BRPI0618920A2 - anticorpos monoclonais contra claudin-18 para o tratamento de cáncer - Google Patents

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Türeci Özlem
Usener Dirk
Fritz Stefan
Uherek Christoph
Brandenburg Gunda
Geppert Harald-Gerhard
Kristina Schröder Anja
Thiel Philippe
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Ganymed Pharmaceuticals Ag
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Abstract

ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA CLAUDIN-18 PARA O TRATAMENTO DE CáNCER. A presente invenção fornece anticorpos úteis como produtos terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de doenças associadas às células expressando CLD18, incluindo doenças relacionadas a tumor, tais como câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer pulmonar, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer de vesícula biliar.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA CLAUDIN-18 PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER"
Terapias baseadas em anticorpo para câncer têm o potencial de um perfil de maior especificidade e menor efeito colateral quando comparado com fármacos convencionais. A razão é uma distinção precisa entre células normais e neoplásicas por anticorpos e o fato de que seu modo de ação conta com mecanismos imunológicos anti-tumor menos tóxicos, tais como ativação de complemento e recrutamento de células imunes citotóxicas.
Alvos para terapias baseadas em anticorpos precisam ter qualidades particulares, as quais formam a base para discriminação apropriada entre células normais e neoplásicas. Obviamente, um alvo com restrição exclusiva às células tumorigenas e totalmente indetectável sobre tecidos normais é |.deal para o desenvolvimento de produtos terapêuticos de anticorpos eficientes e seguros. Em outro aspecto/ uma superexpressão de alto nivel pode ser a base para a janela terapêutica e baixos efeitos colaterais exemplificados pelo receptor de fator de crescimento epidérmico humano do tipo 2 (HER-2) o qual, como um resultado da amplificação de gene, é um bom alvo para o anticorpo trastuzumab (Herceptin). Outros alvos para anticorpos os quais já são aprovados ou estão em desenvolvimento clinico para terapia de tumor têm qualidades distintas, as quais não são baseadas em uma superexpressão numérica de moléculas alvo sobre células tumorigenas. No caso de anticorpos para a proteoglicana MUC-I, um epitopo peptidico repetido na estrutura do alvo é sub-glicosilada em células tumorigenas e, assim, alterado à sua contraparte normal. No caso de anticorpos ao CD20 (rituximab) , CD52 (Campath-IH) e CD22 (epratuzumab) , alvos de anticorpo têm níveis de expressão comparáveis sobre células tumorigenas e linfócitos normais. Aqui, a ablação de células normais pelo anticorpo é tolerável, uma vez que células tronco alvo-negativas restauram o repertório normal de linfócitos. Outros exemplos de acessibilidade diferencial de alvos de anticorpos são o antigeno carcinoembriogênico (CEA) e carboanidrase IX (CA9). Ambos os antígenos são expressos sobre epitélio normal do cólon e rim, respectivamente. Contudo, anticorpos de formação de imagem radioativamente marcados distinguem bem entre tecido tumorigeno e normal, e anticorpos citotóxicos são bem tolerados. Isso é, mais provavelmente, em virtude de uma expressão restrita de CA 9 e CEA sobre o lado luminal de tecido epitelial normal, onde anticorpos de IgG não têm acesso. Também, a molécula de adesão celular epitelial antigênica (Ep-CAM) pertence a essa categoria. Como uma célula homotípica, a molécula de adesão para células epiteliais está localizada no espaço intercelular. Curiosamente, enquanto anticorpos anti-Ep-CAM de alta afinidade são muito tóxicos, anticorpos de afinidade intermediária são bem tolerados. Isso sugere a acessibilidade do alvo Ep-CAM sobre células normais, mas também indica que a cinética de ligação de anticorpo pode abrir uma janela terapêutica.
Uma possibilidade é que outras proteínas especificas de células epiteliais envolvidas em adesão célula/célula podem também ser atraentes para abordagens de anticorpo, uma vez que elas raramente podem ser acessíveis em epitélio bem estruturado a anticorpos, mas se tornam expostas sobre células tumorígenas. Portanto, nós analisamos as proteínas envolvidas na organização da arquitetura do tecido epitelial com relação à sua adequabilidade como alvos para anticorpos terapêuticos. Uma proteína a qual atrai particularmente a nossa atenção é a claudin 18.
A molécula de claudin 18 (CLD18) (número de acesso ao Genbank: variante com splicing 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369 e variante com splicing 2 (CLD18A2): NM_00100202 6, NP_001002026) é uma proteína transmembrana integral com um peso molecular de aproximadamente 27,9 / 27,72 kD. Claudinas são proteínas membrana integrais localizadas dentro das "tight junctions" do epitélio e endotélio. "Tight junctions" organizam uma rede de filamentos interconectados de partículas intramembranosas entre células adjacentes. Em "tight junctions", ocludina e claudinas são os componentes de proteína transmembrana mais proeminentes. Em virtude de suas fortes propriedades de adesão celular, elas criam uma barreira primária para prevenir e controlar o transporte paracelular de solutos e restringem a difusão lateral de lipídios e proteínas de membrana para manter a polaridade celular. Proteínas de formação de "tight junctions" estão criticamente envolvidas em organização da arquitetura de tecido epitelial. Nós presumimos que tais proteínas raramente podem ser acessíveis a anticorpos em epitélio bem estruturado, mas se tornam expostas sobre células tumorígenas.
CLD18 é uma tetraspanina e tem, como tal, 4 regiões hidrofóbicas. Nós geramos dados indicando que a CLD18 apresenta várias conformações diferentes, as quais podem ser seletivamente dirigidas por anticorpos. Uma conformação (CLD18 - Conformação 1) implica que todas as quatro regiões hidrofóbicas servem como domínios transmembrana (TM) regulares e dois loops extracelulares (loopl abrangido pela região hidrofóbica 1 e região hidrofóbica 2; loop2 abrangido pelas regiões hidrofóbicas 3 e 4) são formados, conforme descrito para a vasta maioria de membros da família claudin. Uma segunda conformação (CLD18 Conformação 2) implica que, conforme descrito para PMP22, outro membro da família de tetraspaninas (Taylor et al., J. Neurose. Res. 62: 15-27, 2000), os segundo e terceiro domínios hidrofóbicos não cruzam completamente a membrana plasmática, de modo que a porção (loopD3) entre os primeiro e quarto domínios transmembrana é extracelular. Uma terceira conformação (CLD18 - Conformação 3) implica um grande domínio extracelular com duas regiões hidrofóbicas internas abrangidas pelas primeira e quarta regiões hidrofóbicas, as quais servem como domínios transmembrana regulares. Em virtude da presença do sítio de N- glicosilação clássico no IoopDS da Claudin-18, variantes de topologia CLD18 topologia-2 e CLD18 topologia-3 abrigam um sítio de N-glicosilação extracelular adicional.
Outro nível de complexidade é adicionado à molécula de CLD18 pela presença de duas variantes com splicing diferentes, as quais são descritas em camundongos e em seres humanos (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001). As variantes com splicing CLD18A1 e CLD18A2 diferem quanto aos primeiro 21 aminoácidos N-terminais, os quais compreendem o primeiro TM e loopl, enquanto a seqüência de proteína primária do C-término é idêntica.
CLD18A1 é seletivamente expressa sobre pulmão normal e epitélio de estômago, enquanto que CLD18A2 é expressa apenas sobre células gástricas (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001). De modo mais importante, CLD18A2 está restrita às células diferenciadas de vida curta do epitélio do estômago, mas é desprovida da região de célula tronco gástrica. Usando RT-PCR sensível, nós mostramos que ambas as variantes não são detectáveis em geral em qualquer outro órgão humano normal, mas são robustamente expressas em vários tipos de câncer, incluindo tumores de estômago, esofageal, pancreático e de pulmão, bem como linhagens de células cancerígenas humanas. A expressão é mais proeminente nos subtipos de adenocarcinoma dessas indicações.
O peso molecular da proteína difere em alguns cânceres e tecido adjacente normal. A proteína de maior peso molecular observada em tecido saudável pode ser transferida para o mesmo peso molecular, conforme observado em câncer, através de tratamento de lisatos teciduais com o composto de desglicosilação PNGase F. Isso sugere que CLD18 é menos N-glicosilada em câncer quando comparado com sua contraparte em tecido normal. Essa diferença estrutural provavelmente dá origem a um epítopo alterado. Um motivo de N-glicosilação clássico está na posição aa 116 dentro do domínio de loopD3 da molécula.
Os termos "CLD18" e "variante de CLD18", de acordo com a invenção, abrangerão (i) variantes com splicing de CLD18, (ii) variantes de N-glicosilação de CLD18, (iii) variantes conformacionais de CLD18, (iv) variantes isentas de CLD18 e homotípica/heterotipicamente associadas localizadas em "tight junctions" intercelulares e (v) variantes CLD18 relacionadas a câncer e CLD18-não relacionadas a câncer.
As características moleculares e funcionais de CLD18 tornam essa molécula um alvo altamente interessante para terapia de câncer baseada em anticorpos. Essas são, em particular, (i) a ausência de CLD18 da vasta maioria de tecidos normais com toxicidade relevante, (ii) a restrição de expressão da variante CLD18A2 em uma população de células como células gástricas diferenciadas, as quais podem ser substituídas por células tronco alvo-negativas do estômago, (iii) indica uma glicosilação diferencial potencial entre células normais e neoplásicas, e (iv) a presença de diferentes topologias conformacionais. Além disso, o papel de CLD18 como uma proteína de "tight junction" pode ainda contribuir para uma boa janela terapêutica. Em virtude do fato de células tumorígenas expressarem claudinas, mas freqüentemente não formarem "tight junctions" clássicas para associação homotípica e heterotipica de claudinas, conforme encontrado em tecido epitelial normal, células tumorígenas podem ter um reservatório considerável de claudin livre que é passível de ligação por anticorpo extracelular e imunoterapia. É possível que o acesso de epítopos de ligação de claudinas em epitélio saudável seja impedido dentro de "tight junctions" por tais anticorpos.
O objetivo da invenção é proporcionar anticorpos úteis para terapia de doenças em que CLD18 é expressa, tais como doenças tumorígenas. Os anticorpos descritos aqui também têm utilidade no diagnóstico de tais doenças. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona, em geral, anticorpos úteis como produtos terapêuticos para tratamento e/ou prevenção de doenças associadas às células expressando CLD18, incluindo doenças relacionadas a tumor, tais como câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer da vesícula biliar.
Em um aspecto, a invenção se refere a um anticorpo com a capacidade de se ligar à CLD18 e mediar a morte de células expressando CLD18. De preferência, o anticorpo se liga à CLD18A1 e CLD18A2 e, mais preferivelmente, se liga à CLD18A2, mas não à CLD18A1. De preferência, anticorpos da invenção se ligam ao e são específicos para o loopl ou 1οορ2 da Conformação 1 de CLD. Em outras modalidades preferidas, o anticorpo da invenção se liga ao e é específico para o loopD3 da Conformação 2 de CLD e, em particular, se liga em, ou em torno de um sítio de N- glicosilação potencial na posição 116 dentro do loopD3. Em outras modalidades, o anticorpo da invenção é específico para a forma não glicosilada do sítio de N-glicosilação potencial na posição 116 dentro do loopD3.
A morte de células através do anticorpo da invenção é, de preferência, induzida através da ligação do anticorpo à CLD18 expressa pelas referidas células, mais preferivelmente através de ligação do anticorpo à CLD18A2 expressa pelas referidas células. Em uma modalidade, ligação do anticorpo da invenção à CLD18A1 expressa pelas referidas células não induz a morte das referidas células.
As células expressando CLD18 são, de preferência, células cancerígenas e são, em particular, selecionadas do grupo consistindo de células de câncer gástrico tumorigênico, esofageal, pancreático, de pulmão, ovariano, cólon, hepático, de cabeça-pescoço e de vesícula biliar.
De preferência, o anticorpo da invenção media a morte de células através da indução de Iise mediada por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), apoptose, adesão homotipica e/ou fagocitose, de preferência através da indução de Iise mediada por CDC e/ou Iise mediada por ADCC.
Em uma modalidade, o anticorpo da invenção, não induz a Iise de células mediada por CDC.
De preferência, a lise de células mediada por ADCC ocorre na presença de células efetoras as quais, em modalidades particulares, são selecionadas do grupo consistindo de monócitos, células mononucleares, células NK e PMNs, e a fagocitose é através de macrófagos.
O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo monoclonal, quimérico, humano ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo e pode ser selecionado do grupo consistindo de um anticorpo de IgGl, um de IgG2, de preferência IgG2a e IgG2b, um de IgG3, um de IgG4, um de IgM, um de IgAl, um de- IgA2, um de uma IgA secretora, um de IgD e um de IgE.
De acordo com todos os aspectos da invenção, CLD18 é, de preferência, CLD18 humana, de preferência CLD18A2 humana e a CLD18A2 tem, de preferência, a seqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 e CLD18A1 tem, de preferência, a seqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 8. Em modalidades particularmente preferidas, o anticorpo da invenção se liga a epitopos nativos de CLD18 presentes sobre a superfície de células vivas. Em outras modalidades preferidas, o anticorpo da invenção é específico para células cancerígenas, de preferência células de câncer de estômago.
Em determinadas modalidades da invenção, a CLD18 é expressa sobre a superfície de células.
Anticorpos da invenção podem ser obtidos através de um método compreendendo a etapa de imunização de um animal com uma proteína ou peptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 21-23 e 26-31 ou um fragmento imunogênico das mesmas ou um ácido nucléico ou célula hospedeira expressando a referida proteína ou peptídeo ou um fragmento imunogênico dos mesmos. De preferência, um anticorpo da invenção é específico para as proteínas, os peptídeos ou fragmentos imunogênicos dos mesmos antes mencionados.
Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo da invenção é produzido por um clone com o no. de acesso DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106- 056), DSM ACC2739 (182-D1106-057) , DSM ACC2740 (182-D1106- 058), DSM ACC2741 (182-D1106-059) , DSM ACC2742 (182- D1106- 062), DSM ACC2743 (182-D 1106-067), DSM ACC2745 (182-D758- 035), DSM ACC2746 (182-D758-036) , DSM ACC2747 (182-D758- 040), DSM ACC27 48 (182-D1106-061) , DSM ACC2808 (182-D1106- 279), DSM ACC28 09 (182-D1106-294) ou DSM ACC2810 (182- D1106-362).
Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é acoplado a um agente terapêutico, tal como uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
Em outro aspecto, a invenção se refere a um hibridoma capaz de produzir o anticorpo da invenção. Hibridomas preferidos são aqueles tendo o no. de acesso DSM ACC2737 (182-D1106-055) , DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182- D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294) ou DSM ACC2810 (182-D1106-362).
Os anticorpos da invenção são designados aqui através de referência à designação do anticorpo, por exemplo, 182- D758-035 e/ou através de referência ao clone que produz o anticorpo, por exemplo, 26D12.
A invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção e/ou um conjugado do mesmo com um agente terapêutico e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de inibição de crescimento e/ou morte de uma célula expressando CLD18, de preferência CLD18A2, compreendendo o contato da célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção e/ou um conjugado do mesmo com um agente terapêutico. CLD18 é, de preferência, expressa sobre a superfície da referida célula.
Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células que expressam CLD18, de preferência CLD18A2, compreendendo administração, a um indivíduo, de um anticorpo da invenção, um conjugado do mesmo com um agente terapêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo da invenção ou o conjugado do mesmo com um agente terapêutico. De preferência, a doença ou distúrbio é uma doença relacionada a tumor e, em modalidades particulares, é selecionado do grupo consistindo de câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer da vesícula biliar. CLD18 é, de preferência, expressa sobre a superfície das referidas células. De preferência, os anticorpos da invenção têm a capacidade de discriminar variantes de CLD18 expressas por diferentes tipos de célula, incluindo células cancerígenas e células não malignas. Em uma modalidade particularmente preferida, os anticorpos da invenção têm a capacidade de se ligar à CLD18A2, ao mesmo tempo em que eles não se li'gam à CLD18A1 ou se ligam à CLD18A1 com uma menor especificidade, comparado com a especificidade de ligação à CLD18A2.
O termo "ligação", de acordo com a invenção se refere, de preferência, a uma ligação especifica. "Ligação especifica" significa que um agente, tal como um anticorpo, se liga mais forte a um alvo, tal como um epitopo para o qual ele é específico, comparado com a ligação a outro alvo. Um agente se liga mais forte a um primeiro alvo comparado com um segundo alvo se ele se liga ao primeiro alvo com uma constante de dissociação (K0) a qual é menor do que a constante de dissociação para o segundo alvo. De preferência, a constante de dissociação (K0) para o _alyo_._ao. qual o agente se liga especificamente é mais de 10 vezes, de preferência mais de 20 vezes, mais preferivelmente mais de 50 vezes, ainda mais preferivelmente mais de 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes menor do que a constante de dissociação (K0) para o alvo ao qual o agente não se liga especificamente. Os anticorpos da invenção mediam a morte de células expressando CLD18, de preferência CLD18A2, através de ligação à CLD18, de preferência expressa sobre a superfície das referidas células. Em uma modalidade, anticorpos da invenção induzem a citotoxicidade dependente de complemento (CDC), por exemplo, pelo menos cerca de 20/40% de uma Iise mediada por CDC, de preferência cerca de 40-50% de uma Iise mediada por CDC e, mais preferivelmente, mais de 50% de uma lise mediada por CDC de células expressando CLD18. Tais anticorpos são exemplificados aqui pelos seguintes anticorpos: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163E12 e ch-175D10. Alternativamente, ou além de indução de CDC, os anticorpos da invenção podem induzir à citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de células expressando CLDl8 na presença de células efetoras (por exemplo, monócitos, células mononucleares, células NK e PMNs). Tais anticorpos são exemplificados aqui pelos seguintes anticorpos: 37G11, 37 H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1 e 125E1. Os anticorpos da invenção podem ter a capacidade de induzir a apoptose de células expressando CLD18, de induzir a adesão homotípica de células expressando CLD18 e/ou de induzir a fagocitose de células expressando CLD18 na presença de macrófagos. Os anticorpos da invenção podem ter uma ou mais das propriedades funcionais descritas acima. De preferência, os anticorpos da invenção induzem a Iise mediada por CDC e a lise mediada por ADCC de células expressando CLD18 e, mais preferivelmente, eles induzem a Iise mediada por ADCC de células expressando CLD18, ao mesmo tempo em que eles não induzem a Iise mediada por CDC das referidas células. Células alvo exemplificativas para anticorpos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, células cancerígenas expressando CLD18, de preferência CLD18A2, tais como células tumorigênicas de câncer gástrico, pancreático, esofageal e de pulmão. Em uma modalidade particularmente preferida, morte de células mediada pelos anticorpos da invenção é específica a CLD18A2, isto é, os anticorpos da invenção mediam a morte de células, preferencialmente Iise celular mediada por CDC ou ADCC, expressando CLD18A2, mas não mediam a morte de células expressando CLD18A1 embora não expressando CLD18A2. Os anticorpos descritos acima podem ser usados para mediar a morte de células tumorígenas no tratamento ou prevenção de câncer, tal como câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer da vesícula biliar. Anticorpos da invenção podem ser classificados em classes distintas de acordo com suas propriedades de ligação e sua capacidade de mediar a função efetora sobre células expressando CLD18. Os anticorpos da invenção podem ser classificados de acordo com:
• suas propriedades de ligação a e/ou funções efetoras mediadas sobre células expressando ou CLD18A1 ou CLD18A2 (discriminação de variantes com splicing de CLD18),
• suas propriedades de ligação e/ou funções efetoras mediadas sobre células expressando ou variantes de CLD18 glicosiladas ou não glicosiladas (discriminação entre variantes de CLD18 com e sem N-glicosilação) ,
• suas propriedades de ligação a e/ou funções efetoras mediadas sobre células cancerígenas ou tipos de células normais (discriminação entre variantes de CLD18 expressas por células tumorígenas ou células normais não malignas),
• suas propriedades de ligação a epítopos de CLD18 disfarçados pela formação de "tight junctions",
• suas capacidades de induzir à formação de agregado de CLD18 sobre células vivas, e
• suas capacidades de ligação a uma variante de CLD18 não humana, particularmente variante de CLD18 de camundongos, ratos, coelhos e primatas.
Os anticorpos da invenção podem ter uma ou mais das seguintes propriedades, pelo que referência é fornecida a exemplos específicos de anticorpos da invenção descritos aqui (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-4 5C1, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10) :
a) ligação à CLD18A2, bem como à CLD18A1 (por exemplo, 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2 e 41C6)
b) ligação à CLD18A2, mas não à CLD18A1 (por exemplo, 26B5, 37G11, 38G5, 42E12 e 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch-163E12, ch- 166E2, ch-175D10),
c) ligação à CLD18 naturalmente expressa por células tumorigenas, mas não à CLD18 naturalmente expressa por células ou tecidos não cancerígenos, tais como células de estômago e pulmão (por exemplo, 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10),
d) mediação de morte induzida por CDC de células as quais expressam CLD18A2, mas não de células as quais expressam CLD18A1 (por exemplo, 26D12, 28D10, 37H8 e 39F11, 163E12, ch-125El, ch-163El 2, ch-175D10),
e) mediação de morte induzida por ADCC de células expressando CLD18 (por exemplo, 26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12 e 61C2, ch-163E12, ch-175D10), f) mediação de morte induzida por ADCC, mas não de morte mediada por CDC de células expressando CLD18 (por exemplo, 37G11, 42E12 e 43A11),
g) mediação de morte induzida por ADCC e de morte induzida por CDC de células expressando CLD18A2 (por exemplo, 37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).
Conforme exemplificado aqui, os anticorpos da invenção ainda abrangem moléculas as quais:
a) se ligam às células diferenciadas de estômago normal, mas não às células tronco do estômago (por exemplo, 39F11),
b) não se ligam ao tecido gástrico normal, bem como outros órgãos normais, mas exclusivamente às células cancerígenas (por exemplo, 26B5),
c) se ligam a um epítopo abrangendo uma Asn não glicosilada na posição 116 de CLD18,
d) se ligam à CLD18 humana, bem como de camundongo, permitindo realizar estudos de toxicidade pré-clínicos em camundongos.
Os anticorpos da invenção podem ser derivados de diferentes espécies incluindo, mas não limitado a camundongo, rato, coelho, porco-da-índia e ser humano. Os anticorpos da invenção também incluem moléculas quiméricas nas quais uma região constante de anticorpo derivada de uma espécie, de preferência um ser humano, é combinada com o sitio de ligação a antigeno derivado de outra espécie. Além disso, os anticorpos da invenção incluem moléculas humanizadas nas quais os sítios de ligação a antigeno de um anticorpo derivado de uma espécie não humana são combinados com as regiões constantes e de "framework" de origem humana.
Os anticorpos da invenção incluem anticorpos policlonais e monoclonais e incluem anticorpos de IgG2a (por exemplo, IgG2a, κ, λ) , IgG2b (por exemplo, IgG2b, κ, λ), IgG3 (por exemplo, IgG3, κ, λ) e IgM. Contudo, outros isotipos de anticorpo também são abrangidos pela invenção, incluindo anticorpos de IgGl, IgAl, IgA2, IgA secretora, IgD e IgE. Os anticorpos podem ser anticorpos inteiros ou fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, incluindo, por exemplo, fragmentos Fab, F(ab')2^ Fv, Fv com cadeia simples ou anticorpos bi-específicos. Além disso, os fragmentos de ligação a antigeno incluem proteínas de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação compreendendo (i) um polipeptídeo com domínio de ligação (tal como uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve) que é fundido a um polipeptídeo de região de dobradiça de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de dobradiça e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região constante CH2. Tais proteínas de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação são ainda divulgadas no US2003/0118592 e US 2003/0133939.
Os anticorpos da presente invenção se dissociam, de preferência, da CLD18 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de aproximadamente 1-100 nM ou menos. De preferência, os anticorpos da invenção não reagem cruzadamente com antígenos relacionados à superfície celular e, assim, não inibem sua função.
Em modalidades preferidas, os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades:
a) especificidade pela CLD18, em particular especificidade pela CLD18A2;
b) uma afinidade de ligação à CLD18, em particular CLD18A2, de cerca de 100 nM ou menos, de preferência cerca de 5-10 nM ou menos e, mais preferivelmente, cerca de 1-3 nM ou menos;
c) a capacidade de mediar um alto nível de CDC sobre células CD55/59 negativas ou CD55/59 positivas;
d) a capacidade de inibir o crescimento de células as quais expressam CLD18;
e) a capacidade de induzir a apoptose de células as quais expressam CLD18;
f) a capacidade de induzir a adesão homotípica de células as quais expressam CLD18;
g) a capacidade de induzir a ADCC de células as quais expressam CLD18 na presença de células efetoras;
h) a capacidade de prolongar a sobrevivência de um indivíduo com células tumorígenas as quais expressam CLD18;
i) a capacidade de eliminar células as quais expressam CLDl8;
j) a capacidade de eliminar células as quais expressam baixos níveis de CLDl8; e/ou
k) a capacidade de agregar CLD18 sobre a superfície de células vivas.
Os anticorpos anti-CLD18 da presente invenção podem ser derivatizados, ligados a ou co-expressos a outras especificidades de ligação. Em uma modalidade particular, a invenção proporciona uma molécula bi-específica ou multi- específica compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação pela CLD18 (por exemplo, um anticorpo anti-CLD18 ou mimético do mesmo) e uma segunda especificidade de ligação por uma célula efetora, tal como uma especificidade de ligação por um receptor de Fc (por exemplo, um receptor de Fc-gama, tal como Fc-gama RI ou qualquer outro receptor de Fc) ou um receptor de células T, por exemplo, CD3.
Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculas bi-especificas e multi-especificas que se ligam à CLD18 e a um receptor de Fc ou um receptor de células T, por exemplo, CD3. Exemplos de receptores de Fc são receptor de IgG, receptor de Fc-gama (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Outros receptores de Fe, tais como receptores de IgA (por exemplo, FcaRI) , também podem ser objetivados. 0 receptor de Fc está, de preferência, localizado sobre a superfície de uma célula efetora, por exemplo, um monócito, macrófago ou uma célula mononuclear ativada. Em uma modalidade preferida, as moléculas bi- específicas e multi-específicas se ligam a um receptor de Fc em um sítio o qual é distinto do sítio de ligação Fc de imunoglobulina (por exemplo, IgG ou IgA) do receptor. Portanto, as ligações das moléculas bi-específicas e multi- específicas não são bloqueadas por níveis fisiológicos de imunoglobulinas. Em ainda outro aspecto, os anticorpos anti-CLD18 da invenção são derivatizados, ligados a ou co-expressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab1). Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra) a uma ou mais entidades moleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, para produzir um anticorpo bi-especifico ou multi-especifico), uma citotoxina, ligante celular ou antigeno (por exemplo, para produzir um imunoconjugado, tal como uma imunotoxina) . Um anticorpo da presente invenção pode ser ligado a outras porções terapêuticas, por exemplo, um radioisótopo, um fármaco anti-câncer de pequena molécula, uma citocina ou quimiocina recombinante. Conseqüentemente, a presente invenção abrange uma grande variedade de conjugados de anticorpo, moléculas bi-especificas e multi-especificas e proteínas de fusão, todos os quais se ligam às células expressando CLD18 e os quais podem ser usados para objetivar outras moléculas a tais células.
Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona composições, por exemplo, composições/kits farmacêuticos e de diagnósticos, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável formulado junto com um ou uma combinação de anticorpos da invenção. Em uma modalidade particular, a composição inclui uma combinação de anticorpos os quais se ligam a epítopos distintos ou os quais possuem características funcionais distintas, tais como indução de CDC e/ou ADCC e indução de apoptose. Nessa modalidade da invenção, anticorpos podem ser usados em combinação, por exemplo, como uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos monoclonais anti-CLD18. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 tendo atividades diferentes, mas complementares, podem ser combinados em uma única terapia para obter um efeito terapêutico desejado. Em uma modalidade preferida, a composição inclui um anticorpo anti-CLD18 que media a CDC combinado com outro anticorpo anti-CLD18 que induz a apoptose. Em outra modalidade, a composição inclui um anticorpo anti-CLD18 que media morte altamente eficaz de células alvo na presença de células efetoras, combinado com outro anticorpo anti-CLD18 que inibe o crescimento de células expressando CLD18.
A presente invenção também inclui a administração simultânea ou seqüencial de dois ou mais anticorpos anti- CLD18 da invenção, em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um anticorpo anti-CLD18 quimérico e pelo menos outro anticorpo é um anticorpo anti-CLD18 humano, os anticorpos se ligando aos mesmos ou diferentes epítopos de CLD18. De preferência, um anticorpo anti-CLD18 quimérico da invenção é administrado primeiro, seguido pela administração de um anticorpo anti-CLD18 humano da invenção, em que o anticorpo anti-CLD18 humano é, de preferência, administrado durante um período de tempo prolongado, isto é, como terapia de manutenção. Anticorpos, imunoconjugados, moléculas bi-específicas e multi-especificas e composições da presente invenção podem ser usados em uma variedade de métodos para inibição de crescimento de células expressando CLD18, em particular CLD18A2 e/ou matar seletivamente células expressando CLD18, em particular CLD18A2, através do contato das células com uma quantidade eficaz do anticorpo, imunoconjugado, molécula bi-especifica/multi-especifica ou composição, de. modo que o crescimento da célula é inibido e/ou a célula é morta. Em uma modalidade, o método inclui morte da célula expressando CLD18, opcionalmente na presença de células efetoras, por exemplo, através de CDC, apoptose, ADCC, fagocitose ou através de uma combinação de dois ou mais desses mecanismos. Células expressando CLD18 as quais podem ser inibidas ou mortas usando os anticorpos da invenção incluem células cancerígenas, tais como células tumorigênicas de estômago, pancreáticas, esofageais, de pulmão, ovarianas, de cólon, hepáticas, de cabeça-pescoço e vesícula biliar.
Conseqüentemente, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar e/ou prevenir uma variedade de doenças envolvendo células expressando CLD18 através de administração dos anticorpos a pacientes que sofrem de tais doenças. Doenças exemplificativas que podem ser tratadas (por exemplo, aliviadas) ou prevenidas incluem, mas não estão limitados a, doenças tumorigênicas. Exemplos de doenças tumorigênicas as quais podem ser tratadas e/ou prevenidas incluem câncer gástrico, câncer pancreático, câncer esofageal, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer cólon-retal, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer da vesicula biliar.
Em uma modalidade particular da invenção, o indivíduo ao qual está sendo administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um agente quimioterapêutico, radiação ou um agente que modula, por exemplo, intensifica ou inibe, a expressão ou atividade de um receptor de Fc, por exemplo, um receptor Fc-gama, tal como uma citocina. Citocinas típicas para administração durante tratamento incluem fator de estimulação de colônia de granulócito (G- CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito- macrófago (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF). Agentes terapêuticos típicos incluem, dentre outros, agentes anti-neoplásicos, tais como doxorubicina, cisplatina, taxotero, 5-fluoruracila, metotrexato, gencitabina e ciclofosfamida.
Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a uma estratégia de imunização para imunizar animais não-humanos, tais como camundongos, com CLDl8 humana ou um fragmento peptidico da mesma, de preferência CLD18A2 ou um fragmento peptídico da mesma, para obter anticorpos. Peptideos preferidos para imunização são aqueles selecionados do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31. Conseqüentemente, em modalidades preferidas, os anticorpos da invenção são aqueles obtidos através de imunização usando peptideos selecionados do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31. Analogamente, anticorpos para CLD18 podem ser gerados em um animal não-humano transgênico, tal como um camundongo transgênico. O animal não-humano transgênico pode ser um camundongo transgênico tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve que codifica toda ou uma porção do anticorpo.
Animais do tipo silvestre, bem como não-humanos transgênicos podem ser imunizados com um preparado purificado ou enriquecido de antigeno CLD18 e/ou ácidos nucléicos e/ou células expressando CLD18 ou um fragmento peptidico da mesma. De preferência, o animal não-humano é capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgM) sofrendo recombinação V-D-J e troca de isotipo. Troca de isotipo pode ocorrer, por exemplo, através de troca de isotipo clássica ou não clássica. Conseqüentemente, em ainda outro aspecto, a invenção proporciona células B isoladas a partir de um animal não- humano, conforme descrito acima. As células B isoladas podem, então, ser imortalizadas através de fusão a uma célula imortalizada para fornecer uma fonte (por exemplo, um hibridoma) de anticorpos da invenção. Tais hibridomas (isto é, os quais produzem os anticorpos da invenção) são também incluídos dentro do escopo da invenção.
Conforme exemplificado aqui, os anticorpos da invenção podem ser obtidos diretamente de hibridomas os quais expressam o anticorpo ou podem ser clonados e recombinantemente expressos em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula CHO ou uma célula linfocitica). Outros exemplos de células hospedeiras são microorganismos, tais como E. coli e fungos, tais como leveduras.
Alternativamente, eles podem ser produzidos recombinantemente em um animal não-humano ou planta transgênica.
Células de hibridoma preferidas para produção de anticorpos da invenção são aquelas seqüenciadas ou depositadas no DSMZ (Mascheroder Weg lb, 31824 Braunschweig, Alemanha; novo endereço: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Alemanha) tendo as seguintes designações e números de acesso: a. 182-D1106-055, no. de acesso DSM ACC2737, depositada em 19 de Outubro de 2005
b. 182-D1106-056, no. de acesso DSM ACC2738, depositada em 19 de Outubro de 2005
c. 182-D1106-057, no. de acesso DSM ACC2739, depositada em 19 de Outubro de 2005
d. 182-D1106-058, no. de acesso DSM ACC2740, depositada em 19 de Outubro de 2005
e. 182-D1106-059, no. de acesso DSM ACC2741, depositada em 19 de Outubro de 2005
f. 182-D1106-062, no. de acesso DSM ACC2742, depositada em 19 de Outubro de 2005,
g. 182-D1106-067, no. de acesso DSM ACC2743, depositada em 19 de Outubro de 2005
h. 182-D758-035, no. de acesso DSM ACC2745, depositada em 17 de Novembro de 2005
i. 182-D758-036, no. de acesso DSM ACC2746, depositada em 17 de Novembro de 2005
j. 182-D758-040, no. de acesso DSM ACC2747, depositada em 17 de Novembro de 2005
k. 182-D1106-061, no. de acesso DSM ACC2748, depositada em 17 de Novembro de 2005
1. 182-D1106-279, no. de acesso DSM ACC2808, depositada em 26 de Outubro de 2006 m. 182-D1106-294, no. de acesso DSM ACC2809, depositada em 26 de Outubro de 2006,
n. 182-D1106-362, no. de acesso DSM ACC2810, depositada em 26 de Outubro de 2006.
Anticorpos preferidos da invenção são aqueles produzidos por e obteniveis dos hibridomas descritos acima; isto é, 37G11 no caso de 182-D1106-055, 37H8 no caso de 182-D1106-056, 38G5 no caso de 182-D1106-057, 38H3 no caso de 182-D1106-058, 39F11 no caso de 182-D1106-059, 43A11 no caso de 182-D1106-062, 61C2 no caso de 182-D1106-067, 26B5 no caso de 182-D758-035, 26D12 no caso de 182-D758-036, 28D10 no caso de 182-D758-040, 42E12 no caso de 182-D1106- 061, 125E1 no caso de 182-D1106-279, 163E12 no caso de 182- D1106-294 e 175D10 no caso de 182-D1106-362; e as formas quimerizadas e humanizadas dos mesmos.
Em modalidades preferidas, os anticorpos, em particular formas quimerizadas de anticorpos de acordo com a invenção, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada (CH) compreendendo uma seqüência de aminoácido derivada de uma região constante de cadeia pesada humana, tal como a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 46 ou 150 ou um fragmento das mesmas. Em outras modalidades preferidas, os anticorpos, em particular formas quimerizadas de anticorpos de acordo com a invenção, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia leve (CL) compreendendo uma seqüência de aminoácido derivada de uma região constante de cadeia leve humana, tal como a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 41 ou 148 ou um fragmento das mesmas. Em uma modalidade preferida particular, os anticorpos, em particular formas quimerizadas de anticorpos de acordo com a invenção, incluem anticorpos os quais compreendem uma CH compreendendo uma seqüência de aminoácido derivada de uma CH humana, tal como a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 46 ou 150 ou um fragmento das mesmas e o qual compreende uma CL compreendendo uma seqüência de aminoácido derivada de uma CL humana, tal como a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 41 ou 148 ou um fragmento das mesmas.
Uma CH compreendendo a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 46 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 45. Uma CH compreendendo a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 150 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 149. Uma CL compreendendo a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 41 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 40. Uma CL compreendendo a seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 148 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 147 .
Em determinadas modalidades preferidas, formas quimerizadas de anticorpos incluem anticorpos compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120 e um fragmento das mesmas e/ou compreendendo uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 e um fragmento das mesmas.
Em determinadas modalidades preferidas, formas quiméricas de anticorpos incluem anticorpos compreendendo uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves selecionadas das seguintes possibilidades de (i) a (ix) :
(i) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 115 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 122 ou um fragmento da mesma, (ii) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 116 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 121 ou um fragmento da mesma,
(iii) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 117 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 123 ou um fragmento da mesma,
(iv) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 119 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 126 ou um fragmento da mesma,
(v) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 118 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 125 ou um fragmento da mesma,
(vi) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 124 ou um fragmento da mesma,
(vii) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 127 ou um fragmento da mesma,
(viii) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 128 ou um fragmento da mesma, e
(ix) a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 129 ou um fragmento da mesma.
"Fragmento" ou "fragmento de uma seqüência de aminoácido", conforme usado acima, se refere a uma parte de uma seqüência de anticorpo, isto é, uma seqüência a qual representa a seqüência de anticorpo encurtada no N- e/ou C- término a qual, que, quando substitui a referida seqüência de anticorpo em um anticorpo, retém a ligação do referido anticorpo à CLD18 e, de preferência, funções do referido anticorpo conforme descrito aqui, por exemplo, lise mediada por CDC ou Iise mediada por ADCC. De preferência, um fragmento de uma seqüência de aminoácido compreende pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos resíduos de aminoácido da referida seqüência de aminoácido. Um fragmento de uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, Ί26, 127, 128 e 129 se refere, de preferência, à referida seqüência em que 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos no N-término são removidos. Fragmentos de seqüências de aminoácido descritos aqui podem ser codificados pelos respectivos fragmentos de seqüências de ácido nucléico que codificam as referidas seqüências de aminoácido.
Uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 115 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 100. Uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 116 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 101. Uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 117 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 102. Uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 119 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 104. Uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 118 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 103. Uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 120 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 105.
Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 122 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 107. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 121 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 106. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 123 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 108. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 6 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 111. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 125 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 110. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 124 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 109. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 127 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 112. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 128 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 113. Uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 129 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 114.
Em uma modalidade preferida, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137 e um fragmento das mesmas.
Em uma modalidade preferida, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 e um fragmento das mesmas.
Em determinadas modalidades preferidas, um anticorpo da invenção compreende uma combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionada das seguintes possibilidades de (i) a (ix) :
(i) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 132 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 139 ou um fragmento da mesma,
(ii) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 133 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 138 ou um fragmento da mesma,
(iii) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 134 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 140 ou um fragmento da mesma, (iv) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 136 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 143 ou um fragmento da mesma,
(v) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 135 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 142 ou um fragmento da mesma,
(vi) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento da mesma e
a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 141 ou um fragmento da mesma,
(vii) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento da mesma e
a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 144 ou um fragmento da mesma,
(viii) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 145 ou um fragmento da mesma,
(ix) a VH compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14 6 ou um fragmento da mesma. Uma VH compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 132 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 55. Uma VH compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 133 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 56. Uma VH compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 134 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 57. Uma VH compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 136 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 59. Uma VH compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 135 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 58. Uma VH compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 137 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 60.
Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 139 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 52. Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 138 pode ser codificada por. um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 61.
Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 140 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 63. Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 143 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 66. Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 142 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 65. Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 141 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 64. Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 144 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 67. Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 145 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 68. Uma VL compreendendo uma seqüência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 146 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 69.
Em uma modalidade preferida, um anticorpo da invenção compreende uma VH compreendendo um conjunto de regiões de determinação de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 selecionada das seguintes modalidades (i) a (vi):
(i) CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2:
posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116- 125 de SEQ ID NO: 115,
(ii) CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116,
(iii) CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117,
(iv) CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116- 126 de SEQ ID NO: 118,
(v) CDRl: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, e (vi) CDRl: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120.
Em uma modalidade preferida, um anticorpo da invenção compreende uma VL compreendendo um conjunto de regiões de determinação de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 selecionado das seguintes modalidades (i) a (ix) :
(i) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121,
(ii) CDRl: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122,
(iii) CDRl: posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123,
(iv) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115- 123 de SEQ ID NO: 124,
(v) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125,
(vi) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126,
(vii) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127,
(viii) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e
(ix) CDRl: posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Em uma modalidade preferida, um anticorpo da invenção compreende uma combinação de VH e VL, cada uma compreendendo um conjunto de regiões de determinação de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas das seguintes modalidades de (i) a (ix):
(i) VH: CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDRl: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110- 118 de SEQ ID NO: 122,
(ii) VH: CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115- 123 de SEQ ID NO: 121,
(iii) VH: CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-
124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDRl: posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123,
(iv) VH: CDRl: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 126,
CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115- 122 de SEQ ID NO: 126,
(v) VH: CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125,
CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115- 123 de SEQ ID NO: 125,
(vi) VH: CDRl: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124,
CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115- 123 de SEQ ID NO: 124,
(vii) VH: CDRl: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117- 128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127,
(viii) VH: CDRl: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117- 128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e
(ix) VH: CDRl: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109- 117 de SEQ ID NO: 129.
Em outras modalidades preferidas, um anticorpo da invenção compreende, de preferência, uma ou mais das regiões de determinação de complementaridade (CDRs), de preferência, pelo menos a região variável de CDR3, da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18, de preferência, de um anticorpo monoclonal contra CLD18, descrito aqui e, de preferência, compreende uma ou mais das regiões de determinação de complementaridade (CDRs), de preferência pelo menos a região variável CDR3, das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) descritas aqui. Em uma modalidade, a referida uma ou mais das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) são selecionadas de um conjunto de regiões de determinação de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 descritas aqui. Em uma modalidade particularmente preferida, um anticorpo da invenção compreende, de preferência, as regiões de determinação de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18, de preferência, de um anticorpo monoclonal contra CLD18 descrito aqui e, de preferência, compreende as regiões de determinação de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) descritas aqui.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreendendo uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui compreende as referidas CDRs junto com suas regiões de "framework" intervenientes. De preferência, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50% de uma ou de ambas as primeiras e quartas regiões de "framework", os 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região de "framework" e os 50% N-terminais da quarta região de "framework". A construção de anticorpos da presente invenção feitos através de técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais nas regiões variáveis codificadas por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação, incluindo a introdução de ligantes para unir regiões variáveis da invenção a outras seqüências de proteína, incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de dianticorpos) ou marcadores de proteína.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreendendo uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui, compreende as referidas CDRs em- uma "framework" de anticorpo humano.
Referência aqui a um anticorpo compreendendo, com relação à cadeia pesada do mesmo, uma cadeia em particular ou uma região em particular ou seqüência, de preferência, se refere à situação em que todas as cadeias pesadas do referido anticorpo compreendem a referida cadeia, região ou seqüência em particular. Isso se aplica, correspondentemente, à cadeia leve de um anticorpo.
A presente invenção também se refere a ácidos nucléicos compreendendo genes ou seqüências de ácido nucléico que codificam anticorpos ou partes dos mesmos, por exemplo, uma cadeia de anticorpo, conforme descrito aqui. Os ácidos nucléicos podem estar compreendidos em um vetor, por exemplo, um plasmideo, cosmídeo, vírus, bacteriófago ou outro vetor usado, por exemplo, convencionalmente em engenharia genética. 0 vetor pode compreender outros genes, tais como genes marcadores, os quais permitem a seleção do vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Além disso, o vetor pode compreender elementos de controle de expressão que permitem a expressão apropriada das regiões de codificação em hospedeiros adequados. Tais elementos de controle são conhecidos pelo técnico e podem incluir um promotor, um cassete de ligação e um códon de início de tradução.
De preferência, o ácido nucléico da invenção é operativamente ligado às seqüências de controle de expressão acima, permitindo a expressão em células eucariotas ou procariotas. Elementos de controle que asseguram a expressão em células procariotas ou eucariotas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Métodos para a construção de moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, para a construção de vetores compreendendo as moléculas de ácido nucléico acima, para a introdução dos vetores em células hospedeiras apropriadamente escolhidas, para causar ou obter a expressão são bem conhecidos na técnica.
Outro aspecto da presente invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico ou vetor, conforme divulgado aqui.
Outras características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra uma análise por imunofluorescência de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 acoplada a um fluorocromo verde e que reagiram com soro de camundongo após imunização com DNA com SEQ ID NO: 15 fundida a um epítopo auxiliar.
A Figura 2 mostra uma análise de Western blot de células HEK293 transfectadas com CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3) e células HEK293 não transfectadas com o anticorpo monoclonal de camundongo anti-c-myc 9E1 1 (Serotec, CRL MCA22 00).
A Figura 3 mostra uma análise por imunofluorescência usando células CHO transfectadas com CLD18A2 e o anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000).
As Figuras 4A e B mostram a ligação de sobrenadantes de hibridoma 24H5 e 85A3 às células HEK293 transitoriamente transfectadas com CLD18A2 humana e um marcador fluorescente, conforme determinado através de citometria de fluxo. A Figura 4C mostra a ligação de sobrenadantes de hibridoma 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 às células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana e contra-coradas com iodeto de propidio.
A Figura 5 mostra a ligação de sobrenadantes de hibridoma 24H5 (A), 9E8 (Β), 26B5 (C) e 19B9 (D) às células HEK293 transitoriamente transfectadas com um marcador fluorescente e CLD18A2 humana ou CLD18A2-Myc ou CLD18A2-HA, conforme analisado através de citometria de fluxo.
As Figuras 6A e B mostram a ligação de sobrenadantes de hibridoma 37H8, 43A11, 45C1 e 163E12 às células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 ou CLD18A1 humana, conforme determinado através de citometria de fluxo.
A Figura 7 mostra uma análise por imunofluorescência do anticorpo monoclonal 37G11 especifico para a isoforma CLD18A2 através da coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D) , respectivamente, sob condições nativas (A, B) e com fixação com paraformaldeido (C, D) .
A Figura 8 mostra uma análise por imunofluorescência do anticorpo monoclonal 26B5 à CLD18 através de coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D) , respectivamente, sob condições nativas (A, Β) e com fixação com paraformaldeido (C, D).
Figura 9 RT-PCR de linhagem de célula
Análise por RT-PCR com primers específicos a CLD18A2 mostrou expressão clara em 4/5 das linhagens de células testadas.
A Figura 10 mostra uma análise por imunofluorescência de células DAN-G (subclone F2) e um anticorpo policlonal antÍ-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000).
A Figura 11 mostra uma análise por imunofluorescência de células KATO-III (subclone 3B9 4D5) e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000) .
A Figura 12A mostra uma análise por imunofluorescência de células SNU-16 (subclone G5) com um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Figura 12B mostra uma análise por imunofluorescência de células KATO- III com anticorpos monoclonais da invenção.
A Figura 13 mostra a expressão na superfície de CLD18 sobre células KATO-III e NUGC-4, conforme analisado através de coloração das células com anticorpos monoclonais 61C2 e 163E12, seguido por análise por citometria de fluxo.
Figura 14. Alinhamento de proteína de CLD18A1 humana (NP_057453), CLD18A2 humana (ΝΡ_00100202β), CLD18A1 de camundongo (NP_062789) e CLD18A2 de camundongo (AAL15636).
As Figuras 15 A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 e 163E12, respectivamente, às células HEK293 transitoriamente transfectadas com um marcador fluorescente e CLD18A1 de murino ou CLD18A2 de murino, conforme analisado através de citometria de fluxo.
Figura 16. Análises imunohistoquímicas com AB policlonal pl05. Colorações imunohistoquimicas sobre um subconjunto de tecidos normais (estômago, pulmão, medula óssea e próstata) confirmam a especificidade pelo tecido gástrico (A). Expressão também foi detectada em carcinomas de estômago (fileira superior) e carcinomas de pulmão (B) . Apenas células diferenciadas, mas não células-tronco, expressam CLD18A2 (C).
Figura 17. Análises imunohistoquimicas com AB monoclonal AB 39F11D7
(A) Expressão especifica à proteína foi detectada em mucosa de estômago normal, enquanto que todos os outros tecidos normais testados foram negativos.
(B) Forte expressão de CLD18A2 foi encontrada em carcinomas de estômago e pulmão.
Figura 18. Análises imunohistoquímicas com os ABs monoclonais 26B5 (A), 175D10 (Β), 43A11 (C), 163E12 (D) e 45C1 (E). Todos os anticorpos mostraram forte coloração de tumores de xenoenxerto HEK293-CLD18A2 e espécimes de câncer gástrico, mas não tumores transfectados de controle HEK293- Placebo.
A Figura 19 é um gráfico comparando o percentual de células mortas após indução de CDC por 85A3, 28D10, 24H5 ou 26D12 contra células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana, usando citometria de fluxo.
A Figura 20 é um gráfico comparando o percentual de lise celular especifica após indução de CDC por 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 ou 61C2 contra células CHO aderentes estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana ou CLD18A1 humana, conforme determinado através de medição de fluorescência.
A Figura 21 mostra a indução dependente de concentração de CDC contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana pelo 75B8 (A) , 28D10 (B) ou 37H8 (C) , conforme determinado através de medição de fluorescência.
A Figura 22 mostra a Iise de células HEK293-CLD18A2 pelo 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 e 61C2, respectivamente, na presença de MNCs.
A Figura 23 mostra Iise de células HEK293-CLD18A1 por 26B5, 37H8, 38G5, 47D1 2 e 61C2, respectivamente, na presença de MNCs. A Figura 24 mostra a inibição de crescimento de tumor por anticorpo da invenção em um modelo de tratamento precoce de xenoenxerto com células HEK293-CLD18A2.
As Figuras 25A e B mostram a sobrevivência prolongada através de tratamento com anticorpo da invenção em dois modelos de tratamento precoce de xenoenxerto com células HEK2 93-CLD18A2.
A Figura 26 mostra o prolongamento de sobrevivência por anticorpos da invenção em um modelo de tratamento avançado de xenoenxerto com células HEK293-CLD18A2.
A Figura 27A mostra a inibição de crescimento de tumor pelos anticorpos da invenção em um modelo de tratamento precoce de xenoenxerto. A Figura 27B mostra o prolongamento de sobrevivência pelos anticorpos da invenção em um modelo de tratamento precoce de xenoenxerto. Células DAN-G expressando endogenamente CLD18A2 foram usadas.
A Figura 28 mostra a expressão de RNAm de CLD18A2 em tecidos de camundongo. Investigações por RT-PCR com primers específicos para CLD18A2 não mostraram expressão significativa dentro de todos os tecidos normais testados, exceto o estômago. Os seguintes tecidos normais foram analisados: 1: intestino delgado, 2: baço, 3: pele, 4: estômago, 5: pulmão, 6: pâncreas, 7: nódulo linfático, 8: timo, 9: controle negativo. A Figura 29 mostra expressão de CLD18 em estômago normal. Análise imunohistoquímica com um anticorpo especifico para CLD18 de estômago de camundongo revela um padrão de expressão conservado. Enquanto que o epitélio da superfície e criptas profundas expressam CLD18 em sua superfície celular, a região inicial central é CLD18- negativa.
A Figura 30 mostra coloração com hematoxilina e eosina de tecidos de estômago de camundongos. É mostrada, na visão geral (A) e em detalhes (B), o estômago de um camundongo 37G11-tratado em comparação com um camundongo de controle (C e D), o qual foi tratado apenas com PBS.
As Figuras 31 A e B mostram coloração citométrica de fluxo de células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A1 e A2 humanas, respectivamente, bem como células KATO-III de expressão endógena com anticorpos da invenção (43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10).
A Figura 32 mostra a CDC sobre células expressando CLD18A2 mediada pelos anticorpos quiméricos da invenção.
A Figura 33 mostra a ADCC sobre células KATO-III mediada pelos anticorpos quiméricos da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os anticorpos descritos aqui podem ser anticorpos monoclonais isolados os quais se ligam especificamente a um epitopo presente sobre CLD18. Anticorpos monoclonais isolados abrangidos pela presente invenção incluem anticorpos de IgA, IgG 1-4, IgE, IgM e IgD. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgGl, mais particularmente, um isotipo IgGl, kappa ou IgGl, lambda. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgG3, mais particularmente um isotipo de IgG3, kappa ou IgG3, lambda. Em ainda outra modalidade, anticorpo é um anticorpo de IgG4, mais particularmente um isotipo de IgG4, kappa ou IgG4, lambda. Em ainda outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgAl ou IgA2. Em ainda outra modalidade o anticorpo é um anticorpo IgM.
Em uma modalidade, a invenção descreve anticorpos os quais se ligam especificamente às células expressando CLD18 e, de preferência, (i) se ligam a células expressando CLD18A2 e (ii) não se ligam às células que não expressam CLD18A2, mas expressando CLD18A1. Os anticorpos da invenção, de preferência (i) mediam a morte de células expressando CLD18A2 e (ii) não mediam a morte de células não expressando CLD18A2, mas expressando CLD18A1.
Em outra modalidade, a invenção se refere a anticorpos os quais (i) se ligam especificamente às células cancerígenas expressando CLD18, (ii) não se ligam às células expressando CLD18 de mucosa de estômago normal e/ou (iii) não se ligam às células expressando CLD18 de tecido de pulmão não cancerígeno.
A invenção também inclui anticorpo os quais (i) mediam a morte de células tumorígenas expressando CLD18, (ii) não mediam a morte de células expressando CLD18 de mucosa de estômago normal e/ou (iii) não mediam a morte de células expressando CLD18 de tecido de pulmão não cancerígeno.
Em modalidades particulares, os anticorpos da invenção (i) se ligam a um epítopo sobre CLD18A2 o qual não está presente sobre CLD18A1, de preferência SEQ ID NO: 21, 22 e 23, (ii) se ligam a um epítopo localizado sobre o CLD18A2- loopl, de preferência SEQ ID NO: 28, (iii) se ligam a um epítopo localizado sobre o CLD18A2-loop2, de preferência SEQ ID NO: 30, (iv) se ligam a um epítopo localizado sobre o CLD18A2-Ioop D3, de preferência SEQ ID NO: 31, (v) se ligam a um epítopo, o qual abrange CLD18A2-loopl e CLD18A2- loopD3, (vi) se ligam a um epítopo não-glicosilado localizado sobre o CLDl8A2-loopD3, de preferência SEQ ID NO: 29 ou (vii) se ligam a um epítopo presente em CLD18 humana e de camundongo (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, respectivamente).
Em modalidades particularmente preferidas, os anticorpos da invenção se ligam a um epítopo sobre CLD18A2 o qual não está presente sobre CLD18A1. Os anticorpos da invenção incluem anticorpos totalmente humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos em um animal transgênico não-humano, por exemplo, um camundongo transgênico, capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos à CLD18 sofrendo recombinação V-D-J e troca de isotipo. Tal animal transgênico também pode ser um coelho transgênico para a produção de anticorpos policlonais, tal como divulgado no US 2003/0017534.
A ligação de um anticorpo da invenção ao antigeno CLD18 pode mediar a morte de células expressando CLD18 (por exemplo, uma célula tumorigena), por exemplo, através de ativação do sistema de complemento. A morte de células expressando CLD18 pode ocorrer através de um ou mais dos seguintes mecanismos: citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de células expressando CLDl8; apoptose de células expressando CLD18; fagocitose por células efetoras de células expressando CLD18; ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) por células efetoras de células expressando CLD18.
De forma que a presente invenção possa ser mais prontamente compreendida, determinados termos são primeiro definidos. Definições adicionais são apresentadas por toda a descrição detalhada. DEFINIÇÃO DE TERMOS
O termo "CLD18" se refere à claudin-18 e inclui quaisquer variantes, incluindo CLD18A2 e CLD18A1, conformações, isoformas e homólogos de espécie de CLD18 os quais são naturalmente expressos por células ou são expressos por células transfectadas com o gene de CLD18. De preferência, "CLD18" se refere à CLD18 humana, em particular, CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2) e/ou CLD18A1 (SEQ ID NOs: 7, 8), mais preferivelmente CLD18A2.
O termo "CLD18A1" inclui variantes pós- traducionalmente modificadas, isoformas e homólogos de espécie CLD18A1 humana os quais são naturalmente expressos por células ou são expressos sobre células transfectadas com o gene de CLD18A1.
O termo "CLD18A2" inclui variantes pós- traducionalmente modificadas, isoformas e homólogos de espécie CLD18A2 humana os quais são naturalmente expressos por células ou são expressos sobre células transfectadas com o gene de CLD18A2.
O termo "variante de CLD18" abrangerá (i) variantes com splicing de CLD18, (ii) variantes pós-traducionalmente modificadas de CLD18, particularmente incluindo variantes com diferentes estados de N-glicosilação, (iii) variantes conformacionais de CLD18, particularmente, incluindo CLD18- conformação-1, CLD18-conformação-2 e CLD18-conformação-3, (iv) variantes sem CLD18 e homotípica/heterotipicamente associadas localizadas nas "tight junctions" intercelulares, (v) variantes relacionadas a câncer por CLD18 e não relacionadas a câncer por CLD18.
O termo "raft" se refere aos micro-domínios na membrana ricos em esfingolipidios e colesterol localizados na área da pequena folha externa da membrana plasmática de uma célula. A capacidade de determinadas proteínas de se associar dentro de tais domínios e sua capacidade de formação de "agregados" ou "agregados focais" pode realizar a função da proteína. Por exemplo, a translocação de moléculas de CLD18 para tais estruturas, após serem ligadas pelos anticorpos da presente invenção, cria uma alta densidade de complexos de antígeno-anticorpo à CLD18 nas membranas plasmáticas. Essa alta densidade de complexos de antígeno-anticorpo à CLD18 pode permitir ativação eficiente do sistema de complemento durante CDC.
Os termos "conformação" e "topologia" descrevem como uma molécula integral à membrana está posicionada na membrana da superfície celular e, em particular, qual das suas regiões são extracelulares e, portanto, elegíveis para anticorpos. CLD18, por exemplo, pode existir em três conformações diferentes, as quais mais provavelmente dependem se ela é prevalente como homômeros ou heterômeros e se ela é integrada nas estruturas de "tight junctions" supramoleculares ou "livres". Esses diferentes estados resultam em diferentes epitopos elegiveis a anticorpos.
De acordo com a invenção, o termo "doença" se refere a qualquer estado patológico, incluindo câncer, em particular aquelas formas de câncer descritas aqui.
Por "tumor" entenda-se um grupo anormal de células ou tecido que cresce através de uma proliferação celular rápida, descontrolada e continua a crescer depois que o estimulo o qual iniciou o novo crescimento cessa. Tumores mostram falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal e, usualmente, formam uma massa distinta de tecido, a qual pode ser benigna ou maligna.
Por "metástase" entenda-se a disseminação de células cancerígenas de seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende do desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas de base endoteliais para entrar na poço corporal e vasos e, então, após serem transportadas pelo sangue, infiltração de órgãos alvo. Finalmente, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogênese. Metástase de tumor freqüentemente ocorre mesmo após a remoção do tumor primário, porque as células ou componentes tumorigenos podem permanecer e desenvolver potencial metastático. Em uma modalidade, o termo "metástase" de acordo com a invenção, se refere à "metástase distante", a qual se refere a uma metástase que é remota do tumor primário e ao sistema de nódulo linfático regional.
0 termo "tratamento de uma doença" inclui cura, redução da duração, alivio, prevenção, diminuição ou inibição da progressão ou piora, ou prevenção ou retardo do inicio de uma doença ou dos sintomas da mesma.
De acordo com a invenção, uma amostra pode ser qualquer amostra útil de acordo com a presente invenção, em particular, uma amostra biológica, tal como uma amostra tecidual, incluindo fluidos corporais e/ou uma amostra celular e pode ser obtida de maneira convencional, tal como através de biópsia de tecido, incluindo biópsia por punção, e coletando-se sangue, aspirado brônquico, escarro, urina, fezes ou outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, o termo "amostra biológica" também inclui frações de amostras biológicas.
0 termo "anticorpo" se refere a uma glicoproteina compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) inter-conectadas por ligações de dissulfeto, ou uma porção de ligação a antígeno das mesmas. O termo "anticorpo" também inclui todas as formas recombinantes de anticorpos, em particular dos anticorpos descritos aqui, por exemplo, anticorpos expressos em procariotas, anticorpos não glicosilados, e quaisquer fragmentos de anticorpo de ligação a antigeno e derivados, conforme descrito abaixo. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hiper-variabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de "framework" (FR) . Cada VH ou VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do amino término para o carbóxi término na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
O termo "anticorpo humanizado" se refere a uma molécula com um sitio de ligação a antigeno que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não-humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula é baseada na estrutura e/ou na seqüência de uma imunoglobulina humana. O sitio de ligação a antigeno pode também compreender domínios variáveis completos fundidos a domínios constantes ou apenas as regiões de determinação de complementaridade (CDR) enxertadas sobre regiões de "framework" apropriadas nos domínios variáveis. Sítios de ligação a antigeno podem ser do tipo selvagem ou podem ser modificados através de uma ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, modificados para se assemelhar mais intimamente às imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as seqüências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado o qual contém todas as seis CDRs do anticorpo de camundongo) . Outras formas têm uma ou mais CDRs as quais são alteradas com relação ao anticorpo original.
O termo "anticorpo quimérico" se refere àqueles anticorpos em que uma porção de cada uma das seqüências de aminoácido da cadeia pesada e leve é homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencendo a uma classe em particular, enquanto o segmento restante da cadeia é homólogo às seqüências correspondentes em outra. Tipicamente, a região variável das cadeias leve e pesada imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero, enquanto as porções constantes são homólogas às seqüências de anticorpo derivadas de outra. Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que a região variável pode, convenientemente, ser derivada de fontes presentemente conhecidas usando células B prontamente disponíveis ou hibridomas de organismos hospedeiros não- humanos em combinação com regiões constantes derivadas, por exemplo, de preparados de célula humana. Embora a região variável tenha a vantagem de facilidade de preparo e a especificidade não seja afetada pela fonte, a região constante sendo humana, é menos provável de estimular uma resposta imune de um ser humano quando os anticorpos são injetados do que seria a região constante de uma fonte não- humana. Contudo, a definição não está limitada a esse exemplo em particular.
0 termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de ligação"), conforme usado aqui, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antigeno. Foi mostrado que a função de ligação a antigeno de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigeno" de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) fragmentos F(ab')2r fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação em ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) fragmentos Fd consistindo dos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), os quais consistem de um domínio VH; (vi) regiões de determinação de complementaridade isoladas (CDR) , e (vii) combinações de duas ou mais CDRs isoladas as quais podem, opcionalmente, ser unidas através de um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VH e VL, sejam codificados por genes distintos, eles podem ser unidos usando métodos recombinantes, através de um ligante sintético o qual permite formar moléculas monovalentes (conhecido como Fv com cadeia simples (scFv); veja, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Tais anticorpos com cadeia simples são também considerados como sendo abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo. Outro exemplo são proteínas de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação compreendendo (i) um polipeptídeo com domínio de ligação que é fundido a um polipeptídeo da região de dobradiça da imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de dobradiça e (iii) uma região constante de CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região constante CH2. O polipeptídeo com domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação são ainda divulgadas no US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos usando métodos convencionais bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e os fragmentos são selecionados com relação à utilidade, da mesma maneira como são anticorpos intactos.
O termo "epítopo" significa um determinante de proteína capaz de ligação a um anticorpo, em que o termo "ligação" aqui se refere, de preferência, a uma ligação específica. Epítopos usualmente consistem de agrupamentos de moléculas quimicamente ativos na superfície, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epitopos conformacionais e não conformacionais se distinguem pelo fato de que a ligação ao primeiro, mas não ao último, é perdida na presença de solventes de desnaturação.
O termo "epítopo descontínuo", conforme usado aqui, significa um epítopo conformacional sobre um antígeno de proteína o qual é formado por pelo menos duas regiões distintas na seqüência primária da proteína.
O termo "molécula bi-específica" se destina a incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, peptídeo ou complexo de proteína ou de peptídeo, o qual tem duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode se ligar a ou interagir com (a) um antígeno na superfície celular e (b) um receptor Fc sobre a superfície de uma célula efetora. 0 termo "molécula multi- específica" ou "molécula hetero-específica" se destina a incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, peptídeo ou complexo de proteína ou de peptídeo, o qual tem mais de duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode se ligar a ou interagir com (a) um antígeno na superfície celular, (b) um receptor Fc sobre a superfície de uma célula efetora e (c) pelo menos outro componente. Conseqüentemente, a invenção inclui, mas não está limitada a, moléculas bi-especificas, tri-especificas, tetra-especificas e outras multi-especificas as quais são dirigidas à CLD18 e outros alvos, tais como receptores Fc sobre células efetoras. 0 termo "anticorpos bi-especificos" também inclui dianticorpos. Dianticorpos são anticorpos bivalentes bi-especificos nos quais os domínios VH e VL são expressos sobre uma única cadeia polipeptídica, mas usando um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, desse modo, forçando os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação a antígeno (veja, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121- 1123).
A invenção também inclui derivados dos anticorpos descritos aqui. 0 termo "derivado de anticorpo" se refere a qualquer forma modificada de um anticorpo, por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. Conforme usado aqui, um anticorpo é "derivado de" uma seqüência de linhagem germinativa em particular se o anticorpo é obtido de um sistema através de imunização de um animal ou através de seleção de uma biblioteca de gene de imunoglobulina e em que o anticorpo selecionado é pelo menos 90%, mais preferivelmente, pelo menos 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico, quanto à seqüência de aminoácido, à seqüência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo derivado de uma seqüência de linhagem germinativa em particular mostrará não mais do que 10 diferenças de aminoácido, mais preferivelmente não mais do que 5 ou, ainda mais preferivelmente, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido com relação à seqüência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.
Conforme usado aqui, o termo "hetero-anticorpos" se refere a dois ou mais anticorpos, derivados dos mesmos, ou regiões de ligação a antigeno ligadas juntas, pelo menos duas das quais têm diferentes especificidades. Essas diferentes especificidades incluem uma especificidade de ligação por um receptor Fc sobre uma célula efetora, e uma especificidade de ligação para um antigeno ou epitopo sobre uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumorigena.
Os anticorpos descritos aqui podem ser anticorpos humanos. O termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, se destina a incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de linhagem germinativa humanas. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por seqüências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas através de mutagênese sítio-específica ou aleatória in vitro ou através de mutação somática in vivo).
O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, se refere a um preparado de moléculas de anticorpo com uma única composição molecular. Um anticorpo monoclonal mostra uma única especificidade de ligação e afinidade por um epítopo em particular. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma o qual inclui uma célula B obtida de um animal não-humano, por exemplo, camundongo, fundida a uma célula imortalizada.
O termo "anticorpo recombinante", conforme usado aqui, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico com relação ao genes de imunoglobulina ou um hibridoma preparado do mesmo, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo combinatória recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvem splicing de seqüências de gene de imunoglobulina à outras seqüências de DNA.
0 termo "transfectoma", conforme usado aqui, inclui células hospedeiras eucariotas recombinantes expressando um anticorpo, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células de planta ou fungos, incluindo células de levedura.
Conforme usado aqui, um "anticorpo heterólogo" é definido com relação a um organismo transgênico que produz tal anticorpo. Esse termo se refere a um anticorpo com uma seqüência de aminoácido ou uma seqüência de ácido nucléico de codificação correspondendo àquela encontrada em um organismo não consistindo do organismo transgênico e sendo geralmente derivado de uma outra espécie que não o organismo transgênico.
Conforme usado aqui, um "anticorpo hetero-híbrido" se refere a um anticorpo com cadeias leves e pesadas de diferentes origens orgânicas. Por exemplo, um anticorpo com uma cadeia pesada humana associada com uma cadeia leve de murino é um anticorpo hetero-hibrido.
Os anticorpos descritos aqui são, de preferência, isolados. Um "anticorpo isolado", conforme usado aqui, se destina a se referir a um anticorpo o qual é substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à CLD18 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a outros antigenos que não CLD18). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo, isoforma ou variante de CLD18 humana pode, contudo, ter reatividade cruzada com outros antigenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécie de CLD18) . Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma modalidade da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" se refere a anticorpos tendo diferentes especificidades e sendo combinados em uma composição bem definida.
De acordo com a invenção, o termo "ligação" se refere, de preferência, à "ligação específica". Conforme usado aqui, "ligação específica" se refere à ligação de anticorpo a um antígeno predeterminado. Tipicamente, um anticorpo se liga com uma afinidade correspondendo a uma KD de cerca de 1 x 10"7 M ou menos e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade correspondendo a uma KD que é pelo menos duas ordens de magnitude menor do que sua afinidade por ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseina) do que o antígeno predeterminado ou um antigeno intimamente relacionado.
0 termo "KD" (M), conforme usado aqui, se refere à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno em particular.
Conforme usado aqui, "isotipo" se refere à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.
Conforme usado aqui, "troca de isotipo" se refere ao fenômeno pelo qual a classe ou isotipo de um anticorpo troca de uma classe de Ig para uma das outras classes de Ig.
0 termo "que ocorre naturalmente", conforme usado aqui, quando aplicado a um objeto, se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeos ou polinucleotídeos que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e a qual não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório, ocorre naturalmente.
0 termo "reestruturada", conforme usado aqui, se refere a uma configuração de um locus de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve, em que um segmento V está posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou um segmento J em uma conformação que codifica essencialmente um domínio VL ou VH completo, respectivamente. Um locus de gene de imunoglobulina (anticorpo) reestruturado pode ser identificado através de comparação com o DNA da linhagem germinativa; um locus reestruturado terá pelo menos um elemento de homologia de heptâmero/nonâmero recombinado.
O termo "não reestruturado" ou "configuração de linhagem germinativa", conforme usado aqui em referência a um segmento V, se refere à configuração em que o segmento V Π 3.0 Θ IT θ C OIub inado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
O termo "molécula de ácido nucléico" conforme usado aqui, se destina a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser fita simples ou fita dupla, mas, de preferência, é DNA fita dupla.
Os ácidos nucléicos descritos de acordo com a invenção foram, de preferência, isolados, o termo "ácido nucléico isolado" significa, de acordo com a invenção, que o ácido nucléico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo, através de reação em cadeia de polimerase (PCR), (ii) recombinantemente produzido através de clonagem, (iii) purificado, por exemplo, através de clivagem e fracionamento eletroforético em gel ou (iv) sintetizado, por exemplo, através de síntese química. Um ácido nucléico isolado é um ácido nucléico o qual está disponível para manipulação através de técnicas de DNA recombinante.
Ácidos nucléicos podem, de acordo com a invenção, estar presentes sozinhos, ou em combinação com outros ácidos nucléicos, os quais podem ser homólogos ou heterólogos. Em modalidades preferidas, um ácido nucléico é funcionalmente ligado às seqüências de controle de expressão as quais podem ser homólogas ou heterólogas com relação ao referido ácido nucléico. 0 termo "homólogo" significa que um ácido nucléico também está funcionalmente ligado à seqüência de controle de expressão naturalmente e o termo "heterólogo" significa que um ácido nucléico não está funcionalmente ligado à seqüência de controle de expressão naturalmente.
Um ácido nucléico, tal como um ácido nucléico expressando RNA e/ou proteína ou peptídeo e uma seqüência de controle de expressão são "funcionalmente" ligados um ao outro, se eles são covalentemente ligados um ao outro de uma forma tal que a expressão ou transcrição do referido ácido nucléico está sob o controle ou sob a influência da referida seqüência de controle de expressão. Se o ácido nucléico tem de ser traduzido em uma proteína funcional, então, com uma seqüência de controle de expressão funcionalmente ligada a uma seqüência de codificação, a indução da referida seqüência de controle de expressão resulta na transcrição do referido ácido nucléico, sem causar um desvio de rede na seqüência de codificação ou a referida seqüência de codificação não sendo capaz de ser traduzida na proteína ou peptídeo desejado.
O termo "seqüência de controle de expressão" compreende, de acordo com a invenção, promotores, sítios de ligação ribossômicos, intensificadores e outros elementos de controle os quais regulam a transcrição de um gene ou a tradução de um RNAm. Em modalidades particulares da invenção, as seqüências de controle de expressão podem ser reguladas. A estrutura exata das seqüências de controle de expressão pode variar como uma função da espécie ou tipo de célula, mas geralmente compreende seqüências 51-não transcritas e 5'- e 3'- não traduzidas as quais estão envolvidas na iniciação de transcrição e tradução, respectivamente, tais como TATA box, seqüência de revestimento, seqüência CAAT e semelhantes. Mais especificamente, seqüências de controle de expressão 5'-não transcritas compreendem uma região promotora a qual inclui uma seqüência promotora para controle transcricional do ácido nucléico funcionalmente ligado. Seqüências de controle de expressão podem também compreender seqüências intensificadoras ou seqüências ativadoras a montante. De acordo com a invenção, o termo "promotor" ou "região promotora" se refere ao uma seqüência de ácido nucléico a qual está localizada a montante (5') da seqüência de ácido nucléico que está sendo expressa e controla a expressão da seqüência proporcionando um sitio de reconhecimento e ligação para RNA-polimerase. A "região promotora" pode incluir outros sítios de reconhecimento e ligação para outros fatores os quais estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procarioto ou eucarioto. Além disso, um promotor pode ser "induzível" e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente de indução ou pode ser "constitutivo" se a transcrição não é controlada por um agente de indução. Um gene o qual está sob o controle de um promotor induzível não é expresso ou é somente expresso até um pequeno grau se um agente de indução estiver ausente. Na presença do agente de indução, o gene é trocado, ou o nível de transcrição é aumentado. Isso é mediado, em geral, através da ligação de um fator de transcrição específico.
Promotores os quais são preferidos de acordo com a invenção incluem promotores para SP6, T3 e T7 polimerase, promotor de RNA U6 humano, promotor de CMV e promotores híbridos artificiais dos mesmos (por exemplo, CMV) onde uma parte ou partes são fundidas a uma parte ou partes de promotores de genes de outras proteínas celulares tais como, por exemplo, GAPDH humana (dehidrogenase de gliceraldeido-3-fosfato) e incluindo ou não incluindo (um) íntron(s) adicional(ais).
De acordo com a invenção, o termo "expressão" é usado em seu significado mais geral e compreende a produção de RNA ou de RNA e de proteína/peptídeo. Ele também compreende expressão parcial de ácido nucléicos. Além disso, a expressão pode ser realizada transitória ou estavelmente.
Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucléico está, de acordo com a invenção, presente em um vetor, onde apropriado com um promotor, o qual controla a expressão do ácido nucléico. 0 termo "vetor" é usado aqui em seu significado mais geral e compreende qualquer veículo intermediário para um ácido nucléico o qual permite que o referido ácido nucléico, por exemplo, seja introduzido em células procariotas e/ou eucariotas e, onde apropriado, seja integrado em um genoma. Vetores desse tipo são, de preferência, replicados e/ou expressos nas células. Vetores compreendem plasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos, ou genomas virais. 0 termo "plasmídeo" conforme usado aqui, se refere em geral a uma estrutura de material genético extra cromossômico, usualmente uma dupla de DNA circular, a qual pode se replicar independentemente do DNA cromossômico. Como o vetor para expressão de um anticorpo, qualquer tipo de vetor no qual a cadeia pesada e a cadeia leve de anticorpo estejam presentes em diferentes vetores ou um tipo de vetor no qual a cadeia pesada e a cadeia leve estejam presentes no mesmo vetor podem ser usados.
O ensinamento fornecido aqui com relação às seqüências de aminoácido e ácido nucléico especificas, por exemplo, aquelas mostradas na Listagem de Seqüências, deve ser construído de modo a se referir também às modificações das referidas seqüências específicas que resultam em seqüências as quais são funcionalmente equivalentes às referidas seqüências específicas, por exemplo, seqüências de aminoácido que exibem propriedades idênticas ou similares àquelas das seqüências de aminoácido específicas e seqüências de ácido nucléico que codificam seqüências de aminoácido que exibem propriedades idênticas ou similares àquelas das seqüências de aminoácido codificadas pelas seqüências de ácido nucléico específicas. Uma propriedade importante é reter a ligação de um anticorpo ao seu alvo ou sustentar funções efetoras de um anticorpo. De preferência, uma seqüência modificada com relação a uma seqüência específica, quando ela substitui a seqüência específica em um anticorpo, retém a ligação do referido anticorpo à CLD18 e, de preferência, funções do referido anticorpo conforme descrito aqui, por exemplo, Iise mediada por CDC ou Iise mediada por ADCC.
Será apreciado por aqueles habilitados na técnica que, em particular, as seqüências da CDR, regiões variáveis e hiper-variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade de se ligar à CLD18. Por exemplo, regiões de CDR serão idênticas ou altamente homólogas às regiões especificadas aqui. Por "altamente homólogas" considera-se que de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas nas CDRs. Além disso, as regiões hiper-variáveis e variáveis podem ser modificadas de modo que elas mostram homologia substancialmente com as regiões especificamente divulgadas aqui.
Deve ser compreendido que os ácido nucléicos específicos descritos aqui também incluem ácidos nucléicos modificados para fins de otimização de uso de códon em uma célula hospedeira ou organismo em particular. Diferenças no uso de códon entre organismos podem levar a uma variedade de problemas referentes à expressão de gene heterólogo. Otimização de códon através da troca de um ou mais nucleotídeos da seqüência original pode resultar em uma otimização da expressão de um ácido nucléico, em particular, em otimização de eficácia de tradução, em um hospedei ro homólogo ou heterólogo no qual o referido ácido nucléico deve ser expresso. Por exemplo, se ácidos nucléicos derivados de regiões constantes de codificação e/ou regiões de "framework" humanas de anticorpos têm de ser usadas de acordo com a presente invenção, por exemplo, para o preparo de anticorpos quiméricos ou humanizados, pode ser preferido modificar os referidos ácidos nucléicos para fins de otimização de uso de códon, em particular se os referidos ácidos nucléicos, opcionalmente fundidos a ácidos nucléicos heterólogos, tais como ácidos nucléicos derivados de outros organismos conforme descrito aqui, têm de serem expressos em células de um organismo diferente do ser humano, tal como camundongo ou hâmster. Por exemplo, as seqüências de ácido nucléico que codificam as regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas, tais como aquelas de acordo com SEQ ID NOs: 40 e 45, respectivamente, podem ser modificadas para incluir uma ou mais, de preferência, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e, de preferência, até 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ou 100 ou mais substituições de nucleotideo que resultam em um uso de códon otimizado, mas não resultam em uma alteração da seqüência de aminoácido. Tais substituições de nucleotideo se referem, de preferência, ás substituições de nucleotideos nas SEQ ID NOs: 40 e 45, respectivamente, selecionadas das substituições mostradas no alinhamento a seguir das SEQ ID NOs: 40 e 45, respectivamente, com suas contra-partes modificadas e não resultando em uma alteração na seqüência de aminoácido codificada ou se referem às substituições correspondentes em posições correspondentes em outras seqüências de ácido nucléico que codificam as regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas, respectivamente. De preferência, todas as substituições mostradas nos alinhamentos a seguir das SEQ ID NOs: 40 e 45, respectivamente, com suas contra-partes modificadas que não resultam em uma alteração na seqüência de aminoácido codificada, são realizadas em seqüências de ácido nucléico que codificam regiões constantes de cadeias leve e pesada, respectivamente.
Alinhamento de SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 147:
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT 60
MIIiMIMI Il Il Il IIIIIIMIII Il Il IIIIM Illl Il
CGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCC 60 GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG 120
Il Il Ill Il MIIMIIIIMM MMIMI III I IMIIII Il Ill
GGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAG 120 TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC 180
MMMMMI IMIMII Il Il III IIIIIMM IIIM MMMIM
TGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGAC 180 AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAG 240
MMMMI IIMIIMMM 11 I Il Il Il I Il Il llllllll Il IMIMMI
AGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAG 240 AAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG 300
Il Illll Il IIMIIMIM Il Illll IIitMiM I Illll Il Ill
AAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG 300 AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 324
IMIIIIIIMIM IIIII Ill
AGCTTCAACAGGGGCGAGTGCTAG 324 Alinhamento de SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 149:
GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC 60
IMMI M MMMMMI Ill I IIIIMMM Il IIIIMM Ill
GGCCCAAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCC 60
CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC 120
IIIIMMIIMM MMIMMMMMM Il Illll Ill Illlll Il
CTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGA 120
GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC 180
IIIIIMM I Il I Il Il I Il Il I Il Il Il Il Il III I Il Il Ill I
GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGC 180
CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC 240
Il Il Il Il Il Il Il Il Il 11 Il I IMIIM Il Il 11 Il Il M 11 M Il Il 1111 I 1
CTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC 240
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC 300
Illll Il I Il Il Il Il Il I 11 Il Il I Il Il Il Il 11 Ill MMMII Il III
GTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC 300
AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC 360
Il Il Illll Illll Il IIMIMI Il Il Il Illll Illll Il Ill
AAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTC 360
CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC 420
Il llllllll Il IIIIMMIIMM Illlll I IMIIII Illll Il Ill
CTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGC 420
GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC 480
Il I Il 111 IlIl Il I Il Il Il Il Illll Illll IlIlIl 11 Il I Il I Il Il 11 Il 11
GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC 480 GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT 540
MIIMiIfIf Il MMIIM IllII I Il Il I Il Il I Il Il I I Il Il III I
GTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGG 54 0
GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC 600
Illll Ml Il IMII 111111 Il H Il Il M M M MIIMII MMMMI
GTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGC 600
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG 660
I Il Il Il I Il Il Il IMII 1111 Il 11 Il I Ii I Il Illlll Ill IIMI Il
AAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGC 660
CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC 72 0
MMI Il Il M Il Il Il I Il M I Il I Il Il I Illlll Ill I Il I Il Il Il I
CAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC 72 0
CAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG 780
Illll IlIl IlIl I Illll Il I IlIlIl I Il I I Il I IlIlIl Il 11 11 11 Il I
CAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG Ί S 0
GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC 840
MMIiII Ii Illll ΙΜΙΜΙΜΙΜΙΜΙΜΜ Il Il MMIMM Iill
GAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGAC 84 0
GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC 900
Ill MMMMI Ii llllllll MMMMMM IlllllIIIMIIIi III
GGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAAC 900
GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC 960
II Ill III MMMMI Illll 11 Il Il I Il I Il 11111 Illlll Iil
GTGTTC AGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTG 960 TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 981
Illl Il Il Il I
AGCCTGAGCCCCGGCAAGTAG 981
Além disso, pode ser desejado, de acordo com a presente invenção, modificar as seqüências de aminoácido descritas aqui, em particular aquelas de regiões constantes
de cadeia pesada humana, para adaptar a seqüência a um 5 alótipo desejado, por exemplo, um alótipo encontrado na população Caucasiana. Tais modificações são, de preferência, selecionadas do grupo consistindo das seguintes substituições de aminoácido dentro de SEQ ID NO: 46 ou em posições correspondentes dentro de outras regiões constantes de cadeia pesada humana: K93R, D235E e L237M. De preferência, todas essas modificações são incluídas nas seqüências de aminoácido de regiões constantes de cadeia pesada humana.
De acordo com a invenção, o termo "posições correspondentes" se refere aos resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos dentro de um alinhamento de seqüência de duas seqüências de ácido nucléico ou de proteína que são alinhadas uma com a outra.
De preferência, o grau de identidade entre uma seqüência de ácido nucléico específica descrita aqui e uma seqüência de ácido nucléico a qual é modificada com relação à referida seqüência de ácido nucléico específica será de pelo menos 70%, de preferência pelos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% ou, mais preferivelmente, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. De preferência, as duas seqüências são capazes de hibridização e formação de uma dupla estável uma com a outra, com a hibridização sendo, de preferência, realizada sob condições as quais permitem hibridização específica entre polinucleotídeos (condições estringentes). Condições estringentes são descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editores, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editores, John Wiley & Sons, Inc., New York e se refere, por exemplo, à hibridização a 65°C em tampão de hibridização (3,5 χ SSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro bovino, NaH2PO4 a 2,5 mM (pH de 7) , 0,5% de SDS, EDTA a 2 mM). SSC é cloreto de sódio a 0,15 M/citrato de sódio a 0,15 M, pH de 7. Após hibridização, a membrana para qual o DNA foi transferido é lavada, por exemplo, em 2 x SSC em temperatura ambiente e, então, em 0,1-0,5 χ SSC/0,1 x SDS em temperaturas de até 68°C.
De preferência, o grau de similaridade, de preferência, identidade entre uma seqüência de aminoácido especifica descrita aqui e uma seqüência de aminoácido a qual é modificada com relação à referida seqüência de aminoácido especifica, tal como entre seqüências de aminoácido mostrando homologia substancial será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% ou, mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
Todas as seqüências modificadas descritas acima estão dentro do escopo da presente invenção.
"Similaridade de seqüência" indica o percentual de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições conservativas de aminoácido. "Identidade de seqüência" entre duas seqüências de polipeptídeo ou de ácido nucléico indicam o percentual de aminoácidos ou de nucleotideos que são idênticos entre as seqüências.
A "identidade percentual" é obtida após o melhor alinhamento, esse percentual sendo puramente estatístico e as diferenças entre as duas seqüências sendo distribuídas aleatoriamente e sobre seu comprimento inteiro. Comparações de seqüência entre duas seqüências de nucleotideo ou de aminoácido são convencionalmente realizadas através de comparação dessas seqüências após ter alinhado as mesmas otimamente, a referida comparação sendo realizada através de segmento ou através de uma "janela de comparação" de forma a identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüência. O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca por similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85, 2444, ou por meio de programas de computador os quais usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST Ρ, BLAST N e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
A identidade percentual é calculada determinando-se o número de posições idênticas entre as duas seqüências que estão sendo comparadas, dividindo-se esse número pelo número de posições comparadas e multiplicando-se o resultado obtido por 100 de modo a obter a identidade percentual entre essas duas seqüências.
"Substituições conservativas" podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfifática dos residuos envolvidos. Por exemplo: (a) aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; (b) aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina e glutamina; (c) aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e (d) aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Substituições podem, tipicamente, ser feitas dentro dos grupos (a) - (d) . Além disso, glicina e prolina podem ser substituídas, uma pela outra, baseando-se em sua capacidade de romper [alfa]- hélices. Algumas substituições preferidas podem ser feitas dentre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) PeG; e (iii) A, V, Lei. Dado o código genético conhecido e técnicas de DNA recombinante e sintético, o cientista habilitado pode construir prontamente DNAs que codificam as variantes conservativas de aminoácido.
A presente invenção compreende anticorpos nos quais alterações foram feitas na região Fc de forma a alterar as propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Tais alterações podem resultar em uma diminuição ou aumento da ligação a Clq e CDC ou da ligação a FcyR e ADCC. Substituições podem, por exemplo, ser feitas em um ou mais dos resíduos de aminoácido da região constante de cadeia pesada, desse modo, causando uma alteração em uma função efetora, enquanto retém a capacidade de ligação ao antígeno, quando comparado com o anticorpo modificado, cf. US 5.624.821 e US 5.648.260.
A meia-vida in vivo de anticorpos pode ser aperfeiçoada através da modificação do epítopo do receptor de salvamento do domínio constante de Ig ou um domínio constante semelhante à Ig, de modo que a molécula não compreende um domínio CH2 intacto ou uma região Fc de Ig intacta, cf. US 6.121.022 e US 6.194.551. A meia-vida in vivo pode, além disso, ser aumentada fazendo mutações na região Fe, por exemplo, substituindo treonina por leucina na posição 252, substituindo treonina por serina na posição 254 ou substituindo treonina por fenilalanina na posição 256, cf. US 6.277.375.
Além disso, o padrão de glicosilação de anticorpos pode ser modificado de forma a trocar a função efetora dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos em um transfectoma o qual não adiciona a unidade de fucose normalmente presa à Asn na posição 297 da região Fc de forma a intensificar a afinidade da região Fc por receptores de Fc o que, por sua vez, resultaria em uma ADCC aumentada dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. Além disso, modificação de galactosilação pode ser feita de forma a modificar a CDC.
Alternativamente, em uma modalidade, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência de codificação de anticorpo anti-CLD18, tal como através de mutagênese por saturação e os anticorpos anti-CLD18 resultantes modificados podem ser selecionados com relação à atividade de ligação.
O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), conforme usado aqui, se destina a se referir a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante tenha sido introduzido. Deverá ser compreendido que tais termos se destinam a se referir não apenas à célula particular em questão, mas à prole de tal célula. Em virtude do fato de que determinadas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou influências ambientais, tal prole pode, na verdade, não ser idêntica à célula precursora, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo "célula hospedeira" conforme usado aqui. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células NS/0 e células linfociticas.
Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" inclui qualquer ser humano ou animal não-humano. 0 termo "animal não-humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
O termo "animal transgênico" se refere a um animal tendo um genoma compreendendo um ou mais transgenes, de preferência, transgenes de cadeia pesada e/ou de cadeia leve ou transcromossomas (quer integrados ou não integrados no DNA genômico natural do animal) e o qual é, de preferência, capaz de expressar os transgenes. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter um transgene de cadeia leve humana e também um transgene de cadeia pesada humana ou transcromossoma de cadeia pesada humana, de modo que o camundongo produza anticorpos anti-CLD18 humana quando imunizados com antigeno CLD18 e/ou células expressando CLD18. O transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado ao DNA cromossômico do camundongo, conforme é o caso para camundongos transgênicos, por exemplo, camundongos HuMAb, tais como camundongos HCo7 ou HCol2, ou o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, conforme é o caso para camundongos transcromossômicos (por exemplo, KM), conforme descrito no WO 02/43478. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos podem ser capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos à CLD18 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgE) sofrendo recombinação V-D-J e troca de isotipo.
Mecanismo de Ação do mAb
Embora o seguinte forneça considerações com relação ao mecanismo subjacente da eficácia terapêutica de anticorpos da invenção, ele não deve ser considerado como limitando a invenção de qualquer forma.
Os anticorpos descritos aqui, de preferência, interagem com componentes do sistema imune, de preferência através de ADCC ou CDC. Os anticorpos da invenção também podem se usados para objetivar "payloads" (por exemplo, radioisótopos, fármacos ou toxinas) para matar diretamente células tumorígenas ou podem ser usados sinergisticamente com agentes quimioterapêuticos, atacando tumores através de mecanismos de ação complementares que podem incluir respostas imunes anti-tumor as quais podem ter sido comprometidas em virtude de efeitos colaterais citotóxicos sobre linfócitos T.
Citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por célula. A ADCC descreve a capacidade de matar células das células efetoras conforme descrito aqui, em particular linfócitos o que, de preferência, requer que a célula alvo seja marcada por um anticorpo.
A ADCC, de preferência, ocorre quando os anticorpos se ligam a antigenos sobre células tumorígenas e os domínios Fc do anticorpo se encaixam em receptores Fc (FcR) na superfície de células imunes efetoras. Diversas famílias de receptores Fc têm sido identificadas, e populações de células específicas expressam, caracteristicamente, receptores Fc definidos. A ADCC pode ser encarada como um mecanismo para induzir diretamente a um grau variável da destruição imediata do tumor que leva à apresentação de antígeno e à indução de resposta de células T direcionadas a tumor. De preferência, indução in vivo de ADCC levará às respostas de células T direcionadas a tumor e respostas de anticorpo derivadas de hospedeiro.
Citotoxicidade dependente de complemento. A CDC é outro método de morte de célula que pode ser dirigida por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para ativação de complemento. IgG 1 e IgG 3 também são muito eficazes ao direcionar a CDC através da via de ativação de complemento clássica. De preferência, nessa cascata, a formação de complexos de anticorpo-antigeno resulta na revelação de múltiplos sítios de ligação Clq em proximidade íntima sobre os domínios CH2 para a participação das moléculas de anticorpo, tais como moléculas de IgG (Clq é um de três sub-componentes do complemento Cl). De preferência, esses sítios de ligação Clq revelados convertem a interação anterior Clq-IgG de baixa afinidade a uma com alta avidez, o que dispara uma cascata de eventos envolvendo uma série de outras proteínas de complemento e leva a liberação proteolítica de agentes de ativação/quimiotáticos de células efetoras C3a e C5a. De preferência, a cascata de complemento termina na formação de um complexo que ataca a membrana, o que cria poros na membrana celular os quais facilitam a passagem de água e solutos para dentro e para fora da célula.
Produção de anticorpos
Os anticorpos da invenção podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferidos, em principio, outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnicas de "phage display" usando bibliotecas de genes de anticorpo.
0 sistema animal preferido para preparo de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais é o sistema de murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.
Outros sistemas animais preferidos para o preparo de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais são o sistema de rato e de coelho (por exemplo, descrito Spieker- Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92: 9348 (1995), veja também Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)) . Em ainda outra modalidade, anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra a CLD18 podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos trazendo partes do sistema imune humano ao invés do sistema de camundongo. Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos conhecidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como "camundongos transgênicos". A produção de anticorpos humanos em tais camundongos transgênicos pode ser realizada conforme descrito em detalhes para CD20 no WO 2004 035607.
Ainda outra estratégia para a geração de anticorpos monoclonais é isolar diretamente genes que codificam anticorpos a partir de linfócitos, produzindo anticorpos de estratégia definida, veja, por exemplo, Babcock et al., 1996; "A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy". Para detalhes de manipulação de anticorpo veja também Welschof e Kraus, "Recombinant antibodes for câncer therapy" ISBN-0-89603- 918-8 e Benny K.C. Lo "Antibody Engineering" ISBN 1-58829- 092-1.
Imunizações
Para gerar anticorpos à CLD18, camundongos podem ser imunizados com peptideos conjugados a veiculo derivados da seqüência de CLD18, um preparado enriquecido do antigeno CLD18 recombinantemente expresso ou fragmentos do mesmo e/ou células expressando CLD18, conforme descrito.
Alternativamente, camundongos podem ser imunizados com DNA que codifica a CLD18 humana de comprimento total (por exemplo, SEQ ID NO: 1) ou fragmentos da mesma, em particular, aqueles de SEQ ID NOs: 15, 17 e 19. No caso de imunizações usando um preparado purificado ou enriquecido do antigeno CLD18 não resultarem em anticorpos, camundongos também podem ser imunizados com células expressando CLD18, por exemplo, uma linhagem de célula, para promover respostas imunes.
A resposta imune pode ser monitorada durante o curso do protocolo de imunização com amostras de plasma e de soro sendo obtidas através de coleta de sangue retroorbitais ou através da veia da cauda. Os camundongos com titulação suficiente de imunoglobulina anti-CLD18 podem ser utilizados para fusões. Os camundongos podem receber um reforço intraperitoneal ou intravenoso com células expressando CLD18 três dias antes do sacrifício e da remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas que secretam anticorpo.
Geração de Hibridomas que produzem anticorpos monoclonais Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais à CLD18, esplenócitos e células do nódulo linfático de camundongos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem de célula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de célula de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem, então, ser selecionados para a produção de anticorpos antigeno-especificos. Poços individuais podem, então, ser selecionados através de ELISA com relação à hibridomas que secretam anticorpo. Através de análise por imunofluorescência e FACS usando células expressando CLD18, anticorpos com especificidade pela CLD18 podem ser identificados. Os hibridomas que secretam anticorpo podem ser colocados novamente em placa, selecionados novamente e, se ainda positivos para anticorpos monoclonais anti-CLD18, podem ser subclonados através de diluição limitativa. Os subclones estáveis podem, então, ser cultivados in vítro para gerar anticorpo em meio de cultura tecidual para caracterização. Geração de transfectomas que produzem anticorpos monoclonais
Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene, conforme é bem conhecido na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por exemplo, em uma modalidade, o(s) gene(s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpo, pode(m) ser ligado (s) em um vetor de expressão, tal como um plasmideo de expressão eucariota, tal como usado pelo sistema de expressão de gene GS divulgado no WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338 841 ou outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. O plasmideo purificado com os genes de anticorpo clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucariotas, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucariotas, tais como células derivadas de planta, células fúngicas ou de levedura. O método usado para introduzir esses genes pode ser os métodos descritos na técnica, tais como eletroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após introdução desses genes de anticorpo nas células hospedeiras, células expressando o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Essas células representam os transfectomas os quais podem, então, ser amplificados para seu nivel de expressão e super-escalonados para produzir anticorpos. Anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados desses sobrenadantes de cultura e/ou células.
Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem ser expressos em outros sistemas de expressão, incluindo células procariotas, tais como microorganismos, por exemplo, E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais não-humanos transgênicos, tais como em leite de ovelha e coelhos ou em ovos de galinha ou em plantas transgênicas; veja, por exemplo, Verma, R., et al.
(1998) J. . Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al.
(1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; e Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Uso de seqüências de anticorpo parciais para expressar anticorpos intactos (isto é, humanização e quimerização)
A) Quimerização
Anticorpos monoclonais de murino podem ser usados como anticorpos terapêuticos em seres humanos quando marcados com toxinas ou isótopos radioativos. Anticorpos de murino não marcados são altamente imunogênicos no homem quando repetitivamente aplicados, levando à redução do efeito terapêutico. A principal imunogenicidade é mediada pelas regiões constantes de cadeia pesada. A imunogenicidade de anticorpos de murino no homem pode ser reduzida ou completamente evitada se os respectivos anticorpos são quimerizados ou humanizados. Anticorpos quiméricos são anticorpos, as diferentes porções dos quais são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles tendo uma região constante variável de um anticorpo de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Quimerização de anticorpos é alcançada através da união das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo de murino com a região constante das cadeias pesada e leve humanas (por exemplo, conforme descrito por Kraus et al., em Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for câncer therapy ISBN-0-89603-918-8) . Em uma modalidade preferida, anticorpos guiméricos são gerados através da união da região constante de cadeia leve kappa à região variável de cadeia leve de murino. Em uma modalidade também preferida, anticorpos guiméricos podem ser gerados unindo a região constante de cadeia leve lambda humana à região variável de cadeia leve de murino. As regiões constantes de cadeia pesada preferidas para geração de anticorpos guiméricos são IgG 1, IgG 3 e IgG 4. Outras regiões constantes de cadeia pesada para a geração de anticorpos são IgG2, IgA, IgD e IgM. b) Humanização
Anticorpos interagem com antigenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido gue estão localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeias pesada e leve. Por essa razão, as seqüências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as seqüências fora das CDRs. Em virtude do fato de seqüências de CDR serem responsáveis pela maioria das interações anticorpo- antigeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos específicos que ocorrem naturalmente através de construção de vetores de expressão os quais incluem seqüências de CDR do anticorpo específico que ocorre naturalmente, enxertados sobre seqüências de "framework" a partir de um anticorpo diferente com uma propriedade diferente (veja, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; e Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. ü. S. A. 86: 10029-10033). Tais seqüências de "framework" podem ser obtidas de bancos de dados de DNA públicos que incluem seqüências de gene de anticorpo de linhagem germinativa. Essas seqüências de linhagem germinativa diferirão das seqüências de gene de anticorpo maduro, pois elas não incluirão genes variáveis completamente reunidos, os quais são formados por junção de V (D) J durante a maturação de células B. Seqüências de gene de linhagem germinativa também diferirão das seqüências de um anticorpo de repertório secundário de alta afinidade em indivíduos, imparcialmente, através da região variável. Por exemplo, mutações somáticas não são 106 relativamente freqüentes na porção amino-terminal da região de "framework" 1 e na porção carbóxi-terminal da região de "framework" 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por essa razão, não é necessário obter a seqüência de DNA inteira de um anticorpo em particular de forma a recriar um anticorpo recombinante intacto com propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo original (veja WO 99/45962). Seqüências de cadeias pesada e leve parciais abrangendo as regiões de CDR são, tipicamente, suficientes para essa finalidade. A seqüência parcial é usada para determinar quais segmentos de gene de junção e variável de linhagem germinativa contribuíram para os genes variáveis do anticorpo recombinante. A seqüência de linhagem germinativa é, então, usada para preencher porções que faltam das regiões variáveis. Seqüências lideres de cadeias pesada e leve são clivadas durante a maturação de proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar seqüências que faltam, seqüências de DNAc clonadas podem ser combinadas com oligonucleotídeos sintéticos através de ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, a região variável inteira pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleotídeos curtos de sobreposição e combinada através de amplificação por PCR para criar um clone de região variável inteiramente sintético. Esse processo tem determinadas vantagens tais como eliminação ou inclusão de sítios de restrição particulares ou otimização de códons particulares.
As seqüências de nucleotídeo dos transcritos de cadeias pesada e leve de hibridomas são usadas para projetar um conjunto sobreposto de oligonucleotídeos sintéticos para criar seqüências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às seqüências naturais. As seqüências de cadeias pesada e kappa sintéticas podem diferir das seqüências naturais em três formas: trechos de bases de nucleotídeo repetidas são interrompidos para facilitar a síntese de oligonucleotídeo e amplificação por PCR; sítios de início de tradução ótimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870 ); e sítios HindIII são manipulados a montante dos sítios de início de tradução.
Para as regiões variáveis de cadeias pesada e leve, as seqüências otimizadas com fitas de codificação e não codificação correspondentes são decompostas em 30-50 nucleotídeos aproximadamente no ponto mediano do oligonucleotídeo de não codificação correspondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleotideos podem ser agrupados em conjuntos sobrepostos de fita dupla que abrangem segmentos de 150-400 nucleotideos. Os reservatórios são, então, usados como templates para produzir produtos de amplificação por PCR de 150-400 nucleotideos. Tipicamente, um único conjunto de oligonucleotideo de região variável será decomposto em dois reservatórios, os quais são separadamente amplificados para gerar dois produtos de PCR sobrepostos. Esses produtos de PCR sobrepostos são, então, combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Pode ser desejável incluir um fragmento de sobreposição da região constante de cadeia pesada ou leve na amplificação por PCR para gerar fragmentos que podem ser facilmente clonados nas estruturas de vetor de expressão.
As regiões variáveis de cadeia leve e pesada humanizadas ou quimerizadas reconstruídas são, então, combinadas com seqüências clonadas de promotor, líder, início de tradução, região constante, 3' não traduzida, poliadenilação e término de transcrição para formar estruturas de vetor de expressão. As estruturas de expressão de cadeias leves e pesada podem ser combinadas em um único vetor, co-transfectadas, serialmente transfectadas ou separadamente transfectadas em células hospedeiras as quais são, então, fundidas para formar uma célula hospedeira expressando ambas as cadeias. Plasmideos para uso na construção de vetores de expressão de IgGK são descritos abaixo. Os plasmídeos foram construídos de modo que seqüências de DNAc de cadeia leve kappa V e pesada V amplificadas por PCR pudessem ser usadas para reconstruir minigenes de cadeias leve e pesada completos. Esses plasmídeos podem ser usados para expressar anticorpos IgGl, Kappa ou IgG4, Kappa completamente humanos ou quiméricos. Plasmídeos similares podem ser construídos para expressão de outros isotipos de cadeia pesada ou para expressão de anticorpos compreendendo cadeias leve lambda.
Assim, em outro aspecto da invenção, as características estruturais dos anticorpos anti-CLD18 da. invenção são usadas para criar anticorpos anti-CLDl8 humanizados estruturalmente relacionados os quais retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como ligação à CLD18. Mais especificamente, uma ou mais regiões de CDR de anticorpos monoclonais de camundongo podem ser recombinantemente combinadas com regiões de "framework" humanas conhecidas e CDRs para criar anticorpos adicionais anti-CLD18 humanizados recombinantemente manipulados da invenção.
Ligação às células expressando antígeno A capacidade do anticorpo de se ligar à CLD18 pode ser determinada usando ensaios de ligação padrões, tais como aqueles apresentados nos exemplos (por exemplo, ELISA, Western blot, análise por imunofluorescência e citometria de fluxo).
Caracterização de ligação de anticorpos
Para purificar anticorpos anti-CLD18, hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos para centrifuga de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Alternativamente, anticorpos anti-CLD18 podem ser produzidos em bio-reatores baseados em diálise. Sobrenadantes podem ser filtrados e, se necessário, concentrados antes de cromatografia por afinidade com proteína G-sepharose ou proteína A-sepharose. A IgG eluída pode ser verificada através de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta performance para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser alterada para PBS e a concentração pode ser determinada pela OD280 usando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser transformados em alíquotas e armazenados a -80°C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti- CLD18 selecionados se ligam a epítopos únicos, mutagênese sítio-dirigida ou multi-sítio pode ser usada
Determinação de Isotipo Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, ELISAs de isotipo com vários kits comerciais (por exemplo, Zymed, Roche Diagnostics) podem ser realizados. Poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com Ig anti- camundongo. Após bloqueio, as placas são reagidas com anticorpos monoclonais ou controles de isotipo purificados, em temperatura ambiente, durante duas horas. Os poços podem, então, ser reagidos com IgGl,IgG2a, IgG2b ou IgG3, IgA de camundongo ou sondas conjugadas às peroxidase IgM- especificas de camundongo. Após a lavagem, as placas podem ser reveladas com substrato ABTS (1 mg/ ml) e analisadas em uma OD de 405-650. Alternativamente, o kit IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping (Roche, Cat. No. 1493027) pode ser usado conforme descrito pelo fabricante.
Análise citométrica de fluxo
De forma a demonstrar a presença de anticorpos anti- CLD18 no soro de camundongos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais às células vivas expressando CLD18, pode ser usada citometria de fluxo. Linhagens de células expressando naturalmente ou, após transfecção, CLD18 e controles negativos carecendo de expressão de CLD18 (crescidos sob condições de crescimento padrões) podem ser misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma ou em PBS contendo FBS a 1% e podem ser incubadas a 4°C durante 30 min. Após lavagem, o anticorpo anti-IgG marcado com APC ou Alexa647 pode se ligar ao anticorpo monoclonal ligado a CLD18 sob as mesmas condições conforme a coloração de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas através de citometria de fluxo com um instrumento FACS usando as propriedades de dispersão de luz e lateral para ativar células vivas únicas. De forma a distinguir anticorpos monoclonais específicos a CLD18 de ligantes não específicos, em uma única medição, o método de co- transfecção pode ser empregado. Células transitoriamente transfectadas com plasmídeos gue codificam CLD18 e um marcador fluorescente podem ser corados conforme descrito acima. Células transfectadas podem ser detectadas em um canal de fluorescência diferente das células coradas com anticorpo. Uma vez que a maioria das células transfectadas expressa ambos os transgenes, anticorpos monoclonais específicos a CLD18 se ligam, de preferência, às células expressando o marcador de fluorescência, enquanto os anticorpos não específicos se ligam, em uma proporção comparável, às células não transfectadas. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado, além de, ou ao invés do ensaio de citometria de fluxo. Células podem ser coradas exatamente conforme descrito acima e examinadas através de microscopia por fluorescência.
Proteínas de "tight junction" tendem a ser internalizadas, se o contato célula a célula com células vizinhas de células particularmente aderentes é perdido, por exemplo, através de desprendimento das células. Expressão na superfície celular de CLD18 pode ser otimizada através de a) ajuste das condições de cultura, por exemplo, cultura em uma maior densidade celular de uma maneira padronizada, usando desprendimento suave (por exemplo, EDTA/PBS a 2 mM ou acutase) processamento em temperatura ambiente e adição de inibidores de endocitose (por exemplo, azida de sódio) ou ativadores de transcrição ou tradução de CLD18, e através de b) seleção e clonagem de células mantendo CLD18 em altos níveis na superfície celular, por exemplo, através de seleção com antibióticos em termos de células transfectadas, através de seleção imunomagnética de células ou por FACS, e através de clonagem por diluição limitada.
Microscopia de imunofluorescência.
De forma a demonstrar a presença de anticorpos anti- CLD18 no soro de camundongos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais às. células vivas expressando CLD18, pode ser usada a análise de microscopia por imunofluorescência. Por exemplo, linhagens de células expressando espontaneamente, ou após transfecção, a CLD18 e controles negativos carecendo de expressão de CLD18 são crescidos em placas com câmara sob condições de crescimento padrões em meio DMEM/F12, suplementado com soro de bezerro fetal (FCS) a 10%, L-glutamina a 2 mM, 100 IU/ml de penicilina e 100 μς/ιαΐ estreptomicina. As células podem, então, ser fixadas com metanol ou paraformaldeido ou deixadas não tratadas. As células podem, então, ser reagidas com anticorpos monoclonais contra CLD18 durante 30 min. a 25°C. Após a lavagem, as células podem ser reagidas com um anticorpo secundário de IgG anti-camundongo marcado com Alexa555 (Molecular Probes) sob as mesmas condições. As células podem, então, ser examinadas através de microscopia por fluorescência.
Os niveis totais de CLD18 em células podem ser observados quando as células são fixadas em metanol ou fixadas em paraformaldeido e permeabilizadas com Triton X- 100. Em células vivas e células fixadas com paraformaldeido não permeabilizadas, a localização na superfície de CLD18 pode ser examinada. Objetivação adicional de CLD18 às "tight junctions" pode ser analisada através de co- coloração com marcadores de "tight junction", tal como ZO- 1. Além disso, os efeitos de ligação de anticorpo e localização de CLD18 dentro da membrana celular podem ser examinados. Western Blot
IgG anti-CLD18 pode ser ainda testada com relação à reatividade com o antigeno CLD18 através de Western Blotting. Resumidamente, extratos celulares de células expressando CLD18 e controles negativos apropriados podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS). Após a eletroforese, os antigenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados e hibridizados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG pode ser detectada usando peroxidase de IgG anti- camundongo e revelada com substrato ECL.
Imunohi s toquímica
IgGs anti-CLD18 de camundongo podem ser ainda testadas com relação à reatividade com antigeno CLD18 através de imunohistoquimica de uma maneira conhecida por aqueles habilitados, por exemplo, usando crio-seções fixadas em acetona ou paraformaldeido ou seções teciduais incrustadas em parafina fixadas com paraformaldeido a partir de amostras de tecido cancerígeno ou tecido não cancerígeno obtidas de pacientes durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou de camundongos trazendo tumores xenoenxertados inoculados com linhagens de células expressando CLD18 espontaneamente (por exemplo, DAN-G, SNU-16 ou KATO-III) ou após transfecção (por exemplo, HEK293) . Para imunocoloração, anticorpos reativos à CLD18 pode ser incubados, seguido por anticorpos anti-coelho de cabra ou anti-camundongo de cabra conjugados à peroxidase de armorácia (DAKO) de acordo com as instruções dos vendedores.
Atividades Fagociticas e de Morte de células dos anticorpos in vitro
Além de se ligar especificamente à CLD18, anticorpos anti-CLD18 podem ser testados com relação à sua capacidade de mediar a fagocitose e a morte de células expressando CLD18. A testagem de atividade de anticorpo monoclonal in vítro proporcionará uma seleção inicial para testagem de modelos in vivo.
Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) :
Resumidamente, células polimorfonucleares (PMNs) células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efetoras provenientes de doadores saudáveis podem ser purificadas através de centrifugação por densidade Ficoll Hypaque, seguida por Iise de eritrócitos contaminantes. Células efetoras lavadas podem ser suspensas em RPMI suplementado com soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 10% ou, alternativamente, com soro humano inativado pelo calor a 5% e misturadas com células alvo marcadas com 51Cr- expressando CLD18, em várias proporções de células efetoras para células alvo. Alternativamente, as células alvo podem ser marcadas com um ligante de intensificação de fluorescência (BATDA). Um quelato altamente fluorescente de Európio com o ligante de intensificação, o qual é liberado a partir de células mortas, pode ser medido por um fluorômetro. Outra técnica alternativa pode utilizar a transfecção de células alvo com luciferase. O amarelo lúcifer adicionado pode, então, ser oxidado apenas por células viáveis. IgGs anti-CLD18 purificadas podem, então, ser adicionadas em várias concentrações. IgG humana irrelevante pode ser usada como um controle negativo. Os ensaios podem ser realizados durante quatro a vinte horas a 37°C, dependendo do tipo de célula efetora usada. Amostras podem ser testadas com relação à citólise através da medição da liberação de 51Cr ou da presença do quelato de EuTDA no sobrenadante de cultura. Alternativamente, a luminescência resultante da oxidação de amarelo lúcifer pode ser uma medida de células viáveis.
Anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem também ser testados em várias combinações para determinar se a citólise é intensificada com múltiplos anticorpos monoclonais.
Citotoxicidade dependente de complemento (CDC):
Anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem ser testados com relação à sua capacidade de mediar a CDC usando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, soro para complemento pode ser obtido a partir do sangue de uma maneira conhecida por aqueles habilitados. Para determinar a atividade de CDC de mAbs, diferentes métodos podem ser usados. Liberação de 51Cr pode, por exemplo, ser medida, ou a permeabilidade elevada na membrana pode ser avaliada usando um ensaio de exclusão com iodeto de propidio (PI) . Resumidamente, células alvo podem ser lavadas e 5 χ 105/ml podem ser incubadas com várias concentrações de mAb durante 10-30 min. em temperatura ambiente ou a 37 °C. Soro ou plasma pode, então, ser adicionado até uma concentração final de 20% (v/v) e as células incubadas a 37°C durante 20-30 min. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI em um tubo para FACS. A mistura pode, então, ser imediatamente analisada através de análise por citometria de fluxo usando FACSArray.
Em um ensaio alternativo, indução de CDC pode ser determinada sobre células aderentes. Em uma modalidade desse ensaio, as células são cultivadas 24 horas antes do ensaio com uma densidade de 3 χ l0^/poço em placas de microtitulação de cultura tecidual com fundo plano. No dia seguinte, o meio de crescimento é removido e as células são incubadas em triplicatas com anticorpos. Células de controle são incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo 0,2% de saponina para a determinação da lise de base e da Iise máxima, respectivamente. Após incubação durante 20 min em temperatura ambiente, o sobrenadante é removido e plasma humano a 20% (v/v) ou soro em DMEM (pré-aquecido para 37°C) é adicionado às células e incubado durante mais 20 min a 37°C. Todas as células de cada amostra são adicionadas à solução de iodeto de propidio (10 μg/ ml). Então, os sobrenadantes são substituídos por PBS contendo 2,5 μg/ ml de brometo de etidio e a emissão de fluorescência quando excitado a 520 nM é medida a 600 nM usando Tecan Safire. A lise específica percentual é calculada como segue: lise específica% = (fluorescência da amostra - fluorescência de base) / (fluorescência máxima de lise - fluorescência de base) χ 100.
Inibição da proliferação celular por anticorpos monoclonais:
Para testar a capacidade de iniciar a apoptose, anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem, por exemplo, ser incubados com células tumorigenas CLD18-positivas, por exemplo, SNU-16, DAN- G, KATO-III ou células tumorigenas transfectadas com CLD18 a 37ºC durante cerca de 20 horas. As células podem ser coletadas, lavadas em tampão de ligação de Anexina-V (BD biosciences) e incubadas com FITC ou APC conjugado com Anexina-V (BD biosciences) durante 15 min. no escuro. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI (10 μg/ml em PBS) em um tubo para FACS e ensaiadas imediatamente através de citometria de fluxo (conforme acima) . Alternativamente, uma inibição geral de proliferação celular por anticorpos monoclonais pode ser detectada com kits comercialmente disponíveis. O kit DELFIA Cell Proliferation (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200) é um imuno ensaio não isotópico baseado na medição de incorporação de 5-bromo-21-deoxiuridina (BrdU) durante síntese de DNA de células em proliferação em microplacas. BrdU incorporado é detectado usando anticorpo monoclonal marcado com Európio. Para permitir a detecção de anticorpo, as células são fixadas e o DNA desnaturado usando solução Fix. O anticorpo não marcado é lavado e o indutor DELFIA é adicionado a íons de Európio dissociados do anticorpo marcado em solução, onde eles formam quelatos altamente fluorescentes com os componentes do indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando fluorometria tempo- decomposta na detecção - é proporcional à síntese de DNA na célula de cada poço. Estudos pré-clinicos
Anticorpos monoclonais os quais se ligam à CLD18 também podem ser testados em um modelo in vivo (por exemplo, em camundongos imuno-deficientes trazendo tumores xenoenxertados inoculados com linhagens de células expressando CLD18, por exemplo, DAN-G, SNU-16 ou KATO-III ou após transfecção, por exemplo, HEK293) para determinar sua eficácia ao controlar o crescimento de células tumorigenas expressando CLD18.
Estudos in vivo após xenoenxerto de células tumorigenas expressando CLD18 em camundongos imunocomprometidos ou outros animais podem ser realizados usando anticorpos da invenção. Anticorpos podem ser administrados a camundongos sem tumor, seguido por injeção de células tumorigenas para medir os efeitos dos anticorpos de prevenir a formação de tumores ou sintomas relacionados a tumor. Anticorpos podem ser administrados a camundongos trazendo tumor para determinar a eficácia terapêutica dos respectivos anticorpos para reduzir o crescimento de tumor, metástase ou sintomas relacionados a tumor. A aplicação de anticorpos pode ser combinada com a aplicação de outras substâncias como fármacos citostáticos, inibidores de fator de crescimento, bloqueadores do ciclo celular, inibidores de angiogênese ou outros anticorpos para determinar a eficácia sinergistica e a toxicidade potencial de combinações. Para analisar efeitos colaterais tóxicos mediados pelos anticorpos da invenção, animais podem ser inoculados com os anticorpos ou reagentes de controle e totalmente investigados com relação a sintomas possivelmente relacionados à terapia com anticorpo anti- CLD18. Possíveis efeitos colaterais de aplicação ín vivo de anticorpos à CLD18 incluem, particularmente, toxicidade em tecidos expressando CLD18, incluindo estômago e pulmão. Anticorpos que reconhecem a CLD18 em seres humanos e outras espécies, por exemplo, camundongos, são particularmente úteis para prever efeitos colaterais potenciais mediados pela aplicação de anticorpos monoclonais à CLD18 em seres humanos.
Mapeamento de epitopo
Mapeamento de epitopos reconhecidos pelos anticorpos da invenção pode ser realizado conforme descrito em detalhes em "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) por Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 por Olwyn M. R. Westwood7 Frank C. Hay.
I. Moléculas bi-especificas/multi-especificas as quais se ligam à CLD18
Em ainda outra modalidade da invenção, anticorpos à CLD18 podem ser derivatizados ou ligados à outra molécula funcional, por exemplo, outro peptideo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab1) para gerar uma molécula bi- específica ou multi-especifica a qual se liga a múltiplos sítios de ligação ou epítopos alvo. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais de outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, peptideo ou mimético de ligação.
Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculas bi-específicas e multi-específicas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade pela CLD18 e uma segunda especificidade por um segundo epítopo alvo. Em uma modalidade particular da invenção, o segundo epítopo alvo é um receptor Fc, por exemplo, o receptor Fc-gamaRI humano (CD64) ou um receptor Fc-alfa humano (CD89) ou um receptor de célula T, por exemplo, CD3. Portanto, a invenção inclui moléculas bi-específicas e multi-específicas capazes de ligação às células efetoras expressando Fc-gamaR, Fc-alfaR ou Fc-epsilonR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)) e para objetivar células expressando CLD18. Essas moléculas bi-especificas e multi- especificas podem objetivar células expressando CLD18 às células efetoras e podem disparar atividades de célula efetora mediadas pelo receptor Fc, tal como fagocitose de células expressando CLD18, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocina ou geração de ânion de superóxido.
Moléculas bi-especificas e multi-especificas da invenção podem ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade anti-ligação a Fc e uma especificidade anti-ligação à CLD18. Em uma modalidade, a terceira especificidade de ligação é uma porção anti-fator de intensificação (EF) , por exemplo, uma molécula a qual se liga a uma proteína na superfície envolvida em atividade citotóxica e, desse modo, aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção anti-fator de intensificação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligante que se liga a uma determinada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor e, desse modo, resulta em uma intensificação do efeito dos determinantes de ligação pelo receptor Fc ou um antígeno da célula alvo. A "porção anti-fator de intensificação" pode se ligar a um receptor Fc ou um antígeno da célula alvo. Alternativamente, a porção anti-fator de intensificação pode se ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual as primeiras e segundas especificidades se ligam.
Por exemplo, a porção anti-fator de intensificação pode se ligar a uma célula T citotóxica (por exemplo, via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-I ou outra célula imune que resulta em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo) .
Em uma modalidade, as moléculas bi-especificas e multi-especificas da invenção compreendem, como uma especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2/ Fv ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também ser um dimero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmento minimo do mesmo, tal como um Fv ou uma estrutura com cadeia simples, conforme descrito em Ladner et al. , US 4.946.778. 0 anticorpo pode também ser uma proteína de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação, conforme divulgado no US2003/0118592 e US 2003/0133939.
Em uma modalidade, moléculas bi-especificas e multi- específicas da invenção compreendem uma especificidade de ligação por um Fc-gamaR ou Fc-alfaR presente sobre a superfície de uma célula efetora e uma segunda especificidade de ligação por um antigeno da célula alvo, por exemplo, CLD18.
Em uma modalidade, a especificidade de ligação por um receptor Fc é proporcionada por um anticorpo monoclonal, a ligação do qual não é bloqueada por uma imunoglobulina G (IgG) humana. Conforme usado aqui, o termo "receptor de IgG" se refere a qualquer um dos oito genes de gama-cadeia localizados sobre o cromossoma 1. Esses genes codificam um total de doze isoformas de receptor solúvel ou transmembrana as quais são agrupadas em três classes de receptor Fc-gama: Fc-gamaRI (CD64), Fc-gamaRII (CD32) e Fc- gamaRIII (CD16). Em uma modalidade preferida, o receptor Fc-gama é um Fc-gamaRI humano de alta afinidade.
A produção e caracterização desses anticorpos monoclonais preferidos são descritas por Fanger et al. no WO 88/00052 e na US 4.954.617. Esses anticorpos se ligam a um epitopo de Fc-gamaRI, Fc-gamaRII ou Fc-gamaRIII em um sitio o qual é distinto do sitio de ligação Fcy do receptor e, assim, sua ligação não é substancialmente bloqueada em níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-Fc-gamaRI específicos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Em outras modalidades, o anticorpo anti-receptor Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritas em Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e WO 94/10332. A linhagem de célula que produz o anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection em 4 de Novembro de 1992 sob a designação HA022CL1 e tem o No. de acesso CRL 11 177.
Em ainda outras modalidades preferidas, a especificidade de ligação por um receptor Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humano, por exemplo, um receptor Fc-alfa (Fc-alfaRI (CD89)), a ligação do qual não é, de preferência, bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA). 0 termo "receptor de IgA" se destina a incluir o produto genético de um alfa- gene (Fc-alfaRI) localizado sobre o cromossoma 19. Esse gene é conhecido por codificar várias isoformas na transmembrana com splicing alternativo de 55 a 110 kDa. Fc- alfaRI (CD89) é constitutivamente expresso sobre monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofilicos e neutrofilicos, mas não sobre populações de células não- efetoras. Fc-alfaRI tem média afinidade pela IgAl e IgA2, a qual é aumentada quando de exposição à citocinas, tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Quatro anticorpos monoclonais Fc-alfaRI-específicos, identificados como A3, Α59, Α62 e Ali, os quais se ligam ao Fc-alfaRI fora do domínio de ligação do ligante de IgA, foram descritos (Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).
Fc-alfaRI e Fc-gamaRI são receptores de disparo preferidos para uso na invenção, porque eles (1) são expressos primariamente sobre células efetoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressos em altos níveis (por exemplo, 5,000- 100,000 por célula); (3) são mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); (4) mediam a apresentação intensificada de antígeno, incluindo auto- antígeno, objetivados aos mesmos.
Em outra modalidade, a molécula bi-específica é compreendida por dois anticorpos monoclonais de acordo com a invenção os quais têm atividades funcionais complementares, tal como um anticorpo funcionando predominantemente através de indução de CDC e o outro anticorpo predominantemente através de indução de apoptose.
Um "anticorpo específico à célula efetora ", conforme usado aqui, se refere a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que se liga ao receptor Fc de células efetoras. Anticorpos preferidos para uso na presente invenção se ligam ao receptor Fc de células efetoras em um sítio o qual não é ligado pela imunoglobulina endógena. Conforme usado aqui, o termo "célula efetora" se refere a uma célula imune a qual está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, em oposição às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. Células imunes exemplificativas incluem células de origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (por exemplo, células B e células T, incluindo células T citoliticas (CTLs), células assassinas, células assassinas naturais, granulócitos, mastócitos e basófilos). Algumas células efetoras expressam receptores Fc específicos e trazem funções imunes específicas. Em modalidades específicas, uma célula efetora é capaz de induzir à citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), por exemplo, um neutrófilo capaz de induzir à ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, os quais expressam FcR estão envolvidos em morte específica de células alvo e apresentação de antígenos a outros componentes do sistema imune ou ligação às células que apresentem antígenos. Em outras modalidades, uma célula efetora pode realizar fagocitose de um antígeno alvo, célula alvo ou microorganismo. A expressão de um FcR em particular sobre uma célula efetora pode ser regulada com fatores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, descobriu-se que expressão de Fc-gamaRI é super-regulada pelo interferon gama (IFN-γ) . Essa expressão intensificada aumenta a atividade citotóxica de células trazendo Fc- gamaRI contra alvos. Uma célula efetora pode realizar fagocitose ou Iise de um antigeno alvo ou uma célula alvo.
"Célula alvo" significará qualquer célula indesejável em um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou animal) que pode ser objetivada por um anticorpo da invenção. Em modalidades preferidas, a célula alvo é uma célula expressando ou superexpressando CLD18. Células expressando CLD18 incluem, tipicamente, células tumorígenas.
As moléculas bi-especificas e multi-específicas da presente invenção podem ser feitas usando técnicas químicas (veja, por exemplo, D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5807), técnicas de "polidoma" (Veja US 4.474.893, para Reading) ou técnicas de DNA recombinante.
Em particular, moléculas bi-especificas e multi- específicas da presente invenção podem ser preparadas através de conjugação das especificidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-CLD18, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula bi-específica e multi-específica pode ser gerada separadamente e, então, conjugada à outra. Quando as especificidades de ligação proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N- succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'- ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e sulfo-succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1- carboxilato (sulfo-SMCC) (veja, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648). Outros métodos incluem aqueles descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83) e Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367- 2375). Agentes de conjugação são preferidos SATA e sulfo- SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados via ligação com sulfidrila das regiões de dobradiça do C-terminal das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, de preferência um, antes de conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é particularmente útil onde a molécula bi-especifica e multi-especifica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Uma molécula bi-especifica e multi- específica da invenção, por exemplo, uma molécula bi- específica, pode ser uma molécula com cadeia simples, tal como um anticorpo bi-específico com cadeia simples, uma molécula bi-específica com cadeia simples compreendendo um anticorpo com cadeia simples e um determinante de ligação ou uma molécula bi-específica com cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas bi- específicas e multi-especificas também podem ser moléculas com cadeia simples ou podem compreender pelo· menos duas moléculas com cadeia simples. Métodos para preparo de moléculas bi- e multi-especificas são descritos, por exemplo, na US 5.260.203; US 5.455.030; US 4.881.175; US 5.132.405; US 5.091.513; US 5.476.786; US 5.013.653; US 5.258.498; e US 5.482.858.
Ligação das moléculas bi-específicas e multi- específicas a seus alvos específicos pode ser confirmada através de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise por FACS, um bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou um ensaio de Western blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteina-anticorpo de interesse particular empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) especifico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados usando, por exemplo, um anticorpo ligado à enzima ou fragmento de anticorpo o qual reconhece e se liga especificamente aos complexos de anticorpo-FcR. Alternativamente, o anticorpo pode ser radioativamente marcado e usado em um radioimunoensaio (RIA) (veja, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março de 1986). O isótopo radioativo pode ser detectado através de meios tais como o uso de um γ-contador ou um contador de cintilação ou através de auto- radiografia.
II. Imunoconjugados
Em outro aspecto, a presente invenção se caracteriza por um anticorpo anti-CLD18 conjugado a uma porção ou agente terapêutico, tal como um citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou um radioisótopo. Tais conjugados são referidos aqui como "imunoconjugados" . Imunoconjugados os quais incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial a e que, em particular, mata células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposideo, tenoposideo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glicocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.
Agentes terapêuticos adequados para formação de imunoconjugados da invenção incluem, mas não estão limitados a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5- fluorouracil decarbazina) , agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melphalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNü), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (formalmente daunomicina) e doxorubicina) , antibióticos (por exemplo, dactinomicina (formalmente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Em uma modalidade preferida, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Em outra modalidade, o agente terapêutico é um imunossupressor. Em ainda outra modalidade, o agente terapêutico é GM- CSF. Em uma modalidade preferida, o agente terapêutico é doxorubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucila, ciclofosfamida ou ricina A.
Anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados a um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, ítrio- 90 ou indium-111, para gerar produtos radio-farmacêuticos citotóxicos para o tratamento de um distúrbio relacionado a CLD18, tal como câncer. Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica e a porção de fármaco não deve ser construída como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção do fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina de difteria; uma proteína, tal como fator de necrose tumoral ou interferon-γ; ou modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina- 1 ("IL-I") , interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL- 6"), fator de estimulação de colônia de granulócito- macrófago ("GM-CSF"), fator de estimulação de colônia de granulócito ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.
Técnicas para conjugação de tal porção terapêutica a anticorpos são bem conhecidos; veja, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), páginas 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), páginas 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982) .
Em outra modalidade, os anticorpos de acordo com a invenção são presos a um ligante-quelador, por exemplo, tiuxetano, o qual permite que o anticorpo seja conjugado a um radioisótopo.
III. Composições farmacêuticas Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais, tais como aquelas divulgadas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Em uma modalidade, as composições incluem uma combinação de múltiplos anticorpos isolados (por exemplo, dois ou mais) da invenção os quais atuam através de diferentes mecanismos, por exemplo, um anticorpo o qual atua predominantemente através de . indução de CDC em combinação com outro anticorpo o qual atua através de indução de apoptose.
Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia combinada, isto é, combinado com outros agentes. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um agente antiinflamatório ou pelo menos um agente imuno- supressor. Em uma modalidade, tais agente terapêuticos incluem um ou mais agentes antiinflamatórios, tal como um fármaco esteroidal ou um NSAID (fármaco antiinflamatório não esteroidal). Agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2, tais como rofecoxib (Vioxx) e celecoxib (Celebrex), NSAIDs, tais como ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproxen (Naprosyn) , sulindac (Clinoril) , diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofen (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozina (Daypro) e indometacina (Indocin).
Em outra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem agentes que levam à depleção ou inativação funcional de células T regulatórias, tal como ciclofosfamida em baixa dose, anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-IL2 ou anti- receptor de IL2.
Em ainda outra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais produtos quimioterapêuticos, tais como derivados de Taxol, taxotero, gemcitabina, 5-Fluoruracila, doxorubicina (Adriamicina), cisplatina (Platinol), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar). Em outra modalidade, anticorpos da presente invenção podem ser administrados em combinação com agentes quimioterapêuticos, os quais mostram, de preferência, eficácia terapêutica em pacientes sofrendo de câncer de estômago, esofageal, pancreático e de pulmão.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser administrados em conjunto com radioterapia e/ou células-tronco periféricas autólogas ou transplante de medula óssea.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos selecionados de anticorpos anti-CD25, anticorpos anti-EPCAM, anticorpos anti-EGFR, anti-Her2/neu e anti- CD40 .
Em ainda outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-C3b(i) de forma a intensificar a ativação de complemento.
Conforme usado aqui, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, molécula bi-específica e multi- específica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições que podem inativar o composto.
Um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto precursor e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (veja, por exemplo, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19).
Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácido clorídrico, nitrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiódico, fosforoso, e semelhantes, bem como ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos fenila-substituidos, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio e cálcio, e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'~ dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
Uma composição da presente invenção pode ser administrada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será apreciado por aqueles habilitados na técnica, a via e/ou modo de administração variarão, dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação com liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsuladas. Polímeros biocompatíveis biodegradáveis podem ser usados, tais como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Métodos para o preparo de tais formulações são geralmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.
Para administrar um composto da invenção através de determinadas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com um material para prevenir sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo em um veículo apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e tampão aquosa. Lipossomas incluem emulsões água- em-óleo-em-água CGF, bem como lipossomas convencionais (Strejan et al. (1984) J. Neuroinmmnol. 7: 27).
Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós-estéreis para o preparo extemporâneo de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, uso dos mesmos nas composições farmacêuticas da invenção é considerado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
Composições terapêuticas devem, tipicamente, ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada a uma alta concentração de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio, na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser mantida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através de incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por microfiltração por esterilização.
Geralmente, dispersões são preparadas através de incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contêm um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós- estéreis para o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparo são secagem a vácuo e secagem-congelamento (liofilização) que proporcionam um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada-estéril do mesmo.
Regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma única quantidade pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas durante o tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária, conforme usado aqui, se refere às unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é orientada por e diretamente dependente de (a) as características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido e (b) as limitações inerentes na técnica de composição, tal como um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidróxiariisola butilada (BHA) , hidróxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes de quelação de metal, tais como ácido citrico, ácido etileno diamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.
Para as composições terapêuticas, formulações da presente invenção incluem aquelas adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem, convenientemente, ser apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas através de quaisquer métodos conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente ativo a qual pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem variará, dependendo do indivíduo que está sendo tratado e do modo de administração em particular. A quantidade de ingrediente ativo a qual pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem geralmente será aquela quantidade da composição a qual produz um efeito terapêutico.
Geralmente, de cem por cento, essa quantidade oscilará de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de preferência de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, mais preferivelmente de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento.
Formulações da presente invenção as quais são adequadas para administração vaginal também incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray contendo veículos, tal como é conhecido na técnica como sendo apropriados. Formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições da presente invenção incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e com quaisquer conservantes, tampões ou propelentes os quais possam ser requeridos.
As frases "administração parenteral" e "parenteralmente administrado", conforme usado aqui, significam outros modos de administração que não administração enteral e tópica, usualmente através de injeção e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, sub-aracnóide, intra- espinhal, epidural e intra-esternal. Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados os quais podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tal como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, através de manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e através do uso de tensoativos.
Essas composições também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes de umedecimento, agentes de emulsificação e agentes de dispersão. Prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada através de procedimentos de esterilização e através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Além disso, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser mantida através da inclusão de agentes os quais retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais da invenção são administrados na forma cristalina através de injeção subcutânea, cf. Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12) : 6934-6939. Quando os compostos da presente invenção são administrados como produtos farmacêuticos, a seres humanos e animais, eles podem ser fornecidos sozinhos ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,01 a 99,5% (mais preferivelmente 0,1 a 90%) de ingrediente ativo em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
A despeito da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção os quais podem ser usados em uma forma hidratada adequada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis através de métodos convencionais conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Niveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo a qual é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração em particular, sem ser tóxica para o paciente. O nivel de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições da presente invenção empregadas em particular, da via de administração, do momento de administração, da taxa de excreção do composto que está sendo empregado em particular, da duração de tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições empregadas em particular, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica pregressa do paciente que está sendo tratado e fatores semelhantes bem conhecidos na técnica médica.
Um médico ou veterinário comumente habilitado na técnica pode determinar prontamente e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses dos compostos da invenção empregadas na composição farmacêutica em niveis menores do que aqueles requeridos, de forma a obter o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja obtido. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição da invenção será aquela quantidade do composto a qual é a menor dose eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz geralmente dependerá dos fatores descritos acima. É preferido que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, de preferência administrada proximo ao local do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente em intervalos apropriados no decorrer do dia, opcionalmente em formas de dosagem unitária. Embora seja possível que um composto da presente invenção seja administrado sozinho, é preferível administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição).
Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser administrados através de infusão, de preferência infusão contínua lenta durante um longo período, tal como mais de 24 horas, de forma a reduzir efeitos colaterais tóxicos. A administração também pode ser realizada através de infusão contínua durante um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada através de medição da quantidade de anticorpos monoclonais anti-CLD18 em circulação quando de administração em uma amostra biológica usando anticorpos anti-idiotípicos os quais objetivam os anticorpos anti-CLD18.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos são administrados através de terapia de manutenção tal como, por exemplo, uma vez por semana durante um período de 6 meses ou mais.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser administrados através de um regime incluindo uma infusão de um anticorpo contra CLD18, seguido por uma infusão de um anticorpo contra CLD18 conjugado a um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, de 7 a 9 dias depois.
Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados na US 5.399.163; US 5.383.851; US 5.312.335; US 5.064.413; US 4.941.880; US 4.790.824; ou US 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem aqueles descritos na: US 4.487.603, a qual divulga uma bomba de micro-infusão implantável para distribuição de medicamento em uma taxa controlada; a US 4.486.194, a qual divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; a US 4.447.233, a qual divulga uma bomba para infusão de medicamento para distribuição de medicamento em uma taxa de infusão precisa; a US 4.447.224, a qual divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para distribuição continua de fármaco; a US 4.439.196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármaco osmótico tendo compartimentos com múltiplas câmaras; e a US 4.475.196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármaco osmótico.
Muitos outros de tais implantes, sistemas de distribuição e módulos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofilicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a BBB (se desejado) , eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas veja, por exemplo, US 4.522.811; US 5.374.548; e US 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções as quais são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos e, assim, intensificam a distribuição objetivada do fármaco (veja, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Porções de objetivação exemplificativas incluem folato ou biotina (veja, por exemplo, US 5.416.016 para Low et al.); manosideos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; Μ. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); e receptor de proteína A-tensoativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134).
Em uma modalidade da invenção, os compostos terapêuticos da invenção são formulados em lipossomas. Em uma modalidade mais preferida, os lipossomas incluem uma porção de objetivação. Em uma modalidade ainda mais preferida, os compostos terapêuticos nos lipossomas são distribuídos através de injeção de bolo a um local proximo à área desejada, por exemplo, o local de um tumor. A composição deve ser fluida até o ponto em que exista capacidade de fluxo em uma seringa. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos.
Em outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser formulados para prevenir ou reduzir seu transporte através da placenta. Isso pode ser feito através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através de PEGuilação dos anticorpos ou através de uso de fragmentos F(ab)2'. Outras referências podem ser feitas a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177- 190; e a "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 27 9-283.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia de tumor pode ser medida através de respostas objetivas do tumor as quais podem ser completas ou parciais. Uma resposta completa (CR) é definida como nenhuma evidência clinica, radiológica ou outra da doença. Uma resposta parcial (PR) resulta de uma redução no tamanho de tumor agregado de mais de 50%. 0 tempo médio para a progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta objetiva do tumor.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia de tumor também pode ser medida por sua capacidade de estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto de inibir câncer pode ser avaliada em um sistema modelo com animais para prever a eficácia em tumores humanos. Alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada através de exame da capacidade do composto de inibir o crescimento celular ou apoptose através de ensaios in vitro conhecidos pelo praticamente habilitado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou, de outro modo, aliviar os sintomas em um indivíduo. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de determinar tais quantidades baseado em fatores tais como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo e a composição ou via de administração selecionada em particular.
A composição deve ser estéril e fluida até o ponto em que a composição seja distribuível através de uma seringa. Além de água, o veículo pode ser uma solução salina tamponada isotônica, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através de uso de revestimento, tal como lecitina, através de manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através de uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poli álcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. Absorção em longo prazo das composições injetáveis pode ser obtida através de inclusão, na composição, de um agente o qual retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.
Quando o composto ativo é adequadamente protegido, conforme descrito acima, o composto pode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veiculo ingerivel assimilável. IV. Usos e Métodos da Invenção
Os anticorpos (incluindo imunoconjugados, bi- especificos/multi-especif icos, composições e outros derivados descritos aqui) da presente invenção têm numerosas utilidades terapêuticas envolvendo o tratamento de distúrbios envolvendo células expressando CLD18. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados às células em cultura, por exemplo, in vítro ou ex vivo ou a seres humanos, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios, tais como aqueles descritos aqui. Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" se destina a incluir seres humanos e animais não-humanos os quais respondem aos anticorpos contra CLD18. Indivíduos preferidos incluem pacientes humanos tendo distúrbios que podem ser corrigidos ou aliviados através da morte de células doentes, em particular células caracterizadas por um padrão de expressão alterado de CLD18 comparado com células normais.
Um efeito terapêutico nos tratamentos discutidos aqui é, de preferência, obtido através das propriedades funcionais dos anticorpos da invenção para mediar a morte de células, por exemplo, através de indução de lise mediada por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), Iise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), apoptose, adesão homotipica e/ou fagocitose, de preferência através de indução de Iise mediada por CDC e/ou lise mediada por ADCC.
Por exemplo, em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorígenas expressando CLD18 incluindo, por exemplo, câncer gástrico. Exemplos de doenças tumorigênicas as quais podem ser tratadas e/ou prevenidas abrangem todos os cânceres e entidades tumorígenas expressando CLD18, incluindo câncer de estômago, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de mama, câncer cólon- retal, câncer hepático, câncer da vesícula bilíar e câncer de cabeça-pescoço. Esses cânceres podem estar em estágios precoce, intermediário ou avançado, por exemplo, metástase.
As composições farmacêuticas e métodos de tratamento descritos de acordo com a invenção também podem ser usados para imunização ou vacinação para prevenir uma doença descrita aqui.
Em outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar níveis de CLD18 ou formas particulares de CLD18 ou níveis de células as quais contêm CLD18 sobre sua superfície na membrana, níveis os' quais podem, então, ser ligados a determinadas doenças ou sintomas de doença, tal como descrito acima.
Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para eliminar ou interagir com a função de células expressando CLD18, desse modo, implicando essas células como mediadores importantes da doença. Isso pode ser obtido através de contato de uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-CLDl8 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CLD18. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CLD18 são detectados e comparados na amostra e uma amostra de controle, isto é, uma amostra de referência.
Os anticorpos da invenção podem ser inicialmente testados com relação à sua atividade de ligação associada a usos terapêuticos ou diagnósticos in vitro. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados usando ensaios citométricos de fluxo conforme descrito aqui.
Além disso, a atividade dos anticorpos ao disparar pelo menos uma atividade celular efetora mediada por efetor, incluindo inibição do crescimento de e/ou morte de células expressando CLD18, pode ser testada. Por exemplo, a capacidade dos anticorpos de disparar a CDC e/ou apoptose pode ser testada. Protocolos para ensaiar a CDC, adesão homotípica, agrupamento molecular ou apoptose são descritos aqui.
Os anticorpos da invenção podem ser usados para estimular, in vitro ou in vivo, uma ou mais das seguintes atividades biologias: inibir o crescimento de e/ou diferenciação de uma célula expressando CLDl8; matar uma célula expressando CLD18; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula expressando CLD18 na presença de células efetoras; mediar a CDC de uma célula expressando CLD18 na presença de complemento; mediar a apoptose de uma célula expressando CLD18; induzir à adesão homotípica; e/ou induzir à translocação em "rafts" lipidicos quando ligados à CLD18.
Em uma modalidade em particular, os anticorpos são usados in vitro ou in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas à CLD18. Exemplos de doenças relacionadas à CLD18 incluem, dentre outras, cânceres, tais como câncer gástrico, câncer pancreático, câncer esofageal, câncer de pulmão e cânceres conforme aqueles listados acima.
CLD18A2 é também expressa em células de estômago normais diferenciadas. Possíveis efeitos colaterais clínicos induzidos por anticorpo, através de morte dessas células, podem ser reduzidos ou evitados através de administração paralela de fármacos protetores de estômago, tais como antiácidos ou inibidores da bomba de prótons gástrica, tal como omeprazol ou fármacos relacionados.
Vias adequadas de administração das composições de anticorpo da invenção in vítro e in vivo são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas por aqueles habilitados na técnica.
Conforme descrito acima, anticorpos anti-CLD18 da invenção podem ser co-administrados com um ou mais de outros agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico, agente anti-angiogênico e/ou agente imunossupressor para reduzir a indução de respostas imunes contra os anticorpos da invenção. O anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. No último caso (administração distinta), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou concorrentemente com o agente, ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anti-câncer, por exemplo, radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, dentre outros, agentes anti-neoplásicos, conforme listado acima. A co- administração dos anticorpos anti-CLD18 da presente invenção com agentes quimioterapêuticos proporciona dois agentes anti-câncer os quais operam via diferentes mecanismos, proporcionando um efeito citotóxico às células tumorigenas. Tal co-administração pode resolver problemas em virtude de desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma alteração na antigenicidade das células tumorigenas, o que poderia tornar as mesmas não reativas com o anticorpo.
Em outra modalidade particular da invenção, o indivíduo ao qual está sendo administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um agente anti-agiônico, incluindo anticorpos que objetivam o VEGF ou VEGFR e um ou mais compostos químicos que inibem a angiogênese. O pré- tratamento com ou aplicação paralela desses fármacos pode melhorar a penetração de anticorpos em tumores densos.
Em outra modalidade particular da invenção, o indivíduo ao qual está sendo administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um composto que inibe a sinalização ao receptor de fator de crescimento, incluindo anticorpos monoclonais que se ligam ao receptor de EGFR, bem como compostos químicos que inibem a sinalização iniciada pelo receptor de EGFR, Herl e/ou Her2/neu.
Células efetoras específicas a um alvo, por exemplo, células efetoras ligadas à composições (por exemplo, anticorpos, moléculas bi-específicas e multi-específicas) da invenção também podem ser usadas como agentes terapêuticos. Células efetoras para objetivação podem ser leucócitos humanos, tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células trazendo receptor de IgG ou IgA. Se desejado, células efetoras podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode ser da ordem de IO8 a IO9, mas variará dependendo da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter localização na célula alvo, por exemplo, uma célula tumorigena expressando CLD18 e obter morte de célula através, por exemplo, de fagocitose. Vias de administração também podem variar.
Terapia com células efetoras especificas a um alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção das células objetivadas. Por exemplo, terapia anti- tumor usando as composições da invenção e/ou células efetoras armadas com essas composições pode ser usada em conjunto com quimioterapia. Adicionalmente, imunoterapia combinada pode também ser usada para direcionar duas populações efetoras citotóxicas distintas em direção à rejeição de células tumorigenas. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 ligados a anti-Fc-RI ou anti-CD3 podem ser usados em conjunto com agentes de ligação específicos ao receptor de IgG ou IgA.
Moléculas bi-específicas e multi-especificas da invenção podem também ser usadas para modular os níveis de Fc-gamaR ou Fc-alfaR sobre células efetoras, tal como através do revestimento e eliminação de receptores sobre a superfície celular. Misturas de anti-receptores Fc também podem ser usadas para essa finalidade.
As composições (por exemplo, anticorpos, moléculas bi- específicas e multi-específicas e imunoconjugados) da invenção os quais têm sítios de ligação de complemento, tais como porções de IgGl, -2 ou -3 ou IgM, as quais se ligam ao complemento, também podem ser usadas na presença de complemento. Em uma modalidade, tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um agente de ligação da invenção e células efetoras apropriadas pode ser suplementado através da adição de complemento ou soro contendo complemento. Fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação da invenção pode ser melhorada através de ligação de proteínas de complemento. Em outra modalidade, células alvo revestidas com as composições da invenção também podem ser submetidas à Iise pelo complemento. Em ainda outra modalidade, as composições da invenção não ativam o complemento. As composições da invenção também podem ser administradas junto com o complemento. Conseqüentemente, dentro do escopo da invenção estão composições compreendendo anticorpos, moléculas bi-especificas ou multi-específicas e soro ou complemento. Essas composições são vantajosas pelo fato de que o complemento está localizado em proximidade intimas aos anticorpos, moléculas bi-especificas ou multi-específicas.
Alternativamente, os anticorpos, moléculas bi- específicas ou multi-específicas da invenção e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente. Ligação das composições da presente invenção às células alvo causa translocação do complexo antígeno CLD18- anticorpo em "rafts" lipídicos da membrana celular. Tal translocação cria uma alta densidade de complexos de antígeno-anticorpo os quais podem ativar e/ou intensificar eficientemente a CDC. Também dentro do escopo da presente invenção estão kits compreendendo as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpos e imunoconjugados) e instruções para uso. O kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tal como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo uma atividade complementar).
Conseqüentemente, aos pacientes tratados com composições de anticorpo da invenção pode ser adicionalmente administrado (antes de, simultaneamente com, ou após administração de um anticorpo da invenção) outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, o qual intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos da invenção.
Em outras modalidades, o indivíduo pode ser adicionalmente tratado com um agente que modula, por exemplo, intensifica ou inibe a expressão ou atividade de receptores de Fc-gama ou Fc-alfa, por exemplo, através de tratamento do indivíduo com uma citocina. Citocinas preferidas incluem fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) , fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) , interferon-γ (INF-γ) e fator de necrose tumoral (TNF). Outros agentes importantes para aumento da eficácia terapêutica dos anticorpos e composições farmacêuticas descritas aqui são β-glicanas as quais são homopolissacarídeos de resíduos de glicose ramificados e são produzidas por uma variedade de plantas e microorganismos, por exemplo, bactérias, algas, fungos, leveduras e grãos. Fragmentos de β-glicanas produzidos por organismos também podem ser usados. De preferência, a β- glicana é um polímero de β (1,3) glicose, em que pelo menos algumas das unidades de glicose na parte principal, por exemplo, 3-6% das unidades de glicose na parte principal, possuem ramificações tais como ramificações β(1,6).
Em uma modalidade particular, a invenção proporciona métodos para detecção da presença de antígeno CLD18 em uma amostra ou medição da quantidade de antígeno CLD18, compreendendo contato da amostra e uma amostra de controle, com um anticorpo o qual se liga especificamente à CLD18, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e uma porção do mesmo e a CLD18. A formação de um complexo é, então, detectada, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra, comparado com a amostra de controle, é indicativa da presença de antígeno CLD18 na amostra.
Em ainda outra modalidade, a invenção proporciona um método para detecção da presença ou quantificação da quantidade de células expressando CLD18 in vivo ou in vitro.
O método compreende (i) administração, a um indivíduo, de uma composição da invenção conjugada a um marcador detectável; (ii) exposição do indivíduo a um meio para detecção do referido marcador detectável para identificar áreas contendo células expressando CLD18.
Os métodos conforme descritos acima são úteis, em particular, para diagnóstico de doenças relacionadas à CLD18 e/ou para a localização de doenças relacionadas à CLD18, tais como doenças cancerígenas. De preferência, uma quantidade de CLD18, de preferência CLD18A2, em uma amostra a qual é maior do que a quantidade de CLD18, de preferência CLD18A2, em uma amostra de controle é indicativa da presença de uma doença relacionada à CLD18 em um indivíduo, em particular um ser humano, do qual a amostra é derivada.
Em ainda outra modalidade, imunoconjugados da invenção podem ser usados para objetivar compostos (por exemplo, agentes terapêuticos, marcações, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) às células as quais têm CLD18 expressa sobre sua superfície através de ligação de tais compostos ao anticorpo. Assim, a invenção também proporciona métodos para localização, ex vivo ou in vitro, de células expressando CLD18, tais como células tumorígenas em circulação.
A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como limitantes ao escopo da invenção. EXEMPLOS 1. Geração de anticorpos de murino contra CLD18
a. Imunizações:
Camundongos Balb/c ou camundongos C57/BL6 foram imunizados com vetores de expressão eucariotas, que codificam fragmentos de CLD18 humana (SEQ ID NO: 15, 16; 17, 18). 50 yg ou 25 ug de DNA de plasmideo foram injetados no quadriceps (intramuscular, i.m.) nos dias 1 e 10 para geração de anticorpos monoclonais do Conjunto 1 ou, alternativamente, nos dias 1 e 9, 1 e 11 ou 1, 16 e 36 para geração de anticorpos monoclonais do Conjunto 2 na presença de adjuvantes, por exemplo, CpG (para detalhes veja Tabela lb). CpG, bem como células, foram transfectados com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) apenas ou co-transfectados adicionalmente com RNA que codifica CD40L solúvel de murino foi injetado intramuscularmente, PEI-Man foi injetado intramuscular ou intraperitonealmente. A presença de anticorpos dirigidos contra CLD18 humana no soro dos camundongos foi monitorada através de microscopia por imunofluorescência entre os dias 16 e 43, dependendo do protocolo de imunização especifico usado. A imuno fluorescência foi determinada usando células HEK293 transitoriamente transfectadas com um ácido nucléico que codifica uma estrutura de fusão compreendendo CLD18A2 humana (SEQ ID NOs: 1, 2) e uma proteína repórter fluorescente. A camundongos com respostas imunes detectáveis (Figura 1) foi fornecido um reforço três dias antes de esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais do Conjunto 1 ou o reforço foi fornecido aos camundongos três dias, três e dois dias ou o reforço foi fornecido aos camundongos quatro, três e dois dias antes de esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais do Conjunto 2 através de injeção intraperitoneal de 5 χ IO7 ou, alternativamente, 1 χ IO8 células HEK293 transitoriamente transfectadas com um ácido nucléico que codifica CLD18A2 humana (SEQ ID NOs: 1, 2) (para detalhes veja Tabela lb). Na Tabela la, os protocolos de imunização são dedicados aos respectivos anticorpos monoclonais.
Tabela Ia: Protocolos de imunização usados para geração de anticorpos monoclonais
<table>table see original document page 170</column></row><table> <table>table see original document page 171</column></row><table>
*Para protocolos de imunização específicos, veja Tabela lb. Tabela 1a
<table>table see original document page 172</column></row><table> <table>table see original document page 173</column></row><table> <table>table see original document page 174</column></row><table> b. Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos à CLD18:
Esplenócitos de camundongo foram isolados e fundidos com PEG a uma linhagem de células de mieloma de camundongo baseado em protocolos padrões. Os hibridomas resultantes foram, então, selecionados para a produção de imunoglobulinas com especificidade pela CLD18 usando células HEK293 transfectadas com um ácido nucléico que codifica CLD18 humana através de análise por FACS.
Suspensões de uma única célula de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados foram fundidas com células de mieloma de camundongo não secretórias P3X63Ag8ü.l (ATCC, CRL 1597) em uma proporção de 2:1 usando PEG a 50% (Roche Diagnostics, CRL 738641). As células foram colocadas em placas, a aproximadamente 3 χ loVpoço em placas de microtitulação com fundo plano, seguido por uma incubação de cerca de duas semanas em meio seletivo contendo 10% de soro bovino fetal, 2% de fusão de hibridoma e suplemento de clonagem (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1 363 735) mais HEPES a 10 mM, 2-mercaptoetanol a 0, 055 mM, 50 ug/ml de gentamicina e Ix HAT (Sigma, CRL H0262) . Após 10 a 14 dias, poços individuais foram selecionados através de citometria de fluxo com relação a anticorpos monoclonais anti-CLD18. Os hibridomas que secretam anticorpo foram colocados novamente em placas e, se ainda positivos para anticorpos monoclonais anti-CLD18, foram subclonados através de diluição limitativa. Os subclones estáveis foram, então, cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura tecidual para caracterização. Pelo menos um clone de cada hibridoma, o qual reteve a reatividade das células precursoras (através de FACS), foi escolhido. 9 bancos de células em frasco foram gerados para cada clone e armazenados em nitrogênio liquido.
c. Seleção de anticorpos monoclonais que se ligam à CLD18:
Para determinar o isotipo dos anticorpos, um teste ELISA de isotipo foi realizado. 0 kit Mouse MonoAB ID (Zymed, CRL 90-6550) ou, alternativamente, o kit IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping (Roche, Cat. No. 1493027) foi usado para determinar as subclasses de Ig dos anticorpos monoclonais reativos à CLD18 identificados. Definidas como Conjunto 1, dezenove linhagens de células de hibridoma foram geradas, seis de uma fusão de células de um camundongo C57/BL6 imunizado com CLD18A2-LoopD3 (SEQ ID NOs: 17, 18), treze de uma fusão de células de camundongos Balb/c imunizados com CLD18A2-Loopl (SEQ ID NOs: 15, 16), expressando os seguintes anticorpos:
24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42Ε12, 43Α11, 44e10,47d12,75b8,85a3, 9Ε8, 19Β9
24Η5: IgG2b monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D758-034
26Β5: IgG2a monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D758-035, DSM ACC2745 2
6D12: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182- D758-036, DSM ACC2746
28D10: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D758-040, DSM ACC2747
37G11: IgG2a monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-055, DSM ACC2737
37H8: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182- D1106-056, DSM ACC2738
38G5: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-
D1106-057, DSM ACC2739 camundongo, anticorpo κ, 182-
38H3: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, D1106-058, DSM ACC2740
39F11: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 20 182-D1106-059, DSM ACC2741
41C6: IgG2a monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-060
42E12: IgG2a monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-061, DSM ACC2748 43Α11: IgG2a monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-062, DSM ACC2742
44E10: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-063
47D12: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-064
61C2: IgG2b monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-067, DSM ACC2743
75B8: IgM monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182- D756-001
85A3: IgM monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182- D756-002
9E8: IgM monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182- D758-011
19B9: IgM monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182- D758-024
Definido como Conjunto 2, cinco linhagens de células de hibridoma foram gerados, um de uma fusão de células de camundongos Balb/c imunizados com CLD18A2-LoopD3 (SEQ ID NOs: 17, 18) e CLD18A2-LoopDl (SEQ ID NOs: 15, 16), quatro de uma fusão de células de um camundongo Balb/c imunizados com CLDl 8 A2-LoopDl (SEQ ID NOs: 15, 16), expressando os seguintes anticorpos:
45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10 45C1: IgG2a monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D758-187
125E1: IgG2a monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-279, DSM ACC2808
163E12: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-294, DSM ACC2809
166E2: IgG3 monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-308
175D10: IgGl monoclonal de camundongo, anticorpo κ, 182-D1106-362, DSM ACC2810
2. Produção de anticorpos monoclonais
Produção e purificação de anticorpos monoclonais reativos à CLD18:
Para produzir quantidades em mg de anticorpo por caracterização funcional, células de hibridoma foram cultivadas em bio-reatores baseados em diálise (CELLine CL1000, Integra, Chur, CH) a 2 χ 10^6 células/ml. O sobrenadante contendo anticorpo foi coletado uma vez por semana. Anticorpo monoclonal de camundongo foi purificado usando Melon Gel (Pierce, Rockford, EUA) e concentrado através de precipitação com sulfato de amônio ou, alternativamente, purificado através de Proteína A usando FPLC. A concentração de anticorpo e a pureza foram determinadas através de BCA-Assay e a pureza verificada através de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e coloração com coomassie.
3. Características de ligação de anticorpos monoclonais a. Controle de qualidade de transfectantes em WB, IF:
Para gerar células expressando CLD18A2, células HEK293 ou CHO foram transfectadas com ácidos nucléicos que codificam CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2) ou CLD18A2-myc (SEQ ID NOs: 3, 4).
Células HEK293 foram transfectadas com CLDN18A2-myc (SEQ ID NOs: 3, 4) ou deixadas não transfectadas. 24 horas pós-transfecção, as células foram coletadas, submetidas à Iise e submetidas à eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio. 0 gel foi inoculado e corado com um anticorpo anti-myc de camundongo. Após incubação com um anticorpo anti-camundongo marcado com peroxidase, a inoculação foi revelada com reagente ECL e visualizada usando um aparelho de formação de imagem LAS-3000 (Fuji). Apenas nas células transfectadas, mas não no controle negativo, uma banda com o peso molecular esperado de CLD18-myc foi observada (Figura 2).
Células CHO foram transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2) e crescidas sobre laminulas com câmara durante 24 h. As células foram fixadas com metanol e coradas com um anticorpo' policlonal de coelho contra CLD18 a 1 μg/ml durante 60 min. a 25°C. Após lavagem, as células foram coradas com IgG anti-coelho de cabra marcado com Alexa4 8 8 (Molecular Probes) e avaliado através de microscopia por fluorescência. A Figura 3 mostra células CHO transfectadas, expressando CLD18 sobre a membrana celular, bem como células não transfectadas.
Essas células expressando heterologamente CLD18 foram usadas para os ensaios a seguir para testar a especificidade de ligação do anticorpo.
b. Seleção de ligação de anticorpos monoclonais à CLDl8/triagens primárias através de citometria de fluxo:
Células HEK293 foram co-transfectadas com vetores de expressão que codificam CLD18A2 humana (SEQ ID NOs: 1, 2) e uma proteína repórter de fluorescência 40 h antes do ensaio ou, alternativamente, células HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) foram usadas e contra-coradas com iodeto de propídio (PI). Após o desprendimento das células usando EDTA/PBS a 2 mM, as células foram lavadas com meio de crescimento completo e colocadas em placas a aproximadamente 1-5 χ 10^5 células/poço em placas de microtitulação com fundo em U. As células foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadante de hibridoma, seguido por duas etapas de lavagem com FBS inativado pelo calor/PBS a 1% e, finalmente, incubação com APC ou anticorpo secundário especifico de IgG anti-camundongo conjugado com Alexa647. Após duas etapas de lavagem, as células co-transfectadas foram fixadas com CellFIX (BD Biosciences). A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo usando um BD FACSArray. Expressão do marcador de fluorescência é plotada sobre o eixo horizontal contra a ligação de anticorpo sobre o eixo vertical. Todos os anticorpos de camundongo 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 foram detectados como se ligando especificamente à superfície de células expressando o marcador de fluorescência (Figura 4, células em Q2), conforme exemplificado para sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais 24H5 (Figura 4A, células em Q2), 85A3 (Figura 4B) , 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 e 45C1 (Figura 4C, células em Ql) .
c. Comparação de ligação de anticorpo à CLDl 8A2 com etiqueta Myc ou HA:
As características de ligação dos anticorpos monoclonais CLD18-específicos identificados foram ainda especificadas. Portanto, a ligação de anticorpo monoclonal foi analisada para mutantes de CLD18A2, criados através de inserção de etiquetas de epítopo. CLD18A2- HA (SEQ ID NO: 6) contém uma etiqueta de epítopo-HA em CLD18A2-loopl, enquanto que CLD18A2-Myc (SEQ ID NO: 4) contém uma etiqueta de epítopo-Myc inserida no CLD18A2-loop2. Uma vez que a inserção dessas etiquetas causa a destruição de epítopos, os anticorpos monoclonais identificados, podem ser agrupados de acordo com a perda de ligação a qualquer um dos mutantes. Células HEK293 transitoriamente co- transfectadas com um marcador de fluorescência e CLD18A2 humana ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-HA ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-Myc foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais CLDl8-especificos durante 30 min. a 4°C, seguido por incubação com anticorpo secundário de Igg anti-camundongo conjugado com Alexa647. Antes de análise sobre um BD FACSArray, células foram fixadas usando CellFIX. Conforme exemplificado para 24H5, 9E8, 26B5 e 19B9 na Figura 5, anticorpos monoclonais poderiam ser separados baseado nas suas características de ligação em quatro grupos diferentes: (i) anticorpos que se ligam a uma CLD18A2 não modificada, bem como à CLD18A2-HA e CLD18A2- Myc, por exemplo, 24H5, (Figura 5A) ou (ii) anticorpos que não se ligam à CLD18A2-HA, por exemplo, 9E8, (Figura 5B) ou (iii) anticorpos que não se ligam à CLD18A2-Myc, por exemplo, 26B5, (Figura 5C) ou (iv) anticorpos que não se ligam à CLD18A2-HA nem à CLDl8A2-Myc, por exemplo, 19B9, (Figura 5D).
d. Comparação de ligação de anticorpo a transfectantes de CLD18 Al versus CLDl8A2 humana através de citometria de fluxo:
Especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais identificados às isoformas de CLD18A2 foi analisada através de citometria de fluxo. Células HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 expressando estavelmente CLD18A1 humana (SEQ ID NOs: 7, 8) (HEK2 93-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4 0C com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais, seguido por incubação com anticorpo secundário de IgG anti-camundongo conjugado com Alexa647 e fixação de células ou, alternativamente, sem fixação, mas com contra- coloração com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo usando um BD FACSArray. A Figura 6 mostra exemplos para os dois grupos de anticorpos monoclonais que foram identificados no painel compreendido de 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) anticorpos monoclonais 43A11, 45C1 e 163E12 se ligam especificamente à CLD18A2 humana, mas não à CLD18A1 humana (Figuras βΑ,Β) e (ii) anticorpo monoclonal 37H8 se liga a ambas as isoformas humanas (Figura 6A).
e. Comparação de ligação de anticorpo a transfectantes de CLD18A1 versus CLD18A2 humana através de microscopia por imunofluorescência:
Células HEK293 foram transitoriamente transfectadas com um vetor de expressão que codifica uma proteína de fusão de CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) ou CLD18A2 (SEQ ID NO: 2) com um repórter de fluorescência e crescidas sobre laminulas com câmaras. As células foram coradas não fixadas ou após fixação com paraformaldeído com anticorpo monoclonal contendo sobrenadante de cultura durante 30 min. a 37°C. Após lavagem, as células foram coradas com um anticorpo de Ig anti-camundongo marcado com Alexa555 (Molecular Probes). Ligação de anticorpos foi avaliada através de microscopia por fluorescência. Conforme mostrado na Figura 7, o anticorpo 37G11 reagiu especificamente com CLD18A2 (Figura 7A) , mas não com CLD18A1 (Figura 7B) . Em contraste, o anticorpo 26B5 era reativo com CLD18A2 e CLD18A1 (Figura 8).
Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, foi observada uma diferença clara entre a coloração de células vivas e células fixadas com paraformaldeído. Os anticorpos formaram uma coloração uniforme na membrana quando as células foram fixadas (Figuras 7C, 8C, 8D) . Em contraste, incubação de células vivas com esses anticorpos leva à geração de agrupamentos de proteína, visíveis como um padrão de coloração semelhante a salpicados (Figuras 7A, 8A, 8B) . Isso mostra que todos os anticorpos se ligam a epítopos nativos, conforme encontrado sobre a superfície de células vivas.
f. Determinação de linhagens de células de expressão endógena:
Um par de primer específico a gene de CLD18A2 (SEQ ID NO: 11, 12) foi usado em análises por RT-PCR para selecionar linhagens de célula para expressão de CLD18A2.
Descobriu-se que linhagens de célula de carcinoma gástrico NCI-SNU-I6 (ATCC CRL-5974), NUGC-4 (JCRB0834) e KATO-III (ATCC HTB- 103) e a linhagem de células de adenocarcinoma de pâncreas humano DAN-G (DSMZ ACC249) mostram expressão endógena robusta de CLD18 (Figura 9). Expressão foi confirmada no nível de proteína através de coloração com um soro policlonal de coelho contra CLD18.
g. Coloração de linhagens de células de expressão endógena com anticorpos específicos a CLD18 e análise por imunofluorescência
Células DAN-G, SNU- 16, NUGC-4 e KATO-III foram crescidas sobre lamínulas com câmaras sob condições padrões. As células foram não fixadas ou, alternativamente, fixadas com metanol e coradas com os respectivos anticorpos. Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, foi observada a coloração da superfície celular, conforme exemplificado nas Figuras 10, 11 e 12A. Para os anticorpos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, foi testado o reconhecimento de epítopo nativo e foi observada a coloração da superfície celular sobre células não fixadas, conforme mostrado na Figura 12B. Subgrupos de anticorpos mostraram coloração homogênea da membrana celular, preponderantemente em interfaces célula-célula ou em partes livres da membrana não adjacentes às outras células. Outros anticorpos coraram em focos distintos e agregados sobre a membrana celular juntos, demonstrando que os respectivos anticorpos se ligam a diferentes epítopos, incluindo epítopos os quais são disfarçados por associação homotípica ou heterotípica de CLD18, bem como epítopos de CLD18 acessíveis em "tight junctions" pré-formadas.
h. Coloração de linhagens de células de expressão endógena através de citometria de fluxo
Expressão na superfície de CLD18A2 constitutivamente expressa sobre células KATO-III e NUGC-4 vivas foi analisada através de citometria de fluxo. Isso é exemplificado por células KATO-III e NUGC-4 coradas com anticorpo monoclonal 61C2 ou 163E12, seguido por incubação com anticorpo secundário de IgG anti-camundongo conjugado com Alexa647 e fixação de células ou, alternativamente, sem fixação. A ligação foi analisada através de citometria de fluxo usando um BD FACS Array. A Figura 13 mostra uma forte ligação de 61C2 a pelo menos 70,3% das células KATO-III e de 163E12 à CLD18A2 sobre células KATO-III e NUGC-4.
i. Alinhamento de seqüência de CLD18A1 e CLDl 8Ά2 humanas e de camundongo
CLD18A2 humana (NP_001002026) e CLD18A1 humana (NP_057453) em uma comparação de seqüência diferem quanto ao N-terminal e variantes de CLD18 de camundongo (NP_062789 e AAL15636) demonstram alta homologia e locais com variação de seqüência entre as moléculas (veja Figura 14).
j. Reatividade de anticorpos com CLDl8A1 de murino e CLDl8A2 de murino analisada através de citometria de fluxo
Ligação dos anticorpos monoclonais identificados à CLD18A2 e CLD18A1 de murino foi analisada através de citometria de fluxo. Células HEK293 transitoriamente co- transfectadas com um marcador de fluorescência e CLD18A2 de murino (SEQ ID NOs: 33, 35) ou com um marcador de fluorescência e CLD18A1 de murino (SEQ ID NOs: 36, 37) foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais CLD18-especificos humanos 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 e 163E12, respectivamente, durante 30 min. a 4°C, seguido por incubação com anticorpo secundário de IgG anti-camundongo conjugado com Alexa647 e fixação de células. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo usando um BD FACSArray. A Figura 15 mostra três perfis de ligação diferentes: 38G5 e 45C1 não se ligam a qualquer uma das isoformas de CLD18 de murino, 37G11 e 163E12 se ligam à CLD18A2 de murino, mas não à CLD18A1 de murino e 38H3 se liga à CLD18A1 e CLD18A2 de murino. Esses anticorpos são ferramentas valiosas para determinar a toxicidade potencial de anticorpos monoclonais à CLD18 em estudos pré-clinicos.
Embora esses dados mostrem que os anticorpos monoclonais da invenção 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 7 5B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 gerados contra CLD18 representem uma diversidade de características de ligação a diferentes epítopos e topologias de CLD18 humana, pode ser usada uma combinação de diferentes propriedades descritas nos exemplos 3b, c, d, e, g, h e j para classificar anticorpos monoclonais em tais classes diferentes.
4. Imunohistoquimica (IHC)
Um anticorpo especifico ao epitopo de CLD18A2 gerado através de imunização com o peptídeo de SEQ ID NO: 21 foi usado para caracterização imunohistoquímica de expressão de CLD18A2. Seções de tecido incrustadas em parafina derivadas de um painel compreensivo de tecidos normais e tumorígenos foram usadas para expressão de proteína e análises de localização. Nenhuma expressão significativa foi detectada em qualquer outro tecido de órgão normal, exceto estômago (veja Tabela 2, Figura 16A). Em contraste, expressão de CLD18A2 foi verificada através de imunohistoquímica em diferentes cânceres, incluindo câncer de estômago e câncer de pulmão (Figura 16B) .
De modo interessante, expressão de proteína CLD18A2 em mucosa gástrica estava restrita às células terminalmente diferenciadas do epitélio gástrico nas regiões de base e profunda. Em contraste, células na região inicial da mucosa gástrica, em particular células tronco gástricas na parte do istmo, as quais reabastecem a mucosa inteira, não expressam CLD18A2 (Figura 16C).
Tabela 2: Expressão de CLD18A2 em tecidos normais e tumorígenos conforme analisado através de IHC
Tipo de tecido Resultado Adrenal
Bexiga
Células sangüíneas
Medula óssea
Mama
Cólon
Endotélio
Esôfago
Tubos de Falópio Coração
Rim (glomérulo, túbulo)
Fígado
Pulmão
Nódulo linfático
Ovário
Pâncreas
Paratireóide
Pituitária
Placenta
Tipo de tecido
Próstata
Pele
Baço
Estômago
190
Resultado
+ Músculo estriado
Testículo
Timo
Tireóide
Ureter
Útero (cérvix, endométrio)
O anticorpo monoclonal 39F11 foi usado para estudos imunohistoquímicos específicos à CLD18A2. Conforme mostrado na Figura 17A, nenhuma reatividade significativa foi detectável sobre todos os tecidos normais testados, exceto o estômago (Figura 17A), enquanto que carcinomas de estômago e carcinomas de pulmão permaneceram fortemente positivos (Figura 17B).
Outro grupo de anticorpos da invenção mostrou um padrão de coloração específica a câncer com ligação ao câncer de estômago, mas nenhuma reatividade com tecido de estômago normal. Tal padrão de coloração é mostrado na Figura 18A com o anticorpo monoclonal 26B5. Imunohistoquímica foi usada para análise específica de 175D10 (Figura 18B), 43A11 (Figura 18C), 163E12 (Figura 18D) e 45C1 (Figura 18E) sobre seções derivadas de linhagens de células tumorígenas HEK293: linhagens de células tumorígenas HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) ou CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) ou sendo transfectadas com um plasmideo de controle de expressão contendo apenas o gene de resistência a antibiótico para seleção (HEK293-placebo) foram xenoenxertadas em camundongos para formar tumores sólidos.
Nenhuma expressão foi detectável em tumores de xenoenxerto HEK293 placebo-transfectados. Em contraste, coloração forte e homogênea da membrana foi observada em tumores de xenoenxerto HEK293-CLD18A2 e em espécimes de carcinoma de estômago.
5. Citotoxicidade dependente de complemento (CDC) a. CDC de anticorpos monoclonais do Conjunto 1, conforme medido através de citometria de fluxo
Plasma para Iise de complemento foi preparado através de coleta de sangue de voluntários saudáveis em tubos S- Monovette-EDTA Vacutainer (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemanha) os quais foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. 0 plasma foi coletado e armazenado a -20°C.
Em um primeiro conjunto de experimentos, os sobrenadantes de hibridomas foram analisados com relação à sua capacidade de induzir à citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2). As células foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais 85A3, 28D10, 24H5 ou 26D12, respectivamente, durante 20 min. em temperatura ambiente. Após centrifugação (5 min. a 450 g) , o sobrenadante foi removido e plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido para 37°C) foi adicionado às células e incubado durante mais 20 min. a 37°C. Após o que, a Iise de células foi determinada sobre um FACS usando o método de coloração com iodeto de propidio (PI). PI foi adicionado até uma concentração final de 2,5 pg/ml. Para citometria de fluxo, foi usado um citômetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Pelo menos 10000 eventos foram coletados para análise com resíduos de células excluídos através de ajuste do limiar de dispersão lateral dianteira (FCS). O percentual de células submetidas à Iise (células PI- positivas) é mostrado na Figura 19. Anticorpos monoclonais 85A3, 28D10 e 26D12 induziram à Iise de 33,5%, 38,2% e 39,2%, respectivamente, das células HEK293-CLD18A2, enquanto que CDC mediada por 24H5 foi de apenas 19,3%. b. CDC de anticorpos monoclonais do Conjunto 1
Em um segundo conjunto de experimentos, a especificidade de anticorpos monoclonais de induzir à CDC sobre células expressando CLD18A2 foi analisada. Portanto, um conjunto de anticorpos com ligação específica à CLD18A2 humana ou se ligando também à CLD18A1 humana foi testado com relação à indução de CDC contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana (CHO-CLD18A2) ou CLD18A1 humana (CH0-CLD18A1). Células CHO-CLD18A2 e CHO- CLD18A1 foram cultivadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3 χ 104/poço em placas de microtitulação de cultura tecidual com fundo plano. No dia seguinte, o meio de crescimento foi removido e as células foram incubadas em triplicatas com sobrenadantes de hibridoma ajustados para uma concentração de 10 yg/ml contendo anticorpos monoclonais 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 e 61C2, respectivamente. Células de controle foram incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contando saponina a 0,2% para a determinação da Iise de base e Iise máxima, respectivamente. Após incubação durante 20 min. em temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido para 37 °C) foi adicionado às células e incubado durante mais 20 min. a 37°C. Então, os sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 μg/ml de brometo de etídio e a emissão de fluorescência após excitação a 520 nm foi medida usando um Tecan Safire. A Iise percentual específica foi calculada como segue: Iise % específica = (fluorescência da amostra - fluorescência de base) / (fluorescência em Iise máxima - fluorescência de base) x 100. A Figura 20 mostra que os anticorpos monoclonais 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 e 39F11 mediam alta CDC, o anticorpo monoclonal 38G5 media média CDC, os anticorpos monoclonais 41C6 e 61C2 mediam baixa CDC e os anticorpos monoclonais 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 e 47D12 não mediam CDC contra células CHO-CLD18A2. Em contraste, nenhum dos anticorpos é capaz de induzir à CDC contra células CH0-CLDA1, embora 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 e 61C2 também se liguem à CLD18A1, conforme determinado através de citometria de fluxo e imunofluorescência.
c. Titulação de anticorpo monoclonal e CDC usando anticorpos monoclonais do Conjunto 1
Para medir a capacidade dos anticorpos anti-CLD18 de induzir à CDC em baixas concentrações, um experimento foi realizado, onde três anticorpos diferentes foram titulados. Células CHO-CLD18A2 que cresceram em placas de microtitulação foram incubadas com uma faixa de concentração de 75B8 (100, 30, 10, 3 e 1 pg/ml), 37H8 (10, 3,3 e 1 pg/ml) e 28D10 (10, 1 e 0,1 pg/ml), respectivamente, durante 20 min. em temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 370C) foi adicionado às células e incubados durante mais 20 min. a 37°C. Antes da análise usando um Tecan Safire, sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etidio. As Figuras 21 A-C mostram o percentual de Iise especifica como uma função da concentração de anticorpo. 0 anticorpo monoclonal 75B8 induz à Iise de 31,0% de células CHO-CLD18A2 a 10 pg/ml e cai para 6,2% a 1 ug/ml (Figura 21A) , enquanto que os anticorpos monoclonais 28D10 e 37H8 ainda induzem a uma lise especifica de 39% e 26,5% a 1 yg/ml (Figura 21B, C) , respectivamente.
d. CDC de anticorpos monoclonais do Conjunto 2, conforme medido através de citometria de fluxo
Soro para lise de complemento foi preparado através de coleta de sangue de voluntários saudáveis em tubos Serum- Monovette Vacutainer (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemanha) os quais foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. Soro foi coletado e armazenado a -20°C. Soro de controle foi inativado pelo calor a 56°C durante 30 min antes de armazenamento.
Sobrenadantes de hibridoma foram analisados com relação à sua capacidade de induzir à citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2 humana. As células foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma purificado contendo anticorpos monoclonais 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, respectivamente, durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubado durante mais 30 min. a 37°C. Após o que, a lise celular foi determinada sobre FACS usando o método de coloração com iodeto de propidio (PI). PI foi adicionado a uma concentração de 2,5 pg/ml. Para citometria de fluxo, um citômetro de fluxo BD FACS Array foi usado (BD Biosciences, Mountain View, CA). Pelo menos 10000 eventos foram coletados para análise com resíduos celulares excluídos através de ajuste do limiar de dispersão lateral dianteira (FSC/SSC). A Iise específica foi calculada através da seguinte fórmula: Iise específica = (% de células PI- positivas na amostra - % de células PI-positivas em amostra com soro inativado pelo calor). Lise mediada por CDC foi observada, em particular para 163E12.
6. Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)
Sobrenadantes de hibridoma foram analisados com relação à sua capacidade de induzir à citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) contra células HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293- CLD18A2) ou CLD18A1 humana (HEK293-CLD18A1).
a. Enriquecimento de células mononucleares de sangue periférico humano
Sangue humano de doadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão de fosfato (PBS) e as células sangüíneas foram colocadas em camadas sobre Ficoll (1077 g/ml de Lymphocyte Separation Médium, PAA Laboratories, cat. no. J15-004). Células mononucleares de sangue periférico (MNCs) foram coletadas da interfase, lavadas e resuspensas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro de bezerro fetal inativado pelo calor a 10%, L-glutamina a 2 mM. b. Ajuste de ADCC
Células alvo foram marcadas com um ligante de intensificação de fluorescência (BADTA, Perkin Elmer, kit de ensaio de citotoxicidade DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents7 cat. no. AD0116) durante 30 minutos. Após lavagem extensiva em RPMI-IO suplementado com probenecid a 10 mM (Sigma, cat. no. P8761) , HEPES a 10-20 mM e soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 10%, as células foram ajustadas para 1 χ IO5 células/ml. Células alvo marcadas, células efetoras (MNCs) e sobrenadantes contendo anticorpos monoclonais ajustados para uma concentração de 10 μg/ml foram adicionadas à placas de microtitulação com fundo redondo. Para células efetoras isoladas, uma proporção de efetor para alvo (E:T) de 100:1 (dados não mostrados para 50:1 e 25:1) foi usada. Após incubação (2 horas, 37°C), os ensaios foram cessados através de centrifugação e o ligante de fluorescência liberado de duplicatas foi medido em contagens de Európio em um fluorômetro tempo-sincronizado. O percentual de toxicidade celular foi calculado usando a seguinte fórmula: % de lise especifica = (contagens de liberação experimental - contagens de liberação espontânea) / (contagens de liberação máxima - contagens de liberação espontânea) x 100, com a liberação de ligante de fluorescência máxima determinada através da adição de Triton X-100(concentração final de 0,25%) às células alvo e a liberação espontânea medida na ausência de anticorpos e células efetoras. A Figura 22 mostra que os anticorpos monoclonais 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 e 61C2 mediam ADCC contra células HEK293-CLD18A2. Em contraste, esses anticorpos não induzem a um nivel significativo ou apenas um baixo nivel de citotoxicidade sobre alvos CLD18A1, demonstrando uma ADCC especifica à CLD18A2 (Figura 23) .
7 . Inibição de proliferação
Anticorpos monoclonais de murino purificados foram analisados com relação à sua capacidade de inibir o crescimento de células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2. 1x104 células-alvo expressando endogenamente CLD18A2 (KATO-III) foram cultivadas na presença de aproximadamente 10 μg de anticorpos monoclonais.
0 kit DELFIA Cell Proliferation (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200) é um imunoensaio não isotópico baseado na medição de incorporação de 5-bromo-2'-deóxiuridina (BrdU) durante síntese de DNA de células em proliferação em microplacas. BrdU incorporado é detectado usando anticorpo monoclonal marcado com Európio. Para permitir detecção de anticorpos, as células são fixadas e DNA desnaturado usando solução Fix. Anticorpo não ligado foi lavado e o indutor DELFIA é adicionado para dissociar íons de Európio do anticorpo marcado em solução, onde eles formam quelatos altamente fluorescentes com componentes do Indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando fluorometria tempo- sincronizada na detecção - é proporcional à síntese de DNA na célula de cada poço.
Forte inibição de proliferação foi observada com os anticorpos 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 e 166E2, respectivamente. Inibição moderada de proliferação foi observada com os anticorpos de murino 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 e 38H3, respectivamente.
8. Desempenho em modelos de xenoenxerto terapêutico de camundongo
O potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais identificados que se ligam especificamente à CLD18A2 foi estudado em modelos de xenoenxerto terapêutico, a. Tratamento precoce de tumor expressando altamente CLDl8A2 em camundongos
Camundongos SCID foram subcutaneamente inoculados com 1 χ IO7 células HEK293 expressando estavelmente altos níveis de CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2). Os níveis de expressão de CLD18A2 em células HEK293-CLD18A2 eram comparáveis com níveis de expressão em cânceres gástricos primários de pacientes. Cada grupo de tratamento experimental compreendia 10 camundongos (número de camundongo por grupo η = 10) . A terapia dos camundongos começou 3 dias após inoculação de tumor. 200 pg de sobrenadantes de hibridoma purificado representando os anticorpos monoclonais de murino 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3 ou 61C2 foram injetados uma vez por semana durante 4 semanas, intravenosamente. Alternativamente, 200 μg dos sobrenadantes de hibridoma purificado contendo os anticorpos monoclonais de murino 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 ou 17 5D10 foram administrados duas vezes por semana durante β semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. O crescimento de tumor dos camundongos tratados foi monitorado duas vezes por semana (Volume de Tumor = Comprimento χ Largura χ Largura dividido por 2 em mm3). Os camundongos foram mortos se o tumor atingia um volume de 500 mm ou no caso de morbidade grave. A Figura 24 exemplifica inibição robusta de crescimento de células tumorígenas HEK2 93-CLD18A2 pelos anticorpos da invenção. As Figuras 25A e 25B mostram prolongamento de sobrevivência através de tratamento com anticorpos da invenção em um modelo de xenoenxerto com tratamento precoce usando células HEK293-CLD18A2.
b. Tratamento com inicio tardio de tumores avançados expressando altamente CLDl8A2 em camundongos
O mesmo xenoenxerto de tumor baseado em células HEK293-CLD18A2 foi designada como um protocolo de terapia com inicio tardio em oposição ao tratamento precoce descrito acima. No dia 27 após inoculação de células tumorigenas, os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos de teste, cada um compreendendo 5-6 camundongos e a terapia foi iniciada com 200 μg de sobrenadantes de hibridoma purificado contendo anticorpos monoclonais de murino 43A11, 163E12 e 175D10, respectivamente. Os anticorpos foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. Também, nesse modelo, foi mostrado que os anticorpos da invenção inibem o crescimento de tumor. Para vários anticorpos, isso resultou em prolongamento da sobrevivência (Figura 26).
c. Tratamento precoce de tumores expressando baixos niveis de CLD18A2
Camundongos SCID foram subcutaneamente inoculados com 2 χ 10^5 células da linhagem de célula tumorígena DAN-G, uma linhagem de célula de adenocarcinoma pancreático humano infiltrado que expressa constitutivamente proteína CLD18A2 em baixo nível. Tratamento de camundongos (10 por grupo) foi iniciado 3 dias após enxertagem de tumor: 200 μm de sobrenadantes de hibridoma purificado contendo anticorpos monoclonais de murino 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 ou 175D10 foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. Levando em conta o crescimento agressivo e rápido de tumor da linhagem de célula tumorígena DAN-G pancreática in vivo, os camundongos desenvolveram caquexia de tumor e morreram dentro de uns poucos dias. Ainda, como uma conseqüência, a janela para medição dos efeitos terapêuticos era estreita, a inibição de crescimento de tumor e sobrevivência prolongada mediada por anticorpos da invenção também foi observada nesse modelo (Figuras 27A e 27B).
d. Anticorpos da invenção não estimulam efeitos colaterais em camundongos
Um par de primer específico à CLD18A2 de murino (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC) foi usado em análises por RT-PCR para amplificar DNAc derivado de um painel compreensivo de tecidos normais de camundongo (veja Figura 28). Expressão de CLD18A2 de murino não foi detectável em qualquer um dos tecidos normais testados, exceto estômago (veja Figura 28) . Além disso, um anticorpo especifico à CLD18A2, o qual reage cruzadamente com CLD18A2 humana e de camundongo, foi usado para análise imunohistoquimica de expressão de CLD18A2 em um grande painel de tecidos normais de camundongo (veja Tabela 3) . Exceto quanto ao tecido gástrico normal, todos os tecidos normais testados não mostram expressão de CLD18A2. Conforme nós observamos para a CLD18A2 humana, nós também descobrimos, para a contra- parte de camundongo, que embora células de epitélio superficial e de criptas mais profundas expressem CLD18A2 em sua superfície celular, a região central é CLD18A2- negativa (veja Figuras 29 A-C) . Em resumo, a distribuição tecidual de CLD18A2 parece ser idêntica em homens e camundongos.
Tabela 3: Expressão de CLD18 dentro de tecidos normais de murino, conforme analisado através de imunohistoquimica
Tecido Expressão de CLD18
Cerebelo - Cérebro - Cólon - Esôfago - Coração - Rim
Fígado
Pulmão
Nódulo linfático Ovário Pâncreas
Músculo esquelético Baço
Estômago +
Timo
Bexiga
Nós ainda investigamos os efeitos colaterais potenciais mediados pelos anticorpos 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 em camundongos. Foi anteriormente mostrado, através de análise por FACS, que todos esses anticorpos reagem com CLD18A2 de murino, bem como com a proteína humana.
Nenhum efeito colateral visível foi observado em camundongos durante e após tratamento com esses anticorpos, nem quaisquer correlações histomorfológicas de toxicidade observadas na mucosa gástrica de camundongos tratados com anticorpo comparado com camundongos não tratados (tratados com PBS) (veja Figura 30). 9. Quimerização de anticorpos
a. Geração de anticorpos monoclonais quixnéricos de camundongo / humano s
RNA total e subseqüente DNAc fita simples foram preparados a partir de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e de tecido de baço humano através de métodos padrões conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, usando o kit RNeasy Midi (Qiagen) e transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen).
A região constante da cadeia leve kappa humana foi amplificada a partir de DNAc de PBMC através de PCR. 0 oligômero senso (SEQ ID NO: 38) adicionou um sitio de restrição BamHI na extremidade 5' da região constante e alterou a seqüência de ácido nucléico original 5'-CGAACT-3' que codifica os primeiros dois aminoácidos (Arg-Thr) da região constante em 5'-CGTACG-31, gerando um sítio de restrição BsiWI sem alteração da seqüência de aminoácido. 0 oligômero anti-senso (SEQ ID NO: 39) incluía um códon terminal e adicionou um sítio de restrição NotI na extremidade 3' da região constante amplificada. 0 produto de PCR, bem como um vetor de expressão padrão (por exemplo, pcDNA3.1(+), Invitrogen) foram seqüencialmente incubados com as enzimas de restrição BamHI e NotI. 0 vetor foi adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de bezerro para prevenir recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vetor, de modo que qualquer fusão vindoura de uma região variável na frente da região constante fosse agora possível via um sítio de restrição HindIII (5'-AAGCTT-31 ) a partir do sítio de clonagem múltipla do vetor residual e via o sítio de restrição BsiWI (5' -CGTACG-31 ) gerado com o produto de PCR. A seqüência da região constante de cadeia leve kappa humana inserida no vetor é listada como SEQ ID NO: 40, a seqüência de aminoácido da região constante kappa humana é listada como SEQ ID NO: 41.
A região constante da cadeia pesada gama-1 humana foi amplificada a partir de DNAc de baço através de PCR. O oligômero senso 5' fosforilado (SEQ ID NO: 42) foi colocado sobre o sítio de restrição ApaI que ocorre naturalmente, localizado 11 nucleotídeos a jusante do início da região constante e adicionando um sítio de restrição HindIII na extremidade 5' da parte amplificada da região constante. O oligômero anti-senso 5' fosforilado (SEQ ID NO: 43) incluía um códon terminal e adicionou um sítio de restrição NotI na extremidade 3' da região constante assim amplificada. 0 produto de PCR assim gerado teve a extremidade cega e foi 5' fosforilado. A região constante gama amplificada foi verificada como sendo da subclasse IgGl através de PCR com um oligômero anti-senso discriminatório (SEQ ID NO: 44) e através de seqüenciamento. Um vetor de expressão padrão (por exemplo, pcDNA3.1(+)/Hygro, Invitrogen) com uma resistência a antibiótico diferente (por exemplo, higromicina) daquela que o vetor usou para expressão da cadeia leve (por exemplo, neomicina) foi incubado com a enzima de restrição PmeI para remover completamente o sitio de clonagem múltipla, deixando as extremidades cegas. O vetor foi adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de bezerro para prevenir recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vetor, de modo que qualquer fusão vindoura de uma região variável na frente da região constante fosse agora possível via o sítio de restrição HindIII (5'-AAGCTT-31) e via o sítio de restrição ApaI (5'-GGGCCC-S'), ambos gerados com o produto de PCR. A orientação correta da região constante no vetor, isto é, adequada para o promotor que precede o vetor, foi verificada através de seqüenciamento. Em virtude da posição do sítio de restrição ApaI, qualquer amplificação de uma região variável para essa finalidade tem de incluir os primeiros 11 nucleotídeos da seqüência da região constante gama-1 humana, além da seqüência do sítio ApaI. A seqüência da região constante de cadeia pesada gama-1 humana assim amplificada inserida no vetor é listada como SEQ ID NO: 45, a seqüência de aminoácido da região constante gama-1 humana assim expressa é listada como SEQ ID NO: 46. Tabela 4: Linhagens de células de hibridoma de camundongos usadas para clonagem de anticorpo
<table>table see original document page 210</column></row><table> <table>table see original document page 211</column></row><table> <table>table see original document page 212</column></row><table>
Correspondendo às suas contra-partes de murino, os anticorpos monoclonais quiméricos foram nomeados adicionando o prefixo "ch-", por exemplo, ch-43All, ch- 163E12, ch-125El, ch-166E2, ch-175D10, ch-45Cl.
Amplificação das regiões variáveis de cadeias leve e pesada de murino foi realizada de acordo com o método "step-out PCR" descrito em Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6). Para isso, RNA total foi RNA total foi preparado a partir de linhagens de células de hibridoma monoclonal (veja Tabela 4) através de métodos padrões conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, com o uso do kit RNeasy Mini (Qiagen). DNAc fita simples foi preparado de acordo com o método "template- switch" também descrito em Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6, 1558). Além de um oligômero (dT)30 (SEQ ID NO: 47), ele incluía um oligômero híbrido de DNA/RNA (SEQ ID NO: 48) que servia como um adaptador 5' para troca de template durante polimerização da fita de DNAc. Nesse oligômero adaptador, os três últimos nucleotídeos eram ribo- ao invés de deoxiribonucleotídeos. A subseqüente "step-out PCR" usou um oligômero anti-senso objetivado às subclasses 1, 2a ou 3 das cadeias gama (SEQ ID NO: 49 a 52, respectivamente) . A subclasse de IgG do anticorpo monoclonal de murino produzido pelas linhagens de células de hibridoma foi antes analisada com IsoStrip (veja Exemplo 1) e o oligômero anti-senso apropriado foi conseqüentemente escolhido (veja Tabela 4) . Uma mistura de primer serviu como um oligômero senso na "step-out PCR", compreendendo os dois oligômeros listados em SEQ ID NO: 53 e 54. Algumas linhagens de células de hibridoma expressavam mais de uma cadeia pesada ou leve (além das cadeias expressas pela linhagem de célula de mieloma usada para a geração de hibridomas) . A Tabela 4 resume as SEQ ID NOs das regiões variáveis clonadas e seqüenciadas das cadeias de anticorpo de murino (SEQ ID NO: 55 a 69 e SEQ ID NO: 132 a 146) e das cadeias de anticorpo quimérico de comprimento total clonadas e seqüenciadas (SEQ ID NO: 100 a 129).
As regiões variáveis de murino identificadas foram, então, amplificadas através de PCR omitindo a 5' UTR e a região constante de camundongo 3', adicionando sitios de restrição às extremidades, o que permitiu subclonagem nos vetores de expressão preparados trazendo as regiões constantes humanas. Além disso, os oligômeros senso proporcionaram uma seqüência de Kozak de consenso (5' GCCGCC ACC-3' ou 5'- AGCCACC-3') e os oligômeros anti-senso para regiões variáveis de cadeia pesada incluíam os 11 primeiros nucleotídeos da região constante gama-1 humana, além do sítio de restrição ApaI (veja Tabela 4, SEQ ID NO: 70 a 99) . Regiões variáveis de cadeia leve kappa foram clonadas usando as enzimas de restrição HindIII e BsiWI, as regiões variáveis de cadeia pesada gama demandaram as enzimas de restrição HindIII e ApaI. A região variáveis de cadeia pesada gama do anticorpo monoclonal 45C1 continha um sítio de restrição HindIII interno - aqui, a enzima BsaI compatível foi usada ao invés dessa (veja SEQ ID NO: 80) . SEQ ID NO: 100 a 114 mostram as seqüências de ácido nucléico dos anticorpos quimerizados resultantes (veja Tabela 4) . SEQ ID NO: 115 a 129 mostram as seqüências de aminoácido dos anticorpos quiméricos conseqüentemente expressos (veja Tabela 4) .
b. Geração e produção de anticorpos quiméricos contra CLD18 Linhagens de células de mamífero que produzem anticorpos quiméricos com especificidade pela CLD18 foram geradas. As linhagens de células derivavam de células HEK293T (ATCC CRL-11268). Um dia antes de transfecção, 2,5 x 10'7 células foram colocadas em um disco de cultura tecidual de 14,5 cm e cultivadas em 20 ml de meio completo ou, alternativamente, 1 x 10'7 células foram colocadas em um disco de cultura tecidual de 10 cm e cultivadas em 10 ml de meio completo ou, alternativamente, 0,6 x 10'6 células foram colocadas em um poço de uma placa para tecido com 12 poços e cultivadas em 2-3 ml de meio completo (Meio completo: DMEM:meio F12 suplementado com FBS a 10% sem antibióticos). A densidade celular recomendada no momento de transfecção deverá ser 90% de confluência. Imediatamente antes de transfecção, o meio foi substituído por meio fresco. Células HEK293T foram transfectadas com reagentes de transfecção, por exemplo, lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) ou, alternativamente, Polietilenimina (Sigma- Aldrich, 408727). Exemplificado para a transfecção de células HEK293T, uma quantidade total de DNA de 110 pg ou 296 pg foi usada para um disco para tecido de 14,5 cm e a proporção de agente de transfecção para DNA foi de 1:2,5 e 1:12 para Lipofectamine 2000 e PEI, respectivamente. 24 h após transfecção, o meio foi substituído por meio GMP adequado, por exemplo, X-Vivo 15 (Cambrex) ou um meio químico definido, tal como Pro293a (Cambrex) sem soro. Células HEK293T transfectadas que produziram anticorpos monoclonais quiméricos contra CLD18 foram cultivadas durante mais 96 h. Os sobrenadantes brutos foram coletados, filtrados estéreis e purificados através de proteína A- Sepharose. A concentração de anticorpo foi determinada através do BCA Assay e a pureza verificada através de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e coloração com coomassie.
c. Características de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos
A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos clonados e gerados à CLD18A2 foi analisada através de citometria de fluxo, conforme descrito no Exemplo 3. Células HEK293 vivas expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 expressando estavelmente CLD18A1 humana (SEQ ID NOs: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadantes de cultura de célula HEK293T purificado contendo anticorpos monoclonais quiméricos, seguido por incubação com anticorpo secundário de IgG anti-Fcy humano com fragmento F(ab')2 conjugado com APC e contra-coradas com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo usando um BD FACSArray.
Similarmente, linhagens de células tumorigenas humanas expressando endogenamente CLD18A2, por exemplo, células KATO- III e NUGC-4, foram analisadas através de citometria de fluxo.
As Figuras 31A e B mostram análises citométricas de fluxo dos anticorpos quiméricos ch-43All, ch-125El, ch- 163E12, ch-166E2 e ch-175D10. Todos eles mostram reconhecimento de epitopo nativo e exibem ligação especifica e forte à CLD18A2, mas não à CLD18A1. d. Citotoxicidade dependente de complemento (CDC)
Soro para Iise de complemento foi preparado através de coleta de sangue de voluntários saudáveis em tubos Serum- Monovette Vacutainer (Sarstedt, Niirmbrecht, Alemanha) os quais foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. Soro foi coletado e armazenado a -20°C. Soro de controle foi inativado pelo calor a 56°C durante 30 min antes de armazenamento.
Anticorpos quiméricos purificados em proteina A- Sepharose da presente invenção foram analisados com relação à sua capacidade de induzir à citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2 humana, bem como células CHO-CLD18A2 estavelmente transfectadas. As células foram incubadas com anticorpos monoclonais ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10, respectivamente, em uma concentração final de 2,5 ug/ml a 35 ug/ml durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubado durante mais 30 min. a 37°C. Após o que, células mortas e vivas foram discriminadas através de coloração com PI em uma concentração final de 2,5 pg/ml e o percentual de Iise celular mediada por anticorpo foi determinada através de citometria de fluxo. Para análise citométrica de fluxo, um citômetro de fluxo BD FACSArray foi usado (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Pelo menos 10000 eventos foram coletados para análise com resíduos celulares excluídos através de ajuste do limiar de dispersão lateral dianteira (FSC/SSC). A Iise específica foi calculada através da seguinte fórmula: Iise específica = (% de células PI- positivas na amostra - % de células PI-positivas em amostra com soro inativado pelo calor). Lise específica mediada pela CDC foi mostrada para vários anticorpos. Todos os três anticorpos mediaram CDC robusta sobre células CHO-CLD18A2 (Figura 32). Sobre células KATO-III, os anticorpos ch- 163E12 e ch-175D10 foram indutores de CDC robusta. e. Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)
Anticorpos quiméricos FPLC-purifiçados da invenção foram analisados com relação à sua capacidade de induzir à citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) contra células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2. Sangue humano de doadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão de fosfato (PBS) e células sangüíneas foram colocadas em camadas sobre Ficoll (1077 g/ml, Pharmacia) . Após centrifugação, células mononucleares de sangue periférico (PMBC) foram coletadas da interfase, lavadas e resuspensas em meio de cultura X-vivo-15 suplementado com 5% de soro humano inativado pelo calor.
15 h antes do ensaio, células KATO-III foram transfectadas com luciferase e colocadas em placas a 5 x 10^4 células/poço em uma microplaca branca.
Para o ensaio, células efetoras (PBMC, preparadas conforme descrito acima) em uma proporção de efetuador para alvo (E:T) de 20:1 e anticorpos quiméricos FPLC-purifiçados foram adicionados e incubados durante 2-3 h a 37°C, 5% de CO2. A concentração final do anticorpo no poço era de 50 μg/ml. Após 2-3 h de pré-incubação, amarelo lúcifer (BD Biosciences, San Jose EUA) foi adicionado a 1 mg/ml. A luminescência resultante da oxidação de amarelo lúcifer pela luciferase de células viáveis foi medida continuamente durante até 6 h usando um leitor para microplaca (Infinite200, Tecan, Suíça). O percentual de citotoxicidade celular foi calculado usando a seguinte fórmula: lise % específica = 100 - ( (contagens de luminescência da amostra - contagens de luminescência espontânea) / (contagens de luminescência máxima - contagens de luminescência espontânea) X 100), com a luminescência espontânea determinada através de adição de Triton X-100 (concentração final de 0,2%) e o sinal máximo medido na ausência de anticorpos. Usando esse ensaio, foi mostrado que anticorpos monoclonais ch-163E12 e ch-175D10 mediam forte ADCC sobre células KATO-III (Figura 33).
f. Inibição de proliferação
Anticorpos quiméricos FPLC-purifiçados da invenção foram analisados com relação à sua capacidade de inibir o crescimento de células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2. Células alvo (KATO-III) foram cultivadas na presença dos respectivos anticorpos quiméricos (veja inibição de proliferação de anticorpos de murino, Exemplo 7). Foi mostrado que anticorpos quiméricos purificados por FPLC, ch-163E12 e ch-166E2 inibem a proliferação celular.
10. Seleção de anticorpos como candidatos clínicos protótipos
Protótipos clínicos ideais podem abranger uma ampla variedade de aplicações terapêuticas e diagnosticas (veja também seção IV - Usos e Métodos da Invenção) . De acordo com a invenção, anticorpos dirigidos à CLD18A2 são proporcionados. É mostrado que os anticorpos proporcionados de acordo com a invenção oferecem um amplo espectro de propriedades com relação à especificidade, capacidade de induzir à CDC e ADCC e inibir a proliferação de células expressando CLD18, em particular células tumorigenas. Além disso, foi demonstrado que quimerização de anticorpos pode levar à aquisição de funções efetoras dependentes de Fc adicionais não presentes na molécula de murino precursora. Por exemplo, é mostrado aqui que o anticorpo 175D10 com IgGl de murino não induz à citotoxicidade dependente de complemento (veja Exemplo 5), enquanto que ch-175DlO com IgGl humana induz à Iise especifica de células tumorigenas expressando constitutivamente CLD18 (veja Tabela 5 e Tabela 6).
Os anticorpos proporcionados de acordo com a presente invenção podem ser classificados em classes distintas de acordo com suas propriedades de ligação e sua capacidade de mediar funções efetoras sobre células expressando CLD18. A partir dos anticorpos proporcionados de acordo com a presente invenção, candidatos clínicos protótipos podem ser selecionados baseado em suas características funcionais. Uma visão geral de propriedades para anticorpos selecionados de murino e quiméricos da invenção é fornecida na Tabela 5 e Tabela 6, respectivamente.
Candidatos clínicos protótipos da invenção podem ter uma ou mais das seguintes propriedades: a) Ligação à CLD18A2 humana, mas não à CLD18A1 (por exemplo, 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 e ch- 4 3A11, ch-45C1, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10). Para exemplos, veja Figuras 6A e 6B.
b) Ligação à CLD18A2 de camundongo, mas não à CLD18A1 de camundongo (por exemplo, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, veja Figuras 15A e 15B.
c) Ligação à CLD18 naturalmente expressa por células tumorigenas (por exemplo, 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 e ch-45Cl, ch-43All, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10). Para exemplos, veja Figura 13.
d) Ligação à CLD18 em zonas de contato intercelulares (por exemplo, 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, veja Figuras 12A e 12B.
e) Mediação de morte de células induzida por CDC, as quais expressam CLD18 (por exemplo, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 e ch-163E12 e ch-175D10). Para exemplos, veja Figura 32.
f) Mediação de morte induzida por ADCC de células expressando CLD18 (por exemplo, ch-163E12 e ch-175D10). Para exemplos veja Figura 33.
g) Inibição de proliferação de células expressando CLD18 (por exemplo, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 e ch-163E12 e ch-166E2). h) Inibição de crescimento de tumor em modelos de xenoenxerto com células expressando CLDl8 (por exemplo, - 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, veja Figura 24.
i) Prolongamento de sobrevivência em modelos de xenoenxerto com células expressando CLD18 (por exemplo, - 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, veja Figura 25B. Visao geral exemplificativa de propriedades para selecao de candidatos
Tabela 5: Anticorpos de murino
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Legenda: + excelente desempenho, (+) desempenho em diferentes ambientes. <table>table see original document page 225</column></row><table>

Claims (33)

1. Anticorpo caracterizado pelo fato de ter a capacidade de ligação à CLD18 e mediação de morte de células expressando CLDl8.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de se ligar à CLD18A1 e CLD18A2.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de se ligar à CLD18A2, mas não à CLD18A1.
4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que a referida morte de células é induzida através de ligação do referido anticorpo à CLD18 expressa pelas referidas células.
5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que a referida morte de células é induzida através de ligação do referido anticorpo à CLD18A2 expressa pelas referidas células.
6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que a morte de células não é induzida através de ligação do referido anticorpo à CLD18A1 expressa pelas referidas células.
7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que as referidas células expressando CLDl8 são células cancerígenas.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células cancerígenas são selecionadas do grupo consistindo de células tumorigênicas de câncer gástrico, esofageal, pancreático e pulmonar.
9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato mediar a referida morte de células através de indução de lise mediada por citotoxicidade complemento-dependente (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular anticorpo- dependente (ADCC), apoptose, adesão homotípica e/ou fagocitose.
10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato mediar a referida morte de células através de indução de Iise mediada por CDC e/ou Iise mediada por ADCC.
11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de não induzir à lise mediada por CDC das referidas células.
12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11, caracterizado pelo fato de que a referida Iise mediada por ADCC ocorre na presença de células efetoras selecionadas do grupo consistindo de monócitos, células mononucleares, células NK e PMNs.
13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-12, caracterizado pelo fato de que a referida fagocitose é através de macrófagos.
14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo.
15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo de um anticorpo de IgG1, um de IgG2, de preferência IgG2a e IgG2b, um de IgG3, um de IgG4, um de IgM, um de IgAl, um de IgA2, um de IgA secretória, um de IgD e um de IgE.
16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-15, caracterizado pelo fato de que CLD18A2 tem a seqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2.
17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-16, caracterizado pelo fato de que CLD18A1 tem a seqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 8.
18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado pelo fato de se ligar a epítopos nativos de CLDl8 presentes sobre a superfície de células vivas.
19. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de ser específico para células cancerígenas, de preferência células de câncer de estômago.
20. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizado pelo fato de que a referida CLD18 é expressa sobre a superfície das referidas células.
21. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizado pelo fato de ser obtenível através de um método compreendendo a etapa de imunização de um animal com uma proteína ou peptídeo tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31 ou um fragmento imunogênico do mesmo ou um ácido nucléico ou célula hospedeira expressando a referida proteína ou peptídeo ou um fragmento imunogênico do mesmo.
22. Anticorpo caracterizado pelo fato de ser produzido através de um clone depositado sob o no. de acesso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 OU DSM ACC2810.
23. Hibridoma caracterizado pelo fato de ser capaz de produção do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
24. Hibridoma caracterizado pelo fato de ser depositado sob o no. de acesso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC273 9, DSM ACC274 0, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ou DSM ACC2810.
25. Conjugado caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 acoplado a um agente terapêutico.
26. Conjugado, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
27. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e/ou um conjugado de acordo com a reivindicação 25 ou 26 e um veículo f armaceuticamente aceitável.
28. Método de inibição de crescimento e/ou morte de uma célula expressando CLD18 caracterizado pelo fato de compreender contato de célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 22 e/ou um conjugado de acordo com a reivindicação 25 ou 26 .
29. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células expressando CLDl 8 caracterizado pelo fato de compreender administração, a um indivíduo, de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, um conjugado de acordo com a reivindicação 25 ou 26 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 27.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença relacionada a tumor.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada a tumor, é selecionada do grupo consistindo de câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer pulmonar, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer da vesícula biliar.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-31, caracterizado pelo fato de que a referida CLDl8 é CLD18A2.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-32, caracterizado pelo fato de que a referida CLD18 é expressa sobre a superfície das referidas células..
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B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B25C Requirement related to requested transfer of rights

Owner name: GANYMED PHARMACEUTICALS AG (DE) ; JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAET MAINZ, VERTRETEN DURCH DEN PRAESIDENTEN (DE)

Free format text: A FIM DE ATENDER A ALTERACAO DE NOME E DE ENDERECO E AS DUAS TRANSFERENCIAS, REQUERIDAS ATRAVES DA PETICAO NO 870220039808 DE 09/05/2022, E NECESSARIO ESCLARECER A DIVERGENCIA ENTRE O NOME DA EMPRESA DEPOSITANTE ?JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAET MAINZ, VERTRETEN DURCH DEN PRAESIDENTEN? E O NOME DA EMPRESA CEDENTE ?JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAET MAINZ?. ALEM DISSO, E PRECISO APRESENTAR A GUIA DE CUMPRIMENTO DE EXIGENCIA.

B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAET MAINZ, VERTRETEN DURCH DEN PRAESIDENTEN (DE) ; GANYMED PHARMACEUTICALS GMBH (DE)

B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAET MAINZ, VERTRETEN DURCH DEN PRAESIDENTEN (DE) ; GANYMED PHARMACEUTICALS GMBH (DE)

B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/11/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.

B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAET MAINZ, VERTRETEN DURCH DEN PRAESIDENTEN (DE) ; ASTELLAS PHARMA INC. (JP)

B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: ASTELLAS PHARMA INC. (JP) ; TRON - TRANSLATIONALE ONKOLOGIE AN DER UNIVERSITAETSMEDIZIN DER JOHANNES GUTENBERG UNIVERSITAET MAINZ GEMEINNUETZIGE GMBH (DE)

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A RPI 2710 DE 13/12/2022, QUANTO AO ITEM (73) NOME DO TITULAR.