BRPI0707944A2

BRPI0707944A2 - ácido nucléico

Info

Publication number: BRPI0707944A2
Application number: BRPI0707944-3A
Authority: BR
Inventors: Johnathan Napier; Olga Sayanova; Monica Venegas Caleron
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2006-02-16
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2011-05-17
Also published as: AU2007216359B2; WO2007093776A2; ES2367220T3; CA2641425A1; CA3006116A1; CN101421399B; US8119861B2; CN101421399A; CA2641425C; CA3006116C; AU2007216359A1; WO2007093776A3; US20090019559A1; EP2380984A3; EP2380984A2; DK1984502T3; AR059554A1; EP1984502B1; BRPI0707944B1; EP1984502A2

Abstract

ACIDO NUCLéICO. A presente invenção refere-se ao ácido nucléico derivado de Perkinsus marinus que codifica uma enzima de 9-elongase, uma <30>8- dessaturase e <30>5-dessaturase. Todas as seqúéncias de codificação podem ser transcritas como uma única transcrição.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ÁCIDO NU-CLÉICO" .

A presente invenção refere-se ao ácido nucléico derivado dePerkinsus marinus que codifica um 9-elongase, A8-dessaturase e uma enzi-ma de A5-dessaturase. Todas as seqüências de codificação podem sertranscritas como uma única transcrição, que simplifica o processo de trans-formação de células requerido para expressar todas as três proteínas. A in-venção também refere-se às seqüências de codificação individuais e às pro-teínas codificadas por estas seqüências como também a um processo paraconverter o ácido linoléico em ácido araquidônico.

Os ácidos graxos e triacilglicerídeos têm uma multiplicidade deaplicações na indústria alimentícia, em nutrição animal, em cosméticos e nosetor farmacológico. Dependendo se eles são ácidos graxos saturados ounão saturados ou então triacilglicerídeos com um conteúdo elevado de áci-dos graxos saturados ou não saturados, eles são adequados para muitasaplicações diferentes. Os ácidos graxos poliinsaturados, tal como ácido lino-léico e ácido iinolênico são essenciais para mamíferos, uma vez que elesnão podem ser produzidos pelos mesmos. Os ácidos graxos ω3 e ácidosgraxos ω6 poliinsaturados são então um componente importante na nutriçãoanimal e humana.

A seguir, os ácidos graxos poliinsaturados são referidos comoPUFA, PUFAs, LCPUFA ou LCPUFAs (ácidos graxos poliinsaturados, PU-FA, ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, LCPUFA).

Os vários ácidos graxos e triglicerídeos são principalmente obti-dos de microorganismos tal como Mortierella e Schizochytrium ou de plantasprodutoras de óleo, tal como soja, óleo de semente de colza, algas tal comoCrypthecodinium ou Phaeodactylum e outros, onde eles são obtidos, comouma regra, na forma de seus triacilglicerídeos (= triglicerídeos = trigliceróis).Entretanto, eles também podem ser obtidos de animais, tal como, por exem-plo, peixe. Os ácidos graxos livres são preparados vantajosamente atravésde hidrólise. Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, tal como,ácido docosaexanóico (= DHA, C22:6A4·7'10·13'16·19), ácido eicosapentanóico(= EPA1 C20:5a5'8, 14'17), ácido araquidônico (= ARA, C20:4A5·8'11·14), ácidodi-homo-y-linolênico (C20:3a8' 11· 14) ou ácido de docosapentanóico (DPA,C22:5a7, 10,13,16'19), não são sintetizados em colheitas de óleo, tal como óleode semente de colza, soja, girassol ou açafroa. As fontes naturais conven-cionais destes ácidos graxos são peixes, tal como arenque, salmão, sardi-nha, peixe vermelho, enguia, carpa, truta, hipoglosso, cavala, zander ou a-tum, ou algas.

Dependendo do uso pretendido, os óleos com ácidos graxos sa-turados ou não saturados são preferidos. Em nutrição humana, por exemplo,os lipídios com ácidos graxos não saturados, especificamente ácidos graxospoliinsaturados, são preferidos. Os ácidos oo3-graxos poliinsaturados sãoditos ter um efeito positivo no nível de colesterol no sangue e desse modo napossibilidade de prevenir doença cardíaca. O risco de doença cardíaca, aci-dente vascular cerebral ou hipertensão pode ser reduzido notadamente adi-cionando-se estes ácidos oo3-graxos à comida. Além disso, os ácidos ω3-graxos têm um efeito positivo em processos inflamatórios, especificamenteem processos cronicamente inflamatórios, em associação com doenças i-munológicas, tal como artrite reumática. Eles são então adicionados aoscomestíveis, especificamente aos comestíveis dietéticos, ou são emprega-dos em medicamentos. Os ácidos graxos ω6 tal como ácido araquidônicotendem a ter um efeito negativo nestes distúrbios com relação a estas doen-ças reumáticas por causa do influxo dietético habitual.

Ácidos graxos ω3 e ω6 são precursores de hormônios de tecido,conhecidos como eicosanóides, tal como o prostaglandinas que são deriva-das de ácido di-homo-hinolênico, ácido araquidônico e ácido eicosapenta-nóico, e dos tromboxanos e Ieucotrienos que são derivados de ácido araqui-dônico e ácido de eicosapentanóico. Os eicosanóides (conhecidos como asséries PG2) que são geralmente formados de ácidos ωθ-graxos promovemas reações inflamatórias, ao mesmo tempo em que os eicosanóides (conhe-cidos como as séries PG3) de ácidos graxos u>3 têm pouco ou nenhum efeitopró-inflamatório.

Devido às características positivas dos ácidos graxos poliinsatu-rados, não houve nenhuma falta de tentativas no passado para fabricar ge-nes disponíveis que estão envolvidos na síntese destes ácidos graxos outriglicerídeos para a produção de óleos em vários organismos com um con-teúdo modificado de ácidos graxos não saturados. Desse modo, WO91/13972 e sua U.S. equivalente descreve uma A9-dessaturase. WO 93/11245 reivindica uma A15-dessaturase e WO 94/11516 uma Δ12-dessaturase. Por exemplo, dessaturases adicionais são descritas nos EP-A-O 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-O 794 250, Stukey e outros, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wa-da e outros, Nature 347, 1990: 200-203 ou Huang e outros, Lipids 34, 1999:649-659. Entretanto, a caracterização bioquímica das várias dessaturasestem sido insuficiente até hoje uma vez que as enzimas, sendo proteínas li-gadas à membrana, apresentam grande dificuldade no seu isolamento e ca-racterização (McKeon e outros, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang e outros, Plante Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Comouma regra, as dessaturases ligadas à membrana são caracterizadas por se-rem introduzidas em um organismo adequado que é subseqüentemente ana-lisado quanto à atividade de enzima analisando-se os materiais de partida eos produtos. A6-Dessaturases são descritas nos WO 93/06712, U.S.5.614.393, US5614393, WO 96/21022, WO 00/21557 e WO 99/27111 e aaplicação para a produção de ácidos graxos em organismos transgênicos édescrita nos WO 98/46763, WO 98/46764 e WO 98/46765. Neste contexto, aexpressão de várias dessaturases e a formação de ácidos graxos poliinsatu-rados, é também descrita e reivindicada no WO 99/64616 ou WO 98/46776.Com respeito à expressão eficácia de dessaturases e seu efeito na formaçãode ácidos graxos poliinsaturados, deve ser notado que a expressão de umaúnica dessaturase como descrito até hoje somente resultou em baixos con-teúdos de ácidos graxos não saturado /lipídeos tal como, por exemplo, ácidoγ-linolênico e ácido estearidônico. Além disso, uma mistura de ácidos graxosu>3 e ω6 foi obtida, como uma regra.

Os microorganismos especialmente adequados para a produçãode PUFAs são microalgas tal como espécies de Phaeodactylum tricornutum,Porphiridium, espécies de Thraustochytrium, espécies de Schizochytrium ouespécies de Crypthecodinium, ciliados tais como Stylonychia ou Colpidium,fungos tais como Mortierella, Entomophthora ou Mucor e/ou musgos taiscomo Physcomitrella, Ceratodon e Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen(1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22:1060-1062; M. Akimoto e outros (1998) Appl. Biochemistry e Biotechnology73: 269-278). A seleção de cepa resultou no desenvolvimento de várias ce-pas mutantes dos microorganismos em questão que produzem uma série decompostos desejáveis incluindo PUFAs. Entretanto, a mutação e seleção decepas com uma produção melhorada de uma molécula particular tal como osácidos graxos poliinsaturados, é um processo demorado e difícil. Isto é porque os métodos recombinantes como descrito acima são preferidos sempreque possível.

Porém, somente quantidades limitadas dos ácidos graxos poliin-saturados desejados tais como DPA1 EPA ou ARA podem ser produzidascom a ajuda dos microorganismos acima mencionados, e, dependendo domicroorganismo usado, estes geralmente são obtidos como misturas de áci-do graxo de, por exemplo, EPA, DPA e ARA.

Uma variedade de séries de reação sintéticas está sendo descri-ta pela síntese de ácido araquidônico, ácido de eicosapentanóico (EPA) eácido docosaexanóico (DHA) (figura 1). Desse modo, são produzidos EPAou DHA em bactérias marinhas tal como Vibrio sp. ou Shewanella sp. pelasséries de reação de policetídeo (Yu, R., e outros, Lipids 35:1061-1064, 2000;Takeyama, H., e outros, Microbiology 143:2725-2731, 1997).Uma estratégia alternativa é a atividade alternada de dessatura-

ses e elongases (Zank, T.K. e outros, Plant Journal 31:255-268, 2002; Saku-radani, E., e outros, Gene 238:445-453, 1999). Uma modificação da série dereação descrita acima por A6-dessaturase, A6-elongase, A5-dessaturase,Δδ-elongase e A4-dessaturase é a série de reação de Sprecher (Sprecher2000, Biochim. Biophys. Acta 1486:219-231) em mamíferos. Em vez da Δ4-dessaturação, uma outra etapa de alongamento é efetuado aqui para produ-zir C2A, seguido por uma outra A6-dessaturação e finalmente β-oxidaçãopara produzir o comprimento de cadeia C22. Desse modo, o que é conheci-do como série de reação de Sprecher (veja figura 1) é, entretanto, não ade-quado para a produção em plantas e microorganismos uma vez que os me-canismos reguladores não são conhecidos.

Dependendo do seu padrão de dessaturação, os ácidos graxospoliinsaturados podem ser divididos em duas classes grandes, viz. Ácidosgraxos ω6 ou ω3, que diferem com respeito às suas atividades metabólicase funcionais (figura 1).

O material de partida para a série de reação metabólica ω6 é oácido linoléico de ácido graxo (18:2a9, 12) ao mesmo tempo em que a série dereação ω3 prossegue através de ácido linolênico (18:3a9·12·15). O ácido Iino-lênico é formado pela atividade de uma dessaturase ω3 (Tocher e outros1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117; Domergue e outros 2002, Eur. J. Bio-chem. 269, 4105-4113).

Os mamíferos, e desse modo também os humanos, não têm ne-nhuma atividade de dessaturase correspondente (Δ12 - e Δ u)3-dessaturase)e têm que absorver estes ácidos graxos (ácidos graxo essenciais) pela co-mida. Começando com estes precursores, os ácidos graxos poliinsaturadosfisiologicamente importantes ácido araquidônico (= ARA, 20:4a5·8·11,14), umácido graxo ω6 e os dois ácidos eicosapentanóicos de ácidos graxos ω3 (=EPA, 20:5a5'8·11· 14·17) e ácido docosaexanóico (DHA, 22:6a4·7· 10,13,17·19) sãosintetizados pela seqüência de reações de dessaturase e elongase. A apli-cação de ácidos graxos ω3 mostra a atividade terapêutica descrita acima notratamento de doenças cardiovasculares (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr.Diet. 88, 100-108), Entzündungen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soe. 61, 345-358) e Arthritis (Cleland e James 2000, J., Rheumatol. 27, 2305-2307).

O alongamento de ácidos graxo, através de elongases, atravésde 2 ou 4 átomos de C é de importância crucial para a produção de C20 - eC22-PUFAs, respectivamente. Este processo prossegue por 4 etapas. A pri-meira etapa é a condensação de malonil-CoA com o ácido graxo-acil-CoAatravés de cetoacil-CoA sintase (KCS, a seguir chamado elongase). Isto éseguido por uma etapa de redução (cetoacil-CoA reduetase, KCR), uma eta-pa de desidratação (desidratase) e uma etapa de redução final (enoil-CoAreductase). Foi postulado que a atividade de elongase afeta a especificidadee taxa do processo inteiro (Millar e Kunst, 1997 Plant Journal 12:121-131).

Houve um número grande de tentativas no passado para obtergenes de elongase. Millar e Kunst1 1997 (Plant Journal 12:121-131) e Millare outros, 1999, (Plant Cell 11:825-838) descreve a caracterização de elon-gases de planta para a síntese de ácidos graxo de cadeia longa monoinsatu-rados (C22:1) e para a síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa paraa formação de ceras em plantas (C28-C32). As descrições com respeito à sín-tese de ácido araquidônico e EPA, são encontradas, por exemplo, nosW00159128, W00012720, W002077213 e W00208401. A síntese de áci-dos C24-graxos poliinsaturados é descrita, por exemplo, em Tvrdik e outros2000, JCB 149:707-717 ou W00244320.

As plantas mais altas compreendem ácidos graxos poliinsatura-dos tal como ácido linoléico (18:2Δ9·12) e ácido linolênico (18:3a9,12, 15). ARA,EPA e DHA não são encontrados no óleo de semente de plantas mais altas,ou somente em quantidades pequenas (E. Ucciani: Nouveau Dictionnairedes Huiles Vegetales [New Dictionary of Vegetable Oils]. Technique & Do-cumentation - Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Porém, a produção deLCPUFAs em plantas mais altas, preferivelmente em colheitas de óleo talcomo óleo de semente de colza, linhaça, girassol e soja, seria vantajosauma vez que quantidades grandes de LCPUFAs de alta qualidade para aindústria alimentícia, nutrição animal e propósitos farmacêuticos poderiamser obtidos economicamente. Para este fim, é vantajoso introduzir, em co-Iheitas de óleo, genes que codificam enzimas da biosíntese de LCPUFA pormétodos recombinantes e para expressá-los aqui. Estes genes podem codi-ficar, por exemplo, A9-elongases, Δδ-dessaturases e/ou A5-dessaturases.

Estes genes podem ser isolados vantajosamente de microorganismos eplantas mais baixas que produzem LCPUFAs e os incorporam nas membra-nas ou triacilglicerídeos. Desse modo, já foi possível isolar os genes de Δ6-dessaturase do musgo Physcomitrella patens e genes de A6-elongase de P.patens e do nematódeo C. elegans.As primeiras plantas transgênicas que compreendem e expres-sam os genes que codificam enzimas de biossíntese de LCPUFA e que, co-mo uma conseqüência, produzem LCPUFAs foram descritas pela primeiravez, por exemplo, na Patente DE-A-102 19 203 (processo para a produçãode ácidos graxos poliinsaturados em plantas). Porém, estas plantas produ-zem LCPUFAs em quantidades que requerem otimização adicional paraprocessar os óleos que estão presente nas plantas.

Como pode ser visto da Figura 1, os produtos da iM6-série dereação podem ser modificados usando dessaturases apropriadas e, se ne-cessário, elongases para produzir ácidos graxos ω3. Portanto, seria suma-mente valioso desenvolver um produto que torne possível a produção deARA em um organismo geneticamente modificado.

O parasita de protozoário de ostra Perkinsus marinusi é capazde sintetizar ácidos graxos saturados e não saturados, incluindo o ácido gra-xo essencial, ácido araquidônico [20:4(n - 6), pela série de reação de Δ -8dessaturase. Surpreendentemente, os inventores presentes descobriramque P. marinusi contém nucléico que codifica um A9-elongase, um Δ8-dessaturase e um Δ5 - dessaturase que podem todos ser transcritos comouma única transcrição. A seqüência de tamanho natural é mostrada comoSEQ ID NO: 1.

Então, em um primeiro aspecto da invenção, é fornecida umaseqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipeptídeos com ativida-de de Δθ-elongase, A8-dessaturase e Δ5 - dessaturase e que seja selecio-nado do grupo que consiste em:

a) Seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos deácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo deste;

b) uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduosde ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1;

c) uma seqüência de ácido nucléico, isolada que codifica os po-lipeptídeos com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δ5-dessaturase, em que os polipeptídeos são selecionados do grupo que con-siste em SEQ ID NOS 2, 3 e 4;

d) Um derivado de uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 1 que codifica os polipeptídeos com pelo menos 40% de identidade aonível de aminoácido com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; emque os referidos polipeptídeos têm atividade de A9-elongase, Δ8 - dessatu-rase e A5-dessaturase.

A vantagem da seqüência de ácido nucléico da presente inven-ção é que, embora codifique três enzimas separadas, ela pode ser transcritacomo uma única seqüência que torna muito mais simples preparar os veto-res de clonagem e expressão que expressam todas as três enzimas.

Preferivelmente, a seqüência de ácido nucléico isolada de acor-do com a invenção não é idêntica a SEQ ID NO 1 (seqüência 1047306867)propriamente dita.

No contexto da presente invenção "hibridizar sob condições rigo-rosas" é pretendido descrever as condições de hibridização e lavagem sobas quais as seqüências de nucleotídeo com pelo menos 60% de homologiapara um outro normalmente permanecem hibridizadas com uma outra. Ascondições são preferivelmente tais que as seqüências com pelo menos cer-ca de 65%, preferivelmente pelo menos cerca de 70% e especialmente pre-ferivelmente pelo menos 75% ou mais de homologia para uma outra nor-malmente permaneçam hibridizadas para uma outra. Estas condições rigo-rosas são conhecidas pelo trabalhador versado e são descritas, por exem-plo, em Currents Protocols em Molecular Biology, John Wiley & Sons, N., Y.(1989), 6.3.1-6.3.6. Um exemplo não Iimitante preferido de condições de hi-bridização rigorosas, é a hibridização em 6 χ de citrato de sódio/cloreto desódio (= SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uma ou mais etapasde lavagem em 0,2 χ SSC, 0,1% de SDS de 50 a 65°C. O trabalhador versa-do sabe que estas condições de hibridização diferem dependendo do tipo deácido nucléico e, por exemplo, quando solventes orgânicos estão presentes,relativo à temperatura e concentração de tampão. Sob "condições de hibridi-zação padrão", por exemplo, a temperatura de hibridização está, dependen-do do tipo de ácido nucléico, entre 42°C e 58°C em tampão aquoso comuma concentração de 0,1 a 5 χ SSC (pH 7,2). Se solventes orgânicos, porexemplo, 50% de formamida, estiverem presentes no tampão acima men-cionado, a temperatura sob condições padrão é aproximadamente 42°C. Ascondições de hibridização para híbridos de DNA:DNA, por exemplo, são 0,1χ SSC e 20°C a 45°C, preferivelmente 30°C a 45°C. As condições de hibridi-zação para híbridos de DNA:RNA são, por exemplo, 0,1 χ SSC e 30°C a550C, preferivelmente 45°C a 55°C. As condições de hibridização acimamencionadas são determinadas por via de exemplo para um ácido nucléicocom aproximadamente 100 pb (= pares de base) em comprimento e com umconteúdo de G + C de 50% na ausência de formamida. O trabalhador versa-do sabe como determinar as condições de hibridização exigidas em basedos livros de ensino acima mencionados ou livros de ensino tal como Sam-brook e outros, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989;Hames e Higgins (Ed.) 1985,"Nucleic Acids Hybridization: A Practical Appro-ach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.)1991 ,"Essencial Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Ox-ford University Press, Oxford.

Além disso, quando o relatório presente refere-se às moléculasde ácido nucléico isoladas de uma seqüência de nucleotídeo que hibridizacom uma das seqüências de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQID NO: 3 ou com uma parte desta sob condições rigorosas, "uma parte des-ta" é compreendida como significando, de acordo com a invenção, que pelomenos 25 pares de base (= pb), 50 pb, 75 pb, 100 pb, 125 pb ou 150 pb,preferivelmente pelo menos 175 pb, 200 pb, 225 pb, 250 pb, 275 pb ou 300pb, especialmente preferivelmente 350 pb, 400 pb, 450 pb, 500 pb ou maispares de base são usados para a hibridização.

No contexto da presente invenção "Homólogos" da seqüência deácido nucléico com a seqüência SEQ ID NO: 1 significa, por exemplo, vari-antes alélicas com pelo menos aproximadamente 50 ou 60%, preferivelmen-te pelo menos aproximadamente 60 ou 70%, mais preferivelmente pelo me-nos aproximadamente 70 ou 80%, 90% ou 95% e até mesmo mais preferi-velmente pelo menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ouhomologia com uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1.

"Variantes alélicas" compreendem, em particular, variantes fun-cionais que podem ser obtidas por deleção, inserção ou substituição de nu-cleotídeos de/na seqüência, sendo pretendido, porém, que a atividade deenzima das proteínas resultantes que são sintetizadas seja retida vantajo-samente para a inserção de um ou mais genes.

"Homólogos" também quer dizer homólogos bacterianos, fúngi-cos e de planta, seqüências truncadas, DNA ou RNA de filamento único daseqüência de DNA de codificação e não codificação e derivados tal como,por exemplo, variantes de promotor. Os promotores a montante das seqüên-cias de nucleotídeo detalhadas podem ser modificados por uma ou mais tro-cas de nucleotídeo, através de inserção(s) deleção(s) sem a funcionalidadeou atividade dos promotores que são adversamente afetados, porém. É, a-lém disso, possível que a modificação da seqüência promotora aumente asua atividade ou que ela seja substituída completamente por promotoresmais ativos, incluindo aqueies de organismos heterólogos.

Para determinar a porcentagem de homologia (= identidade) deduas seqüências de aminoácido, as seqüências são escritas uma sob a ou-tra para uma comparação ideal (por exemplo, podem ser introduzidas aber-turas na seqüência de uma proteína ou de um ácido nucléico para gerar umalinhamento ideal com a outra proteína ou o outro ácido nucléico). Então, oresíduo de aminoácido ou nucleotídeos nas posições de aminoácido ou po-sições de nucleotídeo correspondentes, é comparado. Se uma posição emuma seqüência estiver ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou pelomesmo nucleotídeo como a posição correspondente na outra seqüência,então as moléculas são homólogas a esta posição (isto é, "homologia" deaminoácido ou ácido nucléico como usado no presente contexto correspon-de a "identidade" do aminoácido ou ácido nucléico). A porcentagem de ho-mologia entre as duas seqüências é uma função do número de posições queas seqüências compartilham (isto é,% de homologia = número de posiçõesidênticas/número total de posições χ 100). Os termos homologia e identidadeserão considerados então como sinônimos.

A homologia foi calculada sobre a região de seqüência de ácidonucléico ou aminoácido total. O trabalhador versado tem disponível uma sé-rie de programas que são com base em vários algoritmos para a compara-ção de várias seqüências. Aqui, os algoritmos de Needleman e Wunsch ouSmith e Waterman dão resultados particularmente seguros. O programa Pil-eUp (o J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins e outros, CABIOS, 51989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit [Needleman e Wunsch (J.Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) e Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que fazem parte do pacote de software GCG [Genetics Compu-ter Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, U.S.A. 53711 (1991)], foiusado para o alinhamento de seqüência. Os valores Ogy de seqüência quesão indicados acima como uma porcentagem, foram determinado sobre aregião de seqüência total que usa o programa GAP as seguintes colocações:Peso GAP: 50, Peso de Comprimento: 3, Equilíbrio Médio: 10.000 e Dese-quilíbrio Médio: 0,000. A menos que de outro modo especificado, estes ajus-tes foram sempre usados como ajustes padrões para os alinhamentos deseqüência.

No contexto da presente invenção "atividade de A9-elongase,Δδ-dessaturase e Δδ-dessaturase" é entendida como significando que umaproteína codificada por um derivado de SEQ ID NO:1 ou resíduos de ácidonucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 retém uma atividade enzimática depelo menos 10%, preferivelmente 20%, especialmente preferivelmente 30%e muito especialmente 40% comparada com as proteínas/enzimas codifica-das pela seqüência SEQ ID NO: 1 ou resíduos de ácido nucléico 7668 a12077 de SEQ ID NO: 1 e ttttt pode desse modo catalisar a conversão deácido linoléico em ácido araquidônico.

Embora seja freqüentemente extremamente útil transcrever áci-do nucléico que codifica polipeptídeos com atividade de A9-elongase, Δ8-dessaturase e Δδ-dessaturase como uma única seqüência, pode haver al-gumas circunstâncias nas quais seja preferível para fazer uso de ácido nu-cléico que codifica uma única enzima, isto é, uma A9-elongase, uma Δ8-dessaturase ou uma Δδ-dessaturase.

Então, em um segundo aspecto da invenção é fornecida umaseqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com ativi-dade de A9-elongase e que é selecionada do grupo que consiste em:

a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 ou um homólogo de uma destas;

b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9;

c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de A9-elongase, em que o polipeptídeo compreendeSEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10;

d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduosde ácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9, que codi-ficam um polipeptídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de ami-noácido com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; em que o referido polipeptí-deo tem atividade de A9-elongase.

Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma seqüênciade ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de Δ8-dessaturase e que é selecionado do grupo que consiste em:

a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo deste;

b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1;

c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de A8-dessaturase, em que o polipeptídeo compreendeSEQ ID NO: 3;

d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduosde ácido nucléico 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptí-deo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQ IDNO: 3; em que o referido polipeptídeo tem atividade de Δδ-dessaturase.

Em um quarto aspecto da invenção, é fornecida uma seqüênciade ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de Δδ-dessaturase e que é selecionado do grupo que consiste em:

a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo desta;

b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1;

c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de Δδ-dessaturase, em que o polipeptídeo compreendeSEQ ID NO: 4;

d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduosde ácido nucléico 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipep-1δ tídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQID NO: 4; em que o referido polipeptídeo tem atividade de Δδ-dessaturase.

Em ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um polipeptí-deo que é codificado por uma seqüência de ácido nucléico de quaisquer dosprimeiro a quarto aspectos da invenção.

Vantajosamente, o polipeptídeo codificado por estas moléculasde ácido nucléico têm, pelo menos aproximadamente δ0%, preferivelmentepelo menos aproximadamente 60% e mais preferivelmente pelo menos a-proximadamente 70%, 80% ou 90% e preferivelmente pelo menos aproxi-madamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,2δ 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com as seqüências de aminoá-cido mostradas nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ IDNO: 9.

As seqüências de ácido nucléico usadas no processo são intro-duzidas vantajosamente em um cassete de expressão que torna possível aexpressão dos ácidos nucléicos em organismos tal como microorganismosou plantas.

Então, em outro aspecto da invenção é fornecida um construtode gene compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica umou mais polipeptídeos com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e/ouA5-dessaturase como apresentado acima, operavelmente ligado com umaou mais seqüências reguladoras.

No cassete de expressão, a seqüência de ácido nucléico quecodifica Δθ-elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase, é unida opera-velmente com uma ou mais seqüências reguladoras, vantajosamente pararealçar a expressão de gene. É pretendido que estas seqüências regulado-ras tornem possível a expressão específica dos genes e proteínas. Depen-dendo do organismo de hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que ogene é expressado e/ou superexpressado somente após a indução ter ocor-rido, ou então que é expressado e/ou superexpressado imediatamente. Porexemplo, estas seqüências reguladoras tomam a forma de seqüências àsquais indutores ou repressores se ligam, desse modo controlando a expres-são do ácido nucléico. Além destas novas seqüências reguladoras, ou emvez destas seqüências, os elementos reguladores naturais destas seqüên-cias podem ainda estar presentes antes dos genes estruturais atuais e, seapropriado, podem ter sido geneticamente modificados de um tal modo queseu regulamento natural seja eliminado e a expressão dos genes seja inten-sificada. Entretanto, o cassete de expressão (= construto de expressão =construto de gene) também pode ser mais simples na construto, isto é, ne-nhum sinal regulador adicional foi inserido antes da seqüência de ácido nu-cléico ou seus derivados, e o promotor natural junto com seu regulamentonão foi removido. Ao invés, a seqüência reguladora natural foi mutada de umtal modo que o regulamento já não mais ocorra e/ou expressão de gene, éintensificada. Estes promotores modificados também podem estar posicio-nados neles mesmos antes do gene natural na forma de partes de seqüên-cias (= promotor com partes das seqüências de ácido nucléico usadas deacordo com a invenção) para realçar a atividade. Além disso, o construto degene pode vantajosamente também compreender uma ou mais das que sãoconhecidas como seqüências realçadoras em ligação operável com o pro-motor, o que torna possível uma expressão intensificada da seqüência deácido nucléico.

Seqüências vantajosas adicionais, tal como outros elementosreguladores ou seqüências terminadoras, também podem ser inseridas naextremidade 3' das seqüências de DNA. Uma ou mais seqüências que codi-ficam enzimas que catalisam a conversão de ARA em um ácido graxo ω3-insaturado tal como EPA ou DHA também podem estar presentes. Dessemodo, por exemplo, as seqüências que codificam um Δδ-elongase, Δ3-dessaturase e/ou A4-dessaturase, podem estar presentes em uma ou maiscópias do cassete de expressão (= construto de gene). Preferivelmente, so-mente uma cópia dos genes está presente em cada cassete de expressão.Este construto de gene ou os construtos de gene podem ser expressadosjuntos no organismo de hospedeiro. Neste contexto, o(s) construto(s) de ge-ne pode(m) ser inserido(s) em um ou mais vetores e está(ão) presente(s) nacélula na forma livre, ou então é inserido(s) no genoma. É vantajoso para ainserção de outros genes no genoma quando os genes a serem expressa-dos estão presentes juntos em um construto de gene.

Neste contexto, os fatores ou seqüências reguladoras podem,como descrito acima, preferivelmente ter um efeito positivo na expressão degene dos genes introduzidos, desse modo intensificando. Desse modo, umrealce dos elementos reguladores, vantajosamente no nível transcricional,pode ocorrer usando-se sinais de transcrição fortes como intensificadorese/ou promotores. Além disso, porém, a translação intensificada também épossível, por exemplo, melhorando-se a estabilidade do mRNA.

As seqüências reguladoras incluem, em particular, seqüênciasde planta tal como as seqüências promotoras e terminadoras. Os construtospodem ser vantajosamente estavelmente propagados em microorganismos,em particular em E. coli e Agrobacterium tumefaciens, sob condições seleti-vas, e torna possível a transferência de DNA heterólogo em plantas ou mi-croorganismos.

As seqüências reguladoras úteis estão presentes, por exemplo,em promotores tal como o promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, Ipp-lac,laclq, 17, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR ou λ-PL e são empregadas vantajo-samente em bactérias Gram-negativas. Outras, seqüências reguladoras van-tajosas estão, por exemplo, presentes nos promotores Gram-positivos amy eSP02, nos promotores de levedura ou fúngicos ADC1, MFa, CA, P-60,CYC1, GAPDH, TEF1 rp28, ADH ou nos promotores de planta CaMV/35S[Franck e outros, Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward e outros, Plant. Mol.Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, iib4, usp, STLS1, B33, nos ou no promotor deubiquitina ou faseolina. Vantajoso neste contexto também são os promotoresinduzíveis, tal como os promotores descritos nos EP-A-O 388 186 (induzívelpor benzenossulfonamida), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz e outros, induzí-vel por tetraciclina), EP-A-O 335 528 (induzível por ácido abscíssico) ou pro-motores de WO 93/21334 (induzível por etanol ou cicloexenol). Outros pro-motores de planta adequados são o promotor de FBPase citosólico ou opromotor ST-LSI de batata (Stockhaus e outros, EMBO J. 8, 1989, 2445), opromotor de glicina max fosforibosilpirofosfato amidotransferase (N°. de A-cesso de Genbank U87999) ou o promotor nodo-específico descrito na Pa-tente EP-A-O 249 676.

Os promotores especialmente vantajosos são promotores quetornam possível a expressão em tecidos que estão envolvidos na biossínte-se de ácidos graxos. Muito especialmente vantajosos são os promotoresespecíficos de semente, tal como o promotor de USP como descrito, porémtambém outros promotores tal como LeB4, DC3, promotor de faseolina ounapin. Outros promotores especialmente vantajosos são promotores especí-ficos de semente que podem ser usados para plantas monocotiledôneas oudicotiledôneas e que são descritos nos US 5.608.152 (promotor de napin deóleo de semente de colza), WO 98/45461 (promotor de Arabidopsis oleosin),US 5.504.200 (promotor de Phaseolus vulgaris phaseolin), WO 91/13980(promotor de Brassica Bce4), por Baeumlein e outros, Plant J., 2, 2,1992:233-239 (promotor LeB4 de um legume), estes promotores que sãoadequados para dicotilédonas. Os exemplos de promotores que são ade-quados para monocotilédonas são o lpt-2 de cevada ou promotor de IpM(WO 95/15389 e WO 95/23230), o promotor de proteína da cevada e outrospromotores adequados descritos nos WO 99/16890.Em princípio, é possível usar todos os promotores naturais juntocom as suas seqüências reguladoras, tal como aquelas mencionadas acima.Também é possível e vantajoso usar os promotores sintéticos, ou em adiçãoou sozinho, em particular quando eles medeiam expressão específica desemente, tal como aquelas descritas no WO 99/16890.

Para alcançar um conteúdo de ARA particularmente elevado,especialmente em plantas transgênicas os genes deveriam ser expressadosvantajosamente em colheitas de óleo de uma maneira específica de semen-te. Para este fim, podem ser usados os promotores específicos de semente,ou aqueles promotores que são ativos no embrião e/ou no endosperma. Emprincípio, os promotores específicos semente podem ser isolados tanto deplantas dicotiledôneas quanto monocotiledôneas. Os promotores preferidossão listados a seguir: USP (= proteína de semente desconhecida) e vicilina(Vicia faba) [Baumlein e outros, Mol. Gen Genet, 1991, 225(3)], napin (óleode semente de colza) [US 5.608.152], proteína portadora de acila (óleo desemente de colza) [US 5.315.001 e WO 92/18634], oleosina (Arabidopsisthaiiana) [WO 98/45461 e WO 93/20216], faseolina (Phaseolus vulgaris) [US5.504.200], Bce4 [WO 91/13980], Ieguminas B4 (promotor de LegB4) [Bau-mlein e outros, Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 e Iptl (cevada) [WO 95/15389 eW095/23230], promotores específicos de semente de arroz, milho e trigo[WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 e aleuraína [US 5.677.474], Bce4 (óleo desemente de colza) [US 5.530.149], glicinina (soja) [EP 571 741], fosfoenolpiruvato carboxilase (soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (soja) [WO 98/08962],isocitrato Iiase (óleo de semente de colza) [US 5.689.040] ou α-amilase (ce-vada) [EP 781 849],

A expressão de gene planta também pode ser facilitada por umpromotor quimicamente induzível (veja , revisão em Gatz 1997, Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Os promotores quimicamente in-duzíveis são particularmente adequados quando é desejado que expressãode gene ocorra de uma maneira específica de tempo. Os exemplos de taispromotores são um promotor induzível por ácido salicílico (WO 95/19443),um promotor induzível por tetraciclina (Gatz e outros (1992) Plant J. 2, 397-404) e um promotor induzível por etanol.

Para assegurar a integração estável dos genes de biossíntesena planta transgênica em uma pluralidade de gerações, é normalmente ne-cessário para cada dos ácidos nucléico que codifique uma proteína de inte-resse a ser expressada sob o controle de um promotor separado, preferivel-mente um promotor que difere dos outros promotores, uma vez que os moti-vos de seqüência de repetição podem levar a instabilidade do T-DNA, ouaos eventos de recombinação. Esta é uma razão por que o ácido nucléico dapresente invenção é particularmente vantajoso uma vez que seqüências quecodificam A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δδ-dessaturase podem ser trans-critas como uma única unidade que precisa de somente um promotor. Cer-tamente, será necessário para outros genes codificar, por exemplo, Δ5-elongase, oo3-dessaturase e/ou de A4-dessaturase para estar sob o controlede promotores separados.

Neste contexto, o cassete de expressão é construído vantajo-samente de um tal modo que um promotor seja seguido por um sítio de cli-vagem, vantajosamente em um poliligante, para inserção do ácido nucléico aser expressado e, se apropriado, uma seqüência terminadora é posicionadaatrás do poliligante. Esta seqüência é várias vezes repetida, preferivelmentetrês, quatro ou cinco vezes, de forma que até cinco genes possam ser com-binados em um construto e introduzidos na planta transgênica a ser expres-sada. Vantajosamente, a seqüência é repetida até três vezes. Para expres-sar as seqüências de ácido nucléico, a última é inserida atrás do promotorpor um sítio de clivagem adequado, por exemplo, no poliligante. Vantajosa-mente, cada seqüência de ácido nucléico tem seu próprio promotor e, seapropriado, sua própria seqüência terminadora. Tais construtos vantajosossão descritos, por exemplo, em DE 101 02 337 ou DE 101 02 338. Porém,também é possível inserir uma pluralidade de seqüências de ácido nucléicoatrás de um promotor e, se apropriado, antes de uma seqüência terminado-ra. Aqui, o sítio de inserção, ou a seqüência, dos ácidos nucléicos inseridosno cassete de expressão não é de importância crítica, quer dizer que umaseqüência de ácido nucléico pode ser inserida na primeira ou última posiçãono cassete sem sua expressão sendo influenciada substancialmente dessemodo. Vantajosamente, os promotores diferentes tal como, por exemplo, opromotor USP1 LegB4 ou DC3, e seqüências terminadoras diferentes podemser usadas no cassete de expressão. Porém, também é possível usar so-mente um tipo de promotor no cassete. Porém, isto pode levar aos eventosde recombinação indesejados.

Como descrito acima, a transcrição dos genes que foram intro-duzidos, deveria ser vantajosamente terminada por seqüências terminadorasadequadas na extremidade 3' dos genes de biossíntese que foram introduzi-dos (atrás do codon de interrupção). Um exemplo de uma seqüência quepode ser usada neste contexto é a seqüência terminadora OCS 1. Como é ocaso com os promotores, seqüências terminadoras diferentes deveriam serusadas para cada gene.

O construto de gene da presente invenção também pode com-preender genes de biossíntese do ácido graxo ou metabolismo de lipídio se-lecionados do grupo de deidrogenase(s) de acil-CoA, acil-ACP [= proteínaportadora de aciia] dessaturase(s), tioesterase(s), acil-ACP aciltransferase(s)de ácido graxo, acil-CoA:lisofosfolipídeo aciltransferase(s), ácido graxo sin-tases, ácido graxo hidroxilases, acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido graxo dessaturase(s), ácido graxo acetilena-ses, lipoxigenases, triacilglycerol lipases, alenóxido sintases, hidroperóxidoIiases ou ácido graxo elongase(s) e dessaturase(s) tal como A4-dessaturase,A5-dessaturase, Δ6 - dessaturase, A8-dessaturase, A9-dessaturase, Δ12-dessaturase ou Δβ-elongase.

Estes genes ou ácidos nucléicos adicionais podem ser clonadosnos cassetes de expressão, que são então usados para transformar plantascom a ajuda de vetores como Agrobacterium.

Aqui, os fatores ou seqüências reguladoras podem, como descri-to acima, preferivelmente ter um efeito positivo, e desse modo realçar, nosgenes de expressão que foram introduzidos. Desse modo, o realce dos ele-mentos reguladores pode vantajosamente ocorrer no nível transcricional u-sando sinais de transcrição fortes sinaliza como intensificadores e/ou promo-tores. Porém, uma translação intensificada também é possível, por exemplo,melhorando a estabilidade do mRNA. Em princípio, os cassetes de expres-são podem ser usados diretamente para introdução nas plantas ou entãopodem ser introduzidos em um vetor.

Então, em ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um ve-tor que compreende um ácido nucléico ou um construto de gene em quais-quer dos aspectos da invenção descritos acima.

Em uma modalidade, o vetor pode ser um vetor de clonagem.

As seqüências de ácido nucléico da invenção podem ser intro-duzidas sozinhas, ou preferivelmente, em combinação com um cassete deexpressão (construto de ácido nucléico) em um organismo. Para introduziros ácidos nucléicos, os ácidos nucléicos são vantajosamente ampliados eligados de maneira conhecida. Preferivelmente, um procedimento que segueo protocolo para Pfu DNA polimerase ou uma mistura de Pfu/Taq DNA poli-merase é seguida. Os iniciadores são selecionados levando em considera-ção a seqüência a ser ampliada. Os iniciadores deveriam ser escolhidosvantajosamente de tai um modo que o amplificado compreenda a seqüênciacodogênica total desde o códon de partida ao códon de interrupção. Após aamplificação, o amplificado é convenientemente analisado. Por exemplo,uma separação de gelelectroforético pode ser realizada, a qual é seguidapor uma análise quantitativa e qualitativa. Após isso, o amplificado pode serpurificado seguindo um protocolo padrão (por exemplo, Qiagen). Uma alí-quota do amplificado purificado é então disponível para a etapa de clonagemsubseqüente.

Os vetores de clonagem adequados são geralmente conhecidospelo trabalhador versado. Estes incluem, em particular, os vetores que sãocapazes de replicação em sistemas microbianos, quer dizer principalmentevetores que garantem a clonagem eficiente em leveduras ou fungos e quetornam possível a transformação estável de plantas. Aqueles que devem sermencionados em particular são vários sistemas de vetor binário e co-integrado que são adequados para a transformação mediada por T-DNA.Tais sistemas de vetor são, como uma regra, caracterizados pelo fato de queeles compreendem os genes vir requeridos para a transformação mediadapor Agrobacterium e as seqüências de delimitação de T-DNA (borda de T-DNA). Estes sistemas de vetor vantajosamente também compreendem ou-tras regiões cis-reguladoras tal como os promotores e seqüências termina-doras e/ou marcadores de seleção, por meio dos quais os organismos ade-quadamente transformados podem ser identificados. Ao mesmo tempo emque no caso de sistemas de vetor co-integrado, os genes vir e seqüênciasde T-DNA estão dispostos no mesmo vetor, os sistemas binários são combase em pelo menos dois vetores, um dos quais transporta os genes vir, po-rém nenhum T-DNA, ao mesmo tempo em que um segundo transporta o T-DNA, porém nenhum gene vir. Devido a este fato, os últimos vetores men-cionados são relativamente pequenos, fáceis de manipular e replicar tantoem E. coli quanto em Agrobacterium. Estes vetores binários incluem vetoresdas séries pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. De acordo com a invenção,Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV e pCAMBIA são usados por preferência.

Uma avaliação dos vetores binários e de seu uso é encontrada em Hellens eoutros, Trends in Plant Science (2000) 5, 446 - 451. Para preparar os veto-res, os vetores podem ser primeiro Iinearizados com endonuclease(s) derestrição e então modificados enzimaticamente de uma maneira adequada.

Depois disso, o vetor é purificado, e uma alíquota é empregada para a etapade clonagem. Na etapa de clonagem, o amplificado enzimaticamente clivadoe, se apropriado, purificado é clonado com fragmentos de vetor foram prepa-rados de uma maneira semelhante, usando ligase. Neste contexto, um cons-truto de ácido nucléico particular, ou construto de vetor ou plasmídeo, podeter um ou então mais de um segmento de gene codogênico. Os segmentosde gene codogênico nestas construtos são preferivelmente ligados opera-velmente com seqüências reguladoras. As seqüências reguladoras incluem,em particular, seqüências de planta como os promotores e seqüências ter-minadoras descritas acima. O construto pode ser vantajosamente estavel-mente propagado em microorganismos, em particular em E. coli e Agrobac-terium tumefaciens, sob condições seletivas e torna possível a transferênciade DNA heterólogo em plantas ou microorganismos.Os ácidos nucléicos da invenção podem ser introduzidos em or-ganismos, tais como microorganismos ou vantajosamente plantas, vantajo-samente usando vetores de clonagem, e desse modo ser usado na trans-formação de plantas tal como aquelas que são publicadas e citadas em:Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Flori-da), Capítulo 6/7, p. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer inHigher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.:Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes e outros, Techniquesfor Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilizati-on, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225. Desse modo, osácidos nucléicos, os ácidos nucléicos inventivos e construtos de ácido nu-cléico e/ou vetores usados no processo podem ser de usados para a modifi-cação de recombinante de um espectro amplo de organismos, vantajosa- mente plantas, de forma que o último se torne o produtor melhor e/ou maiseficiente de ARA.

Uma série de mecanismos existe peio quai a modificação dasproteínas de A9-elongase, Δδ-dessaturase e A5-dessaturase é possível, deforma que o rendimento, produção e/ou eficiência de produção de ARA emuma planta, preferivelmente em uma planta de colheita de óleo ou um mi-croorganismo, possa ser influenciado diretamente devido a estas proteínasmodificadas. O número ou atividade das proteínas ou genes pode ser au-mentado, de forma que maiores quantidades dos produtos de gene e, nofinal das contas, maiores quantidades dos compostos da fórmula geral I, se-jam produzidas. Uma síntese de novo em um organismo que precisou daatividade e capacidade de biossintetizar os compostos antes de introduçãodo gene(s) correspondente também é possível. Isto se aplica analogamenteà combinação com outras dessaturases ou elongases ou outras enzimas dometabolismo de lipídio e ácido graxo. O uso de várias seqüências divergen-tes, isto é, seqüências que diferem no nível de seqüência de DNA1 tambémpode ser vantajoso neste contexto, ou então o uso de promotores para ex-pressão de gene que torna possível uma expressão de gene diferente com opassar do tempo, por exemplo, como uma função do grau de maturidade deuma semente ou um tecido de armazenamento de óleo.

Devido à introdução de um gene que codifica A9-elongase, Δ8-dessaturase e/ou A5-dessaturase em um organismo, sozinho ou em combi-nação com outros genes em uma célula, não é somente possível aumentar ofluxo de biossíntese para o produto final, porém também aumentar, ou criar acomposição de triacilglicerol correspondente de novo. Igualmente, o númeroou atividade de outros genes que estão envolvidos na importação de nutrien-tes que são requeridos para a biossíntese de um ou mais ácidos graxos, ó-leos, lipídios neutros e/ou polares pode ser aumentado, de forma que a con-centração destes precursores, co-fatores ou intermediários dentro das célu-las ou dentro do compartimento de armazenamento seja aumentada, dessemodo, a capacidade das células de produzir ARA como descrito abaixo éintensificada também. Otimizando-se a atividade ou aumentando-se o núme-ro de um ou mais genes que codifica A9-elongase, A8-dessaturase e/ou Δ5-dessaturase que estão envolvidos na ARA de biossíntese, ou destruindo-sea atividade de um ou mais genes que estão envolvidos na degradação deARA, um rendimento, produção e/ou eficiência aumentados de produção deácido graxo e moléculas de lipídio em organismos, vantajosamente em plan-tas, é tornado possível.

Os ácidos nucléicos, que vantajosamente podem ser usados noprocesso são derivados de bactérias, fungos, diatomáceass, animais tal co-mo, Caenorhabditis ou Oncorhynchus ou plantas tal como algas ou musgos,tal como os gêneros Shewanelia, Physcomitrellal Thraustochytrium, Fusari-um, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, lsochrysis, Aleuri-ta, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, es-pecificamente dos gêneros e espécies Oncorhynchus mykiss, Xenopus Iae-vis, Ciona intestinaiis, Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Os-treococcus sp., Ostreococcus Tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens,Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Cera-todon purpureus, lsochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp.,Muscarioides Viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylumtricornutum, Caenorhabditis elegans ou especialmente vantajosamente deOncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonona ou Cryp-thecodinium cohnii.

Em uma modalidade alternativa, o vetor pode ser um vetor deexpressão projetado para transformar um organismo no qual o ácido nucléi-co deve ser expressado e o ácido linoléico convertido em ARA.

Estes vetores vantajosos, preferivelmente vetores de expressão,compreendem o(s) ácido(s) nucléico(s) que codifica(m) o Δθ-elongase, Δ8-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase e que são descritos nos primeiro a quartoaspectos da invenção.

Como usado no presente contexto, o termo "vetor" refere-se auma molécula de ácido nucléico que é capaz de transportar outro ácido nu-cléico ao qual está ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", uma alça deDNA de filamento duplo circular na qual os segmentos de DNA adicionaispodem ser ligados. Um tipo adicional de vetor é um vetor viral, sendo possí-vel para os segmentos de DNA adicionais serem ligados no genoma viral.Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospe-deira na qual eles foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos comorigem de replicação bacteriana). Outros vetores são vantajosamente inte-grados no genoma de uma célula hospedeira quando eles são introduzidosna célula hospedeira, e desse modo replicam junto com o genoma hospedei-ro. Além disso, certos vetores podem administrar a expressão de genes coma qual eles estão em ligação operável. Estes vetores são referidos no pre-sente contexto como "vetores de expressão". Normalmente, os vetores deexpressão são adequados para técnicas de recombinação de DNA que to-mam a forma de plasmídeos.

Na presente descrição onde o termo "plasmídeo" é usado, deve-ria ser entendido que os plasmídeos podem ser substituídos por outros tiposde vetor de expressão, tal como vetores virais, que exercem funções seme-lhantes. Além disso, o termo "vetor" também é pretendido compreender ou-tros vetores com os quais o trabalhador versado está familiarizado, tal comofagos, vírus tais como SV40, CMV, TMV1 transposons, elementos IS, fasmí-deos, fagomídeos, cosmídeos, DNA linear ou circular.

Os vetores de expressão recombinantes vantajosamente usadosno processo compreendem os ácidos nucléicos descritos abaixo ou o cons-truto de gene descrito acima em uma forma que é adequada para expressaros ácidos nucléicos usados em uma célula hospedeira, o que significa queos vetores de expressão recombinantes compreendem uma ou mais se-qüências reguladoras, selecionadas em base das células hospedeiras usa-das para a expressão, cuja seqüência(s) reguladora é ligada operavelmentecom a seqüência de ácido nucléico a ser expressada. Em um vetor de ex-pressão recombinante, "operavelmente ligado" significa que a seqüência denucleotídeo de interesse é ligada a seqüência(s) reguladora(s) de um talmodo que a expressão da seqüência de nucleotídeo seja possível, e elassão ligadas uma à outra de um tal modo que ambas as seqüências realizama função predita que é designada para seqüência (por exemplo, em um sis-tema de transcrição/translação in vitro, ou em uma célula hospedeira se ovetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "seqüência reguladora" épretendido compreender os promotores, intensificadores e outros elementosde controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Por exem-plo, estas seqüências reguladoras são descritas em Goeddel: Gene Expres-sion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,CA (1990), ou veja: Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Bio-Iogy and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton1 Florida, Ed.: Glick andThompson, Capítulo 7, 89-108, incluindo as referências citadas aqui. As se-qüências reguladoras compreendem aquelas que administram a expressãoconstitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de célulahospedeira e aquelas que administram a expressão direta da seqüência denucleotídeo somente em células hospedeiras específicas sob condições es-pecíficas. O trabalhador versado sabe que o desígnio do vetor de expressãopode depender de fatores tal como a escolha da célula hospedeira ser trans-formada, o nível de expressão desejado da proteína e similares.

Os vetores de expressão recombinantes usados podem ser pro-jetados para a expressão de Δ9 - elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δ5-dessaturase em células procarióticas ou eucarióticas. Isto é vantajoso umavez que as etapas intermediárias da construto de vetor freqüentemente sãorealizadas em microorganismos devido à simplicidade. Por exemplo, o genede A9-elongase, Δδ-dessaturase e/ou A5-dessaturase pode ser expressadoem células bacterianas, células de inseto (usando vetores de expressão deBaculovírus), levedura e outras células fúngicas (veja Romanos, M., A., eoutros (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488;van den Hondel, CAM. J. J., e outros (1991) "Heterologous gene expressionin filamentous fungi", em: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet &L. L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego; e van den Hon-del, C. A.M. J. J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector de-velopment for filamentous fungi, em: Applied Molecular Genetics of Fungi,Peberdy, J. F., e outros, Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cam-bridge), algae (Falciatore e outros, 1999, Marine Biotechnology.1 , 3:239-251), os ciliatos dos tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Te-trahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus,Dessaturaseudocohniiembus, Euplotes, Engelmaniella e Stylonychia, emparticular do gênero Stylonychia lemnae, usando vetores em um método detransformação como descrito no WO 98/01572 e, preferivelmente, em célu-las de plantas de multicelulares (veja Schmidt, R. e Willmitzer, L. (1988) "Hi-gh efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabi-dopsis thaliana Ieaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586; PlantMolecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Capítulo6/7, pp.71-1 19 (1993); F.F. White, B. Jenes e outros, Techniques for GeneTransfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.:Kung e R. Wu1 Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (e referências citadas aqui)).As células hospedeiras adequadas são também descritas em Goeddel, Ge-ne Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego, CA (1990). Como uma alternativa, o vetor de expressão recom-binante pode ser transcrito transladado in vitro, por exemplo, usando as se-qüências reguladoras T7-promotoras e T7-polimerase.Na maioria dos casos, a expressão de proteínas em procariotasenvolve o uso de vetores que compreendem promotores constitutivos ouinduzíveis que administram a expressão de proteínas de fusão ou não fusão.Os vetores de expressão de fusão típicos são, inter alia, pGEX (PharmaciaBiotech Inc; Smith, D.B., e Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway,NJ), onde glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação de maltose-Ee proteína A, respectivamente, são fundidas com a proteína alvo recombi-nante.

Os exemplos de vetores de expressão de E. coli de não fusãoinduzíveis adequados são, inter alia, pTrc (Amann e outros (1988) gene69:301-315) e pET 11 d (Studier e outros, Gene Expression Technology: Me-thods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89). A expressão de gene alvo do vetor pTrc é com baseado na transcriçãode um promotor de fusão trp-lac híbrido pelo RNA polimerase hospedeiro. Aexpressão de gene alvo do vetor pET 11 d é com base na transcrição de umpromotor de fusão T7-gn10-Iac que é mediado por um RNA polimerase viral(T7gn1) que é co-expressAdo. Esta polimerase viral é fornecida pelas cepashospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um λ-profago residente quealoja um gene T7 gn1 sob controle transcricional do promotor IacUV 5.

Outros vetores que são adequados para organismos procarióti-cos são conhecidos pelo trabalhador versado, estes vetores estão, por e-xemplo, em pLG338 de E. coli, pACYC184, as séries pBR, tal como pBR322,as séries pUC tal como pUC18 ou pUC19, as séries M113mp, pKC30,pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-111113-B1,Agt 11 ou pBdCI, em Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 ou plJ361, em Ba-cilo pUB1 10, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667.

Em uma outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor deexpressão de levedura. Os exemplos para vetores para expressão na Ieve-dura S.cerevisiae compreendem pYeDessaturased (Baldari e outros (1987)Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30:933-943),pJRY88 (Schultz e outros (1987) Gene 54:113-123) e pYES2 (InvitrogenCorporation, San Diego, CA). Os vetores e processos para a construto devetores que são adequados para uso em outros fungos, tal como os fungosfilamentosos, compreendem aqueles que são descritos nos detalhes em: vanden Hondel, C.A.M.J.J., & Punt1 P.J. (1991) "Gene transfer systems and vec-tor development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fun-gi, J. F. Peberdy e outros, Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cam-bridge, ou em: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasu-re, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego]. Outros vetores de levedu-ra adequados são, por exemplo, pAG-1, YEp6, YEpI 3 ou pEMBLYe23.

Como uma alternativa, A9-elongase, A8-dessaturase e/ou Δ5-dessaturase podem ser expressados em células de inseto que usam vetoresde Baculovirus. Os vetores de expressão de Baculovirus que estão disponí-veis para a expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por e-xemplo, células de Sf9) compreendem as séries pAc (Smith e outros (1983)Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e as séries pVL (Lucklow e Summers (1989)Virology 170:31-39).

Os vetores de acima mencionados são somente uma pequenaavaliação sobre os vetores adequados que são possíveis. Outros plasmí-deos são conhecidos por trabalhadores versados e são descritos, por exem-pio, em: Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P. H., e outros, Elsevier, Amsterdam-Nova Iorque-Oxford1 1985, ISBN O 444 904018). Para outros sistemas deexpressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, veja os Ca-pítulos 16 e 17 em Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2- edição, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Em uma modalidade adicional do processo, as A9-elongase, Δ8-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase podem ser expressadas em células deplanta unicelulares (tal como, algas), veja Falciatore e outros, 1999, MarineBiotechnology 1 (3):239-251 e referências citadas aqui, e em células deplanta de plantas mais altas (por exemplo, espermatófitos, tal como colheitascultiváveis). Os exemplos de vetores de expressão de planta compreendemaqueles que são descritos nos detalhes: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., eMasterson, R., (1992) "New plant binary vectors with selectable markers Io-cated proximal to the Ieft border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; e Bevan,M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl.Acids Res. 12:8711-8721 ; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em:Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization1 Ed.: Kung e R. Wu,Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Um cassete de expressão de planta preferivelmente compreen-de seqüências reguladoras que são capazes de administrar a expressão degenes em células de planta e são ligadas operavelmente de forma que cadaseqüência possa cumprir sua função, tal como terminação transcricional, porexemplo, sinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferidossão aqueles que são derivados de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, talcomo gene 3 do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen e outros, EMBO J. 3 (1984)835 et. seq), que é conhecido como octopina sintase, ou equivalentes fun-cionais destes, porém todas as outras seqüências terminadoras que sãofuncionalmente ativas em plantas também são adequadas.

Uma vez que a expressão de gene de planta é muito freqüente-mente não limitada ao nível transcricional, um cassete de expressão de plan-ta preferivelmente compreende outras seqüências que são operavelmenteligadas, tal como intensificadores de translação, por exemplo, a seqüência"overdrive", que realça a seqüência líder 5'-não transladada de vírus em mo-saico do tabaco, que aumenta a relação de proteína/RNA (Gallie e outros,1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

Como descrito acima, a expressão de gene de planta deve estarligada operavelmente com um promotor adequado que ativa a expressão degene com a temporização correta ou de uma maneira específica de célula outecido. Os promotores utilizáveis são os promotores constitutivos (Benfey eoutros, EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tal como aqueles esses que são deri-vados de vírus de planta, tal como 35S CaMV (Franck e outros, Cell 21(1980) 285-294), 19S CaMV (também veja EUA 5352605 e WO 84/02913),ou promotores de planta, tal como o promotor do subunidade de Rubisco,que é descrito na Patente US 4.962.028.Outras seqüências preferidas para uso em ligação operável emcassetes de expressão de gene de planta são seqüências de alvejamento,que são requeridas para guiar o produto de gene em seu compartimento decélula correspondente (veja uma revisão em Kermode, Crit. Rev. Plant Sei.15, 4 (1996) 285-423 e referências citadas aqui), por exemplo, no vacúolo,no núcleo, todos os tipos de plastídeos, tais como amiloplastos, cloroplastos,cromoplastos, o espaço extracelular, as mitocôndrias, o reticulo de endo-plasmídeo, elaioplastos, peroxisomas e outros compartimentos de células deplanta.

Como descrito acima, a expressão de gene de planta tambémpode ser obtida por um promotor quimicamente induzível (veja revisão emGatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Os promo-tores quimicamente induzíveis são particularmente adequados quando é de-sejado que a expressão de gene ocorra de uma maneira específica de tem-po. Os exemplos de tais promotores são um promotor induzível por ácidosalicílico (WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz e ou-tros (1992) Plant J. 2, 397-404) e um promotor induzível por etanol.

Os promotores que respondem às condições de tensão bióticasou abióticas também são adequados, por exemplo, o promotor de genePRP1 induzido por patógeno (Ward e outros, Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), o promotor de tomate hsp80 de tomate induzível por calor (US5.187.267), o promotor de alfa-amilase de batata induzível por (WO96/12814) ou o promotor pinll induzível por ferida (EP-A-0 375 091).

Especialmente preferidos são aqueles promotores que provocama expressão de gene em tecidos e órgãos nos quais a biossíntese de ácidosgraxos, lipídios e óleos, ocorre, em células de semente, tal como células doendosperma e do embrião em desenvolvimento. Os promotores adequadossão o promotor de napin de óleo de semente de colza (US 5.608.152), opromotor de Vicia faba USP (Baeumlein e outros, Mol Gen Genet, 1991, 225(3):459-67), o promotor de oleosina Arabidopsis (WO 98/45461), o promotorde faseolina Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor de Bce4 Brassi-ca (WO 91/13980) ou o promotor de Iegumina B4 (LeB4; Baeumlein e ou-tros, 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9), e promotores que provocam a ex-pressão específica semente em plantas monocotiledôneas, tal como milho,cevada, trigo, centeio, arroz e similares. Promotores notáveis adequados sãoo promotor de gene de cevada Ipt2 ou Iptl (WO 95/15389 e WO 95/23230)ou os promotores do gene de proteína de cevada, o gene de glutelina dearroz, o gene de orizina de arroz, o gene de prolamina de arroz, o gene degliadina de trigo, o gene de glutelina de trigo, o gene de zeína de milho, ogene de glutelina de aveia, o gene de casirina de Sorghum ou o gene desecalina de centeio que são descritos no WO 99/16890.

Como descrito acima, pode ser vantajoso incluir em um cassetede expressão, enzimas de codificação de ácidos nucléicos capazes de con-verter ARA em ácidos graxos A3-não saturados tal como EPA ou DHA. Des-se modo, por exemplo, o cassete de expressão pode também incluir o ácidonucléico que codifica uma Δδ-elongase, u)3-dessaturase e/ou Δ4-dessaturase. Tais cassetes de expressão podem ser introduzidos pela trans-formação simultânea de uma pluralidade de construtos de expressão indivi-duais ou, preferivelmente, combinando-se uma pluralidade de cassetes deexpressão em um construto. Além disso, uma pluralidade de vetores podeser transformada com, em cada caso, uma pluralidade de cassetes de ex-pressão e então transferida na célula hospedeira.

Outros promotores que são igualmente especialmente adequa-dos são aqueles que realizam uma expressão específica de plastídeo, umavez que os plastídeos constituem o còmpartimento no qual os precursores ealguns produtos finais são sintetizados de biossíntese de lipídio. Os promo-tores adequados, tal como o promotor de RNA polimerase viral, são descri-tos nos WO 95/16783 e WO 97/06250, e o promotor clpP de Arabidopsis,descrito no WO 99/46394.

O DNA de vetor pode ser introduzido em células procarióticas eeucarióticas por técnicas de transformação ou transfecção convencionais.Os termos "transformação" e "transfecção", conjugação e transdução, comousado no presente contexto, são pretendidos compreender uma multiplicida-de de métodos conhecidos na técnica anterior pela introdução de ácido nu-cléico estrangeiro (por exemplo, o DNA) em uma célula hospedeira, incluin-do a co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecçãomediada por DEAE-dextrana, lipofecção, competência natural, transferênciaquimicamente mediada, eletroporação ou bombardeio de partícula. Os mé-todos adequados para a transformação ou transfecção de células hospedei-ras, incluindo células de planta, podem ser encontrados em Sambrook e ou-tros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2- ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989) e outros livros de laboratório tal como Methods in Molecular Biology,1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland and Davey, HumanaPress, Totowa, Nova Jérsei.

Em um outro aspecto da invenção é fornecido um organismonão humano transgênico que compreende pelo menos um ácido nucléico,construto de gene ou vetor de acordo com um aspecto anterior da invenção.

O organismo não humano transgênico pode ser um microorga-nismo, um animal não humano ou uma planta.

As células hospedeiras que são, em princípio, adequadas paraabsorver o ácido nucléico de acordo com a invenção, o produto de gene deacordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção são todos osorganismos procarióticos ou eucarióticos. Os organismos hospedeiros quesão vantajosamente usados são os microorganismos tais como fungos ouleveduras, ou células de planta, preferivelmente plantas ou partes desta. Osfungos, leveduras ou plantas são preferivelmente usados, especialmenteplantas, por exemplo, plantas tal como colheitas de óleo, que têm alto teorem compostos de lipídio tal como óleo de semente de colza, prímula de noi-te, linho, cardo, amendoim, óleo de colza, linhaça, soja, açafroa, girassol,borragem, ou plantas tal como milho, trigo, centeio, aveias, triticale, arroz,cevada, algodão, mandioca, pimenta, Tagetes, plantas Solanacea tal comobatata, tabaco, berinjela e tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfafa, plantasfechadas (café, cacau, chá), espécies de Salix, árvores (óleo de palma, co-co), e gramas perenes e colheitas de forragem. As plantas especialmentepreferidas de acordo com a invenção são colheitas de óleo tal como soja,amendoim, óleo de semente de colza, óleo de colza, linhaça, linho, prímulade noite, girassol, açafroa, árvores (óleo de palma, coco).

Em uma modalidade vantajosa, o termo "ácido nucléico (molécu-la)" como usado no presente contexto adicionalmente compreende a se-qüência não transladada nas extremidades 3' e 5' da região de gene de codi-ficação: pelo menos 500, preferivelmente 200, especialmente preferivelmen-te 100 nucleotídeos da seqüência a jusante da extremidade 5' da região decodificação e pelo menos 100, preferivelmente 50, especialmente preferi-velmente 20 nucleotídeos da seqüência a jusante da extremidade 3' da regi-ão de gene de codificação. Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é se-parada de outras moléculas de ácido nucléico que estão presentes na fontenatural do ácido nucléico. Um ácido nucléico "isolado" preferivelmente nãotem nenhuma seqüência que naturalmente flanqueie o ácido nucléico noDNA genômico do organismo do qual o ácido nucléico é derivado (por e-xemplo, seqüências que ficam situadas nas extremidades 5' e 3" do ácidonucléico). Em várias modalidades, a molécula de A9-elongase, Δ8-dessaturase ou Δδ-dessaturase isolada pode compreender, por exemplo,menos do que aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kbde seqüências de nucleotídeo que naturalmente flanqueiam a molécula deácido nucléico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucléico é deri-vado. O mesmo se aplica a outras seqüências de ácido nucléico que podemser incluídas em um cassete de expressão, por exemplo seqüências quecodificam uma Δδ-elongase, u>3-dessaturase e/ou A4-dessaturase

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção, por e-xemplo, uma molécula de ácido nucléico com uma seqüência de nucleotídeode SEQ ID NO: 1 ou resíduos 7668 a 12077 desta, ou as partes da SEQ IDNO: 1 especificada pelos segundo a quarto aspectos da invenção, podemser isoladas usando técnicas padrão molecular-biológicas e as informaçõesde seqüência fornecidas nelas. Além disso, por exemplo, uma seqüênciahomóloga ou regiões de seqüência homóloga, conservadas podem ser iden-tificadas no nível de aminoácido ou DNA com a ajuda de algoritmos compa-rativos. Eles podem ser usados como sonda de hibridização e técnicas dehibridização padrão (tal como, por exemplo, aquelas descritas em Sambrooke outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2â ed., Cold Spring Har-bor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989) para isolar seqüências de ácido nucléico adicionais que podemser usadas no processo.

Além disso, uma molécula de ácido nucléico de Perkinsus mari-nus que compreende uma seqüência completa de SEQ ID NO: 1 ou umaparte desta pode ser isolada através de reação em cadeia de polimerase,onde os iniciadores de oligonucleotídeo são usados sobre a base desta se-qüência ou partes desta (por exemplo, uma molécula de ácido nucléico quecompreende a seqüência completa ou parte desta pode ser isolada atravésde reação em cadeia de polimerase que usa iniciadores de oligonucleotídeoque foram gerados com base nesta mesma seqüência). Por exemplo, mRNApode ser isolado de células (por exemplo, por meio do método de extraçãode tiocianato de guanidíneo de Chirgwin e outros (1979) Biochemistry18:5294-5299) e cDNA por meio de transcriptase reversa (por exemplo,transcriptase reversa Moloney MLV, disponibilizado por Gibco/BRL, Bethes-da, MD, ou transcriptase reversa AMV, disponibilizado por Seikagaku Ameri-ca, Inc., St.Petersburg, FL).

Os iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para a amplificaçãopor meio de reação em cadeia de polimerase podem ser gerados com baseem uma das seqüências mostradas na SEQ ID NO: 1 ou com a ajuda dasseqüências de aminoácido detalhadas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 eSEQ ID NO: 4. São mostrados iniciadores particularmente adequados nosExemplos como SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

Um ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser amplifi-cado por técnicas padrão de amplificação de PCR que usam cDNA ou, alter-nativamente, DNA genômico como modelo (SEQ ID NO 9) e iniciadores deoligonucleotídeo adequados (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6). O ácido nu-cléico amplificado desse modo pode ser clonado de em um vetor adequadoe pode ser caracterizado por meio de análise de seqüência de DNA. Os oli-gonucleotídeos que correspondem a uma seqüência de nucleotídeo de des-saturase ou elongase podem ser gerados através de métodos sintéticos pa-drão, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automático.

Os ácidos nucléicos e moléculas de proteína acima menciona-dos com atividade de A9-elongase, A8-dessaturase e/ou A5-dessaturase,podem ser usados em um processo para a produção de ARA de ácido Iino-léico em organismos transgênicos.

Então, em um outro aspecto da invenção, é fornecido um pro-cesso para a conversão de ácido linoléico ou um derivado deste em ácidoaraquidônico ou um derivado deste em um organismo, o processo compre-endendo introduz em um organismo que compreende ácido linoléico, pelomenos uma seqüência de ácido nucléico que compreende:

a) SEQ ID NO: 1 (seqüência completa 1047306867), seqüênciaque compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1ou um homólogo de um destes;

b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 ou umaseqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 deSEQ ID NO: 1;

c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e A5-dessaturase, emque o polipeptídeos é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS 2,3 e 4;

d) um derivado de uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 1 que codifica os polipeptídeos com pelo menos 40% de identidade nonível de aminoácido com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; emque os referidos polipeptídeos têm atividade de A9-elongase, Δ8-dessaturase e A5-dessaturase.

e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

No contexto da presente invenção, um "derivado" de ácido Iino-léico ou araquidônico é um composto no qual o OH da porção de ácido car-boxílico é substituído por uma porção de R11 em que:

R1 é coenzima A (tioéster), lisofosfatidilcolina, Iisofosfatidiletano-lamina, lisofosfatidilglicerol, liso - difosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, Iiso-

um

fosfatidilinositol, base de esfingo ou um radical da fórmula Il

<formula>formula see original document page 37</formula>

em qual

R2 = hidrogênio, colina de Iisofosfatidila1 lisofosfatidiletanolamina,lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglcerol, lisofosfatidilserina,lisofosfatidilinositol ou C2-C24-alquilcarbonila saturada ou nãosaturada,

R3 = hidrogênio, C2-C24-alquilcarbonila saturada ou não satura-da, ou R2 e R3 são independentemente um do outro um radical da fórmulala:

<formula>formula see original document page 37</formula>

em que

η = 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 9, m = 2, 3, 4, 5 ou 6 e ρ = O ou 3;

e em que um oxigênio no radical R1 pode ser substituído enxofretal que R1 seja ligado ao restante da molécula por uma ligação de tioéster.

Os processos de acordo com a invenção preferivelmente produ-zem ARA total em um conteúdo de pelo menos 1 % em peso, vantajosamen-te pelo menos 3% em peso, com base nos ácidos graxos totais nos orga-nismos transgênicos, preferivelmente em uma planta transgênica.

Uma vez que uma pluralidade de etapas de reação é realizadapelos compostos de partida, o ácido linoléico de (18:2a9, 12) no processo deacordo com a invenção, ARA (20:4Δ5' 8,11·14) não é obtido como um produtopuro; traços menores dos precursores sempre estão presentes no produtofinal.

ARA quimicamente puro também pode ser sintetizado pelo pro-cesso descrito acima. Para este fim, ARA ou um derivado deste é isoladodos organismos, tal como os microorganismos ou as plantas ou o meio decultura dentro ou sobre os quais os organismos foram crescidos, ou do or-ganismo e do meio de cultura, da maneira conhecida, por exemplo, por ex-tração, destilação, cristalização, cromatografia ou uma combinação destesmétodos. Estes derivados de ARA ou ARA quimicamente são vantajosospara aplicações no setor de indústria alimentícia, no setor de cosmético eespecialmente no setor de indústria farmacológica.

O processo pode incluir etapas adicionais de converter o ARAem um ácido graxo ω-3 introduzindo-se no organismo o ácido nucléico quecodifica um ω-3 dessaturase e opcionalmente um A5-elongase e/ou um Δ4-elongase e/ou um A4-dessaturase.

Em um outro aspecto a invenção compreende um processo paraa conversão de 18:2Δ9,12 (ácido linoléico) em 20:2Δ11·14, o processo compre-endendo introduzir em um organismo que compreende ácido linoléico pelomenos uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo quetem atividade de A9-elongase e que compreende:

a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico15 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 ou um homólogo de um des-tes;

b) uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9;

c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um po-lipeptídeo com atividade de A9-elongase, em que o polipeptídeo compreen-de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10;

d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduosde ácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9 que codi-fica um polipeptídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de amino-ácido com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10;

em que o referido polipeptídeo tem atividade de A9-elongase;

e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

Em um outro aspecto da invenção é fornecido um processo paraa conversão de 20:2Δ11,14 em 20:3Δ8·11,14, o processo compreendendo intro-duzir em um organismo que compreende 20:2a11, 14, ou que compreende á-cido linoléico e um Δ9 elongase, uma seqüência de ácido nucléico isoladaque codifica um polipeptídeo com atividade de Δδ-dessaturase e que é sele-cionado do grupo que consiste em:

a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo desta;

b) seqüências de ácido nucléico que hibridiza sob condições ri-gorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1;

c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de Δδ-dessaturase, em que o polipeptídeo compreendeSEQ ID NO: 3;

d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduosde ácido nucléico 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptí-deo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQ IDNO: 3;

em que o referido polipeptídeo tem atividade de Δδ-dessaturase;e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um processo pa-ra a conversão de 20:3a8,11,14 em 20:4a5,8"11,14 (ARA), o processo compreen-dendo introduzir em um organismo que compreende 20:3a8,11'14 ou que com-preende 20:2a11, 14 e um Δδ-dessaturase, ou que compreende ácido linoléico,um A9-elongase e um Δδ-dessaturase, uma seqüência de ácido nucléicoisolada que codifica um polipeptídeo com atividade de Δδ-dessaturase e queé selecionado do grupo que consiste em:

a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico10642 a 12077 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo desta;

d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduosde ácido nucléico 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipep-tídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQID NO: 4;

em que o referido polipeptídeo tem atividade de Δδ-dessaturase.

e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

O processo pode incluir etapas adicionais para converter o ARAem um ácido graxo ω-3 introduzindo no organismo, o ácido nucléico que co-difica um ω-3 dessaturase e opcionalmente um Δδ-elongase e/ou um Δ4-elongase e/ou um A4-dessaturase.

Para os processos apresentados acima, descobriu-se que a ex-pressão foi mais efetivamente obtida usando indução com galactose.

Os organismos adequados para a produção no processo de a-cordo com a invenção são, em princípio, qualquer organismo tais como mi-croorganismos, animais não humanos ou plantas.

As plantas que são adequadas são, em princípio, todas aquelasplantas que são capazes de sintetizar ácidos graxos, tal como todas as plan-tas dicotiledôneas ou monocotiledôneas, algas ou musgos. Plantas vantajo-sas são selecionadas do grupo das famílias de planta Adelotheciaceae, A-nacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassica-ceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopo-diaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditriehaeeae, Eiaeagnaeeae,Erieaeeae, Euphorbiaeeae, Fabaeeae, Geraniaeeae, Gramineae, Jugianda-eeae, Lauraeeae, Leguminosae, Linaeeae, Eugienaceae, Prasinophyeeae ouplantas vegetais ou ornamentais, tal como Tagetes.

Os exemplos que podem ser mencionados são as seguintesplantas selecionadas do grupo que consiste em: Adeiotheciaeeae tal comoos gêneros Physeomitrelia, por exemplo, o gênero e espécies Physeomitrellapatens, Anaeardiaeeae tal como os gêneros Pistaeia, Mangifera, Anacardi-um, por exemplo, o gênero e espécies Pistaeia vera [pistache], Mangifer in-dica [manga] ou Anaeardium oeeidentale [cajueiro], Asteraceae, tal como osgêneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Heiianthus,Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, por exemplo, o gênero e espécies Ca-Iendula officinalis [calêndula comum], Carthamus tinctorius [açafroa], Cen-taurea cyanus [centáurea], Cichorium intybus [chicória], Cynara scolymus[alcachofra], Helianthus annus [girassol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lac-tuca esculenta, Lactuca scariola, L. ssp. sativa, Lactuca scariola, L. var. inte-grata, Laetuea scariola, L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana,Locusta communis, Valeriana Iocusta [legumes de salada], Tagetes lúcida,Tagetes erecta ou Tagetes tenuifolia [calêndula africana ou de trincheira],Apiaceae, tal como o gênero Daucus, por exemplo o gênero e espéciesDaucus carota [cenoura], Betulaceae, tal como o gênero Corylus, por exem-pio, os gêneros e espécies Corylus avellana ou Corylus colurna [avelã], Bo-raginaceae, tal como o gênero Borago, por exemplo, o gênero e espéciesBorago officinalis [borragem], Brassicaceae1 tal como os gêneros Brassica,Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, por exemplo, os gêneros eespécies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [óleo de semente de colza],Sinapis arvensis, Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica jun-cea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica si-napioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostarda], Brassicaoleracea [beterraba de forragem] ou Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, talcomo os gêneros Anana, Bromelia (abacaxi), por exemplo, os gêneros e es-pécies Anana comosus, Ananas ananas ou Bromelia comosa [abacaxi], Ca-ricaceae, tal como o gênero Carica, tal como o gênero e espécies de Caricapapaya [mamão], Cannabaceae, tal como a Cannabis de gênero, tal como ogênero e espécies de Canabbis sativa [linho], Convolvulaceae, tal como osgêneros Ipomea, Convolvulus, por exemplo, os gêneros e espécies Ipomoeabatatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus,Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba ou Convolvulus pandu-ratus [batata-doce, batata], Chenopodiaceae, tal como o gênero Beta, talcomo os gêneros e espécies Beta vulgaris, Beta vulgaris. var altíssima, Betavulgaris var. vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulga-ris var. conditiva ou Beta vulgaris var. esculenta [beterraba doce], Crypthe-codiniaceae, tal como o gênero Crypthecodinium, por exemplo, o gênero eespécies Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, tal como o gênero Cucurbi-ta, por exemplo, os gêneros e espécies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta,Cueurbita pepo ou Cueurbita moschata [abóbora], Cymbellaceae, tal comoos gêneros Ânfora, Cymbella, Okedenia1 Phaeodactylum, Reimeria, por e-xemplo, o gênero e espécies Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, talcomo os gêneros Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella,Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Sa-elania, Trichodon, Skottsbergia, por exemplo os gêneros e espécies Cerato-don antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodonpurpurascens, Ceratodon purpureus, purpureus Ceratodon ssp,. convolutus,Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifo-lius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella Chilensis,Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditri-chum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum gigan-teum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichummontanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum,Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium,Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium ha-genii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum,Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuri-dium altemifoiium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridiumravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis,Trichodon cylindricus ou Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae,tal como o gênero Elaeagnus, por exemplo, o gênero e espécie Olea euro-paea [azeitona], Ericaceae, tal como o gênero Kalmia, por exemplo, o gêne-ro e espécies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmiapolifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros ou Kalmia lúcida[loureiro da montanha], Euglenaceae1 tal como o gênero Ascoglena, Astasia,Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalaphacus, Khawkinea,Lepocinclis, Phacus, Strombomonas, Trachelomonas, por exemplo, o gêneroe espécie Euglena gracilis; Euphorbiaceae1 tal como o gênero Manihot1 Jani-pha, Jatropha1 Ricinus1 por exemplo, o gênero e espécies Manihot utilissima,Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihotmanihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [mandioca] ou Ricinuscommunis [planta de óleo de rícino], Fabaceae, tal como o gênero Pisum1Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medica-jo, Glyeine1 Dolichos1 Phaseolus1 soybean, por exemplo, o gênero e espéciesPisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [pea], Albizia berteriana, Albi-zia julibrissin, Albizia Iebbeck1 Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia ber-teriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Ingafragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobiumberterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albi-zia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Serican-rda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbeck, Feuilleealebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa, Medicago sativa, Medicago fal-cata, Medicago varia [alfaia] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis,Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida ou Soja max [soja], Funariace-ae, tal como o gênero Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria1 Physcomitrel-la, Physcomitrium1 por exemplo, o gênero e espécies Aphanorrhegma serra-tum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon boianaeri, Entosthodon bonpian-dii, Entosthodon califomicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jame-sonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrise-tus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana,Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens,Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometri-ca, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens,Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Fu-naria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstomavar. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexe, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serra-ta, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrellacalifornica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitriumaustrale, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Phys-comitrium coloradense, Physcomitrium cupuiiferum, Physcomitrium drum-mondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitri-um hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum,Physeomitrium kellermanii, Physeomitrium megalocarpum, Physeomitriumpyriforme, pyriforme Physeomitrium var. serratum, Physcomitrium rufipes,Physeomitrium sandbergii, Physeomitrium subsphaericum, Physeomitriumwashingtoniense, Geraniaceae, tal como os gêneros Pelargonium, Cocos,Oleum, por exemplo, os gêneros e espécies Cocos nucifera, Pelargoniumgrossularioides ou Oleum cocois [coco], Gramineae, tal como o gênero Sac-charum, por exemplo, o gênero e espécies Saccharum officinarum, Juglan-daceae, tal como os gêneros Juglans, Wallia, por exemplo, os gêneros eespécies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglanscinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii,Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa,Juglans nigra ou Wallia nigra [noz], Lauraceae, tal como os gêneros Persea,Laurus, por exemplo, os gêneros e espécies Laurus nobilis [baía], Perseaamericana, Persea gratíssima ou Persea persea [abacate], Leguminosae, talcomo o gênero Arachis, por exemplo, o gênero e espécies Arachis hypogaea[amendoim], Linaceae,tal como os gêneros Adenolinum, por exemplo, osgêneros e espécies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum,Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linumgrandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense,Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense ou Linum trigy-num [linhaça], Lythrarieae, tal como o gênero Punica, por exemplo, o gêneroe espécies Punica granatum [romã], Malvaceae, tal como o gênero Gossypi-um, por exemplo, os gêneros e espécies Gossypium hirsutum, Gossypiumarboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum ou Gossypiumthurberi [algodão], Marchantiaceae, tal como o gênero Marchantia, por e-xemplo, os gêneros e espécies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea,Marchantia macropora, Musaceae, tal como o gênero Musa, por exemplo osgêneros e espécies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisíaca, Musaspp. [banana], Onagraceae, tal como os gêneros Camissonia, Oenothera,por exemplo, os gêneros e espécies Oenothera biennis ou Camissonia bre-vipes [prímula de noite], Palmae, tal como o gênero Elaeis, por exemplo, ogênero e espécies Elaeis guineensis [óleo de palma], Papaveraceae, tal co-mo, por exemplo, o gênero Papaver, por exemplo, os gêneros e espéciesPapaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [papoula], Pedaliaceae,tal como o gênero Sesamum, por exemplo, o gênero e espécies Sesamumindicum [gergelim], Piperaceae, tal como o gênero Piper1 Artanthe, Pepero-mia, Steffensia, por exemplo, os gêneros e espécies Piper aduncum, Piperamalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betei, Piper cubeba, Piperlongum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elonga-ta, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [pimenta], Po-aceae, tal como os gêneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum1 Andropo-gon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea [milho], Triticum, por exemplo, os gênerose espécies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hor-deum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexasti-chon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hor-deum secalinum [cevada], Secale cereale [centeio], Avena sativa, Avenafatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [aveias], Sor-ghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulga-re, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Sorghum Holcus, Sorghum ae-thiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum,Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineen-se, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sor-ghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcushalepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [milho miúdo], Oryzasativa, Oryza Iatifolia de [arroz], Zea mays [milho] Triticum aestivum, Triticumdurum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sati-vum ou Triticum vulgare [trigo], Porphyridiaceae, tal como os gêneros Chroo-thece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanho-effenia, por exemplo, o gênero e espécies Porphyridium cruentum, Protea-ceae, como o gênero Macadamia, por exemplo, o gênero e espécies Maca-damia intergrifolia [macadâmia], Prasinophyceae, tal como os gêneros Nep-hroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis1 Mantoniella, Ostreococ-cus, por exemplo, os gêneros e espécies, Olivacea de Nephroselmis, Prasi-nococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis sueci-ca, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, tal como o gêneroCoffea, por exemplo, os gêneros e espécies Coffea spp., Coffea Arabica1Coffea canephora ou Coffea liberica, Scrophulariaceae, tal como o gêneroVerbascum, por exemplo, os gêneros e espécies Verbascum blattaria, Ver-bascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascumlongifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum,Verbaseum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentumou Verbascum thapsus [verbascum], Solanaceae, tal como os gêneros Cap-sicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, por exemplo, os gêneros e espé-cies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicumfrutescens [pimenta], Capsicum annuum [páprica], Nicotiana tabacum, Nico-tiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Ni-cotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rus-tica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [batata], Solanum me-longena [berinjela], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum,Lycopersicon Pyriforme, Soianum integrifolium ou Solanum lycopersicum[tomate], Sterculiaceae, tal como o gênero Theobroma, por exemplo, o gêne-ro e espécies Theobroma cacau [cacau] ou Theaceae, tal como o gêneroCamellia, por exemplo, o gênero e espécies de Camellia sinensis [chá].

Os microorganismos vantajosos são, por exemplo, fungos sele-cionados do grupo das famílias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Crypto-coccaceae, Cunninghameliaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellace-ae, Mucoraceae1 Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schi-zosacharomycetaceae, Sodariaceae ou Tuberculariaceae.

Os exemplos de microorganismos que podem ser mencionadossão aqueles dos grupos: Choanephoraceae, tal como os gêneros Blakeslea,Choanephora, por exemplo, os gêneros e espécies Blakeslea trispora, Cho-anephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mor-tierellaceae, tal como o gênero Mortierella, por exemplo, os gêneros e espé-cies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana,Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae, tal como os gêneros,Phytium, Phytophthora1 por exemplo, os gêneros e espécies Pythium debar-yanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum,Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthoracactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthoracitrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthoraerythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytoph-thora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora pal-mivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetace-ae, tal como os gêneros Hansenula, Pichia, Saccharomyees, Saccharomy-codes, Yarrowia, por exemplo, os gêneros e espécies Hansenula anômala,Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hanse-nula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii,Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Han-senula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hanse-nula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Piehia angusta,Pichia anômala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichiacapsuiata, Picnia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa,Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii,Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii,Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta,Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichiapastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum,Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgen-sis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini,Pichia xylosa, Saccharomyees aceti, Saccharomyees bailii, Saccharomyeesbayanus, Saccharomyees bisporus, Saccharomyees capensis, Saccharomy-ees carlsbergensis, Saccharomyees cerevisiae, Saccharomyees cerevisiaevar. ellipsoideus, Saccharomyees chevalieri, Saccharomyees delbrueckii,Saccharomyees diastaticus, Saccharomyees drosophilarum, Saccharomyeeselegans, Saccharomyees ellipsoideus, Saccharomyees fermentati, Saccha-romyees florentinus, Saccharomyees fragilis, Saccharomyees heterogenicus,Saccharomyees hienipiensis, Saccharomyees inusitatus, Saccharomyeesitalicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyees krusei, Saccharomyeeslactis, Saceharomyces marxianus, Saccharomyees microellipsoides, Saccha-romyces montanus, Saccharomyees norbensis, Saceharomyces oleaceus,Paradoxus, Saccharomyces, Saccharomyees pastorianus, Saccharomyeespretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomycesuvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomyce-taceae tal como os gêneros Schizosaccharomyces, por exemplo, as espé-cies Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomycesjaponicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccha-romyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schi-zosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae tal como os gê-neros Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thrausto-chytrium, por exemplo as espécies Schizochytrium aggregatum, Schizochy-trium limacinum, Schizochytrium mangrove, Schizochytrium minutum, Schi-zochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytriumamoeboideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimenta-le, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytriumglobosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, T-hraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multi-rudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum,Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium stria-tum ou Thraustochytrium visurgense.

Outros microorganismos vantajosos são, por exemplo, bactériasselecionadas do grupo das famílias Bacillaceae, Enterobacteriacae ou Rhi-zobiaceae.

Os exemplos que podem ser mencionados são os seguintes mi-croorganismos selecionados do grupo que consiste em: Bacillaceae, tal co-mo o gênero de Bacillus, por exemplo, os gêneros e espécies de Bacillusacidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amylo-liquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacilluscirculans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp, fusiformis, Bacillusgalactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Ba-cillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus-lieheniformis,Baeillus megaterium, Baeillus polymyxa, Baeillus psychrosaccharolytieus,Baeillus pumilus, Baeillus sphaericus, Baeillus subtilis. subsp. spizizenii, Ba-cillus subsp subtilis. subtilis ou Baeillus thuringiensis; Enterobaeteriaeae talcomo os gêneros Citrobacter, Edwardsiella, Enterobaeter1 Erwinia, Escheri-ehia, Klebsiella, Salmonela ou Serratia, por exemplo, os gêneros e espéciesCitrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobac-ter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacterkoseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Ed-wardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwi-nia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwiniacancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica,Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Enwinia carotovora subsp. odori-fera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cy-pripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwiniamilletiae, Erwinia nighfluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Er-winia psidii, Erwinia pyrifoiiae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwiniarubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Enwinia tracheiphila, Erwiniauredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichiaaurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. com-munior, Escherichia coli-mutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia her-mannii, Escherichia sp., Escherichia Vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiel-la edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca,Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmo-nela abony, Salmonela arizonae, Salmonela bongori, Salmonela cholerae-suis subsp. arizonae, Salmonela choleraesuis subsp. bongori, Salmonelacholeraesuis subsp. cholereasuis, Salmonela choleraesuis subsp. diarizona-e, Salmonela choleraesuis subsp. houtenae, Salmonela choleraesuis subsp.indica, Salmonela choleraesuis subsp. salamae, Salmonela daressalaam,Salmonela enterica subsp. houtenae, Salmonela enterica subsp. salamae,Salmonela enteritidis, Salmonela gallinarum, Salmonela heidelberg, Salmo-nela panama, Salmonela senftenberg, Salmonela typhimurium, Serratia en-tomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia Iique-faciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Ser-ratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia piymu-thica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp,. quinovora,Serratia quinivorans ou Serratia rubidaea; Rhizobiaceae, tal como os gêne-ros Agrobacterium, Carbophilus, Cheiatobacter1 Ensifer1 Rhizobium, Sinorhi-zobium, por exemplo, os gêneros e espécies Agrobacterium atlanticum, A-grobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium Iar-rymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacteriumrhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobaeteriumtumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Cheiatobaeterheintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis,Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensi-fer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium cice, Rhizobium etli, Rhizobi-um fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhi-zobium hainanense, Rhizobium nuakuif, Rhizobium huautiense, Rhizobiumindigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobiumloessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhi-zobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium ra-diobacter, Rhizobium rhizogenes, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizo-bium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola,Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizo-bium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhi-zobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhi-zobium saheli ou Sinorhizobium xinjiangense.

Outros exemplos de microorganismos vantajosos para o proces-so de acordo com a invenção são protistas ou diatomáceas selecionadas dogrupo das famílias Dinophyceae, Turaniellidae ou Oxytrichidae, tal como osgêneros e espécies: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum,Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychianotophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum ou Colpidium sp.Aqueles que são vantajosamente aplicados no processo de a -cordo com a invenção são organismos transgênicos, tal como fungos, talcomo mortierella ou thraustrochytrium, leveduras tal como Saccharomycesou Schizosaccharomyces, musgos tal como Physcomitrella ou Ceratodon,animais não humanos tal como Caenorhabditis, algas tal como Nephrosel-mis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniel-la, Ostreococcus, Crypthecodinium ou Phaeodactylum ou plantas tal comoplantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os organismos que são espe-cialmente vantajosamente usados no processo de acordo com a invençãosão organismos que pertencem aos organismos produtores de óleo, querdizer que são usados para a produção de óleo, tal como fungos, tal comoMortierella ou Thraustochytrium, algas tal como Nephroselmis, Pseudoscour-fielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus,Crypthecodinium, Phaeodactylum, ou plantas, em particular plantas, preferi-velmente plantas de semente de óleo ou de colheita de óleo que compreen-dem quantidades grandes de compostos de lipídio, tal como amendoim, óleode semente de coiza, óleo de coiza, girassol, açafroa (Carthamus tinctoria),papoula, mostarda, linho, planta de óleo de rícino, azeitona, gergelim, Ca-lêndula, Punica, prímula de noite, verbascum, cardo, rosas selvagens, avelã,amêndoa, macadâmia, abacate, baía, abóbora, linhaça, soja, pistaches, bor-ragem, árvores (óleo de palma, coco ou noz) ou colheitas cultiváveis tal co-mo milho, trigo, centeio, aveias, triticale, arroz, cevada, algodão, mandioca,pimenta, plantas Tagetes, Solanaceae, tal como batata, tabaco, berinjela etomate, espécies de Vicia, ervilha, alfafa ou plantas fechadas (café, cacau,chá), espécies de Salix, e gramas perenes e colheitas de forragem. As plan-tas preferidas de acordo com a invenção são plantas de colheita de óleo talorno amendoim, óleo de semente de coiza, óleo de coiza, girassol, açafroa,papoula, mostarda, linho, planta de óleo de rícicno, azeitona, Calêndula, Pu-nica, prímula de noite, abóbora, linhaça, soja, borragem, árvores (óleo depalma, coco). Especialmente preferido para o processo são plantas que têmo teor alto de ácidos graxos C18:2-, tal como girassol, açafroa, tabaco, ver-bascum, gergelim, algodão, abóbora, papoula, prímula de noite, noz, linhaça,linho ou cardo. Muito especialmente preferidas plantas são plantas tal comoaçafroa, girassol, papoula, prímula de noite, noz, linhaça ou linho.

Também deve ser vantajoso para o método acima descrito deacordo com a invenção adicionalmente introduzir, no organismo, outros áci-dos nucléicos que codificam as enzimas do metabolismo de ácido graxo oulipídio, além dos ácidos nucléicos dos primeiro a quarto aspectos da inven-ção.

Tais ácidos nucléico são vantajosamente derivados de plantastal como algas, por exemplo, algas da família do Prasinophyceae tal comoos gêneros Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephrosel-mis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pyc-nococcus, Pyramimonas, Scherffelia ou Tetraselmis, tal como os gêneros eespécies Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Mi-cromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephro-selmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp,. Prasinocladus Ascus,Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera,Pyramimonas aisomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, P-yramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetraselmisapiculata, Tetraselmis carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolu-tae, Tetraselmis desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Te-traselmis impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetrasel-mis maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordi-formis, Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele,Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens ou Tetraselmis sp.ou de algas da família Euglenaceae tal como o gênero Ascoglena, Astasia,Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea,Lepocinclis, Phacus, Strombomonas ou Trachelomonas, tal como o gênero eespécie Euglena acus, Euglena geniculate, Euglena gracilis, Euglena mixoc-ylindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trache-lomonas cylindrica ou Trachelomonas volvocina. São derivados os ácidosnucléicos usados vantajosamente de algas dos gêneros Euglena, Mantoniel-la ou Ostreococcus.Outras plantas vantajosas são algas tal como Isochrysis ouCrypthecodinium, algas/diatomáceas, tal como Thalassiosira ou Phaeodact-ylum, musgos tal como Physcomitrella ou Ceratodon, ou plantas mais altastal como Primulaceae, tal como Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermumspinescens ou Osteospermum hyoseroides, microorganismos tal como fun-gos, tal como Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora1 Entomophthora,Mucor ou Mortierella, bactérias tal como Shewanella, leveduras ou animaistal como nematódeos como Caenorhabditis, insetos, rãs, abalone, ou peixe.As seqüências de ácido nucléico isoladas de acordo com a invenção sãovantajosamente derivadas de um animal da ordem dos vertebrados. Preferi-velmente, as seqüências de ácido nucléico são derivadas das classes doVertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei,Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae ou Oncorhynchus ou Ver-tebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus ou Evertebrata tal como Proto-chordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae tal como Amaroucium constella-tum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhat-tensis, Perophora viridis ou Styela partita. Os ácidos nucléicos são especi-almente vantajosamente derivados de fungos, animais, ou de plantas tal co-mo algas ou musgos, preferivelmente da ordem do Salmoniformes, tal comoa família do Salmonidae, tal como o gênero Salmo, por exemplo, dos gêne-ros e espécies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta ou Salmo trutta fario, dealgas, tal como os gêneros Mantoniella ou Ostreococcus, ou das diatomá-ceas tal como os gêneros Thalassiosira ou Phaeodactylum ou de algas talcomo Crypthecodinium.

Em uma modalidade preferida, o processo compreende a etapade obter uma célula ou um organismo intacto que compreende as seqüên-cias de ácido nucléico usadas no processo, onde a célula e/ou organismo étransformado com uma seqüência de ácido nucléico de acordo com a inven-ção que codifica o A9-elongase, e/ou A8-dessaturase e/ou A5-dessaturase,um construto de gene ou um vetor como descrito acima, sozinho ou emcombinação com outras seqüências de ácido nucléico que codificam as pro-teínas do metabolismo de ácido graxo ou lipídio. Em uma outra modalidadepreferida, este processo também compreende a etapa de obter os óleos,lipídios ou ácidos graxos livres do organismo ou da cultura. A cultura pode,por exemplo, tomar a forma de uma cultura de fermentação, por exemplo, nocaso do cultivo de microorganismos, tal como, por exemplo, Mortierella, Tha-lassiosira, Mantoniella, Ostreococcus, Saccharomyces ou Thraustochytrium,ou uma cultura de crescimento em estufa ou campo de uma planta. A célulaou o organismo produzido desse modo é vantajosamente uma célula de umorganismo produtor de óleo, tal como uma colheita de óleo, tal como, porexemplo, amendoim, óleo de semente de colza, óleo de colza, linhaça, linho,amendoim, soja, açafroa, linho, girassóis ou borragem.

No caso de células de planta, tecido de planta ou órgãos deplanta, "crescer" é entendido como significando, por exemplo, o cultivo den-tro ou sobre um meio de nutriente, ou da planta intacta sobre ou dentro deum substrato, por exemplo, em uma cultura hidropônica, composto de plan-tação ou em terra cultivável.

Para os propósitos da invenção, "transgênico" ou "recombinante"significa com respeito a, por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico, umcassete de expressão (=construto de gene) ou um vetor que compreende aseqüência de ácido nucléico ou um organismo transformado com as se-qüências de ácido nucléico, cassetes de expressão ou vetores de acordocom a invenção, todas essas construtos são realizadas através de métodosrecombinantes nos quais ou

a) a seqüência de ácido nucléico de acordo com a invenção, ou

b) uma seqüência de controle genética que é operavelmente li-gada com a seqüência de ácido nucléico de acordo com a invenção, por e-xemplo, um promotor, ou

c) a) e b)

não ficam situadas no seu ambiente genético natural ou foi modi-ficada através de métodos recombinantes, isto sendo possível para a modifi-cação tomar a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção,inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambientegenético natural é compreendido como significando o loco genômico oucromossômico natural no organismo original ou a presença em uma bibliote-ca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético na-tural da seqüência de ácido nucléico é preferivelmente retido, pelo menosem parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucléico pelo menosem um lado e tem um comprimento de seqüência de pelo menos 50 pb, pre-ferivelmente pelo menos 500 pb, especialmente preferivelmente pelo menos1000 pb, preferivelmente pelo menos 5000 pb. Um cassete de expressão deocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural dopromotor natural das seqüências de ácido nucléico com o gene de Δ5-dessaturase correspondente - se torna um cassete de expressão transgêni-co quando este cassete de expressão é modificado por métodos não-naturais, sintéticos ("artificial") tal como, por exemplo, tratamento mutagêni-co. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, na US 5.565.350 ouWO 00/15815.

Um organismo transgênico ou plantas transgênicas para os pro-pósitos da invenção é então compreendido como significando, como acima,que os ácidos nucléico usados no processo não estão no seu lugar naturalno genoma de um organismo, sendo possível que os ácidos nucléicos sejamexpressados homologamente ou heterologamente. Porém, como menciona-do, transgênico também significa que, ao mesmo tempo em que os ácidosnucléicos de acordo com a invenção estão em sua posição natural no geno-ma de um organismo, a seqüência foi modificada com respeito à seqüêncianatural, e/ou que as seqüências reguladoras das seqüências naturais forammodificadas. Transgênico é preferivelmente entendido como significando aexpressão dos ácidos nucléicos de acordo com a invenção em um lugar an-tinatural no genoma, isto é, homólogo ou, preferivelmente, a expressão hete-róloga dos ácidos nucléicos ocorre. Os organismos transgênicos preferidossão fungos tal como Mortierella ou Phytophtora, musgos tal como Physcomi-trella, algas tal como Mantoniella, Euglena, Crypthecodinium ou Ostreococ-eus, diatomáceas tal como Thalassiosira ou Phaeodaetylum, ou plantas talcomo as colheitas de óleo.

Os organismos ou organismos hospedeiros para os ácidos nu-cléico, o cassete de expressão ou o vetor usado no processo de acordo coma invenção são, em princípio, vantajosamente todos os organismos que sãocapazes de sintetizar ácidos graxos, especificamente ácidos graxos não sa-turados, e/ou que são adequados para a expressão de genes recombinan-tes. Os exemplos que podem ser mencionados são plantas tal como Arabi-dopsis, Asteraceae tal como Calendula ou plantas de colheita tal como soja,amendoim, planta de óleo de rícino, girassol, milho, algodão, línho, óleo desemente de colza, coco, óleo de palma, açafroa (Carthamus tinctorius) ousemente de cacau, microorganismos, tal como fungos, por exemplo, o gêne-ro Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia, Phytophtora ou Pythium, bac-térias, tal como o gênero Escherichia ou Shewanella, leveduras, tal como ogênero Saccharomyces, cyanobacteria, ciliates, algas tal como Mantoniella,Euglena, Thalassiosira ou Ostreococcus, ou protozoários tal como dinofla-gellates, tal como Crypthecodinium. Os organismos preferidos são aquelesque são naturalmente capazes de sintetizar quantidades significativas deóleo, tal como fungos, tal como Mortierella alpina, Pythium insidiosum, Phy-tophtora infestans, ou plantas tal como soja, óleo de semente de colza, coco,óleo de palma, açafroa, linho, linho, planta de óleo de rícino, calêndula, a-mendoim, semente de cacau ou girassol, ou leveduras, tal como Saccha-romyces cerevisiae, tal com soja, linho, óleo de semente de colza, açafroa,girassol, Calêndula, Mortierella ou Saccharomyces cerevisiae que são espe-cialmente preferidos. Em princípio, os organismos hospedeiros são, alémdos organismos transgênicos acima mencionados, também animais transgê-nicos, vantajosamente os animais não humanos, por exemplo, C. elegans,Ciona intestinalis ou Xenopus laevis.

Também utilizáveis são as células hospedeiras detalhadas em:Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Aca-demic Press, San Diego, CA (1990).

A expressão cepas que pode ser usada, por exemplo, aquelascom uma atividade de protease mais baixa, é descrita em: Gottesman, Sr,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, Califórnia (1990) 119-128.Estes incluem células de planta e certos tecidos, órgãos e partesde plantas em todas suas formas fenotípicas tal como anteras, fibras, cabe-los da raiz, talos, embriões, caule, cotiledôneas, pecíolos, material colhido,tecido de planta, tecido reprodutivo e culturas de célula que sejam derivadosda planta transgênica atual e/ou possam ser usados para realizar a plantatransgênica.

As plantas transgênicas que compreendem os ácidos graxospoliinsaturados sintetizados no processo de acordo com a invenção podemser comercializadas vantajosamente e diretamente sem haver qualquer ne-cessidade de que os óleos, lipídios ou ácidos graxos sintetizados sejam iso-lados. As plantas para o processo de acordo com a invenção são listadascomo significando plantas intactas e todas as partes da planta, órgãos deplanta ou partes de planta tal como folha, talo, sementes, raiz, tubérculos,anteras, fibras, cabelos da raiz, talos, embriões, caule, cotiledôneas, pecío-los, material colhido, tecido de planta, tecido reprodutivo e cultura de célulaque são derivados da planta transgênica atual e/ou podem ser usados pararealizar a planta transgênica. Neste contexto, a semente compreende todasas partes da semente tal como a casca da semente, células epidérmicas,células da semente, endosperma ou tecido embrionário. Porém, os compos-tos produzidos no processo de acordo com a invenção também podem serisolados dos organismos, vantajosamente plantas, na forma de seus óleos,gorduras, lipídios e/ou ácidos graxos livres. Os ácidos graxos poliinsaturadosproduzidos por este processo podem ser obtidos colhendo-se os organis-mos, ou da colheita na qual eles crescem, ou do campo. Isto pode ser feitopor pressão ou extração das partes da planta, preferivelmente as sementesde planta. Neste contexto, os óleos, gorduras, de lipídios e/ou ácidos graxoslivres podem ser obtidos pelo que é conhecido como batimento a frio oupressionamento a frio sem aplicar calor. Para permitir maior facilidade derompimento das partes da planta, especificamente as sementes, elas sãopreviamente fragmentadas, cozidas em vapor ou assadas. As sementes queforam pré-tratadas desta maneira podem ser subseqüentemente apertadasou extraídas com solventes como hexano quente. O solvente é subseqüen-temente removido. No caso de microorganismos, os últimos são, após co-lheita, por exemplo, extraídos diretamente sem outras etapas de processa-mento ou ainda, após rompimento, extraídos por vários métodos com osquais o operário qualificado está familiarizado. Desta maneira, pode ser iso-lado mais que 96% dos compostos produzidos no processo. Depois disso,os produtos resultantes são processados mais adiante, isto é, refinados.Neste processo, substâncias como as mucilagens de planta e substânciassuspensas são primeiro removidas. O que é conhecido como desenlamea-mento pode ser realizado enzimaticamente ou, por exemplo, quimio-fisicamente por adição de ácido tal como ácido fosfórico. Depois disso, osácidos graxos livres são removidos através de tratamento com uma base,por exemplo, solução de hidróxido de sódio. O produto resultante é lavadocompletamente com água para remover o álcali que permanece no produto eentão é secado. Para remover o pigmento que permanece no produto, osprodutos são sujeitados a branqueamento, por exemplo, usando a terra dacarga ou carvão ativo. No final, o produto é desodorizado, por exemplo, u-sando vapor.

Os ácidos graxos produzidos pelos processos da presente in-venção podem ser isolados do organismo na forma de um óleo, um Iipfdio ouum ácido graxo livre. Por exemplo, os organismos adequados são aquelesmencionados acima. Os organismos preferidos são plantas transgênicas.

Uma modalidade da invenção é então óleos, lipídios ou ácidosgraxos da fórmula I ou frações destes que foram produzidos pelo processoacima descrito, especialmente preferivelmente óleo, lipídio ou uma composi-ção de ácido graxo que compreendem um composto de fórmula I e sendoderivado de plantas transgênicas.

Uma outra modalidade de acordo com a invenção é o uso doóleo, lipídio, dos ácidos graxos e/ou da composição de ácido graxo em pro-dutos alimentícios, comestíveis, cosméticos ou farmacêuticos. Os óleos, lipí-dios, ácidos graxos ou misturas de ácido graxo de acordo com a invençãopodem ser usados da maneira com a qual o trabalhador versado está famili-arizado para misturar com outros óleos, lipídios, ácidos graxos ou misturasde ácido graxo de origem animal, tal como, por exemplo, óleos de peixe.Também podem ser usados estes óleos, lipídios, ácidos graxos ou misturasde ácido graxo que sejam compostos de legume e componentes de animaispara a preparação de produtos alimentícios, comestíveis, cosméticos oufarmacológicos.

O termo "óleo", "lipídio" ou "gordura" é entendido como signifi-cando uma mistura de ácido graxo que compreende ácido(s) graxo não satu-rado, saturado, preferivelmente esterificado. O óleo, lipídio ou gordura é pre-ferivelmente elevado em ácido(s) graxo poliinsaturado livre ou, vantajosa-mente, esterificado, em particular ácido linoléico, ácido γ-linolênico, ácido di-homo- γ-linolênico, ácido araquidônico, ácido α-linolênico, ácido estearidôni-co, ácido eicosatetraenóico, ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentae-nóico ou ácido docosaexaenóico.

A quantidade de ácidos graxos esterificados não saturados pre-ferivelmente quantidades de aproximadamente 30%, um conteúdo de 50% émais preferido, um conteúdo de 60%, 70%, 80% ou mais é ainda mais prefe-rido. Para a análise, o conteúdo de ácido graxo pode, por exemplo, ser de-terminado por cromatografia de gás depois de converter os ácidos graxosnos ésteres de metila através de transesterificação. O óleo, lipídio ou gordu-ra podem compreender vários outros ácidos graxo saturados ou não satura-dos, por exemplo ácido calendúlico, ácido palmítico, ácido palmitoléico, áci-do esteárico, ácido oléico e outros. O conteúdo dos vários ácidos graxos noóleo ou gordura pode variar, em particular dependendo do organismo de par-tida.

O ARA produzido no processo pode estar, como descrito acima,na forma de derivado de ácido graxo, por exemplo, esfingolipídeos, fosfogli-cerídeos, lipídios, glicolipídeos, fosfolipídeos, monoacilglicerol, diacilglicerol,triacilglicerol ou outros ésteres de ácido graxo.

O ARA e outros ácidos graxos poliinsaturados que estão presen-tes podem ser liberados, por exemplo, por tratamento com álcali, por exem-plo, KOH ou NaOH aquoso, ou hidrólise de ácido, vantajosamente na pre-sença de um álcool tal como metanol ou etanol, ou por clivagem enzimática,e isolado por, por exemplo, separação de fase e acidificação subseqüentepor, por exemplo, H2SO4. Os ácidos graxos também podem ser liberadosdiretamente sem a etapa de processamento acima descrita.

Depois da sua introdução em um organismo, vantajosamenteuma célula de planta ou planta, os ácidos nucléicos usados no processo, oupodem estar presentes em um plasmídeo separado ou, vantajosamente, in-tegrado no genoma da célula hospedeira. No caso de integração no geno-ma, a integração pode ser aleatória ou então pode se efetuar através de re-combinação tal que o gene nativo seja substituído pela cópia introduzida, pormeio do que a produção do composto desejado pela célula é modulada, oupelo uso de um gene em trans, de forma que o gene seja operavelmenteligado com uma unidade de expressão funcional que compreende pelo me-nos uma seqüência que garante a expressão de um gene, e pelo menosuma seqüência que garante a poliadenilação de um gene funcionalmentetranscrito. Os ácidos nucléicos são introduzidos vantajosamente nos orga-nismos por cassetes de multiexpressão ou construtos para expressão multi-paralela, vantajosamente nas plantas para a expressão específica de se-mente multiparalela de genes.

Se os microorganismos tal como leveduras, tal como Saccha-romyces ou Schizosaccharomyces, fungos tal como Mortierella, Aspergillus,Phytophtora, Entomophthora, Mucor ou Thraustochytrium, algas tal comoIsochrysis, Mantoniella, Euglena, Ostreococcus, Phaeodactylum ou Crypthe-codinium forem usados como organismos no processo de acordo com a in-venção, estes organismos serão vantajosamente crescidos em culturas defermentação.

Se os microorganismos forem usados como organismos no pro-cesso de acordo com a invenção, eles são crescidos ou cultivados da manei-ra com qual o trabalhador versado está familiarizado, dependendo do orga-nismo hospedeiro. Como uma regra, os microorganismos são crescidos emum meio líquido que compreende uma fonte de carbono, normalmente naforma de açúcares, uma fonte de nitrogênio, normalmente na forma de fon-tes de nitrogênio orgânico tal como extrato de levedura ou sais tal como sul-fato de amônio, elementos traço, tal como sais de ferro, manganês e mag-nésio e, se apropriado, vitaminas, a temperaturas de entre 0°C e 100°C, pre-ferivelmente entre 10°C e 60°C, ao mesmo tempo em que passando em oxi-gênio. O pH do meio líquido pode ou ser qualquer um mantido constante,quer dizer regulado durante o período de cultivo, ou não. As culturas podemser cultivadas em bateladas, semibateladas ou continuamente. Os nutrientespodem ser fornecidos no começo da fermentação ou podem ser alimentadossemicontinuamente ou continuamente. Os ácidos graxos poliinsaturadosproduzidos podem ser isolados dos organismos como descrito acima porprocessos conhecidas pelo trabalhador versado, por exemplo, através deextração, destilação, cristalização, precipitação apropriada com sal, e/oucromatografia. Para este fim, os organismos podem ser rompidos vantajo-samente anteriormente.

Se os organismos hospedeiros forem microorganismos, o pro-cesso de acordo com a invenção é realizado vantajosamente a uma tempe-ratura de entre 0°C e 95°C, preferivelmente entre 10°C e 85°C, especialmen-te preferivelmente entre 15°C e 75°C, muito especialmente preferivelmenteentre 15°C e 45°C.

Neste processo, o valor de pH é mantido vantajosamente entrepH 4 e 12, preferivelmente entre pH 6 e 9, especialmente preferivelmenteentre pH 7 e 8. O processo de acordo com a invenção pode ser operado embateladas, semibateladas ou continuamente. Uma avaliação sobre os méto-dos de cultivo conhecidos pode ser encontrada no livro de Chmiel(Bioprozeptechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess te-chnology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag,Stuttgart, 1991)) ou no livro de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrich-tungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Braunsch-weig/Wiesbaden, 1994)).

O meio de cultura a ser usado tem que satisfazer adequadamen-te às exigências das cepas em questão. As descrições dos meios de culturapara vários microorganismos podem ser encontradas no livro "Manual of Me-thods fur General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology(Washington D. C, USA, 1981).

Como descrito acima, estes meios que normalmente podem serempregados de acordo com a invenção compreendem uma ou mais fontesde carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e/ou elementostraços.

As fontes de carbono preferidas são açúcares, tal como mono-,di- ou polissacarídeos. Os exemplos de fontes de carbono muito boas sãoglicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, mal-tose, sacarose, rafinose, amido ou celulose. Os açúcares também podemser adicionados aos meios por compostos complexos tal como melados ououtros subprodutos de refinação de açúcar. A adição de misturas de umavariedade de fontes de carbono também pode ser vantajosa. Outras possí-veis fontes de carbono são óleos e gorduras tal como, por exemplo, óleo desoja, óleo de girassol, óleo de amendoim e/ou gordura de coco, ácidos gra-xos tal como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e/ou ácido Iino-léico, poliálcoois e/ou álcoois tal como, por exemplo, glicerol, etanol e/oumetanol, e/ou ácidos orgânicos tal como, por exemplo, ácido láctico e/ouácido acético.

As fontes de nitrogênio são compostos de nitrogênio normalmen-te orgânicos ou inorgânicos ou materiais compreendendo estes compostos.Os exemplos de fontes de nitrogênio compreendem amônio na forma líquidaou na forma gasosa ou sais de amônio tal como sulfato de amônio, cloretode amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio ou nitrato de amônio,nitrato, uréia, aminoácidos ou fontes de nitrogênio complexas tal como licormacerado de milho, carne de soja, proteína de soja, extrato de levedura, ex-trato de carne e similares. As fontes de nitrogênio podem ser usadas indivi-dualmente ou como uma mistura.

Os compostos de sal inorgânicos que podem estar presentesnos meios compreendem os sais de cloreto, fósforo e sulfato de cálcio, mag-nésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro.

Os compostos contendo enxofre inorgânico tal como, por exem-plo, sulfatos, sulfetos, ditionetos, tetrationatos, tiossulfatos, sulfetos, ou entãocompostos de enxofre orgânico tal como mercaptanos e tióis, podem serusados como fontes de enxofre para a produção de substâncias químicasfinas contendo enxofre, em particular de metionina.

Ácido fosfórico, fosfato de diidrogênio de potássio ou fosfato dehidrogênio de dipotássio ou sais contendo sódio podem ser usados sais co-mo fontes de fósforo.

Os agentes de quelação podem ser adicionados ao meio paramanter os íons de metal na solução. Os agentes de quelação particularmen-te adequados incluem diidroxifenóis, tal como catecol ou protocatecuato eácidos orgânicos tal como ácido cítrico.

Os meios de fermentação usados de acordo com a invençãopara cultivar microorganismos normalmente também compreendem outrosfatores de crescimento, por exemplo, tal como vitaminas ou promotores decrescimento que incluem, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido ni-cotínico, pantotenato e piridoxina. Os fatores de crescimento e sais freqüen-temente são derivados de componentes de meios complexos tal como extra-to de levedura, melados, licor macerado de milho e similares. Também épossível adicionar precursores adequados ao meio de cultura. A composiçãoexata dos compostos do meio pesadamente depende da experiência particu-lar e é decidida individualmente para cada caso específico. Informações so-bre a otimização do meio podem ser encontradas no livro "Applied Microbiol.Physiology, A Practical Approach" (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRLPress (1997) pp. 53-73, ISBN O 19 963577 3). Os meios de crescimentotambém podem ser obtidos de fornecedores comerciais, por exemplo Stan-dard 1 (Merck) ou BHI (infusão de cérebro coração, DIFCO) e similares.

Todos os componentes do meio são esterilizados, ou através decalor (20 min a 1,5 bar e 1210C) ou através de esterilização de filtro. Oscomponentes ou podem ser esterilizados juntos ou, se precisio for, separa-damente. Todos os componentes do meio podem estar presentes no come-ço do cultivo ou adicionados continuamente ou em batelada.como desejado.

A temperatura de cultura normalmente está entre 15°C e 45°C,preferivelmente de 25°C a 40°C, e pode ser mantida constante ou pode seralterada durante a experiência. O pH do meio deveria estar na faixa de 5 a8,5, preferivelmente em cerca de 7,0. O pH para cultivo pode ser controladodurante cultivo adicionando-se compostos básicos tal como hidróxido de só-dio, hidróxido de potássio, amônio e amônia aquosa ou compostos ácidos talcomo ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. A espumação pode ser controladaempregando antiespumantes tal como, por exemplo, ésteres de poliglicol deácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos é possível adicionarao meio, substâncias adequadas que têm um efeito seletivo, por exemplo,antibiótico. As condições aeróbias são mantidas introduzindo oxigênio oumisturas de gás contendo oxigênio tal como, por exemplo, ar ambiente nacultura. A temperatura da cultura normalmente é 20° a 40°C e preferivelmen-te 25°C a 40°C. A cultura é continuada até que formação do produto deseja-do esteja em um máximo. Este objetivo normalmente é alcançado dentro de10 a 160 horas.

Os caldos de fermentação obtidos deste modo, em particularaqueles contendo ácidos graxos poliinsaturados, normalmente contêm umamassa seca de 7,5 a 25% em peso.

O caldo de fermentação pode então ser processado também. Abiomassa pode, de acordo com a exigência, ser removida completamente ouparcialmente do caldo de fermentação através de métodos de separação talcomo, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma combinaçãodestes métodos ou ser deixada completamente no referido caldo. É vantajo-so processar a biomassa após sua separação.

Porém, o caldo de fermentação também pode ser engrossado oupode ser concentrado sem separar as células, usando métodos conhecidostal como, por exemplo, com a ajuda de um evaporador giratório, evaporadorde película fina, evaporador de película de queda, por osmose inversa ouatravés de nanofiltração. Finalmente, este caldo de fermentação concentra-do pode ser processado para obter os ácidos graxos presentes nele.

Os ácidos graxos obtidos no processo também são adequadoscomo material de partida para a síntese química de produtos adicionais deinteresse. Por exemplo, eles podem ser usados em combinação com umoutro ou sozinhos para a preparação de farmacêuticos, comestíveis, alimen-tos animais ou cosméticos. Todas as seqüências de ácido nucléico usadasno processo de acordo com a invenção são vantajosamente derivadas deum organismo eucariótico, tal como uma planta, um microorganismo ou umanimal. As seqüências de ácido nucléico são derivadas preferivelmente daordem Salmoniformes, algas tal como Mantoniella, Crypthecodinium, Eugle-na ou Ostreococcus, fungos tal como o gênero Phytophthora ou de diatomá-ceas tal como os gêneros Thalassiosira ou Phaeodactylum.

A invenção será descrita agora em maiores detalhes com refe-rência aos seguintes Exemplos e aos desenhos nos quais:

Figura 1 mostra várias séries de reação sintéticas para a bios-síntese de ácidos graxo ω-6 e ω-3.

Figura 2 é um traço de cromatografia de gás que mostra a con-versão de Δ9, 12-18:2 (ácido linoléico) em Δ11 ,14-20:2 por expressão hete-róloga da seqüência de A9-elongase de P. marinus (SEQ ID NO: 1, resíduos7668 a 9200) em levedura ou induzido por galactose (Figura 2A) ou glicose(Figura 2B).

Exemplo 1 - Clonagem de um elonqase de FAE1 de Perkinsus marinus

Perkinsus marinusi é um parasita de protozoário de ostra capazde sintetizar ácidos graxos saturados e não saturados incluindo o ácido gra-xo essencial, ácido araquidônico [20:4(n-6)]. P. marinus emprega a série dereação delta-8 (Δ -8) dessaturase para sintetizar o ácido araquidônico.Materiais e Métodos.Crescimento e colheita de P. marinus

Perkinsus marinus meronts foram cultivados a 28°C em um meiopreparado como descrito por La Peyre e outros (J Eukaryot Microbiol1993;40:304-10) e conteve aminoácidos, nucleotídeos, carboidrato, e vitami-nas, porém nenhum soro bovino fetal.Manipulação de ácido nucléico e clonagem com base em PCR

O DNA foi extraído de células usando um minikit de DNA DNeasy(Qiagen). O DNA foi amplificado com iniciadores específicos para gene de del-ta5 dessaturase como segue: as reações foram aquecidas a 95°C durante 2min seguido por 35 ciclos a 95°C durante 1 minutos, 2 minutos a 52 e 72°C du-rante 4 minutos, em seguida uma única etapa a 72°C durante 5 minutos. Osprodutos de amplificação de PCR foram clonados em vetor de TOPO (Invitro-gen) e verificados através de sequenciamento. O gen FAE elongase foi amplifi-cado com iniciadores específicos de gene (Tabela I) designados para as extre-midades 5' e 3' da região de codificação, com locais de restrição para facilitar aclonagem no vetor de levedura (Tabela I). Os iniciadores dianteiros para clona-gem em vetor de expressão de levedura pYES2 (Invitrogen) foram projetadospara conter um G/A na posição -3 e um G na posição +4 para melhorar a inicia-ção de translação em células eucarióticas.

Iniciadores de oliqonucleotídeo usados neste estudo

As transcrições de Perkinsus marinus foram analisadas atravésde transcriptase reversa PCR (RT - PCR). O RNA total foi extraído de célu-las que usam um minikit de planta RNeasy (Qiagen). Primeiro o cDNA dofilamento foi sintetizado de RNA total que usa o kit de Amplificação de cDNASMARTE RACE (BD-Clontech, Basingstoke, UK) de acordo com as instru-ções do fabricante. Os cDNAs de filamento único foram amplificados com osseguintes iniciadores.

FAEoperon dianteiro 5' - GGAATTCGAGGAGTAGGATCTTATCTGAGGATAGTC A-CACTAGTCGTACT-3' FAEoperon reverso 5'-CATCTGCGAATACTAACCATACÁTT

As reações foram aquecidas a 95°C durante 2 minutos seguidospor 30 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 30 segundos em temperaturasque variam de 55 a 72 de acordo com o iniciador designado e 72°C durante2 minutos, em seguida uma única etapa a 72°C durante 10 minutos. Os pro-dutos de amplificação de PCR foram clonados em vetor TOPO (Invitrogen) everificados através de sequenciamento. Surpreendentemente foi mostradoque as transcrições da A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δδ-dessaturase sãotodas encontradas no mesmo mRNA. Este é o primeiro exemplo mostrandoos genes de PUFA a serem organizados em uma estrutura tipo operon.

Em uma investigação adicional foi analisada a especificidade daA9-elongase. Para este propósito a seqüência de codificação deste gene foiamplificada por RT-PCR como descrito acima usando os seguintes iniciado-res.

Elo2For: 5' - ATGCAAGTTCCCGCGGAGCATCACTCC -3'Elo2Rev: 5' - CGTTACGCATCAATATTATGCATAGCCAACC -3'

O produto de PCR amplificado foi então clonado em um vetor depCRscript de acordo com as recomendações do fabricante (Stratagen). Emuma segunda etapa de PCR as seqüências modificadas para expressão delevedura foram introduzidas usando os seguintes iniciadores.

Expressão de levedura

Kpn Elo2 dianteira 5' - TTGGTACCATGGGATTTCCTGCGGAG -3'Sac Elol Reversa 5' - GGGAGCTCTTACGCATCAATATTATGCATAGC-3'A seqüência dos iniciadores é determinada na orientação 5' a 3'.Os sítios de restrição usados para clonagem estão em negrito.

RESULTADOS

Isolamento de elonqase de FAE1 de P.marinus

Usando dados publicamente disponíveis derivados de um proje-to de sequenciamento de genoma de P.marinus realizado por TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/pmg /) foi identificado um contig (1047306867)que mostrou homologia significante a elongases conhecidas, com a seqüên-cia alvo (designada Elol Para, SEQ ID NO: 9) consistindo em uma estruturade leitura aberta de 511 resíduos e nenhum íntron. O aminoácido putativoderivado da seqüência designada é SEQ ID NO: 10.

Caracterização funcional em Saccharomyces cerevisiae

O cDNA de tamanho natural que corresponde a Δ9 elongase deácido graxo putativo (SEQ ID NO: 9) foi clonado em vetor expressão de le-vedura pYES2 para determina um construto pYPmFAE designada. A cepade S. cerevisiae W303-1A foi transformada com o pYPmFAE ou o vetor va-zio como um controle. As células transformadas foram crescidas em ummeio mínimo que contém rafinose, e foram induzidas com 2% de galactose.Depois de 48 horas de crescimento os ácidos graxos de levedura totais fo-ram extraídos e os FAMEs resultantes analisados por GC.

A análise de GC (Figura 2) revelou que as células de leveduratransformadas com pYPmFAE produziram um ácido graxo adicional que foiidentificado como ácido eicosadienóico que indica que o gene que foi clona-do codificou um ácido graxo delta 9 elongase. A célula de levedura que ex-pressa o ácido graxo delta 9 elongase de P. marinus é capaz de reconhecero C18:2 (c9,12) substrato com uma porcentagem de 8,2% de taxa de con-versão.

A tabela 1 mostra o conteúdo de ácido graxo das células de le-vedura após a transformação com pYPmFAE (+) ou com o vetor vaziopYES2 (-) e indução com 2% de galactose. A porcentagem de conversão em18:2a9'12 a 20:2Δ11·14, por exemplo, é calculado pela equação:% conversão= [20:2Δ11,14]

[18:2Δ8,12] + [20:2Δ1114]<table>table see original document page 69</column></row><table>Listagem de Seqüência

<110> BASF

ei2o> Ácido Nucléico

<130> DY-03<160> 10

<170> Patente em versão 3.1

<210> 1

<211> 18342<212> DNA

<213> Perkinsusmarinus

<220>

<221> CDS

<222> (7566)-(9200)<223>

<220>

<221> CDS

<222> (9351).·(10724)<223><220><221> CDS<222> (10S42)..(12077)<223 >

<400> 1

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tcaattaaat gccaacaatt tcaccagaaa gctgagaacc tcagtcccac gaagtgcttg5100

ctagtcatca gaccgagagt taaacgccga gcctattcgg aaaaccgact atgatgagac5160

tctcatcgtg tcatattgta tgccatcatc ataatctgat ccaatcacgt catggtatca5220

gatggcgagt gactcgccgc gagtcagtac ctgaaagtgc atcctatttc cacggcgcgc5280

gcatgctcat cagcctgtct cttggcagtc gtacgcatgc gtcagcctat tgaatgccac5340

cacagactca agtcaatgac tcttaaccca gagattaacg aaagtccaga gcatatgtgt5400

ggacctgtga agaggaagca atgatgagag aatactctgt tcgggcctgt ataagaacac5460

actgaatagc agagtggaaa tgctgagatc actctggcac acacggagtg agtcggttca5520

ggtcagctac gaattatttt ccatttcacc cagctgtatg cccgagtata acaaatttct55B0

tcactgggge aaatatgcca cgtcaagata tgccaaagtg gggccactàt gccacaccaa5640

gatctgcttg agtatgatat aaatttcttg tctggggcaa atatgccaca ccaagatatg57 00

ccaaagtggg gccactatgc cacaccaaga tctgcttgag tataatataa atttcttgtg5760

tagggcaaat atgccacgcc aagatatgcc aaagtggggc cactatgcca caccaagttc5820

tgcttgagca caatgaatttSB80

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tcttcagtga gacacctatg6300

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tccgactgag aaaagattga6960

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cacgccaaaa tacgcctaagaagtatgaca cgccaagatacatgccaaga tatgcctgagccaagatctg ctcgagtacacaaatcgggg taactatgccagatatgctt aagtacaatatgtgtccgag tatgaaaaaagaacaataaa tttcgtaagtaatatgccaa gccgagatatcgccaaaaca tgcctgggtgacccacttat cttggcgtgctgcccgagta caacaaaattaacaacaaat ttcgccagtgatctcccgag agcgcgacctccggcttgga cgaattgcggagacatgcca tttccgagctgtatttcctt ggtaatttcccagtactcac aagatgacgcacatacgaaa ggtgtattccaatcttgctg ttgttgttat tgttgtgagt ctccgtgtgg gagtgaaccg catcccattg7020

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ctaatatgcg atcaacccca afcaacccctc ggcgcgtcta tacgggccct caaatactgg7320

tgagàtgcaa aatcaagcag tttaggtcgg aaattgtcgt ggttcgtcaa aactcaattc7380

atcgagtccc tccggtcatt cgtcgcgcgc gttgaagacg aacggcgcac caatcatttg7440

cgcacgcgtg caaaacgctc attgcgcagg cctacattcc agaatgtagg gccacggtat7500

gtgctgcact aacatcgcca gactctaçac tcgtagcata atatatggaa ttcgaggagt7560

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caacgttatg actattaaga cgatcgttag gacgtcatta ogtcgtc atg caa gtt7676

Met Gln Val1

ccc gcg gag cat cac tcc act cgg gtt ata tct ate tgt gat ate gtc7724

Pro AIa Glu His His Ser Thr Arg Val lie Ser Ile Cys Asp Ile Val5 10 15

ate tca ggc ccc ttt gga atg tgt aac cat gat tac tcc gct tct ata7772

lie Ser Gly Pro Phe Gly Met Cys Asn His Asp Tyr Ser Ala Ser Ile20 25 30 35

cct gcc tct agt agt ggt age act cga cgt atg cgt ttg gtà gcc tac7820

Pro Ala Ser Ser Ser Gly Ser Thr Arg Arg Met Arg Leu Val Ala Tyr40 45 50

ate aca ttg gtc tct ate cac tat caa cag cta etc ttt tac tct tct7868

Ile Thr Leu Val Ser Ile His Tyr Gln Gln Leu Leu Phe Tyr Ser Ser55 SO 65

ate ata act ata ate act ggc tat cac tac tat gtc gea gct" ctg ccc79IS

Xle Xla Thr Ile70

ctt tac gac ate7 9 64

Leu Tyr Asp Ils85

ctg tgg tta tgt8012

Leu Trp Leu Cys100

ate gat cat gtt8060

Ile Asp His Val

gaa gac ate ate8108

Glu &.sp Ile Ile13 5

tca etc aac ttc8156

Ser Leu Asn Phe15 0

gat aag agt gctB204

Asp Lys Ser Ala155

aac gcc ccc gcc8252

Asn Ala Pro Ala180

gaa gtg ate ata8300

Glu Val Ile Ile

cat cct aaa tet8348

His Pro Lys Ser215

ccg aca ccg tca8396

Pro Thx Pro Ser230

aat gac "gtt ate8444

Asn Asp Val Ile245

Ile Thr Gly Tyr75

tca att gct cta

Ser Ile Ala Leu90

aat tgc tat tac

Asn Cys Tyr Tyr105

gag ttt gac gct

Glu Phe Asp Ala12 0

aac att gcc aagAsn Ile Ala Lys

atg cag cgt ctt

Met Gln Arg Leu155

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Ala Tyr Pro Pro170

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Asp Ala Ser Ala185

act acg gtc aaa

Thr Thx Val Lys200

ate gac tac ateIle Asp Tyr Ile

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His Ala Ala Met235

acc tat aac ctc

Thr Tyr Asn Leu250*

His Tyr Tyr Val

tet gtg ctt tcg

Ser Val Leu Ser95

aac age aag ccc

Asn Ser Lys Pro110

cct ccc tet tgg

Pro Pro Ser Trp125

ata caa ggt tgc

Ile Gln Gly Cys140

ctc gag agg tetLeu Glu Arg Ser

gtg gtt gtt gag

Val Val Val Glu175

gtc aat act aga

Val Asn Thr Arg190

gat ctg ctc aag

Asp Leu Leu Lys205

ate gtc aat tgc

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ata gtg aat gaaIle Val Asn Glu

agt ggt atg ggg

Ser Gly Met Gly255

Ala Ala Leu Pro80

gga cta aca ctaGly Leu Thr Leu

aat gta ttc tgc

Asn Val Phe Cys115

aag gtc agt cat

Lys Val Ser His130

tac acg gaa gat

Tyr Thr Glu Asp145

ggt act tgc cct

Gly Thr Cys Pro160

tca ctg agg act

Ser Leu Arg Thr

gag gaa gcg agg

Glu Glu Ala Arg195

aaa act ggt gtg

Lys Thr Gly Val210

gcc atg tac aac

Ala Met Tyr Asn225

gtc ggt atg agg

Val Gly Met Arg240

tgt aat gcc ggtCys Ser Ala Glygtt ate aca att8492

Val lie Thr Ile260

agg gca ctg att8540

Arg Ala Leu Ile

ggt aat gat cgtBSBB

Gly Asn Asp Arg295

ggt gct gct gct863 6

Gly Ala Ala Ala310

aaa tat aag ttg8684

Lys Tyr Lys Leu325

agt ttt gaa a cg8732

Ser Phe Glii Thr340

att gtt aca cta3780

Ile Val Thx Leu

gct att aaa caa8828

Ala Ile Lys Gln375

aga gaa ctg ttg8876

Arg Glu Leu Leu390

aga aag tcg tca8924

Arg Lys Ser Ser4 05

aag ggt act gat8972

Lys Gly Thr Asp420

gat acc tta caa9020

Asp Thr Leu.Gln

gat cta gca acg

Asp Leu Ala Tiir265

gtc tca act gag

Val Ser Thr Glu280

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ttg cta tcg tca

Leu Leu Ser Ser315

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Leu His Tlir Val330

att atg gag act

Ile Met Glu Thr345

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Arg Leu Gln Lys360

aat ttt act aagAsn Phe Thr Lys

aag gtc tta tac

Lys Val Leu Tyr395

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Lys Glu Gly Arg410

cat tgg tgt att

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cgt ctg ttg aga

Arg Leu Leu Arg27 0

ata cta act cgt

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Gly Asn Thr Leu300

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Arg Thr Gln Val335

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Asp Asp Ser Thr350

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Leu Ala Tyr Met380

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Glu Leu Tyr Val415

cat gct ggt ggc

His Ala Gly Gly430

ctg tca gac tac

Leu Ser Asp Tyr445· -

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Glu Thr Arg Gly275

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Leu Ser Arg Ala320

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Lys Pro Asn Ser355

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Val Ala Ala Val370

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Val Leu Pro Leu385

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Met Lys Met Arg400

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cgt ggt gta ttg

Arg Gly Val Leu- 435

gat ate caa gca

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Ser Arg Ser Val Leu Tyr Glu Arg Gly Asn Tlir Ser Ser Ser Ser Ile455 450 465

tgg tat gag ttg gea tgg ctc gaa cgt gac caa cgt att aag cgt gga9116

Trp Tyr Glu I>eu Ala Trp Leu Glu Arg Asp Gln Arg Ile Lys Arg Gly470 475 4B0

gat agg gta tta cag ttg gct ttt ggt agt ggt ttc aaa tgt aac tca9154

Asp Aarg Val Leu Gln Leu Ala Phe Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser485 490 495

tca gta tgg ttg gct atg cat aat att gat gcg taa cgacaatcag9210

Ser Val Trp Leu Ala Met His Asn Xle Asp Ala500 505 510

tttttctcac tatgagttgg ctccaccgta atcaatggcc atcatctcct tttctagtta9270

ttatcgatga ttatagtcag tgccgatgtg tgctagtgtt ttactcttta tcaacttgtg9330

agtttcaggc cccttttccc atg act act tca acc act act gtg caa cta caa9383

Met Thr Thr Ser Thr Thr Thr Val Gln Leu Gln515 520

gaa gac ctg tca agt ggt gac cag aac gcc cac ccc agt cca age cga9431

Glu Asp Leu Ser Ser Gly Asp Gln Asn Ala Hia Pro Ser Pro Ser Arg

525 * 530 535

gct act cct agt gtt ggt gat act aag gag gat gcg agg gtt gtg ate9479

Ala Thr Pro Ser Val Gly Asp Thr Lys Glu Asp Ala Arg Val Val Ile540 ' 545 550

aaa cta ttt ggt aca tgg gtt gat gtt aca gct tgg ttg aat gac cat9527

Lys Leu Phe Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Trp Leu Asn Asp His555 560 565

cct ggt ggt tet aaa gtg ctc aga gea ttc aac aag aag gac gcg act9575

Pro Gly Gly Ser Lys Val Leu Arg Ala Phe Asn Lys Lys Asp Ala Thr570 575 550 585

gat gct gtt atg gcc atg cac act gat gaa gct ate aag cgc ate ate9623

Asp Ala Val Met Ala Met Kis Thr Asp Glu Ala Ile Lys Arg Ile Ile590 595 600

aga ttt tca aat gtg. gtc tcc. tcg gcc ccc ate aac gcc tet att ggt9671Arg Phe Ser Asn Val Val Ser Ser Ala Pro Xle Asn Ala Ser Ile Gly605 SlO 615

gat gtc cag gtfc att gag asa tct cfca tcg aga gaa cag ttg atg tat9719

Asp Val Gln Val Ile Glu Lys Ser Leu Ser Arg Glu Gln Leu Met Tyr620 625 63D

tac aag ctc cgc act ctt gct aga aac cag ggc tgg ttt caa age aat9767

Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Asn Gln Gly Trp Phe Gln Ser Asn635 640 645

cta tta tat gaà gga gtg aaa gea atg ata gcc ttc ggt ttg etc ate9815

Leu Leu Tyr Glu Gly Val Lys Ala Met Ile Ala Phe Gly Leu Leu Ile650 655 660 665

ate ggg ttt gct act ctc tac ttt gac tat ggt att tgg tca acc gea9863

Ile Gly Phe Ala Thr Leu Tyr Phe Asp Tyr Gly Ile Trp Ser Thr Ala670 675 680

ctg ata ggt ttc gct tgg ttt cag ctg ggg tgg ttg gga cat gac tgg9911

Leu Ile Gly Phe Ala Trp Phe Gln Leu Gly Trp Leu Gly His Asp Trp685 690 695

tca cat cat aca gct cta cct aag tct act act aac tgt gcg aac tac9959

Ser His His Thr Ala Leu Pro Lys Ser Thr Thr Asn Cys Ala Asn Tyr700 705 710

aac gac tat ctt ggc tgg ctt acc ggt ttg gcc aga ggg aat aca ctt10007

Asn Asp Tyr Leu Gly Trp Leu Thr Gly Leu Ala Arg Gly Asn Thr Leu715 720 725

ctg tgg tgg aaa ctg agg cac aat act cat cac gtg ctg acc aat cag10055.

Leu Trp Tirp Lys Leu Arg His Asn Thr His His Val Leu Thr Asn Gln730 735 740 745

tac gag aat gat cct gat att cta act caa cca ccg ttg cat ttt ttc10103

Tyr Glu Asn Asp Pro Asp Ile Leu Thr Gln Pro Pro Leu His Phe Phe750 755 760

gag gac ttc gat gtt ggt aat gtg aac aga tat caa gct gtc tac tac10151

Glu Asp Phe Asp Val Gly Asn Val Asn Arg Tyr Gln Ala Val Tyr Tyr

765 770 775

cta cca atg tta act cta ctg cat cta ttt tgg ttg tac gag tcg gta10199

Leu Pro Met Leu Thr Leu Leu His Leu Phe Trp Leu Tyr Glu Ser Val780 785 790

ttg gtt tgc ttg aga caa agt agg tct att aat aga tac aac cgt atg10247

Leu Val Cys Leu Arg Gln Ser Arg Ser Ile Asn Arg Tyr Asn Arg Met795 BOO B05

cat gcc agg agg gat acc gta gct ttg gta ctt cac ata ctc att gtt10295

His Ala Arg Arg Asp Thr Val Ala Leu Val Leu His Ile Leu Ile Val

310 815 B20 S25

ggc ate ata tcg tac acc agt ggt aag tat ttg ctc ate ctt ctg gcc10343

Gly Ile Ile Ssr Tyr Thr Ser Gly Lys Tyr Leu Leu Ile Leu Leu Ala830 835 840

tac atg qtt agt ggc ttt cta act gct gtt gtt gta ttt gcc age cac10391

Tyx Wet Leu Ser Gly Phe Leu Thr Ala Val Val Val Phe Ala Ser His845 850 BSS

tac aac gag cct agg gta gct tet ggt gaa tcc tta tca ctc gtt cgt10439

Tyr Asn Glu Pro Arg Val Ala Ser Gly Glu Ser Leu Ser Leu Val Arg

860 865 870

cag aca ttg tta acc act ate aat ata ggc tca ttc agt gat act cat10487

Gln Thr Leu Leu Thr Thr Ile Asn Ile Gly Ser Phe Ser Asp Thr His

875 BBO 865

tgg gag aag aag ttg tgg ttc tat cta act ggt ggt ctt aat atg caa10555

Trp Glu Lys Lys Leu Trp Phe Tyr Leu Thr Gly Gly Leu Asn Met Gln

890 895 900 s05

ate gag cat cat ctc ttc cca aca atg ccc cgc cat aat ctt ccg aag2 0583

Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu Pro Lys910 915 920

aca act ttt ctg gtc aag tca cta gcc cag gag cta gga ctg cca tac10631

Thr Thr Phe Leu Val Lys Ser Leu Ala Gln Glu Leu. Gly Leu Pro Tyr• 325 930 , 935

aag gaa acc aac att gtc agt tta acc aag gcg gcc gtt act act ttg10679

Lys Glu Thr Asn Ile Val Ser Leu Thr Lys Ala Ala Val Thr Thr Leu94.0 945 950

cat cat aat gct ctg cgt aac ate gag aga ttg ctt gct aog tag10724 ■ "

His His Asn Ala- Leu Arg Asn Ile Glu Arg Leu Leu Ala Arg.'·■/.' 955 960 " 955

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cgtcatggtc agtagctttc tgatagaatc tttttcatct tcttcctgtt crtqttqa10841 - "atg tct tct ctt acc ctc tac aga ggc ccc ttt tcc cga atg gtg ctc10889

Met Ser Ser Leu Thx Leu Tyr Arg Gly Pro Phe Ser Arg Met Vai Lsu970 975 980

cct cgt cag gaa ate tgc ate aat ggt cgc ata tac gat gtc act gag10937

Pro Arg Gln Glu Ile Cys Ile Asn Gly Arg Ile Tyr Asp Val Thr Glu985 990 995

ttc ate aat cgt cat cca ggt ggt aag att ate ctc ttc caa gtt10982

Phe Ile Asn Arg His Pro Gly Gly Lys Ile Ile Lsu Phe Gln Val1000 1005 1010

ggt gct gat gcc act gat gct ttt cgt gag ttt cat gct aac agt11027

Gly Ala Asp Ala Thr Asp Ala Phe Arg Glu Phe His Ala Gly SerIOlS 1020 1025

gag aag gea gag aag ate ctc aaa acc cta cca tcc cgt gat gat11072

Glu Lys Ala Glu Lys Ile Leu Lys Thr Leu Pro Ser Arg Asp Asp1030 1035 1040

gac ggt act ttc ctt cct tca acc caa cgc tcc ate atg gat gat11117

Asp Gly Tiir Phe Leu Pro Ser Thr Gln Arg Ser Ile Met Aso Asd1045 1050 1055

ttc aaa cgc cta aga gat gac ctc gtc age aga ggt gtc ttc aag11162

Phe Lys Arg Leu Arg Asp Asp Leu Val Ser Arg Gly Val Phe Lys10S0 1065 1070

cca age gtc atg cat gtt gta tac cgc tgc ttg gaa gtc att gct11207

Pro Ser Val Met His Val Val Tyr Arg Cys Leu Glu Val Val Ala

1075 1080 10B5

ctc tat ctc afcfc ggc ttc tat ttg gct ctg tgc acc agt aat gtg11252

Leu Tyr Leu Ile Gly Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Thr Ser Asn Val

109O 1095 1100

tac gtt ggg tgt gct gta ctt ggt gta gct caa ggt cgt gct ggt11297

Tyr Val Gly Cys Ala Val Leu Gly Val Ala Gln Gl y . Arg Ala Gly1105 mo 1115

tgg ttg atg cat gaa gga ggt cat cac tct ctg act ggt aac tgg11342

Trp Leu Met His Glu Gly Gly His His Ser Leu Thr Gly Asn Trp1120 1125 1130

aaa gtt gac cag ttc ctc caa gaa cta ttt ttc age att ogt tat11387

Lys Val Asp Gln Phe Leu Gln Glu Leu Phe Phe Gly Ile Gly Cys1135 1140 1145

ggt atg tca gct gcg tgg tgg cgc aat gca cac aac aag cat cac11432

Gly Met Ser Ala Ala Trp Trp Arg Asn Ala His Asn Lys Eis His1150 1155 1160

gct gct cct cag cat tta ggg aaa gat gtt gat ctc gag aca ttg11477^

Ala Ala Pro Gln His Leu Gly Lys Asp Val Asp Leu Glu Thr Iieu11S5 1170 1175

cct ctg gtc gcc ttc aat aag gcc gta ctt cga ggc cgt cta ccg11522

Pro Leu Val Ala Phe Asn Lys Ala Val Leu Arg Gly Arg Leu Pro1180 1185 1190

tct gtc tgg ate aga tca caa gct gtg tgc ttt gca ccg ata tca11567

Ser Val Trp Ile Arg Ser Gln Ala Val Cys Phe Ala Pro Ile Ser1195 1200 1205

aca cta ctg gta tcg ttc ttt tgg caa ttc tac cta cac ccg agg11612

Thr Leu Leu Val Ser Phe Phe Trp Gln Phe Tyr Leu His Pro Arg

1210 1215 1220

cat att att agg aca ggt cga cga atg gag tct ttc tgg cta ctc11657

His Ile Ile Arg Thr Gly Arg Arg Met Glu Ser Phe Trp Leu Leu

1225 1220 1235

gta cgc tac tta gtt att gtg tac ctc ggg ttc age tat gga ttg11702

Val Arg Tyr Leu Val Ile Val Tyr Leu Gly Phe Ser Tyr Gly Leu

1240 1245 1250

gta tcg gtc ttg tta tgt tac ate gca agt gtg cat gtt ggt ggt11747

Val Ser Val Leu Leu Cys Tyr Ile Ala Ser Val His Val Gly Gly

1255 1250 1255

atg tac ate ttt gta cac ttc gct cta tca cat aca cat tta cct11792

Met Tyr Ile Phe Val His Phe Ala Leu Ser His Thr His Leu Pro1270 1275 1280

gtc att aac cag cat ggt aga gct aac tgg ttg gaa tac gca tct11837

Val Ile Asn Gln His Gly Arg Ala Asn Trp Leu Glu Tyr Ala Ser

1285 1230 1295

aag cac aca gtt aat gtg tca act aac aat tat ttc gtc acatgg11882

Lys His Thr Val Asn Val Ser Thr Asn.Asn Tyr Phe Val Thr Trp

1300 1305 1310

ctc atg agt tat ttg aat tat caa ata gag cat cat ctc ttc ccg11927Leu Met Ssr Tyr Lsu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Pixe Pro1315 1320 1325

tca tgt ccc cag ttt aga ttc ccfc ggt tac gtc agt atg agg gtt11372

Ser Cys Pro Gln Phe Arg Phe Pro Gly Tyr Val Ser Met Axg Val1330 1335 1340

cga gaa ttt ttt cat aag cat gga ttg aag tat aac gag gtc gac12017

Arg Glu Phe Phe His Lys His Gly Leu Lys Tyr Asn Glu Val Gly1345 135D 1355

tat cta cat gca ctc aat ctc aca ttt tca aat ctg gct gct gtt12 062

Tyr Leu His Ala. Leu Asn Leu Thr Phe Ser Asn Leu Ala Ala Val1360 1365 1370

gcc sta gtg gaa tag ctcaatagtg taggagagca tagtagacgc ttatgattgg12117

Ala Ile Val Glu1375

tatgtaaaat caataatgtt tggttgagag tgatcaatgt tttctaccag cggagcacta12177

ataatctgca gcatatacca taacatatcg aaaacfcctgc atttcttata gttctcattc12237

ctagtaagga ccacttcgtc ctagtaatta tcgcccaaca cgggaggaag ttagttcgat12297

gacaaggttg agtatgcctg ctgcaafctac cgtgtctgga ctgaaacgta tcatccctat12357

cgttacaact cattccccgc actctggtgc ataatatgcg cgattcagca ccctttattt12417

ctccccctca acgaccccct cttccgcaca ccgtccttag caggtcaaat ctacccgtca12477

sttatcgtga· taccaccctt gagttgccca actaatacaa ctcaactaca ataagtacac12537

tgcgaatgca tcattaacca tcaacaatat gctcattaaa taataatcta tcatcttcgg12597

acatctcctg ggtgctctcc tcttcactac cggggccagt ctcaatcgat gaccctacta12657

tgggcaáctc tgacgatgac caagatgtta aaacgtgaag ctgtgaatcc aagcactcac12717 -

tcggatcgag aggctcagtt cctctggacc gaactgggct gttcaacatt ccaccagacc12777

ggctatctct caüccatagc agaatgccca cccctatcga tgctgtaccg atgaagaacra12S37agaacttctc tacggctscg taggagccag tggatgaacc tgtcgccgag accaatggcrg12897

acaggaacag tggagcagta tgtaggcgtg gacctcccat attaatgcgt accatcatat12957

gagagttttg ctatgcaagg cttacacacg gattcgaata taagtgtaga aaaaccaatg13017

aaattttccc gattttgctc agaattteca tattgtcagc aacagatgaa gttgaccatg13077

tgcattatct tccatacagg gtacagattc tacggttgca ctatacgata acattggggt13137

gtgatacgac aacactgagc aattgatagg atggaccccc tgagtccggg gccctgagca13197

aagtgcttag atctagagca cagtattgaa gttgaattta cactgaggat tgcatcacta13257

tcaagttgcc accatacacc tcgatcagcc tttgtccact tacgtatatg agccactata13317

acaggcgtaa ccgccaagcc gaagttttgt gcagccgttg taacaccata ggccgcgcct13377

aacagacaaa ccggagtcac aaccatcgat gcagcgatga gtccctggtt ctatccccgg13437

caacatcatt ttaatgtcga aaactcaagt tctacgatga ttgccaatca cacataatgc13497

agcttgttaa. gagatcaagc cagaaattct ccacagcaac ctaccagtct tcctaggagg13557

tactgcagct gctaccaacg gccatactgc agaggcgaac accgtatagg atagccccaa13617

aacggtcata gatatcacct acacaacaac taaacttaga acgaataaag cctcgtaccg13677

ggtgcaatat aggcaggatg atatgtgcca atgtcgccat agtaaaacta gceagaagaa13737

aatagaggcg gtaacccaat ttgtctatgc atataccagc gataggagag cccaatgctg1.3797

acaccccaaa aagtatctga tcgaatattc tccaactaaa tgatcataat aataacgagc13857

cattgaaggt cactcgagag cgatatgagt tgcaccgcca tacggtacga aacagtatca13917

ctatgttgtg ctaatgctca ttccctagca gaatcacaac atagcagaaa agaagggcaa13977

icagttctgc actgcattcg aattacacag gaatgctctc tacaaaaccg ttatacaaat14037caccttggtc aatcgagaga gttcatcaat aactcttgag gggcatgacg tcaataatag14097

tgaáaaacgg ttaacatcat tttactatct actgttgagg gcgacaatat gacaactgfca14157

fcaggaaaaac tgttagtaat tctatatcct tactcccatg atctgtccaa ctttaacatg14217

ggcagccgct ttatccatgg ttggatacca cacctcgacg aaaaatgccg cggcgatgtt14277

attgaaaggc agtataaccg cataggccag cacgcagctg agacatacca accagaagfcc14337

taccgataat gacaatgacg attggagact gagaaaaaag gaagaacttc aacacagtgg14397

tgacaatatt tcgccataag tagccgttat aactgcgcat ttcfccagtag aaaaaccgaa14457

aaatcgtgtt gaaaactgac aaacattctt tcgaataaca aagttaaggt atgtgagagc14517

tccaagccac cactagcatt acttctctat aaagccctga ctgggagctt cctcactagt14577

gatatcatca tcgatgtgct tcgtgaaata acacaacact aacgttagaa taaccgtgcc14637

tgaaaaaagt ccaccgatgg tgacaccata actacgagaa cagcttactt gtcaccgcta14697

taagccccgc tatgaacgct cccgttacct aggaaacata atgtagaaat atatgtgtgg14757

tttcctcagc tgaggtcgta aggttcctca ctacattatg gaaatccaca aacgattttg14817

ggtagaagcg tacapaaacc aacaataagt cctcaaaatt tttccagaat ttccataatt14877

ttaccaacac atgtagttga ccatgtgtat ccatagatag cgataggttc atctcaaaca14937

cttactccat atcgtgcctc tacaccaggt gacagcaaat cgttgagaac cgagccaaat14997

cgggcaactg agaggtttag tcccaatgca aaggcgatct cctgccctcg gaaccagcct15057

gctagaagag tcgtctgtgc cacctgaaga taaaggtata agaggaaggt caccgagagt15117

tccccttaca ttcatgctct ccccgcctag tccgtagatt acccttccta gcagcatagt15177

cctcatagaa aaataatacg acccgacaca ttgtagcgct tgcccgagca ataacagtac15237

cgccagtagg aggagcatgg acctgagcag agcttcttga catgctaaaa ggcctacagg15297

gataaactgc atttttaatg ggagccttcg gaatcttact actacatgag acattgaaaa15357

agtttaggtt tttgcatgga ctttgaagaa ctattccaca cagctacttt aatattcatt15417

gatcacctct gaaatgttgt acaagtttca caaaattcac tcaagtgccg aaacacatca15477

tcacatcata acagcatatc aaacgctcgt tacctcatac caatccactc tatagagact15537

cccagtatta atggcgttac catattgggc agggcataga cggtatataa gagattgaag15597

tagtaggtat attcctcgac agtcataccg ctccctccac ctaaagtagc tgatgcggtc15657

acttctgaca acaacctacc ggtgaatcga gcctgcagtt gatcgtttat cgcggaggga15717

atatcatagg cgtagtactg gccagagagc gctagacagg ccacgatgag aacagcccat15777

cttagttttt caggagggtc gggagtagac ataataaaat catagctacg aaacagaaat15837

tcagccaagt ttgagaaaat accttcccca ggatttgata acaacaggaa aaatgtttat15897

aatgtgatga tgttaaactg attaaagaat gtgttcctag ccgtgtagga aattcaaaat15957

gagtttcact cgggaacatt ctggaagaat cactgcgacg aaagcgatct ggacacagca15017

acgagcagcg gttgactttt cacccgaaac cctcacgaca gtcccttcgc gaaaatcata16077

caggcaaagt ttcatgaaaa aaatgcaatt tttcggtaaa aaacccgcga gaaaaaccgt16137

cagtgatgat tgacgatccg attacaccaa aaatgctgat atttttacgg aaaatttttc16197

cgtaaaagct caggccagcc caggcgtctc gcactgattc atcccttccc ataataacac16257

aattcctcta ctatggacca atacgagtct tagctgtasa gggctaccac cagtagcagâ16317

gccaacágta acagtaagaa aatgatcaac catagaagag atgtagacta aacgcatgaa16377gtgaggccag ggacagctca acagctactc16437

gfcaataatcg ataaaatcaa aacaatgctg16497

actcggtgta aaacgcgata ttcgcgctat16557

tgtttttcat atcactaggg gaaactccaa16617

gcacaaaacg tcataaacca caccaagttc16677

cctctagàat tttcccccac atcatgtcg-t16737

gcgcgcccga ccgaaaagat ctcagaaata16797

tgggcggcac gcttcagacg tgttacgctc1S8S7

tatatttctt atagaatata agaacactga16917

ctattttcaa cctcaagcag tctgattgac16977

gtaggcggta tctgtacact acacagtgag17037

aggcgtcttc gacccgctgg tgtccagggt.17097

attttcaatc tcaaattcag cgaatgaaag17157

tagagtgaca ggaattfctct tcggctgaaa17217

ttgaaaaagfc gtataaaaca accaatatcg17277

fctaaatctta taattttttc actcatgaag17337

atatcatgat tgaacctaat acccgggtga17397

atcacatgga ccacaagctc agtgcgtcaa17457

tatagaactt catcaacaca actgctgcat17517

atctatgaaa ggcagqaacg ataacatagt17577

aatgtgagag tcttcttgaa ttttgccgagtttcacccgt tttacgcgaa gtgacgtaaagcagtagtcg tgaaatatgt ttttcatcagcacattcaca agtagaaagg aacaacaactggttccgtca aattagtatt acgatcgaaccattggctca ctctgcgcca ataatfctagcctcasgccta ccttgcatct gtcgtattaacggcagtgag gattatatgc atattttactcgtactaaac tatacaaacc atgtgttgttagatcccgcg ggaaaacaga caaaagaatggggaactttc agagcccgaa aagtatgctttcgcaacgca acaggctggg aactctacacaacaaattga atagtgaaag ttgatttccaactcatttag cccatgggaa tcaaatgtgaacgatcgagg aattatgtat tctccgatattttctcgaga gcggtataac caggtaaatgacgaccgtat ttcccaaccg tgaatcatcgactgatatac gcctactgta ttcacataacatgtgaaaac ttgaaagtgt cttatcatcacgcatttcta acgactacga acaatgacgtttaatatttt gggaagatca cgatctttac atagtacttg cgcatgagcg acaataaaat17637

cggtctatcg tacgtaacag acaacaattg cttcgaatcg gtaacatcac cgattgaaga17697

gttttaacag gagataa acg atgaagattt acagtatagg fcagccatcaa acsttastaa17757

cagaagagct tatacagccg aatagcatta gcttgttatt ggatagcagt agatagatat17B17

ttctttataa tacttaggcg aattcatcac caaacgcctt gatgaacgaa cttgtctaac17877

tgcttaccag aaaccaagca accaccaata accccagcac accgtattca taacaatcag17937

attcacaacc atcacgatga caccctggaa ccaccatagc ctcaacggga catatcccaa17997

gttgaagaaa ggtggattgg tagagctggt gtagtgagtt aaatgcccag atagagttgt1B057

atacgcaagc gctctgcaac caagctccat cggaacacca gcggcctgca tgatctgcag18117

gaacactggg aacatggcag agacatgtgc agtaatactt gcaaacagat actggaacac18177

atagaaaata gccgtgcaaa tccatacact gccgtaagcc gccacacttg acaacrfccgat18237

cttttcggca aaccactcaa agaagccagt ttccttcaac tcagtagcca acatcagcaa1B297

cacaccgaac caaaggaaca aatcccaagc tccactgtta ttcac18342

<21D> 2

<211> 510

<212:. PRT

<213 b. Perkinsus marinus

<400> 2

Met Gln Val Pro Ala Glu His His Ser Thr Arg Val Ile Ser Ile Cys1 5 10 15

Asp Ile Val Ile Ser Gly Pro Phe Gly Mst Cys Asn His Aso Tyr Ser20 25 3 o"Ala Ser Xle Pró Ala Ser Ser Ser Gly Ser Tiir Arg Arcj Mefc Arg Ls-U35 40 45

Val Ala Tyx Ile Thr Leu Val Ser Ile His Tyr Gln Gln Leu Leu Phe50 55 60

Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Ile Ile Thr Gly Tyr Eis Tyr Tyr Val Ala65 70 75 80

Ala Leu Pro Leu Tyr Asp Ile Ser Ile Ala Leu Ser Val Leu Ser Gly85 90 95

Leu Thr Leu Leu Trp Leu Cys Asn Cys Tyr Tyr Asn Ser Lys Pro Asn100 105 110

Val Phe Cys Ile Asp His Val Glu Phe Asp Ala Pro Pro Ser Trp Lys115 12 0 12 5

Val Ser His Glu Asp Ile Ile Asn Ile Ala Lys Ile Gln Gly Cys Tyr130 135 140

Thr Glu Asp Ser Leu Asn Phe Met Gln Arg Leu Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 1£0

Thr Cys Pro Asp Lys Ser Ala AJLa Tyr Pro Pro Val Val Val Glu Ser165 - .--■■■■ 170 175

Leu Arg Thr Asn Ala Pro Ala Asp Ala Ser Ala Val Asn Thr Arg Glu180 185 ISO

Glu Ala Arg Glu Val Ile Ile Thr Thr Val Lys Asp Leu Leu Lys Lys195 200 205

Thr Gly Val His Pro Lys Ser Ile Asp Tyr Ile Ile Val Asn Cys Ala210 215 220

Met Tyr Asn Pro Thr Pro Ser His Ala Ala Met Ile Val Asn Glu Val225 230 235 240

Gly Met Arg Asn Asp Val Ile Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Met Gly Cys245 250 255

Ser Ala Gly Val Ile Thr Ile Asp Leu Ala Thr Arg Leu Leu Arg Glu250 265 270

Thr Arg Gly Arg AIa Leu Ile Val Ser TtLr Glu Ile Leu Thr Arg Cys275 280 285

Phe Tyr Arg Gly Asn Asp Arg Glu Pro Leu Met Gly Asn Thr Leu Phe290 29S 300

Arg Cys Gly Gly Ala Ala AJLa Leu Leu Ser Ser Leu Pro Lys Asp Leu305 310 315 320

Ser Arg A-Ia Lys Tyr Lys Leu Leu His Thr Val Arg Thr Gln Val Leu325 330 335

Gly Asn Glu Ser Phe Glu Thr Ile Met Glu Thr Asp Asp Ser Thr Lys340 345 350

Pro Asn Ser Ile Val Thr Leu Arg Leu Gln Lys Ser Ile Ile Lys Val355 360 365

Ala Ala Val Ala Ile Lys Gln Asn Phe Thr Lys Leu Ala Tyr Met Val370 375 380

Leu Pro Leu Arg Glu Leu Leu Lys Val Leu Tyr Ser Met Val Thr Met385 390 395 400

Lys Met Arg Arg Lys Ser Ser Lys Glu Gly Arg Glu Leu Tyr Val Pro405 410 415

Asp Phe Arg Lys Gly Thr Asp His Trp Cys Ile Sis Ala Gly Gly Arg420 425 430

Gly Val Leu Asp Thr Leu Gln Asp Ser Leu Gln Leu Ser Asp Tyr Asp435 440 445

Xle Gln Ala Ser Axg Ser Val Leu Tyr Glu Arg Gly Asn Thr Ser Ser450 455 460

Ser Ser Ile Trp Tyr Glu Leu Ala Trp Leu Glu Arg Asp Gln Arg Ile465 470 475 480

Lys Arg Gly Asp Arg Val Leu Gln Leu Ala Phe Gly Ser Gly Phe Lys485 490 435Cys Asa Ser Ser Val Trp Leu Ala Met His Asn Ile Asp Ala500 505 510

<210> 3<211> 457<212> PKT

<213>

Perkinsus marinus

<400> 3

Mefc Tiur Thr Ser Thr Thr Thr Val Gln Leu Gla Glu Asp Leu Ser Ser1 5 10 15

Gly Asp Gln Asn Ala His Pro Ser Pro Ser Arg Ala Thr Pro Ser Val20 25 30

Gly Asp Thx Lys Glu Asp Ala Arg Val Val Ile Lys Leu Phe Gly Tlir35 40 45

Trp Val Asp Val Thr Ala Trp Leu Asn Asp His Pro Gly Gly Ser Lys30 50 55 60

Val Leu Axg Ala Phe Asn Lys Lys Asp Ala Thr Asp Ala Val Met Ala65 70 75 80

Met His Thr Asp Glu Ala Ile Lys Arg Ile Ile Arg Phe Ser Asn ValB5 90 95

Val Ser Ser Ala Pro Ile Asn Ala Ser Ile Gly Asp Val Gln Val Ile100 IOS 110

Glu Lys Ser Leu Ser Arg Glu Gln Leu Met Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr115 120 125

Leu Ala Arg Asn Gln Gly Trp Phe Gln Ser Asn Leu Leu Tyr Glu Gly130 135 140

Val Lys Ala Net Ile Ala Phe Gly Leu Leu lie Ile Gly"Phe Ala Thr145 150 155 160

Leu Tyr Phe Asp Tyr Gly Ile Trp Ser Thr Ala Leu Ile Gly Phe Ala165 170 175Trp Phe Gln Leu Gly Txp Leu Gly His Asp Trp Ser His His Thr Ala180 185 130

Leu Pro Lys Ssr Thx Thr Asn Cys Ala Asn Tyr Asa Asp Tyr Leu Gly135 200 205

Trp Leu Thr Gly Leu Ala Arg Gly Asn Thr Leu Leu Trp Trp Lys Leu210 225 220

Axg His Asn Thr Kis Ris Val Leu Thr Asn Gln Tyr Glu Asn Asp Pro225 230 235 240

Asp Ile Leu Thr Gln Pro Pro Leu His Phe Phe Glu Asp Phe Asp Val245 250 255

Gly Asn Val Asn Arg Tyr Gln Ala Val Tyr Tyr Leu Pro Met Leu Thr260 255 270

Leu Leu His Leu Phe Trp Leu Tyx Glu Ser Val Leu Val Cys Leu Arg275 ZBO 285

Gln Ser Arg Ser Xle Asn Arg Tyr Asxi Axg Met His Ala Arg Arg Asp290 255 300

Thr Val Ala Leu Val Leu His Ile Leu Ile Val Gly Ile Ile Ser Tyr305 3X0 315 320

Thr Ser Gly Lys Tyr Leu Leu Ile Leu Leu Ala Tyr Met Leu Ser Gly325 330 335

Phe Leu Thr Ala Val Val Val Phe Ala Ser His Tyr Asn Glu Pro Arg340 345 350

Val Ala Ser Gly Glu Ser Leu Ser Leu Val Axg Gln Thr Leu Leu Thr355 360 365

Thx Ile Asn Ile Gly Ser Phe Ser Asp Thr His Trp Glu Lys Lys Leu370 375 380

Trp Phe Tyr Leu Thr Gly Gly Leu Asn Met Gln Ile Glu His His Leu365 390 355 400

Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu Pro Lys Thr Thr Phe Leu Val405 410 415Lys Ser Leu Ala Gln Glu Leu Gly Leu Pro Tyr Lys Glu Thr Asn Xle420 425 430

Val Ser Leu Thr Lys Ala Ala Val Thr Thr Leu His Hls Asn Ala Leu435 440 445

Arg Asn Ile Glu Arg Leu Leu Ala Arg450 455

<210s> 4

<211> 411

<212 > PRT

<213 > Perkinsus marinus

<400> 4

Met Ser Ser Leu Thr Leu Tyr Arg Gly Pro Phe Ser Arg Met Val Leu1 5 10 15

Pro Arg Gln Glu Ile Cys Ile Asn Gly Arg Ile Tyr Asp Val Thr Glu20 25 30

Phe Ile Asn Arg His Pro Gly Gly Lys Ile Ile Leu Phe Gln Val Glv35 40 45

Ala Asp Ala Thr Asp Ala Phe Arg Glu Phe His Ala Gly Ser Glu Lys50 55 60

Ala Glu Lys lie Leu Lys Thr Leu Pro Ser Arg Asp Asp Asp Gly Thr55 7 0 7 S 80

Phe Leu Pro Ser Thr Gln Arg Ser Ile Met Asp Asp Phe Lys Arg Leu85 90 95

Arg Asp Asp Leu Val Ser Arg Gly Val Phe Lys Pro Ser Val Met His100 105 no

Val Val Tyr Arg Cys Leu Glu Val Val Ala Leu Tyr Leu Ile Gly Phe115 120 125

Tyr Leu Ala Leu Cys Thr Ser Asn Val Tyr Val Gly Cys Ala Val Leu130 135 140

Gly Val Ala Gln Gly Arg Ala Gly Trp Leu Met His Glu Gly Gly His145 150 ~ 155 160

His Ser Leu Thr Gly Asn Trp Lys Val Asp Gln Phe Leu Gln Glu Leu155 170 175

Phe Phe Gly Ile Gly Cys Gly Met Ser Ala Ala Trp Trp Arg Asn AlaIBO 185 ISO

His Asn Lys His His Ala AIa Pro Gln His Leu Gly Lys Asp Val Asd195 200 205

Leu Glu Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Lys Ala Val Leu Arg Gly210 215 220

Arg Leu Pro Ser Val Trp Ile Arg Ser Gln Ala Val Cys Phe Ala Pro225 230 235 240

Ile Ser Thr Leu Leu Val Ser Phe Phe Trp Gln Phe Tyr Leu His Pro245 250 255

Arg His ale Ile Arg Thr Gly Arg Arg Met Glu Ser Phe Trp Leu Leu260 265 270

Val Arg Tyr Leu Val Ile Val Tyx Leu. Gly Phe Ser Tyr Gly Leu Val275 280 285

Ser Val Leu Leu Cys Tyr Ile Ala Ser Val His Val Gly Gly Het Tyr290 295 30D

Ile Phe Val His Phe Ala Leu Ser His Thr His Leu Pro Val Ile Asn305 310 315 320

Gln His Gly Arg Ala Asn Trp Leu Glu Tyr Ala Ser Lys His Thr Val325 330 335

Asn Val Ser Thr Asn Asn Tyr Phe Val Thr Trp Leu Met Ser Tyr Leu340 345 350

Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Ser Cys Pro Gln Phe Axg355 350 365Phs ?το Gly Tyr Val Ssr Met Arg Val Arg Glu Plie Phe His Lys Eis370 375 380

Gly Leu Lys Tyr Asn Glu Val Gly Tyr Lsu His Ala Leu Asa Leu Thr3BS 390 395 400

Phe Ser Asn Leu Ala Ala Val Ala Ile Val GlU405 410

<210> 5<211> 27<212> DNA

<2i3> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Iniciador de seqüência

<400> 5

atgcaagttc ccgcggagca tcactcc27

<210> S

<211> 31

<212> DKTA

<2i3> Seqüência Artificial

<220>

<223> iniciador de seqüência

<400> 6

cgttacgcat caatattatg catagccaac c31

<210> 7

<211> 2 6

<212> DNA

<213 > Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de seqüência com sitios de restrição para clonagem em vetor de expressão de levedura

<400> 7

ttggtaccat gggatttcct gcggag25

<210> B

<211> 32

<212> DKA

<213 > Seqüência Artificial<220>

<221> Iniciador de seqüência

<400> 6

gggagctctt acgcatcaat Bttatgcata gc32

<210> 9

<211> 1533

<212> DKA

<213> Perkinsusmarinus<220 >

<221> C2DS

<222> (1) . . (1533)

<223>

<400> 3

atg cgs ttt cct gcg gag cgt cac ttc Sct cgg gtt ata tct ate tgt43

Met Aro ^he Pro Rla Glu Arg His Pbe Thr Pjrg Val Ile Ser Ile Cys5 10 15

gat ate ate ate tca gge eco ttt gga atg tgt aae cat gat tac tcc

96Asp Ile Ile Ile Ser Gly Pro Phe Gly Met Cys Asn His Asp Tyr Ser20 25 30

tct tct ata cct gcc tct tgt agt ggt age act cga cgc atg cgt ttg

144

Ser Ser Ile Pro Ala Ser Cys Ser Gly Ser Thr Arg Arg Met Arg Leu35 40 45

gta gcc tac ate aca ttg gtc tct ate cac tat caa cag cta ctc ttt192

Val Ala Tyr Ile Thr Leu Val Ser Ile His Tyr Gln Gln Leu Leu PheSO 55 60

tac tct tct ate gta act cta ate act ggc tat cac tac tat gtc gea240

Tyr Ser Ser Ile Val Thr Leu Ile Thr Gly Tyr His Tyr Tyr Val Ala

65 70 75 80

gct ctg ccc ctt tac gac ata tca ctt gct cta tct gtg ctt tcg gga2B8

Ala Leu Pro Leu Tyr Asp Ile Ser Leu Ala Leu Ser Val Leu Ser Gly85 90 95

ata acg cta ctt tgg tta tgt aat tgc tat tac aac age aag ccc aat336

Ile Thr Leu Leu Trp Leu Cys Asn Cys Tyr Tyr Asn Ser Lys Pro Asn100 105 110

gta ttc tgc ate gat cat gct gag ttt gac gct ccc ccc tct tgg aag384

Val Phe Cys Ile Asp His Ala Glu Phe Asp Ala Pro Pro Ser Trp Lys115 120 125

gtc age cat gaa gac ate ate aac att gcc aag ata caa ggt tgc tac432

Val Ser His Glu Asp Ile Ile Asn Ile Ala Lys Ile Gln Gly Cys Tyr130 135 140

acg gaa gat tca ctc aac ttc atg cag cgt ctt ctc gaa agg tct ggt4B0

Thr Glu Asp Ser Leu Asn Phe Met Gln Arg Leu Leu Glu Arg Ser Gly.

145 150 155' 160

act tgc cct ggt aag agt act gct tac cct cca gtg gtt gtt gag tca528

Thr Cys Pro Gly Lvs Ser Ala Ala Tyr Pro Pro Val Val Val Glu Ser165 170 175

ttg agg act aac gcc ccc gct gat gcc tct gct gtc aat act aga gag576

Leu Arg Tiir Asn Ala Pro Ala Asp Ala Ser Ala Val Asn Thr Arg Glu180 185 190

gaa gcg agg gaa gtg ate ata act acg gtc asa gat ctg ctt aag aag624

Glu Ala Arg Glu Val He Ile Thr Thr Val Lys Asp Leu Leu Lys Lys195 200 205

act ggt gtg cat cct aaa tct att gac tat ate ate gtc aat tgc gccS72

Thx Gly Val His Pro Lys Ser Ile Asp Tyr Ile Ile Val Asa Cys Ala210 215 220

atg tac aac ccg aca ccg tca cat gct gct atg ata gtg aat gaa gtc720

Met Tyr Abh Pro Tlir Pro Ser His Ala Ala Met Ile Val Asn Glu Val

225 230 235 240

ggt atg agg aat gac gtc ato acc tat aac ctc agt ggt atg ggg tgt768

Gly Met Arg Asn Asp Val Ile Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Met Gly Cys245 250 255

agt gcc ggt gtt ato aca att gat cta gca acg cgt ctg ttg aga gag816

Ser Ala Gly Val Ile Thr Ile Asp Leu Ala Thr Arg Leu Leu Arg Glu260 265 270

acc aga ggt agg gca ctg att gtg tca act gag ata cta act cgt tgcB64

Thr Arg Gly Arg Ala Leu Ile Val Ser Thr Glu Ile Leu Thr Arg Cys275 280 285

ttc tat cgt ggt aat gat cgt gaa cca ctg atg ggt aac aca tta ttc912

Phe Tyr Arg Gly Asn Asp Arg Glu Pro Leu Met Gly Asn Thr Leu Phs290 295 300

aga tgt ggt ggt gct gct gct ttg cta tcg tca ttg cct aaa gac tta960

Arg Cys Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Pro Lys Asp Leu205 310 315 320

tct cgt ggt aaa tat aag ttg tta cat acc gta aga acg. caa gtt ctc100 8

Ser Arg Gly Lys Tyr Lys Leu Leu His Thr Val Arg Thr Gln Val Leu

325 330 335

ggt aat gag agt ttt gaa acg att atg gag act gat gac age acc aag1055

Gly Asn Glu Ser Phe Glu Thr Ile Met Glu Thr Asp Asp Ser Thr Lys340 345 ~ 350

ccc aac age att gtt aca ctc agg ctc cag aag aat att ate aaa gtt1104

Pro Asn Ser Ile Val Thr Leu Arg Leu Gln Lys Ser Ile Ile Lys Val355 360 365

gct gct gtt gct att aaa caa aat ttt act aag ctt gct tat gtg gtt1152

Ala AJLa Val Ala Ile Lys Gln Asn Phe Thr Lys Leu Ala Tyr Val Val370 375 380

ctg -cct ctg aga gaa ctg ttg aag gtc gta tat tcg atg gtg atg atg.1200

Leu Pro Leu Arg Glu Leu Leu Lys Val Val Tyr Ser Met Val Met Met385." 390. 395 400aag atg agg agg aag tcg tca aaa gaa ggt cgt gag ttg tac gta cct1248

Lys Met Arg Arg Lys Ssr Ser Lys Glu Gly Arg Glu Leu Tyx Val Pro405 410 415

gat ttt aga aag ggc att gat cat tgg tgt att cat gct ggt ggc cgt1296

Asp Phe Arg Lys Gly Xle Asp His Trp Cys Ile His Ala Gly Gly Arg420 425 430

ggt gta ttg gat acc tta caa gat tct etc cag cta tca gac tat gat1344

Gly Val Leu Asp Thr Leu Gln Asp Ser Leu Gln Leu Ser Asp Tyr Asp435 440 445

ate caa gea age cgt agt gtt ctt tat gag aga ggc aac acc agt aac1392

Ile Gln Ala Ser Arg Ser Val Leu Tyr Glu Arg Gly Asn Thr Ser Ser450 455 460

agt age ata tgg tat gag ttg gea tgg ctc gaa cgt gac caa cgt att1440

Ser Ser Ile Trp Tyr Glu Leu Ala Trp Leu Glu Arg Asp Gln Arg Ile

455 470 475 480

aag cgt gga gat agg gta tta cag gtg gct ttt ggt agt ggt ttc aaa1488

Lys Arg Gly Asp Arg Val Leu Gln Val Ala Phe Gly Ssr Gly Phe Lys485 490 495

tgt aac tca tca gta tgg ttg gct atg cat aat att gat gcg taa1533

Cys Asn Ser Ser Val Trp Leu Ala Met His Asn Ile Asp Ala500 505 510

<210> 10

<211> 510

<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<400> 10

Met Arg Phe Pro Ala Glu Arg His Phe Thr Arg Val Ile Ssr Ile Cys

1 5 10 15

Asp Ile Ile Ile Ser Gly Pro Phe Gly Met Cys Asn His Asp Tyr Ser20 25 30

Ser Ser Ile Pro Ala Ser Cys Ser Gly Ser Thr Arg Arg Met Ara Leu35 40 45

Val Ala Tyr Ile Thr Leu Val Ser Ile His Tyx Gln Gln Leu Leu Phe50 55 60

Tyr Ser Ser Ile Val Thr Leu Ile Thr Qly Tyx His Tyr Tyr Val Ala65 70 75 80

Ala Leu Pro Leu Tyr Asp Ile Ser Lsu Ala Leu Ser Val Leu Ser Gly85 SO 95

Ile Thr Leu Leu Trp Leu Cys Asn Cys Tyr Tyr Asn Ser Lys Pro Asn100 105 110

Val Phe Cys Ile Asp His Ala Glu- Phe Asp Ala Pro Pro Ser Trp Lys115 120 125

Val Ser His Glu Asp Ile lie Asn Ile Ala Lys Ile Gln Gly Cys Tyr130 135 140

Thr Glu Asp Ser Leu Asn Phe Met Gln Arg Leu Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 ISO

Thr Cys Pro Gly Lys Ser Ala Ala Tyr Pro Pro Val Val Val Glu Ser155 170 175

Leu Arg Thr Asn Ala Pro Ala Asp Ala Ser Ala Val Asn Thr Arg Glu180 185 150

Glu Ala Arg Glu Val Ils Ile Thr Thr Val Lys Asp Leu Leu Lys Lys135 200 205

Thr Gly Val His Pro Lys Ser Ile Asp Tyr Ile Ile Val Asn Cys Ala210 215 220

Met Tyr Asn Pro Thr Pro Ser Eis Ala Ala Met Ile Val Asn Glu Val225 230 235 240

Gly Met Arg Asn Asp Val Ile Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Met Gly Cys245 250 255

Ser Ala Gly Val Ile Thr Ile Asp Leu Ala Thr Arg Leu Leu Arg Glu260 265 270Tb.x Arg Gly Arg Ala Leu Ils Val Ser Tiir Glu Ile Leu Tlir Arg Cys275 280 285

Pbe Tyr Arg Gly Asn Asp Arg Glu Pro Leu Met Gly Asn Thr Leu Phe290 295 300

Arg Cys Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Ssr Ser Leu Pro Lys Asp Leu305 310 315 320

Ser Arg Gly Lys Tyr Lys Leu Leu His Thr Val Arg Thr Gln Val Leu325 330 335

Gly Asn Glu Ser Phe Glu Thr Ile Met Glu Thr Asp Asp Ser Thr Lys340 345 350

Pro Asn Ser Ile Val Thr Leu Arg Leu Gln Lys Ser Ile Ile Lys Val355 360 365

A_la Ala Val Ala Ile Lys Gln Asn Phe Thr Lys Leu Ala Tyr Val Val370 375 380

Leu Pro Leu Arg Glu Leu Leu Lys Val Val Tyr Ser Met Val Met Met385 390 395 400

Lys Met Arg Arg Lys Ser Ser Lys Glu Gly Arg Glu Leu Tyr Val Pro405 410 4X5

Asp Phe Arg Lys Gly Ile Asp His Trp Cys Ile His Ala Gly Gly Arg420 425 430

Gly Val Leu Asp Thr Leu Gln Asp Ser Leu Gln Leu Ser Asp Tyr Asp435 440 445

Ile Gln Ala Ser íürg Ser Val Leu Tyr Glu Arg Gly Asn Thr Ser Ser450 455 460

Ser Ser Ile Trp Tyr Glu Leu Ala Trp Leu Glu Arg Asp Gln Arg Ile465 470 475 480

Lys Arg Gly Asp Arg Val Leu Gln Val Ala Phe Gly Ser Gly Phe Lys485 450 * 495

Cys Asn Ser Ser Val Trp Leu Ala Met His Asn Ile Asp Ala500 505 510

Claims

1. Seqüência de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fatode que codifica um polipeptídeo com atividade de Δ9 - elongase e que é se-lecionada a partir do grupo consistindo em:a) uma seqüência compreendendo resíduos de ácido nucléico-7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9;b) uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico compreendendo resíduos-7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9;c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que, codifica um po-lipeptídeo com atividade de A9-elongase, em que o polipeptídeo compreen-de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10;d) um derivado de uma seqüência compreendendo resíduos deácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9 que codificaum polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade no nível de aminoácidocom SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; em que o referido polipeptídeo tematividade de A9-eiongase.

2. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que é codificado poruma seqüência de ácido nucléico, como definida na reivindicação 1.

3. Construto de gene, caracterizado pelo fato de que compreen-de uma seqüência de ácido nucléico, como definida na reivindicação 1, ope-ravelmente ligados a uma ou mais seqüências reguladoras.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende ácido nu-cléico, como definido na reivindicação 1, ou um construto de gene, comodefinido na reivindicação 3.

5. Organismo não humano transgênico, caracterizado pelo fatode que compreende pelo menos um ácido nucléico, como definido na reivin-dicação 1, um construto de gene, como definido na reivindicação 3, ou umvetor, como definido na reivindicação 4.

6. Organismo não humano transgênico de acordo com a reivin-dicação 5, caracterizado pelo fato de que o organismo é um microorganismo,um animal não humano ou uma planta.

7. Organismo não humano transgênico de acordo com a reivin-dicação 6, caracterizado pelo fato de que o organismo é uma planta.

8. Processo para a conversão de ácido linoléico ou um derivadodo mesmo em ácido araquidônico ou um derivado do mesmo em um orga-nismo, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em um orga-nismo que compreende ácido linoléico pelo menos uma seqüência de ácidonucléico compreendendo:uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipeptí-deos com atividade de A9-elongase, A8-dessaturase e A5-dessaturase, emque os polipeptídeos são selecionados a partir do grupo consistindo em SEQID NOS 2, 3 e 4, e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que incluindo ainda a etapa adicional de converter o ácido aracdôni-co em um ácido graxo ω3 introduzindo-se no organismo um ácido nucléicocodificando uma ω3 dessaturase e opcionalmente uma A5-elongase, e/ouuma A4-elongase e/ou uma A4-dessaturase.

10. Processo para a conversão de 18:2Δ9,12 (ácido linoléico) em-20:2a11·14, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em um or-ganismo que compreende ácido linoléico pelo menos uma seqüência de áci-do nucléico que codifica um polipeptídeo que tem atividade de A9-elongasee que compreende:a) uma seqüência compreendendo resíduos de ácido nucléico-7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9;b) uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condiçõesrigorosas com uma seqüência de ácido nucléico compreendendo resíduos-7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9;c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que, codifica um po-lipeptídeo com atividade de Δ9 - elongase, em que o polipeptídeo compre-ende SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10;d) um derivado de uma seqüência compreendendo resíduos deácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9 que codificaum polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade no nível de aminoácidocom SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; em que o referido polipeptídeo tematividade de A9-elongase; e expressando a referida seqüência de ácido nu-cléico.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8a 10, caracterizado pelo fato de que inclui ainda a etapa de indução com ga-lactose.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8a 11, caracterizado pelo fato de que o organismo é um microorganismo, umanimal não humano ou uma planta.