BRPI0619786A2 - proteìna de ligação especìfica, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, anticorpo monoclonal humano, método para determinar o nìvel de fator de crescimento tipo insulina-ii (igf-1i) e fator de crescimento tipo insulina i (igf-1) em uma amostra de paciente, uso da proteìna de ligação especìfica, e, conjugado - Google Patents

Abstract

PROTEìNA DE LIGAçãO ESPECìFICA, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO, MéTODO PARA DETERMINAR O NìVEL DE FATOR DE CRESCIMENTO TIPO INSULINA-lI (IGF-II) E FATOR DE CRESCIMENTO TIPO INSULINA I (IGF-1) EM UMA AMOSTRA DE PACIENTE, USO DA PROTEINA DE LIGAçãO ESPECìFICA, E, CONJUGADO. Proteínas de ligação, tal como anticorpos dirigidos a IGF-II com reatividade cruzada para IGF-1 e usos de tais anticorpos são descritos. Em particular, anticorpos monoclonais completamente humanos dirigidos a IGF-II com reatividade cruzada para IGF-1 são descritos. Também são discutidas sequências de nucleotídeos codificando, e sequências de aminoácidos compreendendo, moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente sequências correspondendo a sequências contíguas de cadeia pesada e leve abrangendo as regiões de arcabouço e/ou regiões determinantes de complementaridade (CDR<39>s), especificamente de FR1 até FR4 ou CDR1 até CDR3.

Description

"PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO, MÉTODO PARA DETERMINAR O NÍVEL DE FATOR DE CRESCIMENTO TIPO INSULINA-II (IGF-II) E FATOR DE CRESCIMENTO TIPO INSULINA I (IGF-1) EM UMA AMOSTRA DE PACIENTE, USO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, E, CONJUGADO"

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119 para Pedido Provisório de Patente Norte-Americana de No. de Série 60/750.085, depositado em 13 de Dezembro de 2005; Pedido Provisório de Patente Norte- Americana de No. de Série 60/750.772, depositado em 14 de Dezembro de 2005; Pedido Provisório de Patente Norte-Americana de No. de Série 60/774.747, depositado em 17 de Fevereiro de 2005; e Pedido Provisório de Patente Norte-Americana de No. de Série 60/808.183, depositado em 24 de Maio de 2006, cada um dos quais é incorporado neste lugar por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Campo da invenção

A invenção se refere a proteínas de ligação que se ligam a fator de crescimento tipo insulina-2 (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-1 (IGF-I) e usos de tais proteínas de ligação. Mais especificamente, a invenção se refere a anticorpos monoclonais dirigidos para IGF-II com reatividade cruzada para IGF-I e usos de estes anticorpos. Aspectos da invenção também se referem a hibridomas ou outras linhagens celulares expressando tais anticorpos. Descrição da técnica Relacionada

Fator de crescimento tipo insulina IGF-I e IGF-II são pequenos polipeptídeos envolvidos na regulação de proliferação, sobrevivência, diferenciação e transformação celular. IGFs exercem suas várias ações primariamente interagindo com um receptor específico de superfície celular, o receptor IGF-I (IGF-IR) e ativando várias cascatas de sinalização intracelular. IGFs circulam no soro principalmente ligados a proteínas de ligação de IGF (IGFBP-1 a 6). A interação de IGFs com o IGF- IR é regulada pelas IGFBPs, e IGFs apenas podem se ligar ao IGFIR uma vez liberados das IGFBPs (principalmente por proteólise das IGFBPs). IGF-I também pode se ligar a um receptor híbrido compreendido de IGF-IR e subunidades de receptor de insulina (IR). IGF-II mostrou se ligar a isoforma "A" do receptor de insulina.

Transformação maligna envolve o desequilíbrio de diversos processos tal como crescimento celular, diferenciação, apoptose, e transformação. IGF-I e IGF-II foram implicados na patofisiologia de uma ampla variedade de condições, e acredita-se que desempenhem um papel em tumorigênese devido às propriedades mitogênicas e antiapoptóticas mediadas pelo receptor IGF-1R-. LeRoith and Roberts, Câncer Lett. 195:127-137 (2003).

IGF-I foi descoberto como um fator de crescimento produzido pelo fígado sob o controle regulador de hormônio de crescimento pituitário e foi originalmente designado somatomedina-C. Salmon et al., J. Lab. Clin. Med. 49:825-826 (1957). Tanto IGF-I como IGF-II são expressos ubiquamente e atuam como fatores de crescimento endócrinos, parácrinos, e autócrinos, através de sua interação com o IGF-IR, uma tirosina quinase transmembrana que é estruturalmente e funcionalmente relacionada ao receptor de insulina (IR). IGF-I funciona primariamente ativando o IGF-IR, ao passo que IGF-II pode atuar ou através do IGF-IR ou através da isoforma IR-A. LeRoith and Roberts, Câncer Lett. 195:127-137 (2003). Adicionalmente, a interação tanto de IGF-I como IGF-1I com as proteínas de ligação de IGF podem afetar a meia-vida e biodisponibilidade dos IGFs, assim como sua interação direta com receptores em alguns casos. Rajaram et al., Endocr. Rev. 18:801-831 (1997).

IGF-1 tem um impacto de longo prazo em proliferação, diferenciação, e apoptose celular. Experimentos em células cultivadas de osteosarcoma e câncer de mama sugeriram que IGF-1 é um mitógeno potente e exerce sua ação mitogênica aumentando síntese de DNA e estimulando a expressão de ciclina Dl, o que acelera progressão do ciclo celular de G1 para fase S. Furlanetto et al., Mol. Endocrinol. 8:510-517 (1994); Dufourny et al., J. Biol. Chem. 272:311663-31171 (1997). Supressão de expressão de ciclina Dl em células de câncer pancreático anulou o efeito mitogênico de IGF-1. Kornniann el al., J. Clin. Invest. 101:344-352 (1998). Em adição a estimular progressão de ciclo celular, IGF-1 também inibe apoptose. IGF-1 mostrou estimular a expressão de proteínas Bel e suprimir expressão de Bax, o que resulta em um aumento na quantidade relativa do heterodímero Bcl/Bax, com isso bloqueando iniciação da via apoptótica. Minshall et al., J. Immunol. 159:1225-1232 (1997); Parrizas et al., Endocrinology 138:1355-1358 (1997); Wang et al., Endocrinology 139:1354-1360 (1998).

Como IGF-1, IGF-I1 também tem ações mitogênicas e antiapoptóticas e regula proliferação e diferenciação celular. Comparado com IGF-1, altas concentrações de IGF-1I circulam em soro. Altas concentrações de IGF-1I no soro foram encontradas em pacientes com câncer colorretal, com uma tendência para altas concentrações em doença avançada. Renehan et al., Br. J Câncer 83:1344-1350. Adicionalmente, a maioria de tumores primários e linhagens celulares transformadas superexpressam mRNA de IGF-1I e proteína. Werner and LeRoith Adv. Câncer Res. 68:183-223 (1996). Superexpressão de IGF-1I em câncer de colo é associada com um fenótipo agressivo, e a perda de estampagem (perda de expressão específica de alelo) do gene IOE-11 pode ser importante em carcinogênese colorretal. Michell et al., Br. J. Câncer 76:60-66 (1997); Takano et al., Oncology 59;210-216 (2000). Células cancerosas com uma forte tendência para formar metástases têm níveis de expressão de IGF-II quatro vezes maiores do que aquelas células com uma baixa capacidade de forma metástase. Guerra et al., Int. J. Câncer 65:812-820(1996).

Pesquisa e estudos clínicos destacaram o papel dos membros da família de IGF no desenvolvimento, manutenção e progressão de câncer. Muitas células cancerosas mostraram superexpressar o IGF-IR e/ou os ligantes de IGF. Por exemplo, IGF-I e IGF-II são fortes mitógenos para uma ampla variedade de linhagens de célula cancerosa, incluindo sarcoma, leucemia, e cânceres da próstata, mama, pulmão, colo, estômago, esôfago, fígado, pâncreas, rim, tireóide, cérebro, ovário, e útero. Macaulay et al., Br. J. Câncer 65:311-320 (1992); Oku et al., AnticancerRes. 11:1591-1595 (1991); LeRoith et al., Ann. Intern. Med. 122:54-59 (1995); Yaginuma et al_, Oncology 54:502-507 (1997); Singh et al., Endocrinology 137:1764-1774 (1996); Frostad et al., Eur. J. Haematol 62:191-198 (1999). Quando IGF-I foi administrado a células malignas de câncer de colo, ele se tornou resistente a apoptose induzida por citocina. Remade-Bonnet et al., Câncer Res. 60:2007- 2017(2000).

O papel de IGFs em câncer também é sustentado por estudos epidemiológicos, que mostraram que altos níveis de IGF-I circulante e baixos níveis de IGFBP-3 estão associados com um risco crescente de desenvolvimento de diversos cânceres comuns (próstata, mama, colorretal e pulmão). Mantzoros et al., Br. J. Câncer 76:1115-1118 (1997); Hankinson et al., Lancet 351:1393-1396 (1998); Ma et al., J. Natl. Câncer Inst. 91 :620- 625 (1999); Karasik et al., J. Clin. Endocrinol Metab. 78:271-276 (1994). Estes resultados sugerem que IGF-I e IOE-11 atuam como poderosos mitogênicos e sinais anti-apoptóticos, e que sua superexpressão se correlaciona com fraca prognose em pacientes com diversos tipos de câncer.

Usando modelos de camundongo knockout, diversos estudos estabeleceram adicionalmente o papel de IGFs em crescimento de tumor. Com o desenvolvimento da tecnologia para deleção gênica condicional específica de tecido, um modelo de camundongo de deficiência de IGF-I em fígado (LID) foi desenvolvido. Deleção específica em fígado do gene igfl anulou expressão de mRNA de IGF-I e causou uma dramática redução em IGF-I circulante Yakar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:7324-7329 (1999). 'Quando tumores mamários foram induzidos no camundongo LID, níveis reduzidos de IGF-1 circulante resultaram em reduções significantes em desenvolvimento, crescimento, e metástase de câncer, ao passo que níveis aumentados de IGF-I circulante foram associados com crescimento estimulado de tumor. Wu et al., Câncer Res. 63:4384-4388 (2003).

Diversos artigos relataram que inibição de expressão de IGF- IR e/ou sinalização leva à inibição de crescimento de tumor, tanto in vitro como in vivo. Inibição de sinalização de IGF também mostrou aumentar a susceptibilidade de células tumorosas a agentes quimioterápicos. Diversas estratégias (oligonucleotídeos antisentido, receptor solúvel, peptídeos inibidores, mutantes dominantes de receptor negativo, moléculas pequenas inibindo a atividade de quinase e anticorpos anti-hIGF-lR) foram desenvolvidas para inibir a via de sinalização de IGF-IR em células tumorosas. Uma abordagem foi direcionar a atividade de quinase de IGF-IR com inibidores de molécula pequena. Dois compostos foram recentemente identificados como inibidores de quinase de molécula pequena capazes de inibir seletivamente o IGF-IR. Garcia-Echeverria et al., Câncer Cell 5:231- 239 (2004); Mitsiades et al., Câncer Cell 5:221-230 (2004). Inibição de atividade de quinase de IGF-IR anulou sobrevivência mediada por IGF-I e formação de colônia em ágar macio de células MCF-7 humanas de câncer de mama. GarciaEcheverria et al., Câncer Cell 5:231-239 (2004). Quando um inibidor de quinase de IGF-IR foi administrado a camundongos carregando xenoenxertos de tumor, sinalização de IGF-IR em xenoenxertos de tumor foi inibida e o crescimento de fibrosarcomas dirigidos por 10E-IR foi significantemente reduzido. Garcia-Echeverria et al., Câncer Cell 5:231-239 (2004). Um efeito similar foi observado em malignidades hematológicas, especialmente mieloma múltiplo. Em células de mieloma múltiplo, um inibidor de quinase de IGF-IR de molécula pequena demonstrou uma potência >16 maior contra o IGF-IR, se comparado ao receptor de insulina, e foi similarmente eficaz em inibir crescimento e sobrevivência celular. Mitsiades et al., Câncer Cell 5:221-230 (2004). O mesmo composto foi injetado intraperitonealmente em camundongos e inibiu crescimento celular de mieloma múltiplo e estimulou sobrevivência dos camundongos. Mitsiades et al., Câncer Cell 5:221-230 (2004). Quando combinado com outros quimioterápicos em doses subterapêuticas, inibição de atividade de quinase de IGF-IR reduziu sinergisticamente carga de tumor. Mitsiades et al., Câncer Cell 5:221-230 (2004).

Outra abordagem para inibir sinalização de IGF foi o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes direcionados contra o receptor IGF-IR.. Vários grupos desenvolveram anticorpos para 10E-IR que inibem autofosforilação estimulada por receptor IGF-1, induzem internalização e degradação de receptor, e reduzem proliferação e sobrevivência de diversas linhagens humanas de célula cancerosa. Halley et al., Mol Câncer Ther. 1:1349-1353 (2002); Maloney et ad_, Câncer Res. 63:5073-5083 (2003); Benini et al., Clin. Câncer Res. 7:1790-1797 (2001); Burtrum et al., Câncer Res. 63:8912-8921 (2003). Adicionalmente, em modelos de tumor de xenoenxerto, bloqueio de IGF-4R resultou em significante inibição de crescimento em tumores de mama, renais e pancreáticos in vivo. Burtrum et al., Câncer Res. 63:89124921 (2003); Maloney et al., Câncer Res. 63:5073- 5083 (2003). Experimentos utilizando anticorpos IGF-IR humanizados quiméricos produziram resultados similares, inibindo crescimento de células de câncer de mama in vitro e em xenoenxertos de tumor. Sachdev et al., Câncer Res. 63:627-635 (2003). Outros anticorpos IGF-IR humanizados bloquearam fosforilação de tirosina induzida por IGF-I e inibição de crescimento em tumores de mama e de pulmão de célula não pequena, assim como in viva. Cohen et al., Clin. CancerRes. 11:2063-2073 (2005); Goetsch et al., Int. Câncer 113:316-328 (2005).

Níveis aumentados de IGF-I também foram associados com diversas condições patológicas não cancerosas, incluindo acromegalia e gigantismo (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), enquanto função anormal de receptor de IGF-I/IGF-II foi implicada em psoríase (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), técnicariosclerose e restenose de músculo liso de vasos sangüíneos seguindo angioplastia (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Níveis aumentados de EGF-I foram implicados em diabetes ou em complicações associadas com diabete, tal como proliferação microvascular (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390- 1395, 1999).

Anticorpos para IGF-I e IGF-II foram descritos na técnica. Veja, por exemplo, Goya et al., Câncer Res. 64:6252-6258 (2004); Miyamoto et al., Clin. Câncer Res. 11:3494-3502 (2005). Adicionalmente, veja Patente Internacional 05/18671, Patente Internacional 05/28515 e Patente Internacional 03/93317.

SUMÁRIO

Formas de realização da invenção se referem a proteínas de ligação que se ligam especificamente a fatores de crescimento tipo insulina e reduzem crescimento de tumor. Em uma forma de realização, as proteínas de ligação são anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fatores de ligação destes que se ligam especificamente a fatores de crescimento tipo insulina e reduzem crescimento de tumor. Mecanismos pelos quais isto pode ser atingido podem incluir e não são limitados a ou inibição de ligação de IGF-1/II a seu receptor IGF-IR, inibição de sinalização de IGF-IR induzida por IGF-1/II, ou depuração aumentada de IGF-1/II, nisto reduzindo a concentração eficaz de IGF-1/11.

Assim, algumas formas de realização fornecem uma proteína de ligação específica isolada completamente humana que se liga preferencialmente a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I) e neutraliza atividade de IGF-1 e IGF-1I. Em certos aspectos, a proteína de ligação se liga a IGF-1I com pelo menos 2,5 vezes maior afinidade do que a IGF-1. Em outros aspectos, a proteína de ligação se liga a IGF-II com pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 7, pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 100 ou pelo menos 150 vezes maior afinidade do que a IGF-1.

Em algumas formas de realização, a proteína de ligação específica tem um EC5O de não mais do que 15 nM para inibir fosforilação de receptor de IGF-I dependente de IGF-1 em células NIH3T3 expressando IGF- 1R ectopicamente. Em alguns aspectos, a proteína de ligação específica tem um EC50 de não mais do que 15 nM, não mais do que 10 nM, ou não mais do que 8 nM para inibir fosforilação de receptor de IGF-1 dependente de IGF-1 em células NIH3T3 expressando IGF- IR ectopicamente.

Em algumas formas de realização, a proteína de ligação específica tem um EC50 de não mais do que 5 nM, não mais do que 4 nM, ou não mais do que 3 nM para inibir fosforilação de receptor de IGF-1 dependente de IGF-1I em células NIH3T3 expressando IGF-1 R ectopicamente.

Em outras formas de realização, a proteína de ligação específica inibe mais do que 70% de proliferação dependente de IGE-II de células NIH3T3 que expressam hIGFIR recombinante com um EC50 de não mais do que 25 nM, não mais do que 20 nM, não mais do que 15 nM, ou não mais do que 10 nM.

Em outras formas de realização, a proteína de ligação específica inibe mais do que 70% de proliferação dependente de IGF-I de células NIH3T3 que expressam hIGF-lR recombinante com um EC50 de não mais do que 40 nM, não mais do que 30 nM, ou não mais do que 25 nM.

Em certas formas de realização, a proteína de ligação específica compete para ligação com um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüência variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 14 e SEQ ID NO..18, e compreendendo uma seqüência variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO.:4, SEQID NO.:8, SEQID NO.: 12 e SEQ ID NO..16.

Uma forma de realização da invenção é um anticorpo completamente humano que se liga a IGE-I com um Kd menor do que 500 picomolar (pM). Mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd menor do que 450 picomolar (pM). Mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd menor do que 410 picomolar (pM). Mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd de menos do que 350 pM. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd de menos do que 300 pM. Mensurações de afinidade e/ou avidez podem ser medidas por BIACORe, como descrito neste lugar.

Ainda outra forma de realização da invenção é um anticorpo monoclonal completamente humano que se liga a IGF-II com um Kd de menos do que 175 picomolar (pM). Mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd menor do que 100 picomolar (pM). Mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd menor do que 50 picomolar (pM). Mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd menor do que 5 picomolar (pM). Ainda mais preferivelmente, o anticorpo se liga com um Kd de menos do que 2 pM.

Em certas formas de realização, a proteína de ligação específica é um anticorpo monoclonal completamente humano ou um fragmento de ligação de um anticorpo monoclonal completamente humano. Os fragmentos de ligação podem incluir fragmentos tal como Fab, Fab1 ou F(ab')2 e Fv.

Uma forma de realização da invenção compreende anticorpos monoclonais completamente humanos 7.251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422), 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423) e 7.159.2 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424) que se ligam especificamente a IGF-I/11 como discutido em mais detalhe abaixo.

Em algumas formas de realização a proteína de ligação específica que se liga a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-1 (IGF-1), ou fragmento de ligação da mesma pode incluir um polipeptídeo de cadeia pesada tendo a seqüência de SEQ ID NO.:6, e um polipeptídeo de cadeia leve tendo a seqüência de SEQ ID NO.:8.

A proteína de ligação específica pode incluir um polipeptídeo de cadeia pesada tendo a seqüência de SEQ ID NO.: 10, e um polipeptídeo de cadeia leve tendo a seqüência de SEQ ID NO.: 12.

A proteína de ligação específica da invenção pode incluir polipeptídeo de cadeia pesada tendo a seqüência de SEQ ID NO.: 14 e um polipeptídeo de cadeia leve tendo a seqüência de SEQ ID NO.: 16.

Em certas formas de realização, a proteína de ligação específica pode estar em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável.

Outra forma de realização inclui moléculas isoladas de ácidos nucléicos codificando qualquer uma das proteínas de ligação específicas descritas neste lugar, vetores tendo moléculas isoladas de ácidos nucléicos codificando as proteínas de ligação específicas, ou uma célula hospedeira transformada com qualquer de tais moléculas de ácidos nucléicos e vetores.

Em certas formas de realização a proteína de ligação específica que se liga a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), ou fragmento de ligação da mesma não se liga especificamente a proteínas IGF-II ou IGF-I quando ditas proteínas são ligadas a Proteínas de Ligação de Fator de Crescimento tipo Insulina.

Formas de realização adicionais incluem métodos de determinar o nível de fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) e fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I) em uma amostra de paciente. Estes métodos podem incluir fornecer uma amostra de paciente; colocar a amostra em contato com uma proteína de ligação específica que se liga a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), ou fragmento de ligação da mesma; e determinar o nível de IGF-1 e IGF-II em dita amostra. Em alguns aspectos, a amostra de paciente é sangue.

Formas de realização adicionais incluem métodos de tratar um tumor maligno em um mamífero. Estes métodos podem incluir selecionar um mamífero com necessidade de tratamento para um tumor maligno; e administrar ao mamífero uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação específica que se liga a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF- II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), ou fragmento de ligação da mesma. Em alguns aspectos o animal é humano. Em alguns aspectos a proteína de ligação é um anticorpo monoclonal completamente humano, e é selecionada a partir do grupo consistindo de mAb 7.251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422), mAb 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423), e mAb 7.159.2 (Número de Acesso de ATCC ΡΤΑ-7424).

Doenças tratáveis podem incluir melanoma, câncer de pulmão de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (de fígado), tumor de tireóide, câncer gástrico (de estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colo, câncer pancreático, e carcinoma epidermóide.

Formas de realização adicionais incluem métodos de tratar uma doença dependente de fator de crescimento em um mamífero. Estes métodos incluem selecionar um mamífero com necessidade de tratamento para uma doença dependente de fator de crescimento; e administrar a dito mamífero uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação específica que se liga a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), ou fragmento de ligação da mesma. Em alguns aspectos, o mamífero pode ser humano. Em alguns aspectos a proteína de ligação é um anticorpo monoclonal completamente humano, e é selecionada a partir do grupo consistindo de rnAb 7.251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422), mAb 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423), e mAb 7.159.2 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424).

Doenças tratáveis dependentes de fator de crescimento podem incluir osteoporose, diabete, e doenças cardiovasculares. Outras condições de doença tratável incluem acromegalia e gigantismo, psoríase, técnicariosclerose e restenose de músculo liso de vasos sangüíneos, assim como diabete.

Formas de realização adicionais incluem um conjugado compreendendo um anticorpo monoclonal completamente humano que se liga a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-1I) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), ou a fragmento de ligação da mesma e um agente terapêutico. Em alguns aspectos o agente terapêutico pode ser uma toxina, um radioisótopo, ou uma composição farmacêutica.

Em outras formas de realização, a invenção fornece anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, que se ligam a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), e compreendem uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada I (CDRI) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Tyr Tyr Trp Ser" (SEQ ID NO: 21); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser" (SEQ ID NO: 22); e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "lie Thr Gly Thr Thr Lys Gly Gly Met Asp Vai" (SEQ ID NO: 23).

Formas de realização adicionais incluem anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, tendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His" (SEQ ID NO: 24). Anticorpos neste lugar também podem incluir uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser" (SEQ ID NO: 25); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Vai" (SEQ ID NO: 26).

Em outras formas de realização, a invenção fornece anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, que se ligam a fator de crescimento tipo insulina-11 (IGF-H) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), e compreendem uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRI) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Tyr Tyr Trp Ser" (SEQ ID NO: 27); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser" (SEQ ID NO: 28); e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "lie Thr Gly Thr Thr Lys Gly Gly Met Asp Vai" (SEQ ID NO: 29).

Formas de realização adicionais incluem anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, tendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Thr Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His" (SEQ ID NO: 30); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser" (SEQ ID NO: 31); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Ser Tyr Asp Set Ser Leu Ser Gly Ser Vai" (SEQ ID NO: 32).

Em outras formas de realização, a invenção fornece anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, que se ligam a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), e compreendem uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Tyr Asp Ile Asn" (SEQ ID NO: 33); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly" (SEQ ID NO: 34); e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai" (SEQ ID NO: 35).

Formas de realização adicionais incluem anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, tendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve I (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Set Gly Ser Set Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser" (SEQ ID NO: 36); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser" (SEQ ID NO: 37); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Vai" (SEQ ID NO: 38).

Em outras formas de realização, a invenção fornece anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, que se ligam a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), e compreendem uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Ser Ser Tyr Tyr Tip Gly" (SEQ ID NO: 81); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gly Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser" (SEQ ID NO: 82); e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Arg Gly His Set Ser Gly Tip Trp Tyr Phe Asp Leu" (SEQ ID NO: 83).

Formas de realização adicionais incluem anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, tendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Arg Ala Set Gln Gly Ile Ser Ser' Tyr Leu Ala" (SEQ ID NO: 84); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser" (SEQ ID NO: 85); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Phe Thr" (SEQ ID NO: 86).

Em outras formas de realização, a invenção fornece anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, que se ligam a fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina-I (IGF-1), e compreendem uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRI) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Ser Ser Asn Tyr Trp Gly" (SEQ ID NO: 87); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gly Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Veja' (SEQ ID NO: 88); e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Arg Gly His Ser Ser Gly Trp Trp Tyr Phe Asp Leu" (SEQ ID NO: 89).

Formas de realização adicionais incluem anticorpos monoclonais completamente humanos, ou fragmento de ligação dos mesmos, tendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Arg Ala Ser Arg Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala" (SEQ ID NO: 90); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser" (SEQ ID NO: 91); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe Thr" (SEQ ID NO: 92).

Algumas formas de realização fornecem o uso das proteínas de ligação específicas descritas neste lugar na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor maligno. Em alguns aspectos, a proteína de ligação específica pode ser um anticorpo monoclonal completamente humano. Em certos aspectos, a proteína de ligação é mAb 7.251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422) ou mAb 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA- 7423) ou mAb 7.159.2 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424). Em alguns aspectos, o medicamento é para uso em combinação com um segundo agente antineoplásico selecionado a partir do grupo consistindo de um anticorpo, um agente quimioterápico, e uma droga radioativa. Em alguns aspectos, o medicamento é para uso em conjunção com ou seguindo uma cirurgia convencional, um transplante de célula tronco de medula óssea ou um transplante de célula tronco periférico.

O tumor maligno pode ser melanoma, câncer de pulmão de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (de fígado), tumor de tireóide, câncer gástrico (de estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colo, câncer pancreático, e carcinoma epidermóide, por exemplo.

Outras formas de realização fornecem o uso das proteínas de ligação específicas descritas neste lugar na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença dependente de fator de crescimento. Em alguns aspectos, a proteína de ligação específica é um anticorpo monoclonal completamente humano e pode ser selecionada a partir do grupo consistindo de mAb 7.2,51.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422), mAb 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423), e mAb 7.159.2 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424).

A doença dependente de fator de crescimento pode ser osteoporose, diabete, e doenças cardiovasculares, por exemplo.

Preferivelmente, o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada tendo uma região determinante de complementaridade (CDR) com uma ou mais das seqüências mostradas em Tabela 11. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada tendo a CDRI, CDR2, ou CDR3 de uma ou mais das seqüências mostradas em Tabela 11, ou uma combinação das mesmas. É observado que aqueles de habitual verso na técnica podem realizar prontamente determinações de CDR. Veja por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NTH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

Formas de realização da invenção descrita neste lugar se referem a anticorpos monoclonais que se ligam a IGF-I/11 e afetam função. Outras formas de realização se referem a anticorpos anti-IGF-l/II completamente humanos e preparações de anticorpo anti-IGF-l/II com propriedades desejáveis a partir de uma perspectiva terapêutica, incluindo alta afinidade de ligação para IGF-I/11, a capacidade de neutralizar IGF- l/II in vitro e in vivo, e a capacidade de inibir proliferação celular induzida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Figura 1 é um gráfico mostrando inibição de crescimento de tumor xenoenxerto em camundongos nus de células NIH3T3 expressando IGF-II e IGF-IR (células de Clone 32) com mAbs 7.159.2, 7.34.1, 7251.3 comparado a controles de IgG2 e PBS. Volume médio de tumor é mostrado no eixo y e tempo depois de implantação é mostrado no eixo x.

Figura 2 é um gráfico mostrando peso corporal em camundongos de xenoenxerto de Clone 32 tratados com mAbs 7.159.2, 7.34.1, 7.251.3 comparado a controles de IgG2 e PBS. Peso corporal médio é mostrado no eixo y e tempo depois de implantação é mostrado no eixo x.

Figura 3 é um gráfico mostrando inibição de crescimento de tumor xenoenxerto em camundongos nus de células NIH3T3 expressando IGF-I e IGF-IR. (células P12) com mAb 7.159.2 comparado a controle de PBS. Volume médio de tumor é mostrado no eixo y e tempo depois de implantação (indicado por data) é mostrado no eixo x.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Formas de realização da invenção descrita neste lugar se referem a proteínas de ligação que se ligam especificamente a IGF-1I com reatividade cruzada para IGF-1 (referido neste lugar como "IGFI/II"). Em algumas formas de realização, as proteínas de ligação são anticorpos, ou fragmentos de ligação destes, e se ligam a IGF-1I com reatividade cruzada para IGF-1 e inibem a ligação destas proteínas ao seu receptor, IGF-IR. Outras formas de realização da invenção incluem anticorpos neutralizantes anti-IGF-1/II completamente humanos, e preparações de anticorpos que são terapeuticamente úteis e se ligam a ambos os fatores de crescimento tipo insulina. Tais preparações de anticorpos anti-IGF-1/II preferivelmente têm propriedades terapêuticas desejáveis, incluindo forte afinidade de ligação para IGF-VII, a capacidade de neutralizar IGF-1/11 in vitro, e a capacidade de inibir proliferação celular induzida por IGF-1/11 in vivo.

Formas de realização da invenção também incluem fragmentos de ligação isolados de anticorpos anti-IGF-1/II. Preferivelmente, os fragmentos de ligação são derivados de anticorpos anti-IGF-1/II completamente humanos. Fragmentos exemplares incluem Fv, Fab1 ou outros fragmentos de anticorpos bem conhecidos, como descrito em mais detalhe abaixo. Formas de realização da invenção também incluem células que expressam anticorpos completamente humanos contra IGF-1/II. Exemplos de células incluem hibridomas, ou células criadas recombinantemente, tal como células de ovário de hamster Chinês (CHO) que produzem anticorpos contra IGF-1/11.

Em adição, formas de realização da invenção incluem métodos de usar estes anticorpos para tratar doenças. Anticorpos anti-IGF-1/II são úteis para prevenir transdução de sinal de IGF-1/11 mediada por IGF-1/II, com isso inibindo proliferação celular. O mecanismo de ação desta inibição pode incluir inibição de IGF-1/11 de se ligar a seu receptor, IGF-IR, inibição de sinalização de IGF-1R induzida por IGF-1/II, ou depuração aumentada de IGF-1/II nisto diminuindo a concentração eficaz de IGF-1/II para se ligar a IGF-1R. Doenças que são tratáveis através deste mecanismo de inibição incluem, mas não são limitadas a, doenças neoplásicas, tal como, melanoma, câncer de pulmão de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (de fígado), tumores ginecológicos, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, glioblastoma, e cânceres e tumores da tireóide, estômago, próstata, mama, ovário, bexiga, pulmão, útero, rim, colo, e pâncreas, glândula salivar, e colorreto.

Outras formas de realização da invenção incluem ensaios diagnósticos para determinar especificamente a quantidade de IGF-1/II em uma amostra biológica. O kit de ensaio pode incluir anticorpos anti-IGF-1/II junto com os marcadores necessários para detectar tais anticorpos. Estes ensaios diagnósticos são úteis para triar por doenças relacionadas a fator de crescimento incluindo, mas não limitado a, doenças neoplásicas, tal como, melanoma, câncer de pulmão de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (de fígado), tumores ginecológicos, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, glioblastoma, e carcinoma da tireóide, estômago, próstata, mama, ovário, bexiga, pulmão, útero, rim, colo, e pâncreas, glândula salivar, e colorreto. Outras condições de doença neoplásica podem incluir acromegalia e gigantismo, psoríase, osteoporose, técnicariosclerose e restenose de músculo liso de vasos sangüíneos, assim como diabetes.

Formas de realização, características adicionais, e os semelhantes em relação a anticorpos anti-IGF-1/II são fornecidos em detalhe adicional abaixo.

Listagem de Seqüências

Formas de realização da invenção incluem os anticorpos anti- IGF-1/II específicos listados abaixo em Tabela 1. Esta Tabela informa o número de identificação de cada anticorpo anti-IGF-1/II, junto com o número de SEQ ID dos genes correspondentes de cadeia pesada e cadeia leve. Ademais, as seqüências de linhagem germinativa das quais cada cadeia pesada e cadeia leve derivam também são fornecidas abaixo em Tabela 1.

A cada anticorpo foi dado um número de identificação que inclui ou dois ou três números separados por um ou dois pontos decimais. Em alguns casos, diversos clones de um anticorpo foram preparados. Embora os clones tenham as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos idênticas à seqüência parental, eles também podem ser listados separadamente, com o número de clone indicado pelo número à direita de um segundo ponto decimal. Assim, por exemplo, as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos de anticorpo 7.159.2 são idênticas às seqüências de anticorpo 7.159.1.

Como pode ser visto comparando as seqüências na listagem de seqüências, SEQ ID NOs.: 1-20 diferem de SEQ ID NOs.: 39-58 porque SEQ ID NOs.: 39-58 incluem o peptídeo sinal não traduzido, e regiões de domínio constante para cada cadeia pesada ou leve seqüenciada. TABELA 1

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Definições

A menos que de outra forma definido, termos científicos e técnicos usados neste lugar devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles de habitual verso na técnica. Ademais, a menos que de outra forma requerido por contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular. Geralmente, nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura de célula e tecido, biologia molecular, e química de proteína e oligo ou polincleotídeo e hibridização descritas neste lugar são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica.

Técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, e cultura de tecido e transformação (e.g., eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com especificações do fabricante ou como comumente realizado na técnica ou como descrito neste lugar. As técnicas e procedimentos precedentes geralmente são realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório. Veja e.g., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), que é incorporado neste lugar por referência. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritos neste lugar são aqueles bem conhecidos e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação, e liberação de produto farmacêutico, e tratamento de pacientes.

Como utilizado em conformidade com a presente descrição, os termos seguintes, a menos que de outra forma indicado, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

O termo "IGF-1" se refere à molécula de fator de crescimento tipo Insulina-I, e o termo "IGF-1I" se refere à molécula de fator de crescimento tipo Insulina-II. O termo "IGF-1/1I" se refere tanto a moléculas fatores de crescimento tipo Insulina-I como II, e se refere à ligação preferencial para IGF-1I com reatividade cruzada para IGF-1. Assim, um anticorpo que se liga a IGF-I/11 irá se ligar preferencialmente a IGF-1I, mas iria reagir cruzado com IGF-1, se ligando a IGF-1I com maior afinidade do que a IGF-1. Por exemplo, o anticorpo pode se ligar a IGF-1I com 2,5 vezes maior afinidade do que a IGF-1. Em certas formas de realização, o anticorpo pode se ligar a IGF-1I com pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 25, pelo menos 50 ou pelo menos 150 vezes maior afinidade do que a IGF-1:

O termo "neutralizante" quando se referindo a um anticorpo se refere à capacidade de um anticorpo de eliminar, ou reduzir significantemente, a atividade de um antígeno alvo. Por conseguinte, um anticorpo anti-IGF-l/II "neutralizante" é capaz de eliminar ou reduzir significantemente a atividade de IGF-I/11. Um anticorpo anti-IGF-l/II neutralizante pode, por exemplo, atuar bloqueando a ligação de IGF-I/11 a seu receptor IGF-IR. Bloqueando esta ligação, a transdução de sinal mediada por IGF-IR é significantemente, ou completamente, eliminada. Idealmente, um anticorpo neutralizante contra IGF-1/11 inibe proliferação celular.

O termo "polinucleotídeo isolado" como usado neste lugar deve significar um polinucleotídeo que foi isolado a partir de seu ambiente que ocorre naturalmente. Tais polinucleotídeos podem ser genômicos, cDNA, ou sintéticos. Polinucleotídeos isolados preferivelmente não estão associados com todos ou uma porção dos polinucleotídeos que eles se associam com na natureza. Os polinucleotídeos isolados podem ser operavelmente ligados a outro polinucleotídeo ao qual não são ligados na natureza. Em adição, polinucleotídeos isolados preferivelmente não ocorrem na natureza como parte de uma seqüência maior.

O termo "proteína isolada" referido neste lugar significa uma proteína que foi isolada a partir de seu ambiente que ocorre naturalmente. Tais proteínas podem ser derivadas de DNA genômico, cDNA, DNA recombinante, RNA recombinante, ou de origem sintética ou alguma combinação destes, a qual por virtude de sua origem, ou fonte de derivação, a "proteína isolada" (1) não está associada com proteínas encontradas na natureza, (2) é livre de outras proteínas da mesma fonte, e.g. livre de proteínas murinas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.

O termo "polipeptídeo" é usado neste lugar como um termo genérico para se referir a proteína nativa, fragmentos, ou análogos de uma seqüência de polipeptídeo. Portanto, proteína nativa, fragmentos, e análogos são espécies do gênero polipeptídeo. Polipeptídeos preferidos em conformidade com a invenção compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada humana e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve humana capa, assim como moléculas de anticorpo formadas por combinações compreendendo as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tal como as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve capa ou lambda, e vice versa, assim como fragmentos e análogos das mesmas. Polipeptídeos preferidos em conformidade com a invenção também podem compreender somente as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada humana ou fragmentos das mesmas.

O termo "que ocorre naturalmente" como usado neste lugar se aplicado a um objeto se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório ou é de outra maneira que ocorre naturalmente.

O termo "operavelmente ligado" como usado neste lugar se refere a posições de componentes descritos de forma que estão em uma relação permitindo que eles funcionem de maneira pretendida. Por exemplo, uma seqüência de controle "operavelmente ligada" a uma seqüência de codificação é conectada de uma maneira tal que expressão da seqüência de codificação é atingida em condições compatíveis com as seqüências de controle.

O termo "polinucleotídeo" como referido neste lugar significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, ou ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada, ou de tipo de nucleotídeos, ou heteroduplexes de RNA-DNA. O termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA.

O termo "oligonucleotídeo" referido neste lugar inclui nucleotídeos que ocorre naturalmentes, e modificados ligados juntos por ligações que ocorre naturalmentes, e não que ocorre naturalmentes. Oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeos geralmente compreendendo um comprimento de 200 bases ou menos. Preferivelmente, oligonucleotídeos são de 10 a 60 bases de comprimento e mais preferivelmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases de comprimento. Oligonucleotídeos são normalmente de fita simples, e.g. para sondas; embora oligonucleotídeos possam ser de dupla fita, e.g. para uso na construção de um gene mutante. Oligonucleotídeos podem ser ou oligonucleotídeos sentido ou antisentido.

O termo "nucleotídeos que ocorre naturalmentes" referido neste lugar inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos modificados" referido neste lugar inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e os semelhantes. O termo "ligações de oligonucleotídeos" referido neste lugar inclui ligações de oligonucleotídeos tal como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, e os semelhantes. Veja e.g., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soe. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente Norte-Americana No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), as descrições dos quais são por aqui incorporadas por referência. Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador para detecção, se desejado. O termo "hibridizam seletivamente" referido neste lugar significa se ligar detectavelmente e especificamente. Polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos destes hibridizam seletivamente com fitas de ácidos nucléicos em condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável com ácidos nucléicos não específicos. Condições de alta estringência podem ser usadas para atingir condições seletivas de hibridização como conhecido na técnica e discutido neste lugar. Geralmente, a homologia de seqüências de ácidos nucléicos entre os polinucleotídeos, oligonucleotídeos, ou fragmentos de anticorpo e uma seqüência de ácidos nucléicos de interesse será pelo menos 80%, e mais tipicamente com homologias preferivelmente crescentes de pelo menos 85%, 90%, 95%, 99%, e 100%.

Duas seqüências de aminoácidos são "homólogas" se existe uma identidade parcial ou completa entre suas seqüências. Por exemplo, 85% de homologia significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas seqüências são alinhadas para pareamento máximo. Lacunas (em qualquer das duas seqüências sendo pareadas) são permitidas para maximizar pareamento; comprimentos de lacuna de 5 ou menos são preferidos com 2 ou menos sendo mais preferidos. Alternativamente e preferivelmente, duas seqüências protéicas (ou seqüências de polipeptídeos derivadas das mesmas de pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, como este termo é usado neste lugar, se elas têm um escore de alinhamento de mais do que 5 (em unidades de desvio padrão) usando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade de lacuna de 6 ou mais. Veja Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e Suplemento 2 para este volume, pp. 1-10. As duas seqüências ou partes das mesmas são mais preferivelmente homólogas se seus aminoácidos são maiores do que ou iguais a 50% idênticos quando otimamente alinhadas usando o programa ALIGN. Deve ser percebido que podem existir regiões diferenciadas de homologia dentro de duas seqüências ortólogas. Por exemplo, os sítios funcionais de ortólogos de camundongos e humanos podem ter um maior grau de homologia do que regiões não funcionais.

O termo "corresponde a" é usado neste lugar para significar que uma seqüência de polinucleotídeos é homóloga (i.e., é idêntica, não estritamente relacionada evolutivamente) a toda ou uma porção de uma seqüência de polinucleotídeos de referência, ou que uma seqüência de polipeptídeos é idêntica a uma seqüência de polipeptídeos de referência.

Em contradição, o termo "complementar a" é usado neste lugar para significar que a seqüência complementar é homóloga a toda ou uma porção de uma seqüência de polinucleotídeos de referência. Para ilustração, a seqüência de nucleotídeos "TATAC" corresponde a uma seqüência de referência "TATAC" e é complementar a uma seqüência de referência "GT ATA".

Os termos seguintes são usados para descrever as relações de seqüência entre duas ou mais seqüências de polinucleotídeos ou aminoácidos: "seqüência de referência", "janela de comparação", "identidade de seqüência", "porcentagem de identidade de seqüência", e "identidade substancial". Uma "seqüência de referência" é uma seqüência definida usada como uma base para uma comparação de seqüências. Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto de uma seqüência maior, por exemplo, como um smento de um cDNA de comprimento completo ou seqüência gênica dada em uma listagem de seqüências ou pode compreender um cDNA de comprimento completo ou seqüência gênica. Geralmente, uma seqüência de referência é de pelo menos 18 nucleotídeos ou 6 aminoácidos de comprimento, freqüentemente pelo menos 24 nucleotídeos ou 8 aminoácidos de comprimento, e freqüentemente pelo menos 48 nucleotídeos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que duas seqüências de polinucleotídeos ou de aminoácidos podem cada (1) compreender uma seqüência (i.e., uma porção da seqüência de polinucleotídeos ou de aminoácidos completa) que é similar entre as duas moléculas, e (2) pode compreender adicionalmente uma seqüência que é divergente entre as duas seqüências de polinucleotídeos ou de aminoácidos, comparações de seqüências entre duas (ou mais) moléculas tipicamente são realizadas comparando seqüências das duas moléculas sobre uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüências. Uma "janela de comparação", como usado neste lugar, se refere a um smento conceituai de pelo menos cerca de 18 posições de nucleotídeos contíguos ou cerca de 6 aminoácidos caracterizado pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos ou seqüência de aminoácidos é comparada a uma seqüência de referência de pelo menos 18 nucleotídeos contíguos ou 6 seqüências de aminoácidos e caracterizado pelo fato de que a porção da seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode incluir adições, deleções, substituições, e os semelhantes (i.e., lacunas) de 20 porcento ou menos se comparada com a seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. Alinhamento ótimo de seqüências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman Adv. App! Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad (U.S.A.) 85:2444 (1988), pelas implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTF1T, FASTA, e TFASTA na Publicação 7.0 de Pacote de Aplicativo Computacional de Wisconsin Genetics, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), pacotes de aplicativo computacional GENEWORKS™, ou MACVECTORe), ou por inspeção, e o melhor alinhamento (i.e., resultando na maior porcentagem de homologia ao longo da janela de comparação) gerado pelos vários métodos é selecionado.

O termo "identidade de seqüência" significa que duas seqüências de polinucleotídeos ou de aminoácidos são idênticas (i.e., em uma base de nucleotídeo por nucleotídeo ou resíduo por resíduo) ao longo da janela de comparação. O termo "porcentagem de identidade de seqüência" é calculado comparando duas seqüências otimamente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base idêntica de ácido nucléico (e.g., A, T, C, G, U, ou 1) ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas seqüências para produzir o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação (i.e., o tamanho de janela), e multiplicando o resultado por 100 para gerar a porcentagem de identidade de seqüência. O termo "identidade substancial" como usado neste lugar indica uma característica de uma seqüência de polinucleotídeos ou de aminoácidos, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo ou aminoácido compreende uma seqüência que tem pelo menos 85 de identidade percentual de seqüência, preferivelmente pelo menos 90 a 95 porcento de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 99 porcento de identidade de seqüência, se comparado a uma seqüência de referência ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleotídeos (6 aminoácidos), freqüentemente ao longo de uma janela de pelo menos 24-48 posições de nucleotídeos (8-16 aminoácidos), caracterizada pelo fato de que a porcentagem de identidade de seqüência é calculada comparando a seqüência de referência com a seqüência que pode incluir deleções ou adições cujo total 20 porcento ou menos da seqüência de referência ao longo da janela de comparação. A seqüência de referência pode ser um subconjunto de uma seqüência maior.

Como usado neste lugar, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações suem uso convencional. Veja immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é incorporado neste lugar por referência. Estereoisômeros (e.g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tal como a-, a-disubstituídos aminoácidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para polipeptídeos da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, i- carboxiglutamato, E-N,N5Ntrimetilisina, E-N-acetilisina, 0-fosfoserina, N- acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N- metilarginina, e outros aminoácidos e iminoáciods similares (e.g., 4- hidroxiprolina). Na notação de polipeptídeos usada neste lugar, a direção da esquerda é a direção amino terminal e a direção da direita é a direção carboxi- terminal, em conformidade com uso padrão e convenção.

Similarmente, a menos que de outra maneira especificado, a extremidade da esquerda de seqüências de polinucleotídeos de fita simples é a extremidade 5'; a direção da esquerda de seqüências de polinucleotídeos de dupla fita é referida como a direção 5'. A direção de adição 5' para 3' de transcritos de RNA nascente é referida como a direção de transcrição; regiões de seqüência na fita de DNA tendo a mesma seqüência que o RNA e que são 5' para a extremidade 5' do transcrito de RNA são referidas como "seqüências anteriores"; regiões de seqüência na fita de DNA tendo a mesma seqüência que o RNA e que são 3' para a extremidade 3' do transcrito de RNA são referidas como "seqüências posteriores".

Se aplicado a polipeptídeos, o termo "identidade substancial" significa que duas seqüências de peptídeos, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacunas padrão, compartilham pelo menos 80 porcento de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 90 porcento de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 95 porcento de identidade de seqüência, e mais preferivelmente pelo menos 99 porcento de identidade de seqüência. Preferivelmente, posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácidos. Substituições conservativas de aminoácidos se referem à permutabilidade de resíduos tendo cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais com hidroxila alifática é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina, e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina, e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Grupos preferidos de substituição conservativa de aminoácidos são: valina-leucina- isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutâmico- aspártico, e asparagina-glutamina.

Como discutido neste lugar, variações secundárias nas seqüências de aminoácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são contempladas como sendo abrangidas pela presente invenção, contanto que as variações na seqüência de aminoácidos mantenham pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, 90%, 95%, e mais preferivelmente 99% de identidade de seqüência com os anticorpos ou moléculas de imunoglobulina descritas neste lugar. Em particular, substituições conservativas de aminoácidos são contempladas. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que têm cadeias laterais relacionadas. Aminoácidos geneticamente codificados geralmente são divididos em famílias: (1) ácidos=aspartato, glutamato; (2) básicos=lisina, arginina, histidina; (3) não polares=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados=glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Famílias mais preferidas são: serina e treonina são uma família de hidroxila alifática; asparagina e glutamina são uma família contendo amida; alanina, valina, leucina e isoleucina são uma família alifática; e fenilalanina, triptofano, e tirosina são uma família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado não tenha um efeito grande na função ou propriedades de ligação da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolve um aminoácido dentro de um sítio de arcabouço. Se uma mudança de aminoácido resulta em um peptídeo funcional pode ser prontamente determinada ensaiando a atividade específica do derivado de polipeptídeo. Ensaios são descritos em detalhe neste lugar. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser prontamente preparados por aqueles de habitual verso na técnica. Términos amino e carboxi preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem perto de limites de domínios funcionais. Domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados de seqüência de nucleotídeos e/ou de aminoácidos com bancos de dados de seqüências públicos ou privados. Preferivelmente, métodos computadorizados de comparação são usados para identificar motivos de seqüências ou domínios de conformação protéica prevista que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. Métodos para identificar seqüências protéicas que se dobram em uma estrutura tridimensional são conhecidos. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Assim, os exemplos que suem demonstram que aqueles de habitual verso na técnica podem reconhecer motivos de seqüências e conformações estruturais que podem ser usadas para definir domínios estruturais e funcionais em conformidade com os anticorpos descritos neste lugar.

Substituições preferidas de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem susceptibilidade a proteólise, (2) reduzem susceptibilidade a oxidação, (3) alteram afinidade de ligação para formar complexos protéicos, (4) alteram afinidades de ligação, e (5) conferem ou modificam outras propriedades fisicoquímicas ou funcionais de tais análogos. Análogos podem incluir várias muteínas de uma seqüência outra do que a seqüência de peptídeo que ocorre naturalmente. Por exemplo, substituições únicas ou múltiplas de aminoácidos (preferivelmente substituições conservativas de aminoácidos) podem ser feitas na seqüência que ocorre naturalmente (preferivelmente na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) formando contatos intermoleculares). Uma substituição conservativa de aminoácido não deve mudar substancialmente as características estruturais da seqüência parental (e.g., um aminoácido de substituição não deve tender a quebrar uma hélice que ocorre na seqüência parental, ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência parental). Exemplos de estruturas secundária e terciária de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Toone, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354:105 (1991), que são cada incorporados neste lugar por referência.

O termo "fragmento de polipeptídeo" como usado neste lugar se refere a um polipeptídeo que tem uma deleção amino-terminal e/ou carboxi-terminal, mas onde a seqüência de aminoácidos remanescente é idêntica às posições correspondentes na seqüência que ocorre naturalmente deduzida, por exemplo, de uma seqüência de cDNA de comprimento completo. Fragmentos tipicamente são de pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, preferivelmente pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, normalmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, e ainda mais preferivelmente pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. O termo "análogo" como usado neste lugar se refere a polipeptídeos que são compreendidos de um smento de pelo menos 25 aminoácidos que tem identidade substancial com uma porção de uma seqüência de aminoácidos deduzida e que tem pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica para IGF-1/II, em condições de ligação adequadas, (2) capacidade de bloquear ligação apropriada de 1GF-1/II, ou (3) capacidade de inibir atividade de IGF-1/II. Tipicamente, análogos de polipeptídeo compreendem uma substituição conservativa de aminoácido (ou adição ou deleção) com respeito à seqüência que ocorre naturalmente. Análogos tipicamente são de pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou maiores, e freqüentemente podem ser tão grandes como um polipeptídeo que ocorre naturalmente de comprimento completo.

Análogos de peptídeo são comumente usados na indústria farmacêutica como drogas de não peptídeo com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Estes tipos de composto não peptídico são denominados "miméticos de peptídeos" ou "peptideomiméticos". Fauchere, Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que são incorporados neste lugar por referência. Tais compostos freqüentemente são desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos de peptídeos que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Geralmente, peptideomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo de paradigma (i.e., um polipeptídeo que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), tal como anticorpo humano, mas têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada a partir do grupo consistindo de: -CH2NH--, --CH2S--, --CH2- CH2—, -CH=CH-(eis e trans), - COCll2-, -CH(OH)Cl-12-, e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (e.g., D-Iisina em lugar de L-lisina) pode ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Em adição, peptídeos restritos compreendendo uma seqüência consenso ou uma variação de seqüência consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporado neste lugar por referência); por exemplo, adicionando resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.

Como usado neste lugar, o termo "anticorpo" se refere a Um polipeptídeo ou grupo de polipeptídeos que são compreendidos de pelo menos um domínio de ligação que é formado a partir do dobramento de cadeias de polipeptídeo tendo espaços de ligação tridimensionais com formatos de superfície interna e distribuições de carga complementares às características de um determinante antigênico de um antígeno. Um anticorpo tipicamente tem uma forma tetramérica, compreendendo dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" e uma "pesada". As regiões variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam um sítio de ligação de anticorpo.

"Fragmentos de ligação" de um anticorpo são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, e anticorpos de cadeia única. Um anticorpo outro do que um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é entendido como tendo cada um de seus sítios de ligação idêntico. Um anticorpo inibe substancialmente adesão de um receptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra-receptor em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60% ou 80%, e mais normalmente mais do que cerca de 85% (se medido em um ensaio de ligação competitiva in vitro).

Como usado neste lugar, uma "proteína de ligação" ou a "proteína de ligação específica" são proteínas que se ligam especificamente a uma molécula alvo. Anticorpos, e fragmentos de ligação de anticorpos, são proteínas de ligação.

O termo "epitopo" inclui qualquer determinante protéico capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Determinantes epitópicos normalmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tal como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e podem, mas não sempre, ter características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Um anticorpo é dito se ligar especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação é ≤ 1 μΜ, preferivelmente ≤ 100 nM e mais preferivelmente ≤ 10 nM.

O termo "agente" é usado neste lugar para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato feito de materiais biológicos.

"Ativo" ou "atividade" em relação a um polipeptídeo IGF-1/II se refere a uma porção de um polipeptídeo IGF-1/11 que tem uma atividade biológica ou uma imunológica de um polipeptídeo IGF-1/11 nativo. "Biológica" quando usado neste lugar se refere a uma função biológica que resulta da atividade do polipeptídeo IGF-1/II nativo. Uma atividade biológica preferida de IGF-1/11 inclui, por exemplo, proliferação celular induzida por IGF-1/II.

"Mamífero" quando usado neste lugar se refere a qualquer animal que é considerado um mamífero. Preferivelmente, o mamífero é humano.

Digestão de anticorpos com a enzima, papaína, resulta em dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, também conhecidos como fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc", não tendo nenhuma atividade de ligação de antígeno mas tendo a capacidade de cristalizar. Digestão de anticorpos com a enzima, pepsina, resulta no fragmento F(ab')2 no qual os dois braços da molécula de anticorpo permanecem ligados e compreendem dois sítios de ligação de antígeno. O fragmento F(ab')2 tem a capacidade de reticular antígeno.

"Fv" quando usado neste lugar se refere ao fragmento mínimo de um anticorpo que retém tanto sítios de reconhecimento de antígeno como de ligação de antígeno.

"Fab" quando usado neste lugar se refere a um fragmento de um anticorpo que compreende o domínio constante da cadeia leve e o domínio CHl da cadeia pesada.

O termo "mAb" se refere a anticorpo monoclonal.

"Lipossomo" quando usado neste lugar se refere a uma pequena vesícula que pode ser útil para liberação de drogas que podem incluir o polipeptídeo IGF-1/II da invenção ou anticorpos para um tal polipeptídeo IGF-1/II para um mamífero.

"Marcador" ou "marcado" como usado neste lugar se refere à adição de uma unidade detectável a um polipeptídeo, por exemplo, um radiomarcador, marcador fluorescente, marcador enzimático quimioluminescente marcado ou um grupo biotinila. Radioisótopos ou radionuclídeos podem incluir 3H, '4C' 15N, 35S, 9oY, 99Tc, 111In, 325I, 131I, marcadores fluorescentes podem incluir rodamina, fósforos de lantanídeo ou FITC e marcadores enzimáticos podem incluir peroxidase de raiz forte, p- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina.

O termo "agente ou droga farmacêutica" como usado neste lugar se refere a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando apropriadamente administrado a um paciente. Outros termos químicos neste lugar são usados de acordo com uso convencional na técnica, como exemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)),(incorporado neste lugar por referência).

Como usado neste lugar, "substancialmente pura" significa que uma espécie objeto é a espécie predominante presente (i.e., em uma base molar ela é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição), e preferivelmente uma fração substancialmente purificada é uma composição caracterizada pelo fato de que a espécie objeto compreende pelo menos cerca de 50 porcento (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura irá compreender mais do que cerca de 80 porcento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais preferivelmente mais do que cerca de 85%, 90%, 95%, e 99%. Mais preferivelmente, a espécie objeto é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos convencionais de detecção) caracterizado pelo fato de que a composição consiste essencialmente de uma única espécie macromolecular.

O termo "paciente" inclui sujeitos humanos e veterinários.

Anticorpos humanos e Humanização de anticorpos

Anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associados com anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constante murinas ou de rato. A presença de tais proteínas derivadas de murino ou rato pode levar à rápida depuração dos anticorpos ou pode levar à geração de uma resposta imune contra o anticorpo por um paciente. A fim de evitar a utilização de anticorpos derivados de murino ou rato, anticorpos completamente humanos podem ser gerados através da introdução de Ioci de anticorpo humano funcional em um roedor, outro mamífero ou animal de forma que o roedor, outro mamífero ou animal produza anticorpos completamente humanos.

Um método para gerar anticorpos completamente humanos é através do uso de linhagens XenoMouse® de camundongos que foram manipuladas para conter até mas menos do que fragmentos configurados de linhagem germinativa dimensionados em 1000 kb do locus de cadeia pesada humana e locus de cadeia leve capa. Veja Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). As linhagens XenoMouse® estão disponíveis a partir de Abgenix, Inc. (Fremont, CA).

A produção das linhagens XenoMouse de camundongos é adicionalmente discutida e delineada em Pedido de Patente Norte-Americana Nos. de Série 07/466.008, depositada em 12 de Janeiro de 1990, 07/610.515, depositada em 8 de Novembro de 1990, 07/919.297, depositada em 24 de Julho de 1992, 07/922.649, depositada em 30 de Julho de 1992, 08/031.801, depositada em 15 de Março de 1993, 08/112.848, depositada em 27 de Agosto de 1993, 08/234.145, depositada em 28 de Abril de 1994, 08/376.279, depositada em 20 de Janeiro de 1995, 08/430.938, depositada em 27 de Abril de 1995, 08/464.584, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/464.582, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/463.191, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/462.837, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/486.853, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/486.857, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/486.859, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/462.513, depositada em 5 de Junho de 1995, 08/724.752, depositada em 2 de Outubro de 1996, 08/759.620, depositada em 3 de Dezembro de 1996, Publicação Norte- Americana 2003/0093820, depositada em 30 de Novembro de 2001 e Patente Norte-Americana Nos. 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181, e 5.939.598 e Patente Japonesa Nos. 3 068 180 82, 3 068 506 132, e 3 068 507 B2. Veja também Patente Européia No., EP 0 463 151 BI, publicada em concessão em 12 de Junho de 1996, Pedido de Patente Internacional No., WO 94/02602, publicado em 3 de Fevereiro de 1994, Pedido de Patente Internacional No., WO 96/34096, publicado em 31 de Outubro de 1996, Patente Internacional 98/24893, publicada em 11 de Junho de 1998, Patente Internacional 00/76310, publicada em 21 de Dezembro de 2000. As descrições de cada uma das patentes, pedidos, e referências citadas acima são por aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Em uma abordagem alternativa, outros, incluindo GenPharm International, Inc., utilizaram uma abordagem de "minilocus". Na abordagem de minilocus, um locus Ig exógeno é imitado através da inclusão de pedaços (genes individuais) do locus Ig. Assim, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, uma região constante mu, e normalmente uma segunda região constante (preferivelmente uma região constante gama) são formados em uma construção para inserção em um animal. Esta abordagem é descrita em Patente Norte-Americana No. 5.545.807 a Surani et al. e Patente Norte-Americana Nos. 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299, e 6.255.458 cada a Lonberg and Kay, Patente Norte-Americana No. 5.591.669 e 6.023.010 a Krimpenfort and Berns, Patente Norte-Americana Nos. 5.612.205, 5.721.367, e 5.789.215 a Berns et al., e Patente Norte-Americana No. 5.643.763 a Choi and Dunn, e Pedido de Patente Norte-Americana de GenPharm International Nos. de Série 07/574.748, depositada em 29 de Agosto de 1990, 07/575.962, depositada em 31 de Agosto de 1990, 07/810.279, depositada em 17 de Dezembro de 1991, 07/853.408, depositada em 18 de Março de 1992, 07/904.068, depositada em 23 de Junho de 1992, 07/990.860, depositada em 16 de Dezembro de 1992, 08/053.131, depositada em 26 de Abril de 1993, 08/096.762, depositada em 22 de Julho de 1993, 08/155.301, depositada em 18 de Novembro de 1993, 08/161.739, depositada em 3 de Dezembro de 1993, 08/165.699, depositada em 10 de Dezembro de 1993, 08/209.741, depositada em 9 de Março de 1994, as descrições dos quais são por aqui incorporadas por referência. Veja também Patente Européia No. 0 546 073 BI, Pedido de Patente Internacional Nos. WO 92103918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, e WO 98/24884 e Patente Norte- Americana No. 5.981.175, as descrições dos quais são por aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Veja adicionalmente Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), e Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996), as descrições dos quais são por aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Kirin também demonstrou a geração de anticorpos humanos a partir de camundongos nos quais, através de fusão microcelular, grandes pedaços de cromossomos, ou cromossomos inteiros, foram introduzidos. Veja Pedido de Patente Européia Nos. 773 288 e 843 961, as descrições das quais são por aqui incorporadas por referência. Adicionalmente, camundongos KJVI —, que são o resultado de cruzamento de camundongos Kirin's Tc com camundongos minilocus de Medarex (Humab) foram gerados. Estes camundongos possuem o transcromossomo humano IgH dos camundongos Kirin e o transgene de cadeia capa dos camundongos de Genpharm (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

Anticorpos humanos também podem ser derivados por métodos in vitro. Exemplos adequados incluem mas não são limitados a apresentação em fagos (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (antigamente Proliferon), Affimed) apresentação em ribossomo (CAT), apresentação em levedura, e os semelhantes.

Preparação de anticorpos

Anticorpos, como descrito neste lugar, foram preparados através da utilização da tecnologia XenoMouse , como descrito abaixo. Tais camundongos, então, são capazes de produzir moléculas de imunoglobulina e anticorpos humanos e são deficientes na produção de moléculas de imunoglobulina e anticorpos murinos. Tecnologias utilizadas para atingir os mesmos são descritas nas patentes, pedidos, e referências descritos na seção de histórico neste lugar. Em particular, entretanto, uma forma de realização preferida de produção transgênica de camundongos e anticorpos destes é descrita em Pedido de Patente Norte-Americana No. de Série 08/759.620, depositada em 3 de Dezembro de 1996 e Pedido de Patente Internacional Nos. WO 98/24893, publicado em 11 de Junho de 1998 e WO 00/76310, publicado em 21 de Dezembro de 2000, as descrições dos quais são por aqui incorporadas por referência. Veja também Mendez et ai. Nature Genetics 15:146-156 (1997), a descrição do qual é por aqui incorporada por referência.

Através do uso de tal tecnologia, anticorpos monoclonais completamente humanos para uma variedade de antígenos foram produzidos. Essencialmente, linhagens XenoMouse® de camundongos são imunizadas com um antígeno de interesse (e.g. IGF-VII), células linfáticas (tal como células B) são recuperadas a partir dos camundongos hiperimunizados, e os linfócitos recuperados são fundidos com uma linhagem celular tipo mielóide para preparar linhagens celulares imortais de hibridoma. Estas linhagens celulares de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produziram anticorpos específicos para o antígeno de interesse. São fornecidos neste lugar métodos para a produção de linhagens celulares múltiplas de hibridoma que produzem anticorpos específicos para IGF-I/11. Ademais, é fornecida neste lugar caracterização dos anticorpos produzidos por tais linhagens celulares, incluindo análises de seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos das cadeias pesadas e leves de tais anticorpos.

Alternativamente, ao invés de serem fundidas a células de mieloma para gerar hibridomas, células B podem ser diretamente ensaiadas. Por exemplo, CD19+ células B podem ser isolados de camundongos XenoMouse® hiperimunes e permitidas proliferar e se diferenciar em células plasmáticas que secretam anticorpo. Anticorpos dos sobrenadantes celulares são então triados por ELISA para reatividade contra o imunogene IGF-I/II. Os sobrenadantes também podem ser triados para imunorreatividade contra fragmentos de IGF-I/11 para adicionalmente mapear os diferentes anticorpos para ligar a domínios de interesse funcional em IGF-VII. Os anticorpos também podem ser triados contra outras quimiocinas relacionadas a humano e contra os ortólogos de IGF-I/11 de rato, de camundongo, e primata não humano, tal como macaco-caranguejeiro, o último para determinar reatividade cruzada de espécie. Células B de poços contendo anticorpos de interesse podem ser imortalizadas por vários métodos incluindo fusão para fazer hibridomas ou a partir de poços individuais ou de poços combinados, ou por infecção com EBV ou transfecção por genes imortalizantes conhecidos e então emplacando em meio adequado. Alternativamente, células plasmáticas que secretam anticorpos únicas com as especificidades desejadas são então isoladas usando um ensaio de placa hemolítica específico para IGF-I/11 (Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sot USA 93:7843-48 (1996)). Células visadas para Iise preferivelmente são células sangüíneas vermelhas de ovelha (SRBCs) revestidas com o antígeno IGF-lilI.

Na presença de uma cultura de célula B contendo células plasmáticas secretando a imunoglobulina de interesse e complemento, a formação de uma placa indica Iise específica mediada por IGF-I/11 das células sangüíneas vermelhas de ovelha circundando a célula plasmática de interesse. A única célula plasmática específica de antígeno no centro da placa pode ser isolada e a informação genética que codifica a especificidade do anticorpo é isolada da única célula plasmática. Usando transcrição reversa seguida por PCR (RT-PCR), o DNA codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo pode ser clonado. Tal DNA clonado pode então ser adicionalmente inserido em um vetor de expressão adequado, preferivelmente uma gaveta de expressão tal como um pcDNA, mais preferivelmente um tal vetor pcDNA contendo os domínios constantes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina. O vetor gerado pode então ser transfectado em células hospedeiras, e.g., células HEK293, células CHO, e cultivado em meios nutritivos convencionais modificados como apropriado para induzir transcrição, selecionar transformantes, ou amplificar os genes codificando as seqüências desejadas.

Em geral, anticorpos produzidos pelos hibridomas fundidos foram cadeias pesadas de IgG2 humana com cadeias leves capa ou lambda completamente humanas. Anticorpos descritos neste lugar possuem cadeias pesadas de IgG4 humana assim como cadeias pesadas de IgG2. Anticorpos também podem ser de outros isotipos humanos, incluindo IgGI. Os anticorpos possuíram altas afinidades, tipicamente posseguindo um Kd de a partir de cerca de 10^6 até cerca de 10^12 M ou abaixo, quando medido por técnicas de fase sólida e fase de solução. Anticorpos posseguindo um Kd de pelo menos 10^11 M são preferidos para inibir a atividade de IGF-1/II.

Como será percebido, anticorpos anti-IGF-1/II podem ser expressos em linhagens celulares outras do que linhagens celulares de hibridoma. Seqüências codificando anticorpos particulares podem ser usadas para transformar uma célula hospedeira de mamífero adequada. Transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo empacotar o polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetor viral) e transduzir uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificado por Patente Norte- Americana Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, e 4.959.455 (cujas patentes são por aqui incorporadas neste lugar por referência). O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrana, precipitação por fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos, e microinjeção direta do DNA em núcleos.

Linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidos na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo mas não limitado a células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (e.g., Hep G2), células epiteliais de rim humano 293, e diversas outras linhagens celulares. Linhagens celulares de particular preferência são selecionadas determinando quais linhagens celulares têm altos níveis de expressão e produzem anticorpos com propriedades de ligação constitutiva de IGF-I/II.

Anticorpos anti-IGF-l/II são úteis na detecção de IGF-I/11 em amostras de pacientes e por conseguinte são úteis como diagnóstico para estados de doença como descrito neste lugar. Em adição, baseado em sua capacidade de neutralizar significantemente atividade de IGF-I/11 (como demonstrado nos Exemplos abaixo), anticorpos anti-IGFI/II têm efeitos terapêuticos para tratar sintomas e condições resultando de expressão de IGF- l/II. Em formas de realização específicas, os anticorpos e métodos neste lugar se referem ao tratamento de sintomas resultando de proliferação celular induzida por IGF-I/11. Formas de realização adicionais envolvem usar os anticorpos e métodos descritos neste lugar para tratar doenças incluindo doenças neoplásicas, tal como, melanoma, câncer de pulmão de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (de fígado), tumor de tireóide, câncer gástrico (de estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colo, tumores ginecológicos, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, e câncer pancreático. Outras condições de doença neoplásica podem incluir acromegalia e gigantismo, psoríase, osteoporose, técnicariosclerose e restenose de músculo liso de vasos sangüíneos, assim como diabete.

Administração Terapêutica e Formulações

Formas de realização da invenção incluem formulações farmacêuticas estéreis de anticorpos anti-IGF-1/II que são úteis como tratamentos para doenças. Tais formulações inibiriam a ligação de IGF-1/II a seu receptor IGF-1R, com isso tratando eficazmente condições patológicas onde, por exemplo, IGF-1/II de soro ou tecido é anormalmente elevado. Anticorpos anti-IGF-l/II preferivelmente possuem afinidade adequada para neutralizar potencialmente e preferivelmente têm uma duração adequada de ação para permitir dosagem infreqüente em humanos. Uma duração prolongada de ação irá permitir programas de dosagem menos freqüentes e mais convenientes por vias parenterais alternadas tal como injeção subcutânea ou intramuscular.

Formulações estéreis podem ser criadas, por exemplo, por filtração através de membranas estéreis de filtração, antes de ou seguindo liofilização e reconstituição do anticorpo. O anticorpo ordinariamente será armazenado em forma liofilizada ou em solução. Composições terapêuticas de anticorpos geralmente são colocadas em um recipiente tendo um porto de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa tendo um adaptador que permite recuperação da formulação, tal como um interruptor penetrável por uma agulha de injeção hipodérmica.

A via de administração de anticorpo está de acordo com métodos conhecidos, e.g., injeção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intrarterial, intratecal, inalação ou via intralesional, ou por sistemas de liberação sustentada como observado abaixo. O anticorpo é preferivelmente administrado continuamente por infusão ou por injeção única.

Uma quantidade eficaz de anticorpo a ser empregado terapeuticamente irá depender, por exemplo, dos objetivos terapêuticos, da via de administração, e da condição do paciente. Por conseguinte, é preferido que o terapeuta titule a dosagem e modifique a via de administração como requerido para obter o efeito terapêutico ótimo. Tipicamente, o médico irá administrar anticorpo até que seja atingida uma dosagem que atinge o efeito desejado. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por ensaios convencionais ou pelos ensaios descritos neste lugar.

Anticorpos, como descrito neste lugar, podem ser preparados em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Esta composição terapêutica pode ser administrada intravenosamente ou através do nariz ou pulmão, preferivelmente como um líquido ou aerossol em pó (liofilizado). A composição também pode ser administrada parenteralmente ou subcutaneamente se desejado. Quando administrada sistemicamente, a composição terapêutica deve ser estéril, livre de pirogênio e em uma solução parenteralmente aceitável respeitando pH, isotonicidade, e estabilidade. Estas condições são conhecidas por aqueles versados na técnica. Resumidamente, formulações de dosagem dos compostos descritos neste lugar são preparadas para armazenamento ou administração misturando o composto tendo o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes, ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis. Tais materiais são não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tal como TRIS 1-ICI, fosfato, citrato, acetato e outros sais de ácido orgânico; antioxidantes tal como ácido ascórbico; peptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de dez resíduos) tal como poliarginina, proteínas, tal como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tal como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, ou arginina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo celulose ou seus derivados, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; álcoois de açúcar tal como manitol ou sorbitol; contra-íons tal como sódio e/ou surfactantes não iônicos tal como TWEEN, PLURONICS ou polietilenoglicol.

Composições estéreis para injeção podem ser formuladas de acordo com prática farmacêutica convencional como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Por exemplo, dissolução ou suspensão do composto ativo em um veículo tal como água ou óleo vegetal que ocorre naturalmente como óleo de gergelim, amendoim, ou semente de algodão ou um veículo graxo sintético como etil oleato ou os semelhantes pode ser desejada. Tampões, conservantes, antioxidantes e os semelhantes podem ser incorporados de acordo com prática farmacêutica aceita.

Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo, cujas matrizes estão na forma de artigos, películas ou microcápsuías moldadas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (e.g., poli(2-hidroxietilmetacrilato) como descrito por Langer et al., Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 e Langer, Chem. Tech, (1982) 12:98-105, ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (Patente Norte-Americana No. 3.773.919, Patente Européia 58.481), copolímeros de L-ácido glutâmico e gama etil-Lglutamato (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556), etileno-vinil acetato não degradável (Langer et al., supra), copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tal como o LUPRON Depot' (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico (Patente Européia 133.988).

Embora polímeros tal como etileno-vinil acetato e ácido láctico-ácido glicólico possibilitem liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos mais curtos de tempo. Quando encapsuladas proteínas permanecem no corpo por um tempo maior, elas podem desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização de proteínas dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto como sendo formação de ligação S-S intermolecular através de troca de dissulfeto, estabilização pode ser atingida modificando resíduos de sulfidrila, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando teor de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições específicas de matriz de polímero.

Composições de liberação sustentada também incluem preparações de cristais do anticorpo suspensos em formulações adequadas capazes de manter cristais em suspensão. Estas preparações quando injetadas subcutaneamente ou intraperitonealmente podem produzir um efeito de liberação sustentada. Outras composições também incluem anticorpos capturados lipossomicamente. Lipossomos contendo tais anticorpos são preparados por métodos conhecidos por si: Patente Norte-Americana No. DE 3.218.121; Epstein et at, Proc. Natl. Acad. Set USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Set USA, (1980) 77:4030-4034; Patente Européia 52.322; Patente Européia 36.676; Patente Européia 88.046; Patente Européia 143.949; 142.641; Pedido de Patente Japonesa 83118008; Patente Norte-Americana Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e Patente Européia 102.324.

A dosagem da formulação de anticorpo para um dado paciente será determinada pelo médico responsável levando em consideração vários fatores conhecidos por modificarem a ação de drogas incluindo severidade e tipo de doença, peso corporal, sexo, dieta, tempo e via de administração, outras medicações e outros fatores clínicos relevantes. Dosagens terapeuticamente eficazes podem ser determinadas ou por métodos in vitro ou in vivo.

Uma quantidade eficaz dos anticorpos, descritos neste lugar, a ser empregada terapeuticamente irá depender, por exemplo, dos objetivos terapêuticos, da via de administração, e da condição do paciente. Por conseguinte, é preferido para o terapeuta titular a dosagem e modificar a via de administração como requerido para obter o efeito terapêutico ótimo. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 0,001 mg/kg até lOOmg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Tipicamente, o médico irá administrar o anticorpo terapêutico até que seja atingida uma dosagem que atinge o efeito desejado. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por ensaios convencionais ou como descrito neste lugar.

Será percebido que administração de entidades terapêuticas em conformidade com as composições e métodos neste lugar será administrada com carreadores adequados, excipientes, e outros agentes que são incorporados em formulações para fornecer transferência melhorada, liberação, tolerância, e os semelhantes. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geléias, ceras, óleos, lipídios, vesículas contendo lipídio (catiônico ou aniônico) (tal como Lipofectinina™), conjugados de DNA, pastas anidras de absorção, emulsões de óleo em água e água em óleo, carbowax em emulsões (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semi-sólidos, e misturas semi-sólidas contendo carbowax. Qualquer das misturas precedentes pode ser apropriada em tratamentos e terapias em conformidade com a presente invenção, contanto que o ingrediente ativo na formulação não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Veja também Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Mt. 1 Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts."

J Pharm Sci .89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" FDA J Pharm Sci Technol. 52:238- 311 (1998) e as citações nestes para informação adicional relacionada a formulações, excipientes e carreadores bem conhecidos por químicos farmacêuticos.

Concepção e Geração de Outros Terapêuticos

Em conformidade com a presente invenção e baseado na atividade dos anticorpos que são produzidos e caracterizados neste lugar com respeito a IGF-1/II, a concepção de outras modalidades terapêuticas é facilitada e descrita para alguém de verso na técnica. Tais modalidades incluem, sem limitação, terapêuticos de anticorpos avançados, tal como anticorpos biespecíficos, imunotoxinas, terapêuticos radiomarcados, e domínios V de anticorpos únicos, agente de ligação tipo anticorpo baseado em outras armações do que região V, geração de terapêuticos de peptídeos, terapias gênicas, particularmente intracorpos, terapêuticos antisentido, e moléculas pequenas.

Em conexão com a geração de terapêuticos de anticorpos avançados, onde fixação de complemento é um atributo desejável, pode ser possível contornar a dependência de complemento para assassinato de célula através do uso de biespecíficos, imunotoxinas, ou radiomarcadores, por exemplo.

Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser gerados que compreendem (i) dois anticorpos, um com uma especificidade para IGF-1/II e outro para uma segunda molécula, que são conjugados juntos, (ii) um único anticorpo que tem uma cadeia específica para IGF-1/II e uma segunda cadeia específica para uma segunda molécula, ou (iii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade tanto para IGF-1/11 como para a outra molécula. Tais anticorpos biespecíficos podem ser gerados usando técnicas que são bem conhecidas; por exemplo, em conexão com (i) e (ii) veja e.g., Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) e Wright and Harris, acima, e em conexão com (iii) veja e.g., Traunecker et al. Int. J. Câncer (Suppl.) 7:51-52 (1992). Em cada caso, a segunda especificidade pode ser feita se desejado. Por exemplo, a segunda especificidade pode ser feita para os receptores de ativação de cadeia pesada, incluindo, sem limitação, CD16 ou CD64 (veja e.g., Deo et al. 18:127 (1997)) ou CD89 (veja e.g., Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)).

Anticorpos também podem ser modificados para atuar como imunotoxinas utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Veja e.g., Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Veja também Patente Norte- Americana No, 5.194.594. Em conexão com a preparação de anticorpos radiomarcados, tais anticorpos modificados também podem ser prontamente preparados utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Veja e.g., Junghans et al. in Câncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafiier and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Veja também Patente Norte-Americana Nos. 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827, 5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471, e 5.697.902. Cada uma das imunotoxinas e moléculas radiomarcadas seria adequada para matar células expressando o domínio desejado de oligomerização de subunidade de enzima multimérica. Em algumas formas de realização, uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do anticorpo em associação com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável é fornecida.

Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-IGF-l/II é ligado a um agente (e.g., radioisótopo, composição farmacêutica, ou uma toxina). Preferivelmente, tais anticorpos podem ser usados para o tratamento de doenças, tais doenças podem se referir a células expressando IGF-l/II ou células superexpressando IGF-l/II. Por exemplo, é contemplado que a droga possui a propriedade farmacêutica selecionada a partir do grupo de antimitótica, alquilante, antimetabólito, antiangiogênica, apoptótica, alcalóide, COX-2, e agentes antibióticos e combinações destes. A droga pode ser selecionada a partir do grupo de mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosouréias, triazenos, análogos de ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabólitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, complexos de coordenação de platina, alcalóides de vinca, uréias substituídas, derivados de metil hidrazina, supressores de adrenocortical, antagonistas, endostatina, taxóis, camptotecinas, oxaliplatina, doxorubicinas e seus análogos, e uma combinação destes.

Exemplos de toxinas adicionais incluem gelonina, exotoxina de Pseudomonas (PE), PE40, PE38, toxina de difteria, ricina, abrina, alfa toxina, saporina, ribonuclease (RNase), DNase 1, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de fitolaca-americana, gelonina, endotoxina de Pseudornonas, assim como derivados, combinações e modificações das mesmas.

Exemplos de radioisótopos incluem emissores de gama, emissores de posítron, e emissores de raios-X que podem ser usados para localização e/ou terapia, e emissores de beta e emissores de alfa que podem ser usados para terapia. Os radioisótopos descritos previamente como úteis para diagnósticos, prognósticos e estadiamento também são úteis para terapêuticos. Exemplos não limitantes de agentes anticâncer ou antileucemia incluem antraciclinas tal como doxorubicina (adriamicina), daunorubicina (daunomicina), idarubicina, detorubicina, carminomicina, epirubicina, esorubicina, e morfolino e derivados substituídos, combinações e modificações das mesmas. Agentes farmacêuticos exemplares incluem cis- platina, taxol, caliqueamicina, vincristina, citarabina (Ara-C), ciclofosfamide, prednisona, daunorubicina, fludarabina, clorambucil, interferon alfa, hidroxiuréia, temozolornida, talidomida, e bleomicina, e derivados, combinações e modificações das mesmas. Preferivelmente, o anticâncer ou antileucemia é doxorubicina, morfolinodoxorubicina, ou morfolinodaunorubicina.

Como será percebido por alguém de verso na técnica, nas formas de realização acima, embora valores de afinidade possam ser importantes, outros fatores podem ser tão importantes ou mais, dependendo da função particular do anticorpo. Por exemplo, para uma imunotoxina (toxina associada com um anticorpo), o ato de ligação do anticorpo ao alvo pode ser útil; entretanto, em algumas formas de realização, é a internalização da toxina na célula que é o resultado final desejado. Como tal, anticorpos com um alto percentual de internalização podem ser desejáveis nestas situações. Assim, em uma forma de realização, anticorpos com uma alta eficiência em internalização são contemplados. Uma alta eficiência de internalização pode ser medida como um percentual de anticorpo internalizado, e pode ser de um valor baixo a 100%. Por exemplo, em formas de realização variadas, 0,1-5, 5- 10, 10-20, 20-30, 3040, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99, e 99-100% pode ser uma alta eficiência. Como será percebido por alguém de verso na técnica, a eficiência desejável pode ser diferente em formas de realização diferentes, dependendo, por exemplo, do agente associado, da quantidade de anticorpo que pode ser administrada a uma área, dos efeitos colaterais do complexo anticorpo-agente, do tipo (e.g., tipo de câncer) e da severidade do problema a ser tratado.

Em outras formas de realização, os anticorpos descritos neste lugar fornecem um kit de ensaio para a detecção de expressão de IGF-/III em tecidos ou células de mamíferos a fim de triar uma doença ou desordem associada com mudanças em expressão de IGF-I/II. O kit compreende um anticorpo que se liga a IGF-UII e meios para indicar a reação do anticorpo com o antígeno, se presente.

Em algumas formas de realização, um artigo de fabricação é fornecido compreendendo um recipiente, compreendendo uma composição contendo um anticorpo anti-IGF-l/II, e um inserto de empacotamento ou marcador indicando que a composição pode ser usada para tratar doença mediada por expressão de IGF-1/II. Preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente, um humano, recebe o anticorpo anti-IGF-1/II.

Combinações

Os anticorpos anti-IGF-l/II definidos acima podem ser aplicados como uma terapia única ou podem envolver, em adição ao composto da invenção, cirurgia convencional ou radioterapia ou quimioterapia. Tal quimioterapia pode incluir uma ou mais das seguintes categorias de agentes antitumor:-

(i) drogas antiproliferativas/antineoplásicas e combinações das mesmas, como usadas em oncologia médica, tal como agentes alquilantes (por exemplo cis-platina, carboplatina, ciclofosfamida, mostarda d nitrogênio, melfalana, clorambucil, busulfano e nitrosouréias); antimetabólitos (por exemplo antifolatos tal como fluoropirimidinas tipo 5-fluorouracil e tegafur, raltitrexede, metotrexato, citosina arabinosídeo e hidroxiuréia); antibióticos antitumour (por exemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina e mitramicina); agentes antimitóticos (por exemplo alcalóides de vinca tipo vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina e taxóides como taxol e taxotere); e inibidores de topoisomerase (por exemplo epipodofilotoxinas como etoposida e teniposida, amsacrine, topotecano e camptotecina);

(ii) agentes citostáticos tal como antiestrógenos (por exemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e iodoxifeno), supressores de receptor de estrógeno (por exemplo fulvestrante), antiandrógenos (por exemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida e acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH ou agonistas de LHRH (por exemplo goserelina, leuprorelina e buserelina), progestágenos (por exemplo acetato de megestrol), inibidores de aromatase (por exemplo como anastrozol, letrozol, vorazol e exemestano) e inibidores de 5a-redutase tal como finasterida;

(iii) agentes que inibem invasão de célula cancerosa (por exemplo inibidores de metaloproteinase como marimastate e inibidores de função de receptor de ativador de plasminogênio uroquinase);

(iv) inibidores de função de fator de crescimento, por exemplo tais inibidores incluem anticorpos de fator de crescimento, anticorpos de receptor de fator de crescimento (por exemplo o anticorpo anti-erbb2 trastuzumabe [Herceptin™l e o anticorpo anti-erbbl cetuximabe [C225)), inibidores de farnesil transferase, inibidores de MEK, inibidores de tirosina quinase e inibidores de serina/treonina quinase, por exemplo inibidores da família de fator de crescimento epidérmico (por exemplo inibidores de tirosina quinase da família EGFR tal como N-(3-cloro-4- fluorofenil)-7-metoxi-6-(3- morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinibe, AZDl 839), N-(3- etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinibe, 051- 774) e 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil-7-(3- morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (Cl 1033)), por exemplo inibidores da família de fator de crescimento derivado de plaqueta e por exemplo inibidores da família de fator de crescimento de hepatócito;

(v) agentes antiangiogênicos tal como aqueles que inibem os efeitos de fator de crescimento endotelial vascular, (por exemplo o anticorpo anti-fator de crescimento endotelial vascular bevacizumabe [Avasfin"T1"9, compostos tal como aqueles descritos em Pedidos de Patente Internacional WO 97122596, WO 97/30035, WO 97/32856 e WO 98/13354) e compostos que atuam por outros mecanismos (por exemplo linomide, inibidores de função integrina ανβ3; angiostatina e inibidores da ação de angiopoietinas e.g angiopoietina 1 e angiopoietina 2);

(vi) agentes de dano vascular tal como Combretastatina A4 e compostos descritos em Pedidos de Patente Internacional WO 99/02166, W000/40529, WO 00/41669, W001/92224, W002/04434 e W002/08213;

(vii) terapias antisentido, por exemplo aquelas que são direcionadas para os alvos listados acima, tal como ISIS 2503, um antisentido anti-ras;

(viii) abordagens de terapia gênica, incluindo por exemplo abordagens para substituir genes aberrantes tal como p53 aberrante ou BRCAI ou BRCA2 aberrante, abordagens GDEPT (terapia com pró-fármaco de enzima dirigia por gene) tal como aquelas usando citosina desaminase, timidina quinase ou uma enzima nitrorredutora bacteriana e abordagens para aumentar tolerância de paciente a quimioterapia ou radioterapia tal como terapia gênica de resistência a múltiplas drogas;

(ix) abordagens imunoterapêuticas, incluindo por exemplo abordagens ex-vivo e in-vivo para aumentar a imunogenicidade de células tumorosas de paciente, tal como transfecção com citocinas tal como interleucina 2, interleucina 4 ou fator estimulante de colônia de granulócito e macrófago, abordagens para diminuir energia de célula T, abordagens usando células imunes transfectadas tal como células dendríticas transfectadas com citocina, abordagens usando linhagens de células tumorosas transfectadas com citocina e abordagens usando anticorpos anti-idiotípicos;

(x) inibidores de ciclo celular incluindo por exemplo inibidores de CDK (eg flavopiridol) e outros inibidores de pontos de controle de ciclo celular (eg quinase de ponto de controle); inibidores de aurora quinase e outras quinases envolvidas em mitose e regulação de citocinese (eg cinesinas mitóticas); e inibidores de histona desacetilase;

(xi) antagonistas de endotelina, incluindo antagonistas de endotelina A, antagonistas de endotelina B e antagonistas de endotelina A e B; por exemplo ZD4054 e ZD1611 (Patente Internacional 96 40681), atrasentan e YM598; e (xii) abordagens terapêuticas bioterapêuticas por exemplo aquelas que usam peptídeos ou proteínas (tal como anticorpos ou construções solúveis de domínio de receptor externo) que ou seqüestram ligantes de receptor, bloqueiam ligação de ligante a receptor ou diminuem sinalização de receptor (e.g. devido a degradação estimulada de receptor ou níveis de expressão diminuídos).

Tal tratamento conjugado pode ser atingido através da dosagem simultânea, seqüencial ou separada dos componentes individuais do tratamento. Tais produtos de combinação empregam os compostos da mesma invenção dentro da variação de dosagem descrita acima e o outro agente farmaceuticamente ativo dentro de sua variação de dosagem aprovada. EXEMPLOS

Os exemplos seguintes, incluindo os experimentos conduzidos e resultados atingidos são fornecidos para propósitos ilustrativos apenas e não são para serem interpretados como limitando as instruções neste lugar.

EXEMPLO 1

Imunização e TITULAÇÃO

Imunização

IGF-I e IGF-II humano recombinante obtidos a partir R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN Cat. No. 2917Gl e 292-G2 respectivamente) foram usados como antígenos. Anticorpos monoclonais contra IGF-1/II foram desenvolvidos imunizando seqüencialmente camundongos XenoMouse® (linhagens XMG2 e XMG4 (linhagem 3C-1) de XenoMouse, Abgenix, Inc. Fremont, CA). Animais de XenoMouse foram imunizados através da via de coxim plantar para todas as injeções. O volume total de cada injeção foi 50 μl por camundongo, 25 μl por coxim plantar. Um total de dez (10) camundongos foram imunizados em cada grupo. Cada injeção foi com 10 ps por camundongo de IGF-I ou IGF-II apenas ou conjugado a antígeno de Hemocianina de caramujo Megathura crenulata (KLH) como um carreador, como detalhado em Tabela 2. A primeira injeção foi constituída em Dulbecco's PBS (DPBS) e misturada 1:1 v/v com Adjuvante Titermax Gold (SIGMA Cat. #T2684, lote 410599). Um total de 8 a 11 reforços adicionais foram então administrados por um período de 27 a 38 dias, misturados com 25 ug de Adju-Phos (gel de fosfato de alumínio, Catálogo # 1452- 250, grupo #8937, HO Biosector) e 10 pg de CpG (15 IAl de hnmunEasy Mouse Adjuvant, catálogo # 303101; lote #11553042; Qiagen) por camundongo, suido por um reforço final de 10 μg de antígeno em DPBS livre de pirogênio, sem adjuvante. Para imunização combinada (animais imunizados tanto com IGF-1 como IGF-1I), o segundo antígeno foi dado nos últimos dois (2) reforços.

TABELA 2. RESUMO DE IMUNIZAÇÃO

<table>table see original document page 61</column></row><table>

EXEMPLO 2

RECUPERAÇÃO DE LINFÓCITOS, ISOLAMENTOS DE CÉLULA B,

FUSÕES E GERAÇÃO DE MBRIDOMAS

Camundongos imunizados foram sacrificados por deslocamento cervical, e os linfonodos de drenagem coletados e combinados de cada cohorte. As células linfóides foram dissociadas esmerilhando em DMEM para liberar as células dos tecidos e as células foram suspensas em DMEM. .As células foram contadas, e 0,9 ml de DMEM por 100 milhões de linfócitos adicionados ao pélete celular para ressuspender as células levemente mas completamente. Usando 100 de CD90+ microesferas magnéticas por 100 milhões de células, as células foram marcadas incubando as células com as microesferas magnéticas a 4°C por 15 minutos. A suspensão celular magneticamente marcada contendo até 10 células positivas (ou até 2x10^9 de células totais) foi carregada em uma coluna LS+ e a coluna lavada com DMEM. O efluente total foi coletado como a fração negativa para CD90 (era esperado que a maioria destas células fosse células B).

A fusão foi realizada misturando células β enriquecidas lavadas de acima e células de mieloma não secretor P3X63Ag8.653 adquiridas a partir de ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) em uma proporção de 1:1. A mistura celular foi levemente peletizada por centrifugação a 800 x g. Depois de remoção completa do sobrenadante, as células foram tratadas com 2-4 mL de solução de Pronase (CalBiochem, cat. # 53702; 0,5 mg/ml em PBS) por não mais do que 2 minutos. Então 3-5 ml de FBS foi adicionado para parar a atividade enzimática e a suspensão foi ajustada para 40 ml de volume total usando solução de fusão de célula elétrica, (ECFS, 0,3M de Sucrose, Sigma, Cat# S7903, 0,lmM de Acetato de Magnésio, Sigma, Cat# M2545, 0,lmM de Acetato de Cálcio, Sigma, Cat# C4705). O sobrenadante foi removido depois de centrifugação e as células foram ressuspensas em 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavagem foi repetida e as células de novo foram ressuspensas em ECFS para uma concentração de 2x10^6 células/ml.

Fusão de célula elétrica foi realizada usando um gerador de fusão (modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego5 CA). O tamanho de câmara de fusão usado foi de 2,0 ml, usando as seguintes configurações instrumentais:

Condição de alinhamento: voltagem: 50 V, tempo: 50.s. Rompimento de membrana a: voltagem: 3000 V, tempo: 30 μs

Tempo de retenção após fusão: 3 s

Depois de ECF, as suspensões celulares foram cuidadosamente removidas da câmara de fusão em condições estéreis e transferidas para um tubo estéril contendo o mesmo volume de Meio de Cultura de Hibridoma (DMEM, JRI-I Biosciences), 15 % de FBS (Hyclone), suplementado com L- glutamina, penicilina/estreptavidina, OPT (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (um de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). As células foram incubadas por 15-30 minutos a 37°C, e então centrifugadas a 400 χ g (1000 rpm) for cinco minutos. As células foram levemente ressuspensas em um pequeno volume de Meio de Seleção de Hibridoma (Meio de Cultura de Hibridoma suplementado com 0,5x HA (Sigma, cat. # A9666)), e o volume apropriadamente ajustado com mais Meio de Seleção de Hibridoma, baseado em um emplacamento final de 5x106 de células B totais por placa de 96 poços e 200 por poço. As células foram misturadas levemente e pipetadas em placas de 96 poços e permitidas crescer. Em dia 7 ou 10, metade do meio foi removida, e as células re-alimentadas com Meio de Seleção de Hibridoma.

EXEMPLO 3

SELEÇÃO DE ANTICORPOS CANDIDATOS POR ELISA

Depois de 14 dias de cultura, sobrenadantes de hibridomas foram triados para anticorpos monoclonais específicos de IGF-1/II. As placas de ELISA (Fisher, Cat. No. 12-565136) foram revestidas com 50 μl/poço de IGF-1 ou IGF-1I humano (2 μg/mL) em Tampão de Revestimento (0,1 M de Tampão Carbonato, pH 9,6, NaHCO3 8,4 g/L), então incubadas a 4°C durante a noite. Depois de incubação, as placas foram lavadas com Tampão de Lavagem (0,05% de Tween 20 em PBS) 3 vezes. 200 μ1/poço de Tampão de Bloqueio (0,5% de BSA, 0,1% de Tween 20, 0,01% de Timerosal em Ix PBS) foram adicionados e as placas incubadas em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de incubação, as placas foram lavadas com Tampão de Lavagem três vezes. 50 ul/poço de sobrenadantes de hibridomas, e controles positivos e negativos foram adicionados e as placas incubadas em temperatura ambiente por 2 horas.

Depois de incubação, as placas foram lavadas três vezes com Tampão de Lavagem. 100 μl/poço de anticorpo de detecção anti-hulgGFc- HRP de cabra (Ca hag, Cat. No. H10507), foi adicionado e as placas incubadas em temperatura ambiente por 1 hora. Em uma triagem secundária, os positivos em primeira triagem foram triados em dois conjuntos, um para detecção de IgG humana (cadeia pesada) e o outro para detecção de cadeia leve capa de Ig humana (anti-hlg capa-HRP de cabra (Southern Biotechnology, Cat. No. 2060-05) a fim de demonstrar composição completamente humana tanto para IgG como Ig capa. Depois de incubação, as placas foram lavadas três vezes com Tampão de Lavagem. 100 μl/poço de TMB (BioFX Lab. Cat. No. TMSK-0100-01) foram adicionados e as placas permitidas desenvolver por cerca de 10 minutos (até que os poços de controle negativo dificilmente começaram a apresentar cor). 50 μl/poço de solução de parada (Solução de parada TMB, (BioFX Lab. Cat. No. STPR-0100-01) foi então adicionada e as placas lidas em um leitor de placa de ELISA em 450nm. Como indicado em Tabela 3, houve um total de 1.233 poços contendo anticorpos contra IGF-1 e -II.

Todos os anticorpos que se ligaram no ensaio ELISA foram contra-triados para ligação a insulina por ELISA a fim de excluir aqueles que reagiram de forma cruzada com insulina. As placas de ELISA (Fisher, Cat. No. 12-565-136) foram revestidas com 50 μΐ/poço de insulina recombinante (concentração: 1µg/ml; Sigma, catálogo # 12643) em Tampão de Revestimento (0,1 M de Tampão Carbonato, pH 9,6, NaHCO3 8:4 g/L), então incubadas a 4°C durante a noite. Como detalhado em Tabela 3, um total de 1.122 anticorpos dos 1233 anticorpos originais não reagiu de forma cruzada com insulina. TABELA 3. RESUMO DE TRIAGEM

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Finalmente, os anticorpos que foram selecionados na contra- triagem foram então testados por ELISA para confirmar ligação a proteínas IGF-I e IGF-II de camundongo. Um total de 683 linhagens de hibridoma foram identificadas que têm reatividade cruzada com IGF-I/11 de camundongo. Por conseguinte, estas linhagens de hibridoma expressaram anticorpos que se ligaram a IGF-I humano, IGF-II humano, IGF-I de camundongo e IGF-II de camundongo, mas não se ligaram a insulina humana.

EXEMPLO 4

INIBIÇÃO DE LIGAÇÃO DE IGF-I E IGF-1IA IGF-1R

O propósito deste estudo foi triar os 683 anticorpos IgG2 e IgG4 humanas anti-IGF-l/II no estágio de sobrenadante de hibridoma para neutralizar atividade, como determinado por inibição de ligação de IGF-1 e IGF-II ao receptor IGF-1R. Assim, um ensaio de ligação de receptor/ligante foi realizado com células NIH3T3 que superexpressam o receptor IGF-IR humano, como descrito abaixo.

Resumidamente, placas de filtro Multi Screen (Multi Screen 0,65 μΜ PVDF de 96 poços, Millipore, Cat. No. MADV NOB 10) foram bloqueadas com Tampão de Bloqueio (PBS contendo 10% de BSA com 0,02% de NaN3) a 200μL/ροςο durante a noite a 4°C. IGF marcado com [125I] (Amersham Life Sciences Cat No. IMl72 (IGF-1) ou 1M238 (IGF-II)) a 100μCi/ml e 50nM foi diluído para a concentração apropriada (70pM final para IGF--I e 200pM final para IGF-II) em tampão de ligação (PBS contendo 2% de BSA com 0,02% de NaN3). A placa de filtro revestida com Tampão de Bloqueio foi lavada uma vez com 200uL de PBS, e 50μL, de sobrenadantes Ab anti-IGFI/II (diluído em tampão de ligação para 25% de volume final) foram pré-incubados com 25μL, de [2251]-IGF na placa MultiScreen por 30-60 minutos em gelo. Fibroblastos subconfluentes NIII3T3 de camundongo expressando estavelmente hIGF-1R (obtidos a partir AstraZeneca) foram coletados com tripsina e ressuspensos em tampão de ligação gelado a 6xlOó/ml, e 25 μL. de células foram adicionados à placa para uma incubação de duas horas em gelo. A placa foi lavada quatro vezes com 200μΙ, de PBS gelado e seca durante a noite. Vinte e cinco μL/poço de cintilante (coquetel SuperMix, Wallac/Perkin Elmer Cat No. 1200-439) foi adicionado e as placas foram lidas usando um leitor Microbeta Trilux (Wallac).

Os controles seguintes foram usados por placa de triagem: nenhum anticorpo (IGF total ligado), anti-IGF-1 neutralizante de controle (#05-172, Upstate) ou mAbs anti-IGF-11 (#MAB292, R&D Systems) a 50μg/ml (histórico não específico) e 0,075 a 0,5 µg/ml (valores aproximados de EC50 dos anticorpos neutralizantes), e IgG2 humana de controle isotipo- pareada (PK16.3.1, Abgenix, lot #360-154) ou mAbs IgG4 (108.2.1, Abgenix, lote 4718-53A) em uma concentração de 0,5 µg/ml (valor aproximado de EC50 de anticorpos neutralizantes). Uma titulação adicional de anticorpos neutralizantes de controle e anticorpos humanos de controle isotipo-pareados foi adicionada a uma placa por ensaio de triagem (1/10 diluição serial de 50 μg/ml (333,3nM)). Todos os controles com ou sem anticorpos foram preparados em tampão de ligação suplementado com IgG2 humana anti-KLH ou sobrenadante esgotado de IgG4 em 25% de volume final.

A porcentagem de inibição foi determinada como sue:

% de Inibição= ([(CPM Total Médio '25"1-IGF ligado)- (COM Médio 25I-IGF ligado na presença de anticorpo)] / ((CPM Total Médio 125I- IGF ligado)-(CPM Médio. 1251-IGF ligado na presença de um excesso de anticorpo neutralizante de controle*)]) x1,00

* o histórico não específico foi determinado como CPM de células com um excesso de mAb anti-IGF neutralizante de controle (50ug/ml, 333,3nM), que foi encontrado como sendo equivalente a um excesso de IGF gelado (menos do que ou igual a 10% de CPM total)

A triagem de sobrenadante de anti-IGF-1/11 foi separada por isotipo por causa de questões de disponibilidade de ligante radiomarcado. Como mostrado em Tabela 4, sobrenadantes dos anticorpos anti-IGF-1/11 com um isotipo IgG2 (293 total) foram primeiro triados contra IGF-I radiomarcado. Um valor de corte em 40% de inibição foi inicialmente aplicado a esta triagem (i.e. linhagens de hibridoma inibindo em 40% e acima foram selecionadas), e 111 acertos foram selecionados para triagem subseqüente contra IGF-II. Dos 111 acertos, um total de 91 linhagens foram encontradas inibindo ligação de IGF-II a seu receptor com um valor de corte de 50%. Um total de 71 acertos finais foram selecionados adotando sobrenadantes que neutralizaram 50% de atividade tanto de IGF-I como de IGF-II.

Todos os sobrenadantes expressando isotipos IgG4 (390 total) foram inicialmente triados contra IGF-II radiomarcado, e 232 acertos com um valor de corte em 50% de inibição foram subseqüentemente triados contra IGF-1. Um total de 90 linhagens foram capazes de inibir ligação de IGF-I a seu receptor com um valor de corte de 50%. Depois de combinar os acertos para IgG2 (71) e IgG4 (90), um total de 161 linhagens foram obtidas que inibiram IGF-1e IGF-1I em 50% ou mais.

Em conclusão, dos 683 sobrenadantes originais, 343 (111 de IgG2 e 232 de IgG4, 50,2%) foram selecionados a partir da primeira triagem ou com IGF-I ou IGF-II. Um total de 161 acertos finais foram obtidos (23,6% de linhagens originais), que são capazes de bloquear tanto ligação de IGF-1 como IGF-11 a IGF-1R com um critério de corte geral de 50% de inibição. TABELA 4. RESUMO DE TRIAGEM DE SOBRENADANTE ESGOTADO DE ANTI-IGF-1/1 (50% DECORTE)

<table>table see original document page 69</column></row><table> EXEMPLO 5

ELISAS COM MUITO ANTÍGENO E ANTÍGENO LIMITADO

A fim de determinar as afinidades relativas entre as 161 linhagens de hibridoma selecionadas em exemplo 4, assim como a concentração de anticorpo nos sobrenadantes de cada linhagem, ensaio ELISA com muito antígeno (HA) e antígeno limitado (LA) foram realizados. No ensaio de quantificação HA, a alta concentração de antígeno e incubação durante a noite limitam o efeito de afinidade de anticorpo, permitindo quantificação da quantidade relativa de anticorpo específico de antígeno presente em cada amostra. A baixa concentração de antígeno no ensaio LA limita o efeito de concentração de anticorpo e resulta em um ranqueamento de anticorpos baseado em sua afinidade relativa.

Ensaio de Quantificação de Muito Antígeno Placas de ELISA foram revestidas com quantidades relativamente grandes ou de antígeno IGF-I ou IGF-II (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN Cat. No. 291-Gl e 292-G2 respectivamente) a 500ng/ml (67nM). Sobrenadantes de hibridomas contendo anticorpo foram titulados por uma variação de diluição de 1:50 a 1:12200. Um controle de um anticorpo específico de IGF conhecido (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN Cat. No. MAB291 e MAB292 respectivamente) foi usado para definir a variação linear do ensaio. Dados dentro da variação linear foram então usados para derivar a concentração relativa do anticorpo específico de IGF em cada amostra titulada.

Ensaio de Antígeno Limitado

Placas de microtítulo foram revestidas com baixas concentrações de antígeno. Cinqüenta microlitros (50 μί) de IGF-I ou IGF-II a 64, 32, 16, 8, 4, e 2 ng/ml (cobrindo um intervalo de 8,5 nM a 0,26 nM) em 1% de leite desnatado I IX PBS pH 7,4 / 0,5% de azida foi adicionado a cada poço. A placa foi incubada por 30 minutos. Placas foram lavadas quatro vezes (4X) com água, e 5 OuL de sobrenadante de hibridoma contendo anticorpos de teste diluídos 1:25 em 1% de leite desnatado / IX PBS pH 7,4 / 0,5% de azida foram adicionados aos poços. Placas foram envoltas estreitamente com capa plástica ou película de parafina, e incubadas durante a noite com agitação em temperatura ambiente.

No dia seguinte, todas as placas foram lavadas cinco vezes (5X) e 50 μΐ, de anticorpo policlonal anti-IgG humana Fe I-IRP de cabra em uma concentração de 0,5 ug/ml em 1% de leite, IX PBS pH 7,4 foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente.

Placas, foram lavadas pelo menos cinco vezes (5X com água de torneira). Cinqüenta microlitros (50) pL de substrato de HPR TMB foi adicionado a cada poço, e a placa foi incubada por 30 minutos. A reação de HRP-TMB foi parada adicionando 50 ut de IM de ácido fosfórico a cada poço. Densidade ótica (absorbância) em 450 nm foi medida para cada poço da placa.

Análise de dados

Foi tirada a média de valores de OD de anticorpos de teste e a variação foi calculada. Anticorpos com o maior sinal e desvio padrão aceitavelmente baixo foram selecionados como anticorpos tendo uma maior afinidade para o antígeno do que teve um anticorpo de referência.

Foi feita uma análise para selecionar melhores anticorpos baseado ou em neutralização (Exemplo 4), potência (baixa concentração de anticorpo como determinado por ELISA HA e alta inibição de ligação de ligante), afinidade (ELISA LA), ou todos os três critérios. A partir desta análise, uma lista de 25 anticorpos foi gerada. Uma análise separada baseada em % de inibição média de ligação de IGF-I e -II e afinidade tanto para IGF- 1 como IGF-II gerou uma segunda lista de 25 anticorpos. Dezesseis anticorpos foram comuns a ambas as listas, resultando em uma lista final de 40 anticorpos. Os resultados de LA e HA para estes 40 anticorpos estão resumidos em Tabela 5. Estas 40 linhagens foram selecionadas para clonagem, das quais 33 foram clonadas com sucesso.

TABELA 5. RESULTADOS DE ELISA COM MUITO E LIMITADO ANTÍGENO PARA 40 MELHORES ANTICORPOS

<table>table see original document page 72</column></row><table> EXEMPLO 6

LIGAÇÃO DE ANTICORPOS A IGF-I E IGF-II LIGADO AIGFBP-3

IGF-I e -II circulam no soro principalmente ligados a proteínas de ligação de IGF (IGFBPs). Um objetivo foi identificar anticorpos que não reconhecem IGFs em complexo com IGFBPs, a fim de evitar depleção in vivo de anticorpos anti-IGF. O formato de ensaio seguinte foi desenvolvido para a caracterização de anticorpos que reconhecem IGF-I ou IGF-Il quando estes fatores de crescimento estão complexados com IGFBP- 3. Especificamente, este ensaio testou a capacidade de IGF em complexos de IGF/anticorpo anti-IGF de se ligar a IGFBP-3.

Bloqueio Mediado por Anticorpo de Captura de IGF por IGFBP-3

Um ensaio foi desenvolvido caracterizado pelo fato de que complexos foram pré-formados entre IGF-I ou IGF-II e anticorpos específicos de IGF dos exemplos mencionados acima. A capacidade destes complexos de se ligar a IGFBP-3 foi testada usando tecnologia de ensaio AlphaScreen (PerkinElmer). Em uma placa de 384 poços, 10 uL de sobrenadantes de hibridomas 1:20 diluídos foram misturados com 10 RL de 3 nM de IGF-I ou IGF-II biotinilado e incubada em temperatura ambiente por 2 horas. Microesferas doadoras de AlphaScreen revestidas com estreptavidina e microesferas aceptoras de AlphaScreen acopladas a IGFBP-3 (10 uL de uma mistura, para uma diluição final 1/60 dos sobrenadantes de hibridomas) foram adicionadas, e a incubação foi continuada por outra hora. Amostras foram então lidas em um leitor de placa Packard Fusion.

Três anticorpos monoclonais anti-IGF comercialmente disponíveis M23 (Cell Sciences), 05-172 (Upstate) e MAB29I (R&D Systems) mostraram diferentes capacidades de inibir ligação de IGF a IGFBP com valores de E50 variando de baixo ng/mL a 100 ng/mL. Nenhuma inibição de ligação de IGF-I ao IGFBP-3 foi observada com irrelevante IgG de camundongo e IgG humana até 10 μg/mL, sugerindo que o efeito de anti- IGF-I é específico. Anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis 05- 166 (Upstate) e MAB292 (R&D) mostraram uma diferença significante em afinidade por inibição de interações IGF-II / IGFBP-3. Estes experimentos mostram que mAbs anti-IGF podem bloquear a ligação de IGF a IGFBP-3, gerando um ensaio que pode ser usado para triar anticorpos purificados de linhagens de hibridoma.. A etapa seguinte foi avaliar os efeitos de meio de hibridoma esgotado no sinal de ensaio.

Diluições seriais do meio de hibridoma e sobrenadantes esgotados de hibridoma anti-KLH foram testadas no sistema de ensaio. Quando sobrenadantes de hibridomas foram diluídos 1:10 em preparação para pré-incubação com IGFI/II (diluição final no ensaio foi 1:60), não houve quase nenhum efeito nos resultados de ensaio. Baseado nestes dados, sobrenadantes de hibridomas foram diluídos para pré-incubação com IGF, fornecendo a diluição final preferida de 1/60 de diluição no ensaio.

Seiscentos e oitenta e três sobrenadantes esgotados positivos para ligação de IGF-I e IGFII foram examinados para sua capacidade de inibir ligação de IGF a IGFBP-3. Inibição acima 50% para IGF-I e acima 60% para IGF-II foram usadas como critérios de corte. Os resultados resumidos da triagem usando estes cortes são mostrados em Tabela 6.

TABELA 6. NÚMEROS DE ACERTOS POSITIVOS IDENTIFICADOS NA TRIAGEM

<table>table see original document page 74</column></row><table>

O ensaio de competição de IGFBP usando o ensaio AlphaScreen identificou 87 amostras inibindo ligação de IGF-I a IGFBP-3 e 129 amostras inibindo ligação de IGF-II a IGFBP-3 dentre 683 sobrenadantes testados. Cinqüenta e uma amostras demonstraram competição dual de IGF-I e IGF-H. Entretanto, a fim de reproduzir mais cuidadosamente a função ou comportamento dos anticorpos in vivo, onde o IGF e o complexo IGFBP seriam amplamente pré-formados, ensaios adicionais, como descrito em exemplo 8 foram realizados.

EXEMPLO 7

DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPO ANTI-IGF-I E IGF- 11 USANDO ANÁLISE BIACORE (TRIAGEM DE BAIXA RESOLUÇÃO) Triagem de baixa resolução de 34 Anticorpos Monoclonais Purificados

A ressonância de plasmônio de superfície (SPR) livre de marcador, ou Biacore, foi utilizada para medir a afinidade de anticorpo para o antígeno. Para este propósito, uma superfície de anticorpo de cabra anti- humano de alta densidade ao longo de um chip CM5 Biacore foi preparada usando acoplamento de amina de rotina. Todos os mAbs foram diluídos para aproximadamente 20 μg/ml em HBS-P tampão de corrida contendo 100 μg/ml de B SA. Cada mAb foi capturado em uma superfície separada usando um tempo de contato de 30 segundos a 10 μί/ηιϊη., e uma lavagem de 5 minutos para estabilização da linha de base de mAb.

IGF-I foi injetado a 335,3 nM por todas as superfícies a 23°C por 120 segundos, suido por uma dissociação de 5 minutos, usando uma vazão de 100 μΕ/ιηϊη. As amostras foram preparadas no HBS-P tampão de corrida descrito acima. As superfícies foram regeneradas depois de cada ciclo de captura/injeção com um pulso de 15 segundos de 146mM de ácido fosfórico (pH 1,5). Os mesmos ciclos de captura/injeção foram repetidos para cada anticorpo com 114.7 nM IGF-11. Dado de ligação com desvio corrigido para os 34 mAbs foi preparado subtraindo o sinal de uma célula de fluxo de controle e subtraindo o desvio de linha de base de um tampão injetado justo antes de cada injeção de antígeno. Dados foram ajustados globalmente para um modelo de interação 1:1 usando CLAMP para determinar a cinética de ligação (David G. Myszka and Thomas Morton (1998) "CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program," TIES 23, 149-150). Um coeficiente de transporte de massa foi usado para ajustar os dados. Os resultados de análise cinética de ligação de IGF-I e IGF-II a 25°C são listados em Tabela 7 abaixo. Os mAbs são ranqueados da maior para a menor afinidade.

TABELA 7. TRIAGEM BIACORE DE BAIXA RESOLUÇÃO DE IGF-I E

IGF-11 DE 3 4ANTICORPOS MONOCLONAIS

<table>table see original document page 76</column></row><table>

Dados de Ligação de IGF-I

A maioria dos mAbs se ajustou a um modelo 1:1 razoavelmente bem. MAbs 4.90.2 e 4.141.1 foram caracterizados por dados extremamente complexos. Estes mAbs foram listados com um asterisco em Tabela 7 porque nenhuma constante cinética significante pode ser estimada a partir do ajuste de modelo 1:1. A última fase de taxa de dissociação mostrou ser muito lenta para ambos destes mAbs (pelo menos 1 X 10-5 s-1), o que torna estes dois mAbs úteis como compostos terapêuticos.

Dados de Ligação de IGF-1I

A maioria dos mAbs se ajusta a um modelo 1:1 razoavelmente bem. A taxa de dissociação para mAb 7.159.2 foi mantida constante a 1 X 10" s-1 porque não houve dados suficientes de decaimento para estimar adequadamente kd.

Os estudos Biacore de baixa resolução neste exemplo são concebidos como uma abordagem semiquantitativa de ranqueamento. A fim de adquirir informação mais acurada considerando as características taxas constantes e afinidades de mAbs individuais, estudos Biacore de alta resolução foram realizados como descrito em Exemplo 8.

EXEMPLO 8

DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPO ANTI-IGF-I E IGF- 1I USANDO ANÁLISE BIACORE (TRIAGEM DE ALTA RESOLUÇÃO)

Uma análise Biacore de alta resolução foi realizada para medir adicionalmente a afinidade de anticorpo para o antígeno. mAbs 7.159.2, 7.234.2, 7.34.1, 7.251.3, e 7.1602 foram cada capturados e os antígenos IGF-I e IGF-11 foram cada injetados em uma variedade de concentrações. As constantes de ligação resultantes estão listadas em Tabela 8.

TABELA 8. AFINIDADE DE ANTICORPO ANTI-IGF DETERMINADA POR ANÁLISE BIACORE DE BAIXA E ALTA RESOLUÇÃO

<table>table see original document page 77</column></row><table> Assim, formas de realização da invenção podem incluir um anticorpo QUE irá se ligar preferencialmente a 1GF-II, mas não irá reagir de forma cruzada com IGF-1, se ligando a IGF-II com maior afinidade do que a IGF-1. Por exemplo, o anticorpo pode se ligar a IGF-II com 2,5 vezes maior afinidade do que a IGF-1. Em certas formas de realização, o anticorpo pode se ligar a IGF-II com pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 25, pelo menos 50 ou pelo menos 150 vezes maior afinidade do que a IGFI.

Triagem de Complexos IGF-l/GFBP-3 Pré-formados

O ensaio de competição de IGFBP descrito em exemplo 6 identificou 87 amostras inibindo ligação de 1GF-1 a IGFBP-3 e 129 amostras inibindo ligação de IGF-11 a IGFBP-3 dentre 683 sobrenadantes testados. Cinqüenta e uma amostras demonstraram competição dual de IGF-I e 1GF-II. Entretanto, a fim de reproduzir mais cuidadosamente a função ou comportamento dos anticorpos in vivo, onde o IGF e o complexo IGFBP seriam amplamente pré-formados, os seguintes ensaios Biacore foram realizados em anticorpos selecionados.

Seis anticorpos selecionados foram triados para determinar se eles se ligam a IGF-I ou IGF-II em complexo com IGFBP. Todos os seis dos mAbs selecionados (7.159.2, 7.146.3, 7.34.1, 7.251.3, 7,58.3, e anticorpo de controle não relacionado ABX-MA1) foram covalentemente imobilizados para uma capacidade de superfície alta (5,400-12,800 RUs) em dois chips CMS Biacore usando acoplamento de amina de rotina com um instrumento Biacore 2000. Uma célula de fluxo em cada chip CMS foi ativada e bloqueada (nenhum mAb imobilizado) para uso como uma superfície de controle.

Em seguida, IGF-I e IGFBP-3 foram misturados juntos em salina tamponada Hepes, pH 7,4, 0,005% de P-20, 100 pg/ml de BSA (HBS- P), para fazer uma solução final de 193 nM e 454 nM, respectivamente. 10E- II e IGFBP-3 foram misturados juntos para fazer uma solução final de 192 nM e 455 ηΜ, respectivamente. Nestas condições, IGF-1 e IGF-1I foram 99,97% complexados por IGFBP-3. Equilíbrio foi atingido dentro de minutos nestas condições. Soluções de 1GF-I/IGFBP-3 e IGF-1I/IGFBP-3 complexados foram passadas através de várias superfícies de mAb a 40 µL/min e 23 °C, por 180 segundos e dissociação foi seguida por 120 segundos. IGF-1 e IGF-1I não complexados foram então passados através de cada superfície a 193 nM e 192 nM, respectivamente, e IGFBP-3 foi passado através de cada superfície a 454 nM. As superfícies foram regeneradas com um pulso de 20 segundos de 10 mM de glicina, pH 2,0.

Os sensorgramas foram processados usando o programa Scrubber subtraindo a mudança de índice refrativo de volume e qualquer sinal de ligação não específico do analito para a superfície branca do sinal de ligação de superfícies com mAb imobilizado. Depois de subtração de correção de branco, os sensorgramas foram referenciados uma segunda vez subtraindo um sensorgrama médio para injeções de tampão por uma célula de fluxo específica. Esta "dupla referência" corrigiu os sensorgramas de ligação de mAb para quaisquer erros sistemáticos presentes em uma célula de fluxo particular.

IGF-VIGFBP-3 e IGF-1I/IGFBP-3 complexados e não complexados ligados razoavelmente fracamente aos anticorpos ligados, com uma estimativa aproximada da interação de ligação não específica sendo um KEy> 1 u,M para todos os seis mAbs, incluindo controle negativo ABX-MA1 (Veja Tabela 9). Entretanto, com ABX-MA I a ligação de IGF-VII foi fraca e indicou que interações de ligação não específica ocorreram com todos estas três análises. Aparentemente, os complexos IGF/IGFBP-3 se ligam levemente com mais força a todos estes mAbs do que IGFBP-3 apenas. Entretanto, pelo fato de tanto IGF-1, IGF-1I e IGBP-3 parecerem se ligar não especificamente a estes próprios mAbs, quando eles são ambos ligados juntos, isto resulta em um complexo de proteína de ligação não específica ainda "pegajoso", o que explica o maior sinal de ligação para o complexo. Os complexos IGF-1/11/IGFBP-3 e IGFBP-3 se ligaram à superfície de controle significantemente também indicando a não especificidade das mesmas duas proteínas. Entretanto, nos sensorgramas abaixo esta ligação secundária é subtraída na primeira referência durante processamento de dados, como descrito acima.

Este experimento sugere que embora 51 das amostras tenham sido previamente mostradas inibindo ligação de IGF-I /TI a IGFBP3 (Exemplo 6), os anticorpos também podem ser ligar ao complexo 1GF/IGFBP in vitro. TABELA 9. RESUMO DE LIGAÇÃO PARA LIGAÇÃO DE IGF-VIGFBP- 3 E IGF-11/1GFBP-3 PARA SEIS MABS.

<table>table see original document page 80</column></row><table>

+, ligação leve relativa a IGF-I ou IGF-11 para o mAb ++-H-, ligação média relativa a IGF-I ou IGF-II para o mAb +++t 1, ligação forte relativa a ligação de IGF-I ou IGF-II ao mAb *Estas classificações NÃO indicam o Kd para estas interações.

EXEMPLO 9

DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPO ANTI-INSULINA USANDO ANÁLISE BIACORE (TRIAGEM DE BAIXA RESOLUÇÃO) A reatividade cruzada de anticorpos foi adicionalmente investigada medindo a afinidade dos mAbs para insulina humana. Anticorpos IGF-VII foram imobilizados para os chips CM5 Biacore, e insulina em solução foi injetada para a determinação da taxa de associação e taxa de dissociação. Cinco mAbs, incluindo 7.234.2, 7.34.1, 7.159.2, 7.160,2, e 7.251.3, foram testados neste experimento. Insulina diluída para 502 nM no tampão de corrida foi injetada sobre todas as superfícies de captura.

Nenhuma ligação de insulina a qualquer dos mAbs foi observada em 502 nM de insulina. Estes resultados sugerem que não existe reatividade cruzada aparente dos mAbs IGF-I/11 com insulina.

EXEMPLO 10

ARMAZENAMENTO DE ANTICORPOS

Armazenamento de epitopo foi realizada para determinar quais dos anticorpos anti-IGF-1/11 iriam competir de forma cruzada com um, e assim seriam propensos a se ligar ao mesmo epitopo em IGF-1/Π. O processo de armazenamento é descrito em Pedido de Patente Norte-Americana 20030175760, também descrito em Jia e ai., J. Immunol. Methods, (2004) 288:91-98, ambos os quais são incorporados por referência em totalidade. Resumidamente, microesferas Luminex foram acopladas com anti-hulgG de camundongo (Pharmingen #555784) seguindo o protocolo de acoplamento de proteína fornecido na página da rede mundial de computadores de Luminex. Microesferas pré-acopladas foram preparadas para acoplamento com anticorpo primário desconhecido usando o procedimento seguinte, protegendo as microesferas da luz. Tubos individuais foram usados para cada sobrenadante desconhecido. O volume de sobrenadante necessário foi calculado usando a seguinte fórmula: (nX2+10) χ 50 ul (onde η = número total de amostras). Uma concentração de 0,1 μg/ml foi usada neste ensaio. O estoque de microesferas foi levemente turbilhonado, e diluído em sobrenadante para uma concentração de 2500 de cada microesfera em 50 μl por poço ou 0.5X105 microesferas/ml.

Amostras foram incubadas em um agitador no escuro em temperatura ambiente durante a noite.

A placa de filtro foi pré-umedecida adicionando 200 μl de tampão de lavagem por poço, que foi então aspirado. 50 μl de cada microesfera foi adicionado a cada poço da placa de filtro. Amostras foram lavadas uma vez adicionando 100 μl/poço de tampão de lavagem e aspirando. Antígeno e controles foram adicionados a placa de filtro a 50 μl/poço. A placa foi coberta, incubada no escuro por 1 hora em um agitador, e então amostras foram lavadas 3 vezes. Um anticorpo secundário desconhecido foi então adicionado a 50 μl/poço. Uma concentração de 0,1 μg/ml foi usada para o anticorpo primário. A placa foi então incubada no escuro por 2 horas em temperatura ambiente em um agitador, e então amostras foram lavadas 3 vezes. 50 μl/poço de anti-IgG humana biotinilada de camundongo (Pharmingen #555785) diluído a 1:500 foi adicionado, e amostras foram incubadas no escuro por 1 hora com agitação em temperatura ambiente.

Amostras foram lavadas 3 vezes. 50 μl/poço de estreptavidina-PE em uma diluição de 1:1000 foi adicionado, e amostras foram incubadas no escuro por 15 minutos com agitação em temperatura ambiente. Depois de correr dois ciclos de lavagem no Luminexl 00, amostras foram lavadas 3 vezes. Conteúdos em cada poço foram ressuspensos em 80 μl de Tampão de Bloqueio. Amostras foram cuidadosamente misturadas com pipetagem diversas vezes para ressuspender as microesferas. Amostras foram então analisadas no Luminexl00. Resultados são apresentados abaixo em Tabela 10.

TABELA 10. COMPARTIMENTOS PARA OS MELHORES ANTICORPOS 34 IGF-l/II POSITIVOS EM ENSAIO FUNCIONAL

<table>table see original document page 82</column></row><table> EXEMPLO 11

ANÁLISE ESTRUTURAL DE ANTICORPOS ANTI-IGF-1/11

As cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis de diversos anticorpos foram seqüenciadas para determinar suas seqüências de DNA. A informação de seqüência completa para os anticorpos anti-IGF-l/II é fornecida na Listagem de Seqüências com seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para cada combinação de cadeia gama e capa. As seqüências pesadas variáveis foram analisadas para determinar a família de VH5 a seqüência de região Dea seqüência de região S. As seqüências foram então traduzidas para determinar a seqüência de aminoácidos primária e comparadas com o VH de linhagem germinativa, seqüências de região DeJ para verificar hipermutações somáticas.

O alinhamento das seqüências destes anticorpos com seus genes de linhagem germinativa são mostrados nas Tabelas seguintes. Tabela II é uma Tabela comparando as regiões de cadeia pesada de anticorpo a sua região de cadeia pesada de linhagem germinativa cognata. Tabela 12 é uma Tabela comparando as regiões de cadeia leve capa de anticorpo a sua região de cadeia leve de linhagem germinativa cognata. Mutações for a de linhagem germinativa são mostradas como o novo aminoácido.

As regiões variáveis (V) de cadeias de imunoglobulina são codificadas por múltiplos segmentos de DNA de linhagem germinativa, que são unidos em regiões variáveis funcionais (VHDJH ou VkJk) durante ontogenia de célula Β. A diversidade molecular e genética da resposta de anticorpo a IGF-IJII foi estudada em detalhe. Estes ensaios revelaram diversos pontos específicos para anticorpos anti-IGF-l/II.

Análise de cinco anticorpos individuais específicos para IGF- l/II resultou na determinação de que os anticorpos foram derivados de três diferentes genes VH de linhagem germinativa, quatro dos quais da família VH4, com 2 anticorpos sendo derivados do segmento de gene VH4-39. Tabelas 11 e 12 mostram os resultados desta análise.

Deve ser percebido que seqüências de aminoácidos dentre os clones irmãos coletados de cada hibridoma são idênticas. Por exemplo, as seqüências de cadeia pesada e cadeia leve para mAb 7.159.2 são idênticas às seqüências mostradas em Tabelas 11 e 12 para mAb 7.159.1.

As CDRIs de cadeia pesada dos anticorpos da invenção têm uma seqüência como descrito em Tabela 11. As CDRIs descritas em Tabela 11 são da definição de Kabat. Alternativamente, as CDRIs podem ser definidas usando uma definição alternativa de forma a incluir os últimos cinco resíduos da seqüência FRL Por exemplo, para anticorpo 7.159.1 a seqüência FRI é QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO.:93) e a seqüência CDRI é GYTFTSYDIN (SEQ ID NO.:94); para anticorpo 7.158.1 a seqüência FRI é QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO.:95) e a seqüência CDRI é GGS1RSSSYYWG (SEQ ID NO.:96); para anticorpo 7.234,1 a seqüência FRI é QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO.:97) e a seqüência CDRI é GGSINSSSNYWG (SEQ ID NO.:98); para anticorpo 734,1 a seqüência FRI é QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO.:99) e a seqüência CDRI é GGSISSYYWS (SEQ ID NO.: 100); e para anticorpo 7.2513 a seqüência FRI é QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID N0.:101) e a seqüência CDRI é GGSISSYYWS (SEQ ID NO.: 102).

Também deve ser percebido que onde um anticorpo particular difere de sua respectiva seqüência de linhagem germinativa no nível de aminoácido, a seqüência de anticorpo pode ser mutada de volta para a seqüência de linhagem germinativa. Tais mutações corretivas podem ocorrer em uma, duas, três ou mais posições, ou uma combinação de qualquer das posições mutadas, usando técnicas padrão de biologia molecular. Como forma de exemplo não limitante, Tabela 12 mostra que a seqüência de cadeia leve de mAb 7.34.1 (SEQ ID NO.: 12) difere da seqüência de linhagem germinativa correspondente (SEQ ID NO.: 80) através de uma mutação de Pro para Ala (mutação 1) na região FRI, e através de uma mutação de Phe para Leu (mutação 2) na região FR2. Assim, a seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos codificando a cadeia leve de mAb 7.34.1 pode ser modificada para mudar mutação 1 para produzir a seqüência de linhagem germinativa no sítio de mutação 1. Ademais, a seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos codificando a cadeia leve de mAb 7.34.1 pode ser modificada para mudar mutação 2 para produzir a seqüência de linhagem germinativa no sítio de mutação 2. Ainda adicionalmente, a seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos codificando a cadeia leve de mAb 7.34.1 pode ser modificada para mudar tanto mutação 1 como mutação 2 para produzir a seqüência de linhagem germinativa no sítio de ambas as mutações 1 e 2. TABELA 11 ANALISE DE CADEIA PASEDA

<table>table see original document page 86</column></row><table>

* A designacao hachurada (#) indica um espaco na linhagem germinativa e e usado para mostrar um alinhamento apropriado com as sequencias de anticorpo mostradas na Tabela.

** As sequencia de linhagem germinativa mostradas na Tabela de linhagem germinativa mostradas Tabela acima sao para propositos de alinhamento, e dever ser percebido que cada regiao de anticorpo individual existe em sua propria localizacao dentro das reqioes cariaveis de segmentos de DNA de linhagem germinativa de imunoglobulina in vivo. TABELA 12. ANALISE DE CADEIA LEVE

<table>table see original document page 87</column></row><table> EXEMPLO 12

FOSFORILAÇÂO INDUZIDA POR INIBICÂO DE IGF-I E IGF-1I DE hIGF-1RECTOPICAMENTE EXPRESSO EM CÉLULAS NIH3T3

Ligantes de IGF exercem suas funções de proliferação e anti- apoptose ativando atividade de tirosina quinase de receptor no receptor IGF- 1R. A fim de avaliar os anticorpos anti IGF-11II para sua capacidade de inibir fosforilação induzida por IGF de IGF-1R, células NIH3T3 expressando ectopicamente hIGF-lR, foram usadas no ensaio seguinte.

Células NIH3T3 expressando ectopicamente o IGF-1R humano foram inseminadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 10.000 células por poço e incubadas durante a noite em meio de inanição (1% de FBS com carvão removido). No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram levemente lavados duas vezes com PBS, e 100µL de meio livre de soro (0% FBS) foi adicionado para enfraquecer pela fome as células. Depois de 1-2 horas, 100ul de meio livre de soro com 0,05% de BSA contendo ou IGF-I (10nM) ou IGF-II (10nM) que foi pré-incubado por 60 minutos a 37°C com várias concentrações de anticorpo, foi adicionado às células em triplicata. A estimulação foi deixada ocorrer por 10 minutos a 37°C, depois de estimulação, meios removidos e 100uL de 3,7% de formaldeído em PBS/3% de BSA adicionado a cada poço e incubado em RT por 20 min. As células foram então lavadas 2X com PBS e 100uL de tampão de permeabilização (0,1% de Triton-X em 3% de BSA/PBS) foi adicionado a cada poço. Este foi permitido incubar em RT por 10 min, descartado e 100ul de 0,6% de peróxido de hidrogênio em PBS/3% de BSA foi adicionado para inativar qualquer atividade de peroxidase endógena. Depois de uma incubação de 20min em RT, as células foram lavadas 3X com P 135/0,1% de Tween-20 e bloqueadas adicionando 100uL de 10% de FBS em PBS/0,1% de Tween-20 em RT por lhr. O Tampão de Bloqueio foi então removido e 50uL de anticorpo anti-fosfo IGFIR a lug/ml (cat#44-804, BioSource) foi adicionado a cada poço em 10% de FBS/PBS-T. Depois de uma incubação de 2hr em RT células foram lavadas 3X com PBST enxaguando por 5 minutos entre cada lavagem. Depois das lavagens 5Oul/poço de um anticorpo secundário de cabra anti IgGFc-HRP de coelho diluído 1:250 em Tampão de Bloqueio foi adicionado a cada um dos poços. Depois de uma incubação de 1 hora em RT as células foram lavadas 3X por 5 minutos com PBST como antes e enxugadas. 50ul de reagente ECL (DuoLux) foi então adicionado e RLUs foi lido imediatamente.

Trinta e duas (32) linhagens de anticorpos foram triadas, e dois ensaios independentes foram realizados para cada antígeno. Os resultados para os dez melhores anticorpos estão resumidos em Tabela 13 abaixo. TABELA 13. RESUMO DE FOSFORILAÇÃO DE IGF-IR DEPENDENTE DE INIBIÇÃO DE IGF EM CÉLULAS NIH3T3

<table>table see original document page 89</column></row><table>

*Estes ensaios podem ter sido corridos em condições limitantes de antígeno dado o KD de mAb para IGF-1 e IGF-11.

EXEMPLO 13

INIBIÇÃO DE PROLIFERAÇÃO INDUZIDA POR IGF-I E IGF-IIDE CÉLULAS NIH3T3 TRANSFECTADAS COM HIGF-IR

Como discutido acima, um dos critérios para neutralizar anticorpos IGF-I/11 é a capacidade de inibir proliferação induzida por IGF. A fim de avaliar os anticorpos para sua capacidade de inibir proliferação induzida por IGF, células NIH3T3 expressando ectopicamente hIGF-lR, foram usadas no ensaio seguinte.

Células NIH3T3 expressando ectopicamente hIGF-lR foram inseminadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 5000 células por poço e cultivadas durante a noite em meio de inanição (1% de FBS com carvão removido). No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram levemente lavados duas vezes em meio sem soro, e IOOpL de meio livre de soro foi adicionado para enfraquecer pela fome as células. IOOpL de meio de inanição contendo 15ng/ml de IGFI ou 50ngiml de IGFII pré-incubados por 30 min a 37°C com várias concentrações de anticorpo foi adicionado às células em duplicata ou triplicata. Seguindo uma incubação de 20h células são vibradas com BrdU por 2h e o grau de incorporação (proliferação) foi quantificado usando o Kit ELISA de Proliferação Celular de Roche (Roche, Cat#l 647 229).

Um total de 32 linhagens de anticorpos foram tríadas, e dois ou três ensaios independentes foram realizados para cada antígeno. Os resultados para os 10 melhores anticorpos estão resumidos em Tabela 14 abaixo.

TABELA 14. RESUMO DE INIBIÇÃO DE PROLIFERAÇÃO

DEPENDENTE DE IGF DE CÉLULAS NIH3T3/hIGF-lR

<table>table see original document page 90</column></row><table>

*Estes ensaios podem ter sido corridos em condições limitantes de antígeno dado o KD de mAb para IGF-I e IGF-II. EXEMPLO 14

INIBICÂO DE FOSFORILACÃO INDUZIDA POR IGF-I AND IGF-H DE hIGF-lR EXPRESSO EM CÉLULAS HUMANAS DE TUMOR

PANCREÁTICO BxPC3

IGF-I/11 exercem suas funções de proliferação e anti-apoptose ativando atividade de tirosina quinase de receptor no receptor IGF-IR. A fim de avaliar os anticorpos para sua capacidade de inibir fosforilação induzida por IGF de IGF-IR, células humanas de tumor pancreático BxPC3, que expressam hIGF-lR endógeno, foram usadas no ensaio seguinte.

Células BxPC3 foram inseminadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 55.000 células por poço e incubadas durante a noite em meio de crescimento regular. No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram levemente lavados duas vezes em meio sem soro, e 100μΕ de meio livre de soro foi adicionado para enfraquecer pela fome as células. Depois de 24 horas, o meio foi descartado, e as células foram levemente lavadas uma vez em meio sem soro. Meio livre de soro com 0,05% de BSA contendo ou IGF-I (20ng/ml) ou IGF-11 (75ng/ml) foi pré-incubado por 30 minutos a 37°C com várias concentrações de anticorpo, e 100μί foi então adicionado às células em triplicata. As placas foram incubadas por 15 minutos a 37°C, e foram subseqüentemente enxaguadas com PBS gelado. 100μί de tampão de Iise foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas por 30 minutos a 4°C. Os lisados foram girados a 2000 rpm por 10 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi coletado. Fosforilação de IGF-IR foi quantificada usando o kit ELISA Duoset human phosphorIGF-lR (R&D Systems, Cat. No. DYCl 770).

Dez linhagens de anticorpos foram tríadas, e dois ensaios independentes foram realizados para cada antígeno. Os resultados estão resumidos em Tabela 15 abaixo. TABELA 15. RESUMO DE INIBIÇÃO DE FOSFORILAÇÃO DE IGF-IR DEPENDENTE DE IGF

<table>table see original document page 92</column></row><table>

*333nlvl para os últimos 3 anticorpos. N.D.: Não Determinado

EXEMPLO 15

INIBIÇÃO DE PROLIFERAÇÃO INDUZIDA POR IGF-1 E IGF-11 DE CÉLULAS HUMANAS DE TUMOR PANCREÁTICO BxPC3

Como discutido acima, um dos critérios para neutralizar anticorpos IGF é a capacidade de inibir proliferação induzida por IGF. A fim de avaliar os anticorpos para sua capacidade de inibir proliferação induzida por IGF, células humanas de tumor pancreático BxPC3, que expressam hlGF- IR endógeno, foram usadas no ensaio seguinte.

Células BxPC3 foram inseminadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 2000 células por poço e cultivadas durante a noite em meio de crescimento regular. No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram levemente lavados duas vezes em meio sem soro, e 100µL de meio livre de soro com l^g/ml de transferrina e 0.,% BSA de (meio de ensaio) foi adicionado para enfraquecer pela fome as células. Depois de 24 horas, o meio foi descartado, as células foram levemente lavadas uma vez em meio sem soro, e 100μL de meio de ensaio contendo 20ng/ml de IGF pré-incubado por 30 min a 37°C com várias concentrações de anticorpo foi adicionado às células em duplicata ou triplicata. As placas foram incubadas por 3 dias, e proliferação foi quantificada usando o reagente CellTiter-Glo (Promega).

Dez linhagens de anticorpos foram tríadas, e dois ou três ensaios independentes foram realizados para cada antígeno. Os resultados estão resumidos em Tabela 16 abaixo. Baseado nos dados funcionais abaixo e nos dos do Exemplo 14, os quatro melhores anticorpos foram selecionados. Resultado de ensaio de proliferação induzida por IGF-I foi excluído dos critérios de seleção por causa da alta variabilidade de ensaio observada. TABELA 16. RESUMO DE INIBIÇÃO DE PROLIFERAÇÃO DEPENDENTE DE IGF- DE CÉLULAS HUMANAS DE TUMOR PANCREÁTICO_BxPC3

<table>table see original document page 93</column></row><table>

*333nM para os últimos 3 anticorpos

ND.: Não Determinado

EXEMPLO 16

DETERMINAÇÃO DE REATIVIDADE CRUZADA COM IGF-1. IGF-IIE INSULINA DE CAMUNDONGO Um objetivo foi desenvolver anticorpos que são específicos para IGF-I e IGF-II mas que não têm nenhuma reatividade cruzada com insulina. A fim de realizar experimentos posteriores em animais, os anticorpos também devem reagir de forma cruzada com IGF-1/II murina mas não insulina murina. Por conseguinte, ensaios ELISA foram realizados para determinar se anticorpos selecionados foram capazes de reagir de forma cruzada com IGFs ou insulina murina.

Como mostrado em Tabela 17, cinco dos dez melhores anticorpos foram testados para reatividade cruzada com insulina de camundongo ou rato por ELISA. Os ELISAs mostraram que estes anticorpos não tiveram nenhuma reatividade cruzada com insulina de camundongo ou rato, comparado a anticorpo de controle negativo PKl6.3.1 e em contraste com anticorpo anti-insulina de rato de controle positivo. TABELA 17. REATIVIDADE CRUZADA COM INSULINA DE CAMUNDONGO

<table>table see original document page 94</column></row><table>

EXEMPLO 17

INIBICÂO DE FOSFORILACÂO INDUZIDA POR IGF-I E IGF-IIDE CAMUNDONGO DE IGF-IR HUMANO ECTOPICAMENTE EXPRESSO

EM CÉLULAS NIH3T3 Os anticorpos monoclonais com reatividade cruzada com IGF- 1 e IGF-II de camundongo foram adicionalmente testados a fim de determinar o grau em que eles inibem fosforilação induzida por IGF do IGF- 1R. Este ensaio foi realizado como previamente descrito usando células NIH3T3 expressando ectopicamente o receptor hIGF-lR. Os resultados deste ensaio estão resumidos em Tabela 18.

Células NIH3T3 expressando ectopicamente o IGF-IR humano foram inseminadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 10.000 células por poço e incubadas durante a noite em meio de inanição (1% de FBS com carvão removido). No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram levemente lavados duas vezes com PBS, e ΙΟΟμΙ. de meio livre de soro (0% FB S) foi adicionado para enfraquecer pela fome as células. Depois de 1-2 horas, 1OOuL de meio livre de soro com 0,05% de BSA contendo ou IGF-1 (IOnM) ou IGF-1I (1OnM) de camundongo (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN Cat. No. 791-MG e 792-MG respectivamente) que foi pré-incubado por 60 minutos a 37°C com várias concentrações de anticorpo, foi adicionado às células em triplicata. A estimulação foi deixada ocorrer por 10 minutos a 37°C, depois de estimulação, meios removidos e 1OOuL de 3,7% de formaldeído em PBS/3% de BSA adicionado a cada poço e incubados em RT por 20 min. As células foram então lavadas 2X com PBS e 1OOuL de tampão de permeabilização (0,1% de Triton-X em 3% de BSA/PBS) foi adicionado a cada poço. Este foi permitido incubar em RT por 10 min, descartado e 1OOul de 0,6% de peróxido de hidrogênio em PBS/3% de BSA foi adicionado para inativar qualquer atividade de peroxidase endógena. Depois de uma incubação de 20min em RT, as células foram lavadas 3X com PBS/0,1% de Tween-20 e bloqueadas adicionando 1OOuL I 0% de FBS em P13 S/0,1% de Tween-20 em RT por 1 h. O Tampão de Bloqueio foi então removido e 5OuL de anticorpo anti-fosfo IGFIR a lug/ml (cat#44-804, BioSource) foi adicionado a cada poço em 10% de FBS/PBS-T. Depois de uma incubação de 2h em RT células foram lavadas 3X com PBST imersão por 5 minutos entre cada lavagem. Depois das lavagens 5Oul/poço de um anticorpo secundário de cabra anti IgGFc de coelho-HRP diluído 1:250 em Tampão de Bloqueio foi adicionado a cada um dos poços. Depois de uma incubação de 1 hora em RT as células foram lavadas 3X por 5 minutos com PBST como antes e enxugadas. 50ul de reagente ECL (DuoLux) foi então adicionado e RLUs foi lido imediatamente. TABELA 18. INIBIÇÃO DE FOSFORILAÇÃO INDUZIDA POR IGF DE CAMUNDONGO-DE hIGF-lR

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EXEMPLO 18

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS NIH3T3 EXPRESSANDO IGF-IIE IGF -1RIN VIVO EM CAMUNDONGOS NUS

A fim de avaliar os anticorpos para sua capacidade de inibir proliferação induzida por IGF-II in viva, os experimentos seguintes foram realizados.

Camundongos fêmeas nus de 6-8 semanas de idade (fornecidos por Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) foram implantados subcutaneamente com 5x106 células de Clone 32 (células NIH3T3 superexpressando ectopicamente IGF-II humano e IGF-I R humano). As células foram suspensas em PBS em um volume de inóculo total de 330 pl. Os tumores foram permitidos crescer para 100-200mm antes de tratamento com anticorpos monoclonais 7.159.2, 7.34.1 e 7.251.3. Anticorpos ou anticorpo de controle de isotipo IgG2 suspensos em PBS foram administrados intraperitonealmente para grupos aleatorizados de 9 ou 12 camundongos semanalmente por 4 semanas a 5 ou 50 mg/kg a partir de Dia 22. PBS foi administrado como um controle de veículo a um grupo adicional de 11 camundongos semanalmente por 4 semanas a partir de Dia 22. Tamanho de tumor e peso corporal foi medido 2-3 vezes por semana. Os resultados estão resumidos em Figuras 1 e 2.

Inibição significante de crescimento de tumor foi observada (veja Figura 1) com nenhuma perda de peso significante ocorrendo em qualquer grupo (veja Figura 2). Anticorpos 7.159.2, 7.34.1 e 7.251.3 inibiram significantemente o crescimento de tumores de Clone 32 a 5 e 50 mg/kg/semana (veja Figura 1).

EXEMPLO 19

INIBICÂO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS NIH3T3 EXPRESSANDO IGF-I E IGF-I RIN VIVO EM CAMUNDONGOS NUS

No exemplo anterior, os anticorpos mostraram inibir proliferação induzida por IGF-II in viva. A fim de avaliar os anticorpos para sua capacidade de inibir proliferação induzida por IGF-1 in viva, os experimentos seguintes foram realizados.

Camundongos fêmeas nus (linhagem Alderley Park derivada de linhagem Swiss nude de camundongos nus, fornecidos por AstraZeneca) foram implantados com 5x 106 células P12 viáveis [células NIH3T3 superexpressando ectopicamente IGF-1 humano e IGF-IR humano (Pietrzkowski et al, Cell Growth & Differentiation, 3, 199-205, 1992)] subcutaneamente no flanco esquerdo. As células foram suspensas em PBS em um volume de inóculo total de 0,1 ml. Dois grupos de animais (cada n=10) foram dosados duas vezes semanalmente a partir do dia de implante de célula ΝΊΗ3Τ3 ou com mAb 7.159.2 a 1,0 mg por camundongo ou com um volume equivalente de veículo PBS (0,3 ml) para o mesmo programa. Todas as doses foram dadas intraperitonealmente através da via (i.p.). Pesos corporais de animais foram medidos diariamente e, uma vez estabelecidos, medidas de tumor foram tomadas duas vezes por semana usando compassos de calibre. O volume para todos os tumores mensuráveis foi calculado a partir das medidas de compasso de calibre assumindo um formato ovóide. Os resultados estão resumidos em Figura 3.

Como mostrado em Figura 3, inibição significante de crescimento de tumor foi observada com mAb 7.159.2 seguindo administração i.p. duas vezes por semana de l,0mg anticorpo/camundongo. Nenhuma perda de peso significante foi observada em qualquer dos grupos de animais. EXEMPLO 20

INIBICÂO DE CRESCIMENTO DE CÉLULA TUMOROSA EM

PACIENTES HUMANOS Um grupo de pacientes humanos com câncer diagnosticados com câncer pancreático é aleatorizado em grupos de tratamento. Cada grupo de pacientes é tratado com injeções intravenosas semanais de mAb 7.159.2, 7.34.1 ou 7251.3 descritos neste lugar. Cada paciente é dosado com uma quantidade eficaz do anticorpo variando de 50 mg/kg a 2,250 mg/kg por 4-8 semanas. Um grupo de controle é dado apenas o regime quimioterápico padrão.

Em tempos periódicos durante e depois do regime de tratamento, carga de tumor é verificada por imageamento de ressonância magnética (Μ I). E encontrado que os pacientes que receberam tratamento com anticorpo semanal com mAb 7.159.2, 7.34.1 ou 7.251.3 mostram reduções significantes em tamanho de tumor, comparado a pacientes que não recebem tratamento com anticorpo. Em alguns pacientes tratados, os tumores não são mais detectáveis. Em contraste, tamanho de tumor aumenta ou permanece substancialmente o mesmo no grupo de controle.

EXEMPLO 21

INIBICÂO DE CRESCIMENTO DE CÉLULA TUMOROSA EM UM

PACIENTE HUMANO Um paciente humano é diagnosticado com um tumor maligno. O paciente é tratado com injeções intravenosas semanais de mAb 7.1592 por 8 semanas. Em tempos periódicos durante e depois do regime de tratamento, carga de tumor é verificada por imageamento de ressonância magnética (MR1). Reduções significantes em tamanho de tumor são encontradas.

EXEMPLO 22

TRATAMENTO DE ACROMEGALIA EM UM PACIENTE HUMANO Um homem adulto é diagnosticado com acromegalia. O paciente é tratado com injeções intravenosas bissemanais de mAb 7.34.1 por um período de 2 anos. Como um resultado, o paciente experimenta uma redução significante nos sintomas de acromegalia.

EXEMPLO 23

TRATAMENTO DE PSORÍASE EM UM PACIENTE HUMANO

Uma mulher adulta é diagnosticada com psoríase severa. O paciente é tratado com injeções intravenosas bissemanais de mAb 7.251.3 por um período de 3 semanas. Como um resultado, o paciente experimenta uma redução significante nos sintomas de psoríase.

EXEMPLO 24

TRATAMENTO DE OSTEOPOROSE EM UM PACIENTE HUMANO

Uma mulher adulta é diagnosticada com osteoporose. O paciente é tratado com injeções intravenosas bissemanais de mAb 7.159.2 por um período de um ano. Como um resultado, existe uma redução significante em perda de densidade óssea.

EXEMPLO 25

TRATAMENTO DE técnicaRIOSCLEROSE EM UM PACIENTE HUMANO

Um homem adulto é diagnosticado com técnicariosclerose. O paciente é tratado com injeções intravenosas bissemanais de mAb 7.34.1 por um período de um ano. Como um resultado, o paciente experimenta uma redução nos sintomas de técnicariosclerose, tal como angina do peito.

EXEMPLO 26

TRATAMENTO DE RESTENOSE EM UM PACIENTE HUMANO

Um homem adulto recebe angioplastia para aliviar uma artéria bloqueada. Seguindo o procedimento de angioplastia, o paciente é tratado com injeções intravenosas bissemanais de mAb 7251.3 por um período de um ano. Como um resultado, o paciente não experimenta restenose da artéria tratada. EXEMPLO 27

TRATAMENTO DE DIABETE EM UM PACIENTE HUMANO

Uma mulher adulta é diagnosticada com diabete. O paciente é tratado com injeções intravenosas bissemanais de mAb 7A 59.2 por um período de um ano. Como um resultado, os sintomas de diabete são reduzidos.

SEQÜÊNCIAS

Os hibridomas subclonados foram seqüenciados para determinar sua estrutura primária tanto no nível de nucleotídeo como de aminoácido tanto para os genes de cadeia pesada variável como leve variável. As seqüências de nucleotídeos e de polipeptídeos das regiões variáveis dos anticorpos monoclonais contra IGF-I e IGF-II, como listado em Tabela 1, são fornecidas na Listagem de Seqüências.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Todas as referências citadas neste lugar, incluindo patentes, pedidos de patentes, artigos, livros-texto, e os semelhantes, e as referências citadas nestes, em um grau que ainda não o são, são por aqui incorporadas neste lugar por referência em sua totalidade.

EQUIVALENTES

O relatório escrito precedente é considerado como sendo suficiente para possibilitar que alguém versado na técnica pratique a invenção. A descrição e Exemplos precedentes detalham certas formas de realização preferidas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos requerentes. Será percebido, entretanto, que não importa quão detalhado o precedente pode aparecer no texto, a invenção pode ser praticada de muitas maneiras e a invenção deve ser interpretada em conformidade com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas. LISTAGEM DA SEQUENCIA

<110> Kaebetr, Olivia Gazit-Bornstein, Gadi Yang, Xiaodong Cartlidge, Susan Ann Tongo, David William

<220>PROTEINAS DE LIGACAO ESPECIFICAS PARAFATORES DE CREECIMENTO TIPO INSULINAE uso das mesmas

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<213> Humano

<400> 102

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Claims (57)

1. Proteína de ligação específica isolada completamente humana, caracterizada pelo fato de que se liga preferencialmente a fator de crescimento tipo insulina-H (IGF-II) com reatividade cruzada para fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I) e neutraliza atividade de IGF-I e IGF-II.

2. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação se liga a IGF-II com pelo menos 2,5 vezes maior afinidade do que a IGF-1.

3. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação tem um EC50 de não mais do que 15 nM para inibir fosforilação de receptor de IGF-I dependente de IGF-I em células NIH3T3 expressando IGF-IR ectopicamente.

4. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação tem um EC50 de não mais do que 5 nM para inibir fosforilação de receptor de IGF- -1 dependente de IGF-II em células NIH3T3 expressando IGF-IR ectopicamente.

5. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação inibe mais do que 70% de proliferação dependente de IGF-II de células NIH3T3 que expressam hIGF-lR recombinante com um Ec5o de não mais do que 25 nM.

6. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação inibe mais do que 70% de proliferação dependente de IGF-I de células NIH3T3 que expressam hIGF-lR recombinante com um EC50 de não mais do que 40 nM.

7. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação compete para ligação com anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüência variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 14 e SEQ ID NO.: 18.

8. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que dito anticorpo monoclonal compreende uma seqüência variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO.:4, SEQ ID NO.:8, SEQ ID N0.:12 e SEQ ID NO: 16.

9. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação se liga a IGF-I com um Kd de menos do que 4 nM.

10. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação se liga a IGF-I com um Kd de menos do que 650 pM.

11. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação se liga a IGF-II com um Kd de menos do que 300 pM.

12. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação é um anticorpo monoclonal completamente humano.

13. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação é um fragmento de ligação de um anticorpo monoclonal completamente humano.

14. Proteína de ligação específica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dito fragmento de ligação é selecionado a partir do grupo consistindo de Fab, Fab' ou F(ab')2 e Fv.

15. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação é anticorpo monoclonal 7.251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422).

16. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação é anticorpo monoclonal 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423).

17. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação é anticorpo monoclonal 7.159.2 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424).

18. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação compreende um polipeptídeo de cadeia pesada tendo a seqüência de SEQ ID NO.:6.

19. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação compreende um polipeptídeo de cadeia leve tendo a seqüência de SEQ ID NO.:8.

20. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação compreende um polipeptídeo de cadeia pesada tendo a seqüência de SEQ ID NO.: 10.

21. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação compreende um polipeptídeo de cadeia leve tendo a seqüência de SEQ ID NO.:12.

22. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação compreende um polipeptídeo de cadeia pesada tendo a seqüência de SEQ ID NO.:14.

23. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação compreende um polipeptídeo de cadeia leve tendo a seqüência de SEQ ID NO.: 16.

24. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 caracterizada pelo fato de estar em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável.

25. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de codificar a proteína de ligação específica como definida na reivindicação 1.

26. Vetor, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 25.

27. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender o vetor como definido na reivindicação 26.

28. Anticorpo monoclonal humano como definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo não se liga especificamente a proteínas IGF-II ou IGF-I quando ditas proteínas são ligadas a Proteínas Insulina de Ligação de Fator de Crescimento.

29. Método para determinar o nível de fator de crescimento tipo insulina-II (IGF-II) e fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I) em uma amostra de paciente, caracterizado pelo fato de compreender: fornecer uma amostra de paciente; colocar dita amostra em contato com a proteína de ligação como definida na reivindicação 1; e determinar o nível de IGF-I e IGF-II em dita amostra.

30. Método de acordo com a reivindicação 29 caracterizado pelo fato de que a amostra de paciente é sangue.

31. Uso da proteína de ligação específica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor maligno.

32. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dita proteína de ligação é um anticorpo monoclonal completamente humano.

33. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dito tumor maligno é selecionado a partir do grupo consistindo de: melanoma, câncer pulmonar de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (de fígado), tumor de tireóide, câncer gástrico (de estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colo, câncer pancreático, e carcinoma epidermóide.

34. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação é mAb 7.251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422) ou mAb 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423) ou mAb 7.1592 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424).

35. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dito medicamento é para uso em combinação com um segundo agente antineoplásico selecionado a partir do grupo consistindo de um anticorpo, um agente quimioterápico, e uma droga radioativa.

36. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dito medicamento é para uso em conjunção com ou seguindo uma cirurgia convencional, um transplante de célula tronco de medula óssea ou um transplante de célula tronco periférico.

37. Uso da proteína de ligação específica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 .caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença dependente de fator de crescimento.

38. Uso de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que dita proteína de ligação é um anticorpo monoclonal completamente humano.

39. Uso de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo de mAb -7.251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422), mAb 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423), e mAb 7.159.2 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424).

40. Uso de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a doença dependente de fator de crescimento é selecionada a partir do grupo consistindo de: osteoporose, diabete, e doenças cardiovasculares.

41. Uso da proteína de ligação específica como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para tratar um tumor maligno em um mamífero.

42. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que dito animal é humano.

43. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que dita proteína de ligação é um anticorpo monoclonal completamente humano.

44. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que dito tumor maligno é selecionado a partir do grupo consistindo de: melanoma, câncer pulmonar de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (de fígado), tumor de tireóide, câncer gástrico (de estômago), câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de bexiga, câncer de pulmão, glioblastoma, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de colo, câncer pancreático, e carcinoma epidermóide.

45. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação é selecionada a partir do grupo consistindo de mAb 7.2513 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422), mAb 7.34J (Número de Acesso de ATCC PTA-7423), e mAb 7.1592 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424).

46. Uso da proteína de ligação específica como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para tratar uma doença dependente de fator de crescimento em um mamífero.

47. Uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que dito mamífero é humano.

48. Uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que dita proteína de ligação é um anticorpo monoclonal completamente humano.

49. Uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo de mAb 7251.3 (Número de Acesso de ATCC PTA-7422), mAb 7.34.1 (Número de Acesso de ATCC PTA-7423), e mAb 7.1592 (Número de Acesso de ATCC PTA-7424).

50. Uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a doença dependente de fator de crescimento é selecionada a partir do grupo consistindo de: osteoporose, diabete, e doenças cardiovasculares.

51. Conjugado, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo como definido na reivindicação 12 ou um fragmento de ligação da mesma e um agente terapêutico.

52. Conjugado de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma toxina.

53. Conjugado de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um radioisótopo.

54. Conjugado de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma composição farmacêutica.

55. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação, ou fragmento de ligação da mesma, compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRI) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Tyr Tyr Trp Ser" (SEQ ID NO: 21); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser" (SEQ ID NO: 22); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "He Thr' Gly Thr Thr Lys Gly Gly Met Asp Vai" (SEQ ID NO: 23); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve - 1 (CDRI) tendo a seqüência de aminoácidos de "Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His" (SEQ ID NO: 24); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve - 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser" (SEQ ID NO: 25); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve - 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Vai" (SEQ ID NO: 26).

56. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação, ou fragmento de ligação da mesma, compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRI) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Tyr Tyr Trp Ser" (SEQ ID NO: 27); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser" (SEQ ID NO: 28); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de Ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly Gly Met Asp Val" (SEQ ID NO: 29); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve -1 (CDRI) tendo a seqüência de aminoácidos de "Thr Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His" (SEQ ID NO: 30); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve -2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser" (SEQ ID NO: 31); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve -3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Vai" (SEQ ID NO: 32).

57. Proteína de ligação específica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita proteína de ligação, ou fragmento de ligação da mesma, compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Tyr Asp Ile Asn" (SEQ ID NO: 33); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly" (SEQ ID NO: 34); uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai" (SEQ ID NO: 35); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve -1 (CDRl) tendo a seqüência de aminoácidos de "Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser" (SEQ ID NO: 36); uma região determinante de complementaridade de cadeia leve -2 (CDR2) tendo a seqüência de aminoácidos de "Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser" (SEQ ID NO: 37); e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve -3 (CDR3) tendo a seqüência de aminoácidos de "Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Vai" (SEQ ID NO: 38).