ES2385054T3 - Proteínas de unión específicas para factores de crecimiento de tipo insulina y usos de las mismas - Google Patents

Proteínas de unión específicas para factores de crecimiento de tipo insulina y usos de las mismas Download PDF

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Abstract

Proteína de unión específica aislada completamente humana que se une preferentemente al factor decrecimiento de tipo insulina-II (IGF-II) con reactividad cruzada por el factor de crecimiento de tipo insulina I(IGF-I) y neutraliza la actividad de IGF-I y IGF-II, comprendiendo dicha proteína de unión, o fragmento deunión de la misma:una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene la secuencia deaminoácidos de "Ser Tyr Asp Ile Asn" (SEQ ID NO: 33);una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (CDR2) que tiene la secuencia deaminoácidos de "Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly" (SEQ ID NO: 34);una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (CDR3) que tiene la secuencia deaminoácidos de "Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val" (SEQ ID NO: 35);una región determinante de complementariedad de cadena ligera 1 (CDR1) que tiene la secuencia deaminoácidos de "Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser" (SEQ ID NO: 36);una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (CDR2) que tiene la secuencia deaminoácidos de "Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser" (SEQ ID NO: 37); yuna región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (CDR3) que tiene la secuencia deaminoácidos de "Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val" (SEQ ID NO: 38).

Description

Proteínas de unión específicas para factores de crecimiento de tipo insulina y usos de las mismas.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta aplicación reivindica prioridad conforme a la ley 35 U.S.C. §119 con respecto a la solicitud provisional estadounidense con número de serie 60/750.085, presentada el 13 de diciembre de 2005; la solicitud provisional estadounidense con número de serie 60/750.772, presentada el 14 de diciembre de 2005; la solicitud provisional estadounidense con número de serie 60/774.747, presentada el 17 de febrero de 2005; y la solicitud provisional estadounidense con número de serie 60/808.183, presentada el 24 de mayo de 2006.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La invención se refiere a proteínas de unión que se unen al factor de crecimiento de tipo insulina-2 (IGF-II) con reactividad cruzada por el factor de crecimiento de tipo insulina-1 (IGF-I) y a usos de tales proteínas de unión. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales dirigidos a IGF-II con reactividad cruzada por IGF-I y a usos de estos anticuerpos. Los aspectos de la invención también se refieren a hibridomas u otras líneas celulares que expresan tales anticuerpos.
Descripción de la técnica relacionada
El factor de crecimiento de tipo insulina IGF-I e IGF-II son polipéptidos pequeños implicados en la regulación de la proliferación, supervivencia, diferenciación y transformación celulares. Los IGF ejercen sus diversas acciones interaccionando principalmente con una receptor de superficie celular específico, el receptor de IGF-I (IGF-IR) y activando diversas cascadas de señalización intracelulares. Los IGF circulan en el suero principalmente unidos a proteínas de unión a IGF (IGFBP-1 a 6). La interacción de IGF con el IGF-IR se regula mediante las IGFBP, y los IGF sólo pueden unirse al IGF-IR una vez liberados de las IGFBP (principalmente mediante proteólisis de las IGFBP). IGF-I también puede unirse a un receptor híbrido compuesto por subunidades de IGF-IR y receptor de insulina (IR). También se ha mostrado que IGF-II se une a la isoforma “A” del receptor de insulina.
La transformación maligna implica el desequilibrio de diversos procesos tales como crecimiento, diferenciación, apoptosis y transformación celulares. Se ha implicado a IGF-I e IGF-II en la fisiopatología de una amplia gama de estados, y se piensa que desempeñan un papel en la tumorigénesis debido a las propiedades mitogénicas y antiapoptóticas mediada por el receptor IGF-IR: LeRoith y Roberts, Cancer Lett. 195:127-137 (2003).
Se descubrió IGF-I como un factor de crecimiento producido por el hígado bajo el control regulatorio de la hormona de crecimiento de la hipófisis y se denominó originalmente somatomedina (C. Salmon et al., J. Lab. Clin. Med. 49:825-826 (1957). Tanto IGFI como IGF-II se expresan de manera ubicua y actúan como factores de crecimiento endocrinos, paracrinos y autocrinos, a través de su interacción con el IGF-IR, una tirosina cinasa transmembrana que está estructural y funcionalmente relacionada con el receptor de insulina (IR). IGF-I funciona principalmente activando el IGF-IR, mientras que IGF-II puede actuar a través de o bien el IGF-IR o bien a través de la isoforma IR-
A. LeRoith y Roberts, Cancer Lett. 195:127-137 (2003). Adicionalmente, la interacción de tanto IGF-I como IGF-II con las proteínas de unión a IGF puede afectar a la semivida y disponibilidad de los IGF, así como a su interacción directa con receptores en algunos casos. Rajaram et al., Endocr. Rev. 18:801-831 (1997).
IGF-I tiene un impacto a largo plazo sobre la proliferación, diferenciación y apoptosis celulares. Experimentos en células de cáncer de mama y osteosarcoma cultivadas sugirieron que IGF-I es un potente mitógeno y ejerce su acción mitogénica aumentando la síntesis de ADN y estimulando la expresión de ciclina D1, que acelera la progresión del ciclo celular desde la fase G1 hasta la S. Furlanetto et al., Mol. Endocrinol. 8:510-517 (1994); Dufourny et al., J. Biol. Chem. 272:311663-31171 (1997). Suppression of cyclin D1 expression in pancreatic cancer cells abolished the mitogenic effect of IGF-I. Kornmann et al., J. Clin. Invest. 101:344-352 (1998). Además de estimular la progresión del ciclo celular, IGF-I también inhibe la apoptosis. Se mostró que IGF-I estimulaba la expresión de proteína Bcl y suprimía la expresión de Bax, lo que da como resultado un aumento en la cantidad relativa del heterodímero Bcl/Bax, bloqueando de ese modo la iniciación de la ruta apoptótica. Minshall et al., J. Immunol. 159:1225-1232 (1997); Parrizas et al., Endocrinology 138:1355-1358 (1997); Wang et al., Endocrinology 139:1354-1360 (1998).
Como IGF-I, IGF-II tiene también acciones mitogénicas y antiapoptóticas y regula la proliferación y diferenciación celulares. En comparación con IGF-I, circulan altas concentraciones de IGF-II en el suero. Se han encontrado concentraciones de IGF-II séricas altas en pacientes con cáncer colorrectal, con una tendencia hacia concentraciones superiores en enfermedad avanzada. Renehan et al., Br. J. Cancer 83:1344-1350. Adicionalmente, la mayoría de tumores primarios y líneas celulares transformadas sobreexpresan ARNm y proteína de IGF-II. Werner y LeRoith Adv. Cancer Res. 68:183-223 (1996). La sobreexpresión de IGF-II en cáncer de colon está asociada con un fenotipo agresivo, y la pérdida de la huella (pérdida de expresión específica de alelo) del gen de IGF-II puede ser importante en carcinogénesis colorrectal. Michell et al., Br. J. Cancer 76:60-66 (1997); Takano et al., Oncology 59:210-216 (2000). Células cancerosas con una fuerte tendencia a metastatizar tienen niveles cuatro veces superiores de expresión de IGF-II que las células con una baja capacidad para metastatizar. Guerra et al., Int. J. Cancer 65:812-820 (1996).
Estudios clínicos y de investigación han destacado el papel de los miembros de la familia de IGF en el desarrollo, el mantenimiento y la progresión del cáncer. Se ha mostrado que muchas células cancerosas sobreexpresan el IGF-IR y/o los ligandos IGF. Por ejemplo, IGF-I y IGF-II son mitógenos fuertes para una amplia variedad de líneas de células cancerosas, incluyendo sarcoma, leucemia y cánceres de la próstata, mama, pulmón, colon, estómago, esófago, hígado, páncreas, riñón, tiroides, cerebro, ovario y útero. Macaulay et al., Br. J. Cancer 65:311-320 (1992); Oku et al., Anticancer Res. 11:1591-1595 (1991); LeRoith et al., Ann. Intern. Med. 122:54-59 (1995); Yaginuma et al., Oncology 54:502-507 (1997); Singh et al., Endocrinology 137:1764-1774 (1996); Frostad et al., Eur. J. Haematol 62:191-198 (1999). Cuando se administró IGF-I a células de cáncer de colon malignas, se hicieron resistentes a la apoptosis inducida por citocinas. Remacle-Bonnet et al., Cancer Res. 60:2007-2017 (2000).
El papel de los IGF en el cáncer está apoyado por estudios epidemiológicos, que mostraron que altos niveles de IGF-I circulante y bajos niveles de IGFBP-3 están asociados con un aumento del riesgo de desarrollar varios cánceres comunes (próstata, mama, colorrectal y pulmón). Mantzoros et al., Br. J. Cancer 76:1115-1118 (1997); Hankinson et al., Lancet 351:1393-1396 (1998); Ma et al., J. Natl. Cancer Inst. 91:620-625 (1999); Karasik et al., J. Clin. Endocrinol Metab. 78: 271-276 (1994). Estos resultados sugieren que IGF-I y IGF-II actúan como señales antiapoptóticas y mitogénicas potentes, y que su sobreexpresión se correlaciona con mal pronóstico en pacientes con varios tipos de cáncer.
Usando modelos de ratones deficientes, varios estudios han establecido además el papel de los IGF en el crecimiento tumoral. Con el desarrollo de la tecnología para deleción génica condicional, específica de tejido, se desarrolló un modelo de ratón de deficiencia en IGF-I hepática (LID). La deleción específica del hígado del gen igf1 suprimió la expresión de ARNm de IGF y provocó una reducción drástica en los niveles de IGF-I circulante. Yakar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:7324-7329 (1999). Cuando se indujeron tumores mamarios en el ratón LID, la reducción de los niveles de IGF-1 circulante dio como resultado reducciones significativas en el desarrollo, el crecimiento y las metástasis del cáncer, mientras que el aumento de los niveles de IGF-1 circulante estaba asociado con crecimiento tumoral potenciado. Wu et al., Cancer Res. 63:4384-4388 (2003).
Varios artículos han notificado que la inhibición de la expresión y/o señalización de IGF-IR conduce a una inhibición del crecimiento tumoral, tanto in vitro como in vivo. También se ha mostrado que la inhibición de la señalización de IGF aumenta la susceptibilidad de células tumorales a agentes quimioterápicos. Una variedad de estrategias (oligonucleótidos antisentido, receptor soluble, péptidos inhibidores, mutantes de receptor negativos dominantes, moléculas pequeñas que inhiben la actividad cinasa y anticuerpos anti-hIGF-IR) se han desarrollado para inhibir la ruta de señalización de IGF-IR en células tumorales. Un enfoque ha sido seleccionar como diana la actividad cinasa de IGF-IR con inhibidores de molécula pequeña. Recientemente se identificaron dos compuestos como inhibidores de cinasa de molécula pequeña que podían inhibir selectivamente el IGF-IR. Garcia-Echeverria et al., Cancer Cell 5:231-239 (2004); Mitsiades et al., Cancer Cell 5:221-230 (2004). La inhibición de la actividad cinasa de IGF-IR suprimió la formación de colonias y supervivencia mediadas por IGF-I en agar blando de células de cáncer de mama humanas MCF-7. Garcia-Echeverria et al., Cancer Cell 5:231-239 (2004). Cuando se administró un inhibidor de cinasa de IGF-IR a ratones que llevaban xenoinjertos de tumores, se inhibió la señalización de IGF-IR en xenoinjertos de tumor y se redujo significativamente el crecimiento de fibrosarcomas impulsados por IGF-IR. Garcia-Echeverria et al., Cancer Cell 5:231-239 (2004). Se observó un efecto similar en tumores malignos hematológicos, especialmente mieloma múltiple. En células de mieloma múltiple, un inhibidor de cinasa de IGF-IR de molécula pequeña demostró una potencia >16 veces mayor contra el IGF-1R, en comparación con el receptor de insulina, y era eficaz de manera similar en la inhibición del crecimiento y la supervivencia celulares. Mitsiades et al., Cancer Cell 5:221-230 (2004). Se inyectó el mismo compuesto por vía intraperitoneal en ratones e inhibió el crecimiento de células de mieloma múltiple y potenció la supervivencia de los ratones. Mitsiades et al., Cancer Cell 5:221-230 (2004). Cuando se combinó con otros quimioterápicos a dosis subterapéuticas, la inhibición de la actividad cinasa de IGF-IR redujo de manera sinérgica la carga tumoral. Mitsiades et al., Cancer Cell 5:221-230 (2004).
Otro enfoque para inhibir la señalización de IGF ha sido el desarrollo de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el receptor IGF-IR. Diversos grupos han desarrollado anticuerpos frente a IGF-IR que inhiben la autofosforilación estimulada por IGF-I del receptor, inducen la internalización y degradación del receptor y reducen la proliferación y supervivencia de diversas líneas de células cancerosas humanas. Hailey et al., Mol Cancer Ther. 1:1349-1353 (2002); Maloney et al., Cancer Res. 63:5073-5083 (2003); Benini et al., Clin. Cancer Res. 7:1790-1797 (2001); Burtrum et al., Cancer Res. 63:8912-8921 (2003). Adicionalmente, en modelos de tumor de xenoinjerto, el bloqueo de IGF-IR dio como resultado una inhibición del crecimiento significativa de tumores de mama, renales y pancreáticos in vivo.Burtrum et al., Cancer Res. 63:8912-8921 (2003); Maloney et al., Cancer Res. 63:5073-5083 (2003). Experimentos utilizando anticuerpos frente a IGF-IR humanizados produjeron resultados similares, inhibiendo el crecimiento de células de cáncer de mama in vitro y en xenoinjertos de tumor. Sachdev et al., Cancer Res. 63:627-635 (2003). Otros anticuerpos frente a IGF-IR humanizados bloquearon la inhibición del crecimiento y la fosforilación de tirosinas inducida por IGF-I en tumores de pulmón de células no pequeñas y de mama, así como in vivo. Cohen et al., Clin. Cancer Res. 11:2063-2073 (2005); Goetsch et al., Int. J. Cancer 113:316-328 (2005).
El aumento de los niveles de IGF-I también se ha asociado con varios estados patológicos no cancerosos, incluyendo acromegalia y gigantismo (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), mientras que la función anómala del receptor de IGF-I/IGF-II se ha implicado en psoriasis (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), aterosclerosis y reestenosis del músculo liso de vasos sanguíneos tras angioplastia (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). El aumento de los niveles de IGF-I se ha implicado en diabetes o en complicaciones asociadas con la diabetes, tales como proliferación microvascular (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999).
Se han dado a conocer en la técnica anticuerpos frente a IGF-I e IGF-II. Véanse, por ejemplo, Goya et al., Cancer Res. 64: 6252-6258 (2004); Miyamoto et al., Clin. Cancer Res. 11:3494-3502 (2005). Adicionalmente, véanse los documentos WO 05/18671, WO 05/28515 y WO 03/93317.
Sumario
Las realizaciones de la invención se refieren a proteínas de unión que se unen específicamente a factores de crecimiento de tipo insulina y reducen el crecimiento tumoral. En una realización, las proteínas de unión son anticuerpos monoclonales completamente humanos, o fragmentos de unión de los mismos que se unen específicamente a factores de crecimiento de tipo insulina y reducen el crecimiento tumoral. Los mecanismos mediante los cuales puede lograrse esto pueden incluir y no se limitan a o bien inhibición de la unión de IGF-I/II a su receptor IGF-IR, inhibición de la señalización de IGF-IR inducida por IGF-I/II, o bien aumento del aclaramiento de IGF-I/II, reduciendo así la concentración eficaz de IGF-I/II.
Por tanto, algunas realizaciones proporcionan una proteína de unión específica aislada completamente humana según la reivindicación 1 en el presente documento. En ciertos aspectos, la proteína de unión se une a IGF-II con al menos 2,5 veces más afinidad que a IGF-I. En otros aspectos, la proteína de unión se une a IGF-II con al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 7, al menos 10, al menos 50, al menos 60, al menos 100 o al menos 150 veces más afinidad que a IGF-I.
En algunas realizaciones, la proteína de unión específica tiene una CE50 de no más de 15 nM para inhibir la fosforilación del receptor de IGF-I dependiente de IGF-I en células NIH3T3 que expresan IGF-1R de manera ectópica. En algunos aspectos, la proteína de unión específica tiene una CE50 de no más de 15 nM, no más de 10 nM o no más de 8 nM para inhibir la fosforilación del receptor de IGF-I dependiente de IGF-I en células NIH3T3 que expresan IGF-1R de manera ectópica.
En algunas realizaciones, la proteína de unión específica tiene una CE50 de no más de 5 nM, no más de 4 nM o no más de 3 nM para inhibir la fosforilación del receptor de IGF-I dependiente de IGF-II en células NIH3T3 que expresan IGF-1R de manera ectópica.
En otras realizaciones, la proteína de unión específica inhibe más del 70% de la proliferación dependiente de IGF-II de células NIH3T3 que expresan hIGF-IR recombinante con una CE50 de no más de 25 nM, no más de 20 nM, no más de 15 nM o no más de 10 nM.
En otras realizaciones, la proteína de unión específica inhibe más del 70% de la proliferación dependiente de IGF-I de células NIH3T3 que expresan hIGF-IR recombinante con una CE50 de no más de 40 nM, no más de 30 nM o no más de 25 nM.
La proteína de unión específica puede ser un anticuerpo completamente humano que se une a IGF-I con una Kd inferior a 500 picomolar (pM). Más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd inferior a 450 picomolar (pM). Más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd inferior a 410 picomolar (pM). Más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd inferior a 350 pM. Incluso más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd de menos de 300 pM. Las mediciones de afinidad y/o avidez pueden medirse mediante BIACORE®, tal como se describe en el presente documento.
La proteína de unión específica puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano que se une a IGF-II con una Kd de menos de 175 picomolar (pM). Más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd inferior a 100 picomolar (pM). Más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd inferior a 50 picomolar (pM). Más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd inferior a 5 picomolar (pM). Incluso más preferiblemente, el anticuerpo se une con una Kd de menos de 2 pM.
En determinadas realizaciones, la proteína de unión específica es un anticuerpo monoclonal completamente humano
o un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los fragmentos de unión pueden incluir fragmentos tales como Fab, Fab’ o F(ab’)2 yFv.
Una realización de la invención comprende el anticuerpo monoclonal completamente humano 7.159.2 (número de registro de la ATCC PTA-7424) que se une específicamente a IGF-I/II, tal como se trata en más detalle a continuación.
En algunas realizaciones la proteína de unión específica que se une a factor de crecimiento de tipo insulina-II (IGF-II) con reactividad cruzada por el factor de crecimiento de tipo insulina-I (IGF-I), o fragmento de unión del mismo puede incluir un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO.: 6, y un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO.: 8.
En determinadas realizaciones, la proteína de unión específica puede estar en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
Otra realización incluye moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para cualquiera de las proteínas de unión específicas descritas en el presente documento, vectores que tienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para las proteínas de unión específicas, o una célula huésped transformada con cualquiera de tales moléculas y vectores de ácido nucleico.
En determinadas realizaciones, la proteína de unión específica que se une a factor de crecimiento de tipo insulina-II (IGF-II) con reactividad cruzada por el factor de crecimiento de tipo insulina-I (IGF-I), o fragmento de unión del mismo no se une específicamente a proteínas IGF-II o IGF-I cuando dichas proteínas están unidas a proteínas de unión a factor de crecimiento de insulina.
Las realizaciones adicionales incluyen métodos de determinación del nivel de factor de crecimiento de tipo insulina-II (IGF-II) y factor de crecimiento de tipo insulina-I (IGF-I) en una muestra de un paciente según la reivindicación 12 en el presente documento. Estos métodos pueden incluir proporcionar una muestra de un paciente; poner en contacto la muestra con una proteína de unión específica que se une al factor de crecimiento de tipo insulina-II (IGF-II) con reactividad cruzada por el factor de crecimiento de tipo insulina-I (IGF-I), o fragmento de unión del mismo; y determinar el nivel de IGFI e IGF-II en dicha muestra. En algunos aspectos, la muestra del paciente es sangre.
Las realizaciones adicionales incluyen un conjugado según la reivindicación 18 en el presente documento. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede ser una toxina, un radioisótopo o una composición farmacéutica.
Algunas realizaciones proporcionan el uso de las proteínas de unión específicas descritas en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor maligno. En algunos aspectos, la proteína de unión específica puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano. En determinados aspectos, la proteína de unión es el AcM 7.159.2 (número de registro de la ATCC PTA-7424). En algunos aspectos, el medicamento es para su uso en combinación con un segundo agente antineoplásico seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterápico y un fármaco radiactivo. En algunos aspectos, el medicamento es para su uso conjuntamente con o tras una cirugía convencional, un trasplante de células madre de la médula ósea o un trasplante de células madre periféricas.
El tumor maligno puede ser melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer pancreático y carcinoma epidermoide, por ejemplo.
Se indica que los expertos habituales en la técnica pueden lograr fácilmente determinaciones de CDR. Véase por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), volúmenes 1-3.
Las realizaciones de la invención descrita en el presente documento se refieren a anticuerpos monoclonales que se unen a IGF-I/II y afectan a la función de IGF-I/II. Otras realizaciones se refieren a anticuerpos anti-IGF-I/II completamente humanos y preparaciones de anticuerpos anti-IGF-I/II con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo alta afinidad de unión por IGF-I/II, la capacidad para neutralizar IGF-I/II in vitro e in vivo y la capacidad para inhibir la proliferación celular inducida por IGF-I/II.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento tumoral de xenoinjerto en ratones desnudos de células NIH3T3 que expresan IGF-II e IGF-IR (células del clon 32) con los AcM 7.159.2, 7.34.1, 7.251.3 en comparación con controles de PBS e IgG2. Se muestra el volumen tumoral medio en el eje y y se muestra el tiempo tras el implante en el eje x.
La figura 2 es un gráfico que muestra el peso corporal en ratones con xenoinjerto del clon 32 tratados con los AcM 7.159.2, 7.34.1, 7.251.3 en comparación con controles de PBS e IgG2. Se muestra el peso corporal medio en el eje y y se muestra el tiempo tras el implante en el eje x.
La figura 3 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento tumoral de xenoinjerto en ratones desnudos de células NIH3T3 que expresan IGFI e IGF-IR (células P12) con el AcM 7.159.2 en comparación con el control de PBS. Se muestra el volumen tumoral medio en el eje y y se muestra el tiempo tras el trasplante (indicado por la fecha) en el eje x.
Descripción detallada
Las realizaciones de la invención descrita en el presente documento se refieren a proteínas de unión que se unen específicamente a IGF-II con reactividad cruzada por IGF-I (denominado en el presente documento “IGFI/II”). En algunas realizaciones, las proteínas de unión son anticuerpos, o fragmentos de unión de los mismos, y se unen a IGF-II con reactividad cruzada por IGF-I e inhiben la unión de estas proteínas a su receptor, IGF-IR. Otras realizaciones de la invención incluyen anticuerpos anti-IGF-I/II neutralizantes completamente humanos, y preparaciones de anticuerpos que son terapéuticamente útiles y se unen a ambos factores de crecimiento de tipo insulina. Tales preparaciones de anticuerpos anti-IGF-I/II tienen preferiblemente propiedades terapéuticas deseables, incluyendo fuerte afinidad de unión por IGF-I/II, la capacidad para neutralizar IGF-I/II in vitro yla capacidad para inhibir la proliferación celular inducida por IGF-I/IT in vivo.
Las realizaciones de la invención también incluyen fragmentos de unión aislados de anticuerpos anti-IGF-I/II. Preferiblemente, los fragmentos de unión se derivan de anticuerpos anti-IGF-I/II completamente humanos. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen Fv, Fab’ u otros fragmentos de anticuerpo bien conocidos, tal como se describe en más detalle a continuación. Las realizaciones de la invención también incluyen células que expresan anticuerpos completamente humanos contra IGF-I/II. Los ejemplos de células incluyen hibridomas, o células creadas de manera recombinante, tales como células de ovario de hámster chino (CHO) que producen anticuerpos contra IGF-I/II.
Anticuerpos anti-IGF-I/II son útiles para prevenir la transducción de señales de IGF-I/II mediada por IGF-I/II, inhibiendo de ese modo la proliferación celular. El mecanismo de acción de esta inhibición puede incluir la inhibición de la unión de IGF-I/II a su receptor, IGF-IR, la inhibición de la señalización de IGF-IR inducida por IGF-I/II o la potenciación del aclaramiento de IGF-I/II reduciendo así la concentración eficaz de IGF-I/II para la unión a IGF-IR. Las enfermedades que pueden tratarse a través de este mecanismo de inhibición incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neoplásicas, tales como, melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumores ginecológicos, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, glioblastoma y cánceres y tumores del tiroides, estómago, próstata, mama, ovario, vejiga, pulmón, útero, riñón, colon y páncreas, glándula salival y colorrectal.
Otras realizaciones de la invención incluyen ensayos de diagnóstico para determinar específicamente la cantidad de IGFI/ II en una muestra biológica. El kit de ensayo puede incluir anticuerpos anti-IGF-I/II junto con los marcadores necesarios para detectar tales anticuerpos. Estos ensayos de diagnóstico son útiles para examinar enfermedades relacionadas con factores de crecimiento incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades neoplásicas, tales como, melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumores ginecológicos, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, glioblastoma y carcinoma de la tiroides, estómago, próstata, mama, ovario, vejiga, pulmón, útero, riñón, colon y páncreas, glándula salival y colorrectal. Otros estados patológicos no neoplásicos pueden incluir acromegalia y gigantismo, psoariasis, osteoporosis, aterosclerosis y reestenosis del músculo liso de vasos sanguíneos, así como diabetes.
Realizaciones, características adicionales y similares referentes a anticuerpos anti-IGF-I/II se proporcionan en detalle adicional a continuación.
Lista de secuencias
Las realizaciones de la invención incluyen los anticuerpos anti-IGF-I/II específicos enumerados a continuación en la tabla 1. Esta tabla notifica el número de identificación de cada anticuerpo anti-IGF-I/II, junto con el número de SEQ ID de los genes de cadena pesada y cadena ligera correspondientes. Además, también se proporcionan a continuación en la tabla 1 las secuencias de la línea germinal a partir de las que se derivan cada cadena pesada y cadena ligera.
A cada anticuerpo se le ha dado un número de identificación que incluye o bien dos o bien tres números separados por uno o dos puntos decimales. En algunos casos, se prepararon varios clones de un anticuerpo. Aunque los clones tienen las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico idénticas que la secuencia original, también pueden enumerarse por separado, con el número del clon indicado mediante el número a la derecha de un segundo punto decimal. Por tanto, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico del anticuerpo 7.159.2 son idénticas a las secuencias del anticuerpo 7.159.1.
Tal como puede observarse comparando las secuencias en la lista de secuencias, SEQ ID NOs.: 1-20 difieren de SEQ ID NOs.: 39-58 porque SEQ ID NOs.: 39-58 incluyen las regiones de dominios no traducidos, de péptido señal y constantes para cada cadena pesada o ligera secuenciada.
TABLA 1
AcM ID No.:
Secuencia SEQ ID NO:
7.158.1
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 1
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
2
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
3
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
4
7.159.2
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 5
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
6
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
7
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
8
7.34.1
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 9
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
10
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
11
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
12
7.251.3
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 13
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
14
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
15
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
16
7.234.1
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 17
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
18
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
19
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
20
7.158.1
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 39
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
40
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
41
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
42
7.159.2
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 43
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
44
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
45
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
46
7.34.1
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 47
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
48
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
49
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
50
7.251.3
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 51
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
52
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
53
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
54
7.234.1
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 55
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
56
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
57
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
58
Línea germinal (7.158.1)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 59
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
60
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
61
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
62
Línea germinal (7.159.1)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 63
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
64
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
65
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
66
Línea germinal (7.34.1)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 67
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
68
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
69
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
70
Línea germinal (7.251.3)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 71
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada
72
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
73
Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera
74
Definiciones
A menos que se definan de otra manera, los términos científicos y técnicos usados en el presente documento deben
5 tener los significados que entienden comúnmente los expertos habituales en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares deben incluir pluralidades y los términos plurales deben incluir el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligo o polinucleótidos descritas en el presente documento se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica.
10 Se usan técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo tisular y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante o como se lleva a cabo comúnmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva. Véase por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), que se incorpora en el presente documento como referencia. Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documentos se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se usan técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéuticas, y tratamiento de pacientes.
Tal como se utilizan según la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, debe entenderse que tienen los siguientes significados:
El término “IGF-I” se refiere a la molécula factor de crecimiento de tipo insulina-I, y el término “IGF-II” se refiere a la molécula factor de crecimiento de tipo insulina-II. El término “IGF-I/II” se refiere a ambas moléculas, factores de crecimiento de tipo insulina-I y II, y se refiere a la unión preferente a IGF-II con reactividad cruzada por IGF-I. Por tanto, un anticuerpo que se une a IGF-I/II se unirá preferentemente a IGF-II, pero reaccionaría de manera cruzada con IGF-I, uniéndose a IGF-II con afinidad superior que a IGF-I. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a IGF-II con 2,5 veces más afinidad que a IGF-I. En determinadas realizaciones, el anticuerpo puede unirse a IGF-II con al menos 5, al menos 10, al menos 25, al menos 50 o al menos 150 veces más afinidad que a IGF-I.
El término “neutralizante” cuando se refiere a un anticuerpo se refiere a la capacidad de un anticuerpo para eliminar,
o reducir significativamente, la actividad de un antígeno diana. Por consiguiente, un anticuerpo anti-IGF-I/II neutralizante puede eliminar o reducir significativamente la actividad de IGF-I/II. Un anticuerpo frente a IGF-I/II neutralizante puede actuar, por ejemplo, bloqueando la unión de IGF-I/II a su receptor IGF-IR. Bloqueando esta unión, la transducción de señales mediada por IGF-IR se elimina significativamente, o completamente. De manera ideal, un anticuerpo neutralizante contra IGF-I/II inhibe la proliferación celular.
El término “polinucleótido aislado” tal como se usa en el presente documento debe significar un polinucleótido que se ha aislado de su entorno en el que se produce de manera natural. Tales polinucleótidos pueden ser genómicos, ADNc o sintéticos. Los polinucleótidos aislados preferiblemente no están asociados con toda o una parte de los polinucleótidos con los que se asocian en la naturaleza. Los polinucleótidos aislados pueden estar operativamente unidos a otro polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza. Además, los polinucleótidos aislados preferiblemente no se producen en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.
El término “proteína aislada” al que se hace referencia en el presente documento significa una proteína que se ha aislado de su entorno en el que se produce de manera natural. Tales proteínas pueden derivarse de ADN genómico, ADNc, ADN recombinante, ARN recombinante u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la “proteína aislada” (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de proteína murinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza.
El término “polipéptido” se usa en el presente documento como un término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por tanto, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies del género polipéptido. Polipéptidos preferidos según la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o lambda, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas. Polipéptidos preferidos según la invención pueden comprender también únicamente las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana o fragmentos de las mismas.
La expresión “que se produce de manera natural” tal como se usa en el presente documento tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otra forma se produce de manera natural.
La expresión “operativamente unido” tal como se usa en el presente documento se refiere a posiciones de componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar de su manera prevista. Por ejemplo, una secuencia de control “operativamente unida” a una secuencia codificante está conectada de tal modo que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias control.
El término “polinucleótido” tal como se le hace referencia en el presente documento significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, o bien ribonucleótidos o desoxinucleótidos o bien una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, o heterodúplex de ARN-ADN. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.
El término “oligonucleótido” al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos que se producen de manera natural y modificados unidos entre sí mediante enlaces que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprenden generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y lo más preferiblemente de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son habitualmente monocatenarios, por ejemplo para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos
o bien sentido o bien antisentido.
La expresión “nucleótidos que se producen de manera natural” a la que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término “nucleótidos modificados” al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término “enlaces oligonucleotídicos” al que se hace referencia en el presente documento incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Véanse por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al. patente estadounidense n.º 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cuyas descripciones se incorporan por el presente documento como referencia. Un oligonucleótido puede incluir un marcador para su detección si se desea.
La expresión “hibridar selectivamente” a la que se hace referencia en el presente documento significa unirse de manera detectable y específica. Polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos hibridan selectivamente con hebras de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de alta rigurosidad para lograr condiciones de hibridación selectiva tal como se conocen en la técnica y se comentan en el presente documento. Generalmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos o fragmentos de anticuerpos y una secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos el 80%, y más normalmente con homologías preferiblemente crecientes de al menos el 85%, el 90%, el 95%, el 99% y el 100%.
Dos secuencias de aminoácidos son “homólogas” si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para apareamiento máximo. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que están apareándose) en apareamiento máximo; se prefieren longitudes de hueco de 5 o menos prefiriéndose más 2 o menos. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de las mismas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, tal como se usa este término en el presente documento, si tienen una puntuación de alineación de como máximo 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por hueco de 6 o más. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y Suplemento 2 a este volumen, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son más de o igual al 50% idénticos cuando se alinean de manera óptima usando el programa ALIGN. Debe apreciarse que puede haber regiones de homología que difieren dentro de dos secuencias ortólogas. Por ejemplo, los sitios funcionales de ortólogos de ratón y ser humano pueden tener un grado de homología superior que regiones no funcionales.
La expresión “corresponde a” se usa en el presente documento significando que una secuencia de polinucleótido es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada evolutivamente) a toda o una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia.
En contraposición, el término “complementario a” se usa en el presente documento significando que la secuencia complementaria es homóloga a toda o una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos “TATAC” corresponde a una secuencia de referencia “TATAC” y es complementaria a una secuencia de referencia “GTATA”.
Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótido o aminoácidos: “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud completa proporcionada en una lista de secuencias o puede comprender una secuencia génica o de ADNc completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos o 8 aminoácidos de longitud y a menudo al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, una parte de la secuencia de polinucleótido o aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos, se realizan normalmente comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas comparando secuencias de las dos moléculas a lo largo de una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos aproximadamente 18 posiciones de nucleótidos contiguos o aproximadamente 6 aminoácidos en las que la secuencia de polinucleótido o secuencia de aminoácidos se compara con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o secuencias de 6 aminoácidos y en las que la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede incluir adiciones, deleciones, sustituciones y similares (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package versión 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), paquetes de software GENEWORKS™ o MACVECTOR®), o mediante inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, la que da como resultado el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generada por los diversos métodos.
El término “identidad de secuencia” significa que dos secuencias de polinucleótido o aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido a nucleótido o residuo a residuo) a lo largo de la ventana de comparación. El término “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparece el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico idéntico (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. El término “identidad sustancial” tal como se usa en el presente documento indica una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácidos, en la que el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos el 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos del 90 al 95 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótido (6 de aminoácido), frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 de aminoácido), en la que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que ascienden a un 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.
Tal como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional, véase Immunology -A Synthesis (2ª edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que se incorpora en el presente documento como referencia. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-, a-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, s-N,N,N-trimetil-lisina, s-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, c-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección a mano izquierda es la dirección amino terminal y la dirección a mano derecha es la dirección carboxilo terminal, según la convención y el uso convencional.
De manera similar, a menos que se especifique lo contrario, el extremo a mano izquierda de secuencias de polinucleótido monocatenarias es el extremo 5’; la dirección a mano izquierda de secuencias de polinucleótido bicatenarias se denomina la dirección 5’. La dirección de adición 5’ a 3’ de transcritos de ARN nacientes se denomina la dirección de transcripción; regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 5’ con respecto al extremo 5’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en el sentido de 5’”, regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 3’ con respecto al extremo 3’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en el sentido de 3’”.
Tal como se aplica a polipéptidos, el término “identidad sustancial” significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento. Preferiblemente, posiciones de residuos que no son idénticas difieren mediante sustituciones de aminoácidos conservativas.
Sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-de hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.
Tal como se comenta en el presente documento, se contempla que variaciones minoritarias en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina estén abarcadas por la presente invención, siempre que tales variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan una identidad de secuencia de al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, el 90%, el 95% y lo más preferiblemente el 99% con los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina descritos en el presente documento. En particular, se contemplan sustituciones de aminoácidos conservativas. Sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) ácida=aspartato, glutamato; (2) básica=lisina, arginina, histidina; (3) no polar=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargada=glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias más preferidas son: serina y treonina son una familia alifáticade hidroxilo; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante sobre la función de unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si la sustitución no implica un aminoácido dentro de un sitio de entramado. Puede determinarse si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional sometiendo a ensayo la actividad específica del derivado de polipéptido. Se describen ensayos en detalle en el presente documento. Los expertos habituales en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Extremos amino y carboxilo terminales preferidos de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de dominios funcionales. Pueden identificarse dominios estructurales y funcionales mediante comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o registradas. Preferiblemente, se usan métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas pronosticados que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan para dar una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según los anticuerpos descritos en el presente documento.
Sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica que se produce de manera natural. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que se produce de manera natural (preferiblemente en la parte del polipéptido fuera del/de los dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe tender a romper una hélice que aparece en la secuencia original, ni alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza a la secuencia original). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991), que se incorporan en el presente documento como referencia.
El término “fragmento de polipéptido” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxilo terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que se produce de manera natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos tienen al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente al menos 50 aminoácidos de longitud e incluso más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de longitud. El término “análogo” tal como se usa en el presente documento se refiere a polipéptidos que están compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a IGF-I/II, en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para bloquear la unión a IGF-I/II apropiada o
(3) capacidad para inhibir la actividad de IGF-I/II. Normalmente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución de aminoácidos conservativa (o adición o deleción) con respecto a la secuencia que se produce de manera natural. Los análogos tienen normalmente al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y pueden ser a menudo tan largos como un polipéptido que se produce de manera natural de longitud completa.
Se usan comúnmente análogos peptídicos en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos”. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que se incorporan en el presente documento como referencia. Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelado molecular informatizado. Pueden usarse miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles para producir un afecto terapéutico
o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido modelo (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como anticuerpo humano, pero que tiene uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH--(cis y trans),-COCH2--, --CH(OH)CH2--y -CH2SO--, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de Llisina) para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporado en el presente documento como referencia); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que están compuestos por al menos un dominio de unión que se forma a partir del plegamiento de cadenas polipeptídicas que tienen espacios de unión tridimensionales con formas de superficie interna y distribuciones de carga complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno. Un anticuerpo tiene normalmente una forma tetramérica, comprendiendo dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” y una “pesada”. Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman un sitio de unión de anticuerpo.
Se producen “fragmentos de unión” de un anticuerpo mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un receptor a un contrarreceptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al contrarreceptor en al menos aproximadamente el 20%, el 40%, el 60% o el 80%, y más habitualmente más de aproximadamente el 85% (tal como se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro).
Tal como se usa en el presente documento, una “proteína de unión” o una “proteína de unión específica” son proteínas que se unen específicamente a una molécula diana. Anticuerpos, y fragmentos de unión de anticuerpos, son proteínas de unión.
El término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína que pueda unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinante epitópicos consisten habitualmente en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y pueden tener, pero no siempre, características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es :1 mM, preferiblemente : 100 nM y lo más preferiblemente : 10 nM.
El término “agente” se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos.
“Activo” o “actividad” con respecto a un polipéptido de IGF-I/II se refiere a una parte de un polipéptido de IGF-I/II que tiene una actividad biológica o una actividad inmunológica de un polipéptido de IGF-I/II nativo. “Biológico” cuando se usa en el presente documento se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido de IGF-I/II nativo. Una actividad biológica de IGF-I/II preferida incluye, por ejemplo, proliferación celular inducida por IGF-I/II.
“Mamífero” cuando se usa en el presente documento se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
La digestión de anticuerpos con la enzima papaína da como resultado dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, conocidos también como fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc”, que no tiene actividad de unión a antígeno pero que tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima pepsina da como resultado un fragmento F(ab’)2 en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen unidos y comprenden dos sitios de unión a antígeno. El fragmento F(ab’)2 tiene la capacidad de reticular antígeno.
“Fv”, cuando se usa en el presente documento, se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que conserva los sitios tanto de reconocimiento de antígeno como de unión a antígeno.
“Fab”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
El término “AcM” se refiere a un anticuerpo monoclonal.
“Liposoma”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a una vesícula pequeña que puede ser útil para la administración de fármacos que pueden incluir el polipéptido de IGF-I/II de la invención o anticuerpos frente a un polipéptido de IGF-I/II de este tipo a un mamífero.
“Marcador” o “marcado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la adición de un resto detectable a un polipéptido, por ejemplo, un radiomarcador, marcador fluorescente, marcador enzimático marcado de manera quimioluminiscente o un grupo biotinilo. Los radioisótopos o radionúclidos pueden incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc,
125I,
111In, 131I, los marcadores fluorescentes pueden incluir rodamina, fósforos de lantánidos o FITC y los marcadores enzimáticos pueden incluir peroxidasa del rábano, 1-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina.
El término “fármaco o agente farmacéutico” tal como se usa en el presente documento se refiere a una composición
o compuesto químico que puede inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. Se usan otros términos de química en el presente documento según el uso convencional en la técnica, tal como se muestra a modo de ejemplo por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)) (incorporado en el presente documento como referencia).
Tal como se usa en el presente documento, “sustancialmente puro” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, el 90%, el 95% y el 99%. Lo más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
El término “paciente” incluye sujetos humanos y veterinarios.
Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos
Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que tienen regiones variables y/o constantes de rata o murinas. La presencia de tales proteínas murinas o derivadas de rata puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos murinos o derivados de rata, pueden generarse anticuerpos completamente humanos a través de la introducción de locus de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamífero o animal de modo que el roedor, otro mamífero o animal produce anticuerpos completamente humanos.
Un método para generar anticuerpos completamente humanos es a través del uso de cepas XenoMouse® de ratones que se han modificado por ingeniería genética para que contengan fragmentos configurados de la línea germinal con un tamaño de hasta pero inferior a 1000 kb del locus de cadena pesada humana y el locus de cadena ligera humana. Véase Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483495 (1998). Las cepas XenoMouse® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA).
La producción de las cepas XenoMouse® de ratones se comenta y perfila adicionalmente en las solicitudes de patente estadounidense con números de serie 07/466.008, presentada el 12 de enero de 1990; 07/610.515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922.649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031.801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112.848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234.145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376.279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430.938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464.584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464.582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463.191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724.752, presentada el 2 de octubre de 1996, 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996, la publicación estadounidense 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001 y las patentes estadounidenses n.os 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y
5.939.598 y las patentes japonesas n.os 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Véase también la patente europea n.º EP 0 463 151 B1, concedida y publicada el 12 de junio de 1996, la solicitud de patente internacional n.º
WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la solicitud de patente internacional n.º WO96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes y referencias citadas anteriormente se incorporan por el presente documento como referencia en su totalidad.
En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de “minilocus”. En este enfoque de minilocus, se imita un locus de Ig exógeno a través de la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por tanto, se forman uno o más genes de VH, uno o más genes de DH, uno o más genes de JH, una región constante mu y habitualmente una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) para dar un constructo para su inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente estadounidense n.º
5.545.807 concedida a Surani et al. y las patentes estadounidenses n.os 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458 cada una concedida a Lonberg y Kay, la patente estadounidense n.º 5.591.669 y 6.023.010 concedida a Krimpenfort y Berns, las patentes estadounidenses n.os 5.612.205, 5.721.367 y 5.789.215 concedidas a Berns et al., y la patente estadounidense n.º
5.643.763 concedida a Choi y Dunn, y las solicitudes de patentes estadounidenses internacionales de GenPharm con números de serie 07/574.748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575.962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810.279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853.408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904.068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990.860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053.131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096.762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155.301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161.739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo de 1994, cuyas descripciones se incorporan por el presente documento como referencia. Véanse también la patente europea n.º 0 546 073 B1, las solicitudes de patente internacional n.os WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente estadounidense n.º 5.981.175, cuyas descripción se incorporan por el presente documento como referencia en su totalidad. Véase además Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996), cuyas descripciones se incorporan por el presente documento como referencia en su totalidad.
Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de fusión microcelular, se han introducido trozos grandes de cromosomas, o cromosomas completos. Véanse las solicitudes de patentes europeas n.os 773 288 y 843 961, cuyas descripciones se incorporan por el presente documento como referencia. Adicionalmente, se han generado ratones KMT, que son el resultado del cruzamiento de ratones Tc de Kirin con ratones con minilocus de Medarex (Humab). Estos ratones tienen el transcromosoma de IgH humano de los ratones de Kirin y el transgén de la cadena kappa de los ratones de Genpharm (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
También pueden derivarse anticuerpos humanos mediante métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen pero no se limitan a presentación en fago (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), presentación en ribosoma (CAT), presentación en levadura y similares.
Preparación de anticuerpos
Se prepararon anticuerpos, tal como se describe en el presente documento, a través de la utilización de la tecnología XenoMouse®, tal como se describe a continuación. Tales ratones, entonces, pueden producir anticuerpos y moléculas de inmunoglobulina humanas y son deficientes en la producción de anticuerpos y moléculas de inmunoglobulina murinas. Las tecnologías utilizadas para lograr esto se dan a conocer en las patentes, solicitudes y referencias dadas a conocer en la sección de antecedentes en el presente documento. En particular, sin embargo, una realización preferida de producción transgénica de ratones y anticuerpos a partir de los mismos se da a conocer en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las solicitudes de patentes internacionales n.os WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, cuyas descripciones se incorporan por el presente documento como referencia. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), cuya descripción se incorpora por el presente documento como referencia.
A través del uso de tal tecnología, se han producido anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a una variedad de antígenos. Esencialmente, se inmunizan líneas XenoMouse® de ratones con un antígeno de interés (por ejemplo IGF-I/II), se recuperan células linfáticas (tales como células B) de los ratones hiperinmunizados y se fusionan los linfocitos recuperados con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Estas líneas celulares de hibridoma se examinan y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos frente al antígeno de interés. Se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos frente a IGF-I/II. Además, se proporciona en el presente documento la caracterización de los anticuerpos producidos por tales líneas celulares, incluyendo análisis de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de las cadenas pesadas y ligeras de tales anticuerpos.
Alternativamente, en lugar de fusionarse con células de mieloma para generar hibridomas, las células B pueden someterse a ensayo directamente. Por ejemplo, pueden aislarse células B CD19+ a partir de ratones XenoMouse® hiperinmunes y dejarse que proliferen y diferencien para dar células plasmáticas que secretan anticuerpos. Se examinan entonces los anticuerpos a partir de los sobrenadantes celulares mediante ELISA para detectar reactividad contra el inmunógeno IGF-I/II. Los sobrenadantes también podrían examinarse para detectar inmunorreactividad contra fragmentos de IGF-I/II para mapear adicionalmente los diferentes anticuerpos para detectar la unión a dominios de interés funcional en IGF-I/II. Los anticuerpos también pueden examinarse frente a otras quimiocinas humanas relacionadas y frente a los ortólogos de IGF-I/II de rata, ratón y primate no humano, tal como mono cynomolgus, este último para determinar la reactividad cruzada de especies. Pueden inmortalizarse células B de pocillos que contienen anticuerpos de interés mediante diversos métodos incluyendo fusión para preparar hibridomas o bien a partir de pocillos individuales o agrupados, o bien mediante infección con VEB o transfección mediante genes de inmortalización conocidos y luego sembrando en placa en medio adecuado. Alternativamente, se aíslan entonces células plasmáticas individuales que secretan anticuerpos con las especificidades deseadas usando un ensayo de placas hemolíticas específico de IGF-I/II (Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)). Las células seleccionadas como diana para la lisis son preferiblemente glóbulos rojos de oveja (SRBC) recubiertos con el antígeno IGF-I/II.
En presencia de un cultivo de células B que contiene células plasmáticas que secretan la inmunoglobulina de interés y complemento, la formación de una placa indica lisis mediada por IGF-I/II específica de los glóbulos rojos de oveja que rodean a la célula plasmática de interés. La célula plasmática específica de antígeno individual en el centro de la placa puede aislarse y la información genética que codifica para la especificidad del anticuerpo se aísla a partir de la célula plasmática individual. Usando transcripción inversa seguida por PCR (RT-PCR), puede clonarse el ADN que codifica para las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo. Tal ADN clonado puede insertarse entonces adicionalmente en un vector de expresión adecuado, preferiblemente un casete de vector tal como un ADNpc, más preferiblemente un vector de ADNpc de este tipo que contiene los dominios constantes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. El vector generado puede transfectarse entonces en células huésped, por ejemplo células HEK293, células CHO, y cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir transcripción, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas.
En general, los anticuerpos producidos mediante los hibridomas fusionados eran cadenas pesadas de IgG2 humana con cadenas ligeras kappa o lambda completamente humanas. Los anticuerpos descritos en el presente documento tienen cadenas pesadas de IgG4 humana así como cadenas pesadas de IgG2. Los anticuerpos también pueden ser de otros isotipos humanos, incluyendo IgG1. Los anticuerpos tenían altas afinidades, teniendo normalmente una Kd de desde aproximadamente 10-6 hasta aproximadamente 10-12 M o menos, cuando se mide mediante técnicas de fase de disolución y fase sólida. Se prefieren anticuerpos que tienen una KD de al menos 10-11 M para inhibir la actividad de IGF-I/II.
Tal como se apreciará, pueden expresarse anticuerpos anti-IGF-I/II en líneas celulares distintas de líneas celulares de hibridoma. Pueden usarse secuencias que codifican para anticuerpos particulares para transformar una célula huésped de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, el empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y la transducción de una célula huésped con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, tal como se muestra a modo de ejemplo mediante las patentes estadounidenses n.os 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455 (patentes que se incorporan por el presente documento en el presente documento como referencia). El procedimiento de transformación usado depende del huésped que va a transformarse. Se conocen bien en la técnica métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos.
Se conocen bien en la técnica líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células 293 de riñón epiteliales humanas y varias otras líneas celulares. Se seleccionan líneas celulares de preferencia particular a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión a IGF-I/II constitutivas.
Los anticuerpos anti-IGF-I/II son útiles en la detección de IGF-I/II en muestras de pacientes y por consiguiente son útiles como diagnósticos para estados patológicos tal como se describe en el presente documento. Además, basándose en su capacidad para neutralizar significativamente la actividad de IGF-I/II (tal como se demuestra en los ejemplos a continuación), los anticuerpos anti-IGF-I/II tienen efectos terapéuticos en el tratamiento de síntomas y estados que resultan de la expresión de IGF-I/II. En realizaciones específicas, los anticuerpos y métodos en el presente documento se refieren al tratamiento de síntomas que resultan de la proliferación celular inducida por IGF-I/II. Realizaciones adicionales implican el uso de los anticuerpos y métodos descritos en el presente documento para tratar enfermedades incluyendo enfermedades neoplásicas, tales como melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, tumores ginecológicos, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago y cáncer pancreático. Otros estados patológicos no neoplásicos pueden incluir acromegalia y gigantismo, psoriasis, osteoporosis, aterosclerosis y reestenosis del músculo liso de vasos sanguíneos, así como diabetes.
Administración terapéutica y formulaciones
Las realizaciones de la invención incluyen formulaciones farmacéuticas estériles de anticuerpos anti-IGF-I/II que son útiles como tratamientos para enfermedades. Tales formulaciones inhibirían la unión de IGF-I/II a su receptor IGF-IR, tratando de ese modo eficazmente estados patológicos en los que, por ejemplo, IGF-I/II tisular o sérico está elevado de manera anómala. Los anticuerpos anti-IGF-I/II tienen preferiblemente una afinidad adecuada para neutralizar de manera potente IGF-I/II, y tienen preferiblemente una duración adecuada de la acción para permitir una dosificación poco frecuente en seres humanos. Una duración prolongada permitirá también programas de dosificación menos frecuentes y más convenientes por vías parenterales alternativas tales como inyección subcutánea o intramuscular.
Pueden crearse formulaciones estériles, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estéril, antes de o tras la liofilización y reconstitución del anticuerpo. El anticuerpo se almacenará habitualmente en forma liofilizada o en disolución. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos se colocan generalmente en un recipiente que tiene un punto de acceso estéril, por ejemplo, un vial o bolsa de disolución intravenosa que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, tal como un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.
La vía de administración del anticuerpo es según métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intratecal, inhalación o intralesional,
o mediante sistemas de liberación sostenida tal como se indica a continuación. El anticuerpo se administra preferiblemente mediante infusión o mediante inyección en bolo.
Una cantidad eficaz de anticuerpo que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y el estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta titule la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Normalmente, el médico administrará anticuerpo hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o mediante los ensayos descritos en el presente documento.
Pueden prepararse anticuerpos, tal como se describe en el presente documento, en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica puede administrarse por vía intravenosa o a través de la nariz o el pulmón, preferiblemente como un aerosol de polvo o líquido (liofilizado). La composición también puede administrarse por vía parenteral o por vía subcutánea según se desee. Cuando se administra de manera sistémica, la composición terapéutica debe ser estéril, libre de pirógenos y debe estar en una disolución parenteralmente aceptable que tiene debido al pH, isotonicidad y estabilidad. Estas condiciones las conocen los expertos en la técnica. En resumen, se preparan formulaciones de dosificación de los compuestos descritos en el presente documento para su almacenamiento o administración mezclando el compuesto que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.
Pueden formularse composiciones estériles para inyección según la práctica farmacéutica convencional tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed., Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Por ejemplo, puede desearse la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal que se produce de manera natural como aceite de sésamo, de cacahuete o de semilla de algodón o un vehículo graso sintético como oleato de etilo o similar. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes y similares según la práctica farmacéutica aceptada.
Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) tal como se describe por Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 y Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente estadounidense n.º 3.773.919,
documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556); copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables (Langer et al., citado anteriormente), ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DepotT (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988).
Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio de disulfuros, puede lograrse la estabilización modificando residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.
Las composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendidos en formulaciones adecuadas que pueden mantener los cristales en suspensión. Estas preparaciones, cuando se inyectan por vía subcutánea o por vía intraperitoneal, pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos atrapados en liposomas. Se preparan liposomas que contienen tales anticuerpos mediante métodos conocidos per se: patente estadounidense n.º DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses n.os 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324.
La dosificación de las formulaciones de anticuerpo para un paciente dado se determinarán por el médico encargado teniendo en consideración diversos factores que se sabe que modifican la acción de los fármacos incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el momento y la vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Pueden determinarse dosificaciones terapéuticamente eficaces mediante métodos o bien in vivo o bien in vitro.
Una cantidad eficaz de los anticuerpos, descrita en el presente documento, que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y el estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta titule la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 0,001 mg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Normalmente, el médico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o tal como se describe en el presente documento.
Se apreciará que la administración que la administración de las entidades terapéuticas según las composiciones y los métodos en el presente documento se administrarán con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar transferencia, administración, tolerancia y similares mejorados. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LipofectinT), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente invención, siempre que el principio activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véanse también Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance”. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2): 210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals”. Int. J Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci. 89(8): 967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las menciones en las mismas para información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos por químicos farmacéuticos.
Diseño y generación de otros productos terapéuticos
Según la presente invención y basándose en la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan en el presente documento con respecto a IGF-I/II, el diseño de otras modalidades terapéuticas se facilita y se da a conocer a un experto en la técnica. Tales modalidades incluyen, sin limitación, productos terapéuticos de anticuerpos avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, productos terapéuticos radiomarcados y dominios V de anticuerpos sencillos, agente de unión similar a anticuerpos basado en armazones distintos de la región V, generación de productos terapéuticos peptídicos, terapias génicas, particularmente intracuerpos, productos terapéuticos antisentido y moléculas pequeñas.
En relación con la generación de productos terapéuticos de anticuerpos avanzados, en los que la fijación al complemento es un atributo deseable, puede ser posible eludir la dependencia del complemento para destruir células a través del uso de agentes biespecíficos, inmunotoxinas o radiomarcadores, por ejemplo.
Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad frente a IGF-I/II y otro frente a una segunda molécula, que se conjugan entre sí, (ii) un anticuerpo sencillo que tiene una cadena específica frente a IGF-I/II y una segunda cadena específica frente a una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de cadena sencilla que tiene especificidad frente a tanto IGF-I/II como la otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas que se conocen bien; por ejemplo, en relación con (i) y (ii) véanse por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, citado anteriormente, y en relación con (iii) véanse por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cancer (supl.) 7:51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad puede prepararse según se desee. Por ejemplo, la segunda especificidad puede prepararse en los receptores de activación de la cadena pesada, incluyendo, sin limitación, CD16 o CD64 (véase por ejemplo, Deo et al. 18:127 (1997)) o CD89 (véase por ejemplo, Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)).
También pueden modificarse anticuerpos para que actúen como inmunotoxinas utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véase por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también la patente estadounidense n.º 5.194.594. En relación con la preparación de anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos modificados también pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véanse por ejemplo, Junghans et al. en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2ª edición, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véanse también las patentes estadounidenses n.os 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827,
5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471 y 5.697.902. Sería probable que cada una de las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas destruyese células que expresan el dominio de oligomerización de subunidades de enzimas multiméricas. En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo en asociación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, se une un anticuerpo anti-IGF-I/II a un agente (por ejemplo, radioisótopo, composición farmacéutica o una toxina). Preferiblemente, tales anticuerpos pueden usarse para el tratamiento de enfermedades, tales enfermedades pueden referirse a células que expresan IGF-I/II o células que sobreexpresan IGF-VII. Por ejemplo, se contempla que el fármaco tenga la propiedad farmacéutica seleccionada del grupo de agentes antimitóticos, alquilantes, antimetabolitos, antiangiogénicos, apoptóticos, alcaloides, COX-2 y antibióticos y combinaciones de los mismos. El fármaco puede seleccionarse del grupo de mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, complejos de coordinación de platino, alcaloides de la vinca, ureas sustituidas, derivados de metilhidrazina, supresores suprarrenales, antagonistas, endostatina, taxoles, campotecinas, oxaliplatino, doxorubicinas y sus análogos, y una combinación de los mismos.
Los ejemplos de toxinas incluyen además gelonina, exotoxina de Pseudomonas (PE), PE40, PE38, toxina diftérica, ricina, ricina, abrina, toxina alfa, saporina, ribonucleasa (ARNasa), ADNasa I, enterotoxina A de estafilococos, proteína antiviral de fitolaca americana, gelonina, endotoxina de Pseudomonas, así como derivados, combinaciones y modificaciones de las mismas.
Los ejemplos de radioisótopos incluyen emisores gamma, emisores de positrones y emisores de rayos x que pueden usarse para localización y/o terapia, y emisores beta y emisores alfa que pueden usarse para terapia. Los radioisótopos descritos anteriormente como útiles para diagnósticos, pronósticos y la determinación del estadio también son útiles para productos terapéuticos. Los agentes no limitativos de agentes anticancerígenos y antileucemia incluyen antraciclinas tales como doxorubicina (adriamicina), daunorubicina (daunomicina), idarubicina, detorubicina, carminomicina, epirubicina, esorubicina y derivados de morfolino y sustituidos, combinaciones y modificaciones de los mismos. Los agentes farmacéuticos a modo de ejemplo incluyen cisplatino, taxol, caliqueamicina, vincristina, citarabina (Ara-C), ciclofosfamida, prednisona, daunorubicina, idarubicina, fludarabina, clorambucilo, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida y bleomicina, y derivados, combinaciones y modificaciones de los mismos. Preferiblemente, el anticancerígeno o antileucemia es doxorubicina, morfolinodoxorubicina o morfolinodaunorubicina.
Tal como apreciará un experto en la técnica, en las realizaciones anteriores, aunque los valores de afinidad pueden ser importantes, otros factores pueden ser tan importantes o más, dependiendo de la función particular del anticuerpo. Por ejemplo, para una inmunotoxina (toxina asociada con un anticuerpo), el acto de la unión del anticuerpo a la diana puede ser útil; sin embargo, en algunas realizaciones, la internalización de la toxina en la célula es el resultado final deseado. Como tales, pueden ser deseables en estas situaciones anticuerpos con un alto porcentaje de internalización. Por tanto, en una realización, se contemplan anticuerpos con una alta eficacia de internalización. Una alta eficacia de internalización puede medirse como un porcentaje de anticuerpo internalizado, y puede ser de desde un valor bajo hasta el 100%. Por ejemplo, en realizaciones variables, un 0,1-5, un 5-10, un 1020, un 20-30, un 30-40, un 40-45, un 45-50, un 50-60, un 60-70, un 70-80, un 80-90, un 90-99 y un 99-100% pueden ser una alta eficacia. Tal como apreciará un experto en la técnica, la eficacia deseable puede ser diferente en diferentes realizaciones, dependiendo de, por ejemplo, el agente asociado, la cantidad de anticuerpo que puede administrarse a una zona, los efectos secundarios del complejo anticuerpo-agente, el tipo (por ejemplo, tipo de cáncer) y la gravedad del problema que va a tratarse.
En otras realizaciones, los anticuerpos dados a conocer en el presente documento proporcionan un kit de ensayo para la detección de la expresión de IGF-I/II en células o tejidos de mamíferos con el fin de examinar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en la expresión de IGFI/ II. El kit comprende un anticuerpo que se une a IGF-I/II y medios para indicar la reacción del anticuerpo con el antígeno, si está presente.
En algunas realizaciones, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente, que comprende una composición que contiene un anticuerpo anti-IGF-I/II, y un prospecto o etiqueta que indica que la composición puede usarse para tratar una enfermedad mediada por la expresión de IGF-I/II. Preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un ser humano, recibe el anticuerpo anti-IGFI/ II.
Combinaciones
Los anticuerpos anti-IGF-I/II definidos anteriormente en el presente documento pueden aplicarse como una única terapia o pueden implicar, además del compuesto de la invención, cirugía convencional o radioterapia o quimioterapia. Tal quimioterapia puede incluir una o más de las siguientes categorías de agentes antitumorales:
(i)
fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, tal como se usa en oncología médica, tales como agentes alquilantes (por ejemplo cis-platino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalán, clorambucilo, busulfano y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina e hidroxiurea; antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina); agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides de la vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotere); e inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecán y camptotecina);
(ii)
agentes citostáticos tales como antiestrógenos (por ejemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno), reguladores por disminución del receptor de estrógenos (por ejemplo fulvestrant), antiandrógenos (por ejemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina), progestógenos (por ejemplo acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5a-reductasa tales como finasterida;
(iii) agentes que inhiben la invasión de células cancerosas (por ejemplo inhibidores de metaloproteinasas como marimastat e inhibidores de la función receptora del activador de plasminógeno de urocinasa);
(iv)
inhibidores de la función de factores de crecimiento, por ejemplo tales inhibidores incluyen anticuerpos frente a factores de crecimiento, anticuerpos frente a receptores de factores de crecimiento (por ejemplo el anticuerpo antierbb2 anticuerpo trastuzumab [HerceptinT] y el anticuerpo anti-erbb1 cetuximab [C225]), inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de MEK, inhibidores de tirosina cinasas e inhibidores de serina/treonina cinasas, por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo inhibidores de tirosina cinasas de la familia de EGFR tales como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N(3-cloro-4fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (CI 1033)), por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de las plaquetas y por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos;
(v)
agentes antiangiogénicos tales como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo el anticuerpo anti-factor de crecimiento de células endoteliales vasculares bevacizumab [AvastinT], compuestos tales como los dados a conocer en las solicitudes de patentes internacionales WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 y WO 98/13354) y compuestos que funcionan mediante otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de la integrina av13, angiostatina e inhibidores de la acción de angiopoyetinas, por ejemplo angiopoyetina 1 y angiopoyetina 2);
(vi)
agentes de daño vascular tales como combretastatina A4 y compuestos dados a conocer en las solicitudes de patentes internacionales WO 99/02166, WO00/40529, WO 00/41669, WO01/92224, WO02/04434 y WO02/08213
(vii) terapias antisentido, por ejemplo las que se dirigen a las dianas enumeradas anteriormente, tales como ISIS 2503, un antisentido anti-ras;
(viii) enfoques de terapia génica, incluyendo por ejemplo enfoques para sustituir genes aberrantes tales como p53 aberrante o BRCA1 o BRCA2 aberrante, enfoques de GDEPT (terapia con profármaco enzimático dirigido a gen) tales como los que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima nitrorreductasa bacteriana y enfoques que aumentan la tolerancia del paciente a la quimioterapia o radioterapia tales como terapia génica de resistencia a múltiples fármacos;
(ix)
enfoques de inmunoterapia, incluyendo por ejemplo enfoques ex vivo e in vivo para aumentar la inmunogenicidad de células tumorales del paciente, tales como transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de colonias de macrófagos, enfoques para disminuir la anergia de células T, enfoques que usan células inmunitarias transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citocinas, enfoques que usan líneas celulares tumorales transfectadas con citocinas y enfoques que usan anticuerpos antiidiopáticos;
(x)
inhibidores del ciclo celular incluyendo por ejemplo inhibidores de CDK (por ejemplo flavopiridol) y otros inhibidores de los puntos de control del ciclo celular (por ejemplo cinasa de punto de control); inhibidores de aurora cinasa y otras cinasas implicadas en la regulación de la citocinesis y mitosis (por ejemplo cinesinas mitóticas); e inhibidores de histona desacetilasas;
(xi)
antagonistas de endotelinas, incluyendo antagonistas de endotelina A, antagonistas de endotelina B y antagonistas de endotelinas A y B; por ejemplo ZD4054 y ZD1611 (documento WO 96 40681), atrasentán y YM598; y
(xii) enfoques terapéuticos biterapéuticos, por ejemplo los que usan péptidos o proteínas (tales como anticuerpos o construcciones de dominios receptores externos solubles) que o bien secuestran ligandos de receptores, bloquean la unión del ligando al receptor o bien disminuyen la señalización del receptor (por ejemplo debido a una degradación potenciada del receptor o a niveles de expresión reducidos).
Tal tratamiento conjunto puede lograrse por medio de dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de combinación emplean los compuestos de esta invención dentro del intervalo de dosificación descrito anteriormente en el presente documento y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados logrados se proporcionan para fines ilustrativos sólo y no debe interpretarse que limitan las enseñanzas en el presente documento.
EJEMPLO 1
Inmunización y TITULACIÓN
Inmunización
Se usaron como antígenos IGF-I e IGF-II humanos recombinantes obtenidos de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, n.º de cat. de MN 291-G1 y 292-G2 respectivamente). Se desarrollaron anticuerpos monoclonales contra IGF-I/II inmunizando secuencialmente ratones XenoMouse® (cepas de XenoMouse XMG2 y XMG4 (cepa 3C-1), Abgenix, Inc. Fremont, CA). Se inmunizaron los animales XenoMouse por la vía de la almohadilla plantar para todas las inyecciones. El volumen total de cada inyección fue de 50 !l por ratón, 25 !l por almohadilla plantar. Se inmunizaron un total de diez (10) ratones en cada grupo. Cada inyección fue con 10 !g por ratón de IGF-I o IGF-II solo o conjugado con antígeno de hemocianina de lapa californiana (KLH) como portador, tal como se detalla en la tabla 2. Se constituyó la primera inyección en PBS de Dulbecco (DPBS) y se mezcló 1:1 v/v con adyuvante Titermax Gold (n.º de cat. de SIGMA T2684, n.º de lote K1599). Se administraron entonces un total de 8 a 11 refuerzos adicionales a lo largo de un periodo de 27 a 38 días, mezclados con 25 !g de Adju-Phos (gel de fosfato de aluminio, n.º de catálogo 1452-250, n.º de lote 8937, HCl Biosector) y 10 !g de CpG (15 !l de adyuvante ImmunEasy Mouse, n.º de catálogo 303101; n.º de lote 11553042; Qiagen) por ratón, seguido por un refuerzo final de 10 !g de antígeno en DPBS libre de pirógenos, sin adyuvante. Para inmunización combinada (animales inmunizados con tanto IGF-I como IGF-II), se administró el segundo antígeno en los últimos dos (2) refuerzos.
TABLA 2. RESUMEN DE LA INMUNIZACIÓN
Grupo de inmunización
Inmunógeno inicial Inmunógeno final Conjugado con KLH Isotipo de ratones Grupo de fusión
1
IGF-I IGF-1 - IgG2-KA
1
3
IGF-1 IGF-1 - IgG4-KA 1
5
IGF-1 IGF-1 + IgG2-KA 1
7
IGF-1 IGF-1 + IgG4-KA 1
2
IGF-2 IGF-2 - IgG2-KA
2
4
IGF-2 IGF-2 - IgG4-KA 2
6
IGF-2 IGF-2 + IgG2-KA 2
8
IGF-2 IGF-2 + IgG4-KA 2
9
IGF-1 IGF-2 - IgG2-KA 3
11
IGF-1 IGF-2 - IgG4-KA 3
13
IGF-1 IGF-2 + IgG2-KA 3
15
IGF-1 IGF-2 + IgG4-KA 3
10
IGF-2 IGF-1 - IgG2-KA 4
12
IGF-2 IGF-1 - IgG4-KA 4
14
IGF-2 IGF-1 + IgG2-KA 4
16
IGF-2 IGF-1 + IgG4-KA 4
5 EJEMPLO 2
RECUPERACIÓN DE LINFOCITOS, AISLAMIENTOS DE CÉLULAS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS
10 Se sacrificaron los ratones inmunizados mediante dislocación cervical, y se extirparon los ganglios linfáticos drenantes y se agruparon a partir de cada cohorte. Se disociaron las células linfoides mediante molienda en DMEM para liberar las células de los tejidos y se suspendieron las células en DMEM. Se contaron las células, y se añadieron 0,9 ml de DMEM por 100 millones de linfocitos al sedimento celular para resuspender las células con cuidado aunque completamente. Usando 100 !l de perlas magnéticas CD90+ por 100 millones de células, se
15 marcaron las células incubando las células con las perlas magnéticas a 4ºC durante 15 minutos. Se cargó la suspensión celular cargada magnéticamente que contenía hasta 108 células positivas (o hasta 2x109 células totales) en una columna LS+ y se lavó la columna con DMEM. Se recogió el efluente total como la fracción negativa para CD90 (se esperaba que la mayoría de estas células fuesen células B.
20 Se realizó la fusión mezclando células B enriquecidas lavadas a partir de lo anterior y células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretoras adquiridas de la ATCC, n.º de cat. CRL 1580 (Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 15481550) a una razón de 1:1. Se sedimentó con cuidado la mezcla de células mediante centrifugación a 800 x g. Tras la eliminación completa del sobrenadante, se trataron las células con 2-4 ml de disolución Pronase (CalBiochem, n.º de cat. 53702; 0,5 mg/ml en PBS) durante no más de 2 minutos. Entonces, se añadieron 3-5 ml de FBS para detener la
25 actividad enzimática y se ajustó la suspensión hasta 40 ml de volumen total usando disolución de electrofusión celular, (ECFS, sacarosa 0,3 M, Sigma, n.º de cat. S7903, acetato de magnesio 0,1 mM, Sigma, n.º de cat. M2545, acetato de calcio 0,1 mM, Sigma, n.º de cat. C4705). Se eliminó el sobrenadante tras la centrifugación y se resuspendieron las células en 40 ml de ECFS. Se repitió esta etapa de lavado y se resuspendieron de nuevo las células en ECFS hasta una concentración de 2x106 células/ml.
30 Se realizó la electrofusión celular usando un generador de fusión (modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA). El tamaño de la cámara de fusión usada era de 2,0 ml, usando los siguientes parámetros de instrumento:
Condición de alineación: tensión: 50 V, tiempo: 50 s.
35 Rotura de la membrana a: tensión: 3000 V, tiempo: 30 !s
Tiempo de retención tras la fusión: 3 s.
Tras la ECF, se retiraron cuidadosamente las suspensiones celulares de la cámara de fusión en condiciones
5 estériles y se transfirieron a un tubo estéril que contenía el mismo volumen de medio de cultivo de hibridomas (DMEM, JRH Biosciences), FBS al 15% (Hyclone), complementado con L-glutamina, pen./estrep., OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). Se incubaron las células durante 15-30 minutos a 37ºC, y luego se centrifugaron a 400 x g (1000 rpm) durante cinco minutos. Se resuspendieron las células con cuidado en un pequeño volumen de medio de selección de hibridomas (medio de cultivo de hibridomas
10 complementado con 0,5x HA (Sigma, n.º de cat. A9666)), y se ajustó el volumen apropiadamente con más medio de selección de hibridomas, basándose en una siembra en placa final de 5x106 células B totales por placa de 96 pocillos y 200 !l por pocillo. Se mezclaron las células con cuidado y se pipetearon en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer. En el día 7 ó 10, se retiró la mitad del medio, y volvieron a alimentarse las células con medio de selección de hibridomas.
15 EJEMPLO 3
SELECCIÓN DE ANTICUERPOS CANDIDATOS MEDIANTE ELISA
20 Tras 14 días de cultivo, se examinaron los sobrenadantes de hibridoma para detectar anticuerpos monoclonales específicos de IGF-I/II. Se recubrieron las placas de ELISA (Fisher, n.º de cat. 12-565-136) con 50 !l/pocillo de IGF-I
o IGF-II humano (2 !g/ml) en tampón de recubrimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6, NaHCO3 8,4 g/l), luego se incubaron a 4ºC durante la noche. Tras la incubación, se lavaron las placas con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en PBS) 3 veces. Se añadieron 200 !l/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,1%,
25 timerosal al 0,01% en 1x PBS) y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la incubación, se lavaron las placas con tampón de lavado tres veces. Se añadieron 50 !l/pocillo de sobrenadantes de hibridoma, y controles positivos y negativos, y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas.
Tras la incubación, se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado. Se añadieron 100 ml/pocillo de
30 anticuerpo de detección de cabra anti-huIgGFc-HRP (Caltag, n.º de cat. H10507), y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora. En un examen secundario, se examinaron los positivos en un primer examen en dos conjuntos, uno para la detección de IgG humana (cadena pesada) y el otro para la detección de la cadena ligera kappa de Ig humana (anti-hIg kappa-HRP de cabra (Southern Biotechnology, n.º de cat. 2060-05) con el fin de demostrar la composición completamente humana para tanto IgG como Ig kappa. Tras la incubación, se lavaron las
35 placas tres veces con tampón de lavado. Se añadieron 100 !l/pocillo de TMB (BioFX Lab. n.º de cat. TMSK-010001) y se dejó que las placas se revelaran durante aproximadamente 10 minutos (hasta que los pocillos control negativo apenas comenzaron a mostrar color). Entonces se añadieron 50 !l/pocillo de disolución de detención (disolución de detención de TMB, (BioFX Lab. n.º de cat. STPR-0100-01) y se leyeron las placas en un lector de placas de ELISA a 450 nm. Tal como se indica en la tabla 3, había un total de 1.233 pocillos que contenían
40 anticuerpos contra IGF-I y II.
Se contraexaminaron todos los anticuerpos que se unían en el ensayo ELISA para detectar la unión a insulina mediante ELISA con el fin de excluir los que reaccionaban de manera cruzada con insulina. Se recubrieron las placas de ELISA (Fisher, n.º de cat. 12-565-136) con 50 !l/pocillo de insulina recombinante (concentración: 1 !g/ml;
45 Sigma, n.º de catálogo I2643) en tampón de recubrimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6, NaHCO3 8,4 g/l), luego se incubaron a 4ºC durante la noche. Tal como se detalla en la tabla 3, un total de 1.122 anticuerpos de los 1233 anticuerpos originales reaccionaron de manera cruzada con insulina.
TABLA 3. RESUMEN DEL EXAMEN 50
N.º de Fn
Cepa de ratón Inmunógeno Diana con detección de hG Diana con detección de hK+hL IGF-I(+) e IGF-II (+) IGF-I(+) y IGF-II(+) e insulina humana (-)
1
G2 KL IGF-I-KLH IGF-II IGF-I 36 28
2
G4 KL IGF-I-KLH IGF-II IGF-I 65 55
3
G2 KL IGF-II o IGF-II-KLH IGF-I IGF-II 168 150
4
G4 KL IGF-II o IGF-II-KLH IGF-I IGF-II 197 194
5
G2KL IGF-I/-II-KLH IGF-II IGF-II 54 50
6
G4 KL IGF-I/-II-KLH IGF-II IGF-II 101 86
7
G2 KL IGF-II/-I-KLH IGF-II IGF-II 294 271
8
G4 KL IGF-II/-I o IGF-II/-I-KLH IGF-II IGF-II 318 288
F1 a F4 total
466 427
F5 a F8 total
767 695
Total
1.233 1.122
Finalmente, los anticuerpos que se seleccionaron en el contraexamen se sometieron a prueba entonces mediante ELISA para confirmar la unión a proteína IGF-I e IGF-II de ratón. Se identificaron un total de 683 líneas de hibridoma que tienen reactividad cruzada con IGF-I/II de ratón. Por consiguiente, estas líneas de hibridoma expresaban
5 anticuerpos que se unían a IGF-I humano, IGF-II humano, IGF-I de ratón e IGF-II de ratón, pero no se unían a insulina humana.
EJEMPLO 4
10 INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DE IGF-I E IGF-II A IGF-IR
El fin de este estudio era examinar los 683 anticuerpos de IgG2 e IgG4 humanos anti-IGF-I/II en la fase de sobrenadante de hibridoma para detectar actividad neutralizante, tal como se determina mediante la inhibición de la unión de IGF-I e IGF-II al receptor IGF-IR. Por tanto, se realizó un ensayo de unión a receptor/ligando con células
15 NIH3T3 que sobreexpresan el receptor IGF-IR humano, tal como se describe a continuación.
En resumen, se bloquearon placas filtrantes Multiscreen (PVDF de 96 pocillos 0,65 mM MultiScreen, Millipore, n.º de cat. MADV N0B 10) con tampón de bloqueo (PBS que contenía BSA al 10% con NaN3 al 0,02%) a 200 !l/pocillo durante la noche a 4ºC. Se diluyó IGF marcado con [12I] (n.º de cat. de Amersham Life Sciences IM172 (IGF-I) o 20 IM238 (IGF-II)) a 100 !Ci/ml y 50 nM hasta la concentración apropiada (70 pM final para IGF-I y 200 pM final para IGF-II) en tampón de unión (PBS que contenía BSA al 2% con NaN3 al 0,02%). Se lavó la placa filtrante recubierta con tampón de bloqueo una vez con 200 !l de PBS, y se preincubaron 50 !l de sobrenadantes de Ac anti-IGF-I/II (diluidos en tampón de unión hasta un volumen final del 25%) con 25 !l de [125I]-IGF en la placa MultiScreen durante 30-60 minutos en hielo. Se recogieron con tripsina fibroblastos de ratón NIH3T3 subconfluentes que expresaban de
25 manera estable hIGF-IR (obtenidos de AstraZeneca) y se resuspendieron en tampón de unión frío a 6x106/ml, y se añadieron 25 !l de células a la placa para una incubación de dos horas en hielo. Se lavó la placa cuatro veces con 200 !l de PBS frío y se secó durante la noche. Se añadieron veinticinco ml/pocillo de centelleador (cóctel SuperMix, n.º de cat. de Wallac/Perkin Elmer 1200-439) y se leyeron las placas usando un lector Microbeta Trilux (Wallac).
30 Se usaron los siguientes controles por placa de examen: sin anticuerpo (IGF total unido), AcM anti-IGF-I (n.º 05-172, Upstate) o anti-IGF-II (n.º MAB292, R&D Systems) neutralizantes control a 50 !g/ml (fondo no específico) y de 0,075 a 0,5 !g/ml (valores de CE50 aproximados de los anticuerpos neutralizantes), y AcM de IgG2 (PK16.3.1, Abgenix, n.º de lote 360-154) o IgG4 (108.2.1, Abgenix, n.º de lote 718-53A) de isotipo coincidente a una concentración de 0,5 !g/ml (valor de CE50 aproximado de anticuerpos neutralizantes). Se añadió una titulación adicional de
35 anticuerpos neutralizantes control y anticuerpos humanos control de isotipo coincidente a una placa por ensayo de examen (dilución en serie 1/10 a partir de 50 !g/ml (333,3 nM)). Se prepararon todos los controles con o sin anticuerpos en tampón de unión complementado con sobrenadante agotado de IgG2 o IgG4 humana anti-KLH a un volumen final del 25%.
40 Se determinó el porcentaje de inhibición tal como sigue:
% de inhibición = ([CPM media total de 125I-IGF unido) – (CPM media total de 125I-IGF unido en presencia de anticuerpo)] / [(CPM media total de 125I-IGF unido) – (CPM media total de 125I-IGF unido en presencia de un exceso de anticuerpo neutralizante control*)] x 100
* Se determinó el fondo no específico como CPM de células con un exceso de Ac anti-IGF neutralizante control (50 !g/ml, 333,3 nM), que se encontró que era equivalente a un exceso de IGF frío (inferior o igual al 10% de CPM total).
50 Se separó el examen de sobrenadante anti-IGF-I/II por isotipo debido a problemas de disponibilidad de ligando radiomarcado. Tal como se muestra en la tabla 4, se examinaron en primer lugar sobrenadantes de los anticuerpos anti-IGF-I/II con un isotipo de IgG2 (293 totales) frente a IGF-I radiomarcado. Se aplicó inicialmente un punto de corte al 40% de inhibición a este examen (es decir, se seleccionaron líneas de hibridoma que inhibían al 40% y por encima), y se seleccionaron 111 aciertos para el examen posterior frente a IGF-II. De los 111 aciertos, se encontró que un total de 91 líneas inhibían la unión de IGF-II a su receptor con un punto de corte del 50%. Se seleccionaron un total de 71 aciertos finales tomando los sobrenadantes que neutralizaron el 50% de la actividad de tanto IGF-I como IGF-II.
5 Se examinaron inicialmente todos los sobrenadantes que expresaban isotipos de IgG4 (390 totales) frente a IGF-II radiomarcado, y se examinaron posteriormente 232 aciertos con un punto de corte al 50% de inhibición frente a IGF-
I. Un total de 90 líneas podían inhibir la unión de IGF-I a su receptor con un punto de corte del 50%. Tras combinar los aciertos para IgG2 (71) e IgG4 (90), se obtuvieron un total de 161 líneas que inhibían IGF-I e IGF-II en un 50% o más.
10 En conclusión, a partir de los 683 sobrenadantes originales, se seleccionaron 343 (111 de IgG2 y 232 de IgG4, 50,2%) a partir del primer examen con o bien IGF-I o bien IGF-II. Se obtuvieron un total de 161 aciertos finales (23,6% de las líneas originales), que pueden bloquear la unión de tanto IGF-I como IGF-II a IGF-IR con unos criterios de punto de corte globales del 50% de inhibición.
TABLA 4. RESUMEN DEL EXAMEN DE SOBRENADANTE AGOTADO ANTI-IGF-I/II (PUNTO DE CORTE DEL 50%)
Actividad de ESN
Fusión n.º
Cepa de ratón Inmunógeno hIGF-II con hG*/hK+ o hG+/hL+ Ensayo de unión R/L de IGF-I % de IGF-I+ total Ensayo de unión R/L de IGF-II en IGF-I+ % de IGF-I/II+ total Ensayo de unión R/L de IGF-II % de IGF-II+ total Ensayo de unión R/L de IGF-I en IGF-II+ % de IGF-I/II+ total
1
G2 KL IGF-I-KLH 14 12 13 85,7 26,5 1 4 7,1 8,2 4 86 20,0 75,4 4, 36 20,0 31,6
2
G4 KL IGF-I-KLH 20
3
G2 KL IGF-II o IGF-II-KLH 49
4
G4 KL IGF-II o IGF-II-KLH 114
5
G2 KL IGF-I/-II-KLH 32 11 75 34,4 37,9 7 59 21,9 29,8 21 121 44,7 57,9 8 42 17,0 20,1
6
G4 KL IGF-V-II-KLH 47
7
G2 KLH IGF-III-I-KLH 198
8
G4 KL IGF-II/-I o IGF-II/-I-KLH 209
683
111 Punto de corte del 40% 16,3 71 10,4 232 34,0 90 13,2
IgG2
IgG4
EJEMPLO 5
ELISAS CON ALTA CONCENTRACIÓN DE ANTÍGENO Y CONCENTRACIÓN LIMITADA DE ANTÍGENO
5 Con el fin de determinar las afinidades relativas entre las 161 líneas de hibridoma seleccionadas en el ejemplo 4, así como la concentración de anticuerpo en los sobrenadantes de cada línea, se llevaron a cabo ensayos ELISA de alta concentración de antígeno (HA) y concentración limitada de antígeno (LA). En el ensayo de cuantificación de HA, la alta concentración de antígeno y la incubación durante la noche limitan el efecto de afinidad del anticuerpo, permitiendo la cuantificación de la cantidad relativa de anticuerpo específico de antígeno presente en cada muestra.
10 La baja concentración de antígeno en el ensayo de LA limita el efecto de la concentración del anticuerpo y da como resultado una clasificación de anticuerpos basada en su afinidad relativa.
Ensayo de cuantificación con alta concentración de antígeno
15 Se recubrieron placas de ELISA con cantidades relativamente grandes de antígeno o bien IGF-I o bien IGF-II (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN N.º de cat. 291-G1 y 292-G2, respectivamente) a 500 ng/ml (67 nM). Se titularon los sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpo en un intervalo de dilución de 1:50 a 1:12200. Se usó un control de un anticuerpo específico para IGF conocido (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN N.º de cat. MAB291 y MAB292, respectivamente) para definir el intervalo lineal del ensayo. Entonces se usaron los datos dentro del
20 intervalo lineal para deducir la concentración relativa del anticuerpo específico para IGF en cada muestra titulada.
Ensayo de concentración limitada de antígeno
Se recubrieron placas de microtitulación con concentraciones bajas de antígeno. Se añadieron a cada pocillo
25 cincuenta microlitros (50 !l) de IGF-I o IGF-II a 64, 32, 16, 8, 4 y 2 ng/ml (cubriendo un intervalo de 8,5 nM a 0,26 nM) en 1% de leche desnatada / 1X PBS pH 7,4 / 0,5% de azida. Se incubó la placa durante 30 minutos.
Se lavaron las placas cuatro veces (4X) con agua y se añadieron a cada pocillo 50 !l de sobrenadante de hibridoma que contenía anticuerpos de prueba diluidos 1,25 en 1% de leche desnatada / 1X PBS pH 7,4 / 0,5% de azida. Se
30 envolvieron las placas de manera apretada con papel plástico o película de parafina, y se incubaron durante la noche con agitación a temperatura ambiente.
Al día siguiente, se lavaron todas las placas cinco veces (5X) y se añadieron a cada pocillo 50 !l de anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc de IgG humana -HRP a una concentración de 0,5 ug/ml en 1% de leche, 1X PBS pH 7,4.
35 Se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
Se lavaron las placas al menos cinco veces (5X con agua del grifo). Se añadieron a cada pocillo cincuenta microlitros (50 !l) de HPR -sustrato de TMB y se incubó la placa durante 30 minutos. Se detuvo la reacción de HRP-TMB añadiendo a cada pocillo 50 !l de ácido fosfórico 1 M. Se midió la densidad óptica (absorbancia) a 450 nm para
40 cada pocillo de la placa.
Análisis de los datos
Se realizó un promedio de los valores de DO de los anticuerpos de prueba y se calculó el intervalo. Se seleccionaron
45 los anticuerpos con la señal y aceptabilidad más alta y desviación estándar baja como anticuerpos que tenían una afinidad más alta por el antígeno que un anticuerpo de referencia.
Entonces se realizó un análisis para seleccionar los anticuerpos principales basándose o bien en la neutralización (ejemplo 4), en la potencia (baja concentración de anticuerpo tal como se determina por ELISA HA e inhibición alta 50 de unión a ligando), en la afinidad (ELISA LA) o bien en los tres criterios. A partir de este análisis, se generó una lista de 25 anticuerpos. Un análisis separado basado en el % de inhibición promedio de la unión de IGF-I y -II y la afinidad tanto por IGF-I como por IGF-II generó una segunda lista de 25 anticuerpos. Dieciséis anticuerpos fueron comunes a ambas listas, dando como resultado una lista final de 40 anticuerpos. Los resultados de LA y HA para estos 40 anticuerpos se resumen en la tabla 5. Se seleccionaron estas 40 líneas para clonación, de las que se
55 clonaron satisfactoriamente 33.
TABLA 5. RESULTADOS DE ELISA CON ALTA CONCENTRACIÓN Y CONCENTRACIÓN LIMITADA DE ANTÍGENO PARA 40 ANTICUERPOS PRINCIPALES
IGF1 HA
IGF2 HA IGF1 LA IGF2 LA IGF1 LA IGF2 LA
ID de
Promedio Des. Est. Promedio Des. Est. IGF1 IGF2 IGF1 IGF2
línea
(ug/ml) HA1 HA1 (ug/ml) HA2 HA2 2 ng/ml 2 ng/ml 4 ng/ml 4 ng/ml
4,121
1,16 0,16 3,56 1,34 0,56 0,53 1,14 0,90
4,141
1,99 0,22 1,99 0,21 0,57 0,79 1,25 1,52
4,142
4,70 0,21 3,65 0,31 0,78 1,00 1,76 1,78
4,143
1,74 0,17 2,03 0,41 0,60 0,99 1,20 1,91
4,25
1,26 0,23 1,48 0,36 0,71 0,81 1,31 1,54
4,69
7,17 1,16 6,50 0,53 0,80 0,80 1,50 1,54
4,90
1,15 0,12 3,68 0,77 0,58 0,48 1,04 0,89
7,118
10,34 1,26 10,32 1,90 0,81 0,85 1,56 1,44
7,123
13,4 3,2 12,0 2,8 1,0 1,7 1,66 2,58
7,127
7,28 0,44 6,59 1,55 1,19 1,37 2,29 2,40
7,130
4,32 0,32 3,51 1,34 0,64 1,17 1,36 1,98
7,146
12,04 0,98 9.63 0,6 0,2 0,86 0,29 1,58
7,158
9,29 0,49 7,1 0,56 1,71 1,42 3,00 2,46
7,159
16,53 1,83 41,1 0,56 1,65 0,98 2,47
7,160
4,9 0,5 5,1 0,2 1,7 2,2 3,14 3,30
7,175
8,46 0,49 6,21 1,22 0,13 0,34 0,14 0,62
7,202
11,94 1,98 15,24 1,72 1,11 1,68 2,28 2,69
7,212
11,30 1,90 10,86 1,26 0,97 0,93 2,22 1,54
7,215
10,11 2,05 10,94 1,39 1,01 1,09 2,25 1,93
7,23
4,30 0,26 3,99 0,29 0,55 1,22 1,40 2,17
7,234
4,7 1,4 3,1 0,4 0,7 1,4 1,79 2,44
7,251
3 0,41 1,93 0,17 1,09 1,02 1,31 1,53
7,252
8,25 0,51 5,55 1,68 1,22 1,23 2,53 2,09
7,268
7,58 0,42 5,07 0,92 1,47 1,37 3,06 2,42
7,29
12,5 1,24 23,53 4,7 0,18 0,39 0,27 0,49
7,3
13,18 2,12 8,83 0,58 0,81 1,28 2,07 1,96
7,34
12,54 1,99 14,67 3,05 0,21 1,07 0,44 1,84
7,41
3,69 0,19 4,97 0,8 1,02 1,53 2,21 2,32
7,56
14,6 2,0 21,7 3,7 1,3 1,4 2,38 2,46
7,58
17,52 0,01 27,54 6,22 0,21 1,15 0,47 1,82
7,66
6,02 0,81 6,18 0,71 0,49 0,97 1,42 1,53
7,77
8,42 0,18 7,25 1,12 0,64 0,46 1,50 1,00
7,85
22,67 0,68 23,63 0,93 0,1 0,33 0,16 0,51
7,99
7,9 0,2 5,9 1,6 0,9 1,0 1,87 1,65
8,119
1,26 0,00 0,77 0,16 2,37 0,79 3,77 1,36
8,141
5,96 0,50 4,12 0,61 1,80 0,61 3,02 1,08
8,146
4,03 0,45 2,55 0,74 0,97 1,06 2,13 1,98
8,287
4,8 0,1 2,8 0,8 2,2 1,6 3,80 2,91
8,8
2,00 0,17 1,45 0,25 1,72 0,77 3,13 1,46
8,86
3,15 0,19 2,36 0,24 0,92 1,35 1,76 2,18
EJEMPLO 6
UNIÓN DE ANTICUERPOS A IGF-1 E IGF-II UNIDOS A IGFBP-3
5 IGF-I y -II circulan en suero principalmente unidos a proteínas de unión a IGF (IGFBP). Un objetivo fue identificar anticuerpos que no reconocen IGF en complejo con IGFBP, con el fin de evitar el agotamiento in vivo de anticuerpos anti-IGF. Se desarrolló el siguiente formato de ensayo para la caracterización de anticuerpos que reconocen IGF-I o IGF-II cuando estos factores de crecimiento forman complejos con IGFBP-3. Específicamente, este ensayo sometió
10 a prueba la capacidad de IGF en complejos IGF/anticuerpo anti-IGF para unirse a IGFBP-3.
Bloqueo mediado por anticuerpos de la captura de IGF por IGFBP-3
Se desarrolló un ensayo en el que se preformaron complejos entre IGF-I o IGF-II y anticuerpos específicos para IGF
15 a partir de los ejemplos mencionados anteriormente. Se sometió a prueba la capacidad de estos complejos para unirse a IGFBP-3 usando tecnología de ensayo AlphaScreen (PerkinElmer). En una placa de 384 pocillos, se mezclaron 10 !l de sobrenadantes de hibridoma diluidos 1:20 con 10 !L de IGF-I o IGF-II biotinilados 3 nM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron perlas donadoras AlphaScreen recubiertas con estreptavidina y perlas aceptoras AlphaScreen acopladas a IGFPB-3 (10 !L de una mezcla, para una dilución final
20 1/60 de los sobrenadantes de hibridoma), y se continuó la incubación durante otra hora. Entonces se leyeron las muestras en un lector de placas Packard Fusion.
Tres anticuerpos monoclonales anti-IGF M23 (Cell Sciences 05-172 (Upstate) y MAB291 (R&D Systems) disponibles comercialmente mostraron diferentes capacidades para inhibir la unión de IGF a IGFBP con valores de CI50 que 25 oscilaban entre pocos ng/ml y 100 ng/ml. No se observó inhibición de la unión de IGF-I a IGFBP-3 con IgG de ratón irrelevante e IgG humana hasta 10 !g/ml, lo que sugiere que el efecto anti-IGF-I es específico. Los anticuerpos monoclonales 05-166 (Upstate) y MAB292 (R&D) disponibles comercialmente mostraron una diferencia significativa
en afinidad para la inhibición de las interacciones IGF-II / IGFBP-3. Estos experimentos muestran que los AcM anti-IGF pueden bloquear la unión de IGF a IGFBP-3, dando un ensayo que podría usarse para examinar anticuerpos purificados a partir de líneas de hibridoma. La siguiente etapa fue evaluar los efectos del medio de hibridoma agotado sobre la señal de ensayo.
5 Se sometieron a prueba diluciones en serie del medio de hibridoma y sobrenadantes agotados de hibridoma anti-KLH en el sistema de ensayo. Cuando los sobrenadantes de hibridoma se diluyeron 1:10 en la preparación para la preincubación con IGFI/II (la dilución final en el ensayo fue 1:60), casi no hubo efecto del medio sobre los resultados del ensayo. Basándose en estos datos, se diluyeron los sobrenadantes de hibridoma para la preincubación con IGF, proporcionando la dilución final de 1/60 preferida en el ensayo.
Se examinaron seiscientos ochenta y tres sobrenadantes agotados positivos para la unión a IGF-I e IGF-II para determinar su capacidad para inhibir la unión de IGF a IGFBP-3. Se usó la inhibición por encima del 50% para IGF-I y por encima del 60% para IGF-II como criterios de punto de corte. Los resultados resumen del examen usando
15 estos puntos de corte se muestran en la tabla 6.
TABLA 6. NÚMEROS DE RESULTADOS POSITIVOS IDENTIFICADOS EN EL EXAMEN
GF-I
IGF-II IGF-I/II
Muestras
Inhibición -> > 50% > 60%
376
(placas 1-4) 48 51 19
307
(placas 5-8) 39 78 32
683
Total 87 129 51
El ensayo de competencia de IGFBP usando un ensayo AlphaScreen identificó 87 muestras que inhibían la unión de IGF-I a IGFBP-3 y 129 muestras que inhibían la unión de IGF-II a IGFBP-3 entre 683 sometidos a prueba. Cincuenta y una muestras demostraron competencia doble de IGF-I e IGF-II. Sin embargo, con el fin de reproducir más cuidadosamente la función o el comportamiento de los anticuerpos in vivo, donde el complejo de IGF e IGFBP se preformaría en buena parte, se realizaron ensayos adicionales, tal como se describe en el ejemplo 8.
25 EJEMPLO 7
DETERMINACIÓN DE AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-IGF-I E IGF-II USANDO EL ANÁLISIS DE BIACORE (EXAMEN DE BAJA RESOLUCIÓN)
Examen de baja resolución de 34 anticuerpos monoclonales purificados
Se utilizó la resonancia de plasmón superficial (SPR) sin marcador, o Biacore, para medir la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Para este fin, se preparó una superficie de anticuerpo de cabra anti-ser humano de alta densidad sobre un chip CM5 de Biacore usando un acoplamiento de amina de rutina. Todos los AcM se diluyeron hasta
35 aproximadamente 20 !g/ml en tampón de transferencia HBS-P que contenía BSA 100 !g/ml. Se capturó cada AcM en una superficie separada usando un tiempo de contacto de 30 segundos a 10 !l/min., y un lavado de 5 minutos para la estabilización del nivel inicial de AcM.
Se inyectó IGF-I a 335,3 nM sobre todas las superficies a 23ºC durante 120 segundos, seguido por una disociación de 5 minutos, usando una velocidad de flujo de 100 !l/min. Se prepararon las muestras en el tampón de transferencia HBS-P descrito anteriormente. Se regeneraron las superficies tras cada ciclo de captura/inyección con un pulso de 15 segundos de ácido fosfórico 146 mM (pH 1,5). Se repitieron los mismos ciclos de captura/inyección para cada anticuerpo con IGF-II 114,7 nM. Se prepararon los datos de unión corregidos por deriva para los 34 AcM restando la señal de una célula de flujo de control y restando la deriva de nivel inicial de un tampón inyectado justo
45 antes de cada inyección de antígeno. Los datos de fijaron globalmente a un modelo de interacción 1:1 usando CLAMP para determinar las cinéticas de unión (David G. Myszka y Thomas Morton (1998) “CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program,” TIBS 23, 149-150). Se usó un coeficiente de transporte de masa en el ajuste de los datos. Los resultados del análisis cinético de la unión de IGF-I e IGF-II a 25ºC se enumeran en la tabla 7 a continuación. Los AcM se clasifican de mayor a menor afinidad.
TABLA 7. EXAMEN DE BIACORE DE BAJA RESOLUCIÓN DE IGF-I E IGF-II DE 34 ANTICUERPOS MONOCLONALES
IGF-II
IGF-I
Muestra
ka (M-1s -1) kd (s-1) KD (pM) ka (M-1s -1) kd (s-1) KD (pM)
7.159.2
3,5 X 106 1,0 X 10-5 2,9 4,3 X 106 9,3 X 10-4 216,0
8.86.1
6,1 X 106 2,4 X 10-4 39,3 3,4 X 106 1,3 X 10-2 3823,0
4.25.1
9,3 X 106 4,1 X 10-4 44,1 5,1 X 106 6,9 X 10-3 1353,0
7.234.2
6,4 X 106 2,9 X 10-4 45,3 6,7 X 106 2,2 X 10-3 328,0
7.160.2
4,6 X 106 2,5 X 10-4 54,3 5,6 X 106 3,3 X 10-3 589,0
7.146.3
3,2 X 106 1,8 X 10-4 56,2 3,8 X 106 8,7 X 10-3 2289,0
7.34.1
3,0 X 106 1,8 X 10-4 60,0 5,2 X 106 3,2 X 10-3 615,0
7.123.1
4,0 X 106 3,4 X 10-4 85,0 4,3 X 106 9,0 X 10-3 2093,0
7.202.3
1,8 X 106 1,7 X 10-4 94,4 1,2 X 106 5,4 X 10-3 4500,0
4.141.1
4,9 X 106 4,7 X 10-4 95,9 * * *
7.215.2
3:2 X 106 3,3 X 10-4 103,0 3,6 X 106 2,6 X 10-2 7222,0
8.287.2
2,4 X 106 2,5 X 10-4 104. 7,7 X 105 1,3 X 10-3 1688,0
8.146.2
7,7 X 106 8,0 X 10-4 104,0 2,4 X 106 1,3 X 10-2 5417,0
4.143.2
1,1 X 107 1,2 X 10-3 109,0 6,4 X 106 1,9 X 10-2 2969,0
7.251.3
3,5 X 106 4,3 X 10-4 123,0 4,6 X 106 4,3 X 10-3 935,0
7.99.1
6,9 X 106 9,9 X 10-4 143,0 6,0 X 106 4,8 X 10-3 800,0
4.142.2
5,3 X 106 8,5 X 10-4 160,0 8,5 X 106 1,9 X 10-2 2235,0
7.41.3
3,2 X 106 5,5 X 10-4 172,0 5,2 X 106 2,9 X 10-3 558,0
7.56.3
3,3 X 106 6,0 X 10-4 182,0 4,8 X 106 3,1 X 10-3 646,0
7.127.1
4,1 X 106 7,6 X 10-4 185,0 4,9 X 106 3,5 X 10-3 714,0
8.8.3
4,0 X 106 7,8 X 10-4 195,0 3,1 X 106 8,2 X 10-4 264,0
7.158.2
3,4 X 106 6,7 X 10-4 197,0 4,4 X 106 2,2 X 10-3 500,0
7.23.3
3,3 X 106 6,5 X 10-4 197,0 4,1 X 106 5,8 X 10-3 1415,0
7.252.1
3,2 X 106 6,5 X 10-4 203,0 2,3 X 106 2,1 X 10-3 913,0
7.66.1
3,6 X 106 7,7 X 10-4 214,0 2,0 X 106 2,5 X 10-3 1250,0
7.130.1
4,2 X 106 1,0 X 10-3 238,0 4,6 X 106 1,8 X 10-2 3913,0
4.90.2
4,9 X 106 1,2 X 10-3 245,0 * * *
7.3.3
3,2 X 106 8,8 X 10-4 275,0 4,1 X 106 3,9 X 10-3 951,0
7.118.1
4,6 X 106 1,5 X 10-3 326,0 5,6 X 106 5,1 X 10-3 911,0
7.212.1
4,2 X 106 1,6 X 10-3 381,0 3,1 X 106 6,0 X 10-3 1935,0
7.175.2
1,3 X 106 7,4 X 10-4 569,0 1,8 X 106 2,0 X 10-2 11111,0
4.121.1
5,5 X 106* 3,2 X 10-3* 582,0* 1,5 X 106 2,1 X 10-3 1400,0
7.85.2
1,9 X 106 1,3 X 10-3 684,0 2,2 X 106 2,9 X 10-2 13182,0
7.58.3
8,9 X 106 7,9 X 10-3 888,0 7,2 X 106 3,2 X 10-2 4444,0
Datos de unión de IGF-I
La mayoría de los AcM de ajustan a un modelo de 1:1 razonablemente bien. Se caracterizaron los AcM 4,90,2 y
5 4,141,1 mediante datos extremadamente complejos. Estos AcM se enumeraron con un asterisco en la tabla 7 porque no pudo estimarse ninguna constante cinética significativa a partir del ajuste de modelo. La última fase de disociación parece ser muy lenta para ambos AcM (al menos 1 X 10-5 s-1), lo que podría hacer que estos dos AcM fueran útiles como compuestos terapéuticos.
10 Datos de unión de IGF-II
La mayoría de los AcM se ajustan a un modelo 1:1 razonablemente bien. La disociación para el AcM 7.159.2 se mantuvo constante a 1 X 10-5 s-1 porque no hubo suficientes datos de descomposición para estimar de manera adecuada la kd.
15 Los estudios de Biacore de baja resolución en este ejemplo están diseñados como un enfoque de clasificación semicuantitativa. Con el fin de adquirir información más precisa en cuanto a las constantes cinéticas características y las afinidades de los AcM individuales, se llevaron a cabo estudios de Biacore de alta resolución tal como se describe en el ejemplo 8.
20 EJEMPLO 8
DETERMINACIÓN DE AFINIDAD DEL ANTICUERPO ANTI-IGF-I e IGF-II USANDO EL ANÁLISIS DE BIACORE (EXAMEN DE ALTA RESOLUCIÓN)
25 Se realizó un análisis de Biacore de alta resolución para medir adicionalmente la afinidad de anticuerpo por el antígeno. Se capturaron cada uno de los anticuerpos 7.159.2, 7.234.2, 7.34.1, 7.251.3 y 7.160.2 y se inyectaron cada uno de los antígenos IGF-I e IGF-II en un intervalo de concentraciones. Las constantes de unión resultantes se enumeran en la tabla 8.
TABLA 8. AFINIDAD DE ANTICUERPO ANTI-IGF DETERMINADA MEDIANTE ANÁLISIS DE BIACORE DE ALTA Y BAJA RESOLUCIÓN
AcM
Baja resolución KD (pM) Alta Resolución KD (PM)
IGF-I
IGF-II IGF-I IGF-II
7.159.2
216,0 2,9 294,0 1,9
7.234.2
328,0 45,3 3760,0 295,0
7.34.1
615,0 60,0 436,0 421,0 164,0 162,0
7.251.3
935,0 123,0 452,0 47,4
7.160.2
589,0 54,3 2800,0 237,0
Por tanto, las realizaciones de la invención pueden incluir un anticuerpo que se unirá preferiblemente a IGF-II, pero
5 que tendrá una reacción cruzada con IGF-I, uniéndose a IGF-II con mayor afinidad que a IGF-I. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a IGF-II con una afinidad 2,5 veces mayor que a IGF-I. En determinadas realizaciones, el anticuerpo puede unirse a IGF-II con al menos 5, al menos 10, al menos 25, al menos 50 o al menos 150 veces mayor afinidad que a IGF-I.
10 Examen de complejos IGF-I/GFBP-3 preformados
El ensayo de competencia de IGFBP descrito en el ejemplo 6 identificó 87 muestras que inhibían la unión de IGF-I a IGFBP-3 y 129 muestras que inhibían la unión de IGF-II a IGFBP-3 entre 683 sobrenadantes sometidos a prueba. Cincuenta y una muestras demostraron competencia doble de IGF-I e IGF-II. Sin embargo, con el fin de reproducir
15 más cuidadosamente la función o el comportamiento de los anticuerpos in vivo, donde el complejo de IGF e IGFBP se preformaría en buena parte, se realizaron los siguientes ensayos de Biacore en anticuerpos seleccionados.
Se examinaron seis anticuerpos seleccionados para determinar si se unían a IGF-I o IGF-II en complejo con IGFBP. Se inmovilizaron covalentemente los seis AcM seleccionados (7.159.2, 7.146.3, 7.34.1, 7.251.3, 7.58.3, y el
20 anticuerpo control no relacionado ABX-MA1) a alta capacidad superficial (5.400-12.800 UR) en dos chips CM5 de Biacore usando acoplamiento de amina de rutina con un instrumento Biacore 2000. Se activó una célula de flujo en cada chip CM5 y se bloqueó (sin AcM inmovilizado) para su uso como superficie de control.
A continuación, se mezclaron IGF-I e IGFBP-3 entre sí en solución salina tamponada con Hepes, pH 7,4, P-20 al
25 0,005%, BSA 100 !g/ml (HBS-P), hasta obtener una disolución final de 193 nM y 454 nM, respectivamente. IGF-II e IGFBP-3 se mezclaron entre sí hasta obtener una disolución final de 192 nM y 455 nM, respectivamente. En estas condiciones, IGF-I e IGF-II se complejaron en un 99,97% por IGFBP-3. Se alcanzó el equilibrio en el plazo de minutos en estas condiciones. Se hicieron fluir las disoluciones de IGF-I/IGFBP-3 e IGF-II/IGFBP-3 complejados a través de las diversas superficies de AcM a 40 !l/min. y 23ºC, durante 180 segundos y se realizó un seguimiento de
30 la disociación durante 120 segundos. Entonces se hicieron fluir IGF-I e IGF-II sin complejar a través de cada superficie a 193 nM y 192 nM, respectivamente, y se hizo fluir IGFBP-3 a través de cada superficie a 454 nM. Las superficies se regeneraron con un pulso de 20 segundos de glicina 10 mM, pH 2,0.
Los sensogramas se procesaron usando el programa Scrubber restando el cambio de índice de refracción en masa
35 y cualquier señal de unión no específica del analito a la superficie de blanco de la señal de unión de superficies con AcM inmovilizado. Tras la resta con corrección de blanco, se tomaron como referencia los sensogramas por segunda vez restando un sensograma promedio para inyecciones tampón sobre una célula de flujo específica. Esta “referencia doble” corrigió los sensogramas de unión de AcM para cualquier error sistemático presente en una célula de flujo particular.
40 IGF-I/IGFBP-3 e IGF-II/IFBP-3 complejados y no complejados se unían de manera bastante débil a los anticuerpos unidos, siendo una estimación aproximada de interacción por unión no específica de KD>1 mM para los seis AcM, incluyendo el control negativo ABX-MA1 (véase la tabla 9). Sin embargo, con ABX-MA1, la unión de IGF-I/II fue débil e indicó interacciones por unión no específica producidas con los tres analitos. Aparentemente, los complejos
45 IGF/IGFBP-3 se unen de manera ligeramente más fuerte a todos estos AcM que IGFBP-3 solo. Sin embargo, debido a que tanto IGF-I, IGF-II como IGBP-3 parecen unirse de manera no específica a estos AcM por sí mismos, cuando se unen ambos entre sí, esto da como resultado un complejo proteico de unión no específica “más pegajoso”, lo que explica la mayor señal de unión para el complejo. Los complejos IGF-I/II/IGFBP-3 e IGFBP-3 se unían a la superficie de control significativamente, indicando también la no especificidad de estas dos proteínas. Sin embargo,
50 en los sensogramas siguientes esta unión de fondo se resta en la primera referencia durante el procesamiento de los datos, tal como se describió anteriormente.
Este experimento sugiere que aunque se había demostrado previamente que 51 de las muestras inhibía la unión de IGF-I/II a IGFBP3 (ejemplo 6), los anticuerpos también pueden unirse al complejo IGF/IGFBP in vitro.
TABLA 9. RESUMEN DE UNIÓN PARA LA UNIÓN DE IGF-I/IGFBP-3 e IGF-II/IGFBP-3 A SEIS AcM.
AcM
Complejo IGFI/IGFBP-3 Complejo IGFII/IGFBP-3 IGFBP-3 IGF-I (o II)
7.159.2
+ + + +++
7.146.3
+ ++ + +++
7.34.1
+ ++ ++ +++
7.251.3
++ ++ ++ +++
7.58.3
++ ++ ++ +++
ABX-MA1
+ + + +
+, unión ligera en relación con IGF-I o IGF-II al AcM ++, unión media en relación con IGF-I o IGF-II al AcM +++, unión fuerte en relación con la unión de IGF-I o IGF-II al AcM *Estas clasificaciones NO indican la KD para estas interacciones
EJEMPLO 9
5 DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DEL ANTICUERPO ANTI-INSULINA USANDO ANÁLISIS DE BIACORE (EXAMEN DE BAJA RESOLUCIÓN)
Se investigó adicionalmente la reactividad cruzada de anticuerpos por IGF-I/II midiendo la afinidad de los AcM por la insulina humana. Se inmovilizaron anticuerpos frente a IGF-I/II a chips CM5 de Biacore y se inyectó insulina en
10 disolución para la determinación de la asociación y la disociación. En este experimento se sometieron a prueba cinco AcM que incluían 7.234.2, 7.34.1, 7.159.2, 7.160.2, y 7.251.3. Se inyectó insulina diluida hasta 502 nM en el tampón de transferencia sobre todas las superficies de captura.
No se observó unión de insulina a ninguno de los AcM a insulina 502 nM. Estos resultados sugieren que no hay 15 reactividad cruzada evidente de los AcM frente a IGF-I/II con insulina.
EJEMPLO 10
CLASIFICACIÓN DE ANTICUERPOS
20 Se realizó la clasificación de epítopos para determinar cuál de los anticuerpos anti-IGF-I/II competiría de manera cruzada entre sí, y por tanto sería más probable que se uniera al mismo epítopo en IGF-I/II. El proceso de clasificación se describe en la solicitud de patente estadounidense 20030175760, también descrita en Jia et al., J. Immunol. Methods, (2004) 288:91-98, que se incorporan ambos como referencia en su totalidad. En resumen, se
25 acoplaron perlas de Luminex con anticuerpo de ratón anti-hulgG (Pharmingen n.º 555784) siguiendo el protocolo de acoplamiento de proteínas proporcionado en el sitio web de Luminex. Se prepararon perlas preacopladas para el acoplamiento a anticuerpo desconocido primario usando el siguiente procedimiento, protegiendo las perlas de la luz. Se usaron tubos individuales para cada sobrenadante desconocido. Se calculó el volumen de sobrenadante necesario usando la siguiente fórmula: (nX2+10) x 50 !l (donde n = número total de muestras). En este ensayo se
30 usó una concentración de 0,1 !g/ml. La disolución madre de perlas se agitó con vórtex suavemente y se diluyó en sobrenadante hasta una concentración de 2500 de cada perla en 50 !l por pocillo o 0,5 X 105 perlas/ml.
Se incubaron las muestras en un agitador en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche.
35 Se prehumedeció la placa de filtro añadiendo 200 !l de tampón de lavado por pocillo, que luego se aspiró. Se añadieron 50 !l de cada perla a cada pocillo de la placa de filtro. Se lavaron las muestras una vez añadiendo 100 !l/pocillo de tampón de lavado y aspirando. Se añadieron el antígeno y los controles a la placa de filtro a 50 !l/pocillo. Se recubrió la placa, se incubó en la oscuridad durante 1 hora en un agitador y luego se lavaron las muestras 3 veces. Entonces se añadió un anticuerpo secundario desconocido a 50 !l/pocillo. Se usó una
40 concentración de 0,1 !g/ml para el anticuerpo primario. Entonces se incubó la placa en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador, y luego se lavaron las muestras 3 veces. Se añadieron 50 !l/pocillo de IgG de ratón anti-ser humano biotinilado (Pharmingen n.º 55785) diluido a 1:500, y se incubaron las muestras en la oscuridad durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente.
45 Se lavaron las muestras 3 veces. Se añadieron 50 !l/pocillo de estreptavidina-PE a una dilución 1:1000 y se incubaron las muestras en la oscuridad durante 15 minutos con agitación a temperatura ambiente. Tras ejecutar dos ciclos de lavado en el Luminex100, se lavaron las muestras 3 veces. Se resuspendió el contenido de cada pocillo en 80 !l de tampón de bloqueo. Se mezclaron cuidadosamente las muestras con pipeteo varias veces para resuspender las perlas. Entonces se analizaron las muestras en el Luminex100. Los resultados se presentan a
50 continuación en la tabla 10.
TABLA 10. CLASIFICACIONES PARA 34 ANTICUERPOS FRENTE A IGF-I/II PRINCIPALES POSITIVOS EN ENSAYO FUNCIONAL
IGF-1
IGF-II Clasif. 1
Clasif. 2 Clasif. 3 Sin clasif.
Clasif. 1 Clasif. 2 Clasif. 3 Sin clasif.
7.3.3
7.58.3
7.175.2
7.215.2
7.3.3
7.158.2
7.175.2
7.215.2
7.23.3
8.287.2
7.85.2
7.127.1
8.146.2
4.90.2
7.661
4.90.2
7.99.1
7.252.1
4.141.1
7.56.3
4.141.1
7.123.1
8.86.1
7.85.2
7.160.2
7.146.3
7.212.1
7.251.3
7.41.3
7.34.1
7.234.2
7.159.2
4.121.1
7.159.2
7.130.1
7.146.3
8.146.2
7.251.3
7.118.1
7.34.1
7.252.1
8.287.2
7.123.1
7.58.3
7.212.1
7.66.1
7.234.2
7.41.3
7.99.1
7.56.3
7.127.1
7.160.2
4.25.1
7.202.3
8.8.3
8.8.3
7.158.2
4.25.1
7.202.3
7.23.3
7.130.1
4.142.2
8.86.1
4.143.2
4.142.2
4.121.1
7.118.1
4.143.2
EJEMPLO 11
ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE ANTICUERPOS ANTI-IGF-I/II
5 Se secuenciaron las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables de varios anticuerpos para determinar sus secuencias de ADN. La información de secuencia completa para los anticuerpos anti-IGF-I/II se proporciona en la lista de secuencias con secuencias de nucleótidos y aminoácidos para cada combinación de cadena gamma y kappa. Se analizaron las secuencias pesadas variables para determinar la familia de VH, la
10 secuencia de la región D y la secuencia de la región J. Entonces se tradujeron las secuencias para determinar la secuencia primaria de aminoácidos y se comparó con las secuencias de las regiones VH, D y J de la línea germinal para evaluar las hipermutaciones somáticas.
La alineación de las secuencias de estos anticuerpos con los genes de su línea germinal se muestra en las tablas
15 siguientes. La tabla 11 es una tabla que compara las regiones de la cadena pesada del anticuerpo con la región de la cadena pesada de su línea germinal relacionada. La tabla 12 es una tabla que compara las regiones de la cadena ligera kappa del anticuerpo con la región de la cadena ligera de su línea germinal relacionada. Las mutaciones que se alejan de la línea germinal se muestran como el nuevo aminoácido.
20 Las regiones variables (V) de las cadenas de inmunoglobulinas están codificadas por múltiples segmentos de ADN de línea germinal, que se unen en regiones variables funcionales (VHDJH o VKJK) durante la ontogenia de las células
B. Se estudió en detalle la diversidad molecular y genética de la respuesta del anticuerpo a IGF-I/II. Estos ensayos revelaron varios puntos específicos para los anticuerpos anti-IGF-I/II.
25 El análisis de cinco anticuerpos individuales específicos para IGF-I/II dio como resultado la determinación de que los anticuerpos se derivaban de tres genes de VH de línea germinal diferentes, cuatro de ellos procedentes de la familia de VH4, derivándose 2 anticuerpos del segmento génico de VH4-39. Las tablas 11 y 12 muestran los resultados de este análisis.
30 Debe apreciarse que las secuencias de aminoácidos entre clones hermanos recogidos de cada hibridoma son idénticas. Por ejemplo, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera para el AcM 7.159.2 son idénticas a las secuencias mostradas en las tablas 11 y 12 para el AcM 7.159.1.
Las CDR1 de la cadena pesada de los anticuerpos de la invención tienen una secuencia tal como se da a conocer
35 en la tabla 11. Las CDR1 dadas a conocer en la tabla 11 son de la definición de Kabat. Alternativamente, las CDR1 pueden definirse usando una definición alternativa para incluir los cinco últimos residuos de la secuencia de FR1. Por ejemplo, para el anticuerpo 7.159.1 la secuencia de FR1 es QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO.: 93) y la secuencia de CDR1 es GYTFTSYDIN (SEQ ID NO.: 94); para el anticuerpo 7.158.1 la secuencia de FR1 es QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO.: 95) y la secuencia de CDR1 es GGSIRSSSYYWG (SEQ ID NO.: 96); para el anticuerpo 7.234.1 la secuencia de FR1 es QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO.: 97) y la secuencia de CDR1 es GGSINSSSNYWG (SEQ ID NO.: 98); para el anticuerpo 7.34.1 la secuencia de FR1 es QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO.: 99) y la secuencia de CDR1 es GGSISSYYWS (SEQ ID NO.:
5 100); y para el anticuerpo 7.251.3 la secuencia de FR1 es QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO.: 101) y la secuencia de CDR1 es GGSISSYYWS (SEQ ID NO.: 102).
También debe apreciarse que cuando un anticuerpo particular difiere de la secuencia de su línea germinal respectiva a nivel de aminoácidos, la secuencia del anticuerpo puede mutarse de nuevo a la secuencia a la línea germinal. Las 10 mutaciones correctivas de este tipo pueden producirse en una, dos, tres o más posiciones, o en una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, usando técnicas de biología molecular convencionales. A modo de ejemplo no limitativo, la tabla 12 muestra que la secuencia de la cadena ligera del AcM 7.34.1 (SEQ ID NO.: 12) difiere de la secuencia de la línea germinal correspondiente (SEQ ID NO.:80) por una mutación de Pro a Ala (mutación 1) en la región FR1, y por una mutación de Phe a Leu (mutación 2) en la región FR2. Por tanto, la secuencia de aminoácidos 15 o nucleótidos que codifica para cadena ligera de AcM 7.34.1 puede modificarse para cambiar la mutación 1 para dar la secuencia de la línea germinal en el sitio de la mutación 1. Además, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos que codifica para la cadena ligera del AcM 7.34.1 puede modificarse para cambiar la mutación 2 para dar la secuencia de la línea germinal en el sitio de la mutación 2. Todavía adicionalmente, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos que codifica para la cadena ligera del AcM 7.34.1 puede modificarse para cambiar tanto la mutación 1
20 como la mutación 2 para dar la secuencia de la línea germinal en los sitios de ambas mutaciones 1 y 2.

TABLA 11. ANÁLISIS DE CADENAS PESADAS
Nombre de la cadena
SEQ ID NO. V D J FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
Línea germinal**
75 VH1-8 N.D. JH6B
7_159_1
6 “ “ v
Línea germinal
77 VH4-39 D6-19 JH2
7_158_1
2 “ “ “
7_234_1
18 “ “ “
Línea germinal
79 VH4-59 D1-20 JH6B
7_34_1
10 “ “ “
7_251_3
14 “ “ “
* La designación con almohadilla (#) indica un espacio en la línea germinal y se usa para mostrar una alineación apropiada con las secuencias de anticuerpo mostradas en la tabla. ** Las secuencias de la línea germinal mostradas en la tabla anterior son para fines de alineación y debe comprenderse que cada región de anticuerpo individual existe en su propia ubicación dentro de las regiones variables de los segmentos de ADN de la línea germinal de inmunoglobulinas in vivo.
TABLA 12. ANÁLISIS DE CADENAS LIGERAS
Nombre de la cadena
SEQ ID NO. V J FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
Línea germinal
76 VH1-19 JL2
7_159_1
8 “ v
Línea germinal
78 L5 JK3
7_158_1
4 “ “
7_234_1
20 “ “
Línea germinal
80 V1-13 JL 2
7_34_1
12 “ “
7_251_3
16 n “
* La designación con almohadilla (#) indica un espacio en la línea germinal y se usa para mostrar una alineación apropiada con las secuencias de anticuerpo mostradas en la tabla. ** Las secuencias de la línea germinal mostradas en la tabla anterior son para fines de alineación y debe comprenderse que cada región de anticuerpo individual existe en su propia ubicación dentro de las regiones variables de los segmentos de ADN de la línea germinal de inmunoglobulinas in vivo.
EJEMPLO 12 INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN INDUCIDA POR IGF-I E IGF-II DE hIGF-IR EXPRESADO ECTÓPICAMENTE
EN CÉLULAS NIH3T3
5 Los ligandos de IGF ejercen sus funciones de proliferación y anti-apoptosis activando la actividad tirosina cinasa de receptor en el receptor IGF-IR. Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-IGF-I/II para inhibir la fosforilación inducida por IGF de IGF-IR, se usaron células NIH3T3 que expresan ectópicamente hIGF-IR en el siguiente ensayo.
10 Se sembraron células NIH3T3 que expresan ectópicamente el IGF-IR humano en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo y se incubaron durante la noche en medio de inanición (FBS tratado con carbón vegetal al 1%). Al día siguiente, se desechó el medio de crecimiento, se lavaron suavemente los pocillos dos veces con PBS, y se añadieron 100 !L de medio libre de suero (FBS al 0%) para producir la inanición de las células.
15 Tras 1-2 horas, se añadieron a las células por triplicado 100 !l de medio libre de suero con BSA al 0,05% que contenía o bien IGF-I (10 nM) o bien IGF-II (10 nM) que se había preincubado durante 60 minutos a 37ºC con diversas concentraciones de anticuerpo. Se permitió que se produjera la estimulación durante 10 minutos a 37ºC. Tras la estimulación, se eliminaron los medios y se añadieron a cada pocillo 100 ul de formaldehído al 3,7% en PBS/BSA al 3% y se incubaron a TA durante 20 min. Entonces se lavaron las células 2X con PBS y se añadieron a
20 cada pocillo 100 ul de tampón de permeabilización (Triton-X al 0,1% en BSA al 3%/PBS). Esto se dejó incubar a TA durante 10 min., se desechó y se añadieron 100 ul de peróxido de hidrógeno al 0,6% en PBS/BSA al 3% para inactivar cualquier actividad peroxidasa endógena. Tras una incubación a TA durante 20 min., se lavaron las células 3X con PBS/Tween-20 al 0,1% y se bloquearon añadiendo 100 ul de FBS al 10% en PBS/Tween-20 al 0,1% a TA durante 1 h. Entonces se eliminó el tampón de bloqueo y se añadieron a cada pocillo 50 ul de anticuerpo anti-fosfo
25 IGFIR a 1 ug/ml (n.º de cat. 44-804, BioSource) en FBS al 10%/PBS-T. Tras una incubación a TA durante 2 h, se lavaron las células 3X con PBST sumergiendo durante 5 minutos entre cada lavado. Tras los lavados, se añadieron a cada uno de los pocillos 50 ul/pocillo de un anticuerpo secundario de cabra anti-región Fc de IgG de conejo-HRP diluido 1:250 en tampón de bloqueo. Tras 1 hora de incubación a TA se lavaron las células 3X durante 5 minutos con PBST igual que antes y se secaron golpeándolas ligeramente. Entonces se añadieron 50 ul de reactivo ECL
30 (DuoLux) y se leyeron inmediatamente las URL.
Se examinaron treinta y dos (32) líneas de anticuerpos y se realizaron dos ensayos independientes para cada antígeno. Los resultados para los diez anticuerpos principales se resumen en la tabla 13 a continuación.
35 TABLA 13. RESUMEN DE INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE IGF-IR DEPENDIENTE DE IGF EN CÉLULAS NIH3T3
Resultados de IGF-I pTYR (n=2)
Resultados de IGF-II pTYR (n=2)
% de activación máx.
CE50 (nM)* % de activación máx. CE50 (nM)*
ID de AcM
Media DE Media DE Media DE Media DE
7.159.2
16,5% 6,6% 7,4 0,8 28,6% 5,4% 3,1 0,2
7.34.1
14,2% 1,8% 9,4 0,8 21,5% 3,9% 2,5 0,1
7.146.3
19,5% 3,9% 19,0 5,7 23,6% 2,1% 3,6 0,2
7.251.3
16,9% 5,4% 14,5 0,7 15,9% 1,5% 3,0 0,9
7.234.2
21,1% 3,0% 24,3 1,0 21,1% 0,1% 7,7 0,1
7.160.2
33,6% 6,4% 22,9 0,1 21,5% 0,6% 4,7 0,2
7.158.2
22,7% 0,9% 28,3 0,5 33,7% 2,4% 11,3 3,2
7.56.3
31,3% 2,2% 25,1 4,3 21,2% 0,2% 6,3 0,5
7.118.1
24,1% 5,2% 40,8 2,6 21,8% 3,2% 13,9 5,3
7.41.3
33,1% 6,1% 47,1 7,0 29,5% 4,4% 3,5 4,0
* Estos ensayos pueden haberse realizado en condiciones de limitación de antígeno dada la KD del AcM para IGF-I e IGF-II.
EJEMPLO 13
40 INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN INDUCIDA POR IGF-I e IGF-II DE CÉLULAS NIH3T3 TRANSFECTADAS CON HIGF-IR
Tal como se comentó anteriormente, uno de los criterios para neutralizar anticuerpos frente a IGF-I/II es la capacidad para inhibir la proliferación inducida por IGF. Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos para determinar la 45 proliferación inducida por IGF, se usaron células NIH3T3 que expresan ectópicamente hIGF-IR en el siguiente ensayo.
Se sembraron células NIH3T3 que expresan ectópicamente hIGF-IR en una placa de 96 pocillos a una densidad de
5.000 células por pocillo y se cultivaron durante la noche en medio de inanición (FBS tratado con carbón vegetal al
1%). Al día siguiente, se desechó el medio de crecimiento, se lavaron suavemente los pocillos dos veces en medio sin suero, y se añadieron 100 !L de medio libre de suero para producir la inanición de las células. Se añadieron a las células por duplicado o por triplicado 100 !l de medio de inanición que contenía 15 ng/ml de IGFI o 50 ng/ml de IGFII preincubado durante 30 min. a 37ºC con diversas concentraciones de anticuerpo. Tras 20 horas de incubación, se
5 pulsaron las células con BdrU durante 2 horas y se cuantificó el grado de incorporación (proliferación) usando el kit de ELISA de proliferación celular de Roche (Roche, n.º de cat. 1 647 229).
Se examinó un total de 32 líneas de anticuerpos y se realizaron dos o tres ensayos independientes para cada antígeno. Los resultados para los diez anticuerpos principales se resumen en la tabla 14 a continuación.
10 TABLA 14. RESUMEN DE INHIBICIÓN DE PROLIFERACIÓN DEPENDIENTE DE IGF EN CÉLULAS NIH3T3/hIGF-IR
Ensayo de proliferación de IGF-I
Ensayo de proliferación de IGF-II
% de inhibición
CE50 (nM)* % de inhibición CE50 (nM)*
ID de AcM
Media (n=3) DE Media (n=3) DE Media (n=2) DE Media (n=2) DE
7.159.2
77,0% 9,6% 24,1 5,9 99,3% 0,6% 7,6 2,5
7.34.1
72,6% 5,6% 23,4 8,1 73,6% 11,8% 16,3 0,4
7.146.3
65,3% 5,5% 37,2 4,5 82,0% 6,9% 15,9 3,4
7.251.3
72,4% 15,3% 38,9 4,3 79,2% 7,8% 22,0 3,7
7.234.2
67,3% 6,9% 40,6 4,6 62,1% 17,2% 24,3 2,4
7.160.2
62,8% 5,7% 47,6 10,7 45,9% 0,8% 24,7 2,8
7.158.2
57,4% 19,5% 42,8 1,7 54,6% 6,6% 36,0 4,2
7.56.3
50,2% 7,8% 65,7 31,9 48,0% 10,9% 38,3 7,5
7.118.1
59,4% 14,5% 1626,6 2714,5 68,3% 0,8% 49,9 3,8
7.41.3
29,5% 14,7% 76,3 35,9 51,9% 13,7% 61,9 23,7
* Estos ensayos pueden haberse realizado en condiciones de limitación de antígeno dada la KD del AcM para IGF-I e IGF-II.
EJEMPLO 14 INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN INDUCIDA POR IGF-I E IGF-II DE hIGF-IR EXPRESADO EN CÉLULAS DE
TUMOR PANCREÁTICO HUMANO BxPC3
IGF-IIII ejerce sus funciones de proliferación y anti-apoptosis activando la actividad tirosina cinasa de receptor en el
20 receptor IGF-IR. Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la fosforilación inducida por IGF de IGF-IR, se usaron células de tumor pancreático humano BcPC3, que expresan hIGF-IR endógeno, en el siguiente ensayo.
Se sembraron células BxPC3 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 55.000 células por pocillo y se
25 incubaron durante la noche en medio de crecimiento regular. Al día siguiente, se desechó el medio de crecimiento, se lavaron suavemente los pocillos dos veces en medio sin suero, y se añadieron a las células 1000 !l de medio libre de suero para producir la inanición de las células. Tras 24 horas, se desechó el medio y se lavaron suavemente las células una vez en medio sin suero. Se preincubó medio libre de suero con BSA al 0,05% que contenía o bien IGF-I (20 ng/ml) o bien IGF-II (75 ng/ml) durante 30 minutos a 37ºC con diversas concentraciones de anticuerpo, y
30 entonces se añadieron 100 !l a las células por triplicado. Se incubaron las placas durante 15 minutos a 37ºC, y se enjuagaron posteriormente con PBS frío. Se añadieron a los pocillos 100 !l de tampón de lisis y se incubaron las placas durante 30 minutos a 4ºC. Se centrifugaron los lisados a 2000 rpm durante 10 minutos a 4ºC, y se recogió el sobrenadante. Se cuantificó la fosforilación de IGF-IR usando el kit de ELISA para fósforo-IGF-IR humano Duoset (R&D Systems, N.º de cat. DYC1770).
35 Se examinaron diez líneas de anticuerpos y se realizaron dos ensayos independientes para cada antígeno. Los resultados se resumen en la tabla 15 a continuación.

TABLA 15. RESUMEN DE INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE IGF-IR DEPENDIENTE DE IGF 40 NIH3T3
Resultados de IGF-I pTYR (n=2)
Resultados de IGF-II pTYR (n=2)
n=1
n=2 n=1 n=2
ID de AcM
% de inhibición máx. (333,3 nM) CE50 (nM) % de inhibición máx. (333,3 nM) CE50 (nM) % de inhibición máx. (333,3 nM) CE50 (nM) % de inhibición máx. (133,3 nM) CE50 (nM)
7.159.2
100,0 3,3 100,0 1,6 100,0 1,6 91,2 1,7
7.34.1
100,0 5,9 98,5 3,8 100,0 2,0 89,7 1,9
7.146.3
96,4 16,1 94,2 10,7 100,0 2,0 87,9 2,0
7.251.3
95,7 7,5 95,2 5,3 100,0 N.D. 91,3 2,6
7.234.2
97,3 5,1 91,5 2,9 98,5 1,9 77,3 2,3
7.160.2
93,4 5,3 89,2 3,1 88,6 1,7 73,2 2,5
7.158.2
92,9 4,5 89,4 3,6 92,4 N.D. 74,0 4,2
7.56.3
84,9 N.D. 88,7 6,5 91,4 10,1 66,2 5,1
7.118.1
90,5 13,1 90,6 11,8 95,7 17,9 78,0 13,1
7.41.3
88,6 6,5 86,5 6,5 88,6 4,5 70,6 3,1
*333 nM para los 3 últimos anticuerpos. N.D.: No determinado

EJEMPLO 15 INHIBICIÓN DE PROLIFERACIÓN INDUCIDA POR IGF-I E IGF-II DE CÉLULAS DE TUMOR PANCREÁTICO
5 HUMANO BxPC3
Tal como se comentó anteriormente, uno de los criterios para neutralizar anticuerpos frente a IGF es la capacidad para inhibir la proliferación inducida por IGF. Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la proliferación inducida por IGF, se usaron células de tumor pancreático humano BcPC3, que expresan hIGF-IR
10 endógeno, en el siguiente ensayo.
Se sembraron células BxPC3 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2.000 células por pocillo y se cultivaron durante la noche en medio de crecimiento regular. Al día siguiente, se desechó el medio de crecimiento, se lavaron suavemente los pocillos dos veces en medio sin suero, y se añadieron 100 !l de medio libre de suero con
15 transferrina 10 !g/ml y BSA al 0,1% (medio de ensayo) para producir la inanición de las células. Tras 24 horas, se desechó el medio y se lavaron suavemente las células una vez en medio sin suero, y se añadieron a las células por duplicado o por triplicado 100 !l de medio de ensayo que contenía IGF 20 ng/ml preincubado durante 30 minutos a 37ºC con diversas concentraciones de anticuerpo. Se incubaron las placas durante 3 días y se cuantificó la proliferación usando el reactivo CellTiter-Glo (Promega).
20 Se examinaron diez líneas de anticuerpos y se realizaron dos o tres ensayos independientes para cada antígeno. Los resultados se resumen en la tabla 16 a continuación. Basándose en los datos funcionales a continuación y en los datos del ejemplo 1,4, se seleccionaron los cuatro mejores anticuerpos. Se excluyeron los datos del ensayo de proliferación inducida por IGF-I de los criterios de elección debido a la alta variabilidad del ensayo observada.
25 TABLA 16. RESUMEN DE INHIBICIÓN DE PROLIFERACIÓN DEPENDIENTE DE IGF EN CÉLULAS DE TUMOR PANCREÁTICO HUMANO BxPC3
Resultados de proliferación con IGF-II
ID de AcM
% de inhibición máx. (333,3 nM) CE50 (nM) % de inhibición máx. (133,3 nM) CE50 (nM)
7.159.2
120,0 0,8 118,3 0,9
7.34.1
117,0 0,5 109,0 6,7
7.146.3
128,7 3,0 119,5 7,3
7.2513
128,5 0,5 105,3 4,4
7.234.2
111,7 N.D. 200,7 2,6
7.160.2
79,7 1,1 155,7 N.D.
7.158.2
86,3 0,0013 148,3 N.D.
7.56.3
87,0 N.D. 112,3 102,0
7.118.1
114,0 34,0 137,0 54,7
7.41.3
102,0 N.D. 73,0 N.D.
*333 nM para los 3 últimos anticuerpos. N.D.: No determinado
EJEMPLO 16 30 DETERMINACIÓN DE REACTIVIDAD CRUZADA CON IGF-1,IGF-II E INSULINA DE RATÓN
Un objetivo fue desarrollar anticuerpos que fueran específicos para IGF-I e IGF-II pero que no tuvieran reactividad cruzada con insulina. Con el fin de realizar experimentos posteriores en animales, los anticuerpos también deben 35 reaccionar de manera cruzada con IGFI/ II murino pero no con insulina murina. Por consiguiente, se realizaron ensayos de ELISA para determinar si los anticuerpos seleccionados podían reaccionar de manera cruzada con IGF
o insulina murinos.
Tal como se muestra en la tabla 17, se sometieron a prueba cinco de los diez anticuerpos principales para determinar la reactividad cruzada con insulina de ratón o rata mediante ELISA. Los ELISA mostraron que estos anticuerpos no tenían reactividad cruzada con insulina de ratón o rata, en comparación con el anticuerpo de control negativo PK16,3.1 y en comparación con el anticuerpo de control positivo anti-insulina de rata.
TABLA 17. REACTIVIDAD CRUZADA CON INSULINA DE RATÓN
DO a 450 con diferentes Ag
Anticuerpos
Insulina de ratón Insulina de rata Sin Ag
7.159.2
0,52 0,52 0,56
7.160.2
0,60 0,57 0,62
7.34.1
0,48 0,47 0,55
7.251.3
0,55 0,53 0,56
7.234.2
0,51 0,49 0,66
Suero
1,28 1,23 1,34
Anti-insulina de rata
2,52 3,06 0,10
PK16.3.1
0,58 0,58 0,62
EJEMPLO 17 10 INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN INDUCIDA POR IGF-I E IGF-II DE RATÓN DE IGF-IR HUMANO
EXPRESADO ECTÓPICAMENTE EN CÉLULAS NIH3T3
Los anticuerpos monoclonales con reactividad cruzada con IGF-I e IGF-II de ratón se sometieron adicionalmente a prueba con el fin de determinar el grado en que inhiben la fosforilación inducida por IGF de IGF-IR. Este ensayo se
15 realizó tal como se describió anteriormente usando células NIH3T3 que expresan ectópicamente el receptor hIGF-IR. Los resultados de este ensayo se resumen en la tabla 18.
Se sembraron células NIH3T3 que expresan ectópicamente el IGF-IR humano en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo y se incubaron durante la noche en medio de inanición (FBS tratado con 20 carbón vegetal al 1%). Al día siguiente, se desechó el medio de crecimiento, se lavaron suavemente los pocillos dos veces con PBS, y se añadieron 100 !L de medio libre de suero (FBS al 0%) para producir la inanición de las células. Tras 1-2 horas, se añadieron a las células por triplicado 100 !l de medio libre de suero con BSA al 0,05% que contenía o bien IGF-I (10 nM) o bien IGF-II (10 nM) de ratón (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN N.º de cat. 791-MG y 792-MG, respectivamente) que se había preincubado durante 60 minutos a 37ºC con diversas concentraciones 25 de anticuerpo. Se permitió que se produjera la estimulación durante 10 minutos a 37ºC. Tras la estimulación, se eliminaron los medios y se añadieron a cada pocillo 100 ul de formaldehído al 3,7% en PBS/BSA al 3% y se incubaron a TA durante 20 min. Entonces se lavaron las células 2X con PBS y se añadieron a cada pocillo 100 ul de tampón de permeabilización (Triton-X al 0,1% en BSA al 3%/PBS). Esto se dejó incubar a TA durante 10 min., se desechó y se añadieron 100 ul de peróxido de hidrógeno al 0,6% en PBS/BSA al 3% para inactivar cualquier 30 actividad peroxidasa endógena. Tras una incubación a TA durante 20 min., se lavaron las células 3X con PBS/Tween-20 al 0,1% y se bloquearon añadiendo 100 ul de FBS al 10% en PBS/Tween-20 al 0,1% a TA durante 1
h. Entonces se eliminó el tampón de bloqueo y se añadieron a cada pocillo 50 ul de anticuerpo anti-fosfo-IGFIR a 1 ug/ml (n.º de cat. 44-804, BioSource) en FBS al 10%/PBS-T. Tras una incubación a TA durante 2 h, se lavaron las células 3X con PBST sumergiendo durante 5 minutos entre cada lavado. Tras los lavados, se añadieron a cada uno
35 de los pocillos 50 ul/pocillo de un anticuerpo secundario de cabra anti-región Fc de IgG de conejo-HRP diluido 1:250 en tampón de bloqueo. Tras 1 hora de incubación a TA se lavaron las células 3X durante 5 minutos con PBST igual que antes y se secaron golpeándolas ligeramente. Entonces se añadieron 50 ul de reactivo ECL (DuoLux) y se leyeron inmediatamente las URL.
40 TABLA 18. INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN INDUCIDA POR IGF DE RATÓN DE hIGF-IR
CE50 de IGF-I de ratón (nM)
CE50 de IGF-II de ratón (nM)
ID de AcM
n=1 n=2 n=1 n=2
7.159.2
2,8 5,7 3,1 5,0
734.1
6,0 10,2 4,0 9,7
7.251.3
6,7 10,6 5,4 8,7
7.234.2
46,0 36,1
7.160.2
49,5 225,2
EJEMPLO 18
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS NIH3T3 QUE EXPRESAN IGF-II E IGF-1R IN VIVO EN RATONES 45 DESNUDOS
Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la proliferación inducida por IGF-II in vivo, se realizaron los siguientes experimentos.
Se implantaron en ratones desnudos hembra de 6-8 semanas de edad (proporcionados por Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EE.UU.) por vía subcutánea 5 x 106 células del clon 32 (células NIH3T3 que sobrexpresan ectópicamente IGF-II humano e IGF-1R humano). Se suspendieron las células en PBS en un volumen de inóculo total de 330 !l. Se permitió que los tumores crecieran hasta 100-200 mm3 antes del tratamiento con los anticuerpos monoclonales 7.159.2, 7.34.1 y 7.251.3. Se administraron los anticuerpos o el anticuerpo control del isotipo IgG2 suspendidos en PBS por vía intraperitoneal a grupos aleatorizados de 9 ó 12 ratones semanalmente durante 4 semanas a 5 ó 50 mg/kg desde el día 22. Se administró PBS como control de vehículo a un grupo adicional de 11 ratones semanalmente durante 4 semanas desde el día 22. Se midió el tamaño del tumor y el peso corporal 2-3 veces por semana. Los resultados se resumen en las figuras 1 y 2.
Se observó inhibición significativa del crecimiento tumoral (véase la figura 1) sin que se produjera pérdida de peso significativa en ningún grupo (véase la figura 2). Los anticuerpos 7.159.2, 7.34.1 y 7.251.3 inhibieron significativamente el crecimiento de los tumores del clon 32 a 5 y 50 mg/kg/semana (véase la figura 1).
EJEMPLO 19
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS NIH3T3 QUE EXPRESAN IGF-I e IGF-1R IN VIVO EN RATONES DESNUDOS
En el ejemplo anterior, se demostró que los anticuerpos inhiben la proliferación inducida por IGF-II in vivo. Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la proliferación inducida por IGF-I in vivo, se realizaron los siguientes experimentos.
Se implantaron en ratones desnudos hembra (variedad Alderley Park derivada de la variedad de ratones Swiss nu/nu, proporcionada por AstraZeneca) 5 x 106 células P12 viables [células NIH3T3 que sobrexpresan ectópicamente IGF-I humano e IGF-1R humano (Pietrzkowski et al, Cell Growth&Differentiation, 3, 199-205, 1992)] por vía subcutánea en el costado izquierdo. Se suspendieron las células en PBS en un volumen de inóculo total de 0,1 ml. Se administró a dos grupos de animales (cada uno de n=10) dos veces a la semana desde el día del implante de las células NIH3T3 o bien el AcM 7.159.2 a 1,0 mg por ratón o bien un volumen equivalente de vehículo PBS (0,3 ml) con el mismo programa. Todas las dosis se administraron por vía intraperitoneal a través de la vía (i.p.). Se midieron los pesos corporales de los animales diariamente, y una vez establecidos, se tomaron mediciones del tumor dos veces a la semana usando calibradores. Se calculó el volumen de todos los tumores medibles a partir de las mediciones con calibrador suponiendo una forma ovoide. Los resultados se resumen en la figura 3.
Tal como se muestra en la figura 3, se observó inhibición significativa del crecimiento tumoral con el AcM 7.159.2 tras la administración i.p. dos veces a la semana de 1,0 mg de anticuerpo/ratón. No se observó pérdida de peso significativa en ninguno de los grupos de animales.
EJEMPLO 20
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS TUMORALES EN PACIENTES HUMANOS
Se aleatoriza a un grupo de pacientes humanos con cáncer a los que se diagnosticó cáncer pancreático en grupos de tratamiento. Cada grupo de pacientes se trata con inyecciones intravenosas semanales de AcM 7.159.2, 7.34.1 o
7.251.3 descritos en el presente documento. Se administra a cada paciente una cantidad eficaz del anticuerpo que oscila entre 50 mg/kg y 2.250 mg/kg durante 4-8 semanas. A un grupo control se le administra sólo el régimen quimioterápico convencional.
En momentos periódicos durante y tras el régimen de tratamiento, se evalúa la carga tumoral mediante obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI). Se encuentra que los pacientes que han recibido tratamiento con anticuerpos semanalmente con AcM 7.159.2, 7.34.1 o 7.251.3 muestran reducciones significativas en el tamaño del tumor, en comparación con los pacientes que no reciben tratamiento con anticuerpos. En algunos pacientes tratados, los tumores ya no son detectables. En contraposición, el tamaño del tumor aumenta o permanece sustancialmente igual en el grupo control.
EJEMPLO 21
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS TUMORALES EN UN PACIENTE HUMANO
Se diagnostica a un paciente humano de tumor maligno. Se trata al paciente con inyecciones intravenosas semanales de AcM 7.159.2 durante 8 semanas. En momentos periódicos durante y tras el régimen de tratamiento, se evalúa la carga tumoral mediante obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI). Se encuentran reducciones significativas en el tamaño del tumor.
EJEMPLO 22
TRATAMIENTO DE ACROMEGALIA EN UN PACIENTE HUMANO Se diagnostica a un hombre adulto de acromegalia. Se trata al paciente con inyecciones intravenosas dos veces a la
semana de AcM 7.34.1 durante un periodo de 2 años. Como resultado, el paciente experimenta una reducción significativa en los síntomas de acromegalia. EJEMPLO 23 TRATAMIENTO DE PSORIASIS EN UN PACIENTE HUMANO Se diagnostica a una mujer adulta de psoriasis grave. Se trata a la paciente con inyecciones intravenosas dos veces
a la semana de AcM 7.251.3 durante un periodo de 3 semanas. Como resultado, la paciente experimenta una reducción significativa en los síntomas de psoriasis. EJEMPLO 24
TRATAMIENTO DE OSTEOPOROSIS EN UN PACIENTE HUMANO Se diagnostica a una mujer adulta de osteoporosis. Se trata a la paciente con inyecciones intravenosas dos veces a la semana de AcM 7.159.2 durante un periodo de un año. Como resultado, hay una reducción significativa en la pérdida de densidad ósea.
EJEMPLO 25 TRATAMIENTO DE ATEROSCLEROSIS EN UN PACIENTE HUMANO Se diagnostica a un hombre adulto de aterosclerosis. Se trata al paciente con inyecciones intravenosas dos veces a
la semana de AcM 7.34.1 durante un periodo de un año. Como resultado, el paciente experimenta una reducción en los síntomas de aterosclerosis, tal como la angina de pecho. EJEMPLO 26
TRATAMIENTO DE REESTENOSIS EN UN PACIENTE HUMANO Se somete a angioplastia a un hombre adulto para aliviar una arteria bloqueada. Tras el procedimiento de angioplastia, se trata al paciente con inyecciones intravenosas dos veces a la semana de AcM 7.251.3 durante un periodo de un año. Como resultado, el paciente no experimenta reestenosis de la arteria tratada.
EJEMPLO 27 TRATAMIENTO DE DIABETES EN UN PACIENTE HUMANO Se diagnostica a una mujer adulta de diabetes. Se trata a la paciente con inyecciones intravenosas dos veces a la
semana de AcM 7.159.2 durante un periodo de un año. Como resultado, se reducen los síntomas de diabetes. SECUENCIAS Se secuenciaron los hibridomas subclonados para determinar su estructura primaria tanto a nivel de nucleótidos
como de aminoácidos tanto para los genes variables de la cadena pesada como para los genes variables de la cadena ligera. Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos de las regiones variables de los anticuerpos monoclonales frente a IGF-I e IGF-II, tal como se enumeran en la tabla 1, se facilitan en la lista de secuencias.
EQUIVALENTES La anterior memoria descriptiva escrita se considera suficiente para permitir que un experto en la técnica ponga en práctica la invención. La descripción y los ejemplos anteriores detallan determinadas realizaciones preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará, sin embargo, que independientemente de lo detallado que pueda aparecer lo anterior en el texto, la invención puede ponerse en práctica de muchas formas y la invención debe interpretarse según las reivindicaciones adjuntas.
Lista de secuencias
<110> Raeber, Olivia Gazit-Bornstein, Gadi Yang, xiaodong
5 Cartlidge, Susan Ann Tonge, David William
<120> PROTEÍNAS DE UNIÓN ESPECÍFICAS PARA FACTORES DE CRECIMIENTO DE TIPO INSULINA Y USOS
DE LAS MISMAS 10
<130> ABXAZ.004VPC
<160> 102
15 <170> FastSEQ para Windows versión 4.0
<210> 1
<211> 372
<212> ADN 20 <213> Ser humano
<400> 1
25 <210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> Ser humano
30 <400> 2
<210> 3
<211> 324 35 <212> ADN
<213> Ser humano
<400> 3
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> Ser humano
<400> 4
10
<210> 5
<211> 363
<212> ADN
<213> Ser humano
15
<400> 5
<210>
6 20 <211> 121
<212> PRT
<213> Ser humano
<210> 7
<211> 336
<212> ADN
<213> Ser humano
<400> 7
<210>
9 15 <211> 360
5
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> Ser humano
10
<400> 8
<212> ADN
<213> Ser humano
<210> 10
<211> 120
<212> PRT 25 <213> Ser humano
<400> 10
<210> 11
<211> 336
<212> ADN
<213> Ser humano
<400> 11
10 <210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> Ser humano
15 <400> 12
<210> 13
<211> 360 20 <212> ADN
<213> Ser humano
<400> 13
25
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> Ser humano
30
<400> 14
<210> 15
<211> 336
<212> ADN
<213> Ser humano
<210> 16
<211> 112
<212> PRT 15 <213> Ser humano
<400> 16
20 <210> 17
<211> 372
<212> ADN
<213> Ser humano
25 <400> 17
<210> 18
<211> 124
<212> PRT
<213> Ser humano
<210> 19
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Ser humano
<400> 19
20 <210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> Ser humano
25 <400> 20 <210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> Ser humano
<400> 21
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> Ser humano
<400> 22
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Ser humano
<400> 23
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Ser humano
<400> 24
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
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<213> Ser humano
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<213> Ser humano
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<213> Ser humano
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35
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<213> Ser humano
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10
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<212> ADN
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<212> ADN
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11
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11
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<212> PRT
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<213> Ser humano
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<210> 96 15 <211> 12
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<210> 97
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<212> PRT 25 <213> Ser humano
<400> 97
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25 40 <212> PRT
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15
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<213> Ser humano
20
<400> 102

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Proteína de unión específica aislada completamente humana que se une preferentemente al factor de crecimiento de tipo insulina-II (IGF-II) con reactividad cruzada por el factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-I) y neutraliza la actividad de IGF-I y IGF-II, comprendiendo dicha proteína de unión, o fragmento de unión de la misma:
    una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de “Ser Tyr Asp Ile Asn” (SEQ ID NO: 33);
    una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (CDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de “Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly” (SEQ ID NO: 34);
    una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (CDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de “Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val” (SEQ ID NO: 35);
    una región determinante de complementariedad de cadena ligera 1 (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de “Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser” (SEQ ID NO: 36);
    una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (CDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de “Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser” (SEQ ID NO: 37); y
    una región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (CDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de “Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val” (SEQ ID NO: 38).
  2. 2.
    Proteína de unión específica según la reivindicación 1, siendo dicha proteína de unión el anticuerpo monoclonal 7.159.2 (número de registro de la ATCC PTA-7424).
  3. 3.
    Proteína de unión específica según la reivindicación 1, comprendiendo dicha proteína de unión un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO.: 6;
    o comprendiendo dicha proteína de unión un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO.: 8.
  4. 4.
    Proteína de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, comprendiendo dicha proteína de unión un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO.: 6;
    y comprendiendo dicha proteína de unión un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO.: 8.
  5. 5.
    Proteína de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo dicha proteína de unión un anticuerpo monoclonal completamente humano; o
    un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano.
  6. 6.
    Proteína de unión específica según la reivindicación 5, en la que dicho fragmento de unión se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab’ o F(ab’)2 y Fv.
  7. 7.
    Proteína de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
  8. 8.
    Molécula de ácido nucleico que codifica proteína de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  9. 9.
    Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.
  10. 10.
    Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 9.
  11. 11.
    Proteína de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, no uniéndose específicamente dicha proteína de unión específica a proteínas IGF-II o IGF-I cuando dichas proteínas están unidas a proteínas de unión a factor de crecimiento de insulina.
  12. 12.
    Método de determinación del nivel de factor de crecimiento de tipo insulina-II (IGF-II) y factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-I) en una muestra de un paciente que comprende:
    poner en contacto una muestra de un paciente con la proteína de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y
    determinar el nivel de IGF-I y IGF-II en dicha muestra.
  13. 13.
    Uso de la proteína de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor maligno.
  14. 14.
    Uso según la reivindicación 13, en el que dicho tumor maligno se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer pancreático y carcinoma epidermoide.
  15. 15.
    Uso según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho medicamento es para su uso en combinación con un segundo agente antineoplásico seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterápico y un fármaco radiactivo.
  16. 16.
    Uso según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho medicamento es para su uso conjuntamente con o tras una cirugía convencional, un trasplante de células madre de la médula ósea o un trasplante de células madre periféricas.
  17. 17.
    Conjugado que comprende el anticuerpo según la reivindicación 5 o un fragmento de unión del mismo y un agente terapéutico.
  18. 18.
    Conjugado según la reivindicación 17, en el que el agente terapéutico es una toxina;
    un radioisótopo; o
    una composición farmacéutica.
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Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2524305C (en) * 2003-05-01 2015-12-08 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
CA2612449A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-28 Imclone Systems Incorporated Receptor antagonists for treatment of metastatic bone cancer
AP2008004569A0 (en) * 2006-02-03 2008-08-31 Imclone Systems Inc IGR-IR antagonists as adjuvants for treatment of prostrate cancer
EP2046833B9 (en) 2006-07-14 2014-02-19 AC Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
WO2008152422A2 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 Astrazeneca Ab Binding proteins specific for insulin-like growth factors and uses thereof-909
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
PE20090368A1 (es) * 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
US20110052667A1 (en) * 2007-06-28 2011-03-03 Sylgen Laboratories, Inc. Compositions and methods for inhibiting angiogenesis and tumorigenesis
AU2008311367B2 (en) 2007-10-05 2014-11-13 Ac Immune S.A. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
SG190572A1 (en) * 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20110165145A1 (en) * 2008-05-09 2011-07-07 Dransfield Daniel T Igf-ii/igf-iie binding proteins
TW201006485A (en) 2008-06-03 2010-02-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102149825B (zh) 2008-07-08 2015-07-22 Abbvie公司 前列腺素e2双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
CA2740440A1 (en) * 2008-10-14 2010-04-22 Dyax Corp. Use of igf-ii/igf-iie binding proteins for the treatment and prevention of systemic sclerosis-associated pulmonary fibrosis
CZ301597B6 (cs) * 2008-11-03 2010-04-28 Univerzita Karlova v Praze, 1. Lékarská fakulta Kombinace monoklonálních protilátek nebo jejich Fab fragmentu pro použití jako lécivo a farmaceutický prípravek tyto protilátky nebo jejich Fab fragmenty obsahující
EA201100741A1 (ru) 2008-11-10 2012-01-30 Новартис Аг Антитела к модифицированным пептидам ифр-1/е человека
NZ597692A (en) * 2008-12-12 2013-08-30 Boehringer Ingelheim Int Anti-IGF antibodies
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
AU2010282508B2 (en) 2009-08-13 2015-05-28 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for production of antibodies having minimal CDRs
WO2011028811A2 (en) * 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BR112012008833A2 (pt) * 2009-10-15 2015-09-08 Abbott Lab imunoglobulinas de dominio variavel duplo e usos das mesmas
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2598882B1 (en) 2010-07-30 2017-07-26 AC Immune S.A. Safe and functional humanized antibodies for use in treating an amyloidosis
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2013539364A (ja) 2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
EP2640421A4 (en) * 2010-11-16 2014-05-28 Medimmune Llc THERAPIES FOR TREATMENTS WITH ANTI-IGF ANTIBODIES
MX2013008833A (es) * 2011-02-02 2013-12-06 Amgen Inc Metodos y composiciones relacionadas con la inhibicion de receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (igf-1r).
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
US9150644B2 (en) 2011-04-12 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (IGF) I and II
US9127056B2 (en) 2011-10-17 2015-09-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monospecific and bispecific human monoclonal antibodies targeting insulin-like growth factor II (IGF-II)
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
TW202037609A (zh) 2012-11-01 2020-10-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014085596A1 (en) * 2012-11-29 2014-06-05 Bayer Healthcare Llc MONOCLONAL ANTIBODIES AGAISNT ACTIVATED PROTEIN C (aPC)
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
WO2014150840A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Medimmune, Llc Methods of treating breast cancer
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
EP3041863A4 (en) 2013-09-05 2017-08-16 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
CA2934313A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Medimmune, Llc Compositions and methods for treating sarcoma
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
AU2016283344B2 (en) 2015-06-24 2022-08-04 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion protein containing BDNF
KR102497564B1 (ko) 2016-12-26 2023-02-07 제이씨알 파마 가부시키가이샤 혈액뇌관문을 통과하는 신규한 항인간 트랜스페린 수용체 항체
CA3052936A1 (en) 2016-12-26 2018-07-05 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion protein of bdnf and anti-transferrin receptor antibody
CA3056011A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US12325737B2 (en) 2018-03-26 2025-06-10 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
SG11202108398YA (en) * 2019-02-01 2021-08-30 Novarock Biotherapeutics Ltd Anti-claudin 18 antibodies and methods of use thereof
AU2020337958A1 (en) 2019-08-28 2022-03-17 Horizon Therapeutics Ireland Dac Methods for the treatment of thyroid eye disease
BR112022005583A2 (pt) 2019-09-26 2022-09-20 Amgen Inc Métodos para a produção de composições de anticorpos
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
KR20230087539A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 암젠 인크 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
US20250076309A1 (en) 2021-10-05 2025-03-06 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
CN114031685B (zh) * 2022-01-10 2022-03-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种全人源抗新冠病毒中和抗体zw2g10及应用
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
AU2024287547A1 (en) 2023-07-07 2026-01-22 Viridian Therapeutics, Inc. Methods of treating chronic thyroid eye disease
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
GB1047304A (es) 1963-07-05
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3169595D1 (en) 1980-11-10 1985-05-02 Gersonde Klaus Method of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatment, the use of this method and apparatus for its application
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
JPS58118008A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Nec Corp デ−タ処理装置
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
JPS58166633A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
JPS58166634A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3483949D1 (de) 1983-09-26 1991-02-21 Udo Dr Med Ehrenfeld Mittel und erzeugnis fuer die diagnose und therapie von tumoren sowie zur behandlung von schwaechen der zelligen und humoralen immunabwehr.
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
JPS62170639A (ja) 1986-01-22 1987-07-27 株式会社システムメンテナンス 防蟻板の取付け工法
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DK0486622T3 (da) 1989-08-09 1999-07-19 Rhomed Inc Direkte radiomærkning af antistoffer og andre proteiner med technetium eller rhenium
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
CA2058041A1 (en) 1990-06-27 1991-12-28 Katsuichi Sakano Anti-igf-ii monoclonal antibody
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69133557D1 (de) 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
AU4541093A (en) 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
UA58494C2 (uk) 1995-06-07 2003-08-15 Зенека Лімітед Похідні n-гетероарилпіридинсульфонаміду, фармацевтична композиція, спосіб одержання та спосіб протидії впливам ендотеліну
KR100308764B1 (ko) 1995-08-29 2001-12-17 마나배게이사꾸 키메라동물및그의제작법
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DE69720965T2 (de) 1996-02-13 2004-02-05 Astrazeneca Ab Chinazolinderivate und deren verwendung als vegf hemmer
NZ331191A (en) 1996-03-05 2000-03-27 Zeneca Ltd 4-anilinoquinazoline derivatives and pharmaceutical compositions thereof
GB9718972D0 (en) 1996-09-25 1997-11-12 Zeneca Ltd Chemical compounds
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
GB9714249D0 (en) 1997-07-08 1997-09-10 Angiogene Pharm Ltd Vascular damaging agents
US6417330B1 (en) * 1998-06-01 2002-07-09 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein variants
GB9900334D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Angiogene Pharm Ltd Tricylic vascular damaging agents
GB9900752D0 (en) 1999-01-15 1999-03-03 Angiogene Pharm Ltd Benzimidazole vascular damaging agents
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
AU2001258628A1 (en) 2000-05-31 2001-12-11 Astrazeneca Ab Indole derivatives with vascular damaging activity
MXPA02012903A (es) 2000-07-07 2004-07-30 Angiogene Pharm Ltd Derivados de colquinol como inhibidores de angiogenesis.
MXPA02012905A (es) 2000-07-07 2004-07-30 Angiogene Pharm Ltd Derivados de colquinol como agentes de dano vascular..
ME00502B (me) * 2001-01-05 2011-10-10 Amgen Fremont Inc Antitjela za insulinu sličan receptor faktora i rasta
CA2469196A1 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Discovery of therapeutic products
AU2003231554A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody to human insulin-like growth factor
CA2524305C (en) 2003-05-01 2015-12-08 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
CA2536288A1 (en) * 2003-08-21 2005-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cancer metastasis inhibitor
ATE492562T1 (de) 2003-09-24 2011-01-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Rekombinanter antikörper gegen humanen insulin- like growth factor
JPWO2005027970A1 (ja) * 2003-09-24 2007-11-15 協和醗酵工業株式会社 癌治療用医薬
JP5149800B2 (ja) 2005-08-17 2013-02-20 アメリカ合衆国 Ｉｇｆ−ｉｉに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009519711A (ja) 2009-05-21
ECSP088616A (es) 2008-08-29
US20110200607A1 (en) 2011-08-18
CN105753983A (zh) 2016-07-13
IL191718A0 (en) 2009-02-11
HK1124764A1 (en) 2009-07-24
AR058322A1 (es) 2008-01-30
JP5302007B2 (ja) 2013-10-02
MX2008007688A (es) 2008-09-26
RU2008128355A (ru) 2010-01-20
US7939637B2 (en) 2011-05-10
RU2492185C2 (ru) 2013-09-10
US20070196376A1 (en) 2007-08-23
US9181336B2 (en) 2015-11-10
HRP20120421T1 (hr) 2012-07-31
CY1112876T1 (el) 2016-04-13
IL191718A (en) 2014-08-31
PT1979001E (pt) 2012-07-13
BRPI0619786A2 (pt) 2011-10-18
NO20082634L (no) 2008-09-08
WO2007070432A3 (en) 2007-11-29
KR20080089592A (ko) 2008-10-07
US8410058B2 (en) 2013-04-02
EP1979001A2 (en) 2008-10-15
UY30002A1 (es) 2007-07-31
ATE552853T1 (de) 2012-04-15
IL234798A (en) 2016-02-29
US20130274450A1 (en) 2013-10-17
DK1979001T3 (da) 2012-07-16
AU2006326649B2 (en) 2011-03-24
EP1979001B1 (en) 2012-04-11
EP2404616A3 (en) 2012-02-29
AU2006326649A1 (en) 2007-06-21
US20160090414A1 (en) 2016-03-31
CA2633956A1 (en) 2007-06-21
EP2404616A2 (en) 2012-01-11
PL1979001T3 (pl) 2012-09-28
WO2007070432A2 (en) 2007-06-21
KR101372690B1 (ko) 2014-03-17
RU2013125306A (ru) 2014-12-10
RS52357B (sr) 2012-12-31
TW200801040A (en) 2008-01-01
CA2633956C (en) 2016-12-06
RU2549703C2 (ru) 2015-04-27
US9796779B2 (en) 2017-10-24

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