perfuradas é dada na Tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 27</column></row><table>

A partir destes resultados, conclui-se que apenas as células queforam submetidas aos tratamentos sub-letais são capazes de absorverquantidades significativas de iodeto de propidium. Além disso, os resultadosmostram que uma combinação de dois tratamentos sub-letais pode gerarbactérias viáveis, não viáveis mesmo se cada tratamento sub-letal em sitivesse apenas um impacto limitado na viabilidade.

Exemplo 2

A bactéria probiótica das cepas selecionadas (por exemplo,Lactobacillus reuteri SD2112, L. rhamnosus HN001, L plantarum WCFS1, Ldelbrueckii LMG6891, L. casei immunitas, Bifidobacterium Iactis Bb-12) podeser exposta a dois ou mais de diversos tratamentos sub-letais que, emcombinação, geram a eles não viáveis sem perder todas de suascaracterísticas probióticas.

A bactéria probiótica viável em uma concentração de 106 a 108cfu/ mL pode;

(1) permanecer não tratada (controle positivo), ou

(2) ser incubada a 100° C por 30 minutos (controle negativo), ou

(3) ser exposta às seguintes combinações de tratamentos sub-letais;

3.1 - aquecer a uma temperatura de 15° C acima da temperaturade crescimento ótima por 5 minutos, seguido pela adição direta de pelo menosuma Iisozima,entre 0,1 e 1 ppm, entre 0,9 mM e 5 mM de sorbato de sódio ouentre 0,05 e 1 ppm de lisina, ou

3.2 - aquecer a uma temperatura de 15° C acima da temperaturade crescimento ótima por 5 minutos, seguido pela aplicação direta de umapressão de 150 MPa e 400 MPa a 5o C por 20 a 60 segundos, ou

3.3 - aquecer a uma temperatura de 15° C acima da temperaturade crescimento ótima por 5 minutos, seguido pela aplicação direta de umcampo elétrico pulsado utilizando entre 5 e 100 kV/ cm com um comprimentode pulso entre 1 e 10 ps a 10° C, ou

3.4 - adição de pelo menos uma Iisozima entre 0,1 e 1 ppm, entre0,9 mM e 5 mM de sorbato de sódio ou entre 0,05 e 1 ppm de nisina, seguidodiretamente pela aplicação de uma pressão entre 150 MPa e 400 MPa a 5o Cpor 20 a 60 segundos, ou

3.5 - adição de pelo menos uma Iisozima entre 0,1 e 1 ppm, entre0,9 mM e 5 mM de sorbato de sódio ou entre 0,05 e 1 ppm de nisina, seguidodiretamente pela aplicação de um campo elétrico pulsado utilizando entre 5 e100 kV/ cm com um comprimento de pulso entre 1 e 10 με a 10° C.

Seguindo qualquer uma das duas combinações das etapas detratamento sub-letal 3,1 a 3,5 acima e os tratamentos controle 1 e 2, a bactériaprobiótica pode ser contada por uma série de diluições em um meio de diluiçãoapropriado, seguido pelo plaqueamento em meio agar seletivo em condiçõesanaeróbias por cerca de 24 horas a 37° C, para estimar o número residual deunidades formadoras de colônias e verificando, assim, a eficiência da geraçãode bactéria probiótica não viável. Outras alíquotas podem ser utilizadas paraavaliar a integridade do DNA, por exemplo, por eletroforese em gel de agaroseou por outros meios apropriados conhecidos pelos técnicos no assunto e/oualíquotas podem ser utilizadas para comparar a atividade imunomoduladoradas diferentes preparações de bactéria probiótica.

Um exemplo de avaliar a atividade imunomoduladora é incubar ascélulas mononucleares do sangue periférico (PBMC) derivadas do sangue devoluntários humanos por diversos períodos (24 a 48 horas) com diluições emsérie de diferentes preparações de bactérias probióticas, ou com 0,1 a 10 pg/ml de DNA isolado de várias preparações de bactérias probióticas. Os eventosde sinalização acionados pela interação destas preparações com o PBMChumano recentemente isolado podem ser avaliados como a ativação dediversas quinases, translocação de NFkB ou pelos efeitos a jusante(downstream) resultantes, tal como a produção de citocina.

Apesar de que seja reconhecido que a sensibilidade dasdiferentes cepas de bactéria probiótica para combinações distintas detratamentos sub-letais possa variar, o ensinamento geral é que a bactériaprobiótica tratada com calor (tratamento 2 acima) e a bactéria probiótica tratadade acordo com a presente invenção (tratamentos 3,1 a 3,5 acima) se tornamnão viáveis. Além disso, a bactéria probiótica não tratada (tratamento 1) e abactéria probiótica tratada de acordo com a presente invenção (tratamentos 3,1a 3,5 acima) retêm pelo menos um pouco do efeito modulador na atividade doPBMC humano. Isto indica que a bactéria probiótica submetida aos tratamentossub-letais de acordo com a presente invenção (tratamentos 3,1 a 3,5 acima)pode exercer efeitos probióticos benéficos quando administradas no contextode um produto alimentício sem trazer todos os problemas associados com autilização de bactéria probiótica viva. Entretanto, este não é o caso de quandoas bactérias se tornam não viáveis pelos tratamentos letais, tal como umtratamento a quente convencional (tratamento 2).

Exemplo 3

As preparações de cepas de bactérias probióticas preparadasconforme descrito nos tratamentos 3,1 a 3,5 acima do Exemplo 2, podemvantajosamente ser adicionadas posteriormente a uma bebida concentradacom base em extratos de frutas e vegetais ou com base em proteína de soja(um produto denominado 'dose') para adicionar os benefícios probióticos aoproduto em dose sem alterar as suas propriedades organolépticas e de saborpela pós acidificação pelos probióticos.

Claims (16)

1. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM PRODUTOCOMESTÍVEL, que compreende bactérias não viáveis que fornecem umbenefício à saúde do indivíduo que consome a bactéria, caracterizado pelo fatode que o método compreende submeter a bactéria viável a pelo menos doistratamentos sub-letais para obter a bactéria não viável fornecendo um benefícioà saúde, cada tratamento sub-letal independentemente não sendo suficientepara gerar a bactéria não viável.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende submeter a bactéria viável a pelo menos doistratamentos sub-letais, pelo menos um dos tratamentos sub-letais reduz acapacidade de replicação da bactéria viável em pelo menos 5%, depreferência, em pelo menos 10%.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que compreende submeter a bactéria viável a pelomenos dois tratamentos sub-letais, em que a soma das porcentagens deredução na capacidade de replicação observada para cada tratamento sub-letalnão excede 60%.

4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-3, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) submeter uma bactéria viável que fornece dito benefício àsaúde a pelo menos dois tratamentos sub-letais e subseqüentemente colocarem contato a bactéria não viável produzida desta forma, com um produtocomestível ou pelo menos um de seus ingredientes, ou(b) colocar em contato a bactéria viável que fornece dito benefícioà saúde com um produto comestível e subseqüentemente submeter o produtocomestível que compreende a bactéria viável a pelo menos dois tratamentossub-letais, ou(c) colocar em contato a bactéria viável que fornece dito benefícioà saúde com pelo menos um ingrediente de um produto comestível esubseqüentemente submeter a mistura de bactéria viável e de ingrediente apelo menos dois tratamentos sub-Ietais.

5. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o produto comestível é um produto alimentícioou uma bebida.

6. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o benefício à saúde é um efeito probiótico.

7. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as bactérias são bactérias não patogênicas.

8. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as bactérias são substancialmente intactas naestrutura no produto comestível.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a bactéria retém padrões microbianos conservados quepodem ser reconhecidos pelos receptores de reconhecimento de padrão dosistema imune.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os padrões microbianos conservados compreendem DNA e/ouconstituintes da parede celular.

11. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as bactérias são selecionadas a partir dogênero Lactobacillus ou Bifidobacterium.

12. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o produto comestível contém entre 106 e 1011 bactérias por porção.

13. MÉTODO, dé acordo com uma das reivindicações de 1 a-12, caracterizado pelo fato de que cada uma de duas ou mais etapas detratamento sub-letal é independentemente selecionada a partir de:(i) aplicação de pressão,(ii) ajuste de pH,(iii) ajuste da pressão osmótica,(iv) aquecimento,(v) homogeneização,(vi) ciclos de congelamento - descongelamento,(vii) secagem por aspersão,(viii) adição de um ou mais agentes que possuem um efeitobactericida,(ix) aplicação de um campo elétrico pulsado.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que cada uma de duas ou mais etapas detratamento sub-letal é independentemente selecionada a partir de:(i) aplicar uma pressão de 150 MPa a 400 MPa a -30° C a-25°C por entre 20 a 60 segundos,(ii) ajustar o pH a um intervalo de pH 3 a 5, ou de pH 8 a 9,(iii) ajustar a pressão osmótica pela adição de uma quantidadeapropriada de um sal de metal alcalino ou alcalino terroso,(vi) aquecer a uma temperatura de 10° C a 25° C acima datemperatura de crescimento ótima para a bactéria, por entre 1 a 5 minutos,(v) homogeneizar de 20 a 30 bar de 10° C a 15° C acima datemperatura de crescimento ótima para a bactéria, por entre 1 a 5 minutos,(vi) submeter a uma etapa de congelamento e subseqüenteetapa de descongelamento por entre 5 a 25 ciclos,(vii) a adição de uma quantidade apropriada de um ou maisagente(s) que possuem um efeito bactericida e que são selecionados a partirdo sorbato de sódio, Iisozima e nisina,(viii) aplicação de um campo elétrico pulsado utilizando entre 15a 100 kV/ cm com um comprimento de pulso entre 1 a 10 ps de 10°C a 50°C.

15. PRODUTO COMESTÍVEL, caracterizado pelo fato de serobtido pelo método conforme descrito em uma das reivindicações de 1 a 14.

16. PRODUTO COMESTÍVEL, de acordo com a reivindicação-15, caracterizado pelo fato de que é um produto alimentício ou uma bebida.