BRPI0614254A2

BRPI0614254A2 - redução de interferência entre adjuvantes contendo óleo e antìgenos contendo tensoativos

Info

Publication number: BRPI0614254A2
Application number: BRPI0614254-0A
Authority: BR
Inventors: Mario Contorni
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2005-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2011-03-15
Also published as: WO2007015167A3; KR20080038384A; US20090220547A1; NZ565512A; EP1909830B1; SI1909830T1; IL189102A; IL189102A0; CY1112149T1; AU2006274647B2; DK1909830T3; CA2617362A1; EP1909830A2; WO2007015167A2; PL1909830T3; MX2008001527A; JP2009503051A; AP2745A; ATE526036T1; PT1909830E

Abstract

REDUçãO DE INTERFêRENCIA ENTRE ADJUVANTES CONTENDO óLEO E ANTìGENOS CONTENDO TENSOATIVOS. A inclusão de adjuvantes graxos em composições de vacina pode causar dificuldades com certos componentes antiqênicos, particularmente com antígenos que incluem um componente tensoativo. Um método para a preparação de uma composição imunogênica que compreende um antígeno e um adjuvante graxo envolve a purificação do antígeno substancialmente na ausência de tensoativo. Quando tensoativos não podem ser evitados, os seguintes são combinados: (i) um componente antígeno que inclui um tensoativo e (ii) um componente adjuvante graxo, para gerar uma composição em que a proporção de peso entre o referido adjuvante graxo e o referido tensoativo é menor que 1.000:1.

Description

REDUÇÃO DE INTERFERÊNCIA ENTRE ADJUVANTES CONTENDO ÓLEO EANTÍGENOS CONTENDO TENSOATIVOS

Todos os documentos aqui citados são aqui incorporadosem sua totalidade por referência.

Campo técnico

Esta invenção está no campo de fabricação de vacinascom adjuvantes. Em particular, ela diz respeito ao uso deadjuvantes graxos durante a fabricação de vacinas baseadasem antígenos que contêm tensoativos.

Técnica de fundamento

O uso de adjuvantes para melhorar as respostas imunescontra antígenos de vacina é bem conhecido (por exemplo,veja, as referências 1 e 2). Por vários anos os únicosadjuvantes aprovados para uso humano eram sais de alumínio,mas vacinas contendo o adjuvante MF59 e o adjuvante RC-529foram aprovadas em vários países, que incluem Itália (noproduto FLUAD™ de Chiron) e Argentina (no produtoSUPERVAX™ de Berna Biotech). Adjuvantes adicionais emúltimo estágio de uso experimental humano incluem misturasde colesterol e saponinas, ISCOMs, MPLTM, AS04, virossomos,SBA4 etc.

Uma característica comum de algumas alternativas aossais de alumínio é a presença de um componente graxo. Porexemplo, o adjuvante MF5 9 inclui esqualeno (um óleo), eMPLTM contém uma forma desacilada de monofosforil lipídeo Aque tem múltiplas cadeias de ácidos graxos anexadas a umaestrutura de di-glicosamina.

A invenção visa evitar a interferência que podeocorrer entre esses adjuvantes graxos e antígenos queincluem um componente tensoativo.Sumário da invenção

O inventor constatou que adjuvantes graxos eracomposições de vacina podem ser incompatíveis com antígenosque incluem um componente tensoativo. Em várias situações,no entanto, permanece desejável combinar um adjuvante graxoe uma mistura antígeno/tensoativo, e é um objetivo dainvenção fornecer vias de evitar as dificuldades que podemsurgir ao fazê-lo. É também um objetivo fornecer processospara combinar adjuvantes e antígenos, em que aincompatibilidade é evitada.

Para evitar esses problemas de incompatibilidadequando do uso de antígenos que são tipicamente purificadospelo uso de tensoativos, um primeiro aspecto da invençãofornece um processo para a preparação de uma composiçãoimunogênica, em que: (a) a composição compreende umantígeno e um adjuvante graxo; e (b) o antígeno épurificado substancialmente na ausência de tensoativo. Aopurificar o antígeno por uma via alternativa que evita ouso de tensoativo, qualquer incompatibilidade comadjuvantes graxos pode ser superada.

Por razões clínicas, históricas ou reguladoras, noentanto, pode não ser possível purificar um antígeno sem ouso de tensoativos, ou remover totalmente tensoativos dasvacinas. Nessa situação, a invenção evita interferência porredução da proporção de óleo para o tensoativo nacomposição. Uma vacina de MF59/HBsAg típica contém umgrande excesso de óleo em relação ao tensoativo, com umaproporção de óleo:tensoativo de mais que 4.000:1 (em peso).

A invenção deseja minimizar a quantidade de adjuvante graxona composição e, em um segundo aspecto, a invenção usa nomáximo um excesso de peso de óleo de 1.000 vezes. Portanto,a invenção fornece um processo para a preparação de umacomposição imunogênica, que compreende as etapas decombinação de (i) um componente antígeno que inclui umtensoativo e (ii) um componente adjuvante graxo, para geraruma composição em que a proporção de peso do adjuvantegraxo para o tensoativo é menor que 1.000:1. De modosimilar, a invenção fornece uma composição imunogênica, emque: (a) a composição compreende um componente antígeno eum componente adjuvante graxo; (b) o componente antígenoinclui um tensoativo; e (c) a proporção de peso doadjuvante graxo para o tensoativo é menor que 1.000:1.O adjuvante graxo

O primeiro e segundo aspectos da invenção utilizam umadjuvante graxo, ou seja, um componente adjuvante queinclui uma molécula graxa. Adjuvantes graxos típicoscompreendem um óleo metabolizável, um ácido graxo e/ou umamolécula que compreende uma porção de ácido graxo.

Dois adjuvantes graxos preferidos são os adjuvantesconhecidos como "MF5 9" e "MPL". "MF5 9" é um adjuvante graxoporque ele contém esqualeno, que é um óleo metabolizável."MPL" é um adjuvante graxo porque ele contém umdissacarídeo substituído com múltiplas cadeias de ácidograxo. Bem como MF59, outros adjuvantes de emulsão óleo emágua também podem ser usados.

Portanto, composições preferidas da invenção incluem:(a) uma emulsão óleo em água, como uma emulsão óleo em águasubmicrométrica que compreende esqualeno e monooleato depolioxietileno sorbitano (e, opcionalmente, trioleato desorbitano); e/ou (b) um monofosforil lipídeo A 3-0-desacilado. Monooleato de polioxietileno sorbitano é tambémconhecido como polisorbato 80.

Em adição a "MF59" e "MPL", outros adjuvantes graxosque podem ser usados com a invenção incluem, mas não sãolimitados a: derivados de fosfato de glicosaminídeo; N-acil-pseudodipeptIdeos; o adjuvante solúvel derivado dolipideo A de Escherichia coli conhecido como "OM-174";compostos que contêm lipideos ligados a uma estruturaaciclica que contém fosfato; e análogos de lipideo Asintético acíclico.

Quando um adjuvante de emulsão óleo em água como MF5 9é usado, ele é tipicamente adicionado a um volume igual deuma composição aquosa de antigeno, de modo que a emulsão é50% em volume da composição total. Quando um adjuvante 3D-MPL é usado, uma dose típica está entre 25 μg/ml e 200μg/ml por exemplo na faixa de 50-150 μg/ml, 75-125 μg/ml,90-110 μg/ml,ou cerca de 100 μg/ml. É comum administrarentre 25-75 μg de 3D-MPL por dose por exemplo entre 45-55μg, ou cerca de 50 μg de 3D-MPL por dose. Um adjuvante deemulsão como MF59 será tipicamente fornecido em umrecipiente separado do antigeno, para mistura extemporâneano momento do uso, ou ele pode ser fornecido já misturadocom o antigeno. Um adjuvante de 3D-MPL será tipicamente jámisturado com o antigeno antes da distribuição ao usuáriofinal.

MF59

0 adjuvante "MF5 9" é uma emulsão óleo em água formadaa partir de esqualeno, Tween 8 0 (monooleato depolioxietileno sorbitano) e Span 85 (trioleato desorbitano). A emulsão é microfluidifiçada para gerar umaemulsão com um tamanho de gotícula submicrométrica. Apreparação de MF59 foi originalmente descrita na referência3, e o produto foi fabricado e vendido pela "ChironCorporation". Detalhes adicionais podem ser encontrados nocapitulo 10 da ref. 2, capitulo 12 da ref. 1 e nasreferências 4 a 6. A composição de MF59 em volume é 5%esqualeno, 0,5% polisorbato 80 e 0,5% Span 85. Em termos depeso, essas proporções se tornam 4,3% de esqualeno, 0,5% depolisorbato 80 e 0,48% de Span 85. 0 conteúdo de tensoativopróprio de MF5 9 não é levado em consideração quando docálculo da proporção óleo:tensoativo no segundo aspecto dainvenção, uma vez que a proporção é baseada no conteúdo detensoativo do antígeno.

A emulsão de MF5 9 inclui vantajosamente íons decitrato, por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio.Outras emulsões óleo em água

Como uma alternativa ao adjuvante MF59, outrasemulsões óleo em água podem ser usadas. Emulsões deadjuvante tipicamente incluem pelo menos um óleo e pelomenos um tensoativo, com o óleo(s) e tensoativo(s) sendobiodegradáveis (metabolizáveis) e biocompatíveis. Asgotículas de óleo na emulsão são têm geralmente menos que 5μιτι de diâmetro, tipicamente com um diâmetrosubmicrométrica. Tamanhos de partícula pequena podem seratingidos com um microfluidificador para fornecer emulsõesestáveis. Gotículas com um tamanho menor que 220 nm sãopreferidas ma vez que elas podem ser submetidas aesterilização de filtro.

As emulsões podem incluir óleos como aqueles de umanimal (tal como peixe) ou de fonte vegetal, em vez deóleos minerais. Fontes para óleos vegetais incluem nozes,sementes e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo decoco e óleo de oliva, os mais comumente disponíveis,exemplificam os óleos de nozes. Óleo de jojoba pode serusado, por exemplo, obtido do grão da jojoba. Óleos desementes incluem óleo de açafrão, óleo de semente dealgodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente degergelim e outros. No grupo de grãos, o óleo de milho é omais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãoscereais como trigo, aveias, centeio, arroz, teff, triticalee outros também podem ser usados. Esteres de ácido graxo de6-10 carbonos de glicerol e 1,2-propanodiol, embora nãoocorram naturalmente em óleos de semente, podem serpreparados por hidrólise, separação e esterificação dosmateriais adequados iniciando a partir dos óleos de nozes esementes. Gorduras e óleos de leite de mamífero sãometabolizáveis e podem, portanto, ser usados na práticadessa invenção. Os procedimentos para separação,purificação, saponificação e outros meios necessários paraobter óleos puros de fontes animais são bem conhecidos natécnica. A maioria dos peixes contém óleos metabolizáveisque podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, óleo defígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo debaleia como espermacete exemplificam vários dos óleos depeixe que podem ser usados nessa. Um número de óleos decadeia ramificada é sintetizado bioquimicamente em unidadesde isopreno de 5-carbonos e são geralmente referidos comoterpenóides. Óleos de fígado de tubarão contêm terpenóidesramificados, insaturados conhecidos como esqualeno,2,6,10,15,19,2 3-hexametil-2,6,10,14,18,22 -tetracosahexaeno,que é particularmente aqui preferido. Esqualano o análogosaturado ao esqualeno, é também um óleo preferido. Óleos,que incluem esqualeno e esqualano, são facilmentedisponíveis de fontes comerciais ou podem ser obtidos pormétodos conhecidos na técnica. Outros óleos preferidos sãoos tocoferóis (veja abaixo). Misturas de óleos podem serusadas.

Tensoativos podem ser classificados por seu "HLB"(equilíbrio hidrofilia/lipofilia). Tensoativos preferidosda invenção têm um HLB de pelo menos 10, preferivelmentepelo menos 15, e mais pref erivelmente pelo menos 16. Ainvenção pode ser usada com tensoativos que incluem, semlimitação: os tensoativos de ésteres de polioxietilenosorbitano (comumente referidos como cmo os Tweens),especialmente polisorbato 20 e polisorbato 80; copolímerosde óxido de etileno (EO) , óxido de propileno (PO) , e/ouóxido de butileno (BO) , vendidos sob o nome comercialDOWFAX™, como copolímeros em bloco lineares EO/PO;octoxinóis, que podem variar no número de grupos derepetição de etoxi(oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9(Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo departicular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPALCA-630/NP-40); fosfolipídeos como fosfatidilcolina(Iecitina); éteres graxos de polioxietileno derivados delauril, cetil, estearil e oleil álcoois (conhecidos comotensoativos Brij), como trietilenoglicol monolauril éter(Brij 30) ; e ésteres de sorbitano (comumente conhecidoscomo SPANs), como trioleato de sorbitano (Span 85) emonolaurato de sorbitano. Tensoativos preferidos parainclusão em uma emulsao sao Tween 8 0 (monooleato depolioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato desorbitano), lecitina e Triton X-IOO. Misturas detensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas deTween 80/Span 85, ou misturas de Tween80/Triton-X100.

Adjuvantes de emulsão óleo em água úteis com ainvenção incluem, mas não são limitados a:

- uma emulsão de esqualeno, tocoferol e Tween 80. Aemulsão pode incluir solução salina tamponada por fosfato.Ela também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/oulecitina. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno,de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e aproporção de peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente<1 uma vez que essa fornece uma emulsão mais estável. Umatal emulsão pode ser feita por dissolução de Tween 8 0 emPBS para gerar uma solução a 2%, então mistura de 90 mldessa solução com a mistura de (5g de DL-α-tocoferol e 5ml de esqualeno), então microfluidificação da mistura. Aemulsão resultante pode ter goticulas de óleosubmicrométricas, por exemplo, com um diâmetro médio entre100 e 250 nm, preferivelmente cerca de 180 nm.

- uma emulsão de esqualeno, tocoferol, e um detergentede Triton (por exemplo Triton X-100).

- uma emulsão de esqualano, polisorbato 8 0 e poloxamer401 ("Pluronic™ L121"). A emulsão pode ser formulada emsolução salina tamponada por fosfato, pH 7,4. Essa emulsãoé um veiculo de liberação útil para dipeptideos de muramil,e tem sido usado com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1" [7](0,05-1% Thr-MDP, 5% esqualano, 2,5% Pluronic L121 e 0,2%polisorbato 80) . Ela também pode ser usada sem o Thr-MDP,como no adjuvante "AF" [8] (5% esqualano, 1,25% PluronicL121 e 0,2% polisorbato 80). Microfluidificação épreferida.

- uma emulsão que tem de 0,5-50% de um óleo, 0,1-10%de um fosfolipídeo, e 0,05-5% de um tensoativo não iônico.

Como descrito na referência 9, componentes preferidos defosfolipideo são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol,ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Tamanhode gotículas submicrométricas são vantajosos.

- uma emulsão óleo em água submicrométrica de um óleonão metabolizável (como óleo mineral leve) e pelo menos umtensoativo (como lecitina, Tween 80 ou Span 80). Aditivospodem ser incluídos, como QuilA saponina, colesterol, umconjugado saponina-lipofíIico (como GPI-0100, descrito nareferência 10, produzido por adição de amina alifática adesacilsaponina via grupo carboxil de ácido glicurônico),brometo de dimetildioctadecilamônio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina.

- uma emulsão em que uma saponina (por exemplo QuilAou QS21) e um esterol (por exemplo um colesterol) sãoassociados como micelas em hélice [11].

As emulsões são preferivelmente misturadas comantígeno extemporaneamente, no momento da liberação.Portanto, o adjuvante e antígeno são tipicamente mantidosseparadamente em um pacote ou vacina distribuída, prontospara formulação final no momento do uso. 0 antígeno estarágeralmente em uma forma aquosa, de modo que a vacina éfinalmente preparada por mistura de dois líquidos. Aproporção de volume dos dois líquidos para mistura podevariar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5) mas é geralmente decerca de 1:1.

Quando a composição inclui um tocoferol, qualquer umde α, β, γ, δ, ε, ou ξ tocoferóis pode ser usado, mas a-tocoferóis são preferidos. O tocoferol pode ter váriasformas, por exemplo, diferentes sais e/ou isômeros. Saisincluem sais orgânicos, como succinato, acetato, nicotinatoetc. D-α-tocoferol e DL-a-tocoferol podem ser usados. Uma-tocoferol preferido é DL-a-tocoferol, e o sal preferidodesse tocoferol é o succinato.

3D-MPL

Monofosforil lipideo A 3-O-desacilado (3D-MPL; tambémreferido como monofosforil lipideo A 3 de-O-acilado ou 3-0-desacil-4'-monofosforil lipideo A) é um adjuvanteconhecido. 0 nome indica que a posição 3 da glicosamina deextremidade redutora no monofosforil lipideo A édesacilada. 3D-MPL foi preparado a partir de um mutante semheptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente similarao lipideo A mas é desprovido de um grupo fosforil estávelem ácido e um grupo acil estável em base. Ele ativa célulasda linhagem de monócitos/macrófagos e estimula a liberaçãode várias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-a e GM-CSF. A preparação de 3D-MPL foi originalmente descrita nareferência 12, e o produto foi fabricado e vendido porCorixa Corporation sob o nome comercial "MPL". Detalhesadicionais podem ser encontrados na referências 13 a 16.

3D-MPL pode ter a forma de uma mistura de moléculasrelacionadas, que variam por sua acilação (por exemplo,tendo 3, 4, 5 ou 6 cadeias de acil, que podem ser decomprimento diferentes). Os dois monossacarídeos deglicosamina (também conhecidas como 2-desoxi-2-amino-glicose) são N-acilados em seus carbonos de posição 2 (ouseja, nas posições 2 e 2'), e há também O-acilação naposição 3'. 0 grupo anexado ao carbono 2 tem a fórmula -NH-CO-CH2-CR1R1'. 0 grupo anexado ao carbono 2' tem a fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2'. 0 grupo anexado ao carbono 3' tem afórmula -O-CO-CH2-CRR . Uma estrutura representativa é:

<formula>formula see original document page 12</formula>

Grupos R1, R2 e R3 são cada um independentemente —(CH2)n—CH3. 0 valor de η é preferivelmente entre 8 e 16,mais preferivelmente entre 9 e 12, e é mais preferivelmente 10.

Grupos R1', R2' e R3' podem ser independentemente: (a)-H; (b) -OH; ou (c) -O-CO-R4, em que R4 é-H ou -(CH2)m-CH3,em que o valor de m é pref erivelmente entre 8 e 16, e émais pref erivelmente 10, 12 ou 14. Na posição 2, m épreferivelmente 14. Na posição 2', m é preferivelmente 10.

Na posição 3', m é pref erivelmente 12. Grupos R1', R2' e R3'são assim preferivelmente grupos -0-acil de ácidododecanóico, tetradecanóico ou hexadecanóico.

Quando todos de R1', R2' e R3' são —H então o 3D-MPL emapenas 3 cadeias acil (uma em cada das posições 2, 2' e3') . Quando apenas dois de R1', R2' e R3' são —H então o 3D-MPL pode ter 4 cadeias acil. Quando apenas um de R1', R2' eR3' é —H então o 3D-MPL pode ter 5 cadeias acil. Quandonenhum de R1', R2' e R3' é -H então o 3D-MPL pode ter 6cadeias acil. O adjuvante 3D-MPL usado de acordo com ainvenção pode ser uma mistura dessas formas, com de 3 a 6cadeias acil, mas é preferível incluir 3D-MPL com 6 cadeiasacil na mistura, e em particular para assegurar que a formade cadeia de hexaacil faça pelo menos 10% em peso do 3D-MPLtotal, por exemplo >20%, >30%, >40%, >50% ou mais. 3D-MPLcom 6 cadeias acil é a forma mais ativa de adjuvante.

Portanto, a forma mais preferida de 3D-MPL parainclusão nas composições da invenção é:

Quando 3D-MPL é usado na forma de uma mistura entãoreferências a quantidades ou concentrações de 3D-MPL nascomposições da invenção referem-se às espécies combinadasde 3D-MPL na mistura.

Em condições aquosas, 3D-MPL pode formar agregadosmicelares ou partículas com diferentes tamanhos, porexemplo, com um diâmetro <150 nm ou >500 nm. Cada um dessesou ambos podem ser usados com a invenção, e as melhorespartículas podem ser selecionadas por ensaio rotineiro.Partículas menores (por exemplo, pequenas o suficiente paragerar uma suspensão aquosa transparente de 3D-MPL) sãopreferidas para uso de acordo com a invenção por causa desua atividade superior [17] . Partículas preferidas têm umdiâmetro médio menor que 220 nm, mais preferivelmente menosque 200 nm ou menos que 150 nm ou menos que 120 nm, e podematé ter m diâmetro médio menor que 100 nm. Na maioria doscasos, no entanto, o diâmetro médio não será menor que 50nm. Essas partículas são pequenas o suficiente para seremadequadas para esterilização em filtro. O diâmetro dapartícula pode ser avaliado por técnica rotineira dedisseminação de luz dinâmica, que revela um diâmetro médiode partícula. Quando uma partícula é dita como tendo umdiâmetro de χ nm, haverá geralmente uma distribuição departículas por volta dessa média, mas pelo menos 50% emnúmero (por exemplo, >60%, >70%, >80%, >90%,ou mais) daspartículas terão um diâmetro na faixa de χ ± 25%.

O 3D-MPL pode ser usado por si ou como um adjuvante,ou em combinação com um ou mais de outros compostosadjuvantes. Por exemplo, é conhecido o uso de 3D-MPL emcombinação com a saponina QS21 [18], com QS21 e uma emulsãoóleo em água [19] , com um fosfato de alumínio [20] , comhidróxido de alumínio [21], ou com saponinas & interleucina-12 [22].

Uma mistura preferida de adjuvante, particularmentepara uso com HBsAg, compreende uma mistura de 3D-MPL e umsal de alumínio, preferivelmente fosfato de alumínio.Vantajosamente, o 3D-MPL é adsorvido no sal de alumínio.Preferivelmente pelo menos 50% (em peso) do 3D-MPL éadsorvido por exemplo >60%, >70%, >80%, >90%, >95%, >98% oumais.

Adjuvantes de alumínio atualmente em uso sãotipicamente referidos como adjuvantes de "hidróxido dealumínio" ou como "fosfato de alumínio". Esses são nomes deconveniência, no entanto, como nenhum é uma descriçãoprecisa do real composto químico que é presente (porexemplo, veja o capítulo 9 da referência 2) . Paracombinação com um adjuvante graxo como 3D-MPL, a invençãopode usar qualquer um dos "hidróxido" ou sais de "fosfato"que estão em uso geral como adjuvantes.

Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio"são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que sãocomumente, pelo menos parcialmente, cristalinos.

Oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pelafórmula AlO(OH), pode ser distinto de outros compostos dealumínio, como hidróxido de alumínio Al(OH)3, em suaespectroscopia de infravermelho (IR), em particular pelapresença de uma banda de absorção a 1. OVOcm"1 e umaramificação forte a 3.090-3.IOOcm"1 (capítulo 9 da ref. 2).

Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio"são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, freqüentementetambém contendo uma pequena quantidade de sulfato. Elespodem ser obtidos por precipitação, e as condições dereação e concentrações durante a precipitação influencia ograu de substituição de fosfato por hidroxil no sal.

Hidroxifosfatos geralmente têm uma proporção molar deP04/A1 molar entre 0,3 e 0,99. Hidroxifosfatos podem serdistintos de AlPO4 pela presença de grupos hidroxil. Porexemplo, uma banda de espectro de IR a 3.164 cm"1 (porexemplo, quando aquecido a 2000C) indica a presença degrupos hidroxil estruturais (capítulo 9 da ref. 2).

A proporção molar de P04/A13+ molar de um adjuvante defosfato de alumínio estará geralmente entre 0,3 e 1,2,preferivelmente entre 0,8 e 1,2, e mais preferivelmente0,95 ±0,1. 0 fosfato de alumínio será geralmente amorfo,particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvantetípico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com proporçãomolar de P04/Al entre 0,84 e 0,92, incluída a 0,6mg de Al3+/ml. O fosfato de alumínio geralmente será particulado.Diâmetros típicos das partículas são na faixa de 0,5-20 μπ\(por exemplo, cerca de 5-10 μτη) depois de qualquer adsorçãode antígeno.

O PZC de fosfato de alumínio é inversamenterelacionado ao grau de substituição de fosfato porhidroxil, e esse grau de substituição pode variardependendo das condições de reação e concentração dereagentes usados para a preparação do sal por precipitação.PZC é também alterado por troca da concentração de íonsfosfato livres em solução (mais fosfato = PZC mais ácido)oupor adição de um tampão como um tampão de histidina (tornaPZC mais básico). Fosfato de alumínios usado de acordo coma invenção geralmente terá um PZC entre 4,0 e 7,0, maispreferivelmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, cerca de 5,7.

Uma solução de fosfato de alumínio usada para preparara composição da invenção pode conter um tampão (por exemploum tampão de fosfato ou histidina ou Tris), mas isso não ésempre necessário. A solução de fosfato de alumínio épreferivelraente estéril e livre de pirógeno. A solução defosfato de alumínio pode incluir íons de fosfato aquosolivres, por exemplo, presentes em uma concentração entre1,0 e 20 mM, pref erivelmente entre 5 e 15 mM, e maispreferivelmente cerca de 10 mM. A solução de fosfato dealumínio também pode compreender cloreto de sódio. Aconcentração de cloreto de sódio é preferivelmente na faixade 0,1 a 100 mg/ml (por exemplo 0,5-50 mg/ml, 1-20 mg/ml,2-10 mg/ml) e é mais preferivelmente cerca de 3±1 mg/ml. Apresença de NaCl facilita a medição correta do pH antes daabsorção de antígenos.

0 fosfato de alumínio é preferivelmente usado na formade uma solução aquosa à qual 3D-MPL (e, opcionalmente, umantígeno) é adicionado (NB: é padrão referir-se a fosfatode alumínio aquoso como uma "solução" embora, em um pontode vista físico-químico estrito, o sal é insolúvel e formauma suspensão). É preferível diluir o fosfato de alumíniona concentração necessária e assegurar uma soluçãohomogênea antes da adição de 3D-MPL e/ou do antígeno.

N-acil-pseudodipeptides

Um adjuvante de N-acil-pseudodipeptídeopreferivelmente inclui um grupo hidroxil que é esterificadopor um grupo ácido na forma neutra ou carregada. Os gruposacil dão aos pseudodipeptídeos um caráter graxo. 0adjuvante preferivelmente tem a fórmula (I):

<formula>formula see original document page 17</formula>

Em que:

R1 é um grupo acil derivado de um ácidocarboxílico de cadeia linear ou ramificada, saturado ouinsaturado que tem de 2 a 24 átomos de carbono, o ácidocarboxílico sendo não substituído ou substituído com um oumais substituintes selecionados do grupo que consiste emhidroxil, 5 alquil, alcoxi, aciloxi, amino, acilamino,aciltio e (grupos (C1^4) alquil)tio;

R2 é um grupo acil derivado de um ácidocarboxílico de cadeia linear ou ramificada, saturado ouinsaturado que tem de 2 a 24 átomos de carbono, o ácidocarboxílico sendo não substituído ou substituído com um oumais substituintes selecionados do grupo que consiste emhidroxil, alquil, alcoxi, aciloxi, amino, acilamino,aciltio e (grupos (Ci-24) alquil) tio;

- X é um átomo de hidrogênio ou um grupo ácido emforma neutra ou carregada;

- Y é um átomo de hidrogênio ou um grupo ácido emforma neutra ou carregada;

A é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ouum grupo imino -NH-;

B é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ouum grupo imino -NH-;

- m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

- n é O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

- p é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 OU 10;

- q é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

desde que pelo menos um dos substituintes X ou Ydesigne um grupo ácido em forma neutra ou iônica.

O adjuvante pode ser usado em forma de ácido ou sal,com uma base orgânica ou mineral.

O sal que forma bases para uso terapêutico incluiprincipalmente bases de metal alcalino como hidróxidos desódio, potássio ou lítio, sais de amônio; bases de metalalcalino terroso como hidróxido de cálcio ou estrôncio esais de magnésio; sais de metal ferroso e outros; basesorgânicas como aquelas derivadas de aminas primárias,secundárias, terciárias como metilamina, dietilamina,monoetanolamina, dietanolamina, benzilamina, N-metilbenzilamina, veratrilamina, trimetoxibenzilamina;aminoácidos básicos como lisina e ornitina ou açúcares deamino. Exemplos de bases que não são usadasterapeuticamente são brucina, estriquinina, agmatina,homarina, glicosamina, N-metilglicosamina ou N-metilmorfolina.

Substituintes preferidos XeY são selecionados de:

- carboxi [ (Ci-5) alquil]

- CH- [ (CH2) rC00H] [(CH2)sCOOH], em que : réO, 1, 2, 3, 4 ou5; séO, 1, 2, 3, 4 OU 5

- fosfono [ (Ci-5) alquil]

- dihidroxifosforiloxi [ (C1-5) alquil]

- dimetoxifosforil- fosfono

- hidroxissulfonil

- hidroxissulfonil [ (C1-5) alquil]

- hidroxissulfoniloxi [ (C1-5) alquil]

Quando os substituintes X e/ou Y designam um grupoácido em forma neutra, é feita referência à formacarboxilica, sulfônica ou fosfórica livre. Quando o grupoácido está em forma carregada, é feita referência à formade sal carboxílico, sulfônico ou fosfórico, por adição deuma base orgânica ou mineral, preferivelmente uma para usoterapêutico. Considerações similares se aplicam em que Xe/ou Y designam um grupo carboxilalquil,alquenilbiscarboxílico, hidroxissulfonil,

hidroxissulfonilalquil, hidroxissulfonil-oxialquil,fosfonoalquil ou fosforil-oxialquil.

Quando m=l e n=0, o adjuvante deriva de serina. Quandom=2 e n=0, o adjuvante deriva de homosserina. Se m=3 e n=0,é feita referência a um composto pentahomosserina. Se m=4 en=0, é feita referência a um composto hexahomosserina.

Quando p=3 e q=l, o produto de interesse pode ser umcomposto de citrulina, ornitina ou arginina. Quando p=4 eq=l, é feita referência a um composto de homoarginina oulisina.

R1 e R2 incluem derivados de acil de cadeia linear ouramificada, saturados ou insaturados que têm váriostamanhos de cadeia, de natureza distinta ou idêntica, quepode ter um ou mais substituintes selecionados do grupo queconsiste em grupos alquil, amino, acilamino, hidroxil,alcoxi, aciloxi, aciltio e alquiltio.

Exemplos de tais derivados acilados, substituídos sãoradicais ricinoleil, 1,2-hidroxiestearoil, 2-hidroxi-3-metil butiroil, 3-hidroxi-2-aminopentanoil, palmitoil,elaidil, eleostearoil, araquidoil, araquidonil, gadoleil,behenil, erucil, 8-metildecanoil, 9-metildecanoil,docosohexaenoil ou eicosapentaneoil.

Adjuvantes preferidos têm a fórmula (Ia), em que AeBsão átomos de oxigênio:

<formula>formula see original document page 20</formula>

Na fórmula (Ia), XeY são preferivelmente um átomo dehidrogênio ou um grupo fosfono.Adjuvantes adequados de fórmula (Ia) incluem:

3 -(3-dodecanoiloxitetradecanoilamino) 9- (3 -hidroxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecan-1,10-diol 1e/ou 10-dihidrogêniofosfato e seus sais de adição formadoscom uma base orgânica ou mineral,

3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoilamino) 9-(3-hidroxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecan-1,10-diol 1,10-bis(dihidrogêniofosfato) e seus sais de adição formados comuma base orgânica ou mineral,

- 3-(3-hidroxitetradecanoilamino) 9-(3-dodecanoiloxitetradecanoilamino) 4-oxo-5- azadecan-1,10 -diol 1,10-bis(dihidrogêniofosfato) e seus sais de adiçãoformados com uma base orgânica ou mineral,

3-(3-dodecanoiloxitetradecanoilamino) 9-(3 -hidroxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecan-l,10-diol 1-dihidrogêniofosfato e seus sais de adição formados com umabase orgânica ou mineral,

3-(3-hidroxitetradecanoilamino) 9-(3-dodecanoiloxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecan-1,10-diol1-dihidrogêniofosfato e seus sais de adição formados comuma base orgânica ou mineral

3-(3-hidroxitetradecanoilamino) 9-(3-dodecanoiloxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecano-1,10-diol 10-dihidrogêniofosfato e seus sais de adição formadoscom uma base orgânica ou mineral.

Métodos para síntese de um adjuvante de fórmula (I)são revelados em detalhes na referência 23, e incluemmétodos que compreendem as etapas de: proteção dos gruposfuncionais de amina nas posições (q+1) e ω de um ácidodiamino por bloqueio dos reagentes com . acidólise ehidrogenólise, respectivamente; reação do grupo funcionalcarboxílico livre com um agente redutor para gerar umálcool correspondente; desproteção do grupo funcional deamina (q+1) e então acilação por meio de um derivadofuncional de ácido carboxílico de fórmula R2OH, esubseqüentemente liberação do grupo funcional de aminaterminal por hidrogenólise para gerar um diamino álcool defórmula geral II:

<formula>formula see original document page 22</formula>

Cujo amino álcool é condensado na presença de umagente de condensação de peptídeo em um solvente inerte,junto com um composto de aminoácido ω-hidroxi, ω-amino ouω-tio de fórmula geral III:

<formula>formula see original document page 22</formula>

para fornecer um composto de dipeptídeo de fórmula(IV) :

<formula>formula see original document page 22</formula>

o grupo funcional de álcool livre terminal do qualpodem ser, se necessário, protegido (por exemplo por umgrupo alquil ou acil, ou qualquer outro grupo de proteçãoadequado) ou substituído, se necessário, na presença de umagente de ligação. 0 álcool protegido pode ser submetido auma hidrogenação catalítica ou outro tratamento dedesproteção para obter o derivado de fórmula geral I.

Métodos para síntese de adjuvantes de fórmula (II) sãotambém revelados em detalhe na referência 23, e incluemmétodos que compreende as etapas de: proteção de gruposfuncionais de amina nas posições (q+1) e ω de um ácidodiamino de fórmula H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-HCOOH por proteção dereagentes que são facilmente submetidos a acidólise ehidrogenólise, respectivamente; reação do grupo funcionalcarboxílico livre com um agente redutor para gerar umálcool correspondente; desproteção do grupo funcional deamina na posição (q+1) e então acilação por meio de umderivado funcional de ácido carboxílico de fórmula R2OH,então desproteção do grupo funcional de amina terminal porhidrogenólise para obter um amino álcool de fórmula geralII; cujo amino álcool é condensado na presença de um agentede condensação de peptídeo em um solvente inerte, junto comum derivado funcional de aminoácido ω-hidroxi, de fórmulageral IIIa: X0-(CH7)m-CH-(CH2)n-COOH

<formula>formula see original document page 23</formula>

em que X é radical dialquiloxi ou diariloxi- fosforilde fórmula (RO)2P-O para gerar um composto semelhante apeptídeo de fórmula IVa:

(RO)2PO -(CH2)tn-CH-(CH2)0-CONH-(CHi)-CH-(CH2 )q-OH

<formula>formula see original document page 23</formula>

em que R é um radical que é facilmente submetido ahidrogenólise, o outro grupo funcional de álcool do qualpode ser, se desejado, fosforilado por um agente defosforilação na presença de um agente de ligação, senecessário. O álcool protegido pode ser submetido ahidrogenação catalítica por um lado para desproteger ogrupo funcional de álcool opcionalmente presente no R2 degrupo acil e no outros, liberar o grupo funcional defosfato e então desproteger através de hidrogenólise osegundo grupo funcional de fosfato opcionalmente presente,para obter o derivado de fórmula geral V:<formula>formula see original document page 24</formula>

e opcionalmente realizar a etapa adicional de formaçãode sal por meio de uma base orgânica ou mineral.

A estereoquímica de centros quirais dos gruposacilamino é determinada pela configuração de aminoácidoinicialmente usada enquanto a estereoquímica de gruposacilamino depende da configuração de ácido graxoinicialmente usada. Um pode iniciar a partir de um diaminoácido tendo configuração L ou D de uma natureza racêmica.Um pode iniciar a partir de um aminoácido hidroxilado deconfiguração L ou D de uma mistura racêmica. Todos essesestereoisômeros ou diastereoisômeros são incluídos noescopo da invenção.

Adjuvantes particularmente preferidos, e notavelmentecompostos mono- e bis-fosforilados, são aqueles que sãoconhecidos como "0M-294-MP" (fórmula VI) e "0M-294-DP"(fórmula VII) [23]:

<formula>formula see original document page 24</formula>OM-174

OM-174 pode ser obtido através de síntese química, eretém um motivo de triacil de lipídeo A. Ele é descrito emmaiores detalhes nas referências 24-26. A Referência 26 dáa fórmula de OM-174 como:

<formula>formula see original document page 25</formula>

Portanto, OM-174 tem uma estrutura de diglicosaminaβ(l->6)-ligada 1,4'-bifosforilada, como encontrado nolipídeo natural A. OM-174 pode estar presente na forma deagregados com uma estrutura H1 micelar, ou seja, em que asmoléculas de lipídeo são embaladas com sua estrutura em umasuperfície cilíndrica com as cadeias acil direcionadas parao interior, com os cilindros em si sendo embalados de modohexagonal. Uma fase cúbica pode ser ausente. Uma fase H11também pode estar ausente.

Derivados de fosfato de glicosaminídeo

Derivados de fosfato de aminoalquil glicosaminídeo(AGP) (por exemplo RC-529 [27,28]) são adjuvantes graxospor causa da cadeia acil. Em geral, esses derivados podemter a seguinte fórmula [29]:<formula>formula see original document page 26</formula>

em que:

- X representa um átomo de oxigênio ou enxofre naposição axial ou equatorial;

- Y representa um átomo de oxigênio ou grupo NH;

- "η", "m" , "p" e "q" são o mesmo ou diferentes e sãonúmeros inteiros de 0 a 6;

- Ri, R2, e R3, que podem ser o mesmo ou diferentes,são resíduos de acil graxo que têm de 1 a cerca de 20átomos de carbono e em que um de R1, R2 ou R3 éopcionalmente hidrogênio;

R4 e R5 são o mesmo ou diferentes e sãohidrogênio ou metil;

R6 e R7 são o mesmo ou diferentes e sãohidrogênio, hidroxi, alcoxi, fosfono, fosfonooxi, sulfo,sulfooxi, amino, mercapto, ciano, nitro, formil ou carboxie ésteres e amidas desses;

R8 e R9 são o mesmo ou diferentes e são fosfonoou hidrogênio, com preferivelmente pelo menos um de R8 e/ouR9 sendo fosfono.A configuração dos centros estereogênicos 3' aos quaisos resíduos de acil graxo normais são anexados é R ou S,mas preferivelmente R. A estereoquímica dos átomos decarbono aos quais R4 ou R5 são anexados pode ser R ou S.

Todos os estereoisômeros, enantiômeros e diastereômeros, emisturas desses, são considerados como dentro do escopo daatual invenção. Adjuvantes adequados incluem sais dessescompostos.

Um composto AGP preferido é "RC-529", que pode serpreparado como descrito na ref. 30:

<formula>formula see original document page 27</formula>

Análogos de lipídeo A sintético acíclico

Um análogo de lipídeo A que pode ser usado como umadjuvante nas composições da invenção é ER-112022 [31] , umdímero de fosfolipídeo conectado via uma estruturaacíclica:<formula>formula see original document page 28</formula>

Cada unidade monomérica de ER-112022 contém 3 gruposgraxos únicos que são ligados indiretamente a um diéster defosfato. Os grupos gordurosos incluem uma cadeia de éter de10-carbonos, uma cadeia de aciloxi insaturado de 12-carbonos ligada à cadeia de éter, e uma cadeia de b-oxo-amida de 14-carbonos, ligadas próximo ao fosfodiéster.Portanto, o composto tem 3 características únicas comparadocom o lipídeo A de ocorrência natural de E. coli: (i) ER-112022 é desprovido de uma estrutura de carboidratocíclico; (ii) segundo, os fosfatos são fosfodiésteresincorporados nos imites do esqueleto estrutural, diferentedos fosfoésteres no lipídeo A de E. coli; e (iii) aestrutura é simétrica (seis ácidos graxos simetricamenteorganizados em um esqueleto não carboidrato).

Compostos úteis similares incluem aqueles com afórmula XIV, XV ou XVI, ou sais desses:

<formula>formula see original document page 28</formula>Como definido na referência 32, como "ER 803 058", "ER803732", "ER 804053", ER 804058", ~ER 804059", "ER 804442","ER 804680", "ER 804764", ER 803022 ou "ER 804057" por

exemplo:

<formula>formula see original document page 29</formula>

Compostos que contêm lipídeos ligados a um esqueletoacíclico que contém fosfato também podem ser usados comoadjuvantes, como o antagonista de TLR4 E5564 [33,34] :

<formula>formula see original document page 29</formula>

O tensoativo

O primeiro aspecto da invenção evita substancialmenteo uso de tensoativo durante a purificação de antigeno, demodo que o tensoativo não seja encontrado no componenteantígeno usado na invenção, no segundo aspecto, no entanto,o tensoativo é usado, mas em níveis controlados em relaçãoao adjuvante graxo.

O tensoativo será tipicamente um tensoativo nãoiônico, particularmente aqueles que são já encontrados emformulações de vacina. Tensoativos orgânicos sãopreferidos. Esses são tipicamente produtos da reação de umóxido de alquileno (por exemplo, óxido de etileno) com umálcool graxo, ácido graxo, alquilfenol, alquilamina ououtro composto adequado que tem pelo menos um átomo dehidrogênio ativo. Para a maioria dos tensoativos os álcooismais comuns, aminas e ácidos têm um comprimento de cadeiade carbono na faixa de C8-Ci8. Os alquilfenóis mais comunssão nonilfenol e octilfenol. Tensoativos contendo resíduosde poli(oxieteno) são particularmente preferidos.

Por exemplo, a invenção pode ser usada com tensoativosque incluem, sem limitação: os tensoativos de ésteres depolioxietileno sorbitano (comumente referidos como osTweens), especialmente polisorbato 20 e polisorbato 80;copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno(PO), e/ou óxido de butileno (BO), vendidos sob o nomecomercial DOWFAX™, como copolímeros em bloco linearesEO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de grupos derepetição etoxi (oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9(Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo departicular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPALCA-630/NP-40); éteres graxos dè polioxietileno derivados delauril, cetil, estearil e oleil álcoois (conhecidos comotensoativos Brij), como trietileneglicol monolauril éter(Brij 30); e ésteres de sorbitano (comumente referidos comoos SPANs), como trioleato de sorbitano (Span 85) emonolaurato de sorbitano.

Dois tensoativos específicos de interesse são TritonX-IOO e polisorbato 20. Assim, modalidades preferidas doprimeiro aspecto da invenção evitam substancialmente o usodesses dois tensoativo não iônicos em particular, epreferivelmente evitam substancialmente o uso de qualquertensoativo não iônico. De forma similar, modalidadespreferidas do segundo aspecto da invenção usam umcomponente antígeno que compreende um desses doistensoativo não iônicos.

A invenção é particularmente adequada para uso compolisorbato 20. Esse tensoativo tem um perfil de segurançaestabelecido para administração a humanos, incluindo emvacinas.

Tensoativos podem ser classificados por seu "HLB"(equilíbrio hidrófilo/lipófilo) . Tensoativos preferidos dainvenção têm um HLB de pelo menos 10, pref erivelmente pelomenos 15, e mais preferivelmente pelo menos 16.

Para evitar a administração de grandes doses dotensoativo a um paciente no segundo aspecto da invenção, épreferível que a concentração do tensoativo na composiçãonão seja de mais que 5 0 μg/ml, por exemplo, <4 0 μg/ml, <3 5μ9/πι1, <30 μ9/ττι1, <25 μg/ml, <20 μ9/πι1, <15 μ9/πι1, <10μg/ml, <5 μg/ml etc. A concentração de <20 μg/ml épreferida.

0 antígeno

A invenção envolve o uso de um antígeno. A invenção éparticularmente adequada para uso com antígenos que sãotipicamente purificados pelo uso de tensoativos. Essesantígenos são tipicamente lipofílicos. Eles incluirãocomumente pelo menos uma região de transmembrana, quefunciona in vivo para localizar o antígeno em uma bicamadalipídica, por exemplo, na superfície de um patógeno. Ainvenção é particularmente útil para uso com antígenos desuperfície viral.

No segundo aspecto da invenção, o componente antígenoinclui um tensoativo. Em vez de ser uma simples mistura deantígeno e tensoativo, é preferível que o antígeno etensoativo devam estar na forma de um complexo. Complexosde antígeno/tensoativo incluem lipossomos estabilizados portensoativo que contêm antígeno, e niossomos, que sãovesículas formadas a partir de compostos anfifílicos nãoiônicos sintéticos. Um complexo antígeno/tensoativopreferido é um antígeno de superfície de hepatite Bparticulado, purificado na presença de tensoativo. AReferência 3 5 descreve como partículas de HBsAgrecombinante podem reter Tween 20 que foi usado durante asua purificação (até 25 μg Tween 20 por 100 μg HBsAg).

0 antígeno mais preferido para uso com o segundoaspecto da invenção é assim o antígeno de superfície dovírus da hepatite B (HBV) , na forma de partículassubstancialmente esféricas (diâmetro médio de cerca de 20nm) , incluindo uma matriz de lipídeo que compreende ambosfosfolipídeos e um tensoativo não iônico, como polisorbato20. Tensoativo não iônico pode ser incorporado na partículadurante a purificação.

Para o primeiro aspecto da invenção, no entanto, umaforma preferida de HBsAg é uma em que HBsAg é purificadosem o uso de tensoativo não iônicos, de modo que apartícula de HBsAg não incorpore qualquer tensoativo, dessaforma evitando interferência com o adjuvante graxo.

O vírus da hepatite B (HBV) é um dos agentesconhecidos que causa a hepatite viral. O vírion do HBVconsiste em um núcleo interno circundado por umrevestimento proteico ou capsídeo externo, e o núcleo viralcontém o genoma do DNA viral. O principal componente docapsídeo é uma proteína conhecida como antígeno desuperfície de HBV ou, mas comumente, "HBsAg", que étipicamente um polipeptídeo de 226 aminoácidos com um pesomolecular de -24 kDa. Todas as vacinas existentes dehepatite B contêm HBsAg, e quando esse antígeno éadministrado a uma pessoa normal ele estimula a produção deanticorpos anti-HBsAg que protegem contra infecção por HBV.

Para fabricação de vacina, HBsAg pode ser feito deduas maneiras. O primeiro método envolve a purificação doantígeno em forma particulada do plasma de portadores dehepatite B crônica, uma vez que grandes quantidades deHBsAg são sintetizadas no fígado e liberadas na correntesangüínea durante uma infecção por HBV. A segunda maneiraenvolve a expressão da proteína por métodos de DNArecombinante. HBsAg para uso com o método da invenção érecombinantemente expresso em células de levedura.Leveduras adequadas incluem hospedeiros de Saccharomyces(como S.cerevisiae), Pichia (como P.pastoris) ou Hanensula(como H.poliworpha). Como uma alternativa, o antígeno podeser expresso em células de mamíferos recombinantes (porexemplo em ovário de hamster da China (CHO), células COS,células Bu3, etc.), inseto (por exemplo uso de vetores debaculovírus), ou células de planta. Em geral, entretanto,expressão em levedura é usada.

0 HBsAg expresso em levedura é preferivelmente nãoglicosilado. Diferentemente de HBsAg nativo (ou seja, comono produto plasma-purifiçado), HBsAg expresso em levedura égeralmente não glicosilado, e essa é a forma mais preferidade HBsAg para uso com a invenção, porque ele é altamenteimunogênico e pode ser preparado sem o risco decontaminação de produto do sangue. Partículas de HBsAgexpresso em levedura podem incluir fosfatidilinositol, quenão é encontrado em vírion de HBV natural. As partículastambém podem incluir uma quantidade não tóxica de LPS paraestimular o sistema imune [36].

Vários métodos para purificar HBsAg são conhecidos natécnica (por exemplo, veja as refs 37-62). Desses váriosprocessos, o primeiro aspecto da invenção usa um em que umtensoativo não iônico não é usado. Em contraste, o segundoaspecto da invenção usa um tensoativo não iônico durante apurificação, de modo que o tensoativo torna-se incorporadono produto final particulado de HBsAg. O uso de polisorbatodurante o rompimento de células de levedura recombinante noinício da purificação é um modo preferido de introduzir otensoativo nas partículas de HBsAg.

Um método preferido para purificação de HBsAg envolve,após o rompimento da célula: ultrafiltração; cromatografiade exclusão por tamanho; cromatografia de troca aniônica;ultracentrifugação; dessalinização; e filtração estéril.Lisados podem ser precipitados após o rompimento da célula(por exemplo, com o uso de polietileno glicol), deixandoHBsAg em solução, pronto para ultrafiltração. Antes oudepois da filtração estéril, é possível estabilizarpartículas de HBsAg por tratamento cora formaldeído. 0excesso de formaldeído pode ser então removido porultrafiltração ou por cromatografia. Filtração estériladicional pode ser usada.

O HBsAg é preferivelmente de HBV subtipo adw2.

Em adição à seqüência "S" , um antígeno de superfíciepode incluir toda ou parte de uma pré-seqüência S, comotoda ou parte de uma pré-seqüência Sl e/ou pré-seqüência S2.

Outros antígenos de superfície viral que podem serusados com a invenção serão geralmente glicoproteínas deenvelope de um vírus envelopado. Antígenos de superfícieviral para uso com a invenção podem incluir, mas não sãolimitados a:

- uma proteína de retroviridae. Retroviridae incluemlentivírus e espumavírus. Vírus de interesse incluem HTLV-I, HTLV-II, vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírusda imunodeficiência humana (HIV, incluindo HIV-I e HIV-2),vírus da imunodeficiência de símios (SIV), vírus espumosode chimpanzé e espumavírus humano.

- uma proteína de paramyxoviridae, como a proteína F.Paramyxoviridae incluem (a) Paramyxovirinae, que incluemParamixovírus, Rubulavírus e Morbillivírus e (b)Pneumovirinae, que incluem os Pneumovírus. Vírus deinteresse incluem vírus parainfluenza (PIV), paramixovírushumano, vírus da peste bovina (Rinderpest), vírus da pestedos pequenos Ruminantes, vírus do sarampo, vírus dacaxumba, vírus sincicial respiratório (RSV), Vírus Nipah,Vírus Hendra, Morbilivírus Eqüino (EMV), Lissavírus e vírusMenangle.- uma proteína de Filoviridae. Filoviridae inclui osvírus de Marburg e Ebola.

-uma glicoproteína spike de coronaviridae.

Coronaviridae incluem coronavírus e torovírus. Vírus deinteresse incluem o coronavírus humano (incluindo ocoronavírus da SARS), vírus da bronquite infecciosaaviária, vírus da peritonite infecciosa felina, vírus dahepatite de murídeo, vírus da diarréia epidêmica suína,vírus da encefalomielite de hemaglutinação suína, vírus dagastroenterite transmissível suína e vírus do Berne.

- uma proteína de rhabdoviridae, como a proteína G.Rhabdoviridae inclui os Rhabdovírus, Vesiculovírus,Lissavírus, Efemerovírus, Citorrabdovírus eNucleorrabdovírus. Vírus de interesse incluem vírus daestomatite vesicular, vírus da raiva, vírus mokola, vírusda febre efêmera bovina.

- uma proteína de togaviridae. Togaviridae inclui osAlfavírus e Rubivírus. Vírus de interesse incluem vírusSindbis, vírus da encefalite ocidental e oriental, vírus dafloresta de Semliki, vírus da rubéola, vírus Aura, vírusBabanki, vírus avis-A da floresta de Barmah, vírus bebaru,vírus Buggy Creek, vírus chikungunya, vírus dos Everglades,vírus de Fort Morgan, vírus getah, vírus de Highlands J,vírus Kyzylagach, vírus Mayaro, vírus Middelburg, vírusMucambo, vírus Ndumu, vírus Ockelbo, vírus o'nyong-nyong,Pixuna vírus, vírus Ross River, vírus Sagiyama, Una vírus,vírus da encefalite eqüina da Venezuela e vírus Whataroa.

uma glicoproteína de envelope ("E') de umflaviviridae. Flaviviridae inclui Flavivírus, Pestivírus eHepacivírus. Vírus de interesse incluem vírus da dengue,vírus da hepatite C, vírus da febre amarela, vírus daencefalite japonesa, vírus do oeste do nilo, vírus daencefalite de St. Louís, vírus da diarréia bovina e vírusda encefalite de origem em carrapato (TBE).

- uma proteína de bunyaviridae. Bunyaviridae inclui osBuniavírus, Nairovírus, Flebovírus, Hantavírus, eTospovírus. Vírus de interesse incluem buniavírus, vírusBunyamwera, vírus da encefalite da Califórnia, vírus de LaCross, vírus Hantaan, vírus Sin Nombre, vírus da febrehemorrágica da Criméia-Congo, vírus da febre SandflySicilian e vírus da febre de Rift valley.

- uma proteína de arenaviridae. Arenaviridae incluivírus da coriomeningite linfocítica, vírus ippy e lassavírus.

- uma proteína de hepadnaviridae (incluindo HBsAg).

Hepadnaviridae inclui ortohepadnavírus e avihepadnavírus.Bem como vírus da hepatite B humana, essa família viralinclui vírus da hepatite B de esquilo da terra, vírus dahepatite B da marmota, vírus da hepatite B de woollymonkey, vírus da hepatite B esquilo do ártico, vírus dahepatite B de pato, vírus da hepatite B de garça, e vírusda hepatite B de ganso Ross.

- uma proteína de herpesviridae. Herpesviridae incluios Simplexvírus, Varicellovírus, Roseolovírus,Citomegalovírus, Muromegalovírus, Linfocriptovírus eRadinovírus. Vírus de interesse incluem o herpes vírushumano, incluindo Vírus do Herpes Simples (HSV), vírusVaricela-zoster (VZV), vírus de Epstein-Barr (EBV),Citomegalovírus (CMV), Herpesvírus Humano 6 (HHV6),Herpesvírus Humano 7 (HHV7), e Herpesvírus Humano 8 (HHV8)etc. Antlgenos adequados podem ser selecionados deglicoproteínas gB, gC, gD e gH (por exemplo, em HSV) . HSVgD2 é particularmente preferido.

- uma proteína de Orthomyxoviridae. Orthomyxoviridaeinclui vírus influenza e vírus thogoto. Antígenos de vírusinfluenza são preferidos (vírus influenza A, B ou C) ,incluindo hemaglutinina de antígenos de superfície (HA)e/ou neuraminidase (NA).

Esses antígenos de superfície viral são tipicamentepurificados pelo uso de tensoativos, e assim o componenteantígeno pode incluir um tensoativo, particularmente depresente em uma forma particulada que inclui lipídeos.

A invenção é também útil com antígenos particuladosbaseados em proteínas híbridas ou de fusão que compreendemum antígeno de superfície viral e um antígeno heterólogo.Por exemplo, sabe-se como fundir a seqüência de HBsAg aosantígenos heterólogos para explorar a capacidade do HBsAgde montar partículas.

Por exemplo, a referência 63 relata fusões de HIV-I gp120 a HBsAg para gerar uma proteína que se montouespontaneamente em partículas que se assemelham apartículas nativas de HBsAg em tamanho e densidade,consistentes com uma composição lipídica de cerca de 25% eum conteúdo de gpl20 de cerca de 100 por partícula. 0 gpl20foi capaz de se dobrar em sua conformação nativa na fusão ereteve sua atividade biológica. De modo similar, epitoposde HIV gp41 foram melhorados ao fazer fusões internas comHBsAg, e a proteína de fusão auto-montada em partículas delipoproteína de 22 nm [64].

Essa abordagem também foi usada para vacinas demalária. A Referência 65 relata que epitopos de até 61aa doantígeno de malária gpl90 foram inseridos na seqüência deHBsAg, e que as partículas híbridas expressas podemelicitar uma resposta imune anti-gpl90 em animais. AReferência 66 relata uma proteína que tem 16 repetições deuma seqüência de 4-mer da proteína de circunsporozoítaexpresso como proteína de fusão com HBsAg. A Referência 67relata a produção em levedura de partículas semelhantes avírus compostas de Pfsl6 fundido a HBsAg. A Referência 68revela um antígeno híbrido em que a proteína decircunsporozoíta é fundida a HBsAg. A Referência 69 revelauma fusão da região C-terminal da proteína 1 de superfíciede merozoíto de P. vivax, que formou partículasimunogênicas de 20-45 nm de tamanho. O uso de HBsAg paraapresentação de antígenos de malária em forma particuladade auto-montagem é portanto, bem conhecido na técnica.

Portanto, a invenção pode ser usada com antígenoshíbridos que compreendem um antígeno de superfície viral eum antígeno heterólogo. 0 antígeno heterólogo pode serinserido na seqüência de antígeno de superfície viral, oupode ser fundido ao N-terminal ou C-terminal da seqüênciade antígeno de superfície viral. Se o antígeno desuperfície viral nativo pode montar em partículas (porexemplo, HBsAg) então a inserção ou fusão não evitará essamontagem.

Nessas proteínas híbridas, o antígeno heterólogo podeser de uma bactéria, de um fungo, de um parasita, de umvírus (mas, por definição, o antígeno heterólogo não éHBsAg) etc. É possível incluir um antígeno heterólogocompleto na proteína híbrida, mas é mais usual incluir umfragmento antigênico do antígeno.

Particularmente quando o antígeno de superfície viralé HBsAg, o antígeno heterólogo pode ser de HIV, Plasmodiumfalciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariaeouPlasmodium ovale. Antígenos de HIV adequados para fazerhíbridos de HBsAg incluem glicoproteína de envelope gpl2 0ou fragmentos antigênicos desses [63]. Antígenos adequadosde P.falciparum para fazer híbridos de HBsAg podem serbaseados em uma subunidade do antígeno de superfície decircunsporozoíta ("CSP"), por exemplo, eles podem incluirentre 3 e 20 repetições de seu motivo NANP (Id de Seq. N°:2), e/ou eles podem incluir a região C-terminal de CSP (mastipicamente não incluindo os 12 aminoácidos finais do C-terminal). Por exemplo, a invenção pode usar o antígenoconhecido como "RTS", que contém uma grande porção do C-terminal de CSP de NF54 ou 7G8 isolado de P. falciparum(aminoácidos 210 a 398, que incluem 19 repetições NANP e aregião de epitopo de célula T nos aminoácidos 367 a 390) ,fundido ao N-terminal de HBsAg em quatro aminoácidos daporção preS2 de HBsAg. Quando expresso em levedura, RTSforma partículas que incluem lipídeos (primariamentefosfolipídeo) em adição a proteína. A seqüência de RTS podeassim conter: (i) um resíduo de metionina N-terminal; (ii)Met-Ala-Pro; (iii) 189 aminoácidos que correspondem aosaminoácidos 210-398 de proteína CS de P. falciparum 7G8 ouaos aminoácidos 207-395 de proteína CS de P.falciparumNF54; (iv) Arg ou Gly; (v) Pro-Val-Thr-Asn de proteína Pré-S2 de hepatite B; e (vi) HBsAg. do isolado 7G8, RTS decomprimento total tem a seqüência dada como Id. de Seq. N0:1 na referência 70 (veja também a Figura 5 da referência71) :

MMAPD PNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENNANNAVKNNNNEEPSDKHIEQYLKKIKNSISTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYENDIEKKICKMEKCSSVFNWNSRPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI (Id. de Seq. N°: 1)

A proteína híbrida pode ser expressa em levedura,usando uma seqüência que codifica Id. de Seq. N0:1. Épreferível co-expressar a proteína híbrida em levedura comHBsAg normal. Essa abordagem foi previamente usada com RTS,e o produto de co-expressão é referido como "RTS,S". umaproporção de RTS: S de cerca de 1:4 é útil. A expressão emlevedura S.cerevisiae é preferida, usando um plasmídeo quetem uma seqüência que codifica a proteína híbrida, e queinclui: (1) um promotor acima de um gene de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, para controle da expressão daseqüência codificadora; e (2) um terminador de transcriçãoARG3 abaixo da seqüência codificadora. Os plasmídeos tambémincluirão tipicamente: (3) um marcador de seleção de LEU2 ;(4) uma seqüência de plasmídeo de 2fj.; e (5) uma origem dereplicação funcional em Escherichia coli.

RTS,S pode ser combinado com outros antígenos demalária, como proteína anônima relacionada a trombospondina(TRAP). Um adjuvante graxo preferido para uso com RTS,Sinclui uma emulsão óleo em água, 3d-MPL e uma saponina QS-21.

Proporção de adjuvante graxo e tensoativoNo segundo aspecto da invenção, a proporção de peso nacomposição do adjuvante graxo para o tensoativo do antigenoé menor que 1.000:1.

Para um adjuvante MF5 9, a proporção de peso é baseadana quantidade de esqualeno. Para uma composição que contém0,1 ]ag/ml de tensoativo em um componente antigeno, aconcentração de esqualeno será menor que 100 jag/ml. Parauma composição que contém 1 pg/ml de tensoativo em umcomponente antigeno, a concentração de esqualeno será menorque 1 mg/ml. Para uma composição que contém 10 pg/ml detensoativo em um componente antigeno, a concentração deesqualeno será menor que 10 mg/ml, enquanto a concentraçãode esqualeno em uma composição tipica de adjuvante MF5 9seria de 43 mg/ml (ou seja, 4.300:1).

Para um adjuvante 3D-MPL, a proporção de peso ébaseada na quantidade de total de 3D-MPL, ou seja,incluindo todas as formas diferentes de acil que podemestar presentes. Para uma composição que contém 0,1 pg/mlde tensoativo em um componente antigeno, a concentraçãototal de 3D-MPL será menor que 100 pg/ml. Para umacomposição que contém 1 pg/ml de tensoativo em umcomponente antigeno, a concentração total de 3D-MPL serámenor que 1 mg/ml.

A proporção de 1.000:1 é uma máxima. Para tambémreduzir o potencial para interferência entre óleo em umadjuvante e tensoativo em um antigeno, a proporção pode serreduzida. Assim a proporção pode ser <500:1, <400:1,<300:1, <200:1, <100:1, <50:1, ou ainda <25:1. Em umaproporção <100:1, a composição que contém 10 yg/ml detensoativo em um componente antigeno deve ter um conteúdode óleo (por exemplo conteúdo de esqualeno ou 3D-MPL) de 1mg/ml. Em uma proporção <25:1, a composição que contém 10pg/ml de tensoativo em um componente antígeno deve ter umconteúdo de óleo (por exemplo conteúdo de esqualeno ou 3D- MPL) <250 pg/ml; inversamente, a composição que compreendelOOpg/ml de 3D-MPL deve ter não menos que 4 pg/ml detensoativo como parte do antígeno.

A proporção é preferivelmente maior que 1.5:1 porexemplo >2:1, >2,5:1, >3:1, >4:1, >5:1 ou mais.

Para 3D-MPL, uma proporção entre 2,5:1 e 25:1 épreferida, mais preferivelmente entre 2,5:1 e 10:1, e aindamais preferivelmente entre 2,5:1 e 5:1. Assim, a composiçãoque contém lOpg/ml de tensoativo em um componente antígenodeve ter um conteúdo de 3D-MPL entre 25 pg/ml e 250 pg/ml,preferivelmente entre 25 pg/ml e 100 pg/ml, e ainda maispreferivelmente entre 25 pg/ml e 50 pg/ml; inversamente, acomposição que compreende 100 pg/ml de 3D-MPL deve incluirum antígeno que tem um conteúdo de tensoativo entre 4 pg/mle 40 pg/ml, preferivelmente entre 10 pg/ml e 40 pg/ml, eainda mais preferivelmente entre 20 pg/ml e 40 pg/ml.

A composição imunogênica

Assim como possuindo antígeno e um adjuvante graxo (e,no segundo aspecto, um baixo nível de tensoativo), ascomposições da invenção podem compreender transportadores,adjuvantes, excipientes, tampões etc., como descrito emmaiores detalhes abaixo. Esses componentes não antigênicospodem ter várias fontes. Por exemplo, eles podem estarpresentes em um dos materiais de antígeno ou adjuvante queserão usados durante a fabricação ou podem ser adicionadosseparadamente daqueles componentes.Composições preferidas da invenção incluem um ou maistransportadores e/ou excipientes farmacêuticos.

Para controlar a tonicidade, é preferível incluir umsal fisiológico, como um sal de sódio. Cloreto de sódio(NaCl) é preferido, que pode estar presente entre 1 e 20mg/ml.

As composições terão geralmente uma osmolalidade entre200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre 240-360mOsm/kg, e estarão mais preferivelmente na faixa de 280-320mOsm/kg. A osmolalidade foi previamente relatada como nãotendo um impacto sobre a dor causada pela vacinação [72] ,mas manter a osmolalidade nessa faixa é, todavia,preferível.

As composições da invenção podem incluir um ou maistampões. Tampões típicos incluem: um tampão de fosfato;

um tampão Tris; um tampão de borato; um tampão desuccinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato.

Tampões serão tipicamente incluídos na faixa de 5-50 mM, epreferivelmente na faixa de 5-20 mM.

O pH da composição da invenção será geralmente entre5,0 e 7,5, e mais tipicamente entre 5,0 e 6,0 paraestabilidade ótima,ou entre 6,0 e 7,0. 0 processo dainvenção pode assim incluir uma etapa de ajuste do pH davacina antes da embalagem dela em recipientes de dosagem. Avacina que contém toxóides diftéricos e tetânicospref erivelmente tem um pH >6, para evitar o risco dereversão de toxicidade nos toxóides (particularmente notoxóide diftérico), e assim a vacina que contém toxóides eantígenos HBsAg têm preferivelmente um pH entre 6,0 e 7,0.para outras vacinas, incluindo vacinas monovalentes deHBsAg, um pH <6 pode ser aceitável.

As composições da invenção são preferivelmenteestéreis.

As composições da invenção são preferivelmente nãopirogênicas, por exemplo, contendo <1 EU (unidade deendotoxina, uma medida padrão) por dose, e preferivelmente<0,1 EU por dose.

As composições da invenção são preferivelmente livresde glúten.

Se HBsAg absorvido é usado, o produto da vacina finalpode ser uma suspensão com uma aparência turva. Essaaparência significa que contaminação microbiana não éfacilmente visível, e assim a vacina preferivelmente contémum agente antimicrobiano. Isso é particularmente importantequando a vacina é embalada em recipientes de multidose.

Conservantes preferidos para inclusão são 2 -fenoxietanole/ou timerosal. É recomendado, no entanto, não usarconservantes mercuriais durante o processo da invenção,embora timerosal seja encontrado em várias vacinas de HBVexistentes. Para segurança, no entanto, é preferível que acomposição final contenha menos que cerca de 25 ng/ml demercúrio. Mais preferivelmente, o produto da vacina finalmão deve conter timerosal detectável. Isso será geralmenteatingido por remoção do conservante mercurial de umapreparação de antígeno antes de sua adição no processo dainvenção ou ao evitar o uso de timerosal durante apreparação dos componentes usados para fazer a composição.HBsAg pode ser submetido a diálise (por exemplo, comocisteína) para remover quaisquer conservantes mercuriaiscomo timerosal que pode ter sido usado durante a preparaçãodo HBsAg [73,74].

Durante a fabricação, a diluição dos componentes paragerar concentrações finais desejadas será comumenterealizada com WFI (água para injeção).

A concentração de qualquer fosfato de alumínio nacomposição da invenção, expressa em termos de Al3+, épreferivelmente menos que 5 mg/ml por exemplo <4 mg/ml, <3mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml etc.

A concentração de HBsAg na composição da invenção épreferivelmente menos que 100 |ag/ml, por exemplo, <90(ig/ml, <80 ng/ml, <70 (ag/ml, <65 ng/ml, <60 ^ig/ml, <55jag/ml, <5 0 jag/ml, <4 5 j^g/ml, <4 0 (ag/ml etc. A concentraçãode cerca de 40 ng/ml ou cerca de 20 jag/ml é típica.

As composições da invenção são preferivelmenteadministradas a pacientes em doses de 0,5 ml. Referências adoses de 0,5 ml doses devem incluir variância normal, porexemplo, 0,5 ml ± 0,05 ml.

A invenção pode fornecer material volumoso que éadequado para embalagem em doses individuais, que ser entãodistribuído para administração a pacientes. Asconcentrações acima mencionadas são tipicamenteconcentrações em dose embalada final, e assim,concentrações em vacina de volume podem ser maiores (porexemplo, para serem reduzidas às concentrações finais pordiluição).

As composições da invenção estarão geralmente em formaaquosa.

Embalagem das composições da invenção

Depois da combinação do antígeno e adjuvante, osprocessos da invenção podem compreender uma etapa deextração e embalagem de uma amostra de 0,5 ml da mistura emum recipiente. Para situações de multidose, quantidades demúltiplas doses serão extraídas e embaladas juntas em umúnico recipiente. Como acima mencionado, em um arranjoalternativo o antígeno e adjuvante são embaladosseparadamente, para mistura extemporânea no momento do uso.

Os processos da invenção podem compreender a etapaadicional de embalagem da vacina em recipientes para uso.Recipientes adequados incluem frascos e seringasdescartáveis (preferivelmente estéreis).

Quando a composição da invenção é embalada em frascos,esses são preferivelmente feitos de vidro ou de um materialplástico. 0 frasco é preferivelmente esterilizado antes dacomposição ser adicionada a ele. Para evitar problemas compacientes sensíveis ao látex, os frascos sãopreferivelmente selados com uma tampa livre de látex. 0frasco pode incluir uma única dose de vacina, ou ele podeincluir mais de uma dose (um frasco de 'multidose'), porexemplo, 10 doses. Quando do uso de um frasco de multidose,cada dose deve ser retirada com uma agulha e seringaestéreis e sob condições assépticas estritas, tomandocuidado para evitar a contaminação do conteúdo do frasco.Frascos preferidos são feitos de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um fecho deLuer) adaptada de modo que uma seringa pré-preenchida possaser inserida na tampa, o conteúdo da seringa pode serexpelido no frasco, e o conteúdo do frasco pode serremovido de volta para a seringa. Após a remoção da seringado frasco, uma agulha pode ser então anexada e a composiçãopode ser administrada a um paciente. A tampa épreferivelmente localizada dentro de uma cobertura ou selo,de modo que a cobertura ou selo tenha que ser removidoantes da tampa poder ser acessada.

Quando a composição é embalada em uma seringa, o que épreferível, a seringa não terá normalmente uma agulhaanexada a ela, embora uma agulha separada possa ser supridacom a seringa para montagem e uso. Agulhas de segurança sãopreferidas. Agulhas de 1 polegada (2,54 cm) calibre 23, 1polegada calibre 25 e 5/8 polegadas (1,3 cm) calibre 25 sãotípicas. As seringas pode ser fornecidas com rótulosdestacáveis em que o número do lote e data de validade doconteúdo podem ser impressos, para facilitar a estocagem. 0embolo em uma seringa preferivelmente tem um tampo paraevitar que o êmbolo seja acidentalmente removido durante aaspiração. Um tampo de êmbolo de borracha de butil épreferido. As seringas podem ter uma tampa de borracha delátex e/ou tampo. Seringas descartáveis contêm uma únicadose da vacina. A seringa terá geralmente uma tampa deponta para selar a ponta antes da anexação de uma agulha, ea tampa de ponta é preferivelmente feita de borracha debutil. Se a seringa e agulha são embaladas separadamente,então a agulha é preferivelmente ajustada com um protetorde borracha de butil. Borracha de butil cinza é preferida.

As seringas preferidas são aquelas comercializadas sob onome comercial "Tip-Lok"™.

Quando um recipiente de vidro (por exemplo uma seringaou a frasco) é usado, então é preferível usar um recipientefeito de um vidro de borossilicato em vez de um vidro decal de soda.

Depois da composição ser embalada em um recipiente, orecipiente pode ser então colocado era uma caixa paradistribuição, por exemplo, dentro de uma caixa decartolina, e a caixa será rotulada com detalhes da vacina,por exemplo, seu nome comercial, uma lista dos antígenos navacina (por exemplo "hepatite B recombinante" etc.), orecipiente de apresentação (por exemplo "Seringas Tip-LokDescartáveis pré-preenchidas" ou "frascos de dose única de10 x 0,5 ml"), sua dose (por exemplo "cada um contendo umadose de 0,5ml"), recomendações (por exemplo "para usoadulto apenas" ou "para uso Pediátrico apenas"), uma datade validade, uma indicação (por exemplo "imunização ativacontra infecção por vírus da hepatite B (HBV) causada portodos os subtipos conhecidos para pacientes cominsuficiência renal (incluindo pacientes de pré-hemodiálisee hemodiálise) , de idade de 15 anos adiante" etc.), umnúmero de patente etc. Cada caixa deve conter mais de umavacina embalada, por exemplo, cinco ou dez vacinasembaladas (particularmente para frascos). Se a vacina écontida em uma seringa então a caixa deve mostrar umretrato da seringa.

A vacina pode ser distribuída junto (por exemplo, namesma caixa) com uma bula que contém detalhes da vacina,por exemplo, instruções para administração, detalhes doantígenos na vacina etc. as instruções também podem conteradvertências, por exemplo, para manter uma solução deadrenalina pronta disponível em caso de reação anafiláticaapós a vacinação etc.

A vacina embalada é preferivelmente estocada entre 20Ce 8°C. Ela deve não ser congelada.

Métodos de tratamento e Administração da vacinaAs composições da invenção são adequadas paraadministração a pacientes humanos, e a invenção fornece ummétodo de despertar uma resposta imune em um paciente, quecompreende a etapa de administração da composição dainvenção ao paciente.

A invenção também fornece a composição da invençãopara uso em medicina.

A invenção também fornece o uso de (i) um antigenopurificado substancialmente na ausência de tensoativo e(ii) um adjuvante graxo, na fabricação de um medicamentopara administração ao paciente.

A invenção também fornece o uso de (i) um componenteantigeno que inclui um tensoativo e (ii) um adjuvantegraxo, na fabricação de um medicamento para administraçãoao paciente, em que a proporção de peso do adjuvantegraxo em (ii) para tensoativo em (i) é menor que 1.000:1.

As composições imunogênicas da invenção sãopreferivelmente vacinas, por exemplo, para uso na prevençãoe/ou tratamento de infecção por vírus da hepatite B.

Pacientes que receberam composições da invençãopreferivelmente têm um título sérico anti-HBsAg GM>500mIU/ml, medido 6 semanas depois da primeira imunização.Mais preferivelmente, o título é >500mIU/ml, quando medidodepois de 12 meses.

As composições são particularmente úteis para proteçãocontra e/ou tratamento de infecções por vírus da hepatite Bem pacientes para os quais as vacinas de adjuvanteexistentes (como o produto ENGERIX B™) são ineficazes.

Subgrupos de pacientes para os quais as composições são particularmente adequadas incluem: pacientesimunocomprometidos; pacientes em hemodiálise; pacientes empré-hemodiálise; pacientes com insuficiência renal;pacientes com falência renal; pacientes com falência renalprecoce antes de necessitarem hemodiálise; pacientes queesperam por transplante de figado, por exemplo, em listasde espera; pacientes com falência renal de estágio final;pacientes que receberam um transplante de órgão(particularmente um transplante de figado), por exemplo, noperíodo de 6 meses que precede a primeira dose da vacina dainvenção; pacientes que recebem (ou receberam, por exemplo,no período de 6 meses que precede a primeira dose da vacinada invenção) tratamento com imunoglobulina para hepatite B(HBIg) ; pacientes com um haplótipo HLA DQ2 [75] ; pacientescom um haplótipo HLA DR3 [75] ; pacientes com um haplótipoHLA DR7 [75] ; pacientes com o alelo de HLA DQB1*0202 [76] ;pacientes infectados com HIV; portadores crônicos de HBV;pacientes que receberam recentemente transfusão sangüínea;pacientes que receberam medicamentos imunossupressores ;pacientes que sofrem de AIDS; pacientes com ascite;pacientes com cirrose; pacientes com encefalopatia;pacientes que recebem terapia com interferon, e emparticular ifn-a; pacientes que fumam cigarros; pacientesque fumam charutos; pacientes com um índice de massacorporal >3 0 kg/m2; e pacientes que receberam uma vacina deHBsAg mas não foram soroconvertidos (por exemplo, eles têmum título sérico anti-HBsAg <10 mIU/ml após um esquema dedosagem padrão primário, como 3 doses de ENGERIX B™) .

Esses pacientes podem ter uma taxa de clearance decreatinina menor que 3 0 ml/min (a faixa saudável normalsendo -100-140 ml/min em homens e 90-130 ml/min emmulheres). Os pacientes têm preferivelmente pelo menos 15anos de idade, por exemplo, entre 15-40 anos, entre 15-60anos, entre 40-60 anos, ou mesmo acima de 60. Os pacientescom mais de 55 podem ser tratados a despeito de qualquerdoença subjacente.

As composições da invenção podem ser administradas porinjeção intramuscular, por exemplo, no deltóide.

Quando as composições da invenção incluem um adjuvantebaseado em alumínio, um depósito dos componentes podeocorrer durante a estocagem. A composição deve ser,portanto, agitada antes da administração a um paciente, acomposição agitada será uma suspensão branca.

Processos preferidos e vacinas da invenção

Um processo preferido para a preparação de umacomposição imunogênica compreende as etapas de combinaçãode (i) um componente HBsAg que inclui polisorbato 20 e (ii)um componente adjuvante que compreende 3D-MPL adsorvido aum fosfato de alumínio, para gerar uma composição em que aproporção de peso de 3D-MPL para polisorbato 20 é menor que1. 000:1.

Uma composição imunogênica preferida é uma em que: (a)a composição compreende HBsAg, polisorbato 20, 3D-MPL e umadjuvante de fosfato de alumínio; e (b) a proporção de pesodo 3D-1VIPL para polisorbato 20 é menor que 1.000:1. O 3D-MPLe o HBsAg são preferivelmente adsorvidos ao fosfato dealumínio. A concentração de HBsAg é de cerca de 4 0 ^g/ml. Aconcentração de 3D-MPL é cerca de 100 |ag/ml. A concentraçãode Al3+ é cerca de 1 mg/ml.

Uma outra composição preferida da invenção compreende(i) HBsAg, purificado de S.cerevisiae, e (ii) um adjuvanteque compreende uma mistura de fosfato de alumínio e 3D-MPL.A concentração de HBsAg é de cerca de 4 0 |ig/ml. Aconcentração de 3D-MPL é cerca de 100 |ig/ml. A concentraçãode Al3+ é cerca de 1 mg/ml. HBsAg inclui polisorbato 20, ea proporção de peso óleo:tensoativo (ou seja, a proporçãode peso de 3D-MPL:polisorbato 20) é entre 2,5:1 e 100:1 ouseja, o polisorbato 20 está presente em um nível entre 1ug/ml e 4 0 jag/ml (ou seja, entre 2,5 |ag e 100 jag depolisorbato 20 por 100 ^g de HBsAg). A proporção épreferivelmente entre 2,5:1 e 25:1 ou seja, o polisorbato20 está presente em um nível entre 4 fo.g/ml e 40 [xg/ml. O3D-MPL e o HBsAg são ambos adsorvidos ao fosfato dealumínio.

Geral

O termo "que compreende" engloba "que inclui" bem coo"que consiste", por exemplo, uma composição "quecompreende" X pode consistir exclusivamente em X ou podeincluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

A palavra "substancialmente" não exclui"completamente", por exemplo, uma composição que é"substancialmente livre" de Y pode ser completamente livrede Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" podeser omitida da definição da invenção.

O termo "cerca de" em relação a um valor numérico xsignifica, por exemplo, x ± 10%.

A menos que especificamente determinado, um processoque compreende uma etapa de mistura de dois ou maiscomponentes não requer qualquer ordem específica demistura. Assim, componentes podem ser misturados emqualquer ordem. Quando há três componentes então doiscomponentes podem ser combinados um com o outro e então acombinação pode ser combinada com o terceiro componenteetc. Como acima descrito, os componentes podem sermisturados durante a fabricação ou extemporaneamente nomomento do uso.

Quando um antígeno é descrito com sendo "adsorvido" aum adjuvante, é preferível que pelo menos 50% (em peso)daquele antígeno seja adsorvido, por exemplo, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mais. É preferível que HBsAgseja totalmente adsorvido, ou seja, nenhum seja detectávelno sobrenadante.

Quando materiais animais (e particularmente bovino)são usados na cultura de células, eles devem ser obtidos defontes que sejam livres de encefalopatias espongiformestransmissíveis (TSEs), e em particular livres deencefalopatia espongiforme bovina (BSE).

Borrachas de butil incluem borrachas de clorobutil ebromobutil.

Deve ser percebido que grupos ionizáveis podem existirna forma neutra mostrada nas fórmulas nessa, ou podemexistir em forma carregada, por exemplo, dependendo do pH.Portanto, um grupo fosfato pode ser mostrado como -P-O-(OH)2, essa fórmula é meramente representativa do grupofosfato neutro, e outras formas carregadas são englobadaspela invenção. De modo similar, anéis de açúcar podemexistir em forma aberta e fechada e, embora formas fechadassejam mostradas em fórmulas estruturais nessa, formasabertas são também englobadas pela invenção.

Modos para realizar a invenção

Três diferentes preparações de HBsAg foram estudadas:HBsAg expresso em células de S.cerevisiae,purificado com o uso de tensoativo não iônico.

- HBsAg expresso em células de levedura Hanensula,purificado com o uso de tensoativo não iônico.

- HBsAg expresso em células CHO, com seqüência preS2,purificado sem o uso de tensoativos.

Dois diferentes adjuvantes foram estudados:

- Hidróxido de alumínio (1 mg/ml)

- MF5 9 em tampão de citrato (13 mM)

Seis formulações foram preparadas, cada um com 20(gg/ml de HBsAg, 0,15M NaCl e 0,01% mertiolate:

<table>table see original document page 55</column></row><table>

MF59 foi relatado por melhorar a resposta de anticorpoem primatas a HBsAg recombinante [77]. As formulações AaDforam usadas para imunizar macacos african green. Grupos de6 macacos foram imunizados por via intramuscular no dia 0 edia 28. Sangue foi coletado no tempo 0 e então a cada 2semanas até a semana 8, e os títulos de anti-HBsAg (GMT)foram medidos por ELISA. Os títulos foram normalizados a1,0, que foi o valor do dia 14 em cada grupo, e osresultados normalizados foram como se segue:<table>table see original document page 56</column></row><table>

Observando os títulos do dia 42 e dia 56, esses dadosmostram que o adjuvante MF59 aumentou os títulos muito maismarcadamente que o adjuvante de alumínio para antígenoexpresso em CHO (aumento de 160 vezes vs. aumento de 20vezes no dia 42), mas a situação foi revertida para oantígeno expresso em Hanensula (aumento de 85 vezes vs.aumento de 110 vezes no dia 42).

Experimentos similares foram realizados em babuínos,com o uso das formulações B, EeF. Os valores de GMT forammedidos 14 dias após a primeira injeção e, em relação aovalor do grupo F, como se segue:

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Aqui, o uso de MF5 9 em vez do adjuvante de alumínioleva a uma resposta menor de GMT (comparar grupos EeF),enquanto um aumento deva ser esperado (grupo B e referência 77).

As respostas de anti-HBsAg 28 depois da primeirainjeção com o uso das formulações EeF foram tambémcomparadas em macacos rhesus, macacos african green ecamundongos C3H (NB: camundongos receberam 60% da dose deHBsAg). Bem como medindo os valores de GMT, o númerodaqueles que respondem foi também medido, ou seja, animaisque mostram um título >10 mIU/ml. Os resultados,normalizados ao grupo F, foram como se segue:_

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Em contraste a camundongos, portanto, o uso de MF5 9como o adjuvante em primatas resultou em uma diminuiçãosubstancial tanto em valores de GMT quanto nos níveis dosque respondem para o HBsAg expresso em S. cerevisiae.

Finalmente, o aumento em GMT que resulta de vacinaçãode reforço com as formulações EeF foi medido em macacosafrican green soro-positivos. Os títulos foram medidosantes da dose de reforço e então novamente 2 8 dias depois,e o aumento em títulos foi como se segue:

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Bem como dando um menor aumento em vezes que oadjuvante de hidróxido de alumínio, MF5 9 gerou um menorvalor de GMT 28 dias após a dose de reforço.

No geral, portanto, MF59 parece ser um pior adjuvanteque hidróxido de alumínio para HBsAg expresso em leveduraem primatas, mas um melhor adjuvante para HBsAg expresso emCHO. Esses resultados podem ser explicados por umainteração entre (a) tensoativo residual em HBsAg purificadode levedura e (b) excesso de óleo de esqualeno no adjuvantede MF59. Como um óleo, esqualeno é submetido à ação detensoativos em condições aquosas, e vice versa, e éproposto que o tensoativo no antígeno seja incompatível como óleo no adjuvante. Essa incompatibilidade pode sersolucionada com purificação do HBsAg sem o uso dedetergentes (por exemplo, como no material expresso emCHO),ou ao assegurar que o óleo não esteja presente em umtal excesso que ele interfira com o tensoativo no antígeno.

Em uma composição de HBsAg com adjuvante MF5 9, umvolume de MF5 9 é combinado com um volume de solução deantígeno. Em um volume de 100 ml, haverá assim, 5 0 ml deMF59 e 50 ml de HBsAg em solução. Esses 100 ml contêm 2,15g esqualeno do MF5 9 e , e uma concentração de HBsAg de 4 0jj.g/ml, eles contêm 2 mg de HBsAg. Em uma concentração depolisorbato 20 de 25 jag por 100 ^ig de HBsAg [35] , os 100 mlcontêm 0,5 mg de polisorbato 20. A proporçãoóleo:tensoativo em uma vacina típica de adjuvante MF59 éassim 4.300:1. Por redução do excesso de óleo para menosque 1.000:1, a interação entre óleo no adjuvante etensoativo no antígeno pode ser substancialmente reduzida,dessa forma reduzindo a interferência.

Deve ser compreendido que a invenção foi descritaapenas por via de exemplo e que podem ser feitasmodificações, embora permanecendo dentro do escopo eespírito da invenção.

REFERÊNCIAS (cujos conteúdos são aqui incorporados porreferência)

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<110><120>

<130>

<140><1M1>

<150><151>

<15Q><151>

<150 ><1S1>

<ltO>

<1?Q>

<210><211 ><212><213>

<HDO>Asn Ala1

NOVARTIS VACCINES AND MAGNOSTICS SRLCONTORNI Mario

Redução de interferência entre adjuvantes que contêm óleo eantígenos que contêm tensoativos

pomsTflUo

PCT/IB^OGb/mVYV02/08/2006

GB-OSlSeIOb -ti02/08/2005

GB-0522ScH •004/11/2005

6B-0S23123•124/11/2005

SeqWi n991 versão 1.02

1M

PRT

Plasmodium falciparum

Asn PrO

<210> 2 <211> 423 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <M00> 2 (let flet Ala Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn1 £ 10 15Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn

20

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn35

Asn Pro Asn Ala Asn Pro AsnSO 55

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asnb£ 70

2 S

Ala AsnMO

Asn Lys Asn Asn Gln

as

Asn ProAsn Asp

Lys Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser

Pro Asn Arg Asn Val100

Pro AsnAla Asn Pro AsnAla AsnGly Asn

Asn AsnAsp Lys

Ala AsnMS

Ala Asn5*0

30

Pro Asn AlaPro Asn Ala

Pro Asn75

Gly GlncIO

Pro Asn Ala

ao

Asp Glu105

Ala AsnGly HisAla AsnHis Ile Glu Gln Tyr

Asn Net ProIS

Asn Ala Val110115

Leu Lys Lys Ile130

Val Thr Cys Gly145

Asn Lys Pro Lys

Ile Cys Lys MetLfiQ

Arg Pro Val ThrIIS

Leu Leu Val LeuElO

Ile Pro Gln Ser225

Gly Ser Pro Val

His Ser Pro ThrS LQ

Cys Leu Arg Arg375

Ile Phe Leu Leu310

Pro Leu Ile Pro305

Cys Thr Thr Pro

Thr Lys Pro Thr

340

Trp Ala Phe Ala355

Trp Leu Ser Leu370

Pro Thr Val Trp335

Ser Leu Tyr Ser

Phe Cys Leu TrpMEQ

120

Lys Asn Ser Ile Ser Thr135

Asn Gly Ile Gln Val Arg150

Asp Glu Leu Asp Tyr GluIbS 170

Glu Lys Cys Ser Ser ValIAS

Asn Net Glu Asn Ile Thr500

Gln Ala Gly Phe Phe Leu

ais

Leu Asp Ser Trp Trp Thr230

Cys Leu Gly Gln245

Ser Cys Pro Pro

Phe Ile Ile Phe2ÔD

VaI Leu Leu AspScJS

Giy Ser Thr Thr31G

Ala Gln Gly Asn325

Asp Gly Asn Cys

Lys Tyr Leu Trp3b0

Leu Val Pro Phe375

Glu Trp

ma

Ile Lys155

Asn Asp

Phe Asn

Ser Gly

Leu Thr230

Ser Leu235

Asn SerESO

Gln SerPro GlyLeu Phe Ile Leu

Ile Cys3 ti 5

Tyr Gln

Thr Asn

Ser Met330

Thr Cys345

Glu TrpVal Gln

Leu Ser Ala Ile Trp Met310

Gly Met300

Thr Gly315

Phe ProIle ProAla Ser

Trp Phe

aao

Het Trp315

IHS

Ser Pro Cys Ser

Pro Gly Ser AlaIbO

Ile Glu Lys Lys175

Val Val Asn Ser

no

Phe Leu Gly Pro205

Arg Ile Leu Thr

Asn Phe Leu Gly240

Pro Thr Ser Asn255

Tyr Arg Trp Net270

Leu Leu Cys Leu2fl5

Leu Pro Val Cys

Pro Cys Lys Thr320

Ser Cys Cys Cys335

Ile Pro Ser Ser350

Val Arg Phe Ser3L 5

Val Gly Leu Ser

Tyr Trp Gly Pro400

Ile Val Ser Pro405

Val Tyr Ile

Phe Ile410

Pro Leu Leu Pro Ile Phe415

Claims

1. Processo para a preparação de uma composiçãoimunogênica caracterizado pelo fato de compreender asetapas de combinação de (i) um componente antígeno queinclui um tensoativo e (ii) um componente adjuvante graxo,para gerar uma composição em que a proporção de peso entreo adjuvante graxo e o tensoativo é menor que 1.000:1.

2. Composição imunogênica caracterizada pelo fato deque: (a) a composição compreende um componente antígeno eum componente adjuvante graxo; (b) o componente antígenoinclui um tensoativo; e (c) a proporção de peso entre oadjuvante graxo e o tensoativo é menor que 1.000:1.

3. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que oadjuvante graxo compreende um óleo metabolizável.

4. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o adjuvantegraxo compreende uma emulsão óleo em água submicrométricade esqualeno e polisorbato 80.

5. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que oadjuvante graxo compreende uma molécula que compreende umaporção de ácido graxo.

6. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o adjuvantegraxo é um monofosforil lipídeo A 3-desoxiacilado ("3D-MPL").

7. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o 3D-MPL éuma mistura de moléculas que variam em sua acilação.

8. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 6 ou reivindicação 7, caracterizado pelo fatode que o adjuvante graxo inclui: <formula>formula see original document page 65</formula>

9. Processo ou composicao, de acordo com qualqueruma das reivindicacaoes 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fatode que o 3D-MPL está na forma de partículas.

10. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de que aspartículas podem ser esterilizadas em filtro.

11. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelofato de que o 3D-MPL está em combinação com um sal dealumínio.

12. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sal dealumínio é um fosfato de alumínio.

13. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o 3D-MPL éadsorvido no sal de alumínio.

14. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou-13, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é um ésterde polioxietileno sorbitano.

15. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o éster épolisorbato 20.

16. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que aconcentração de tensoativo é de não mais que 50 pg/ml.

17. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que oantigeno é um antigeno de superfície viral.

18. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antigenoé um antigeno de superfície de hepatite B particulado("HBsAg'), purificado na presença de tensoativo.

19. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o HBsAgestá expresso em uma célula de levedura.

20. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a leveduraé Saccharornyces cerevisiae.

21. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 18, 19 ou 20, caracterizado pelofato de que o HBsAg é não glicosilado e/ou incluifosfatidilinositol.

22. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelofato de que o HBsAg é de subtipo adw2 do vírus da hepatite B.

23. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizadopelo fato de que o antígeno é uma proteína híbrida quecompreende um antígeno de superfície viral e um antígenoheterólogo.

24. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o antígenode superfície viral é HBsAg e o antígeno heterólogo é umantígeno de malária.

25. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a proteínahíbrida compreende HBsAg e um fragmento da proteína decircunsporozoíta de Plasmodium falciparum.

26. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a proteínahíbrida compreende uma porção C-terminal de uma proteína decircunsporozoíta de Plasmodium falciparum, quatro ou maisrepetições acopladas (tandem) da região imunodominante daproteína de circunsporozoíta e HBsAg.

27. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou-26, caracterizado pelo fato de que a proporção de pesoentre o adjuvante graxo e o tensoativo é menor que 500:1.

28. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26ou 27, caracterizado pelo fato de que a proporção de pesoentre o adjuvante graxo e o tensoativo é menor que 50:1.

29. Processo sou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,-27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o adjuvante graxoé um 3D-MPL e a proporção de peso entre o adjuvante graxo eo tensoativo é entre 2,5:1 e 25:1.

30. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,-27, 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a composiçãotem uma osmolalidade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg.

31. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,-27, 28, 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que acomposição inclui um tampão de fosfato.

32. Processo ou composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,-27, 28, 29, 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que acomposição tem um pH entre 6,0 e 7,0.

33. Uso de (i) um componente antígeno que inclui umtensoativo e (ii) um adjuvante graxo caracterizado pelofato de ser na fabricação de um medicamento paraadministração ao paciente, em que a proporção de peso entreo adjuvante graxo em (ii) e o tensoativo em (i) é menor que-1. 000 :1.

34. Processo para a preparação de uma composiçãoimunogênica caracterizado pelo fato de que compreende asetapas de combinação de (i) um componente HBsAg que incluipolisorbato 2 0 e (ii) um componente adjuvante quecompreende 3D-MPL adsorvido em um fosfato de alumínio, paragerar uma composição em que a proporção de peso entre 3D-MPL e polisorbato 20 é menor que 1.000:1.

35. Composição imunogênica caracterizada pelo fato deque: (a) a composição compreende HBsAg, polisorbato 20, 3D-MPL e um adjuvante de fosfato de alumínio; e (b) aproporção de peso entre 3D-MPL e polisorbato 2 0 é menor que-1.000:1.

36. Processo para a preparação de uma composiçãoimunogênica caracterizado pelo fato de que: (a) acomposição compreende um antígeno e um adjuvante graxo; e(b) o antígeno é substancialmente purificado na ausência detensoativo.