BRPI0617485B1 - Anticorpo anti-il-13 humano isolado, composição farmacêutica e uso do referido anticorpo - Google Patents

Anticorpo anti-il-13 humano isolado, composição farmacêutica e uso do referido anticorpo Download PDF

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Abstract

<b>região de ligação de antígeno isolada de um anticorpo ou fragmento funcional dele, anticorpo il-3 humano ou humanizado, composição farmacêutica e uso do referido anticorpo<d>a presente invenção refere-se a moléculas de ligação anti-il-1 3 humanas, particularmente anticorpos, e a métodos para uso de moléculas de anticorpo anti-il-13 em diagnóstico ou tratamento de distúrbios relacionados a il-13, tal como asma, dermatite atópica, rinite alérgica, fibrose, doença inflamatória do intestino e linfoma de hodgkin.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO ANTI-IL-13 HUMANO ISOLADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO REFERIDO ANTICORPO.
Campo de Uso
A presente invenção refere-se a membros de ligação específicos, em particular moléculas de anticorpo anti-IL-13 humano e especialmente aqueles que neutralizam a atividade de IL-13. A invenção refere-se ainda a métodos para uso de moléculas de anticorpo anti-IL-13 em diagnóstico ou tratamento de distúrbios relacionados a IL-13, tal como asma, dermatite atópica, rinite alérgica, fibrose, doença inflamatória do intestino e linfoma de Hodgkin.
Antecedentes da Invenção
A interleucina (IL)-13 é uma citocina de 114 aminoácidos com uma massa molecular não-modificada de aproximadamente 12 kDa [McKenzie, A.N. e outros, J. Immunol., 1993.150 (12):p. 5436-44 e Minty,
A. e outros, Nature, 1993.362 (6417): p.248-50]. A IL-13 está mais intimamente relacionada com IL-4 com a qual ela compartilha 30% de similaridade de sequência no nível de aminoácido. O gene de IL-13 humana está localizado no cromossomo 5q31 adjacente ao gene de IL-14. Esta região de cromossomo 5q contém sequências de gene para outras citocinas derivadas de linfócito Th2 incluindo GM-CSF e IL-5, cujos níveis junto com IL-4 foram mostrados se relacionar com severidade de doença em asmáticos e modelos de roedores de inflamação alérgica [Nakamura, Y. e outros, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996 15(5): p. 680-7, Robinson, D.S. e outros, N. Engl. J. Med., 1992.326 (5): p. 298-304, Walker, C. e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1994, 150(4): p. 1038-48, Humbert, M. e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1996, 154(5): p. 1497504, Corrigan, C.J. e A. B. Kay, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 1991.94 (1-4): p.270-1, Bentley, A.M. e outros, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1993].
Embora inicialmente identificada como citocina derivada de linfócito CD4+ Th2, ela também é produzida por células T CD4+ Th1, células NK
Petição 870190000413, de 03/01/2019, pág. 29/32 de linfócitos T CD8+ e populações de não-célula-T tal como mastócitos, basófilos, eosinófilos, macrófagos, monócitos e células musculares lisas da via aérea.
A IL-3 é relatada mediar seus efeitos através de um sistema de receptor que inclui a cadeia α de receptor de IL-4 (IL-4Rot), que pode ela mesma se ligar a IL-4 mas não IL-3, e pelo menos duas outras proteínas de superfície celular, IL-13aRai e IL-13Ra2 [Murata, T. e outros, Int. J. Hematol., 1999.69 (1):p.13-20, Andrews, A.L. e outros, J. Biol. Chem., 2002.277 (48):p.46073-8], IL-13Rcti pode se ligar a IL-13 com pouca afinidade, subsequentemente recrutando IL-4Ra para formar um receptor funcional de alta afinidade que sinaliza [Miloux, B. e outros, FEBS Lett., 1997.401 (2-3): p. 163-6, Hilton, D.J. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 1996.93(1), p. 497-501]. O banco de dados do Genbank lista a sequência de aminoácido e a sequência de ácido nucléico de IL-13Ra-i como NP 001551 e Y10659, respectivamente. Estudos em camundongos deficientes em STAT6 (transdutor de sinal e ativador de transcrição 6) revelaram que IL-13, de uma maneira similar a IL-4, sinaliza utilizando o curso JAK-STAT6 [Kupeiman, D. e outros, J. Exp. Med., 1998. 187 (6): p. 939-48, Nelms, K. e outros, Annu. Rev. Immunol., 1999. 17: p. 701-38]. IL-13Ra2 compartilha 37% de identidade de sequência com IL-13Roti no nível de aminoácido e se liga a IL-13 com alta afinidade [Zhang, J.G. e outros, J. Biol. Chem., 1997.272 (14): p. 9474-80, Caput, D. e outros, J. Biol. Chem., 1996.271 (28): p. 16921-6]. No entanto, IL-13Ra2 tem um filamento citoplásmico mais curto que não tem motivos de sinalização. Células expressando IL-13Rot2 não são responsivas a IL-13 mesmo na presença de IL-4Ra [Kawakami, K. e outros, Blood, 2001.97 (9): p. 2673-9]. É postulado, no entanto, que IL-13Rot2 aja como um receptor de atração regulando o funcionamento de IL-13 mas não IL-14. Isto é apoiado por estudos em camundongos deficientes em IL-13Ra2 cujo fenótipo estava de acordo com responsividade aumentada a IL-13 [Wood, N. e outros, J. Exp. Med., 2003.197 (6): p. 703-709, Chiaramonte, M.G. e outros, J. Exp. Med., 2003.197 (6): p. 687-701]. O banco de dados do Genbank lista a sequência de aminoácido e a sequência de ácido nucléico de IL-13Rot2 como
ΝΡ000631 e Y08768, respectivamente.
Sumário da Invenção
Uma modalidade da invenção aqui provê um anticorpo humano ou humanizado isolado ou fragmento funcional dele com uma região de ligação de antígeno que é específica para a proteína-alvo IL-13 e o anticorpo ou fragmento funcional dele se liga a IL-13. Em uma modalidade relacionada, a ligação a IL-13 é determinada pelo menos pela ligação do receptor de IL-13 na superfície celular prevenindo liberação de mediador inflamatório.
Em ainda outra modalidade, a invenção provê uma região de ligação de antígeno isolada de um anticorpo ou fragmento funcional dele. Em certas modalidades, a região de ligação de antígeno isolada inclui uma região H-CDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada das SEQ ID NOs: 9-10 e variantes conservativas delas. Conforme aqui descrito, as variantes conservativas incluem resíduos de aminoácido em qualquer uma das sequências de aminoácido identificadas. Em uma modalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma região H-CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 e variantes conservativas dela. Em outra modalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma região de H-CDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NOs: 6 e 7 e variantes conservativas delas.
Em outra modalidade, a região de ligação de antígeno isolada é uma região L-CDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NOs: 20-22 e variantes conservativas delas. Em ainda outra modalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma região de L-CDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NOs: 16-18 e variantes conservativas delas. Em ainda outra modalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma região L-CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e variantes conservativas dela.
Em certas modalidades, a região de ligação de antígeno isolada é uma cadeia leve variável tendo uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID 16-22 e variantes conservativas delas.
Em outra modalidade, a região de ligação de antígeno isolada é uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido selecionada de uma a três de SEQ ID 6 10, e uma sequência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de sequência nas regiões de CDR com regiões de CDR tendo SEQ ID NOs: 6-10. Em uma modalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido selecionada de uma a três de SEQ ID NOs: 16-22, e uma sequência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de sequência nas regiões de CDR com as regiões de CDR tendo SEQ ID NOs: 16-22.
Em uma certa modalidade, o anticorpo isolado é uma IgG. Em outra modalidade, o anticorpo isolado é uma lgG1 ou uma lgG4.
Em ainda outra modalidade, a invenção provê um anticorpo humano ou humanizado ou fragmento funcional dele, tendo uma região de ligação de antígeno que é específica para um epítopo de IL-13, e o anticorpo ou fragmento funcional se liga a receptores de superfície de IL-13 em uma célula. Em uma modalidade relacionada, a invenção provê um anticorpo humano ou humanizado ou fragmento funcional dele, tendo uma região de ligação de antígeno que é específica para um epítopo de IL-13 alvo, e o epítopo contém um ou mais resíduos de aminoácido de resíduos de aminoácido 1-112 de IL-13 alvo. Em uma modalidade relacionada, o epítopo é um epítopo conformacional.
Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento funcional é um fragmento de anticorpo Fab ou scFv. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo isolado é uma IgG. Em outra modalidade relacionada, o anticorpo isolado é uma lgG1 ou uma lgG4.
Em outra modalidade, a invenção provê uma composição farmacêutica tendo pelo menos um de qualquer um dos anticorpos acima ou fragmentos funcionais ou variantes conservativas e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável para tal.
Em ainda outra modalidade, a invenção provê um animal transgênico carregando um gene codificando qualquer um dos anticorpos acima ou fragmentos funcionais deles.
Em certas modalidades, a invenção provê um método para tratamento de um distúrbio ou condições associadas à presença de uma céluia tendo um receptor direcionado para IL-13. O método envolve a administração a um indivíduo com necessidade uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições farmacêuticas acima. Em uma modalidade relacionada, o distúrbio ou condição a ser tratado é um distúrbio respiratório.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é asma brônquica, que é uma doença inflamatória persistente comum do pulmão caracterizada por hiper-responsividade das vias aéreas superiores (AHR), superprodução de muco, fibrose e níveis de IgE no soro aumentados. Li e outros, Abstract for pôster submitted at The Americam Thoraic Society Annual Meeting, 2003, Seattle, relataram efeitos de um anticorpo de IL-13 anticamundongo neutralizante em um modelo de camundongo crônico de asma.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é uma Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (COPD). Zheng e outros, J. Clin. Invest., 2000.106 (9): p; 1081-93, demonstraram que superexpressão de IL13 no pulmão do camundongo causou enfisema, produção de muco elevada e inflamação, refletindo aspectos de COPD humana. Níveis de mRNA de IL13 foram mostrados ser maiores em amostras de tecido de autópsia de indivíduos com uma história de COPD quando comparado com amostras de pulmão de indivíduo sem nenhuma doença pulmonar relatada (J. Elias, Oral communication at American Thoracic Society Annual Meeting, 2002). Em outro estudo, níveis aumentados de IL-13 foram demonstrados através de imuno-histoquímica em seções de pulmão periféricas de pacientes COPD [Wardlaw, A.J., Clin. Med., 2001.1 (3): p. 214-8].
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é selecionado de outras doenças e condições inflamatórias ou obstrutivas das vias aéreas superiores tal como dano ao pulmão agudo (ALI), síndrome do desconforto respiratório agudo/adulto (ARDS), dispnéia, inflamação da via aérea alérgica, doença da via aérea pequena, carcinoma de pulmão, síndrome do peito aguda em pacientes com doença de célula falciforme e hipertensão pulmonar, bem como exacerbação de hiper-reatividade das vias aé reas consequente a outra terapia de fármaco, em particular outra terapia de fármaco inalado.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é bronquite de qualquer tipo ou gênese incluindo, por exemplo, bronquite aguda, araquídica, catarral, croupus, crônica ou ftinoide.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado inclui pneumoconiose (uma doença dos pulmões, inflamatória, geralmente ocupacional, frequentemente acompanhada por obstrução das vias aéreas superiores, seja aguda ou crônica, e ocasionada por inalação repetida de pós), de qualquer tipo ou gênese, incluindo, por exemplo, aluminose, antracose, asbestose, calicose, ptilose, siderose, silicose, tabacose e bissinose.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é selecionado de rinite atópica (febre do feno), dermatite alérgica (eczema) e sinusite crônica. Níveis aumentados de IL-13 foram medidos em indivíduos humanos com rinite atópica (febre do feno), dermatite alérgica (eczema) e sinusite crônica. Por exemplo, níveis de IL-13 foram verificados ser mais altos em células de biópsias bronquiais, lavagem do septo e bronco-alveolar (BAL) de asmáticos comparado com indivíduos controle [Humbert, M. e outros, J. Allergy Clin. Immunol., 1997.99 (5): p. 657-65, Kotsimbos, T.C., P. Ernest e Q.A. Hamid, Proc. Assoe. Am. Physicians, 1996.108 (5): p. 368-73, Komai-Koma, M. F.Y Liew e P.C. Wilkinson, J. Immunol., 1995.155 (3): p. 1110-6, Naseer, T. e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997].
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é selecionado de outras condições inflamatórias da pele, por exemplo, psoríase ou lúpus eritematoso.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é doença inflamatória do intestino, tal como colite ulcerativa e doença de Crohn. Heller e outros (2002) Immunity, 17(5):629-38, relatam que neutralização de IL-13 através da administração de IL-13Ra2 solúvel melhorou a inflamação colônica em um modelo de murino de colite ulcerativa humana. Correspondentemente, expressão de IL-13 foi maior em espécies de biópsia retal de pacientes com colite ulcerativa quando comparado com controles.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é selecionado de outras condições fibróticas, tal como esclerose sistêmica, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática ou pulmão fibroide. Níveis aumentados de IL-13 foram medidos no soro de pacientes com esclerose sistêmica [Hasegawa, M. e outros, J. Rheumatol., 1997.24 (2): p. 328-32] e em amostras de BAL de pacientes afetados com outras formas de fibrose pulmonar [Hancock, A. e outros, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1998],
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é fibrose do fígado. Inibição específica de IL-13 através da administração de IL-13Ra2 solúvel ou rompimento do gene de IL-13, mas não ablação de produção de IL-4, preveniu fibrogênese no fígado [Fallon, P.G e outros, J. Immunol., 2000.164 (5): p. 2585-91, Chiaramonte, M.G. e outros, J. Clin. Invest., 1999.104 (6): p. 777-85, Chiaramonte, M.G. e outros, Hepatology, 2001.34(2): p. 273-82].
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é doença de Hodgkin. A doença de Hodgkin é incomum dentre males pelo que a célula Reed-Sternberg neoplástica, frequentemente derivada de células B, forma apenas uma pequena proporção da massa clinicamente detectável. Linhagens de célula derivadas de doença de Hodgkin e células ReedSternberg primárias frequentemente expressam IL-13 e seu receptor [Skinnider, B.F. e outros, Blood, 2001.97(1): p. 250-5]. Como IL-13 promove sobrevivência e proliferação celulares em células B normais, foi proposto que IL-13 podería agir como um fator de crescimento para células ReeSternberg. Skinnider e outros demonstraram que anticorpos de neutralização contra IL-13 podem inibir o crescimento de linhagens de célula derivadas de doença de Hodgkin in vitro [Kappu, U. e outros, J. Exp. Med., 1999.189 (12): p. 1939-46]. Essas constatações sugerem que células Reed-Sternberg poderíam aumentar sua própria sobrevivência por uma alça de citocina autócrina e parácrina de IL-13. De acordo com esta hipótese, níveis aumentados de IL-13 foram detectados no soro de alguns pacientes com doença de Hodking quando comparado com controles normais [Fiumara, P. F., Cabanillas e A. Younes, Blood, 2001.98 (9): p.2877-8], Inibidores de IL-13 podem então prevenir progressão de doença através da inibição da proliferação de células
Reed-Sternberg malignas.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é recorrência ou metástase de tumor. Inibição de IL-13 foi mostrada aprimorar vacinas antivirais em modelos de animal e pode ser benéfica no tratamento de HIV e outras doenças infecciosas [Ahlers, J.D. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2002]. Muitas células de câncer humanas expressam antígenos específicos de tumor imunogênicos. No entanto, embora muitos tumores espontaneamente regridam, vários evadem o sistema imune (imunovigilância) ao suprimir imunidade mediada por célula T. Terabe e outros, Nat. Immunol., 2000.1 (6): p. 515-20, demonstraram um papel de IL-13 em imunossupressão em um modelo de camundongo onde tumores espontaneamente regridem após crescimento inicial e então recorrem. Inibição específica de IL-13, com IL-13Ra2 solúvel, protegeu esses camundongos de recorrência de tumor. Terabe e outros continuaram a mostrar que IL-13 suprime a diferenciação de linfócitos citotóxicos CD8+ específicos de tumor que fazem a mediação de respostas imunes antitumor.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é uma infecção viral respiratória, que exacerba condições crônicas de base tal como asma, bronquite crônica, COPD, otite média e sinusite. A infecção viral respiratória tratada pode ser associada à infecção bacteriana secundária, tal como otite média, sinusite ou pneumonia.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é selecionado de outras doenças ou condições, em particular doenças ou condições tendo um componente inflamatório, por exemplo, doenças do osso e juntas incluindo artrite reumatoide, artrite psoriática e outras doenças tal como aterosclerose, esclerose múltipla e rejeição de aloenxerto aguda ou crônica, por exemplo, seguindo transplante de coração, rim, fígado, pulmão ou medula óssea.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é choque endotóxico, glomerulonefrite, isquemia cerebral e cardíaca, doença de Alzheimer, fibrose cística, infecções por vírus e exacerbações associadas à elas, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), esclerose múltipla (MS), gastrite associada com Helicobacter pylori e cânceres, particularmente o crescimento de câncer ovariano.
Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado são os sintomas causados por infecção viral em um humano que é causada pelo rinovírus humano, outros enterovírus, coronavírus, herpes vírus, vírus influenza, vírus parainfluenza, vírus sincial respiratório ou um adenovírus.
Tratamento de acordo com a presente invenção pode ser sintomático ou profilático.
A eficácia de um agente da invenção na inibição de condições inflamatórias, por exemplo, em doenças das vias aéreas respiratórias, pode ser demonstrada em um modelo de animal, por exemplo, modelo de camundongo, rato ou coelho, de inflamação das vias aéreas ou outras condições inflamatórias, por exemplo, conforme descrito por Wada e outros, J. Exp. Med. (1994) 180:1135-40; Sekido e outros, Nature (1993) 365:654-57; Modelska e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med. (1999) 160:1450-56; e Laffon e outros (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 160:1443-49.
Em ainda outra modalidade, a invenção provê um método para identificação de uma célula tendo um receptor para IL-3. Este método envolve contato da célula com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo acima tendo ainda um marcador detectável. O marcador é radioativo, fluorescente, magnético, paramagnético ou quimioluminescente. O método pode ainda envolver qualquer um dos acima formando imagem ou separando a célula marcada.
Em outra modalidade, qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo humanos ou humanizados acima são sintéticos.
Em outra modalidade, a invenção provê uma composição farmacêutica e um agente terapêutico adicional.
O agente terapêutico adicional pode ser selecionado do grupo consistindo em substâncias de fármaco anti-inflamatório, broncodilatador, anti-histamina ou antitussígeno, particularmente no tratamento de doenças das vias aéreas obstrutivas ou inflamatórias tal como aquelas mencionados aqui anteriormente, por exemplo, como potencializadores de atividade tera pêutica de tais fármacos ou como um meio de redução da dosagem requerida ou efeitos colaterais potenciais de tais fármacos. Um agente terapêutico da invenção pode ser misturado com a outra substância de fármaco em uma composição farmacêutica fixa ou ele pode ser administrado separadamente, antes, simultaneamente com ou após a outra substância de fármaco. Deste modo a invenção inclui uma combinação de um agente da invenção conforme aqui anteriormente descrito com uma substância de fármaco antiinflamatório, broncodilatadora, anti-histamina ou antítussígeno, o dito agente da invenção e a dita substância de fármaco estando na mesma composição farmacêutica ou uma diferente.
Fármacos anti-inflamatórios adequados incluem esteroides, em particular glucocorticosteroides tal como budenosida, dipropionato de beclametasona, propionato de fluticasoina, ciclesonida ou furoato de mometasona ou esteroides descritos nos WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (especialmente aqueles dos Exemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 e 101), WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 e WO 04/66920; agonistas de receptor de glucocorticoide não-esteroidais, tais como aqueles descritos nos DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 eWO 04/26248; antagonistas de LTB4 tal como BIIL 284, CP- 195543, DPCI 1870, LTB4 etanolamida, LY 293111, LY 255283, CGS025019C, CP- 195543, ONO-4057, SB 209247, SC-53228 e aqueles descritos na US 5451700; tais antagonistas de LTD4 incluem montelucaste, pranlucaste, zafírlucaste, accolate, SR2640, Wy48,252, ICI 198615, MK-571, LY-171883, Ro 24-5913 e L-648051; inibidores de PDE4 tal como cilomilast (Ariflo® GlaxoSmithKline), Roflumilast (Byk Gulden), V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (ScheringPlough), Arofilina (Almirall Prodesfarma), PDI 89659 / PD168787 (ParkeDavis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (Celgene), SelCID(TM) CC10004 (Celgene), VM554/UM565 (Vemalls), T-440 (Tanabe), KW-4490 (Kyowa Hakko Kogyo) e aqueles descritos nos WO 92/19594, WO 93/19749,
WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945, WO 04/045607 e WO 04/037805; agonistas de A2a tal como aqueles descritos nos EP 1052264, EP 1241176, EP 409595A2, WO 94/17090, WO 96/02543, WO 96/02553, WO 98/28319, WO 99/24449, WO 99/24450, WO
99/24451, WO 99/38877, WO 99/41267, WO 99/67263, WO 99/67264,WO
99/67265, WO 99/67266, WO 00/23457, WO 00/77018, WO 00/78774,WO
01/23399, WO 01/27130, WO 01/27131, WO 01/60835, WO 01/94368,WO
02/00676, WO 02/22630, WO 02/96462 e WO 03/086408; e antagonistas de
A28 tal como aqueles descritos no WO 02/42298.
Fármacos broncodilatadores adequados incluem agentes anticolinérgicos ou antimuscarínicos, em particular brometo de ipatrópio, brometo de oxitrópio, sais de tiotrópio e CHF 4226 (Chiesi) e glicopirrolato, mas também aqueles descritos nas EP 424021, US 3714357, US 5171744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 e WO 04/05285; e agonistas de adrenoceptor beta-2 tal como albuterol (salbutamol), metaproterenol, terbutalina, salmeterol fenoterol, procaterol e especialmente formoterol, carmoterol e seus sais farmaceuticamente aceitáveis e compostos (em forma de sal livre ou solvato) de fórmula I do WO 00/75114, documento que é aqui incorporado a título de referência, de preferência compostos dos seus Exemplos, especialmente um composto de fórmula
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isto é, (5-[(R)-2-(5,6-Dietil-indan-2-ilamino)-1 -hidróxi-etil]-8-hidróxi-1 H-quinolin -2- ona) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como compostos (na forma livre ou sal ou solvato) de fórmula I do WO 04/16601, e também compostos dos EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035,
US 2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/ 70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO
04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618 WO 04/46083 , WO 04/80964,
EP1460064, WO 04/087142, WO 04/089892, EP 01477167, US 2004/
0242622, US 2004/0229904, WO 04/108675, WO 04/108676, WO 05/033121,
WO 05/040103 e WO 05/044787.
Fármacos anti-inflamatórios e broncodilatadores duplos adequados incluem agonistas de adrenoceptor beta-2 /antagonistas muscarínicos duplos tal como aqueles descritos nos US 2004/0167167, WO 04/74246 e WO 04/74812.
Substâncias de fármaco anti-histamina adequadas incluem cloridrato de cetirizina, acetaminofeno, fumarato de clemastina, prometazina, loratidina, desloratidina, cloridrato de difenilidramina e fexofenadina, activastina, astemizol, azelastina, ebastina, epinastina, mizolastina e tefenadina bem como aquelas reveladas nos JP 2004107299, WO 03/099807 e WO 04/026841.
Combinações de agentes terapêuticos da invenção e agentes anticolinérgicos ou antimuscarínicos, esteroides, agonistas de beta-2, inibidores de PDE4, agonistas de receptor de dopamina, antagonistas de LTD4 ou antagonistas de LTB4 podem ser também usadas. Outras combinações úteis dos agentes da invenção com fármacos anti-inflamatórios são aquelas com outros antagonistas de receptores de quimiocina, por exemplo, CCR-1, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 e CCR10, CXCR11, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5 tal como antagonistas da Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 e SCHD, antagonistas Takeda tal como cloreto de N-[[4-[[[6,7-di-hidro-2-(4metilfenil)-5H-benzociclo-hepten-8-il]carbonil]amino]fenil]-metil]-tetra-hidroN,N-dimetil-2H-piran-4-amino (TAK-770), antagonistas de CCR-5 descritos na US 6166037 (particularmente reivindicações 18 e 19), WO 0066558 (particularmente reivindicação 8), WO 0066559 (particularmente reivindicação 9),
WO 04/018425 e WO 04/026873.
O agente terapêutico adicionai pode ser também seiecionaao do grupo consistindo em outras moléculas de ligação de citocina, particularmente anticorpos de outras citocinas, em particular uma combinação com um anticorpo anti-IL4, tal como descrito no PCT/EP2005/00836, e anticorpo antiIgE, tal como Xolair®, um anticorpo anti-IL31, um anticorpo anti-IL-31R, um anticorpo anti-TSLP, um anticorpo de receptor anti-TSLP, um anticorpo antiendoglina, um anticorpo anti-IL1b ou outro anticorpo anti-IL13, tal como descrito no WO 05/007699.
Em uma certa modalidade, a invenção provê um anticorpo tendo uma primeira sequência de aminoácido que é uma cadeia pesada selecionada de um a três de SEQ ID NOs: 6-10 e uma sequência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de sequência nas regiões de CDR com as regiões de CDR tendo SEQ ID NOs: 6-10; e uma segunda sequência de aminoácido que é uma cadeia leve selecionada de uma a três de SEQ ID NOs: 16-22 e uma sequência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de sequência nas regiões de CDR com as regiões de CDR mostradas nas SEQ ID NOs: 16-22.
Em ainda outra modalidade, a invenção provê um imunoconjugado feito de um primeiro componente que é um anticorpo ou fragmento dele e um segundo componente tendo uma segunda sequência de aminoácido. Por exemplo, o imunoconjugado é uma citotoxina, ou o imunoconjugado é uma proteína ou anticorpo de ligação tendo uma especificidade de ligação para um alvo que é diferente de IL-13.
Em certas modalidades, a invenção provê um anticorpo biespecífico.
Em outra modalidade, a invenção provê um kit tendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo dele. Em algumas modalidades, o kit contém ainda um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável então. Em outras modalidades relacionadas, o anticorpo no kit está presente em uma dose unitária. Em ainda outra modalidade relacionada, o kit inclui instruções para uso na administração a um indivíduo.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se a anticorpos isolados, particuiarmente anticorpos humanos, que se ligam especificamente a IL-13 e que inibem as propriedades funcionais de IL-13. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são derivados de sequências de cadeia pesadas e leves particulares e/ou compreendem características estruturais particulares tal como regiões de CDR compreendendo sequências de aminoácido particulares. A invenção provê anticorpos isolados, métodos de fabricação de tais anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo tais anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. A invenção refere-se também a métodos de uso dos anticorpos para inibir um distúrbio ou condição associado à presença de IL-13 alvo de receptor celular, por exemplo, no tratamento de uma condição inflamatória ou alérgica, particularmente uma doença da via aérea inflamatória ou obstrutiva.
A fim de que a presente invenção possa ser mais prontamente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são mostradas durante a descrição detalhada.
O termo ‘interleucina-13’ ou ‘IL-13’ é, exceto onde o contexto ditar de outro modo, faz referência a IL-13 humana. A presente invenção provê anticorpos para IL-13 humana, especialmente anticorpos humanos, que são reativos cruzados com IL-13 de primata não-humano, incluindo IL-13 de macaco cinomólogo e rhesus. Anticorpos de acordo com algumas modalidades da presente invenção reconhecem uma variante de IL-13 onde o resíduo arginina na posição de aminoácido 130 é substituído por glutamina. Em outros aspectos e modalidades a presente invenção provê membros de ligação específicos contra IL-13 de murino, especificamente IL-13 de camundongo.
O termo resposta imune refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentando antígeno, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em dano seletivo a, destruição de ou eliminação do corpo humano de patógenos invasores, célu15
Ias ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.
Um curso de transdução de sinal·' refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para uma outra porção de uma célula. Conforme aqui usado, a expressão receptor de superfície celular inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e capazes da transmissão de tal sinal através da membrana de plasma de uma célula. Um exemplo de um receptor de superfície celular da presente invenção é o receptor de IL-13 ao qual a molécula da proteína IL-13 se liga.
O termo anticorpo conforme referido aqui inclui anticorpos integrais e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, porção de ligação de antígeno) ou suas cadeias simples. Um anticorpo de ocorrência natural é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser mais subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e Vl é composta de três CDRs e quatro FRs dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
O termo porção de ligação de antígeno de um anticorpo (ou simplesmente porção de antígeno), conforme aqui usado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade em especificamente se ligar a um antígeno (por exemplo, IL-13). Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento integral. Exemplos de fragmentos de ligação compreendidos dentro do termo porção de ligação de antígeno de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de impedimento; e um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; um fragmento dAb (Ward e outros, 1989, Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR).
Ainda, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam tornados uma cadeia de proteína única onde as regiões VL e VH se emparelham para formarem moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); vide, por exemplo, Bird e outros, 1988, Science 242:423-426; e Huston e outros, 1998 Proc. Natl. Acad. Sei., 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples pretendem também ser compreendidos dentro do termo porção de ligação de antígeno de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas daqueles versados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos.
Um anticorpo isolado, conforme aqui usado, refere-se a um anticorpo que é substancial mente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a IL-13 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos outros que não IL-13). Um anticorpo isolado que especificamente se liga a IL-13 pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos, tal como moléculas de IL-13 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou agentes químicos.
O termo anticorpo monoclonal ou composição de anticorpo monoclonal conforme aqui usado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal mostra uma especificidade de ligação única e afinidade para um epítopo particular.
O termo anticorpo humano, conforme aqui usado, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis onde ambas regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de origem humana. Ainda, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante é também derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de linhagem germinativa humana, ou versões mutadas de sequências de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por metagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo anticorpo humano, conforme aqui usado, não pretende incluir anticorpos onde sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humana.
O termo anticorpo monoclonal humano refere-se a anticorpos mostrando uma especificidade de ligação única que têm regiões variáveis onde ambas regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências humanas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal nãohumano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanos fundidos a uma célula imortalizada.
O termo anticorpo humano recombinante, conforme aqui usado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tal como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossomal para genes de imunoglobulina humanos ou um hibridoma preparado a partir deles, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatorial, recombinante, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de qualquer outro meio que envolva união de todo ou uma porção de um gene de imunoglobulina humano, sequências a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis onde as regiões de estrutura e de CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências Ig humanas for usado, mutagênese somática in vivo) e então as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com sequências VH e VL de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.
Conforme aqui usado, isotipo refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM, IgE, IgG tal como lgG1 ou lgG4) que é codificado pelos genes de região constante de cadeia pesada.
As expressões um anticorpo reconhecendo um antígeno e um anticorpo específico para um antígeno são usadas intercomutavelmente aqui com o termo um anticorpo que se liga especifica mente a um antígeno.
Conforme aqui usado, um anticorpo que se liga especificamente a IL-13 humana pretende se referir a um anticorpo que se liga a IL-13 humana com um Kd de 5 x 10'9 M ou menos. Anticorpo que se liga com cruzamento com um antígeno outro que não IL-13 humana pretende se referir a um anticorpo que se liga a este antígeno com 5 x 10'9 M ou menos. Um anticorpo que não reage com cruzamento com um antígeno particular pre tende se referir a um anticorpo que se liga a este antigeno com um KD de 1,5 x IO’8 M ou mais, ou um KD de 5’10 x 10'8 M ou 1 x 10’7 M ou mais. Em certas modalidades, tais anticorpos que não reagem com cruzamento com o antígeno exibem ligação essencialmente não-detectável contra essas proteínas em ensaios de ligação padrão.
Conforme aqui usado, um anticorpo que iniba a ligação de IL-13 ao receptor de IL-13 refere-se a um anticorpo que inibe a ligação de IL-13 ao receptor com um KD de 5 nM ou menos.
Conforme aqui usado, um anticorpo que inibe a liberação de mediador inflamatório pretende se referira um anticorpo que inibe liberação de eotaxina induzida por IL-13 a partir de fibroblastos de pulmão humano com uma IC50 de menos do que 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1,0 nM, 0,5 nM ou menos.
O termo Kassoc ou Ka, conforme aqui usado, pretende se referir à taxa de associação de uma interação de anticorpo-antígeno particular, enquanto o termo Kdis ou KD, conforme aqui usado, pretende se referir à taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. O termo KD, conforme aqui usado, pretende se referir à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem-estabelecidos na técnica. Um método para determinação do Kd de um anticorpo é através do uso de ressonância de plásmon de superfície, ou usando um sistema biossensor tal como um sistema Biacore®.
Conforme aqui usado, o termo alta afinidade para um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo tendo um KD de 10'8 M ou menos, 10‘9 M ou menos ou 10'10 M ou menos para um antígeno-alvo.
Conforme aqui usado, o termo indivíduo inclui qualquer animal humano ou não-humano. O termo animal não-humano inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamíferos, tal como primatas nãohumanos, ovelha, cachorros, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhes nas subseções que seguem.
Ensaios-padrão para avaliar a capacidade de ligação de anticorpo com relação a IL-13 de várias espécies são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, western blots e RIAs. Ensaios adequados são descritos em detalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos pode também ser avaliada através de ensaios-padrão conhecidos na técnica, tal como através de análise Biacore. Ensaios para avaliar os efeitos dos anticorpos sobre propriedades funcionais de IL-13 são descritos em mais detalhes nos Exemplos.
Deste modo, um anticorpo que inibe uma ou mais dessas propriedades funcionais de IL-13 (por exemplo, atividades bioquímica, imunoquímica, celular, fisiológica ou outras, ou similar) conforme determinado de acordo com metodologias conhecidas na técnica e descritas aqui será compreendido se relacionar com uma diminuição estatisticamente significante na atividade particular com relação àquela vista na ausência do anticorpo (por exemplo, ou quando um anticorpo controle de especificidade irrelevante está presente). Um anticorpo que inibe atividade de IL-13 realiza tal diminuição estatisticamente significante em pelo menos 10% do parâmetro medido, em pelo menos 50%, 80% ou 90%, e em certas modalidades um anticorpo da invenção pode inibir mais de 95%, 98% ou 99% de atividade funcional de IL-13. Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos, isolados e estrutural mente caracterizados, conforme descrito nos Exemplos 1-5. As sequências de aminoácido de VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 6-10, respectivamente. As sequências de aminoácido de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 16-22, respectivamente. Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, ainda tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 de identidade percentual nas regiões de CDR com as regiões de CDR mostradas nas sequências descritas acima.
Uma vez que cada um desses anticorpos pode se ligar a IL-13, as sequências de VH θ VL podem ser misturadas e combinadas para criarem outras moiéculas de iigação anti-iL-13 da invenção. Ligação de IL-13 de tais anticorpos misturados e combinados pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando cadeias de Vh e VL são misturadas e combinadas, uma sequência de Vh de um par Vh/Vl particular deve ser substituída com uma sequência de VH estruturalmente similar. Da mesma maneira, uma sequência de VL de um par VH/VL particular deve ser substituída com uma sequência de VL estruturalmente similar. As sequências de VH e VL dos anticorpos da presente invenção são particularmente condescendentes à mistura e combinação, uma vez que esses anticorpos usam sequências de Vh e Vl derivadas das mesmas sequências de linhagem germinativa e então exibem similaridade estrutural.
Em outro aspecto, a invenção provê anticorpos que compreendem as CDR1s, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e cadeia leve dos anticorpos, ou combinações delas. As sequências de aminoácido da CDR1s de VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 6-7. A sequência de aminoácido das CDR2s de VH dos anticorpos é mostrada na SEQ ID NO: 8. As sequências de aminoácido das CDR3s de Vh dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 9-10. As sequências de aminoácido das CDR1s de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 16-18. As sequências de aminoácido das CDR2s de VL dos anticorpos são mostradas na SEQ ID NO:
19. As sequências de aminoácido das CDR3s de Vl dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 20-22. As regiões de CDR são delineadas usando o sistema Kabat (Kabat, E.A. e outros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH NQ 91-3242).
Dado que cada um desses anticorpos pode ser ligar a IL-3 e que a especificidade de ligação de antígeno é provida principalmente pelas regiões CDR1,2 e 3, as sequências de CDR1, 2 e 3 de VH e a sequências CDR1,2 e 3 de VL podem ser misturadas e combinadas (isto é, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo de va conter uma CDR1, 2 e 3 de VH e uma CDR1, 2 e 3 de Vl) para criar outras moléculas de ligação anti-IL-13 da invenção. Ligação de IL-13 de tais anticorpos misturados e combinados pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando sequências de CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de Vh particular deve ser substituída com uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). Da mesma maneira, quando sequências de CDR de VL são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VL particular deve ser substituída com sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). Será prontamente aparente ao versado de habilidade comum na técnica que sequências de VH e VL novas podem ser criadas através da substituição de uma ou mais sequências de região de CDR de Vh e/ou VL com sequências estruturalmente similares das sequências de CDR mostradas aqui para anticorpos monoclonais da presente invenção.
Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno dele tem: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6-7, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9-10; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16-18; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 20-22; onde o anticorpo se liga especificamente a IL-13.
Em uma certa modalidade, o anticorpo consiste em: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 9; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 16; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 19; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 20.
Em outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 10; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 19; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21.
Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:10; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 18; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 19; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 22.
Conforme aqui usado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que são o produto de ou derivadas de uma sequência de linhagem germinativa particular se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem imunização de um camundongo transgênico carregando genes de imunoglobulina humanos com o antígeno de interesse ou avaliação de uma biblioteca de gene de imunoglobulina humano mostrada no fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é o produto de ou derivado de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana pode ser identificado desta maneira através de comparação da sequência de aminoácido do anticorpo humano com as sequências de aminoácido de imunoglobulinas de linhagem germinativa humana e seleção da sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana que é mais próxima em sequência (isto é, % de identidade maior) da sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é o produto de ou derivado de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particuiar pode conter diferenças de aminoácido conforme comparado com a sequência de linhagem germinativa devido, por exemplo, a mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação direcionada ao sítio. No entanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácido a uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácido de imunoglobulina de linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95%, ou até pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácido à sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência de linhagem germinativa humana particular vai mostrar não mais do que diferenças de 10 aminoácidos da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode mostrar não mais do que 5, ou até mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.
Anticorpos homólogos
Em ainda outra modalidade, um anticorpo da invenção tem regiões variáveis de cadeias pesada e leve tendo sequências de aminoácido que são homólogas às sequências de aminoácido dos anticorpos descritos aqui, e onde os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-IL-13 da invenção.
Por exemplo, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno dele, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, onde: a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6-10; a região variável de cadeia ieve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16-22; o anticorpo se liga especificamente a IL-13, e o anticorpo exibe pelo menos uma das propriedades funcionais que seguem: o anticorpo inibe a ligação da proteína IL-13 ao receptor de IL-13 ou o anticorpo inibe a ligação de receptor de IL-13 prevenindo ou melhorando uma condição inflamatória ou alérgica, particularmente uma doença das vias aéreas inflamatória ou obstrutiva, ou o anticorpo inibe ligação de receptor IL-13 prevenindo ou melhorando asma ou o anticorpo inibe ligação de receptor IL-13 prevenindo ou melhorando COPD.
Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais, duas ou mais ou três das propriedades funcionais discutidas acima. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
Em outras modalidades, as sequências de aminoácido de VH e/ou VL podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às sequências mostradas acima. Um anticorpo tendo regiões de VH e VL tendo alta (isto é, 80% ou mais) homologia com as regiões de VH e VL das SEQ ID NOs: 6-10 e 16-22, respectivamente, pode ser obtido através de mutagênese (por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucléico codificando SEQ ID NOs: 6-10 e/ou 16-22, seguido por teste do anticorpo alterado codificado para a função retida (isto é, a função mostrada acima) usando os ensaios funcionais descritos aqui.
Conforme aqui usado, a homologia percentual entre duas sequências de aminoácido é equivalente à identidade percentual entre as duas sequências. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de homologia = Na de posições idênticas/ N- total de posições x 100), levando em consideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzido para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de identidade percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não-limitantes abaixo.
A identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1998) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma falta de comprimento de lacuna (gap lenght penalty”) de 12 e uma falta de lacuna (gap penalty) de 4. Ainda, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol., 48:444-453, 1970) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando ou uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna (gap weight”) de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento (lenght weight”) de 1,2, 3, 4, 5 ou 6.
Adicional ou alternativamente, as sequências de proteína da presente invenção podem ser usadas mais como uma sequência de investigação (query sequence) para realizar uma pesquisa em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul e outros, 1990, J. Mol. Biol., 215:403-10. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavras = 3 para se obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para se obter alinhamentos com lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul e outros, 1997, Nucleic Acid Res. 25(17): 3389-3402. Quando utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros de padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Vide http://www.ncbi.nhn.nih.gov.
Anticorpos com modificações conservativas
Em certas modalidades, um anticorpo da invenção tem uma região variável de cadeia pesada que consiste em sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve consistindo em sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, onde uma ou mais dessas sequências de CDR têm sequências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos descritos aqui ou suas modificações conservativas, e onde os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-IL-13 da invenção. Deste modo, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno dele, consistindo em uma região variável de cadeia pesada consistindo em sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve consistindo em sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, onde: as regiões variáveis de cadeia pesada de CDR1 são sequências consistindo em sequências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 6-7 e suas modificações conservativas; a região variável de cadeia pesada de CDR2 é uma sequência consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, e suas modificações conservativas; a região variável de cadeia pesada de CDR3 são sequências consistindo em sequências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 910 e suas modificações conservativas; as regiões variáveis de cadeia leve de CDR1 são sequências consistindo em sequências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 16-18 e suas modificações conservativas; as regiões variáveis de cadeia leve de CDR2 são uma sequência consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19, e suas sequências conservativas; as regiões variáveis de cadeia leve de CDR3 são sequências consistindo em sequências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 20-22, e suas modificações conservativas; o anticorpo se liga especificamente a IL-13; e o anticorpo inibe ligação de receptor de IL-13 prevenindo liberação de mediador inflamatório.
Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais, duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais listadas discutidas acima. Tais anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
Conforme aqui usado, o termo modificações de sequência conservativas pretende se referir a modificações de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácido. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácido. Modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção através de técnicas padrão conhecidas no campo, tal como mutagênese direcionada a sítio e mutagênese mediada por PCR.
Substituições de aminoácido conservativas são umas onde o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Deste modo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões de CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral, e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida usando os ensaios funcionais descritos aqui.
Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que anticorpos anti-IL-13 da invenção
Em outra modalidade, a invenção provê anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que os vários anticorpos anti-IL-13 da invenção providos aqui. Tais anticorpos adicionais podem ser identificados com base em sua capacidade em competir com cruzamento (por exemplo, inibir competitivamente a ligação de, de uma maneira estatisticamente significante) com outros anticorpos da invenção em ensaios de ligação de IL-13 padrão. A capa cidade de um anticorpo de teste em inibir a ligação de anticorpos da presente invenção a IL-13 humana demonstra que o anticorpo de teste pode competir com este anticorpo para ligação a IL-13 humana; tal anticorpo pode, de acordo com teoria não-limitante, se ligar ao mesmo epítopo ou um relacionado (por exemplo, um estruturalmente similar ou espacialmente proximal) em IL-13 humana como o anticorpo com o qual ele compete. Em uma certa modalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em IL-13 humana que os anticorpos da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoctonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos.
Anticorpos engenheirados e modificados
Um anticorpo da invenção pode ser ainda preparado usando um anticorpo tendo uma ou mais sequências de VH e/ou VL mostradas aqui como material de partida para engenheirar um anticorpo modificado, anticorpo modificado que pode ter propriedades alteradas do anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser engenheirado através da modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentre de uma ou mais regiões de estrutura. Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser engenheirado através de modificação de resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.
Um tipo de engenharia de região variável que pode ser realizada é enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos-alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeias leve e pesada. Por esta razão, as sequências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequência fora das CDRs. Devido ao fato das sequências de CDRs serem responsáveis pela maior parte das interações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos através de construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxertadas nas sequências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. e outros, 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. e outros, 1986, Nature 321:522-525; Queen, C. e outros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:10029-10033; Patente U.S. N5.225.539 para Wintere Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen e outros).
Deste modo, outra modalidade da invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação de antígeno, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6-7; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8; sequências de CDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9-10, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve tendo sequências de CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16-18; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19; e sequências de CDR3 consistindo em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 20-22, respectivamente. Deste modo, tais anticorpos contêm as sequências de CDR VH e VL de anticorpos monoclonais, mas podem conter sequências estruturais diferentes desses anticorpos.
Tais sequências de estrutura podem ser obtidas de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de gene de anticorpo de linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa para genes de região variável de cadeias pesada e leve humanos podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linhagem germinativa humana VBase (disponível na Internet no www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E.A. e outros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N2 91-3242; Tomlinson, I. M. e outros, 1992 J. foi. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. e ou tros, 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836; cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.
Um exemplo de sequências de estrutura para uso nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente similares às sequências de estrutura usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, sequências de consenso e/ou sequências de estrutura usadas por anticorpos monoclonais da invenção. As sequências CDR1, 2 e 3 de VH, e as sequências CDR1, 2 e 3 de VL> podem ser enxertadas nas regiões estruturais que têm a sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linhagem germinativa da qual a sequência de estrutura deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que contêm uma ou mais mutações conforme comparado com as sequências de linhagem germinativa. Por exemplo, foi constatado que em certos casos é benéfico mudar resíduos dentro das regiões de estrutura para manter ou aumentar a capacidade de ligação a antígeno do anticorpo (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen e outros).
Outro tipo de modificação de região variável é mutar resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para então melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecida como maturação de afinidade. Mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo conforme aqui descrito e provido nos Exemplos. Modificações conservativas (conforme acima discutido) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácido. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.
Deste modo, em outra modalidade, a invenção provê anticorpos monoclonais anti-IL-13 isolados, ou suas porções de ligação de antígeno, consistindo em uma região variável de cadeia pesada tendo: uma região
CDR1 de VH consistindo em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo tendo SEQ ID NOs: 6-7 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido conforme comparado com SEQ ID NOs: 6-7; uma região CDR2 de VH tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido conforme comparado com SEQ ID NO: 8; uma região CDR de Vh tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 9-10 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido conforme comparado com as SEQ ID NOs: 9-10; uma região CDR1 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16-18 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido conforme comparado com SEQ ID NOs: 16-18; uma região CDR2 de VL tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido conforme comparado com SEQ ID NO: 19; e uma região CDR3 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 20-22 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido conforme comparado com as SEQ ID NOs: 20-22.
Os anticorpos engenheirados da invenção incluem aqueles onde modificações foram feitas em resíduos de estrutura dentro de VH e/ou VL1 por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é a mutação recuperada (backmutate) um ou mais resíduos de estrutura para a sequência de linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, o anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura que diferem da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos de podem ser identificados comparando as sequências de estrutura do anticor po com as sequências de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. rara retornar as sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser a mutação recuperada (backmutated) para a sequência de linhagem germinativa através de, por exemplo, mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese mediada por PCR. Tais anticorpos recuperados (backmutated) pretendem também ser compreendidos pela invenção.
Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de célula T para então reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem é também referida como desimunização e é descrita em mais detalhes na Publicação de Patente U.S. N- 20030153043 de Carr e outros.
Em adição ou alternativa para modificações feitas dentro das regiões de estrutura ou CDR, os anticorpos da invenção podem ser engenheirados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida no soro, fixação de complemento, ligação de receptor Fc e/ou citotoxidez celular dependente de antígeno. Ainda, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo. A numeração de resíduos de na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.
Em uma modalidade, a região de divagem de CH1 é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de divagem é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita mais na Patente U.S. N° 5.677.425 de Bodmer e outros. O número de resíduos de cisteína na região de divagem de CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias pesadas e leves ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.
Em outra modalidade, a região de divagem Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especifica-
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na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de divagem Fc de modo que o anticorpo tem ligação da proteína A Staphylococcyí (SpA) prejudicada com relação à ligação de SpA do domínio de divagem Fc nativo. Esta abordagem é descrita em mais detalhes na Patente U.S. N- 6.165.745 de Ward e outros.
Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das mutações que seguem podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na Patente U.S. N- 6.277.375 para Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação de receptor selvagem tomado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.869.046 e 6.121.022 de Presta e outros.
Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retém a capacidade de ligação de antigeno do anticorpo de origem. O ligante efetor para o qual afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 de complemento. Esta abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas para Wintere outros.
Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de modo que tal anticorpo tem ligação de C1q alterada e/ou citotoxidez dependente de complemento (CDC) reduzida ou abolida. Esta abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos. 6.194.551 de Idusogie e outros.
Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para então alterar a capacidade do anticorpo em fixar complemento. Esta abordagem é descrita mais na Publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer e outros.
Em ainda outra modalidade, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo em mediar citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcy através da modificação de um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita mais na Publicação PCT WO 00/42072 de Presta. Além disso, os sítios de ligação em lgG1 humano para FcyRI, Fc-fRIl, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação aperfeiçoada foram descritas (vide Shields, R.L. e outros, 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604).
Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo sem glicosilação). Glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tais modificações do carboidrato podem ser realizadas através de, por exemplo, alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas que resultam em eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estrutura de região variável para então eliminar glicosilação neste sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. N2S 5.714.350 e 6.350.861 de Co e outros.
Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito o qual tem um tipo alterado de glicosilação tal como anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac divididas ao meio aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas através de, por exemplo, expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com mecanismo de glicosilação alterado. Células com mecanismo de glicosilação alterado foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras onde expressar anticorpos recombinantes da invenção para então produzir um anticorpo com glicosiiação alterada. Por exemplo, a EP 1.176.195 de Hang e outros descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de modo que anticorpos expressos em tal linhagem celular exibem hipofocusilação. A Publicação PCT WO03/035835 de Presta descreve uma linhagem de célula CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida em ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (vide também, Shields, R.L. e outros, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). A Publicação PCT WO 99/54342 de Umana e outros descreve linhagens celulares engenheiradas para expressar glicosil transferases de modificação de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnTIlI)) de modo que anticorpos expressos nas linhagens de células engenheiradas exibem estruturas GlcNac divididas ao meio aumentadas que resulta em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (vide também Umana e outros, 1999, Nat. Biotech. 17:176-180).
Outra modificação dos presentes anticorpos que é compreendida pela invenção é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo, aumento da meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento dele, tipicamente é reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster ou aldeído reativo derivado de PEG, sob condições onde um ou mais grupos PEG ficam ligados a um anticorpo ou fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme aqui usado, o termo polietileno glicol pretende compreender qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tal como mono (C1-C10)alcóxi ou arilóxi-polietíleno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vi de, por exemplo, Ep 0 154 316 de Nishimura e outros e EP 0 401 384 de Ishikawa e outros.
Métodos de engenharia de anticorpos
Conforme acima discutido, os anticorpos anti-IL-13 tendo sequências de VH θ VL mostrados aqui podem ser usados para criar novos anticorpos anti-IL-13 através da modificação das sequências de VH ou VL, ou da(s) região(ões) constante(s) ligada(s) a elas. Deste modo, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo anti-IL-13 da invenção são usadas para criar anticorpos anti-IL-13 estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como ligação a IL-13 humana e também inibição de uma ou mais propriedades funcionais de IL-13 (por exemplo, ligação de receptor, inibição de liberação de mediador).
Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos da presente invenção, ou suas mutações, podem ser combinadas recombinantemente com regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-IL-3 recombinantemente engenheirados, adicionais, da invenção, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de engenharia é um ou mais das sequências de VH e/ou VL providas aqui, ou uma ou mais regiões CDR delas. Para criar o anticorpo engenheirado, não é necessário preparar realmente (isto é, expressar uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das sequências VH e/ou VL providas aqui, ou uma ou mais regiões CDR delas. Pelo contrário, a informação contida na(s) sequenciais) é usada como o material de partida para criar uma sequência(s) de segunda geração derivada(s) da(s) sequência(s) original(ais) e então a(s) sequência(s) de segunda geração é/são preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.
Deste modo, em outra modalidade, a invenção provê um método para preparação de um anticorpo anti-IL-13 consistindo em: uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de CDR1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6-7, uma sequên cia de CDR de SEQ ID NO: 8 e/ou uma sequência de CDR3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9-10; e urna sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve tendo uma sequência de CDR1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16-18, uma sequência de CDR2 de SEQ ID NO: 19 e/ou uma sequência de CDR3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 20-22; alteração de pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada e/ou sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressão da sequência de anticorpo alterada como uma proteína.
Técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada. O anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é um que retém uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-IL-13 descritos aqui, cujas propriedades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, especificamente ligação a IL-13 humana; e o anticorpo exibe pelo menos uma das propriedades funcionais que seguem: o anticorpo inibe ligação de proteína IL-13 ao receptor de IL-13, ou o anticorpo inibe ligação do receptor de IL-13 prevenindo ou melhorando uma condição inflamatória, fibrótica ou alérgica, particularmente uma doença das vias aéreas inflamatória ou obstrutiva, ou o anticorpo inibe a ligação do receptor de IL-13 deste modo prevenindo ou melhorando a asma.
O anticorpo alterado pode exibir uma ou mais, duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais descritas acima.
As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando ensaios-padrão disponíveis na técnica e/ou descritos aqui, tal como aqueles mostrados nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).
Em certas modalidades dos métodos de engenharia de anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatória ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo anti-IL-13 e os anticorpos anti-IL-13 modificados resultantes podem ser avaliados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades funcio nais conforme aqui descrito. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exernpio, a Publicação PCT WO 02/092780 de Short descreve métodos para criação e avaliação de mutações de anticorpo usando mutagênese por saturação, montagem de ligação sintética ou uma combinação delas. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar e outros descreve métodos de uso de métodos de avaliação computacional para otimizar propriedades físíco-químicas de anticorpos.
Moléculas de ácido nucléico codificando anticorpos da invenção
Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisato de célula ou podem ser ácidos nucléicos em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucléico é isolado ou tornado substancialmente puro quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ou proteínas celulares, através de técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, associação de CsCI, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outros bemconhecidos na técnica. Vide F. Ausubel e outros, Ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova York. Um ácido nucléico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. Em uma modalidade, o ácido nucléico é uma molécula de cDNA. O ácido nucléico pode estar presente em um vetor tal como um vetor de exposição (display) de fago ou em um vetor de plasmídeo recombinante.
Ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidos usando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos carregando genes de imunoglobulina humanos conforme descrito mais abaixo), cDNAs codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de expo sição de fago), ácido nucléico codificando o anticorpo pode ser recuperado de vários clones de fago que são membros da biblioteca.
Uma vez fragmentos de DNA codificando segmentos de Vh e Vl sendo obtidos, esses segmentos de DNA podem ser manipulados mais através de técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento integral, para genes de fragmento Fab ou para um gene de scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA codificando VL ou VH é operativamente ligado a outra molécula de DNA, ou a um fragmento codificando outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo operativamente ligado, conforme usado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de uma maneira funcional, por exemplo, de modo que as sequências de aminoácido codificadas por dois fragmentos de DNA permaneçam em estrutura, ou de modo que a proteína seja expressa sob controle de um promotor desejado.
O DNA isolado codificando a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento integral ligando o DNA codificando VH a uma outra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, E. A., e outros, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N- 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo essas regiões podem ser obtidos através de amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGI , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificando VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA codificando apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.
O DNA isolado codificando a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento integral (bem como em um gene de cadeia leve de Fab) ligando operativamente o DNA codificando VL a outra molécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. As sehumanos sao conhecidas na técnica (vide, por exemplo, E..A. e outros, 1991 Sequences of Pro teins of ímmunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N- 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo essas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.
Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA codificando VH θ VL são operativamente ligados a outro fragmento codificando um ligante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácido (Gly4-Ser)3, de modo que as sequências de VH e VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH unidas por um ligante flexível (vide, por exemplo, Bird e outros, 1988 Science 242:423-426; Huston e outros, 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty e outros, 1990 Nature 348:552-554).
Produção de anticorpos monoclonais da invenção
Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, através da técnica de hibridização celular somática padrão de Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495. Muitas técnicas para produção de anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.
Um sistema animal para preparação de hibridomas é o sistema de murino. Produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bemestabelecido. Protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são bem-conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.
Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de murino preparado conforme acima descrito. DNA codificando as imuno globulinas de cadeias pesada e leve pode ser obtido do hibridoma de murino de interesse e ser engenheirado para conter sequências de imunoglobulina de não-murino (por exemplo, humanas) usando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.816.567 para Ca billy e outros). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR de mu rino podem ser inseridas em uma estrutura humana usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. N- 5.225.539 para Winter e Patentes U.S. N2S 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Que en e outros.
Em uma certa modalidade, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos direcionados contra IL-13 podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos carregando partes do sistema imune humano ao invés do sistema de camundongo. Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundongos HuMab e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como camundongo Ig humano.
O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci de gene de imunoglobulina humano que codificam sequências de imunoglobulina de cadeias pesada (μ e γ) e leve κ humanas não-rearranjadas, junto com mutações direcionadas que inativam os locl de cadeias μ e κ endógenas (vide, por exemplo, Lonberg e outros, 1994, Nature 368(6474):856-859). Deste modo, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeias pesada e leve humanos introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar monoclonal IgGx humano de alta afinidade (Lonberg, N. e outros, 1994 supra', revisto em Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D., 1995 Intern. Rev. lmmunolA3: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sei. 764:536-546). A preparação e uso de camundongos HuMAb, e as modificações genômícas carregadas por tais camundongos, são descritos mais em Tayior, L. e outros, 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. e outros, 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon e outros, 1993 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:3720-3724; Choi e outros, 1993 Nature Genetics 4:1 17-123; Chen, J. e outros, 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon e outros, 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Tayior, L. e outros, 1994 International Immunology 579-591; e Fishwild, D. e outros, 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, cujos conteúdos são aqui especificamente incorporados a título de referência em sua totalidade. Vide ainda Patentes U.S. Nss 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. N- 5,545,807 para Surani e outros; Publicações PCT N2S WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 eWO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT N2 WO 01/14424 para Korman e outros.
Em outra modalidade, anticorpos humanos da invenção podem ser criados usando um camundongo que carrega sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos tal como um camundongo que carrega um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano. Tais camundongos, referidos aqui como camundongo KM, são descritos em detalhes na Publicação PCT N- WO 02/43478 para Ishida e outros.
Ainda, sistemas animais transgênicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti-IL-13 da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenocamundongo (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati e outros.
Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti-IL-13 da invenção. Por exemplo, camundongos carregando ambos um transcromossomo de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano, referidos
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em Tomizuka e outros, 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727. Ainda, vacas carregando transcromossomos de cadeias pesada e leve humanos foram descritas na técnica (Kuroiwa e outros, 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para criar anticorpos anti-IL-13 da invenção.
Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser também preparados usando métodos de exposição de fago para avaliação de bibliotecas de genes de imunoglobulina humanos. Tais métodos de exposição de fago para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nas 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 to para Ladner e outros; Patentes U.S. N-s 5.427.908 e 5.580.717 para Dower e outros; Patentes U.S. N-s 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty e outros; Patentes U.S. Nas 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e
6.593.081 para Griffiths e outros
Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser também preparados usando camundongos SCID onde células imunes humanas foram reconstituídas de modo que uma resposta de anticorpo humano pode ser gerada quando da imunização. Tais camundongos são descritos nas, por exemplo, Patentes U.S. N-s 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson e outros. Geração de anticorpos monoclonais humanos contra IL-13
IL-13 humana recombinante (hr) purificada conjugada a Epítopos auxiliares T Pan DR (PADRE) é usada como o antígeno. Anticorpos monoclonais completamente humanos para IL-13 são preparados usando as linhagens HCo7 de camundongos transgênicos HuMab que expressam genes de anticorpo humano. Nesta linhagem de camundongo, o gene de cadeia leve capa de camundongo endógeno pode ser homoziguamente rompido conforme descrito em Chen e outros, 1993, EMBO J., 12:811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno pode ser homoziguamente rompido conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01109187. Esta linhagem de camundongo carrega um transgene de cadeia leve capa humano, KCo5, conforme descrito em Fishwild e outros, 1996, Nature Biote chnology 14:845-851 e o transgene de cadeia pesada humano HCo7 conforme descrito nas Patentes U.S. NQS 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807.
Para gerar anticorpos monoclonais integralmente humanos para IL-13 da invenção, camundongos HuMab são imunizados com uma mistura de IL-13 recombinante purificada derivada de conjugado de HEKEBNA/PADRE (42 ug/camundongo) e Quil A (15 ug/camundongo, Accurate Chemical). Esquemas de imunização gerais para camundongos HuMab são descritos em Lonberg, N. e outros, 1994 Nature 368(6474):856-859; Fishwild, D. e outros, 1996 Nature Biotechnology 14:845-851 e Publicação PCT WO 98/24884. Camundongos transgênicos são imunizados ou intravenosamente (IV) ou subcutaneamente (SC) entre os dias 1-71. Os camundongos são reforçados intravenosamente com antigeno (sem adjuvante) dois dias antes do sacrifício e remoção do baço. RNA foi isolado dos baços usando o Nucleospin RNA II isolation kit (BD Bioscience/Clontech). O RNA foi usado para gerar uma biblioteca de dispaly de fago de domínios variáveis de cadeias H e L aleatoriamente ordenados em um vetor de exposição de fago conforme descrito na Patente U.S. 6.794.132. A biblioteca de exposição de fago foi submetida a cinco rodadas de seleção usando hrlL-13 biotinilada em um protocolo de ligação de equilíbrio de fase de solução conforme descrito na patente. As primeiras quatro rodadas de seleção empregaram hrlL-13 a 10'8 M e a última rodada da seleção empregou hrlL-13 a 10'9 Μ. A razão de sinal para ruído final determinada através de contagem de pfu’s recuperados na presença de antigeno divididos pelos pfu’s recuperados na ausência de antígeno foi 37 para esta biblioteca, indicando que mais de 90% do fago selecionado estavam expressando anticorpos que se ligavam a hrlL-13. A biblioteca de exposição de fago foi então su belo nada em um vetor de pia sm ideo para a expressão de Fab solúvel conforme descrito na Patente U.S. 6.794.132. Geração de transfectomas produzindo anticorpos monoclonais
Os anticorpos da invenção podem ser também produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene como é bem-conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science
229:1202).
Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou seus fragmentos de anticorpo, DNAs codificando cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento completo podem ser obtidos através de técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de DNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos nos vetores de expressão de modo que os genes são operativa mente ligados a sequências de controle transcripcional e traducional. Neste contexto, o termo operativamente ligado pretende significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo que sequências de controle transcripcional e traducional dentro do vetor servem sua função pretendida de regulagem da transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega se quaisquer sítios de restrição estiverem presentes). As regiões variáveis de cadeias leve e pesada dos anticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento completo de qualquer isotipo de anticorpo através da inserção deles em vetores de expressão já codificando regiões constantes de cadeias pesada e constante de cadeia leve do isotipo desejado de modo que o segmento de VH é operativamente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetor e o segmento de VLé operativamente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo de sinal é ligado em estrutura ao término amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não-imunogiobulina).
Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção carregam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo sequência reguladora pretende incluir promotores, aumentadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Será compreendido por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores tal como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão de proteína desejado, etc. Sequências reguladoras para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam níveis altos de expressão de proteína em células de mamífero, tal como promotores e/ou aumentadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o adenovírus de promotor tardio principal (AdMLP)) e polioma. Altemativamente, sequências reguladoras não-virais podem ser usadas, tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de P-globina. Ainda, elementos reguladores compostos de sequências de fontes diferentes, tal como o sistema promotor SRa, que contém sequências do promotor inicial de SV40 e a repetição terminal longa de vírus da leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe, Y. e outros, 1988 Mol. Cell. Bioi. 8:466-472).
Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar sequências adicionais, tal como sequências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita seleção de células hospedeiras onde o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, Patentes U.S. NQS 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel e outros). Por e xemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tal como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis incluem o gene de di-hidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).
Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão codificando as cadeias pesada e leve é/são transfectados em uma célula hospedeira através de técnicas padrão. As várias formas do termo transfecção” pretendem compreender uma ampla variedade de técnicas geralmente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de cálcio-fosfato, transfecção com DEAE-dextrano e similar. É teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção ou em células procarióticas ou eucarióticas. Expressão de anticorpos em células eucarióticas, em particular células hospedeirass de mamífero, é discutida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que as células procarióticas de se reunirem e secretar um anticorpo apropriadamente revestido (folded) e imunologicamente ativo. Expressão procariótica de genes de anticorpo foi descrita ser ineficaz para produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss, M.A. e Wood, C.R., 1985 Immunology Today 6:13-
13).
Células hospedeiras de mamífero para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub eChasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 usadas com um marcador selecionável de DH FR, por exemplo, conforme descrito em RJ. Kaufman e P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621, células de mieloma de NSO, células COS e células SP2. Quando vetores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos através de cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura onde as células hospedeiras são cultivadas. Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão.
Imunoconjugados
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-IL-13, ou um fragmento dele, conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citocina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são referidos aqui como imunoconjugados. Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como imunotoxinas. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para células (por exemplo, mate). Exemplos incluem táxon, citocalasína B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, t. coichicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidróxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol e puromicina e análogos ou homólogos deles. Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoruracil decarbazina), agentes ablativos (por exemplo, mecloretamina, tioepa cloraxnbucii, meifalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, calicheamicinas, maitansinas e auristatinas e seus derivados. Um exemplo de conjugado de anticorpo de calicheamicina está comercialmente disponível (MylotargTM: Wyeth-Ayerst).
Citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção usando tecnologia de ligante disponível da técnica. Exemplos de tipos de li gante que foram usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, ligantes contendo hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e peptídeo. Um ligante pode ser escolhido que seja, por exemplo, suscetível á divagem por pH baixo dentro do compartimento lisossomal ou suscetível à divagem por proteases, tal como proteases de preferência expressas em tecido de tumor tal como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).
Para discussão adicional de tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos vide também Saito, G. e outros, 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199- 215; Trail, P.A. e outros, 2003 Câncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G., 2003 Câncer Cell 3:207-212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Câncer 2:750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados a um isótopo radioativo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para uso diagnostica ou terapeuticamente incluem, mas não estão limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. Métodos para preparação de radioimunoconjugados são estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin® (DEC Pharmaceuticals) e Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals) e métodos similares podem ser usados para preparar radioimunoconjugados usando os anticorpos da invenção.
Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção de fármaco não deve ser considerada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídio possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo dela, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose de tumor ou interferon-γ; ou modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interieucina-6 (iL-6), fator de estimuiação de coiônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) ou outros fatores de crescimento.
Técnicas para conjugação de tal porção terapêutica a anticorpos são bem-conhecidas, vide, por exemplo, Amon e outros, Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy, em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld e outros (eds.), pp. 243-56 (Alan
R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros, Antibodies For Drug Delivery, em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson e outros (eds.), pp. 623-53 (Marcei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review, em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera e outros (eds.), pp. 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy, em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin e outros (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe e outros, The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Moléculas biespecíficas
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-IL-13, ou um fragmento dele, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções de ligação de antígeno dele, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula específica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação diferentes de moléculas-alvo. O anticorpo da invenção pode na realidade ser derivatizado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação e/ou moléculas-alvo diferentes; tais moléculas multiespecíficas pretendem ser também compreendidas pelo termo molécula biespecífica conforme aqui usado. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação nãocovalente ou de outro rnodo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que uma molécula biespecífica resulte.
Deste modo, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para IL13 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Por exemplo, o segundo epítopo-alvo é um receptor Fc, por exemplo, FcyRI (CD64) humano ou um receptor Fca humano (CD89). Deste modo, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligação a ambas moléculas efetoras expressando FcyR, FcaR ou FceR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs) e a células-alvo expressando IL-13. Essas moléculas biespecíficas são direcionadas a células expressando IL-13 para célula efetora e disparam atividades de célula efetora mediada por receptor Fc, tais como fagocitose de uma célula expressando IL-13, citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocina ou geração de ânion superóxido.
Adicionalmente, para a invenção na qual a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, em adição a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-IL-13. Por exemplo, a terceira especificidade de ligação poderia ser uma porção de fator de antiaumento (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida em atividade citotóxica e então aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A porção de fator antiaumento poderia ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligante que se liga a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor, e então resulta em um aumento do efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou o antígeno de célula alvo.
A porção de fator antiaumento pode se ligar a um receptor Fc ou um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator antiaumento poderia se ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual as primeira e segunda especificidades se ligam. Por exemplo, a porção de fator antiaumento pode se ligar a uma célula T citotóxica (por exemplo, através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD44, ICAM-1 ou outra célula imune que resulte em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).
Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo dele, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou Fv de cadeia simples. O anticorpo pode ser também um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmento mínimo dele tal como um Fv ou um construto de cadeia simples conforme descrito em Ladner e outros Patente U.S. N2 4.946.778, cujo conteúdo é aqui expressamente incorporado a título de referência.
Em uma modalidade, a especificidade de ligação para um receptor Fcy é provida por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada por imunoglobulina G humana (IgG). Conforme aqui usado, o termo receptor de IgG refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia γ localizados no cromossomo 1. Esses genes codificam um total de doze isoformas de receptor de transmembrana ou solúvel que são agrupadas em três classes de receptor Fy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII (CD 16). Em outra modalidade, o receptor Fcy é um FcyRI humano de alta afinidade. O FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que mostra alta afinidade para IgG monomérica (108 - 109 M 1).
A produção e a caracterização de certos anticorpos monoclonais anti-Fcy são descritas por Fanger e outros na Publicação PCT WO 88/00052 e na Patente U.S. N2 4.954.617, cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Esses anticorpos se ligam a um epítopo de FcyRI, FcyRII or FcyRIII em um local que é distinto do sítio de ligação Fcy do receptor e, então, sua ligação não é bloqueada substancialmente pelos níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma produzindo mAb32 está disponível da American Type Culture Collection, N2 de Acesso ATCC HB9469. Em outras modalidades, o anticorpo do receptor anti-Fcy é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22 (Η22). A produção e a caracterização do anticorpo H22 são descritas em Graziano, R.F. e outros, 1995 J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e Publicação PCT WO 94/10332. A linhagem celular produzindo o anticorpo 1122 foi depositada na American Type Culture Collection sob a projetoação HA022CL1 e tem o número de acesso CRL 11177.
Em ainda outras modalidades, a especificidade de ligação para um receptor Fc é provida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humano, por exemplo, um receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89), cuja ligação não foi bloqueada por imunoglobulina humana A (IgA). O termo receptor de IgA pretende incluir o produto de gene de um gene (FcaRI) localizado no cromossomo 19. Este gene é conhecido codificar várias isoformas de transmembrana altemativamente unidas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de célula não-efetora. FcaRI tem afinidade de meio (5 χ 107 M'1) para ambas lgA1 e lgA2, que é aumentada quando da exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. e outros, 1996 Criticai Reviews in Immunology 116:423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos para FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcaRI fora do domínio do ligante de IgA, foram descritos (Monteiro, R.C. e outros, 1992 J. immunol. 148:1764).
FcaRI and FcyRI são receptores de acionamento para uso em moléculas biespecíficas da invenção porque eles são expressos principalmente em células efetoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; expressos em níveis altos (por exemplo, 5.000100.000 por célula); mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); fazem a mediação de apresentação de antígeno aumentada de antígenos, incluindo autoantígenos, direcionados a eles.
Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais de murino, quiméricos e humanizados.
As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas através de conjugação das especificidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-IL-13, usando métodos bem-connecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e então conjugada uma à outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou ligação com cruzamento pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação com cruzamento incluem proteína A, carbodi-imida, Nsuccinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridi(ditio) propionato (SPDP) e 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky e outros, 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA e outros, 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus, 1985, Behring Inst. Mitt. N2 78, 118-132; Brennan e outros, 1985 Science 229:81-83) e Glennie e outros, 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados através de ligação sulfidrila das regiões de divagem C-terminais das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, a região de divagem é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica for uma mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x proteína de fusão de Fab. Uma molécula biespecífica da invenção compreende um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Número 5.260.203; Patente U.S. Número 5.455.030; Patente U.S. Número 4.881.175; Patente U.S. Número 5.132.405; Patente
U.S. Número 5.091.513; Patente U.S. Número 5.476.786; Patente U.S. Número 5.013.653; Patente U.S. Número 5.258.498 e Patente U.S. Número 5.482.858.
Ligação das moléculas específicas a seus alvos específicos pode ser confirmada através de, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado á enzima (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular através do emprego de um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados usando, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado à enzima que reconhece e especificamente se liga aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente marcado 4 e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub; B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techníques, The Endocríne Society, Março, 1986, que é aqui incorporado a título de referência). O isótopo radioativo pode ser detectado por tais meios tal como o uso de um contador γ ou um contador de cintilação ou através de autorradiografia.
Composições farmacêuticas
Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou suas porção(ões) de ligação de antígeno, da presente invenção, formulada junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a epítopos diferentes no antígeno-alvo ou que têm atividades complementares.
As composições farmacêuticas da invenção podem ser também administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-IL-13 da presente invenção combinado com pelo menos outro agente anti-inflamatório. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação são descritos em mais detalhes abaixo na seção sobre uso dos anticorpos da invenção.
Conforme aqui usado, veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similar que sejam fisiologicamente compatíveis. O veículo deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidermal (por exemplo, através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.
Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto de origem e não causa quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (vide, por exemplo, Berge, S.M., e outros, 1977 J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos nãotóxicos, tal como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodrídico, fosfórico e similar, bem como de ácidos orgânicos não-tóxicos tais como ácidos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil-substituídos, ácidos hidróxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similar. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similar, bem como de aminas orgânicas não-tóxicas, tais como ΝΝ’-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similar.
Uma composição farmacêutica da invenção pode também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e similar; antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa-tocoferol e similar; e agentes de quelação de metal, tal como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similar.
Exemplos de veículos aquosos e não-aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similar), e suas misturas adequadas, óleos vegetais tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e através do uso de tensoativos.
Essas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. Prevenção de presença de micro-organismos pode ser assegurada tanto através de procedimentos de esterilização, supra, e através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e similar. Deve ser também desejável incluir isotônicos, tais como acuçares, cloreto de sódio e similares nas composições. Ainda, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada através da inclusão de agentes que retardam absorção tal como monoestearato de alumínio e gelatina.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetável estéril. O uso de tais meios e agentes para substância farmaceuticamente ativa é conhecido na técnica. Exceto na medida em que quaisquer meios ou agente convencional forem incompatíveis com o composto ativo, seu uso nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos suplementares podem ser também incorporados às composições.
As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similar) e suas misturas adequadas. A fiuidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. Em muitos casos, uma pessoa pode incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização por microfiltragem. Em geral, dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreis para preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem com pulverização (liofilização) que dão um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução estéril-filtrada deles.
A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única vai variar dependendo do indivíduo sendo tratado e do modo particular de administra ção. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única vai geralmente ser aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, de cem por cento, esta quantidade vai variar de a partir de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de a partir de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento ou de a partir de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Os regimes de dosagem são ajustados para prover a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem conforme aqui usado refere-se a unidades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido, e das limitações inerentes à técnica de composição tal como um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Para administração do anticorpo, as faixas de dosagem de a partir de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg do peso do corpo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso do corpo, 1 mg/kg de peso do corpo, 3 mg/kg de peso do corpo, 5 mg/kg de peso do corpo ou 10 mg/kg de peso do corpo ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a ca da três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem para um anticorpo anti-IL13 da invenção podem incluir 1 mg/kg de peso do corpo ou 3 mg/kg de peso do corpo através de administração intravenosa ou subcutânea, com o anticorpo sendo dado usando um dos programas de dosagem que seguem: por exemplo, a cada quatro semanas para seis dosagens, então a cada três meses; a cada três semanas; 3 mg/kg de peso do corpo uma vez seguido por 1 mg/kg de peso do corpo a cada três semanas.
Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, caso onde a dosagem de cada anticorpo administrado se encaixa dentro das faixas indicadas. Anticorpo é geralmente administrado em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Intervalos podem ser também irregulares conforme indicado através da medição dos níveis no sangue de anticorpo para o antígeno-alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 pg/ml e em alguns métodos cerca de 25-300 pg/ml.
Alternativamente, anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso onde administração menos frequente é requerida. A dosagem e a frequência variam dependendo da meiavida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não-humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não frequentes durante um período de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é algumas vezes requerida até progressão da doença ser reduzida ou terminada ou até o paciente mostrar melhora parcial ou completa dos sintomas de doença. Em seguida, o paciente pode ser administrado com um regime profilático.
Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado vai depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou do éster, sal ou amida delas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem-conhecidos na técnica médica.
Uma dosagem terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IL3 da invenção pode resultar em uma diminuição na severidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livres de sintoma de doença ou uma prevenção de prejuízo ou incapacidade devido à afecção da doença.
Uma composição da presente invenção pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será compreendido pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração vai variar dependendo dos resultados desejados. As vias de administração para anticorpos da invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, por exemplo, através de injeção ou infusão. A expressão administração parenteral conforme aqui usado significa modos de administração outros que não administração enteral e tópica, geralmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosas, intramusculares, intra-arteriais, intratecais, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradermais, intraperitoneais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra-articulares, subcapsulares, subaraquinoides, intraespinhais, epidurais e intrasternais.
Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via não-parenteral, tal como uma via de administração tópica, epidermal ou mucosal, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.
Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que vão proteger o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdermais e sistemas de aplicação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, podem ser usados, tal como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos daqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Susta/ned and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcei Dekker, Inc., NewYork, 1978.
Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tal como os dispositivos mostrados na Patente U.S. N2 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bemconhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. N2 4.487.603, que mostra uma bomba de microinfusão implantável para distribuição da medicação em uma taxa controlada; Patente U.S. N2 4.486.194, que mostra um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. N2 4.447.233, que mostra uma bomba de infusão para medicação para aplicação de medicação em uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. N2 4.447.224, que mostra um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para aplicação de fármaco contínua; Patente U.S. N2 4.439.196, que mostra um sistema de aplicação de fármaco osmótico tendo compartimentos multicâmara; e Patente U.S. N2 4.475.196, que mostra um sistema de aplicação de fármaco osmótico. Essas patentes são aqui incorpo radas a título de referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de aplicação e módulos são conhecidos daqueles versados na técnica.
Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas vide, por exemplo, Patentes U.S. 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, então aumentam a aplicação de fármaco direcionada (vide, por exemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Cline. Pharmacol. 29:685). Porções-alvo exemplares incluem folato ou biotina (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.416.016 para Low e outros); manosídeos (Umezawa e outros, 1988, Biochem. Biophys, Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman e outros, 1995 FEBS Lett., 357:140; M. Owais e outros, 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensoativo (Briscoe e outros, 1995 Am. J. PhysiolA233: 134); p1 20 (Schreier e outros, 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); vide também K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273.
Usos e métodos da invenção
Os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) da presente invenção têm utilidades de diagnóstico e terapêutica in vitro e in vivo. Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas a células em cultura, por exemplo, in vitro ou in vivo, ou em um indivíduo, por exemplo, in vitro, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. O termo indivíduo conforme aqui usado pretende incluir animais humanos e não-humanos. Animais não-humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos, ovelha, cachorro, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis. Os métodos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanos tendo um distúrbio associado com expressão de IL-13 aberrante. Quando anticorpos para IL-13 são administrados junto com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente.
Em uma modalidade, os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) da invenção podem ser usados para detectar níveis de IL-13, ou níveis de células que contêm IL-13. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através de contato de uma amostra (tal como uma amostra in vitro) e uma amostra de controle com o anticorpo anti-IL-13 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e IL-13. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e IL-13 são detectados e comparados na amostra e controle. Por exemplo, métodos de detecção padrão, bemconhecidos na técnica, tal como ELISA e ensaios de citometria de fluxo, podem ser realizados usando as composições da invenção.
Deste modo, em um aspecto, a invenção provê ainda métodos para detecção da presença de IL-13 (por exemplo, antígeno IL-13 humano) em uma amostra, ou medição da quantidade de IL-13, compreendendo contato da amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação de antígeno dele, que se liga especificamente a IL-13, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção dele e IL-13. A formação de um complexo é então detectada, onde a diferença em formação de complexo entre a amostra comparado com a amostra de controle é indicativa da presença de IL-13 na amostra.
Também dentro do escopo da invenção estão estojos consistindo nas composições (por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas) da invenção e instruções para uso. O kit pode conter ainda pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno-alvo distinto do primeiro anticorpo). Estojos tipicamente incluem um marcador indicando o uso pretendido dos conteúdos do kit. O termo marcador inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido no ou com o kit, ou que de outro modo acompanhe o kit.
A invenção tendo sido descrita integralmente é ilustrada mais pelos exemplos e reivindicações que seguem, que são ilustrativos e não pretendem ser mais limitantes. Aqueles versados na técnica vão reconhecer ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina vários equivalentes para os procedimentos específicos descritos aqui. Tais equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção e reivindicações. Os conteúdos de todas as referências, incluindo patentes emitidas e pedidos de patente publicados, citados ao longo deste pedido são aqui incorporados a título de referência.
Exemplos
Exemplo 1: Geração de anticorpos específicos de IL-13 humanos de bibliotecas de baço imunizadas
O RNA de baços foi usado para gerar uma biblioteca de exposição de fago (phage display) de domínios variáveis de cadeias H e L aleatoriamente ordenados em um vetor de exposição de fago de Fab conforme descrito na Patente U.S. 6.794.132. A biblioteca de exposição de fago foi submetida a cinco rodadas de seleção usando hrlL-13 biotinilado em um protocolo de ligação de equilíbrio de fase de solução conforme descrito na patente. As primeiras quatro rodadas de seleção empregaram hrlL-13 a 10'8 M e a última rodada de seleção empregou hrlL-13 a 10'9 Μ. A razão de sinal para ruído final determinada através de contagem de pfu’s recuperados na presença de antígeno dividido pelos pfu’s recuperados na ausência de antígeno foi 37 para esta biblioteca, indicando que mais de 90% dos fagos selecionados estavam expressando anticorpos que se ligam à hrlL-13. A biblioteca de exposição de fago foi então subclonada em um vetor de plasmídeo para a expressão de Fab solúvel conforme descrito na Patente U.S. 6.794.132. A biblioteca subclonada compreende vetores de plasmídeo em E. coli, cada plasmídeo codificando um fragmento Fab monoclonal. A biblioteca de suclone foi posta em placa e colônias representando clones individuais foram coletadas para inocular placas de 96 poços. Após crescimento da noite para o dia, as culturas de placa foram usadas para arquivar bancos de célula congelada para os clones em placas de 96 poços e também para se mear placas de 96 poços réplicas que foram induzidas para expressar anticorpos monoclonais. No dia seguinte, essas culturas de placa de 96 poços foram submetidas à extração com detergente e purificação para recuperar quantidades em micrograma de anticorpos. Os anticorpos purificados foram tratados para remover endotoxina e filtrados estéreis terminalmente. Ensaios ELISA foram conduzidos usando rhlL-13 biotinilada revestida em placas de avidina para identificar quais poços continham positivos funcionais. Ensaios sanduíche se direcionando à região constante dos anticorpos foram usados para determinar as concentrações de anticorpo em poços diferentes. As placas de 96 poços contendo os anticorpos e os dados de ensaio foram avaliados quanto à atividade biológica. Os clones de interesse nos bancos de célula congelada de 96 poços foram então sequenciados para identificar aqueles expressando anticorpos únicos. Subsequentemente, os bancos de célula congelada desses clones únicos foram usados para semear culturas de frasco de agitação de pequena escala e cultivadas da noite para o dia. Frascos de grande escala foram semeados usando as culturas da noite para o dia e então induzidos para expressar anticorpos. No dia seguinte, as culturas de frasco foram mecanicamente homogeneizadas e purificadas para dar quantidades em miligrama de anticorpos. Os Fabs purificados foram processados para remoção de endotoxina e submetidos à filtragem estéril terminal. A atividade funcional desses anticorpos foi demonstrada através de ELISA usando rhlL-13 biotinilada revestida em placas de avidina. As concentrações de anticorpo foram determinadas através de medição de absorbância a 280 nm. Os Fabs purificados foram avaliados quanto à ligação e atividade in vitro em um ensaio baseado em célula.
Exemplo 2: Análise quantitativa de afinidades de ligação: determinação de candidatos Fab IL-13 anti-humanos
Medições de ressonância de plásmon de superfície quantificando a interação de Fabs anti-IL13 com várias hrlL-13 foram realizadas usando o biossensor óptico, BIAcore 2000. Ligação específica de IL-13 a um respectivo Fab IL-13 imobilizado em um chip BIAcore pode ser medida seguindo acúmulo do ligante no receptor. As taxas de associação microscópica (kon) θ dissociação (kOff) podem ser obtidas diretamente das taxas de acúmulo de massa no chip e são expressas em unidades de resposta (RUs). Fab anti-IL13 é imobilizado na superfície do chip através de um anticorpo Lk antihumano secundário (Jackson Immunochemicals). Este anticorpo de captura foi covalentemente ligado usando o Amine coupling kit’ (BIAcore, N- Cat. BR-1000-50) conforme recomendado nos protocolos do fabricante. 250 pl de concentrações variáveis de hrlL-13 foram injetados em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min e o traço cinético foi registrado. A superfície do chip foi regenerada por duas etapas de lavagem ácida usando HCI a 100 mM e injetando 10 pl com uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min. Este tratamento leva à dissociação do complexo Fab IL-13 devido à desnaturação ácida reversível. Nenhuma perda significante de atividade de ligação foi observada quando o anticorpo foi reinjetado para uma rodada subsequente. Os traços de cinética foram avaliados com o software BIAcore aplicando o modelo de associação Langmuir 1:1.
Os dados de afinidade sumarizados sobre IL-13 humana são mostrados na Tabela 1 aqui.
Tabela 1
Fab KD [pM] IL-13 humana
01471/G6 100 + 2
03161/H2 197 ± 12
01951/G12 480 ± 68
01771/E10 343 ± 54
Exemplo 3: Conversão para o formato IgG
Os modelos de sequenciamento de DNA de anticorpo foram purificados de culturas de 3 ml usando minipreps QIAprep (Qiagen Inc.). Os moldes foram sequenciados usando um Applied Biosystems 3100 Avant Genetic Analyzer de acordo com as especificações do fabricante. As regiões variáveis de cadeia pesada e capa de clones selecionados foram separadamente amplificadas dos moldes de sequenciamento através de PCR, purificadas através de eletroforese de gel de agarose e excisadas e purificadas do gel. Plasmídeos codificando as VH e VL foram clonados em cassetes de expressão para cadeias leve capa e pesadas IgGi humanas. A linhagem de célula de origem Sp2/0 foi transfectada com dois vetores, um para os vetores de cadeia pesada e um para leve. As células transfectadas foram selecionadas e amplificadas usando G418 e metotrexato respectivamente resultando na emergência de grupos de célula amplificada, resistente, produzindo os anticorpos com títulos variando de 5 mg/L a 30 mg/L. Clonagem por diluição foi então empregada, resultando no isolamento de 127 clones viáveis de placas de 96 poços. Linhagens de célula emergentes foram então testadas quanto à produtividade em um formato de agitador descontínuo alimentado. Teste de estabilidade para confirmar a integração estável dos construtos de expressão e expressão robusta de produto foi também realizado durante um período de 90 minutos. Northern blots exibiram RNAs de comprimento integral, simples, com intensidades de faixa iguais, indicando níveis de expressão similares para ambas cadeia pesada e cadeia leve.
Exemplo 4: Caracterização in vitro de anticorpos integrais anti-IL-13 em um ensaio baseado em célula
IL-13 é um indutor potente de liberação de eotaxina a partir de fibroblastos de pulmão humanos. A capacidade dos anticorpos de neutralizar a bioatividade de IL-13 foi avaliada em um ensaio de liberação de eotaxina induzida por IL-13 usando fibroblastos de pulmão humanos. Resumidamente, células (2 x 104 células por poço em um volume de 100 μΙ) foram postas em placa em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 96 poços. As células foram estimuladas com uma concentração de IL-13 conferindo 80% da liberação de eotaxina máxima, que foi predeterminada para cada batelada de células usando uma curva padrão de 0-100 ng/ml de IL-13. Concentrações variáveis dos anticorpos foram coaplicadas às células. As células foram deixadas incubar por 24 horas a 37°C, CO2 a 5% e os meios de cultura foram coletados e armazenados a 20°C até requeridos. Os níveis de eotaxina dentro dos meios foram medidos através de ELISA específico (R&D systems) onde a sensibilidade de ensaio estava entre 15-1000 pg/ml.
Os Fabs anti-IL-13 foram então analisados com relação a EC50 conforme acima descrito e mostrado na Tabela 2.
Tabela 2
Anticorpo EC5o [nM] IL-13 humana
01471/G6 1,23 ±0,4
03161/H2 0,95 ±0,2
01951/G12 0,33 ±0,1
01771/E10 1,71 ±0,5
Exemplo 5: Análise de sequência dos anticorpos anti-IL-13
As sequências de nucleotídeo das regiões variáveis de cadeias pesada e leve (VH e VL) de todos os anticorpos foram determinadas. Se5 quências de aminoácido das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) são listadas nas Tabelas 3 e 4 aqui. As CDRs de acordo com a definição de Kabat (E. Kabat e outros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) são listadas nas Tabelas 3a e 4a,
Tabela 3
Anticorpo HCDR1 SEQ ID N- HCDR1 HCDR2 SEQ ID N- HCDR2 HCDR3 SEQ ID Ne HC- DR3
01471/G6 GFTFSNYG 1 IWYDGSN 3 VKGSGDIP 4
03161/H2 GFTFSNYG 1 IWYDGSN 3 VKGSGDIP 4
01951/G12 GFTFSSYG 2 IWYDGSN 3 ARLWFGDLD 5
01771/E10 GFTFSSYG 2 IWYDGSN 3 ARLWFGDLD 5
Tabela 3A
Anticorpo HCDR1 SEQ ID N- HCDR1 HCDR2 SEQ ID N- HCDR2 HCDR3 SEQ ID NQ HCDR3
01471/G6 NYGMH 6 IIWYDGSNKYYADSVKG 3 GSGDIPFDY 9
03161/H2 NYGMH 6 IIWYDGSNKYYADSVK 3 GSGDIPFDY 9
01951/G12 SYGMH 7 IIWYDGSNKYYADSVK 3 LWFGDLDAFDI 10
01771/E10 SYGMH 7 IIWYDGSNKYYADSVK 3 LWFGDLDAFDI 10
Tabela 4 : I I------------------------------------------Γ
S ι
Anticorpo ICDR1 SEQ N2 HCDR1 ID HCDR2 SEQ ID N2 HCDR2 HCDR3 SEQ ID N2 HCDR3
01471/G6 QSVSSY 11 DA 12 HQRSHWPPI 13
03161/H2 QSVSSY 11 DA 12 HQRSHWPPI 13
01951/G12 QSVSSY 11 DA 12 QQRSSWPPV 14
01771/E10 QSVSSY 11 DA 12 HQRSSWPPI 15
Tabela 4A
Anticorpo LCDR1 SEQ ID N2 HCDR1 HCDR2 SEQ N2 DR2 ID HC- HCDR3 SEQ ID N2 HCDR3
01471/G6 RASQSVSS- 16 DASNRAT 19 HQRSHWP- 20
YLA PIFT
03161/H2 RASQSVSS- 16 DASNRAT 19 HQRSHWP- 20
YLA PIFT
01951/G12 RAGQSVSS- 17 DASNRAT 19 Q- 21
YLV QRSSWPPV
YT
01771/E10 RASQSVSS- 18 DASNRAT 19 HQRSSWP- 22
YLA PIFT
As sequências dos anticorpos das tabelas anteriores, incluindo regiões de estrutura, são mostradas abaixo. As regiões constantes de cadeias leve e pesada do anticorpo lgG1 integral são também mostradas abaixo, incorporando, como um exemplo, as regiões variáveis do anticorpo 01951/G12 (em negrito).
Sequência do Anticorpo 01471/G6 (i) Região variáve! de HC
A sequência de aminoácido variável de HC para 01471/G6 é mostrada na SEQ ID NO: 23 e é codificada pela sequência de nucleotídeo 5 mostrada na SEQ ID NO: 24
EVQLVESGGGVVQPGRSLRL gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60
SCAASGFTFSNYGMHWVRQA tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggct 120
PGKGLEWVAIIWYDGSNKYY ccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactat 180
ADSVKGRFTISRDNSKNTLY gcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat 240
LQMNSLRAE DTAVYYCVKGS ctgcaaatgaacagtctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtgaaaggatct 300
G D I PFDYWGQGTLVT {SEQ ID NO : 23) ggggatattccctttgactactggggccagggaaccctggtcace 345 (SEQ ID NO :24) (ii) Região variável de LC
A sequência de aminoácido variável de LC para 01471/G6 é mostrada na SEQ ID NO: 25 e é codificada pela sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 26
EIVLTQSPATLSSSPGERAT gaaattgtgttgacgcagtctccagccaccctgtcttcgtctccaggggaaagagccacc 60
LSCRASQSVSSYLAWYQQKP ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacct 120
GQAPRLLIYDASNRATGI PA ggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagcc 180
RF5GSGSGTDFTLTISSLEP aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240
EDFAVYYCHQRSHWPPI F T F gaagattttgcagtctattactgtcatcagcgtagccactggcctcccatattcactttc 300
G P G T (SEQ ID NO; 25) ggccctgggacc 312 (SEQ ID NO: 26) (i) Região variável de HC
A sequência de aminoácido variável de HC para 03161/H2 é mostrada na SEQ ID NO: 27 e é codificada pela sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 28 evqlvesgggvvqpgrslrl gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60 scaasgftfsnygmhwvrqa tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggct 120
PGKGLEWVAI IWYDGSNKYY ccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactat 180
ADSVKGRFTISRDNSKNTLY gcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat 240
LQMNSLRAEDTAVYYCVKGS ctgcaaatgaacagtctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtgaaaggatct 300
GDIPFDYWGQGTLVT (SEQ ID NO : 27) ggggatattccctttgactactggggccagggaaccctggtcacc 34 5> (SEQ ID NO : 28) (ii) Região variável de LC
A sequência de aminoácido variável de LC para 03161/H2 é mostrada na SEQ ID NO: 29 e é codificada pela sequência de nucleotídeo mos5 trada na SEQ ID NO: 30
EIVLTQSPATLSSSPGERAT gaaattgtgttgacgcagtccccagccaccctgtcttcgtctccaggggaaagagccacc 60
LSCRASQSVSSYLAWYQQKP ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacct 120
GQAPRLLIYDASNRATGTPA ggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcaccccagcc 180
RFSGSGSGTDFTLTISSLEP aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240 EDFAVYYCHQRSHWPPIFTF gaagattttgcagtctattactgtcatcagcgtagccactggcctcccatattcactttc 300
G P G T (SEQ ID NO :29) ggccctgggacc 312 {SEQ ID NO :30)
Sequência de anticorpo 01951/G12 (i) Região variável de HC
A sequência de aminoácido variável de HC para 01951/G12 é mostrada na SEQ ID NO: 31 e é codificada pela sequência de nucleotídeo 10 mostrada na SEQ ID NO: 32
EVQLVESGGGVVQPGRSLRL gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60
SCAASGFTFSSYGMHWVRQA tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggct 120
PGKGLEWVAI IWYDGSNKYY ccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatacta t 180
ADSVKGRFTISRDNSKNTLY gcgqactccgtgaaqggccgattcaccatctccagaqacaattccaagaacacgctgtat 240
LQMNSLRAEDTAVYYCARLW ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattaetgtgcgaggctatgg 300
FGDLDAFDIWGQGTMVT (SEQ ID NO : 31) ttcggggacttagatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcacc 351 (SEQ ID
NO :32) (i) Região variável de LC
A sequência de aminoácido variável de LC para 01951/G12 é mostrada na SEQ ID NO: 33 e é codificada pela sequência de nucleotideo mostrada na SEQ ID NO: 34
EIVLTQSPATLSLSPGERAI gaaa t tgtgttgacgcagtctccagccaccctgtctt tgtctccaggggaaagagccatc 60
LSCRAGQSVSSYLVWYQQKP ctctcctgcagggccggtcagagtgttagcagttacttagtctggtaccaacagaaacct 120
GQAPRLLIYDASNRATGI PA ggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggca tcccagcc 180
RFSGSGSGTDFTLTI SSLEP aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240 edfavyycqqrsswppvytf gaagattttgcagtttattactgtcagcagcgcagcagctggcctccggtgtacactttt 300
G Q G T (SEQ ID NO :33) ggccaggggacc 312 (SEQ ID NO : 34)
Sequência de anticorpo 01771/E10 (i) Região variável de HC
A sequência de aminoácido variável de HC para 01771/E10 é mostrada na SEQ ID NO: 35 e é codificada pela sequência de nucleotideo mostrada na SEQ ID NO: 36
QVQLVQSGGGVVQPGBSLRL caggtgcagctggtgcagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60
SCAASGFTFSSYGMHWVRQA tcctgtgcggcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggct 120
PGKGLEWVAIIWYDGSNKYY ccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactat 180
ADSVKGRFTISRDNSKNTLY gcggactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattecaagaacacgctatat 240
LQMNSLRAEDTAVYYCARLW ctacaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggctatgg 300
FGDLDAFD IWGQGTMVT (SEQ ID NO :35) ttcggggacttagatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcacc 351 (SEQ ID NO :36) (i) Região variável de LC
A sequência de aminoácido variável de LC para 01771/E10 é mostrada na SEQ ÍD NO: 37 e é codificada pela sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 38
E IVLTQSPATLSLSPGERAT gaaattgtgttgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc 60 lscrasqsvssylawyqqkp ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacct 120
GQAPRLLIYDASNRATGI PA ggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagcc 180 rfsgsgsgtdftltisslep aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240
EDFAVYYCHQRSSWPPIFTF gaagattttgcggtttattactgtcatcagcgtagcagctggcccccgatattcactttc 300
G P G T (SEQ ID NO :37} ggccctgggacc 312 (SEQ ID NO :38)
Sequência de Cadeia Leve de lqG1 de Anticorpo Integral Incorporando a 5 Região Variável de Anticorpo 01951/G12 (Em negrito)
A sequência de aminoácido de LC é mostrada na SEQ ID NO: 39 e é codificada pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 40.
M S V L T Q V L A L L L L W L T G
1 ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGCGTTG CTGCTGCTGT GGCTTACAGG
T R C E I V L T Q S PAT L S L S
51 TACGCGTTGT GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT
P G E R A I L S C R A G Q S V s
101 CTCCAGGGGA AAGAGCCATC CTCTCCTGCA GGGCCGGTCA GAGTGTTAGC
S Y I» V W Y Q Q K P G Q A P R L L
151 AGTTACTTAG TCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT
I Y D A S N R A T G I P A R F S G
201 CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG
S G S G T D F T L T I s s L E P
251 GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT
E D F A V Y Y C Q Q R S S W PPV
301 GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGCAGCAGCT GGCCTCCGGT
Y T F G Q G T K L E I K R T V A A
351 GTACACTTTT GGCCAQGGGA CCAAGCTTGA AATCAAACGA ACTGTGGCTG
P s v F I F P P S D E Q L K S G
401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA
T A S V V C L L Ν N F Y P R E A K
451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA
V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S
501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA
V T E Q D S K D S T Y S L S S T
551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC
L T L S K A D Y E K Η K V Y A C E
601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA
V T H Q G L S S P V T K S F N R G
651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG
E C * (SEQ ID NO:39)
701 GAGAGTGTTA G (SEQ ID NO:40)
Sequência de Cadeia Pesada de lgG1 de Anticorpo Integral Incorporando a Região Variável de Anticorpo 01951/G12 (Em negrito)
A sequência de aminoácido de HC é mostrada na SEQ ID NO: 41 e é codificada pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 42.
1 Μ A W V ATGGCTTGGG W T L TGTGGACCTT PFL GCCATTCCTG Μ A A A ATGGCAGCTG Q S V CCCAAAGTGT
51 Q Α Ε CCAGGCAGAA V Q L V GTGCAGCTGG E S G TGGAGTCTGG G G V GGGAGGCGTG V Q P G GTCCAGCCTG
101 R S L GGAGGTCCCT R L S GAGACTCTCC C A A S TGTGCAGCGT G F T CTGGATTCAC F S S CTTCAGTAGC
151 Y G Μ H TATGGCATGC W V R ACTGGGTCCG Q A P CCAGGCTCCA G X G L GGCAAGGGGC E W V TGGAGTGGGT
201 A I I GGCAATTATA W Y D G TGGTATGATG S N X GAAGTAATAA Y Y A ATACTATGCG D S V X GACTCCGTGA
251 G R F agggccgatt TIS CACCATCTCC R D N S AGAGACAATT X N T CCAAGAACAC L Y L GCTGTATCTG
301 Q Μ N S CAAATGAACA L R A GCCTGAGAGC E D T CGAGGACACG A V Y Y GCTGTGTATT C A R ACTGTGCGAG
351 L W F GCTATGGTTC G D L D GGGGACTTAG AFD ATGCTTTTGA I W G TATCTGGGGC Q G T M CAAGGGACAA
401 V T V TGGTCACCGT S S A CTCCTCAGCC S T K G TCCACCAAGG P S V GCCCATCGGT F P L CTTCCCCCTG
451 A P S S GCACCCTCCT K S T CCAAGAGCAC S G G CTCTGGGGGC T A A L ACAGCGGCCC G C L TGGGCTGCCT
501 V K D GGTCAAGGAC Y F P E TACTTCCCCG P V T AACCGGTGAC V s w GGTGTCGTGG N S G A AACTCAGGCG
551 L T S CCCTGACCAG G V H CGGCGTGCAC T F P A ACCTTCCCGG V L Q CTGTCCTACA S S G GTCCTCAGGA
601 L Y S L CTCTACTCCC S S V TCAGCAGCGT V T V CGTGACCGTG P S S S CCCTCCAGCA L G T GCTTGGGCAC
651 Q T Y CCAGACCTAC I C N V ATCTGCAACG N Η K TGAATCACAA P S N GCCCAGCAAC T K V D ACCAAGGTGG
701 K R V ACAAGAGAGT E P K TGAGCCCAAA S C D K TCTTGTGACA T Η T AAACTCACAC C P P ATGCCCACCG
751 C P A P TGCCCAGCAC E L L CTGAACTCCT G G P GGGGGGACCG S V F L TCAGTCTTCC F P P TCTTCCCCCC
801 K P K AAAACCCAAG D T L M GACACCCTCA I S R TGATCTCCCG T P E GACCCCTGAG V T C V GTCACATGCG
851 V V D TGGTGGTGGA V S H CGTGAGCCAC E D P E GAAGACCCTG V K F AGGTCAAGTT N W Y CAACTGGTAC
V D G V E V H N A K Τ K P R E E Q
901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA
Y N S Τ Y R V V S V L Τ V L H Q D
951 GTACAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG
W L N G K E Y K C K V S N K A L
1001 ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC
P A P I E K T I S K A K G Q P R E
1051 CCAGCCCCCA tcgagaaaac CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA
P Q V Y T L P P S R E E M Τ K N Q
1101 accacaggtg TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC
V S L T C L V K G F Y P S DIA
1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC
V E W E S N G Q P E N N Y K T T P
1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC
P V L D S D G S F F L Y S K L Τ V
1251 TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTATAGC AAGCTCACCG
D K S R W Q Q G N V F S C S V M
1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG
Η E A L Η N H Y T Q K S L S L S P
1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCCCC
G Κ * (SEQ ID NO: 41) 1401 GGGTAAATGA (SEQ ID NO:42)

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo anti-IL-13 humano isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma região de ligação a antígeno em que as regiões HCDR1, H-CDR2 e H-CDR3 e L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3 representadas em uma sequência de aminoácidos juntos são:
    SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, e
    SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21.
  2. 2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 33.
  3. 3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 41 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve compreende SEQ ID NO: 39.
  4. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é uma IgG 1 ou uma lgG4.
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  6. 6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de asma.
  7. 7. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar um distúrbio ou condição associado com a presença de IL-13 direcionada ao receptor celular.
  8. 8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ou condição é asma.
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