BRPI0616523A2 - método para aumentar a toleráncia de uma planta a um estresse abiótico, método para aumentar a biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, construção de ácido nucléico, célula de planta e polipeptìdeo isolado - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA AUMENTAR A TOLERáNCIA DE PLANTA A UM ESTRESSE ABIóTICO, MéTODO PARA AUMENTAR A BIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, CéLULA DE PLANTA E POLIPEPTìDEO ISOLADO. São fornecidas as sequências de polinucleotídeo e métodos para utilizar as mesmas de modo a aumentar a tolerância de uma planta aos estresses abiáticos e ou aumentar a biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta.

Description

"MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO, MÉTODO PARAAUMENTAR A BIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA,CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, CÉLULA DE PLANTA EPOLIPEPTíDEO ISOLADO"

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-seaos métodos para aumentar a tolerância ao estresse abióticoe/ou biomassa nas plantas e, mais especificamente, nasplantas que expressam os genes de tolerância ao estresseabiótico exógeno.

As condições do estresseabiótico (também denominado como "estresse ambiental"), taiscomo, salinidade, seca, enchente, temperatura subideal epoluição química tóxica, provocam dano substancial àsplantas agrícolas, A maioria das plantas desenvolveuestratégias para se protegerem contra essas condições.Entretanto, se a gravidade e duração das condições deestresse forem muito grandes, os efeitos no desenvolvimentoda planta, crescimento e rendimento da maioria das plantasde safra são profundos. Além do mais, a maioria das plantasde safra são muito suscetíveis ao estresse abiótico (ABS) e,assim, necessitam de condições ideais de crescimento pararendimentos comerciais de safra. A exposição contínua aoestresse provoca alterações principais no metabolismo daplanta, o que finalmente leva à morte da célula e,conseqüentemente, perdas de rendimento. Assim, ao invés depesquisa extensiva e a utilização de medidas sofisticadas eintensivas para a proteção de colheitas, as perdas devido àscondições de estresse abiótico permanecem em bilhões dedólares anualmente (1,2).

0 seguinte resume asimplicações das condições exemplares do estresse abiótico.

Problemas associados com aseca. Uma seca é um período de clima anormalmente seco quepersiste o tempo suficiente para produzir um desequilíbriohidrológico grave (por exemplo, dano à safra, deficiência deabastecimento de água, etc.). Enquanto a maior parte do-clima que sentimos é breve e efêmero, a seca é um fenômenomais gradual, lentamente estabelecendo-se em uma área efortalecendo sua compreensão com o tempo. Nos casos graves,a seca pode durar por muitos anos e pode ter efeitosdevastadores na agricultura e abastecimentos de água. Compopulação em desenvolvimento e deficiência crônica de águapotável disponível, a seca não é somente o problema númeroum relacionado ao clima na agricultura, ela também seclassifica como um dos principais desastres naturais detodos os tempos, provocando não somente o dano econômico,porém também perda de vidas humanas. Por exemplo, as perdasda seca dos Estados Unidos de 1988 excederam $40 bilhões,excedendo as perdas provocadas pelo Furação Andrew em 1992,pelas as enchentes do Rio Mississipi de 1993 e pelo oterremoto de São Francisco em 1989. Em algumas . áreas domundo/ os efeitos da seca podem ser muito mais graves. NoChifre da África, a seca de 1984-1985 precedeu a fome quematou 750.000 pessoas.Os problemas para as plantasprovocados por baixa disponibilidade de água incluem osestresses mecânicos provocados pela retirada de águacelular. A seca também faz com que as plantas tornem-se maissuscetíveis a diversos desastres (Simpson (1981). "0 Valordo Conhecimento Fisiológico do Estresse da Água nasPlantas", Em Estresse de Água nas Plantas, (Simpson, G. M.,ed.), Praeger, N.Y., pp. 235-265).

Além de muitas regiões deterra· do mundo que são muito áridas para a maioria, se nãotodas, as plantas de safra, o uso exagerado e utilizaçãoexagerada da água disponível é resultante em uma perdacrescente do terreno utilizado para agricultura, um processoque, no extremo, resulta em desertificação. 0 problema éainda composto pelo acúmulo crescente de sal nos solos,conforme acima descrito, o que adiciona à perda da águadisponível nos solos.

Problemas associados com altosníveis de sal. Um em cada cinco hectares de terreno irrigadoé danificado pelo sal, um fator histórico importante nodeclínio das sociedades agrárias antigas. Espera-se que essacondição somente piore, ainda reduzindo a disponibilidade deterreno arável e produção de safra, considerando que nenhumadas cinco safras alimentícias principais - trigo, milho,arroz, batata e soja - pode tolerar o sal em excesso.

Os efeitos prejudiciais do salnas plantas são conseqüências do déficit de água resultanteem estresse osmótico (semelhante ao estresse da seca) e osefeitos dos íons de sódio em excesso nos processosbioquímicos críticos. Assim como o frio e a seca, a salinaalta provoca déficit de água; a presença de alto sal tornadifícil para as raízes de planta extraírem a água de seuambiente (Buchanan et al. (2000) em Bioquímica e BiologiaMolecular das Plantas, Sociedade Norte-Americana deFisiologistas de Planta, Rockville, Md.). A salinidade dosolo é assim uma das variáveis mais importantes quedeterminam onde uma planta pode florescer. Em muitas partesdo mundo, as áreas de terreno relativamente grandes não sãocultiváveis devido à salinidade de solo naturalmente alta.Para compor o problema, a salinação dos solos que sãoutilizados para a produção agrícola é um problemasignificativo e crescente nas regiões que dependemexpressivamente na agricultura. 0 último é composto pelautilização excessiva, fertilização excessiva e deficiênciade água, tipicamente provocadas pela alteração climática epelas demandas da população em crescimento. A tolerância aosal é de importância específica no início do ciclo de vidada planta, considerando que a evaporação da superfície dosolo provoca o' movimento ascendente da água, e o salacumula-se na camada superior do solo em que as sementes sãocolocadas. Assim, a germinação normalmente ocorre em umaconcentração de sal' muito mais alta do que o nível médio desal em todo o perfil do solo.

Problemas associados com calorexcessivo. A germinação de muitas safras em muito sensível àtemperatura. Um gene que melhoraria a germinação emcondições de calor seria útil para as safras que sãoplantadas no final da temporada ou em climas quentes. Asmudas e as planta maduras que são expostas ao calorexcessivo podem sofrer choque de calor, o que pode surgir emdiversos órgãos, incluindo nas folhas e especificamente nafrüta, quando a transpiração é insuficiente para superar oestresse de calor. O calor também danifica as estruturascelulares, incluindo organelas e citoesqueleto, e prejudicaa função de membrana [Buchanan et al. (2000) em Bioquímica eBiologia Molecular das Plantas, Sociedade Norte-Americana deFisiologistas de Planta, Rockville, Md. 0 choque de calorpode produzir uma diminuição na síntese geral de proteína,acompanhada pela expressão das proteínas de choque de calor.

As proteínas de choque de calor atuam como acompanhantes eestão envolvidas no novo enovelamento de proteínasdesnaturadas pelo calor.

0 estresse de calorfreqüentemente acompanha as condições de baixadisponibilidade da água. 0 próprio calor é visto como umestresse de interação e adiciona aos efeitos prejudiciaisprovocados pelas condições de déficit da água. A demandaevaporativa exibe aumentos exponenciais próximos comaumentos nas temperaturas de dia e podem resultar em altastaxas de transpiração e baixos potenciais de água da planta[Hall et al. (2000) Fisiol. de Planta 123: 1449-1458]. 0dano de alta temperatura ao pólen quase nunca ocorre emconjunto com o estresse da seca, e raramente ocorre sobcondições com água suficiente. Dessa forma, a separação dosefeitos do calor e estresse da seca sobre a polinização édifícil. 0 estresse combinado pode alterar o metabolismo daplanta de modos novos; portanto, o entendimento da interaçãoentre os estresses diferentes pode ser importante para odesenvolvimento das estratégias de , modo a otimizar atolerância ao estresse através de manipulação genética.

Problemas associados comcondições de frio em excesso. 0 termo "sensibilidade aoresfriamento" foi utilizado para descrever muitos tipos dedano fisiológico, produzido em baixas temperaturas, porémacima de congelamento. A maioria das safras de origenstropicais, tais como, soja, arroz, milho e algodão, éfacilmente danificada pelo resfriamento. 0 dano deresfriamento típico inclui definhamento, necrose, clorose ouvazamento de íons a partir das membranas de célula. Osmecanismos subjacentes da sensibilidade ao resfriamentoainda não são completamente entendidos, porém provavelmente,envolvem o nível de saturação da membrana e outrasdeficiências fisiológicas. Por exemplo, a fotoinibição dafotossíntese (interrupção da fotossíntese devido às altasintensidades de luz) freqüentemente ocorre sob as condiçõesatmosféricas limpas subseqüentes às noites frias de fim doverão/outono. Por exemplo, o resfriamento pode preceder asperdas de rendimento e baixa qualidade do produto através damaturação atrasada do milho. Outra conseqüência docrescimento deficiente é a proteção um tanto deficiente daterra dos campos de milho na primavera, freqüentementeresultando em erosão do solo, ocorrência crescente de ervasdaninhas e absorção reduzida de nutrientes. Uma absorção comatraso do nitrogênio de mineral também poderia preceder asperdas crescentes de nitrato no lençol aquático. Através dealgumas estimativas, o resfriamento contabiliza as perdasmonetárias nos Estados Unidos (EUA) somente através da secae inundação.

O déficit de água é umcomponente comum de muitos estresses de planta. 0 déficit deágua ocorre nas células da planta quando toda a taxa detranspiração da planta excede a absorção da água. Além daseca, outros estresses, tais como salinidade e baixatemperatura, produzem a desidratação celular (McCue e Hanson(1990) Biotecnologia de Tendências 8: 358-362).

A transdução do sinal deestresse de seca e sal consiste em vias de sinalização dehomeostase iônica e osmótica. O aspecto iônico do estressede sal é sinalizado através da via SOS em que um complexo dequinase de proteína SOS3-SOS2 r.esponsivo ao cálcio controlaa expressão e atividade dos transportadores de íon, taiscomo, SOSl. A via que regula a homeostase do íon em respostaao estresse de sal. foi revisada recentemente por Xiong e Zhu(2002) Ambiente da Célula de Planta 25: 131-139.

O componente osmótico doestresse de sal envolve as reações complexas de planta quese sobrepõem com as respostas de seca e/ou estresse de frio.

Os aspectos comuns da respostacie seca, frio e estresse de sal foram revisados recentementepor Xiong e Zhu (2002) supra). Tais incluem:(a) alterações transitórias nos níveis de cálciocitoplásmico muito cedo no evento de sinalização (Knight,

(2000) Int. Rev. Cytol . 195: 269-324; Sanders et al . (1999)Célula de Planta 11: 691-706);

(b)- transdução de sinal através de quinases de proteínadependente de cálcio e/ou ativadas por mitógeno (CDPKs; videXiong et al. , 2002) e fosfatase de proteína (Merlot et al.

(2001) J. de Planta 25: 295-303; Tahtiharju e Paiva (2001)J. de Planta 26: 461-470);

(c) aumentos nos níveis de ácido abscísico em resposta aoestresse iniciando um subsistema de respostas (Xiong et al.(2002) supra, e referências lá contidas);

(d) fosfatos de inositol como moléculas de sinal (pelo menospara um subsistema das alterações de transcrição responsivasao estresse (Xiong et al. (2001) Dev. de Genes 15: 1971-1984);

(e) ativação de fosfolipases que, por sua vez, geram umarranjo diverso de segundas moléculas mensageiras, algumasdas quais poderiam regular a atividade ' das quinasesresponsivas ao estresse (funções da fosfolipase D em uma viaindependente ABA, Frank et al. (2000) Célula da planta 12:111-12 4);

(f) indução de genes do tipo abundante de embriogênese(LEA) , incluindo os genes de COR/RD responsivos a CRT/'DRE(Xiong e Zhu (2002) supra);

(g) níveis crescentes de ■ antioxidantes e osmólitoscompatíveis, . tais como, prolina e açúcares solúveis(Hasegaw.a et al. (2000) Rev. An. de Fisiol. de Planta Mol.de Planta 51: 463-499); e [0028] (h) acúmulo cie espécies deoxigênio reativo, tais como, superóxido, peróxido dehidrogênio e radicais de hidroxila (Hasegawa. et al. (2000)supra).

A biossintese de ácidoabscisico é regulada pelo estresse osmótico em etapasmúltiplas. Tanto a sinalização de estresse osmóticoindependente de ABA quanto o independente primeiro modificaconstitutivamente os fatores de transcrição expressos,levando à expressão dos ativadores de transcrição deresposta prematura, que então ativa os genes causadores detolerância ao estresse ajusante.

Com base na semelhança demuitos aspectos das respostas de frio, seca e estresse desal, pode ser concluído que os genes que aumentam atolerância ao frio ou estresse de sal também podem melhorara proteção ao estresse da seca. De fato, isso já foidemonstrado para os fatores de transcrição (no caso deAtc-BF/DREBI) e para outros genes, tais como OsCDPK7 (Saijoet al. (2000). J. de Planta 23: 319-327), ou AVPl (um prótonde pirofosfatase vacuolar— bomba,. Gaxiola et al. (2001)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 114 4 4-11449).

O desenvolvimento das plantastolerantes ao estresse é uma estratégia que possui opotencial para resolver ou mediar polo monos a Iouns dossosproblemas. Entretanto, as estratégias adicionais de criacãode planta utilizadas para desenvolver novas linhas .deplantas que exibem tolerância a ABS são relativamenteineficientes, considerando que são monótonas, demoradas e deresultado imprevisto. Além do mais, os recursos limitados degermoplasma para tolerância ao estresse e incompatibilidadeem cruzamentos entre espécies de planta remotamenterelacionadas representam os problemas significativosdeparados na criação convencional. Adicionalmente,, osprocessos celulares que precedem a tolerância de ABS sãocomplexos por natureza e envolvem múltiplos mecanismos deadaptação celular e numerosas vias metabólicas (4-7).

Os esforços da· engenhariagenética, com o objetivo de conferir tolerância ao estresseabiótico às safras transgênicas, foram descritos na técnicaanterior. Os·estudos por Apse e Blumwald (Biotecnol. de OpinAtual 13:146-150, 2002), Quesada et al. (Fisiol. de Planta.130:951-963, 2002), Holmstrõm et al. (Natureza 379: 683-684,1996), Xu et al. (Fisiol. de Planta 110: 249-257, 1996),Pilon-Smits e Ebskamp (Fisiol. de Planta 107: 125-130, 1995)e Tarczynski et al. (Ciência 259: 508-510, 1993), todostentaram gerar as plantas tolerantes ao estresse.

Além disso, diversas pedidosde patente e patentes norte-americanas também descrevem ospolinucleotideos associados com a tolerância ao estresse esua utilização na geração de plantas tolerantes ao estresse.

As Patentes dos EUA N°s 5.296.462 e 5.356.816 descrevem atransformação de plantas com os polinucleotideos codificandoas proteínas envolvidas na adaptação a frio de Arabidopsisthaliana, para assim promover a tolerância ao frio nasplantas transformadas.A Pat. dos EUA N0 6.670.528transformação de plantas com os polinucleotídeosos polipeptídeos aglutinantes aos elementosao estresse, para assim- promover a tolerânciatransformadas ao estresse abiótico.

A Pat. dos EUA N0 6.720.477transformação de plantas com polinucleotideouma proteína relacionada ao estresse dedo sinal, capaz de aumentar a tolerância dasplantas transformadas ao estresse abiótico.

Os Pedidos dos EUA N°s deSérie 09/938842 e 10/342224 descrevem os genes relacionadosao estresse abiótico e sua utilização ao conferir às plantasa tolerância ao estresse abiótico.

0 Pedido dos EUA N0 de Série

10/231035 descreve a expressão excedente de uma sulfurase deco-fator de molibdênio nas plantas para assim aumentar suatolerância ao estresse abiótico.

Embora os estudos. acimadescritos tenham sido pelo menos parcialmente bem-sucedidosna geração de plantas tolerantes ao estresse, ainda existeuma necessidade para os genes tolerantes ao estresse quepodem ser utilizados para gerar as plantas tolerantes de umaampla faixa de condições de estresse abiótico.

Ao reduzir a presente invençãopara prática, os presentes inventores identificaram, atravésde estudos de bioinformática e laboratoriais, diversos novosgenes de tolerância ao estresse abiótico, que podem ser

descreve a codificando responsivos das plantas descreve a codificandotransduçãoutilizados para aumentar a tolerância ao estresse abióticoe/ou biomassa, vigor e rendimento nas plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto dapresente invenção, é fornecido um método para aumentar atolerância de uma planta a um estresse abiótico,compreendendo a expressão dentro da planta de umpolinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo com umaseqüência de aminoácido pelo menos 90 "· homóloga à SEQ IDN0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-56, 58-63, 66-119, 139-154 OU155, assim aumentando a tolerância da planta ao estresseabiótico.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas, descritas, oestresse abiótico é selecionado a partir do grupoconsistindo em salinidade, privação de água, baixatemperatura, alta temperatura, toxicidade de metal pesado,anaerobiose, deficiência de nutriente, excesso de nutriente,poluição atmosférica e irradiação UV.

De acordo com outro aspecto dapresente invenção, é fornecido um método para aumentar abiomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta,compreendendo a expressão dentro da planta de umpolinucleotídeo. exógeno codificando um polipeptídeocom uma seqüência de aminoácido pelo menos 90homóloga à SEQ IDN0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-56, 58-63, 66-1 1 9, 1 3 9- 154 ou 155, assim aumentando biomassa,vigor e/ou rendimento da planta.De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, aexpressão é efetuada por:

(a) transformação de uma célula da planta com opolinucleotídeo exógeno;

(b) geração de uma planta madura a partir da célula; e

(c) cultivação da planta madura sob condições adequadaspara expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da plantamadura.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, atransformação é efetuada pela introdução na célula da plantade uma construção de ácido nucléico incluindo opolinucleotídeo exógeno e pelo menos um promotor capaz deinstruir a transcrição do polinucleotídeo exógeno na célulada planta.

De acordo com ainda outroaspecto da presente invenção, é fornecido uma construção deácido nucléico, compreendendo uma seqüência de ácidonucléico pelo menos 90 % idêntica a uma seqüência denucleotídeo selecionada a partir do grupoconsistindo na SEQ ID N°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 156, 157,158, 159, 160-202, 204-209, 212-285 e um promotor capaz deinstruir a transcrição da seqüência de ácido nucléico em umacélula hospedeira.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, opromotor é um promotor constitutivo.De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, opromotor constitutivo é o promotor de CaMV 35S.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, opromotor constitutivo é o promotor de At6669.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, opromotor é um promotor induzível.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, opromotor induzível é um promotor induzível de estresseabiótico.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, a célulahospedeira é uma célula da planta.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, a célulada planta forma uma parte de uma célula da plantadicotiledônea.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, a célulada planta forma uma parte de uma célula da plantamonocotiledônea.

De acordo com ainda outroaspecto da presente invenção, é fornecido um polipeptídeoisolado, compreendendo uma seqüência de aminoácido pelomenos 90 % homóloga à seqüência de aminoácido codificada porum polinucleotideo selecionado a partir do grupo consistindoem SEQ ID N°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 156, 157, 158, 159, 160-202, 204-209, 212-285.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, aseqüência de aminoácido é pelo menos 90 % homóloga à SEQ IDN°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-56, 58-63, 66-121, 141-156 ou 157.

De acordo com um aspectoadicional da presente invenção, é fornecida uma célula daplanta compreendendo um polinucleotideo exógeno codificandoum polipeptideo com uma seqüência de aminoácido pelo menos90 Ή homóloga à.SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-56, 58-63,66-119, 139-154 ou 155, assim aumentando a tolerância daplanta ao estresse abiótico.

De acordo com característicasadicionais nas configurações preferidas descritas, .a célulada planta forma uma parte de uma planta.

A presente invenção trata deforma bem-sucedida das falhas das configurações atualmenteconhecidas ao fornecer os métodos para utilizar os novosgenes de tolerância ao estresse abiótico de modo a aumentara tolerância de plantas ao estresse abiótico e/ou biomassa.

Exceto se de outro mododefinido, todos os termos técnicos e científicos aquiutilizados possuem os mesmos significados conforme comumenteentendidos por aqueles com habilidade na técnica aos quaisesta invenção pertence. Embora os métodos e materiaissemelhantes ou equivalentes àqueles descritos no presentepossam ser utilizados na prática ou teste da presenteinvenção, os métodos e materiais adequados são descritosabaixo. No caso de conflito, a especificação de patente,incluindo as definições, controlará. Além disso, osmateriais, métodos e exemplos são somente ilustrativos e nãotêm a intenção de serem limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção é aqui descrita,somente através de exemplo, com referência aos desenhosanexos. Com referência específica agora aos desenhos emdetalhes, é enfatizado que os detalhes demonstrados são paraexemplo e para fins de discussão ilustrativa somente dasconfigurações preferidas da presente invenção, e sãoapresentados de modo a fornecer o que é acreditado comosendo a descrição mais útil e prontamente entendida dosprincípios e aspectos conceituais da invenção. Com relação aisso, nenhuma tentativa é feita para demonstrar os detalhesestruturais da. invenção em mais detalhes do que necessáriopara um entendimento fundamental da invenção, a descriçãotomada com os desenhos torna aparente para aqueles comhabilidade na técnica como as diversas formas da invençãopodem ser configuradas na prática.

a figura 1 uma ilustração esquemática da metodologiautilizada para medir o tamanho das plantas. Asfotos digitais são tiradas utilizando iluminaçãouniforme e um tripé ajustado em uma distânciaconstante. As fotos digitais obtidas sãoprocessadas utilizando um filtro "com baseverde" "que remove as "partes não verdes" dafoto, deixando somente a área de roseta daplanta para quantificação. Após a quantificaçãoda área de roseta, os resultados são exportadosa uma planilha eletrônica e analisadosutilizando software estatístico;

as figuras 2A-B são os resultados representativos de umgene (SEQ ID 156) que confere a tolerância aoestresse abiótico descoberta de acordo com osensinamentos da presente invenção;

a figura 2Ao crescimento das plantas sob condição nãoestressantes por 7-10 dias foi transferido àsaltas condições osmóticas e seu crescimento foiseguido por 12 dias utilizando formação deimagem digital. As imagens processadas das fotostiradas no Dia 0, Dia 5 e Dia 12 são mostradas.

Observe as plantas de controle no centrosuperior de cada prato e os eventos transgênicosindependentes envolvendo as plantas de controle; e

a figura 2Bé um gráfico que descreve o crescimento de áreada planta como uma função do tempo utilizando asimagens mostradas no painel A. Quatro dos cincoeventos mostrados são capazes de crescersignificativamente mais rápido do que as plantasde controle do tipo selvagem sob as mesmascondições. A análise estatística dos resultadosé mostrada abaixo na Tabela 5 linhas 1-5.DESCRIÇÃO DAS CONFIGURAÇÕES PREFERIDAS

A presente invenção é demétodos para aumentar a tolerância de plantas ao estresseabiótico e/ou biomassa ao utilizar os novos genes detolerância ao estresse abiótico e de plantas' que exibem atolerância aumentada às condições de, estresse e/oucapacidade aumentada para acumular a biomassa.

Os princípios e operação dapresente invenção podem ser mais bem entendidos comreferência aos desenhos e descrições anexas.

Antes de explicar pelo menosuma configuração da invenção em detalhes, deve ser entendidoque a invenção não é limitada em sua aplicação aos detalhesde construção e disposição dos componentes, estabelecidos naseguinte descrição ou ilustrados nos desenhos. A invenção écapaz de outras configurações ou de ser praticada ourealizada em diversos modos. Da mesma forma, deve serentendido que a fraseologia e terminologia aqui utilizadassão para fins de descrição e não devem ser consideradas comolimitantes.

Ao reduzir a presente invençãopara prática, os presentes inventores, ao utilizar astécnicas de bioinformática, identificaram as seqüências depolinucleotídeo que codificam as supostas proteínas detolerância aò estresse abiótico (ABST) (Exemplo 1) . Asseqüências selecionadas foram isoladas (Exemplo 2), clonadasem vetores de expressão (Exemplo 3-4) e introduzidas nasplantas Arabidopsis thaliana (Exemplo 5-6) . Essas plantasforam cultivadas sob condições de estresse de salinidade, ousob condições normais, e verificadas para biomassa aumentadaconforme comparado com as plantas de controle semelhantesque não transportam os genes de ABST exógenos. Conforme éevidente a partir dos resultados mostrados no Exemplo 8, asseqüências de ácido nucléico selecionadas de acordo com osensinamentos da presente invenção foram mostradas paramelhorar a tolerância de plantas transgênicas látransfectadas ao estresse abiótico conforme comparado com asplantas de controle.

Assim, de acordo com umaspecto da presente invenção, é fornecido um método paraaumentar a tolerância de uma planta a um estresse abióticoe/ou biomassa da planta. O método inclui a expressão dentroda de um polinucleotideo exógeno codificando um polipeptideocom uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % homóloga àSEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-56, 58-63, 66-119, 139-154ou 155.

De acordo com uma configuraçãopreferida desse aspecto da presente invenção, opolinucleotídeo isolado é conforme estabelecido na SEQ IDN0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 156, 157, 158, 159, 160-202, 204-209,212-285.

Alternativamente, opolinucleotídeo exógeno da presente invenção codifica umpolipeptideo- com uma seqüência de aminoácido conforme aindadescrito abaixo, pelo menos cerca de 70 pelo menos cercade 75 n, pelo menos cerca de 8.0 %, pelo menos cerca de 81pelo· menos cerca de 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelomenos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menoscerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %:,pelo menos cerca de 91 .%, pelo menos cerca de 92 %, pelomenos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menoscerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 a,pelo menos cerca de 99 %, ou mais , digamos, 100 % homóloga a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupoconsistindo na SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-56, 58-63,66-119, 139-154 ou 155.

A frase "estresse abiótico"aqui utilizada refere-se a qualquer efeito adverso nometabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de umaplanta. De forma correspondente, o estresse abiótico podeser induzido pelas condições de crescimentos ambientaissubideais, tais como, por exemplo, salinidade, privação deágua, inundação, resfriamento, baixa ou alta temperatura,toxicidade de metal pesado, anaerobiose, deficiência denutriente, poluição atmosférica ou irradiação UV. Asimplicações do estresse abiótico são discutidas na seção deHistórico.

A frase "tolerância aoestresse abiótico" conforme aqui utilizada refere-se acapacidade de uma planta de resistir a um estresse abióticosem sofrer uma alteração substancial no metabolismo.,crescimento, produtividade e/ou viabilidade.Preferivelmente, as plantas por engenharia genética dapresente invenção exibem pelo menos cerca de mais 2", mais 5V mais 10 %, mais 20 mais 30 I1 mais 40 %, mais 50 %,mais 60 %, mais 70 %, mais 80 mais 90 v, ou tolerânciamesmo mais alta ao estresse abiótico do que as plantas nãotransgênicas.

Conforme aqui utilizado, otermo "polinucleotideo exógeno" refere-se a uma seqüência deácido nucléico que não naturalmente expresso dentro daplanta, porém que, quando introduzida na planta de uma formaestável ou transitória, produz pelo menos um produto depolipeptideo.

A homologia (p.ex., homologiade porcentagem) pode ser .determinada utilizando qualquersoftware de comparação de homologia, incluindo, por exemplo,o software BlastP do Centro Nacional de Informação deBiotecnologia (NCBI), tal como, através da utilização deparâmetros padrões .

A identidade (p.ex., homologiade porcentagem) pode ser determinada utilizando qualquersoftware de comparação de homologia, incluindo, por exemplo,o software BlastN do Centro Nacional de Informação deBiotecnologia (NCBI) tal como, através da utilização deparâmetros padrões.

0 polinucleotideo da presenteinvenção refere-se a uma única ou dupla seqüência de ácidonucléico de fita dupla que é isolada e fornecida na forma deuma seqüência de RNA, uma seqüência complementar depolinucleotídeo (cDNA), uma seqüência de polinucleotídeogenômico e/ou uma seqüência de polinucleotídeo composto(p.ex., uma combinação do acima).

Conforme aqui utilizada, afrase "seqüência de polinucleotídeo complementar" refere-sea uma seqüência, que resulta da transcrição reversa do RNAmensageiro utilizando uma transcriptase reversa ou qualqueroutra polimerase de DNA dependente de RNA. Tal seqüênciapode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitroutilizando uma Polimerase de DNA dependente de RNA.

Conforme aqui utilizado, afrase "seqüência de polinucleotídeo genômico" refere-se auma seqüência derivada (isolada) a partir de um cromossomo eassim representa uma porção contígua de um cromossomo.

Conforme aqui utilizado, afrase "seqüência de polinucleotídeo composto" refere-se auma seqüência, que é pelo menos parcialmente complementar epelo menos parcialmente genômica. Uma seqüência compostapode incluir algumas seqüências de éxons exigidas paracodificar o polipeptídeo da presente invenção, bem comoalgumas seqüências intrônicas interpondo-se entre elas. Asseqüências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindode outros genes, e tipicamente incluirão as seqüências desinal de splicing conservadas. Tais seqüências intrônicaspodem ainda incluir os elementos regulatórios da expressãoda atuação de eis.

As seqüências de ácido núcléicodos polipeptídeos da presente invenção poderão ser otimizadaspara expressão. Tais seqüências otimizadas são fornecidas emSEQ ID N0s: 156, 157, 158 e 159. Os exemplos de taismodificações de seqüência incluem, porém não são limitadosa, um teor de G/C alterado para aproximar-se mais daqueletipicamente encontrado nas espécies de planta de interesse,e a remoção de códons atipicamente·encontrada nas espéciesde planta comumente denominadas como otimização de códon.

A frase "otimização de códon"refere-se a seleção dos nucleotideos apropriados de DNA parautilização dentro de um gene estrutural ou seu fragmento quese aproxima da utilização do códon dentro da planta deinteresse. Portanto, um gene ou seqüência de ácido nucléicootimizado refere-se a um gene em que a seqüência denucleotídeo de um gene naturalmente ocorrente ou nativotenham sido modificado com a finalidade de utilizar oscódons preferidos estatisticamente ou favorecidosestatisticamente dentro da planta. A seqüência denucleotídeo tipicamente é examinada no nível de DNA e aregião de codificação otimizada para expressão nas espéciesde planta determinadas utilizando qualquer procedimentoadequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al.(1996, Relatórios de célula da planta 15:677-681). Nessemétodo, o desvio padrão da utilização do códon, uma mediçãoda influência de utilização do códon, podem ser calculadosao primeiro encontrar o desvio proporcional quadrado deutilização de cada códon do gene nativo relativo aquele dosgenes de planta altamente expressos, seguido por um cálculodo desvio quadrado médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = η= 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / Ν, em que Xn refere-se afreqüência de utilização do códon η nos genes de plantaaltamente expressos, em que Yn à freqüência de utilização docódon η no gene de interesse e N refere-se ao número totalde códons no gene de interesse. Uma tabela da utilização docódon a partir de genes altamente expressos das plantasdicotiledôneas é compilada utilizando os dados de Murray etal. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

Um método para otimizar aseqüência de ácido nucléico em conformidade com a utilizaçãopreferida do códon para o tipo de célula especifica daplanta é com base no uso direto, sem realização de quaisquercálculos estatísticos extras, das tabelas de otimização decódon, tais como aquelas fornecidas on-line no Banco deDados de Utilização do Códon através do banco de DNA NIAS(Instituto Nacional de Ciências Agro-biológicas) no Japão(http://www.kazusa.ou.jp/codon/). 0 Banco de Dados deUtilização do Códon contém as tabelas de utilização do códonpara um número de diferentes espécies, com cada tabela deutilização do códon tendo sido estatisticamente determinadacom base nos dados presentes em Genbank.

Ao utilizar as tabelas acimade modo a determinar os códons mais preferidos ou maisfavorecidos para cada aminoácido em uma espécie particular(por exemplo,. arroz), uma seqüência de nucleotideonaturalmente ocorrente codificando uma proteína de interessepode ser o códon otimizado para tais espécies de plantaespecíficas. Isso é efetuado ao substituir os códons quepossam ter uma . baixa incidência estatística no yenomaespecífica da espécie com os códons correspondentes, comrelação a um aminoácido, que são estatisticamente maisfavorecidos. Entretanto, um ou mais códons menos favorecidospodem ser selecionados para excluir os locais existentes derestrição, para criar novos em junções potencialmente úteis(extremidades 5' e 3' para adicional o peptídeo de sinal oucassetes de terminação, locais internos que poderiam serutilizados para cortar e unir os segmentos juntos paraproduzir uma seqüência correta e comprimento total), ou paraeliminar as seqüências de nucleotídeo que podemnegativamente afetar a estabilidade ou expressão do mRNA.

A seqüência de codificação donucleotídeo naturalmente ocorrente também pode, antes dequalquer modificação, conter um número de códons quecorrespondem a um códon estatisticamente favorecido em umaespécie de planta especifica. Portanto, a otimização decódon da seqüência de nucleotídeo nativo pode compreender adeterminação de quais códons, dentro da seqüência denucleotídeo nativa, não são estatisticamente favorecidos comrelação a uma planta específica, e modificação desses códonsem conformidade com uma tabela de utilização do códon daplanta específica de modo a produzir um derivativo otimizadodo códon. Uma seqüência modificada de nucleotídeo pode sertotal ou parcialmente otimizada para a utilização de códonda planta, contanto que a proteína codificada pela seqüênciamodificada de nucleotídeo seja produzida em um nível maisalto do que a proteína codificada pelo gene naturalmenteocorrente ou nativo ' correspondente. A construção dos genessintéticos ao alterar a utilização do códon é descrita em,por exemplo, Pedido de Patente PCT 93/07278.

Assim, a presente invençãoabrange as seqüências de ácido nucléico descritas acima;seus fragmentos; seqüências passíveis de cruzamento comrelação a isso; seqüências homólogas à mesma, seqüênciascodificando polipeptideos semelhantes com diferenteutilização do códon, seqüências alteradas caracterizadas pormutações, tais como exclusão, inserção ou substituição de umo mais nucleotideos, sejam naturalmente ocorrentes ouinduzidos pelo homem, sejam aleatoriamente ou de um mododirigido.

Os polinucleotídeos acimadescritos também codificam os polipeptídeos previamente nãocaracterizados.

Dessa forma·, a presenteinvenção fornece um polipeptídeo com uma seqüência deaminoácido conforme ainda descrito abaixo, pelo menos cercade 70:λ, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80?·,pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82·!·., pelo menoscerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de85%, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87%, pelomenos cerca de 8 8%, pelo menos cerca de 8 9%, pelo menoscerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de92%, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 93%, pelomenos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95%, pelo menoscerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pêlo menos cerca·de98 V., pelo menos cerca de 99 'h, ou mais, digamos, 100 r,homóloga a uma seqüência de aminoácido selecionada a partirdo grupo consistindo na SEQ ID N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-56, 58-63, 66-119, 139-154 ou 155.

A presente invenção tambémabrange os fragmentos dos polipeptideos e polipeptideos commutações acima descritos, tais como, exclusões, inserções ousubstituições de um ou mais aminoácidos, sejam naturalmenteocorrentes ou induzidos pelo homem, sejam aleatoriamente oude um modo dirigido.

Uma planta adequada para usocom o método da presente invenção pode ser qualquer plantamonocotiledônea ou dicotiledônea, incluindo, porém semlimitação a, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, arroz,soja, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, sementede colza, canola, pimenta, girassol, batata, tabaco, tomate,berinjela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, umagrama permanente e uma safra de forragem.

A expressão do polinucleotídeoexógeno da presente invenção dentro da planta pode serefetuada ao transformar uma ou mais células da planta com opolinucleotídeo exógeno, seguido pela geração de umaplanta madura a partir das células transformadas ecultivação da planta madura sob condições adequadaspara expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da plantamadura.

Preferivelmente, atransformação é efetuada ao introduzir na célula da plantauma construção de ácido nucléico que inclui opoliiiucleotídeo exógeno da presente invenção e pelo menos umpromotor .capaz de instruir a transcrição do polinucleotídeoexógeno na célula da planta. Os detalhes adicionais dasabordagens adequadas de transformação sãõ fornecidos abaixo.

Conforme aqui utilizado, otermo "promotor" refere-se a uma região do DNA que seencontra a montante do local de iniciação da transcrição deum gene, ao qual a polimerase do RNA aglutina-se parainiciar a transcrição do RNA. O promotor controla o local emque (p.ex., qual porção de uma planta, qual órgão dentro deum animal, etc.) e/ou quando (p.ex., qual etapa ou condiçãona existência de um organismo) o gene é expresso.

Qualquer seqüência adequada depromotor pode ser utilizada pela construção de ácidonucléico da presente invenção. Preferivelmente, o promotor éum promotor constitutivo, um especifico do tecido ou umpromotor induzivel de estresse abiótico.

Os promotores constitutivosadequados incluem, por exemplo, promotor de CaMV 35S (SEQ IDN°: 120; Odell et al., Natureza 313:810-812, 1985); promotorde At 6 6 69 Arabidopsis (SEQ ID N°: 121, patente N0W02 004 /104 1 62 ) ; milho Ubi 1 (Christensen et al . , Plant Sol.Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al.,Célula da planta 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al . , Genet.de Apl. Teor. 81:581-588, 1991); e Synthetic Super MAS (Niet al., O Diário da Planta 7: 661-76, 1995). Outrospromotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes dosEUA N°s 5.659.026; 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121;5.569.597: 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; e 5.608.142.

Os promotores específicos dotecido adequados incluem, porém não são limitados a,promotores específicos de folha, tais conforme descritos,por exemplo, por Yamamoto et al. , J. de Planta 12:255-265,1997; Kwon et al., Fisiol. de Planta. 105:357-67, 1994;Yamamoto et al. , Fisiol. de célula da planta 35:773-778,1994; Gotor et al., J. de Planta 3:509-18, 1993; Orozco etal., Biol. Mol. da Planta 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:9586-9590, 1993.

Os promotores induzíveis deestresse abiótico adequados incluem, porém não são limitadosa, promotores induzíveis de sal, tais como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al. , Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993);promotores induzíveis de seca, tais como o promotor de generabl7 de milho (Pia et. al. , Plant Mol. Biol. 21:259-266,1993), promotor de gene rab28 de milho (Busk et. al., J. daPlanta 11:1285-1295, 1997) e promotor' de gene Ivr2 de milho(Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); epromotores induzíveis de calor, tais como, o promotor dehsp80 do tomate a partir do tomate (Pat. dos EUA N05.187.267) .

A construção de ácido nucléicoda presente invenção preferivelmente ainda inclui ummarcador selecionável apropriado e/ou uma origem dereplicação. Preferivelmente, a construção de ácido nucléicoutilizada em um vetor transportador, o qual pode propagartanto em Ε. coli (em que a construção compreende um marcadorselecionável apropriado e origem de replicação) e sercompatível com a propagação nas células. A construção deacordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, umplasmídeo, um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago,um vírus ou um cromossomo artificial.

A construção de ácido nucléicoda presente invenção pode ser utilizada para transformarestável ou transitoriamente a células da planta. Natransformação estável, o polinucleotídeo exógeno·da presenteinvenção é integrado no genoma da planta e, como tal,representa um traço estável e herdado. Na transformaçãotransitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pelacélula transformada, porém não é integrado no genoma e, comotal, representa um traço transitório.

Existem diversos métodos paraintroduzir genes estrangeiros nas plantas monocotiledôneas edicotiledôneas (Potrykus, I., Rev. Anual de Fisiol. dePlanta, Biol. Mol . da Planta (1991) 42:205-225; Shimamoto etal., Natureza (1989) 338:274-27 6).

Os métodos de princípio paraprovocar uma integração estável do DNA exógeno no DNAgenômico da planta incluem duas abordagens principais:(i) Transferência do gene mediado por Agrobacterium: Kleeet al. (1987) Rev. Anual da Fisiol. de Planta 38:467-486;Klee e Rogers em Cultura de Célula e Genética Somática daCélula de Plantas, Vol. 6, Biologia Molecular dos GenesNucleares da Planta, eds. Schell, J., e Vasil, L. K.,Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25;Gatenby, em Biotecnologia da Planta, eds. Kung, S. eArntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989)p. 93-112.

(ii) Absorção direta do DNA: Paszkowski et al. , em Culturade Célula e Genética Somática da Célula de Plantas, Vol. 6,Biologia Molecular dos Genes Nucleares da Planta eds.Schell, J., e Vasil, L: K., Academic Publishers, San Diego,Calif. (1989) p. 52-68; incluindo os métodos para absorçãodireta do DNA em protoplastas·, Toriyama, K. et al. (1988)Bio/Tecnologia 5:1072-1074. Absorção do DNA induzida porbreve choque elétrico da células da planta: Zhang et al.Rep. de célula da planta (1988) 7:379-384. Fromm et al.Natureza (1986) 319:791-793. Injeção de DNA nas células daplanta ou tecidos através de bombardeio de partícula, Kleinet al. Bio/Tecnologia (1988) 6:559-563; McCabe et al.Bio/Tecnologia (1988) 6:923-926; Sanford, Fisiol. Planta(1990) 79:206-209; através do uso de sistemas demicropipetas: Neuhaus et al. , Genet. de Apl. Teor. (1987)75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Fisiol. Planta (1990)79:213-217; transformação de cristal capilar de fibras devidro ou carboneto de silício das culturas de célula,embriões ou tecido de calo, Pat. dos EUA N0 5.464.765 oupela incubação direta do DNA com pólen de germinação, DeWetet al. em Manipulação Experimental do Tecido de Óvulo, eds.Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman,London, (1985) p. .197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sei.USA (1986) 83:715-719.O sistema de Agrobacteriuminclui o uso de vetores de plasmídeo que contêm os segmentosdefinidos de DNA que se integram ao DNA genômico da planta.Os métodos de inoculação do tecido da planta variamdependendo das espécies de planta e o sistema deadministração de Agrobacterium. Uma abordagem amplamenteusada é. o procedimento de disco da folha que pode serrealizado com qualquer explante de tecido que fornece umaboa fonte para iniciação de toda a diferenciação da planta.Horsch et al. em Manual de Biologia Molecular da Planta A5,Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Umaabordagem complementar emprega o sistema de administração deAgrobacterium em combinação com a infiltração a vácuo. Osistema de Agrobacterium é especialmente viável na criaçãodas plantas dicotiledôneas transgênicas.

Existem diversos métodos detransferência direta do DNA nas células da planta. Naeletroporação, as protoplastas são brevemente expostas a umforte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamenteinjetado diretamente nas células utilizando micropipetasmuito pequenas. No bombardeio de micropartícula, o DNA éadsorvido em microprojéteis, tais como cristal de sulfato demagnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteissão fisicamente acelerados nas células ou tecidos de planta.

Após a transformação estável,a propagação da planta é exercida. 0 método mais comum depropagação da planta é por semente. A regeneração porpropagação de semente, entretanto, possui a deficiência que,devido à heterozigosidade, existe uma falta de uniformidadena safra, considerando que as sementes são produzidas pelasplantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelasleis de Mendelian. Basicamente, cada semente é geneticamentediferente e cada crescerá com seus próprios traçosespecíficos. Portanto, é preferido que a planta transformadaseja produzida de modo que a planta regenerada possua ostraços e as características idênticos à planta transgênicaprecursora. Portanto, é preferido que a planta transformadaseja regenerada por micropropagação que fornece umareprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

A micropropagação é umprocesso de crescimento de plantas de nova geração a partirde uma única peça de tecido que foi removida a partir de umaplanta precursora selecionada ou cultivar. Esse processopermite a reprodução em massa das plantas com o tecidopreferido expressando a proteína de fusão. As plantas denova geração que são produzidas são geneticamente idênticasa, e possuem todas as características de, a planta original.

A micropropagação permite a produção em massa de material deplanta de qualidade em um curto período de tempo e ofereceuma rápida multiplicação de cultivares selecionados napreservação das características da planta transformada outransgênica original. As vantagens da clonagem de plantassão a velocidade da multiplicação da planta e a qualidade euniformidade das plantas produzidas.

A micropropagação é umprocedimento de etapa múltipla que exige a alteração do meiode cultura ou condições de crescimento entre as etapas.Dessa forma, o processo de micropropagação envolve quatroetapas básicas: Etapa um, cultivação inicial do tecido;etapa dois, multiplicação da cultura de tecido; Etapa três,diferenciação e formação da planta; e etapa quatro,cultivação em estufa e endurecimento. Durante a etapa um,cultivação inicial do tecido, a cultura do tecido éestabelecida e certificada como ' livre de contaminantes.Durante a etapa dois, a cultura inicial do tecido émultiplicada até um número suficiente de amostras de tecidoser produzido para atender os objetivos de produção. Durantea etapa três, as amostras de tecido cultivadas na etapa doissão divididas e cultivadas em plântulas individuais. Naetapa·quatro, as plântulas transformadas são transferidas auma estufa para endurecimento, em que a tolerância dasplantas à luz é gradualmente aumentada, de modo que possaser cultivada no ambiente natural.

Preferivelmente, as plantastransformadas maduras geraram, conforme acima descrito, sãoainda selecionadas para tolerância ao estresse abiótico. Deforma correspondente, as plantas transformadas e nãotransformadas (do tipo selvagem) são expostas a uma condiçãode estresse abiótico, tal como, privação de água,temperatura sub-ideal, deficiência de nutriente, oupreferivelmente uma condição de estresse de sal. O estressede sal pode ser efetuado de diversas formas, tais como, porexemplo, ao irrigar as plantas com uma soluçãoexcessivamente osmótica, ao cultivar as plantashidroponicamente em. uma solução de crescimentoexcessivamente osmótica (p.ex., solução Hoagland), ou aocultivar as plantas em um meio de crescimento excessivamenteosmótico (p.ex., meio MS). Considerando que as diferentesplantas variam consideravelmente em sua tolerância àsalinidade, a concentração de sal na água de irrigação,solução de crescimento ou meio de crescimento épreferivelmente ajustada de acordo com as característicasespecificas de cultivar de planta específica ou variedade,de modo a infligir um efeito suave ou moderado na fisiologiae/ou morfologia das plantas (para diretrizes com relação àconcentração apropriada, vide Bernstein e Kafkafi,Crescimento de Raiz Sob Estresse de Salinidade Em: Raízes dePlanta, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e KafkafiU. (editores) Mareei Dekker Inc., New York, 2002, ereferência lá contida). Após a exposição à condição deestresse, as plantas são freqüentemente monitoradas até osefeitos substanciais fisiológicos e/ou morfológicosaparecerem em plantas do tipo selvagem. Subseqüentemente, asplantas transformadas que não exibem efeitossubstanciais fisiológicos e/ou morfológicos, ou queexibem biomassa maior do que as plantas do tiposelvagem, são identificadas como plantas tolerantes aoestresse abiótico.

Embora a transformação estávelseja atualmente preferida, a transformação transitória dascélulas de folha, células de meristema ou toda a planta,também é contemplada pela presente invenção.A transformação transitóriapode ser efetuada por quaisquer dos métodos diretos detransferência do DNA acima descritos ou por infecção viralutilizando os virus modificados de planta.

Os virus que se mostraramúteis pára a transformação de hospedeiros de planta incluemCaMV, TMV e BV. A transformação de plantas utilizando osvirus de planta é descrita na Pat. dos EUA N0 4.855.237(BGV), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Publicado Japonês N0 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV) , EPA 278.667 (BV); e Gluzman,Y. et al. , Comunicações em Biologia Molecular: VetoresVirais, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189(1988) . As partículas de pseudovírus para uso na expressãodo DNA estrangeiro em muitos hospedeiros, incluindo asplantas, são. descritas em WO 87/06261.

Preferivelmente, o vírus dapresente invenção é avirulento e, assim, é incapaz deprovocar sintomas graves, tais como taxa reduzida decrescimento, mosaico, manchas em anel, enrolamento da folha,.amarelecimento, listras, formação de erupções, formação detumor e sulcos. Um vírus avirulento adequado pode ser umvírus avirulento naturalmente ocorrente ou um vírusartificialmente atenuado. A atenuação de vírus pode serefetuada ao -utilizar os métodos bem conhecidos na técnica,incluindo, porém não limitado a, aquecimento sub-letal,tratamento químico ou por técnicas direcionadas demutagênese, tais conforme descritas, por exemplo, porKurihara. e Watanabe (Patologia de Planta Molecular 4:259-269, 2003), Gal-on et al . (1992), Atreya et al . (1992) eHuet et al. (1994) .

As cepas adequadas de víruspodem ser obtidas a partir das fontes disponíveis, taiscomo, por exemplo, a American Type culture Collection (ATCC)ou por isolamento de plantas infectadas. 0 isolamento dosvírus a partir de tecidos infectados de planta pode serefetuado pelas técnicas bem conhecidas na técnica, taisconforme descritas, por exemplo, por Foster . e Tatlor, Eds."Protocolos de Virologia de Planta: A Partir do Isolamentode Vírus para Resistência Transgênica (Métodos na BiologiaMolecular (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998.Brevemente, os tecidos de uma planta infectada sãoacreditados como contendo uma alta concentração de um vírusadequado, preferivelinente folhas jovens e pétalas de flores,são trituradas em uma solução tampão (p.ex., solução tampãode fosfato) para produzir uma seiva infectada por vírus quepode ser utilizada em inoculações subseqüentes.

A construção dos vírus de RNAde planta para a introdução e expressão das seqüênciasvirais de polinucleotídeo exógeno nas plantas é demonstradapelas referências acima, bem como por Dawson, W. 0. et al.,Virologia (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J.(1987) 6:307-311; French et al. Ciência (1986) 231:1294-1297; e Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76.

Quando o vírus é um vírus deDNA, as modificações adequadas podem ser feitas ao própriovírus. Alternativamente, o vírus pode primeiro ser clonadoem um plasmídeo bacteriano para facilidade de. construção dovetor viral desejado com o DNA estrangeiro. 0 vírus pode serentão removido a partir do plasmideo.. Se o vírus for umvírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode serligada ao DNA viral, que é então replicado pela bactéria. Atranscrição e tradução desse DNA produzirá a proteína derevestimento que envolverá o DNA viral. Se o vírus for umvírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA einserido em um plasmídeo. 0 plasmídeo é então utilizado pararealizar todas as construções. 0 vírus de RNA é entãoproduzido ao transcrever a seqüência viral do plasmídeo etradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s)revestimento que envolve(m) o RNA viral.

A construção dos vírus deplanta de RNA para a introdução e expressão nas plantas deseqüências de polinucleotídeo exógeno não viral, tais comoaquelas incluídas na construção' da presente invenção, édemonstrada pelas referências acima, bem como na Pat. dosEUA N0 5.316.931 .

Em uma configuração, umpolinucleotídeo viral de planta é fornecido, em que aseqüência de codificação da proteína de revestimento nativa"foi excluída a partir de um polinucleotídeo viral, umaseqüência de codificação da proteína de revestimento nãonativa e um promotor não nativo, preferivelmente o promotorsubgenômico da seqüência de codificação da proteína derevestimento não nativa, capaz de expressão no hospedeiro deplanta, empacotamento do polinucleotídeo viral da plantarecombinante, e garantia de uma infecção sistemática dohospedeiro pelo polinucleotideo viral da plantarecombinante, foram inseridos. Alternativamente, o gene daproteína de revestimento pode ser desativado por inserção daseqüência de polinucleotideo não nativa dentro dele, de modoque uma proteína seja produzida. 0 polinucleotideo viral deplanta recombinante pode conter um ou mais promotoressubgenômicos não nativos adicionais. Cada promotorsubgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressaros genes adjacentes ou seqüências de polinucleotideo nohospedeiro de planta e incapaz de recombinação entre si ecom promotores subgenômicos nativos. As seqüências depolinucleotideo não nativo (estrangeiro) podem ser inseridasadjacentes ao promotor subgenômico viral de plantanativo ou aos promotores subgenômicos virais deplanta não nativos, se mais de uma seqüência depolinucleotideo for incluída. As seqüências depolinucleotideo não nativo são transcritas ou expressas naplanta de hospedeiro sob o controle do promotor subgenômico'para produzir os produtos desejados.

Em uma segunda configuração,um polinucleotideo viral de pl.anta recombinante é fornecidocomo na primeira configuração, exceto que a seqüênciade codificação de proteína de revestimento nativa écolocada adjacente a um dos promotores subgenômicosde proteína de revestimento não nativa, ao invés deuma seqüência de codificação de proteína de revestimento nãonativa.Em uma terceira configuração,um polinucleotideo viral de planta recombinante é fornecido,em que o gene de proteína de revestimento nativo estáadjacente a seu promotor subgenômico e um ou mais promotoressubgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotideoviral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos sãocapazes de transcrever ou expressar os genes adjacentes emum hospedeiro de planta e são incapazes de recombinaçãoentre si e com os promotores subgenômicos nativos. Asseqüências de polinucleotideo não nativo podem ser inseridasadjacentes aos promotores virais de plantas subgenômicas nãonativos, de modo que as seqüências são transcritas ouexpressas na planta de hospedeiro sob o controle dospromotores subgenômicos para produzir o produto desejado.

Em uma quarta configuração, umpolinucleotideo viral de planta recombinante é fornecidoconforme na terceira configuração, exceto que a seqüência decodificação de. proteína de revestimento nativa é substituídapor uma seqüência de codificação de proteína de revestimentonão nativa.

Os vetores virais sãoenvolvidos pelas proteínas de revestimento codificadas pelopolinucleotideo viral de planta recombinante para produzirum vírus de planta recombinante. 0 polinucleotideo viral deplanta recombinante ou vírus de planta recombinante é usadopara infectar as plantas apropriadas de hospedeiro. 0polinucleotideo viral de planta recombinante é capaz dereplicação no hospedeiro, dispersão sistêmica no hospedeiro,e transcrição ou expressão do(s) gene(s) estrangeiro(s)(polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para . produzir aproteína desejada.

As técnicas para inoculação devírus nas plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor,eds. "Protocolos de Virologia de Planta: A Partir doIsolamento de Vírus para Resistência Transgênica (Métodos naBiologia Molecular (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press,1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Métodos em Virologia" 7vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A."Métodos na Virologia de Planta",, Blackwell, Oxford, 1984;Walkey, D.G.A. "Virologia Aplicada de Planta", Wiley, NewYork, 1985; e Kado e Agrawa, eds. "Princípios e Técnicas naVirologia de Planta", Van Nostrand-Reinhold, New York.

Além do acima, opolinucleotídeo da presente invenção também pode serintroduzido em um genoma de cloroplasto, assim permitindo aexpressão do cloroplasto.

Uma técnica para introduzir asseqüências de polinucleotídeo exógeno ao genoma doscloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os seguintesprocedimentos. Primeiro, as células da planta sãoquimicamente tratadas, de modo a reduzir o número decloroplastos por célula para cerca de um. Então, opolinucleotídeo exógeno é introduzido através do bombardeiode partícula nas células com o objetivo de introduzir pelomenos uma molécula de polinucleotídeo exógeno noscloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos selecionados, demodo ' que eles são passíveis de integração no genoma docloroplasto através de recombinação homóloga, que éprontamente efetuada pelas enzimas inerentes no cloroplasto.Para essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, alémde um gene de interesse, pelo menos um estiramento depolinucleotídeo que é derivado a partir do genoma decloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui ummarcador selecionável, o qual atual através de procedimentosseqüências de seleção para verificar que todas ousubstancialmente todas as cópias dos genomas de cloroplastosapós tal seleção incluirão o polinucleotídeo exógeno. Osdetalhes adiciOnais relacionados a essa técnica são;encontrados nas Pat. dos EUA N°s 4.945.050; e 5.693.507, asquais são incorporadas no presente por referência. Umpolipeptídeo pode assim ser produzido pelo sistema deexpressão da proteína do cloroplasto e tornar-se integrado àmembrana interna do cloroplasto.

Considerando que a tolerânciaao estresse abiótico nas plantas pode envolver múltiplosgenes atuando de modo aditivo ou em sinergia (vide, porexemplo, em Quesda et al., Fisiol. de Planta. 130:951-063,2002), a presente invenção também abrange a expressão de umapluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única plantade hospedeiro para assim atingir a tolerância superior aoestresse abiótico.

A expressão de uma pluralidadede polinucleotídeos exógenos em uma única planta dehospedeiro pode ser efetuada pela introdução conjunta demúltiplas construções de ácido nucléico, cada uma incluindoum diferente polinucleotídeo exógeno, em uma única célula daplanta. A célula transformada pode ser então regenerada emuma planta madura utilizando os métodos descritos acima.

Alternativamente, a expressãode uma pluralidade de polinucleotideos exógenos em uma únicaplanta de hospedeiro pode ser efetuada pela introduçãoconjunta de uma única célula de planta e uma únicaconstrução de ácido nucléico incluindo urna pluralidade deIU diferentes polinucleotideos exógenos. Tal construção podeser projetada com uma única seqüência de promotor que podetranscrever uma mensagem policistrônica, incluindo todas asdiferentes seqüências de polinucleotídeo exógeno. Parapermitir a tradução conjunta dos diferentes polipeptídeoscodificados pela mensagem policistrônica, as seqüências depolinucleotídeo podem ser interligadas através de umaseqüência do local de entrada interna de ribossomo (IRES), oque facilita a tradução das seqüências de polinucleotídeoposicionadas a jusante da seqüência de IRES. Nesse caso, amolécula de RNA policistrônica transcrita codificando osdiferentes polipeptídeos acima descritos serátraduzida a partir da extremidade 5' coberta e asduas seqüências de IRES internas da molécula de RNApolicistrônica, para assim produzir na célula todosos diferentes polipeptídeos. Alternativamente, aconstrução pode incluir diversas seqüências de promotor,cada uma ligada a uma diferente seqüência de polinucleotídeoexógeno.A célula da planta

transformada cora a construção, incluindo uma pluralidade dediferentes polinucleotideos exógenos, pode ser regenerada emuma planta madura, utilizando os métodos acima descritos.

Alternativamente, a expressãode uma pluralidade dos polinucleotideos exógenos em umaúnica planta de hospedeiro pode ser efetuada pela introduçãode diferentes construções de ácido nucléico, incluindodiferentes polinucleotideos exógenos, em uma pluralidade deplantas. As plantas regeneradas transformadas podem entãoser criadas de forma cruzada e a progênie resultanteselecionada para tolerância superior aos traços de estresseabiótico e/ou biomassa, utilizando as técnicas convencionaisde cultivação'de planta.

Conseqüentemente, o presentepedido fornece os métodos para utilizar os novos genes detolerância ao estresse abiótico para aumentar a tolerânciaao estresse abiótico e/ou biomassa em uma ampla faixa deplantas econômicas, de uma forma segura e econômica.

As plantas estão sujeitas auma faixa de desafios ambientais. Diversos desses, incluindoo estresse de sal, estresse osmótico geral, estresse de secae estresse de resfriamento, possuem a capacidade de impactartoda a disponibilidade de planta e água celular. De maneiranão surpreendente, então, as respostas de planta a essacoleção de estresses são relacionadas. Em uma revisãorecente, Zhu observou que "a maioria dos estudos com relaçãoà sinalização do estresse de água enfocou no estresse de salprincipalmente devido às respostas de planta ao sal e secaserem estreitamente relacionadas e os mecanismos sesobrepõe" (Zhu (2002) Rev. Anual de Biol. da Planta 53: 247-273). Muitos exemplos de respostas e vias semelhantes a esseconjunto de estresses foram documentados. Por exemplo, osfatores de transcrição de CBF foram demonstrados para aresistência de condição ao sal, resfriamento e seca (Kasugaet al. (1999) Biotecnol. da Natureza 17: 287-291). 0 gene deArabidopsis rd29B é induzido em resposta ao estresse de sale desidratação, um processo que é mediado amplamente atravésde um processo de transdução do sinal de ABA (Uno et al.(2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 11632-11637),resultando em atividade alterada dos fatores de transcriçãoque aglutinam a um elemento a montante dentro do promotor derd29B. Na Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo),Patharker e Cushman demonstraram que uma quinase de proteínadependente do cálcio (McCDPKl) é por exposição aos estressesde seca e sal (Patharker e Cushman (2000) J. da Planta 24:679-691). A quinase induzida por estresse também· foidemonstrada para fosforilar um fator de transcrição,presumidamente alterando sua atividade, embora os níveis detranscrição do fator de transcrição alvo não sejam alteradosem resposta ao estresse de sal ou seca." De forma semelhante,Saijo et al. demonstraram que uma quinase de proteínadependente de calmodulina induzida por sal/seca (0sCDPK7)conferiu tolerância aumentada de sal e seca ao arroz quandoexpresso em excesso (Saijo et al. (2000) J. da Planta 23:319-327) .A exposição à desidrataçãoinvoca estratégias semelhantes de sobrevivência nas plantas,assim como o estresse de resfriamento (vide, por exemplo,Yelenosky (1989) Fisiol. de Planta 89: 444-451) e o estressede seca induz a tolerância ao resfriamento (vide, porexemplo, Siminovitch et al. (1982) Fisiol. de Planta 69:250-255; e Guy et al. (1992) Planta 188: 265-270). Além daindução das proteínas aclimatação ao frio, as estratégiasque permitem que as plantas sobrevivam em baixas condiçõesde água podem incluir, por exemplo, área de superfíciereduzida, ou óleo de superfície ou produção de cera.

Será apreciado que algumasvias envolvidas na resistência a um estresse (conforme acimadescrito), também serão envolvidas na resistência aos outrosestresses, reguladas pelos mesmos genes ou genes homólogos.Claramente, as vias gerais de resistência são relacionadas,não idênticas e, portanto, nem todos os genes que controlama resistência a um estresse controlarão a resistência aosoutros estresses. Não obstante, se uma resistência àscondições do gene a um desses estresses, será aparente paraaquele com habilidade na técnica para testar a resistência aesses estresses relacionados. Os métodos para avaliar aresistência ao estresse são ainda fornecidos na seção de

Exemplos que se segue.

As seqüências depolinucleotídeo da presente invenção são capazes de aumentaruma biomassa de uma planta. Será apreciado que a capacidadedos polipeptídeos . da presente invenção aumente orendimento/biomassa/vigor da planta sendo inerente a suacapacidade de promover o aumento no tamanho de célula daplanta (conforme mostrado no Exemplo 8 e Figura 2).

Assim, a presente invençãotambém abrange um método para aumentar umabiomassa/vigor/rendimento de uma planta (plantas coniferas,musgo, alga, monocotiledônea ou dicotiledônea, bem comooutras plantas listadas em

http://www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae) .

Conforme aqui utilizado, afrase "biomassa da planta" refere-se a quantia ou quantidadede tecido produzido a partir da planta em uma temporada decrescimento, o que também poderia determinar ou afetar orendimento da planta ou o rendimento conforme área decrescimento.

Conforme aqui utilizado, afrase "vigor da planta" refere-se a quantia ou quantidade detecido produzido a partir da planta em determinado tempo.Assim, o vigor aumentado poderia determinar ou afetar orendimento da planta ou o rendimento conforme tempo decrescimento ou área de crescimento.

Conforme aqui utilizado, afrase "rendimento da planta" refere-se a quantia ouquantidade de tecido produzido e colhido conforme a plantaproduz o produto. Assim, o rendimento aumentado poderiaafetar o beneficio econômico que poderia ser obtido a partirda planta em determinada área de crescimento e/ou tempo decrescimento.Preferivelmente, as plantaspor engenharia genética da presente invenção exibem pelomenos cerca de mais 2%, mais 5 mais 10 mais '20 , mais30 If mais 40 %, mais 50 %, mais 60 %, mais 70 %, mais 80 %,mais 90 % ou mesmo biomassa, vigor e/ou rendimento maior doque as plantas não transgênicas.

Os métodos de ensaio do vigorda planta, rendimento e biomassa são. bem conhecidos natécnica (vide Exemplo 10).

Assim, a presente invenção éde alto valor agrícola para promover o rendimento de safrascomercialmente desejadas (p.ex., biomassa do órgãovegetativo, tal como, madeira de álamo, ou órgão reprodutor,tal como, o número de sementes ou biomassa da semente).

Conforme aqui utilizado, otermo "cerca" refere-se a ± 10 %.

Os objetos, vantagens ecaracterísticas novas adicionais da presente invençãotornar-se-ão aparentes para aquele com habilidade na técnica mediante exame dos seguintes exemplos, que não têm aintenção de serem limitantes. Adicionalmente, cada uma dasdiversas configurações e aspectos da presente invenção,conforme delineada acima e conforme reivindicada na seção dereivindicações, encontra suporte experimental nos seguintesexemplos.

EXEMPLOS

Referência agora é feita aosseguintes exemplos, os quais, conjuntamente com asdescrições acima, ilustram a invenção de uma forma não1imitante.

De modo geral, a nomenclaturaaqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizadosna presente invenção incluem técnicas moleculares,bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Taistécnicas são completamente explicadas na literatura. Vide,por exemplo, "Clonagem Molecular: Um Manual de laboratório"Sambrook et al., (1989); "Protocolos Atuais em BiologiaMolecular" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubelet al., "Protocolos Atuais em Biologia Molecular", JohnWiley e Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "Um GuiaPrático para Clonagem Molecular", John Wiley & Sons, NewYork (1988); Watson et al. , "DNA Recombinante", ScientificAmerican Books, New York; Birren et al. (eds) "Análise deGenoma: Uma Série de Manual Laboratorial", Vols. 1-4, ColdSpring. Harbor Laboratory Press, New York (1998);metodologias conforme estabelecidas nas Pat. dos EUA N°s4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272 . 057;"Biologia da Célula: Um Compêndio Laboratorial", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Protocolos Atuais emImunologia" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stiteset al. (eds), "Imunologia Básica e Clinica" (8a Edição),Appleton & Lange,' Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi(eds), "Métodos Selecionados em Imunologia Celular", W. H.Freeman e Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveissão extensivamente descritos na patente e literaturacientifica, vide, por exemplo, Pat. dos EUA N°s. 3.791.932;3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517;3.879.262; 3.901.654; 3.93 5.07 4; 3.984.533; 3.996.345;4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521;"Síntese de Oligonucleotídeo" Gait, M. J., ed. (1984);"Hibridização do ácido nucléico" Hames, B. D., e Higgins S.J., eds. (1985); "Transcrição e Tradução" Hames, B. D., eHiggins S. J., eds. (1984); "Cultura da Célula Animal"Freshney, R. I., ed. (1986); "Enzimas e CélulasImobilizadas" IRL Press, (1986); "Um Guia Prática paraClonagem Molecular" Perbal, B., (1984) e "Métodos emEnzimologia" Vol. 1-317, Academic Press; "Protocolos PCR: UmGuia Para Métodos e Aplicações", Academic Press, San Diego,CA (1990); Marshak et al. , "Estratégias para Purificação eCaracterização de Proteína - Um Manual de CursoLaboratorial" CSHL Press (1996); todos os quais sãoincorporados por referência como se totalmente estabelecidosno presente. Outras referências gerais são fornecidas emtodo este documento. Os procedimentos lá contidos sãoacreditados como sendo bem conhecidos na técnica e sãofornecidos para conveniência do leitor.

Exceto se de outro mododefinido, todos os termos técnicos e científicos aquiutilizados possuem os mesmos significados conforme comumenteentendidos por aquele com habilidade na técnica, aos quaisesta invenção pertence. Embora os métodos e materiaissemelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possamser utilizados na prática ou teste da presente invenção, osmétodos e materiais adequados são descritos abaixo.EXEMPLO 1

Identificação dos supostos genes de tolerância ao estresseabiótico a partir de Monocotiledôneas

Os genes de tolerância aoestresse abiótico (ABST) foram identificados e validados invivo conforme previamente descritos em W02 0Q4/104162 para opresente cessionário. Vários genes ABS e polipeptideoscodificados através disso foram identificados a partir dedicot iledôneas (SEQ ID N°s 122-126 e 127-131,respectivamente). Foram realizados exames de seqüênciasortólogas em bancos de dados genômicos de monocotiledôneas,bancos de dados NCBI HTP://World Wide Web (ponto) nbci(ponto) ηIm (ponto) nih (ponto)gov) e TIGR (HTP://World WideWeb (ponto) tigr (ponto) org/) de Milho, Sorgo, Arroz eCevada.

As etiquetas de seqüênciaexpressa (ESTs) e seqüências de cDNA foram agrupadas emontadas utilizando o software LEADS1'1 (Compugen) ecomparadas ao banco de dados TIGR(http://www.tigr.org/) ' das monocotiledôneas acima.De modo geral, o agrupamento de 372.000 de ESTs domilho resultou em 41.990 grupos entre eles 19.870singletones. No Sorgo, cerca de 190.000 de ESTsforam agrupados em 39.000 grupos, enquanto na cevada370.500 de ESTs geraram 50.000 diferentes grupos, cada umrepresentando um diferente gene. 0 número semelhante deseqüências e genes agrupados foi encontrado no banco dedados genômico do arroz.Um resumo do perfil deexpressão digital foi compilado para cada grupo de acordocom todas as palavras-chave incluídas nos registros deseqüência compreendendo o grupo. A expressão digital, tambémconhecida como northern blot eletrônico, é uma ferramentaque exibe o perfil da expressão virtual com base nasseqüências de EST que formam o grupo de gene. A ferramentapode fornecer o perfil de expressão .de um grupo em termos daanatomia de planta (em quais tecidos/órgãos o gene éexpresso), etapa de desenvolvimento (as etapas dedesenvolvimento em que um gene pode ser encontrado) e perfilde tratamento (fornece as condições fisiológicas sob asquais um gene é expresso, tais como, seca, frio, infecção depatógeno, etc.). Considerando uma distribuição aleatória deESTs nos diferentes grupos, a expressão digital fornece umavalor de probabilidade que descreve a probabilidade de umgrupo ter um total de N ESTs para conter X ESTs a partir dedeterminada coleção de bibliotecas. Para os cálculos deprobabilidade são considerados: a) o número de ESTs nogrupo, b) o número de ESTs das bibliotecas implicadas erelacionadas, c) o número geral de ESTs disponíveis querepresentam as espécies. Assim, os grupos com baixos valoresde probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs apartir do grupo de bibliotecas de interesse que indicam umaexpressão especializada.

Os conceitos da ortologia eparalogia foram recentemente aplicados às caracterizações eclassificações funcionais na escala das comparações de todoo genoma. Os ortólogos e parólogos constituem dois tiposprincipais de homólogos: O primeiro desenvolveu-se a partirde um ancestral comum por especialização, e os últimos sãorelacionados por eventos de duplicação. É presumido que osparólogos originando-se dos eventos antigos de duplicaçãosão prováveis de terem divergidos na função, enquanto osverdadeiros ortólogos são mais prováveis de reter funçãoidêntica com o tempo evolucionário.

Para ainda investigar eidentificar os supostos genes ortólogos de ABST a partir dasespécies monocotiledôneas, dois métodos computacionais foramintegrados:

(i) O método para alinhamento das seqüências ortólogas - ométodo é efetuado ao construir os grupos ortólogos atravésde taxa eucariótica múltipla, utilizando modificações noalgoritmo do grupo Markov para agrupar os supostos ortólogose parólogos. Esses supostos ortólogos foram aindaorganizados de acordo com Filograma - um diagrama deramificação (árvore) presumido como uma estimativa de umafilogenia dos genes.

(ii) 0 método para gerar o perfil de expressão do "Expressãodigital" - Os presentes inventores realizaram trabalhoconsiderável com o objetivo de anotar as seqüências. Osdados de expressão foram analisados e as bibliotecas de ESTforam classificadas utilizando um vocabulário fixo de termosusuais, tais como, tratamentos experimentais. As anotaçõesde todos os ESTs agrupados para um gene foram analisadasestatisticamente ao comparar sua freqüência no grupo versussua abundância no banco de dados, permitindo construir umperfil de expressão numérico e gráfico de tal gene, que édesignado como "expressão digital".

O fundamento lógico parautilizar esses dois métodos complementares é com base naassunção de que os verdadeiros ortólogos são prováveis dereter função idêntica no tempo evolucionário. Esses doismétodos (padrão de seqüência e expressão) fornecem doisdiferentes conjuntos de indicações sobre as semelhantes defunção entre os dois genes homólogos, semelhanças no nivelde seqüência - aminoácidos idênticos nos domínios deproteína e semelhanças nos perfis de expressão.

Ao comparar as seqüências apartir monocotiledôneas aos genes de ABST de tomate, osníveis de homologia. entre os genes de tomate e seu melhorgene ortólogo a partir das monocotiledôneas diferiram-sedramaticamente, variando de 45% a 88V, . Além do mais, operfil de expressão in silico dos genes de monocotiledôneasnão se ajusta sempre a um gene envolvido na tolerância deABS. Assim, uma pesquisa extensiva para o ortólogo funcionaldas monocotiledôneas de cada gene de tomate (SEQ ID N0: 122-131) foi efetuada.

Na tentativa de identificar osmelhores ortólogos dos genes de ABST de tomate, doisconjuntos de análises foram realizados. Primeiro, asseqüências de 5 genes de ABST de tomate (SEQ ID N0:' 122-126)e suas seqüências deduzidas de polipeptídeo (SEQ ID N°: 127-• 131) foram comparadas a todas as supostas proteínas demonocotiledôneas, codificadas pelas seqüências de DNA dosgrupos de gene acima mencionados. A comparação foi realizadano nível de proteína, procurando a identidade maior do que45 o ao longo de toda a seqüência de proteína.

A Tabela 1 abaixo mostra osmelhores genes homólogos e seu nível de identidade para asproteínas de ABST de tomate. Depois, essas proteínas demonocotiledôneas originaram-se a partir de diferentesespécies de monocotiledôneas (cevada, sorgo e milho) foram escolhidascom base an seu padrão de . expressão durante o desenvolvimento dediversas espécies de monocotiledôneas. Essa triagem foi com basena expressão digital dos genes, conforme acima descrito. Aexpressão digital representa a distribuição dos ESTs quecompõe cada gene in silico e o desvio da distribuiçãoefetiva a partir da distribuição aleatória. Os genes foramselecionados com base em três critérios: genes com expressãomaior nas raízes, raízes e folhas e/ou induzidos portratamentos que representam as condições de.estresse do solo(seca, salinidade, deficiências do solo). Um aumento naexpressão foi considerado somente nos casos em que umaumento maior do 2 vezes (relativos à distribuiçãoaleatória de EST) era evidente com probabilidade de significânciainferior a 0,05. A Tabela 2 abaixo resume o perfil de expressãodos genes em diferentes órgãos ou tecidos e ostratamentos que realçaram elevação significativa emseu nível de expressão.

Tabela 1: O nível de homologia entre os genes de ABST detomate e seus genes homólogos a partir de monocotiledôneas.<table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table>

Nenhum*- Nenhum dos tratamentos com elevação significativana expressão digital pôde ser considerado como tratamento deestresse do solo.

A combinação da triagem acimaconforme descrito na Tabela 1 e na Tabela 2 acima revelou alista final de cinco genes de monocotiledôneas que sãoprevistos para serem os mais relacionados aos genes de ABSTde tomate (SEQ ID N°s 1, 3, 5, 7, 9).

As seqüências selecionadas depolinucleotideo (Tabela 3 abaixo) foram analisadas parapresença de ORFs utilizando Vector NTI suite (InforMax,U.K.) versão 6 (Hasting Software, Inc: www.generunner.com/).Os ORFs identificados em cada uma dessas seqüências depolinucleotídeo foram comparados com as seqüências do bancode dados Genbank, utilizando Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/); o ORF que exibe a homologiamais alta a uma seqüência ou seqüências GenBank foi mapeadocom a finalidade de identificar um códon de inicio de ATG. Aposição do códon de inicio de ATG desse ORF foi entãocomparada ao da seqüência identificada de polinucleotideocom a finalidade de verificar que cada uma das cincoseqüências aqui descritas inclui um ORF de comprimento totale um códon de inicio de ATG (assim se qualifica como um"suposto gene de ABST de monocotiledôneas").Tabela 3

Genes de ABST de monocotiledôneas

<table>table see original document page 59</column></row><table>

* - Ainda descrito no Exemplo 2 abaixo.

Os polipeptídeos com homologiasignificativa aos genes de ABST de monocotiledôneas foramidentificados a partir dos bancos de dados NCBI utilizando osoftware BLAST (Tabela 4).

Tabela 4

<table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>

EXEMPLO 2

Geração dos supostos genes de ABST de monocotiledôneas

As seqüências de DNA dos genesde ABST monocotiledôneas foram sintetizadas por GeneArt(Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) geneart(ponto) com/) . O DNA sintético foi projetado era ambiente virtual, combase nas seqüências codificadas de aminoácido dos genes de ABST demonocotiledôneas (SEQ ID N°s 2, 4, 6, 12) e usando tabelasde utilização do códons calculadas a partir de conjuntos detranscrição de plantas (é possível encontrar exemplos detais tabelas no Banco de Dados de Utilização do Códonsdisponível on-line em I-ITP://World Wide Web (ponto) kazusa(ponto) Ou (ponto) jp/códon/). As seqüências de codificaçãootimizadas são projetadas de uma forma que nenhuma alteraçãoé introduzida na seqüência de aminoácido codificada aoutilizar os códons preferidos para expressão nas plantasdicotiledôneas (principalmente tomate e Arabidopsis) eplantas monocotiledôneas, tais como o milho. Pelo menos umamutação silenciosa por 20 pares de base de nucleotídeo foiintroduzida na seqüência comparada às seqüências demonocotiledôneas ortólogas para evitar o possívelsilenciamento ao expressar em excesso o gene em espécies demonocotiledôneas, tais como o milho. Para as seqüênciasotimizadas, os seguintes locais de enzima de restrição foramadicionados- SalI, XbaI, BamHI, SmaI na extremidade 5' eSacI na extremidade 3' . As seqüências sintetizadas pelofornecedor (GeneArt, Gmbh) foram clonadas no plasmideo depCR-Script. As seqüências resultantes são SEQ ID N°s 156,157, 158, 159; representando ABST original demonocotiledôneas SEQ ID N°s 1, 3, 5, 11 respectivamente,conforme descrito na Tabela 3 acima.

EXEMPLO 3

Clonagem de supostos genes de ABST

Os plasmideos de PCR Scriptabrigando os genes sintéticos de ABST com base emmonocotiledôneas foram digeridos com as endonucleases derestrição XbaI e SacI (Roche) . 0 fragmento resultante foipurificado utilizando o Kit de Extração de Gel (Qiagen,Alemanha) e ligado utilizando a enzima de ligase T 4 DNA(Roche) no vetor de expressão da planta pKG(NOSter), (SEQ IDN0 136), removido com as mesmas enzimas. 0 plasmideo pKG écom base na espinha dorsal PCR Script, com diversasalterações no local de polylinker para facilitar a clonagemdos genes de interesse a jusante a um promotor e a montantea um terminador adequado para expressão nas células daplanta. Como resultado, o gene inserido, junto com opromotor e o terminador podem ser facilmente movimentados aum vetor binário.

Os supostos genes de abrigo depKG(NOSter) resultante das monocotiledôneas' de ABST foramintroduzidos às células competentes de DH 5 do E. coli poreletroporação, utilizando um eletroporador MicroPulser(Biorad), cadinhos de 0,2 cm (Biorad) e programa deeletroporação de EC-2 (Biorad). As células tratadas foramcultivadas em meio liquido LB em 37 0C por 1 h, entãolaminadas em ágar LB complementado com ampicilina (100 mg/L)e incubadas em 37 0C por 16h. As colônias que sedesenvolveram no meio seletivo foram analisadas por PCRutilizando os primers da SEQ ID N0 132 e SEQ ID N0 133, queforam projetados para transpor a seqüência inseridos nosplasmideos de pKG. Os produtos resultantes de PCR foramseparados em géis de agarose a 1 % e as colônias "positivasde PCR" rotuladas e ainda cultivadas. 0 DNA a partir dascolônias positivas foi isolado utilizando (Qiagen) eseqüenciado utilizando o seqüenciador ABI 377 (AmershamBiosciences Inc) de modo a verificar a falta de mutações naseqüência final.

A seqüência do promotor deAt 6 6 69 (estabelecida em SEQ ID N0: 121) foi inserida emtodos os plasmideos de pKG(NOSter) que abrigam os supostosgenes de ABST de monocotiledôneas utilizando as enzimas derestrição HindIII e SalI (Roche). As colônias foramanalisadas por PCR utilizando os primers SEQ ID N°: 138 eSEQ ID N°: 133. Os plasmideos positivos foram identificados,isolados e seqüenciados, conforme acima descrito.

EXEMPLO 4

Geração de vetores binários compreendendo supostos genes deABST de monocotiledôneas e promotores de planta para acionarsua expressão

Geração de vetores binárioscompreendendo o promotor de At6669: As quatro construções depKG(At6669 +NOSter) abrigando os supostos genes de ABST demonocotiledôneas a jusante da seqüência do promotor deAt 6 669 (estabelecido na SEQ ID N0: 121), e a montante doterminador da Nopalina-Sintetase (NOS), foram digeridas comHindIII e EcoRI (Roche), com a finalidade de remover oscassetes de expressão que estavam ligados no plasmídeo depGI digerido com as mesmas endonucleases de restrição. Nogeral, quatro construções de pGI foram geradas, cada 'umacompreendendo o promotor de At6669 posicionado a montante deum suposto gene de ABST de Monocotiledôneas com umaseqüência estabelecida na SEQ ID N°: 1,3,5, ,11.

0 plasmideo pPI foi construídoao inserir uma seqüência de sinal poli-(A) sintético,originando-se a partir do vetor de plasmídeo básico de pGL3(Promega, Conta N0 U47295; bp 4658-4811) no local derestrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech, ContaN0 U12640) . Em alguns casos, o plasmídeo binário de espinhadorsal utilizado foi o pGI, o qual é semelhante ao pPI,porém o gene de GUS foi substituído pelo gene GUS-Intron(Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990).

0 promotor de At6669 foiisolado a partir do DNA genômico.Arabidopsis thaliana varColO por amplificação de PCR utilizando os primersestabelecidos na SEQ ID N°s: 134 e 135. 0 produto de PCR foipurificado (Qiagen, Alemanha) e digerido com asendonucleases de restrição HindIII e SalI (Roche). Aseqüência de promotor resultante foi introduzida no vetor depPI binário aberto digerido com as mesmas enzimas, paraproduzir o plasmídeo de pPI+At6669.

EXEMPLO 5

Transformação das células de Agrobacterium tumefaciens comos vetores binários abrigando os supostos genes de ABST demonocotiledôneas

Cada um dos vetores bináriosdescrito no Exemplo 4 acima foi utilizado para transformaras células de Agrobacterium. Duas construções bináriasadicionais, com o gene relator de Luciferase substituindo ogene de ABST de Monocotiledôneas (posicionado a jusante dopromotor de 35S ou promotor de At6669), foram utilizadascomo controles negativos.

Os vetores binários foramintroduzidos nas células competentes de Agrobacteriumtumefaciens GV301 ou LB4404 (cerca de IO' células/mL) poreletroporação. A eletroporação foi efetuada ao utilizar umeletroporador MicroPulser (Biorad), cadinhos de 0,2 cm(Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). Ascélulas tratadas foram cultivadas em meio liquido LB em 280C por 3 h, então laminadas em ágar de LB complementado comgentamicina (50 mg/L; para cepas de Agrobacterium GV301) ouestreptomicina (300 mg/L; para cepa de Agrobacterium LB4404)e canamicina (50 mg/L) em 28 0C por 48 h. As colônias deAbrobacterium que se desenvolveram no meio seletivo foramanalisadas por PCR utilizando os primers estabelecidos naSEQ ID N°s: 132 e 138, que foram projetados para transpor aseqüência inserida no plasmídeo de pPI . Os produtosresultantes de PCR foram isolados e seqüenciados conformedescrito no Exemplo 4 acima, de modo a verificar que asseqüências corretas de ABST foram adequadamente introduzidasàs células de Agrobacterium.

EXEMPLO 6

Transformação das plantas de Arabidopsis thaliana comsupostos genes de ABST de monocotiledôneas

As plantas de Arabidopsisthaliana Columbia (plantas T,,) foram transformadasutilizando o procedimento de Imersão Floral descrito porClough e Bent (10) e por Desfeux et al. (11), com pequenasmodificações. Brevemente, as Plantas Tn foram semeadas empotes de 250 ml preenchidos com mistura de crescimento combase em turfa úmida. Os potes foram cobertos com papel dealumínio.e uma cúpula de plástico, mantido em 4o C por 3-4dias, ' então descobertos e incubados em uma câmara decrescimento em 18-24 0C sob 16/8 h de ciclos de luz/escuro.As plantas Tn estavam prontas para transformação seis diasantes da antese.

As colônias únicas deAgrobacterium transportando as construções binárias foramgeradas conforme descrito no Exemplo 5 acima. As colôniasforam cultivadas no meio de LB complementado com canamicina(50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foramincubadas em 28 0C por 48 h sob agitação vigorosa e entãocentrifugadas, em 4000 rpm por 5 minutos. As pelotascompreendendo as células de Agrobacterium foram novamentesuspensas em um meio de transformação contendo Murashige-Skoog (Duchefa) de diluído pela metade (2,15 g/L); 0,044 μΜde benzilaminopurina (Sigma); 112 pg/L de vitaminas B5Gambourg (Sigma); 5% de sacarose; e 0,2 ml/L de Silwet L-77(OSI Specialists, CT) em água dupla destilada, no pH de 5,7.

A transformação das plantas T1,foi efetuada pela inversão de cada planta em uma suspensãode Agrobacterium, de modo que o tecido da planta acima daterra foi submergido por 3-5 segundos. Cada planta T,,inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja deplástico, então coberta para manter a umidade e foi mantidano escuro em temperatura ambiente por 18 h, para facilitar ainfecção e transformação. As plantas transformadas(transgênicas) foram então descobertas e transferidas a umaestufa para recuperação e maturação. As plantas T,,transgênicas foram cultivadas na estufa por 3-5 semanas, atéas síliquas ficarem marrons e secas. As sementes foramcolhidas das plantas e mantidas em temperatura ambiente atéa semeadura.

Para gerar as plantastransgênicas Ti e T2 que abrigam os genes, as sementescoletadas a partir das plantas transgênicas Tn foramesterilizadas na superfície através de imersão em etanol a70 Ti por 1 minuto, seguido por imersão em hipoclorito desódio a 5 % e triton a 0,05% por 5 minutos. As sementesesterilizadas na superfície foram totalmente lavadas em águadestilada estéril contendo Murashige-Skoog diluído pelametade (Duchefa) ; sacarose a 2%; ágar de planta a 0,8%;canamicina a 50 mM; e carbenicilina a 200 mM (Duchefa) . Asplacas de cultura foram incubadas em 4 0C por 48 horas,então transferidas a uma sala de crescimento em 25 0C poruma semana adicional de incubação. As plantas vitais T1 deArabidopsis foram transferidas às placas de cultura frescapor outra semana de incubação. Após a incubação, as plantasTi foram removidas das placas de cultura e plantadas emmistura de crescimento contida em potes de 250 ml. Asplantas transgênicas foram permitidas para crescer em umaestufa até a maturidade. As sementes colhidas aplantas T1 foram cultivadas e crescidas até acomo plantas T;.: sob as mesmas condições conformepara cultivação e crescimento das plantas T1 .

EXEMPLO 7

Avaliação da germinação das plantas transgênicassob as condições de estresse abiótico

A tolerância à salinidade ouestresse osmótico tem o objetivo de identificar os genes queconferem melhor germinação, vigor da muda ou crescimento emalto sal, seca ou combinação dos mesmos ou outros estressesambientais. As plantas diferem em sua tolerância ao sal(NaCl) dependendo de sua etapa de desenvolvimento, portanto,as respostas de germinação de semente, vigor da muda ecrescimento são avaliadas.

Um teste de tolerância típicaà salinidade é efetuado ao obter as plantas em diferentesetapas de desenvolvimento e irrigá-las com concentraçõespartir das maturidade utilizadas cultivadascrescentes de NaCl (por exemplo 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400mM) . As plantas transgênicas são comparadas às plantas decontrole em sua aparência fenotípica externa, grau dedefinhamento e sucesso geral para atingir a maturidade eprogênie de rendimento em concentrações inibitórias àsplantas de controle. Os parâmetros quantitativos datolerância medida são conforme o caso anterior, o peso secoe úmido médio e o peso das sementes de rendimento, o tamanhomédio das sementes e o número de sementes produzidas porplanta. Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaiosde MaCl e manitol) são conduzidos para determinar se umfenótipo tolerante ao estresse osmótico é especifico ao NaClou se é um fenótipo geral relacionado ao estresse osmótico.As plantas tolerantes ao estresse osmótico são, de modogeral, mais tolerantes às condições de seca, salinidade eresfriamento e, portanto, são altamente valiosas em termosde traços agronômicos.Métodos:

0 método utilizado para testaras plantas com relação à tolerância melhorada ao estresseabiótico inclui o teste de germinação e crescimento da mudasob condições adversas, tais como alta salinidade e altaosmose.

Ensaio de germinação - Ostestes de germinação comparam a porcentagem das sementes apartir das plantas transgênicas que poderia concluir oprocesso de germinação (protuberância da radicula a partirdo revestimento da semente e abertura completa doscotilédones) para a porcentagem de sementes a partir dasplantas de controle tratadas da mesma forma. A avaliação dagerminação e vigor da muda é conduzida por três semanas apósa plantação. Para medir a germinação e crescimento da muda,sementes das plantas T2 são esterilizadas na superfície eindividualmente semeadas nas placas quadradas de ágarcontendo, por exemplo, meio basal solidificado complementadocom alta salinidade (por exemplo, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400mM) ou alta osmose (por exemplo, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400mM de manitol). O meio basal é o meio de Murashige-Skoog a50 V: (MS) + vitaminas complementadas com ágar de planta a0,8 v. na qualidade de agente de solidificação. Após aseméadura, as placas são transferidas por 2-3 dias em 4 "Cpara estratificação e então cultivadas por três semanas.

Para seguir a germinação ecrescimento em condições adversas, as placas sãoselecionadas manual ou automaticamente e o tamanho de plantaé determinado. Cinco a dez eventos independentes detransformação podem ser analisados a partir de cadaconstrução. As plantas que expressam os genes destainvenção são comparadas às plantas de controlesemeadas nas mesmas placas sob as mesmas condições oupara a medição média de todas as construções, sementes eeventos semeados.

EXEMPLO 8

Avaliação do crescimento da planta transgênica sob condiçõesde estresse abiótico

Métodos:Resistência e análise ao estresse - Um experimentocomplementar realizado com mudas segue a tolerância daplantas às condições adversas. As sementes esterilizadas nasuperfície são semeadas no meio basal [meio de Murashige-Skoog a 50' % (MS) + vitaminas complementadas, com ágar deplanta a 0,8% na qualidade de agente de solidificação] napresença da canamicina (para _as plantas transgênicas) ou emsua ausência (para as plantas de controle do tipo selvagem).Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2-3 diasem 4 °C para estratificação e então cultivadas em 25 'C sobciclos diários de luz de 23 horas e escuro de 1 hora por 7 a10 dias. Nesse ponto de tempo, as mudas aleatoriamenteescolhidas foram cuidadosamente transferidas às placascontendo as condições de alta salinidade (NaCl a 150 mM) oucondições que.são semelhantes à alta osmolaridade encontradadurante a seca (manitol a 210 mM) . 0 crescimento da plantafoi seguido como uma função de tempo utilizando a formaçãode imagem digital. Para seguir o crescimento da planta emcondições adversas, as plantas foram fotografadas no dia emque foram transferidas às condições de estresse (Dia 0) . Asfotos foram subseqüentemente tiradas a cada poucos dias apóstransferir as plantas à condição de estresse e até 12 diasapós a transferência. 0 tamanho da planta foi determinado apartir das fotos digitais tiradas. O software ImageJ foiutilizado para quantificar o tamanho da planta a partir dasfotos digitais (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Os scriptsproprietários foram projetados para analisar o tamanho dasplantas individuais como uma função do tempo. A Figura 1mostra a metodologia utilizada para a quantificação da áreade imagem. Cinco a dez eventos independentes detransformação foram analisados a partir de cada construção epelo menos 6 plantas aleatoriamente selecionadas a partir decada evento foram analisadas em cada experimento deestresse. As plantas que expressam os genes a partir destainvenção foram comparadas às plantas de controle semeadasnas mesmas placas de indução do estresse (controlesinternos) ou à medição média de todas as plantas de controleusadas no mesmo experimento (todos os controles).

Análise estatística - Paraidentificar os genes que conferem tolerância às plantasdemonstrando diferenças significativas, os dados de área deplanta foram analisados utilizando o programa deestatísticas JMP (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary,NC, EUA). Um ANOVA unidirecional (ANalysis Of VAriance[Análise de Variância]) foi utilizado com a finalidade dedetectar a variação entre os diferentes genes (populações deeventos independentes) e plantas de controle e identificaras construções e ventos demonstrando desempenho destacadosestatisticamente diferentes. Para o gene versus análise decontrole, um teste t de Students foi empregado, utilizando asignificância de p<0,05. Com a finalidade de encontrareventos de transformação diferentes significativamentediferentes com área de planta aumentada, o teste Tukey's HSD(Honestly Significantly Different [Diferente de FormaHonesta e Significativa]) foi empregado utilizando asignificância de p<0,05. 0 ANOVA bidirecional foi usado paraidentificar os eventos que demonstraram diferençassignificativas na área de planta em determinados pontos dodia, comparado à área média das plantas de controlecrescendo nas mesmas placas ou em todas as placas do mesmoexperimento. O teste t de Student foi utilizado, paracomparar os eventos independentes de transformação para asplantas de controle.Resultados:

Com a finalidade deidentificar os genes que fornecem tolerância à salinidade ouosmose, as plantas T2 foram geradas a partir de 5 a 10eventos transgênicos independentes a partir de cadaconstrução. As sementes foram coletadas a partir das plantasT2 e as plantas produzidas a partir dela foram analisadas.Conforme acima detalhado, as plantas foram semeadas em ummeio seletivo em que as plantas transgênicas são capazes deempenho (canamicina) e após 7-10 dias (4-6 etapas de folha)as plantas foram transferidas a um meio de produção doestresse: alta salinidade (150 mM) ou alta osmose (manitol a210 mM) . O tamanho de planta foi analisado desde o dia. datransferência e até 12 dias após isso. O teste t de Studente teste Tukey HSD foram utilizados para identificar oseventos que demonstram desempenho destacado comparado àsplantas do tipo selvagem.

Os resultados das plantastransgênicas que expressam a SEQ ID N°s 156, 157, 158, 159,representam o ABST de monocotiledôneas originais SEQ ID N°s1, 3, 5, 11 respectivamente, conforme descrito na Tabela 4.acima sob o promotor de At6669 (Seq ID 121) sãodemonstrados. As diferenças significativas foram encontradasna capacidade das plantas transgênicas de crescer napresença do estresse de alta salinidade estresse e/ouestresse de al.ta osmose. A Tabela 5 abaixo resume os achadosdos eventos destacados que conferem a tolerância ao estresseosmótico em comparação com as plantas de controle. Asdiversas construções incluídas neste pedido fornecem àsplantas transgênicas uma capacidade melhorada de resistiraos estresses abióticos.

Conforme demonstrado, 4 de 5eventos de transformação que expressam a SEQ ID 156demonstram tolerância significativamente melhorada à osmose,conforme julgada pela capacidade das plantas transgênicas decontinuar a desenvolver da mesma forma em alta concentraçãode osmose (vide Tabela 5, linhas 1-5). Os resultados obtidospara a SEQ ID 156. também são demonstrados na Figura 2. Nopainel A são demonstradas as imagens processadas tiradas nodia 0, 5 e 12 a partir da placa que continha as plantastransgênicas e plantas de controle. 0 painel B demonstra aárea média de planta dos diferentes eventos nos· diferentespontos de tempo. Os eventos 1, 2, 3 e 4 sãosignificativamente mais tolerantes ã osmose (p<0,05). Outrasconstruções desse pedido também protegem as plantas dosefeitos de alta osmose. Novamente, quatro de cinco eventosindependentes .transformação que expressam a SEQ ID 159demonstraram capacidade aumentada significativa para crescersob condições de alta osmose (Tabela 5 abaixo, linhas 6-10).Além disso, um dos eventos que expressam a SEQ ID 158demonstrou tolerância significativamente alta à alta osmosedo que suas plantas de controle correspondente.Tabela 5

Meio de LS. das plantas transgênicas T2 de Arabidopsiscultivadas na presença de 210 mM de manitol

<table>table see original document page 76</column></row><table>

Os resultados dos testes detolerância à salinidade estão resumidos na Tabela 6 abaixo.Conforme detalhado na Tabela 6 (linhas 1-4), três eventostransgênicos independentes com uma construção contendo a SEQID 156 exibiram uma tolerância significativamente mais altaao estresse de salinidade do que as plantas de controle noexperimento (p<0,05). Os resultados semelhantes foramobtidos com as plantas que expressam a SEQ ID 159. Da mesmaforma nesse caso, três diferentes eventos transgênicosdemonstraram tolerância aumentada significativa ao estressede salinidade comparado a suas plantas de controlecomparáveis (vide Tabela 6, linhas 5-9).Tabela 6

Meio de LS de plantas transgênicas T^ Arabidopsis cultivadasna presença de 150 mM de NaCl

<table>table see original document page 77</column></row><table>

Os experimentos independentesque avaliam a capacidade das construções de fornecer atolerância à salinidade e alta osmose foram realizados comoparte desse estudo. Foi averiguado que os genes protegem asplantas transgênicas contra os efeitos deletérios de ambosos estresses. Considerados em conjunto, os resultadosclaramente demonstraram a capacidade dos genes e construçõesincluídos, neste pedido para fornecer tolerância ao estresseabiótico.

EXEMPLO 9

Avaliar as alterações naarquitetura de raiz devido à expressão dos genes de ABST demonocotiledôneas

Muitos .traços chave naagricultura moderna podem ser explicados na arquitetura daraiz. O tamanho e profundidade da raiz correlacionam-se àtolerância à seca e eficiência do uso de fertilizante. Ossistemas de raiz mais profunda podem acessar a águaarmazenadas em camadas mais profundas do solo. De formasemelhante, um sistema de raiz altamente ramificada fornecemelhor cobertura do solo e, portanto, pode efetivamenteabsorver todos os macro e micronutrientes disponíveis,resultando em eficiência melhorada do uso de fertilizante.Para testar se as plantas transgênicas produzem umadiferente estrutura de raiz, as plantas são , cultivadas emplacas de ágar colocadas verticalmente. As placas sãofotografadas a cada poucos dias e o tamanho, comprimento eárea cobertos pelas raízes de planta são avaliados. A partirde cada construção criada, diversos eventos independentes detransformação são verificados. Para avaliar as diferençassignificativas entre as características de raiz, é possívelaplicar o ANOVA unidirecional e bidirecional utilizando oteste t de Students ou teste de Tukey HSD para identificaros eventos que demonstram as características destacadas deraiz e para fornecer um escore estatístico para os achados(vide Exemplo 8 acima).

EXEMPLO 10

Biomassa Aumentada das plantas transgênicas da presenteinvenção

As plantas transgênicas Ti ouT2 geradas conforme acima descrito são individualmente"transplantadas em potes contendo uma mistura de crescimentode turfa e . vermiculita (proporção de volume 3:2,respectivamente). Os potes são cobertos pelo período de 24 hpara endurecimento, então colocados na- estufa em ordemaleatória completa e irrigados com água potável (fornecidana parte inferior dos potes a cada 3-5 dias) por sete dias.Após isso, metade das plantas é irrigada com uma solução desal (100 mM de NaCl e 5 mM de CaCl.-?) para induzir o estressede salinidade (condições de estresse). A outra metade dasplantas continua a ser irrigada com água potável (condiçõesnormais). Todas as plantas são cultivadas na estufa em 100 V>de RH por 28 dias, então colhidas (o tecido acima da terra)e pesadas (imediatamente ou após a secagem no forno em 50'Cpor 2 4 h).

É apreciado que determinadascaracterísticas da invenção, que são, para clareza,descritas no contexto de configurações separadas, tambémpodem ser fornecidas em combinação em uma únicaconfiguração. De forma oposta, diversas características dainvenção, que são, para brevidade, descritas nocontexto de uma única configuração, também podem serfornecidas separadamente ou em qualquer subcombinaçãoadequada.

Embora a invenção tenha sidodescrita em conjunto com suas configurações específicas, éevidente que muitas alternativas, modificações e variaçõesserão aparentes para aqueles com habilidade na técnica. Deforma correspondente, têm-se a intenção de abranger todas astais alternativas, modificações e variações que fiquemdentro do espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.Todas as publicações, patentes, pedidos de patente eseqüências identificados por seus números de acessãomencionados nesta especificação são aqui incorporados em suatotalidade por referência na especifica, na mesmamedida como se cada publicação, patente, pedido depatente ou seqüência individual identificado por seunúmero de acessão tenha sido especifica eindividualmente indicado para ser incorporado nopresente por . referência. Além disso, a citação ouidentificação de qualquer referência neste pedidonão será interpretada como uma admissão de que talreferência está disponível como técnica anterior da presenteinvenção.

REFERÊNCIAS MENCIONADAS(Referências adicionais são abaixo mencionadas)

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2 . www . f ao . org/ag/agl/aglw/watermanagement/introduc . strri

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4. Flowers TJ, Yeo' Ar (1995) . Cultivação para resistência àsalinidade nas plantas de safra: para onde agora? Aust JFisiol. de Planta 22:875-884.

5. Nguyen BD, Brar DS, Bui BC, Nguyen TV, Pham LN, Nguyen HT(2003). Identificação e mapeamento de QTL para tolerância aoalumínio introgressed [sic] a partir de nova fonte, ORYZARUFIPOGON Griff., no arroz, indica (Oryza sativa L.).

6.. Theor Appl Genet. 106:583-93.7. Sanchez AC, Subudhi PK, Rosenow DT, Nguyen HT (2002).Mapeamento de QTLs associado com resistência à seca no sorgo

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8. Quesada V, Garcia-Martinez S, Piqueras P, Ponce MR, MicolJL (2002) . Arquitetura genética da tolerância ao NaCl em

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9. Apse MP, Blumwald E (2002) . Engenharia de tolerância aosal nas plantas. Curr Opin Biotechnol. 13:146-150.

10. Rontein D, Basset G, Hanson AD (2002). Engenhariametabólica do acúmulo osmoprotetor nas plantas. Eng Metab4 : 49-56

11. Clough SJ, Bent AF (1998). Imersão Floral: um métodosimplificado para transformação mediada por Agrobacterium daArabidopsis thaliana. J de Planta 16:735-43.

12. Desfeux C, Clough SJ, Bent AF (2000). Tecidosreprodutores femininos são o alvo principal da transformaçãomediada por Agrobacterium através do método de imersãofloral de Arabidopsis. Fisiol. de Planta 123:895-904.

Claims (24)

1. "MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO",caracterizado por compreender a expressão dentro da plantade um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptideocom uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % homóloga àSEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-119, 127-131, 139-154 ou155, assim aumentando a tolerância da planta ao estresseabiótico.

2. "MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO", segundo oreivindicado em 1, caracterizado pelo fato de que o referidoestresse abiótico é selecionado a partir do grupoconsistindo em salinidade, privação de água, baixatemperatura, alta temperatura, toxicidade de metal pesado,anaerobiose, deficiência de nutriente, excesso de nutriente,poluição atmosférica e irradiação UV.

3. "MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO", segundo oreivindicado em 1, caracterizado pelo fato de que a referidaplanta é urna planta dicotiledônea.

4. "MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO", segundo Oreivindicado em 1, caracterizado pelo fato de que a referidaplanta é uma planta monodicotiledônea.

5. "MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO", segundo oreivindicado em 1, caracterizado pelo fato de que o referidopolinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindona SEQ ID N°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 122-126, 156-285.

6. "MÉTODO PARA AUMENTAR ABIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA",caracterizado por compreender a expressão dentro da plantade um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeocom uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % homóloga àSEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-119, 127-131, 139-154 ou-155, assim aumentando a biomassa, vigor e/ou rendimento daplanta.

7. "MÉTODO PARA AUMENTAR ABIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA", segundo oreivindicado em 6, ■ caracterizado pelo fato de que areferida planta é uma planta dicotiledônea.

8. "MÉTODO PARA AUMENTAR ABIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA", segundo oreivindicado reivindicado em 6, caracterizado pelo fato deque a referida planta é uma planta monodicotiledônea.

9. "MÉTODO PARA AUMENTAR ABIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA", segundo oreivindicado em 6, caracterizado pelo fato de que o referidopolinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindona SEQ ID N°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 122-126, 156-285.

10. "CONSTRUÇÃO DE ÁCIDONUCLÉICO", caracterizada por compreender uma seqüência deácido nucléico pelo menos 90 % idêntica a uma seqüência denucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo na SEQID N°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 122-126, 156-285 e um promotorcapaz de instruir a transcrição da referida seqüência deácido nucléico em uma célula hospedeira.

11. "CONSTRUÇÃO DE ÁCIDONUCLÉICO", segundo o reivindicado em 10, caracterizada pelofato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

12. "CONSTRUÇÃO DE ÁCIDONUCLÉICO", segundo o reivindicado em 10, caracterizada pelofato de que o referido promotor é um promotor induzivel.

13. "CONSTRUÇÃO DE ÁCIDONUCLÉICO", segundo o reivindicado em 10, caracterizada pelofato de que a referida célula hospedeira é uma célula deplanta.

14. "CÉLULA DE PLANTA",caracterizada por compreender um polipeptídeo exógeno comuma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % homóloga à SEQIDN0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-119, 127-131, 139-154 ou 155.

15. "CÉLULA DE PLANTA",segundo o reivindicado em 14, caracterizada pelo fato de quea referida célula de planta forma uma parte de umaplanta.

16. "MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO", segundo oreivindicado em 1, caracterizado por ainda compreender ocrescimento da planta expressando o referido polinucleotideoexógeno sob o estresse abiótico.

17. "MÉTODO PARA AUMENTAR ATOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UM ESTRESSE ABIÓTICO", segundo oreivindicado em 1, caracterizado pelo fato de que o referidopolipeptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo naSEQIDN0S: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-119, 127-131, 139-155.

18. "MÉTODO PARA AUMENTAR ABIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA", segundo oreivindicado em. 6, caracterizado pelo fato de que o referidopolipeptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo naSEQ ID N0 s: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-119, 127-131, 139-155.

19. "CONSTRUÇÃO DE ÁCIDONUCLÉICO", segundo o reivindicado em 10, caracterizada pelofato de que a referida seqüência de ácido nucléico éselecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID N0S: 1,-3, 5, 7, 9, 11, 122-126, 156-285.

20. "POLIPEPTÍDEO ISOLADO",caracterizado por compreender uma seqüência de aminoácidopelo menos 90 % homóloga a uma seqüência de aminoácidoselecionada, a partir do grupo consistindo na SEQ ID N°s:2,-4, 6, 8, 10, 12, 13-119, 127-131, 139-155.

21. "POLIPEPTÍDEO ISOLADO",segundo o reivindicado em 20, caracterizado pelo fato de quea referida seqüência de aminoácido é selecionada a partir dogrupo consistindo na SEQ ID N°s:2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-119,-127-131, 139-155.

22. "CÉLULA DE PLANTA",segundo o reivindicado em 14, caracterizada pelo fato de quea referida seqüência de aminoácido é selecionada a partir dogrupo consistindo na SEQ ID N°s:2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-119,-127-131, 139-155.

23. "CÉLULA DE PLANTA",caracterizado por compreender um polinucleotideo exógeno,compreendendo uma seqüência de ácido nucléico pelo menos 90homóloga à seqüência de ácido, nucléico, selecionada apartir do grupo consistindo na SEQ ID N°s: 1, 3, 5, 7, 9,-11, 122-126, 156-285. ·

24. "CÉLULA DE PLANTA",segundo o reivindicado em 23, caracterizada pelo fato de quea referida seqüência de ácido nucléico é selecionada apartir do grupo consistindo na SEQ ID N°s:l, 3, 5, 7, 9, 11,-122-126, 156-285.