BRPI0707944B1

BRPI0707944B1 - construto de gene, vetor, microrganismo transgênico e processos para a conversão de 18:29,12 (ácido linoléico) em 20:211,14

Info

Publication number: BRPI0707944B1
Application number: BRPI0707944A
Authority: BR
Inventors: Napier Johnathan; Venegas Caleron Monica; Sayanova Olga
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh; Rothamsted Res Ltd
Priority date: 2006-02-16
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2017-04-11
Also published as: AU2007216359B2; WO2007093776A2; ES2367220T3; CA2641425A1; CA3006116A1; CN101421399B; US8119861B2; CN101421399A; CA2641425C; CA3006116C; AU2007216359A1; WO2007093776A3; US20090019559A1; EP2380984A3; EP2380984A2; DK1984502T3; AR059554A1; EP1984502B1; EP1984502A2; BRPI0707944A2

Abstract

ácido nucléico. a presente invenção refere-se ao ácido nucléico derivado de perkinsus marinus que codifica uma enzima de 9-elongase, uma <30>8- dessaturase e <30>5-dessaturase. todas as seqúéncias de codificação podem ser transcritas como uma única transcrição.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRUTO DE GENE, VETOR, MICRORGANISMO TRANSGÊNICO E PROCESSOS PARA A CONVERSÃO DE 18:2Δ912 (ÁCIDO LINOLÉICO) EM 20:2Δ11’14". A presente invenção refere-se ao ácido nucléico derivado de Perkinsus marinus que codifica um 9-elongase, A8-dessaturase e uma enzima de A5-dessaturase. Todas as sequências de codificação podem ser transcritas como uma única transcrição, que simplifica o processo de transformação de células requerido para expressar todas as três proteínas. A invenção também refere-se às sequências de codificação individuais e às proteínas codificadas por estas sequências como também a um processo para converter o ácido linoléico em ácido araquidônico.

Os ácidos graxos e triacilglicerídeos têm uma multiplicidade de aplicações na indústria alimentícia, em nutrição animal, em cosméticos e no setor farmacológico. Dependendo se eles são ácidos graxos saturados ou não saturados ou então triacilglicerídeos com um conteúdo elevado de ácidos graxos saturados ou não saturados, eles são adequados para muitas aplicações diferentes. Os ácidos graxos poliin-saturados, tal como ácido linoléico e ácido linolênico são essenciais para mamíferos, uma vez que eles não podem ser produzidos pelos mesmos. Os ácidos graxos ω3 e ácidos graxos ω6 poliinsaturados são então um componente importante na nutrição animal e humana. A seguir, os ácidos graxos poliinsaturados são referidos como PUFA, PUFAs, LCPUFA ou LCPUFAs (ácidos graxos poliinsaturados, PUFA, ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, LCPUFA).

Os vários ácidos graxos e triglicerídeos são principalmente obtidos de microorganismos tal como Mortierella e Schizochytrium ou de plantas produtoras de óleo, tal como soja, óleo de semente de col-za, algas tal como Crypthecodinium ou Phaeodactylum e outros, onde eles são obtidos, como uma regra, na forma de seus triacilglicerídeos Segue-se folha 1 a (= triglicerídeos = trigliceróis). Entretanto, eles também podem ser obtidos de animais, tal como, por exemplo, peixe. Os ácidos graxos livres são preparados vantajosamente através de hidrólise. Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, tal como, ácido docosae-xanóico (= DHA, C22:6_4,7,10,13,16,19), ácido eicosapentanóico (= EPA, C20:5A5'8’η14’17), ácido araquidônico (= ARA, C20:4A5'8’11·14), ácido di-homo-y-linolênico (C20:3A8, 11, 14) ou ácido de docosapentanóico (DPA, C22:5A7'10’13,16,19), não são sintetizados em colheitas de óleo, tal como óleo de semente de colza, soja, girassol ou açafroa. As fontes naturais convencionais destes ácidos graxos são peixes, tal como arenque, salmão, sardinha, peixe vermelho, enguia, carpa, truta, hipoglosso, cavala, zander ou atum, ou algas.

Dependendo do uso pretendido, os óleos com ácidos graxos saturados ou não saturados são preferidos. Em nutrição humana, por exemplo, os lipídios com ácidos graxos não saturados, especificamente ácidos graxos poliinsaturados, são preferidos. Os ácidos u)3-graxos poliinsaturados são ditos ter um efeito positivo no nível de colesterol no sangue e desse modo na possibilidade de prevenir doença cardíaca. O risco de doença cardíaca, acidente vascular cerebral ou hipertensão pode ser reduzido notadamente adicionando-se estes ácidos u)3-graxos à comida. Além disso, os ácidos ω3-graxos têm um efeito positivo em processos inflamatórios, especificamente em processos cronicamente inflamatórios, em associação com doenças i-munológicas, tal como artrite reumática. Eles são então adicionados aos comestíveis, especificamente aos comestíveis dietéticos, ou são empregados em medicamentos. Os ácidos graxos u>6 tal como ácido araquidônico tendem a ter um efeito negativo nestes distúrbios com relação a estas doenças reumáticas por causa do influxo dietético habitual. Ácidos graxos ω3 e ω6 são precursores de hormônios de tecido, conhecidos como eicosanóides, tal como o prostaglandinas que são derivadas de ácido di-homo-hinolênico, ácido araquidônico e ácido eicosapenta-nóico, e dos tromboxanos e leucotrienos que são derivados de ácido araquidônico e ácido de eicosapentanóico. Os eicosanóides (conhecidos como as séries PG2) que são geralmente formados de ácidos u>6-graxos promovem as reações inflamatórias, ao mesmo tempo em que os eicosanóides (conhecidos como as séries PG3) de ácidos graxos ω3 têm pouco ou nenhum efeito pró-inflamatório.

Devido às características positivas dos ácidos graxos poliinsatu- rados, não houve nenhuma falta de tentativas no passado para fabricar genes disponíveis que estão envolvidos na síntese destes ácidos graxos ou triglicerídeos para a produção de óleos em vários organismos com um conteúdo modificado de ácidos graxos não saturados. Desse modo, WO 91/13972 e sua U.S. equivalente descreve uma A9-dessaturase. WO 93/1 1245 reivindica uma A15-dessaturase e WO 94/11516 uma Δ12-dessaturase. Por exemplo, dessaturases adicionais são descritas nos EP-A-O 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey e outros, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wa-da e outros, Nature 347, 1990: 200-203 ou Huang e outros, Lipids 34, 1999: 649-659. Entretanto, a caracterização bioquímica das várias dessaturases tem sido insuficiente até hoje uma vez que as enzimas, sendo proteínas ligadas à membrana, apresentam grande dificuldade no seu isolamento e caracterização (McKeon e outros, Methods in Enzymol. 71, 1981: 1214112147, Wang e outros, Plante Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Como uma regra, as dessaturases ligadas à membrana são caracterizadas por serem introduzidas em um organismo adequado que é subseqüentemente analisado quanto à atividade de enzima analisando-se os materiais de partida e os produtos. Δ6-Dessaturases são descritas nos WO 93/06712, U.S. 5.614.393, US5614393, WO 96/21022, WO 00/21557 e WO 99/27111 e a aplicação para a produção de ácidos graxos em organismos transgênicos é descrita nos WO 98/46763, WO 98/46764 e WO 98/46765. Neste contexto, a expressão de várias dessaturases e a formação de ácidos graxos poliinsatu-rados, é também descrita e reivindicada no WO 99/64616 ou WO 98/46776. Com respeito à expressão eficácia de dessaturases e seu efeito na formação de ácidos graxos poliinsaturados, deve ser notado que a expressão de uma única dessaturase como descrito até hoje somente resultou em baixos conteúdos de ácidos graxos não saturado /lipídeos tal como, por exemplo, ácido γ-linolênico e ácido estearidônico. Além disso, uma mistura de ácidos graxos u>3 e ω6 foi obtida, como uma regra.

Os microorganismos especialmente adequados para a produção de PUFAs são microalgas tal como espécies de Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium, espécies de Thraustochytrium, espécies de Schizochytrium ou espécies de Crypthecodinium, ciliados tais como Stylonychia ou Colpidium, fungos tais como Mortierella, Entomophthora ou Mucor e/ou musgos tais como Physcomitrella, Ceratodon e Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto e outros (1998) Appl. Biochemistry e Biotechnology 73: 269-278). A seleção de cepa resultou no desenvolvimento de várias cepas mutantes dos microorganismos em questão que produzem uma série de compostos desejáveis incluindo PUFAs. Entretanto, a mutação e seleção de cepas com uma produção melhorada de uma molécula particular tal como os ácidos graxos poliinsaturados, é um processo demorado e difícil. Isto é por que os métodos recombinantes como descrito acima são preferidos sempre que possível.

Porém, somente quantidades limitadas dos ácidos graxos poliinsaturados desejados tais como DPA, EPA ou ARA podem ser produzidas com a ajuda dos microorganismos acima mencionados, e, dependendo do microorganismo usado, estes geralmente são obtidos como misturas de ácido graxo de, por exemplo, EPA, DPA e ARA.

Uma variedade de séries de reação sintéticas está sendo descrita pela síntese de ácido araquidônico, ácido de eicosapentanóico (EPA) e ácido docosaexanóico (DHA) (figura 1). Desse modo, são produzidos EPA ou DHA em bactérias marinhas tal como Vibrio sp. ou Shewanella sp. pelas séries de reação de policetídeo (Yu, R., e outros, Lipids 35:1061-1064, 2000; Takeyama, H., e outros, Microbiology 143:2725-2731,1997).

Uma estratégia alternativa é a atividade alternada de dessatura-ses e elongases (Zank, T.K. e outros, Plant Journal 31:255-268, 2002; Saku-radani, E., e outros, Gene 238:445-453, 1999). Uma modificação da série de reação descrita acima por A6-dessaturase, A6-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase e A4-dessaturase é a série de reação de Sprecher (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486:219-231) em mamíferos. Em vez da Δ4-dessaturação, uma outra etapa de alongamento é efetuado aqui para produzir C2A, seguido por uma outra A6-dessaturação e finalmente β-oxidação para produzir o comprimento de cadeia C22. Desse modo, o que é conhecido como série de reação de Sprecher (veja figura 1) é, entretanto, não adequado para a produção em plantas e microorganismos uma vez que os mecanismos reguladores não são conhecidos.

Dependendo do seu padrão de dessaturação, os ácidos graxos poliinsaturados podem ser divididos em duas classes grandes, viz. Ácidos graxos ω6 ou ω3, que diferem com respeito às suas atividades metabólicas e funcionais (figura 1). O material de partida para a série de reação metabólica w6éo ácido linoléico de ácido graxo (18:2Δ9,12) ao mesmo tempo em que a série de reação ω3 prossegue através de ácido linolênico (18:3Δ9,12,15). O ácido lino-lênico é formado pela atividade de uma dessaturase ω3 (Tocher e outros 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117; Domergue e outros 2002, Eur. J. Bio-chem. 269, 4105-4113).

Os mamíferos, e desse modo também os humanos, não têm nenhuma atividade de dessaturase correspondente (Δ12 - e Δ oo3-dessaturase) e têm que absorver estes ácidos graxos (ácidos graxo essenciais) pela comida. Começando com estes precursores, os ácidos graxos poliinsaturados fisiologicamente importantes ácido araquidônico (= ARA, 20:4Δ5,8,11,14), um ácido graxo ω6 e os dois ácidos eicosapentanóicos de ácidos graxos ω3 (= ΕΡΑ, 20:5δ5’8’11' h 17) e ácido docosaexanóico (DHA, 22:6Δ4'7’10'13’17’19) são sintetizados pela seqüência de reações de dessaturase e elongase. A aplicação de ácidos graxos ω3 mostra a atividade terapêutica descrita acima no tratamento de doenças cardiovasculares (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108), Entzündungen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345358) e Arthritis (Cleland e James 2000, J., Rheumatol. 27, 2305-2307). O alongamento de ácidos graxo, através de elongases, através de 2 ou 4 átomos de C é de importância crucial para a produção de C20 - e C22-PUFAS, respectivamente. Este processo prossegue por 4 etapas. A primeira etapa é a condensação de malonil-CoA com 0 ácido graxo-acil-CoA através de cetoacil-CoA sintase (KCS, a seguir chamado elongase). Isto é seguido por uma etapa de redução (cetoacil-CoA reductase, KCR), uma eta- pa de desidratação (desidratase) e uma etapa de redução final (enoil-CoA reductase). Foi postulado que a atividade de elongase afeta a especificidade e taxa do processo inteiro (Millar e Kunst, 1997 Plant Journal 12:121-131).

Houve um número grande de tentativas no passado para obter genes de elongase. Millar e Kunst, 1997 (Plant Journal 12:121-131) e Millar e outros, 1999, (Plant Cell 11:825-838) descreve a caracterização de elon-gases de planta para a síntese de ácidos graxo de cadeia longa monoinsatu-rados (C22:1) e para a síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa para a formação de ceras em plantas (C28-C32). As descrições com respeito à síntese de ácido araquidônico e EPA, são encontradas, por exemplo, nos WO0159128, W00012720, W002077213 e W00208401. A síntese de ácidos C24-graxos poliinsaturados é descrita, por exemplo, em Tvrdik e outros 2000, JCB 149:707-717 ou W00244320.

As plantas mais altas compreendem ácidos graxos poliinsaturados tal como ácido linoléico (18:2Δ9,12) e ácido linolênico (18:3Δ9,12,15). ARA, EPA e DHA não são encontrados no óleo de semente de plantas mais altas, ou somente em quantidades pequenas (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Vegetales [New Dictionary of Vegetable Oils]. Technique & Documentation - Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Porém, a produção de LCPUFAs em plantas mais altas, preferivelmente em colheitas de óleo tal como óleo de semente de colza, linhaça, girassol e soja, seria vantajosa uma vez que quantidades grandes de LCPUFAs de alta qualidade para a indústria alimentícia, nutrição animal e propósitos farmacêuticos poderíam ser obtidos economicamente. Para este fim, é vantajoso introduzir, em colheitas de óleo, genes que codificam enzimas da biosíntese de LCPUFA por métodos recombinantes e para expressá-los aqui. Estes genes podem codificar, por exemplo, A9-elongases, Δδ-dessaturases e/ou Δδ-dessaturases. Estes genes podem ser isolados vantajosamente de microorganismos e plantas mais baixas que produzem LCPUFAs e os incorporam nas membranas ou triacilglicerídeos. Desse modo, já foi possível isolar os genes de Δ6-dessaturase do musgo Physcomitrella patens e genes de A6-elongase de P. patens e do nematódeo C. elegans.

As primeiras plantas transgênicas que compreendem e expressam os genes que codificam enzimas de biossíntese de LCPUFA e que, como uma conseqüência, produzem LCPUFAs foram descritas pela primeira vez, por exemplo, na Patente DE-A-102 19 203 (processo para a produção de ácidos graxos poliinsaturados em plantas). Porém, estas plantas produzem LCPUFAs em quantidades que requerem otimização adicional para processar os óleos que estão presente nas plantas.

Como pode ser visto da Figura 1, os produtos da ωΔΘ-série de reação podem ser modificados usando dessaturases apropriadas e, se necessário, elo/igases para produzir ácidos graxos ω3. Portanto, seria sumamente valioso desenvolver um produto que torne possível a produção de ARA em um organismo geneticamente modificado. O parasita de protozoário de ostra Perkinsus marinusi é capaz de sintetizar ácidos graxos saturados e não saturados, incluindo o ácido gra-xo essencial, ácido araquidônico [20:4(n - 6), pela série de reação de Δ -8 dessaturase. Surpreendentemente, os inventores presentes descobriram que P. marinusi contém nucléico que codifica um A9-elongase, um Δ8-dessaturase e um Δ5 - dessaturase que podem todos ser transcritos como uma única transcrição. A seqüência de tamanho natural é mostrada como SEQ ID NO: 1.

Então, em um primeiro aspecto da invenção, é fornecida uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipeptídeos com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δ5 - dessaturase e que seja selecionado do grupo que consiste em: a) Seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo deste; b) uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1; c) uma seqüência de ácido nucléico, isolada que codifica os polipeptídeos com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δδ-dessaturase, em que os polipeptídeos são selecionados do grupo que con- siste em SEQ ID NOS 2, 3 e 4; d) Um derivado de uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 que codifica os polipeptídeos com pelo menos 40% de identidade ao nível de aminoácido com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; em que os referidos polipeptídeos têm atividade de Δθ-elongase, Δ8 - dessatu-rase e Δδ-dessaturase. A vantagem da seqüência de ácido nucléico da presente invenção é que, embora codifique três enzimas separadas, ela pode ser transcrita como uma única seqüência que torna muito mais simples preparar os vetores de clonagem e expressão que expressam todas as três enzimas.

Preferivelmente, a seqüência de ácido nucléico isolada de acordo com a invenção não é idêntica a SEQ ID NO 1 (seqüência 1047306867) propriamente dita.

No contexto da presente invenção "hibridizar sob condições rigorosas" é pretendido descrever as condições de hibridização e lavagem sob as quais as seqüências de nucleotídeo com pelo menos 60% de homologia para um outro normalmente permanecem hibridizadas com uma outra. As condições são preferivelmente tais que as seqüências com pelo menos cerca de 65%, preferivelmente pelo menos cerca de 70% e especialmente preferivelmente pelo menos 75% ou mais de homologia para uma outra normalmente permaneçam hibridizadas para uma outra. Estas condições rigorosas são conhecidas pelo trabalhador versado e são descritas, por exemplo, em Currents Protocols em Molecular Biology, John Wiley & Sons, N., Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Um exemplo não limitante preferido de condições de hibridização rigorosas, é a hibridização em 6 x de citrato de sódio/cloreto de sódio (= SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uma ou mais etapas de lavagem em 0,2 x SSC, 0,1% de SDS de 50 a 65°C. O trabalhador versado sabe que estas condições de hibridização diferem dependendo do tipo de ácido nucléico e, por exemplo, quando solventes orgânicos estão presentes, relativo à temperatura e concentração de tampão. Sob "condições de hibridização padrão", por exemplo, a temperatura de hibridização está, dependendo do tipo de ácido nucléico, entre 42°C e 58°C em tampão aquoso com uma concentração de 0,1 a 5 x SSC (pH 7,2). Se solventes orgânicos, por exemplo, 50% de formamida, estiverem presentes no tampão acima mencionado, a temperatura sob condições padrão é aproximadamente 42°C. As condições de hibridização para híbridos de DNA:DNA, por exemplo, são 0,1 x SSC e 20°C a 45°C, preferivelmente 30°C a 45°C. As condições de hibridização para híbridos de DNA:RNA são, por exemplo, 0,1 x SSC e 30°C a 550C, preferivelmente 45°C a 55°C. As condições de hibridização acima mencionadas são determinadas por via de exemplo para um ácido nucléico com aproximadamente 100 pb (= pares de base) em comprimento e com um conteúdo de G + C de 50% na ausência de formamida. O trabalhador versado sabe como determinar as condições de hibridização exigidas em base dos livros de ensino acima mencionados ou livros de ensino tal como Sam-brook e outros, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames e Higgins (Ed.) 1985,"Nucleic Acids Hybridization: A Practical Appro-ach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991,"Essencial Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Além disso, quando o relatório presente refere-se às moléculas de ácido nucléico isoladas de uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza com uma das seqüências de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou com uma parte desta sob condições rigorosas, "uma parte desta" é compreendida como significando, de acordo com a invenção, que pelo menos 25 pares de base (= pb), 50 pb, 75 pb, 100 pb, 125 pb ou 150 pb, preferivelmente pelo menos 175 pb, 200 pb, 225 pb, 250 pb, 275 pb ou 300 pb, especialmente preferivelmente 350 pb, 400 pb, 450 pb, 500 pb ou mais pares de base são usados para a hibridização.

No contexto da presente invenção "Homólogos" da seqüência de ácido nucléico com a seqüência SEQ ID NO: 1 significa, por exemplo, variantes alélicas com pelo menos aproximadamente 50 ou 60%, preferivelmente pelo menos aproximadamente 60 ou 70%, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 70 ou 80%, 90% ou 95% e até mesmo mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ou homologia com uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1. "Variantes alélicas" compreendem, em particular, variantes funcionais que podem ser obtidas por deleção, inserção ou substituição de nu-cleotídeos de/na seqüência, sendo pretendido, porém, que a atividade de enzima das proteínas resultantes que são sintetizadas seja retida vantajosamente para a inserção de um ou mais genes. "Homólogos" também quer dizer homólogos bacterianos, fúngi- f cos e de planta, seqüências truncadas, DNA ou RNA de filamento único da seqüência de DNA de codificação e não codificação e derivados tal como, por exemplo, variantes de promotor. Os promotores a montante das seqüências de nucleotídeo detalhadas podem ser modificados por uma ou mais trocas de nucleotídeo, através de inserção(s) deleção{s) sem a funcionalidade ou atividade dos promotores que são adversamente afetados, porém. É, além disso, possível que a modificação da seqüência promotora aumente a sua atividade ou que ela seja substituída completamente por promotores mais ativos, incluindo aqueles de organismos heterólogos.

Para determinar a porcentagem de homologia (= identidade) de duas seqüências de aminoácido, as seqüências são escritas uma sob a outra para uma comparação ideal (por exemplo, podem ser introduzidas aberturas na seqüência de uma proteína ou de um ácido nucléico para gerar um alinhamento ideal com a outra proteína ou o outro ácido nucléico). Então, o resíduo de aminoácido ou nucleotídeos nas posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes, é comparado. Se uma posição em uma seqüência estiver ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou pelo mesmo nucleotídeo como a posição correspondente na outra seqüência, então as moléculas são homólogas a esta posição (isto é, "homologia" de aminoácido ou ácido nucléico como usado no presente contexto corresponde a "identidade" do aminoácido ou ácido nucléico). A porcentagem de homologia entre as duas seqüências é uma função do número de posições que as seqüências compartilham (isto é,% de homologia = número de posições idênticas/número total de posições x 100). Os termos homologia e identidade serão considerados então como sinônimos. A homologia foi calculada sobre a região de seqüência de ácido nucléico ou aminoácido total. O trabalhador versado tem disponível uma série de programas que são com base em vários algoritmos para a comparação de várias sequências. Aqui, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman dão resultados particularmente seguros. O programa Pil-eUp (o J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins e outros, CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit [Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) e Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482489 (1981)], que fazem parte do pacote de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, U.S.A. 53711 (1991)], foi usado para o alinhamento de seqüência. Os valores Ogy de seqüência que são indicados acima como uma porcentagem, foram determinado sobre a região de seqüência total que usa o programa GAP as seguintes colocações: Peso GAP: 50, Peso de Comprimento: 3, Equilíbrio Médio: 10.000 e Desequilíbrio Médio: 0,000. A menos que de outro modo especificado, estes ajustes foram sempre usados como ajustes padrões para os alinhamentos de seqüência.

No contexto da presente invenção "atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e A5-dessaturase" é entendida como significando que uma proteína codificada por um derivado de SEQ ID NO:1 ou resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 retém uma atividade enzimática de pelo menos 10%, preferivelmente 20%, especialmente preferivelmente 30% e muito especialmente 40% comparada com as proteínas/enzimas codificadas pela seqüência SEQ ID NO: 1 ou resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 e ttttt pode desse modo catalisar a conversão de ácido linoléico em ácido araquidônico.

Embora seja freqüentemente extremamente útil transcrever ácido nucléico que codifica polipeptídeos com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e A5-dessaturase como uma única seqüência, pode haver algumas circunstâncias nas quais seja preferível para fazer uso de ácido nucléico que codifica uma única enzima, isto é, uma A9-elongase, uma Δ8- dessaturase ou uma A5-dessaturase.

Então, em um segundo aspecto da invenção é fornecida uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de A9-elongase e que é selecionada do grupo que consiste em: a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 ou um homólogo de uma destas; b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9; c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de A9-elongase, em que o polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9, que codificam um polipeptídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de ami-noácido com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; em que o referido polipeptídeo tem atividade de A9-elongase.

Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de Δ8-dessaturase e que é selecionado do grupo que consiste em: a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo deste; b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1; c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de A8-dessaturase, em que o polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 3;

d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQ ID NO: 3; em que o referido polipeptídeo tem atividade de Δδ-dessaturase.

Em um quarto aspecto da invenção, é fornecida uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de Δ5-dessaturase e que é selecionado do grupo que consiste em: a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo desta; b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1; c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de Δδ-dessaturase, em que o polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 4; d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQ ID NO: 4; em que o referido polipeptídeo tem atividade de Δδ-dessaturase.

Em ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácido nucléico de quaisquer dos primeiro a quarto aspectos da invenção.

Vantajosamente, o polipeptídeo codificado por estas moléculas de ácido nucléico têm, pelo menos aproximadamente 60%, preferivelmente pelo menos aproximadamente 60% e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 70%, 80% ou 90% e preferivelmente pelo menos aproximadamente 8δ%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 9δ%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com as seqüências de aminoá-cido mostradas nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 9.

As seqüências de ácido nucléico usadas no processo são introduzidas vantajosamente em um cassete de expressão que torna possível a expressão dos ácidos nucléicos em organismos tal como microorganismos ou plantas.

Então, em outro aspecto da invenção é fornecida um construto de gene compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica um ou mais polipeptídeos com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e/ou A5-dessaturase como apresentado acima, operavelmente ligado com uma ou mais seqüências reguladoras.

No cassete de expressão, a seqüência de ácido nucléico que codifica A9-elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase, é unida operavelmente com uma ou mais seqüências reguladoras, vantajosamente para realçar a expressão de gene. É pretendido que estas seqüências reguladoras tornem possível a expressão específica dos genes e proteínas. Dependendo do organismo de hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expressado e/ou superexpressado somente após a indução ter ocorrido, ou então que é expressado e/ou superexpressado imediatamente. Por exemplo, estas seqüências reguladoras tomam a forma de seqüências às quais indutores ou repressores se ligam, desse modo controlando a expressão do ácido nucléico. Além destas novas seqüências reguladoras, ou em vez destas seqüências, os elementos reguladores naturais destas seqüências podem ainda estar presentes antes dos genes estruturais atuais e, se apropriado, podem ter sido geneticamente modificados de um tal modo que seu regulamento natural seja eliminado e a expressão dos genes seja intensificada. Entretanto, o cassete de expressão (= construto de expressão = construto de gene) também pode ser mais simples na construto, isto é, nenhum sinal regulador adicional foi inserido antes da seqüência de ácido nucléico ou seus derivados, e o promotor natural junto com seu regulamento não foi removido. Ao invés, a seqüência reguladora natural foi mutada de um tal modo que o regulamento já não mais ocorra e/ou expressão de gene, é intensificada. Estes promotores modificados também podem estar posicionados neles mesmos antes do gene natural na forma de partes de seqüências (= promotor com partes das seqüências de ácido nucléico usadas de acordo com a invenção) para realçar a atividade. Além disso, o construto de gene pode vantajosamente também compreender uma ou mais das que são conhecidas como seqüências realçadoras em ligação operável com o promotor, o que torna possível uma expressão intensificada da seqüência de ácido nucléico.

Seqüências vantajosas adicionais, tai como outros elementos reguladores ou seqüências terminadoras, também podem ser inseridas na extremidade 3' das seqüências de DNA. Uma ou mais seqüências que codificam enzimas que catalisam a conversão de ARA em um ácido graxo ω3-insaturado tal como EPA ou DHA também podem estar presentes. Desse modo, por exemplo, as seqüências que codificam um A5-elongase, Δ3-dessaturase e/ou A4-dessaturase, podem estar presentes em uma ou mais cópias do cassete de expressão (= construto de gene). Preferivelmente, somente uma cópia dos genes está presente em cada cassete de expressão. Este construto de gene ou os construtos de gene podem ser expressados juntos no organismo de hospedeiro. Neste contexto, o(s) construto(s) de gene pode(m) ser inserido(s) em um ou mais vetores e está(ão) presente(s) na célula na forma livre, ou então é inserido(s) no genoma. É vantajoso para a inserção de outros genes no genoma quando os genes a serem expressados estão presentes juntos em um construto de gene.

Neste contexto, os fatores ou seqüências reguladoras podem, como descrito acima, preferivelmente ter um efeito positivo na expressão de gene dos genes introduzidos, desse modo intensificando. Desse modo, um realce dos elementos reguladores, vantajosamente no nível transcricional, pode ocorrer usando-se sinais de transcrição fortes como intensificadores e/ou promotores. Além disso, porém, a translação intensificada também é possível, por exemplo, melhorando-se a estabilidade do mRNA.

As seqüências reguladoras incluem, em particular, seqüências de planta tal como as seqüências promotoras e terminadoras. Os construtos podem ser vantajosamente estavelmente propagados em microorganismos, em particular em E. coli e Agrobacterium tumefaciens, sob condições seletivas, e torna possível a transferência de DNA heterólogo em plantas ou microorganismos.

As seqüências reguladoras úteis estão presentes, por exemplo, em promotores tal como o promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, 17, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR ou λ-PL e são empregadas vantajo- samente em bactérias Gram-negativas. Outras, seqüências reguladoras vantajosas estão, por exemplo, presentes nos promotores Gram-positivos amy e SP02, nos promotores de levedura ou fúngicos ADC1, MFa, CA, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH ou nos promotores de planta CaMV/35S [Franck e outros, Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward e outros, Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, iib4, usp, STLS1, B33, nos ou no promotor de ubiquitina ou faseolina. Vantajoso neste contexto também são os promotores induzíveis, tal como os promotores descritos nos EP-A-0 388 186 (induzível por benzenossulfonamida), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz e outros, induzível por tetraciclina), EP-A-0 335 528 (induzível por ácido abscíssico) ou promotores de WO 93/21334 (induzível por etanol ou cicloexenol). Outros promotores de planta adequados são o promotor de FBPase citosólico ou o promotor ST-LSI de batata (Stockhaus e outros, EMBO J. 8, 1989, 2445), o promotor de glicina max fosforibosilpirofosfato amidotransferase (N°. de Acesso de Genbank U87999) ou o promotor nodo-específico descrito na Patente EP-A-0 249 676.

Os promotores especialmente vantajosos são promotores que tornam possível a expressão em tecidos que estão envolvidos na biossínte-se de ácidos graxos. Muito especialmente vantajosos são os promotores específicos de semente, tal como o promotor de USP como descrito, porém também outros promotores tal como LeB4, DC3, promotor de faseolina ou napin. Outros promotores especialmente vantajosos são promotores específicos de semente que podem ser usados para plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas e que são descritos nos US 5.608.152 (promotor de napin de óleo de semente de colza), WO 98/45461 (promotor de Arabidopsis oleosin), US 5.504.200 (promotor de Phaseolus vulgaris phaseolin), WO 91/13980 (promotor de Brassica Bce4), por Baeumlein e outros, Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (promotor LeB4 de um legume), estes promotores que são adequados para dicotilédonas. Os exemplos de promotores que são adequados para monocotilédonas são o lpt-2 de cevada ou promotor de lpt-1 (WO 95/15389 e WO 95/23230), o promotor de proteína da cevada e outros promotores adequados descritos nos WO 99/16890.

Em princípio, é possível usar todos os promotores naturais junto com as suas seqüências reguladoras, tal como aquelas mencionadas acima. Também é possível e vantajoso usar os promotores sintéticos, ou em adição ou sozinho, em particular quando eles medeiam expressão específica de semente, tal como aquelas descritas no WO 99/16890.

Para alcançar um conteúdo de ARA particularmente elevado, especialmente em plantas transgênicas os genes deveríam ser expressados vantajosamente em colheitas de óleo de uma maneira específica de semente. Para este fim, podem ser usados os promotores específicos de semente, ou aqueles promotores que são ativos no embrião e/ou no endosperma. Em princípio, os promotores específicos semente podem ser isolados tanto de plantas dicotiledôneas quanto monocotiledôneas. Os promotores preferidos são listados a seguir: USP (= proteína de semente desconhecida) e vicilina (Vicia faba) [Baumlein e outros, Mol. Gen Genet, 1991, 225(3)], napin (óleo de semente de colza) [US 5.608.152], proteína portadora de acila (óleo de semente de colza) [US 5.315.001 e WO 92/18634], oleosina (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 e WO 93/20216], faseolina (Phaseolus vulgaris) [US 5.504.200], Bce4 [WO 91/13980], leguminas B4 (promotor de LegB4) [Baumlein e outros, Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 e Ipt1 (cevada) [WO 95/15389 e WO95/23230], promotores específicos de semente de arroz, milho e trigo [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 e aleuraína [US 5.677.474], Bce4 (óleo de semente de colza) [US 5.530.149], glicinina (soja) [EP 571 741], fosfoenol piruvato carboxilase (soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (soja) [WO 98/08962], isocitrato liase (óleo de semente de colza) [US 5.689.040] ou α-amilase (cevada) [EP 781 849]. A expressão de gene planta também pode ser facilitada por um promotor quimicamente induzível (veja , revisão em Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Os promotores quimicamente in-duzíveis são particularmente adequados quando é desejado que expressão de gene ocorra de uma maneira específica de tempo. Os exemplos de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz e outros (1992) Plant J. 2, 397- 404) e um promotor induzível por etanol.

Para assegurar a integração estável dos genes de biossíntese na planta transgênica em uma pluralidade de gerações, é normalmente necessário para cada dos ácidos nucléico que codifique uma proteína de interesse a ser expressada sob o controle de um promotor separado, preferivelmente um promotor que difere dos outros promotores, uma vez que os motivos de seqüência de repetição podem levar a instabilidade do T-DNA, ou aos eventos de recombinação. Esta é uma razão por que o ácido nucléico da presente invenção é particularmente vantajoso uma vez que seqüências que codificam A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δδ-dessaturase podem ser transcritas como uma única unidade que precisa de somente um promotor. Certamente, será necessário para outros genes codificar, por exemplo, Δ5-elongase, u>3-dessaturase e/ou de A4-dessaturase para estar sob o controle de promotores separados.

Neste contexto, o cassete de expressão é construído vantajosamente de um tal modo que um promotor seja seguido por um sítio de divagem, vantajosamente em um poliligante, para inserção do ácido nucléico a ser expressado e, se apropriado, uma seqüência terminadora é posicionada atrás do poliligante. Esta seqüência é várias vezes repetida, preferivelmente três, quatro ou cinco vezes, de forma que até cinco genes possam ser combinados em um construto e introduzidos na planta transgênica a ser expressada. Vantajosamente, a seqüência é repetida até três vezes. Para expressar as seqüências de ácido nucléico, a última é inserida atrás do promotor por um sítio de divagem adequado, por exemplo, no poliligante. Vantajosamente, cada seqüência de ácido nucléico tem seu próprio promotor e, se apropriado, sua própria seqüência terminadora. Tais construtos vantajosos são descritos, por exemplo, em DE 101 02 337 ou DE 101 02 338. Porém, também é possível inserir uma pluralidade de seqüências de ácido nucléico atrás de um promotor e, se apropriado, antes de uma seqüência terminadora. Aqui, o sítio de inserção, ou a seqüência, dos ácidos nucléicos inseridos no cassete de expressão não é de importância crítica, quer dizer que uma seqüência de ácido nucléico pode ser inserida na primeira ou última posição no cassete sem sua expressão sendo influenciada substancialmente desse modo. Vantajosamente, os promotores diferentes tal como, por exemplo, o promotor USP, LegB4 ou DC3, e seqüências terminadoras diferentes podem ser usadas no cassete de expressão. Porém, também é possível usar somente um tipo de promotor no cassete. Porém, isto pode levar aos eventos de recombinação indesejados.

Como descrito acima, a transcrição dos genes que foram introduzidos, deveria ser vantajosamente terminada por seqüências terminadoras adequadas na extremidade 3' dos genes de biossíntese que foram introduzidos (atrás do codon de interrupção). Um exemplo de uma seqüência que pode ser usada neste contexto é a seqüência terminadora OCS 1. Como é o caso com os promotores, seqüências terminadoras diferentes deveriam ser usadas para cada gene. O construto de gene da presente invenção também pode compreender genes de biossíntese do ácido graxo ou metabolismo de lipídio selecionados do grupo de deidrogenase(s) de acil-CoA, acil-ACP [= proteína portadora de acila] dessaturase(s), tioesterase(s), acil-ACP aciltransferase(s) de ácido graxo, acil-CoA:lisofosfolipídeo aciltransferase(s), ácido graxo sin-tases, ácido graxo hidroxilases, acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido graxo dessaturase(s), ácido graxo acetilena-ses, lipoxigenases, triacilglycerol lipases, alenóxido sintases, hidroperóxido liases ou ácido graxo elongase(s) e dessaturase(s) tal como A4-dessaturase, A5-dessaturase, Δ6 - dessaturase, Δδ-dessaturase, A9-dessaturase, Δ12-dessaturase ou Δδ-elongase.

Estes genes ou ácidos nucléicos adicionais podem ser clonados nos cassetes de expressão, que são então usados para transformar plantas com a ajuda de vetores como Agrobacterium.

Aqui, os fatores ou seqüências reguladoras podem, como descrito acima, preferivelmente ter um efeito positivo, e desse modo realçar, nos genes de expressão que foram introduzidos. Desse modo, o realce dos elementos reguladores pode vantajosamente ocorrer no nível transcricional usando sinais de transcrição fortes sinaliza como intensificadores e/ou promo- tores. Porém, uma translação intensificada também é possível, por exemplo, melhorando a estabilidade do mRNA. Em princípio, os cassetes de expressão podem ser usados diretamente para introdução nas plantas ou então podem ser introduzidos em um vetor.

Então, em ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor que compreende um ácido nucléico ou um construto de gene em quaisquer dos aspectos da invenção descritos acima.

Em uma modalidade, o vetor pode ser um vetor de clonagem.

As seqüências de ácido nucléico da invenção podem ser introduzidas sozinhas, ou preferivelmente, em combinação com um cassete de expressão (construto de ácido nucléico) em um organismo. Para introduzir os ácidos nucléicos, os ácidos nucléicos são vantajosamente ampliados e ligados de maneira conhecida. Preferivelmente, um procedimento que segue o protocolo para Pfu DNA polimerase ou uma mistura de Pfu/Taq DNA poli-merase é seguida. Os iniciadores são selecionados levando em consideração a seqüência a ser ampliada. Os iniciadores deveríam ser escolhidos vantajosamente de tal um modo que o amplificado compreenda a seqüência codogênica total desde o códon de partida ao códon de interrupção. Após a amplificação, o amplificado é convenientemente analisado. Por exemplo, uma separação de gelelectroforético pode ser realizada, a qual é seguida por uma análise quantitativa e qualitativa. Após isso, o amplificado pode ser purificado seguindo um protocolo padrão (por exemplo, Qiagen). Uma alíquota do amplificado purificado é então disponível para a etapa de clonagem subseqüente.

Os vetores de clonagem adequados são geralmente conhecidos pelo trabalhador versado. Estes incluem, em particular, os vetores que são capazes de replicação em sistemas microbianos, quer dizer principalmente vetores que garantem a clonagem eficiente em leveduras ou fungos e que tornam possível a transformação estável de plantas. Aqueles que devem ser mencionados em particular são vários sistemas de vetor binário e co-integrado que são adequados para a transformação mediada por T-DNA. Tais sistemas de vetor são, como uma regra, caracterizados pelo fato de que eles compreendem os genes vir requeridos para a transformação mediada por Agrobacterium e as seqüências de delimitação de T-DNA (borda de T-DNA). Estes sistemas de vetor vantajosamente também compreendem outras regiões cis-reguladoras tal como os promotores e seqüências termina-doras e/ou marcadores de seleção, por meio dos quais os organismos adequadamente transformados podem ser identificados. Ao mesmo tempo em que no caso de sistemas de vetor co-integrado, os genes vir e seqüências de T-DNA estão dispostos no mesmo vetor, os sistemas binários são com base em pelo menos dois vetores, um dos quais transporta os genes vir, porém nenhum T-DNA, ao mesmo tempo em que um segundo transporta o T-DNA, porém nenhum gene vir. Devido a este fato, os últimos vetores mencionados são relativamente pequenos, fáceis de manipular e replicar tanto em £ coli quanto em Agrobacterium. Estes vetores binários incluem vetores das séries pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. De acordo com a invenção, Bin19, pB1101, pBinAR, pGPTV e pCAMBIA são usados por preferência. Uma avaliação dos vetores binários e de seu uso é encontrada em Hellens e outros, Trends in Plant Science (2000) 5, 446 - 451. Para preparar os vetores, os vetores podem ser primeiro linearizados com endonuclease(s) de restrição e então modificados enzimaticamente de uma maneira adequada. Depois disso, o vetor é purificado, e uma alíquota é empregada para a etapa de clonagem. Na etapa de clonagem, o amplificado enzimaticamente clivado e, se apropriado, purificado é clonado com fragmentos de vetor foram preparados de uma maneira semelhante, usando ligase. Neste contexto, um cons-truto de ácido nucléico particular, ou construto de vetor ou plasmídeo, pode ter um ou então mais de um segmento de gene codogênico. Os segmentos de gene codogênico nestas construtos são preferivelmente ligados opera-velmente com seqüências reguladoras. As seqüências reguladoras incluem, em particular, seqüências de planta como os promotores e seqüências ter-minadoras descritas acima. O construto pode ser vantajosamente estavel-mente propagado em microorganismos, em particular em £ coli e Agrobacterium tumefaciens, sob condições seletivas e torna possível a transferência de DNA heterólogo em plantas ou microorganismos.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser introduzidos em organismos, tais como microorganismos ou vantajosamente plantas, vantajosamente usando vetores de clonagem, e desse modo ser usado na transformação de plantas tal como aquelas que são publicadas e citadas em: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Capítulo 6/7, p. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes e outros, Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225. Desse modo, os ácidos nucléicos, os ácidos nucléicos inventivos e construtos de ácido nu-cléico e/ou vetores usados no processo podem ser de usados para a modificação de recombinante de um espectro amplo de organismos, vantajosamente plantas, de forma que o último se torne o produtor melhor e/ou mais eficiente de ARA.

Uma série de mecanismos existe pelo qual a modificação das proteínas de A9-elongase, A8-dessaturase e Δδ-dessaturase é possível, de forma que o rendimento, produção e/ou eficiência de produção de ARA em uma planta, preferivelmente em uma planta de colheita de óleo ou um microorganismo, possa ser influenciado diretamente devido a estas proteínas modificadas. O número ou atividade das proteínas ou genes pode ser aumentado, de forma que maiores quantidades dos produtos de gene e, no final das contas, maiores quantidades dos compostos da fórmula geral I, sejam produzidas. Uma síntese de novo em um organismo que precisou da atividade e capacidade de biossintetizar os compostos antes de introdução do gene(s) correspondente também é possível. Isto se aplica analogamente à combinação com outras dessaturases ou elongases ou outras enzimas do metabolismo de lipídio e ácido graxo. O uso de várias seqüências divergentes, isto é, seqüências que diferem no nível de seqüência de DNA, também pode ser vantajoso neste contexto, ou então o uso de promotores para expressão de gene que torna possível uma expressão de gene diferente com o passar do tempo, por exemplo, como uma função do grau de maturidade de uma semente ou um tecido de armazenamento de óleo.

Devido à introdução de um gene que codifica A9-elongase, Δ8-dessaturase e/ou A5-dessaturase em um organismo, sozinho ou em combinação com outros genes em uma célula, não é somente possível aumentar o fluxo de biossíntese para o produto final, porém também aumentar, ou criar a composição de triacilglicerol correspondente de novo. Igualmente, o número ou atividade de outros genes que estão envolvidos na importação de nutrientes que são requeridos para a biossíntese de um ou mais ácidos graxos, óleos, lipídios neutros e/ou polares pode ser aumentado, de forma que a concentração destes precursores, co-fatores ou intermediários dentro das células ou dentro do compartimento de armazenamento seja aumentada, desse modo, a capacidade das células de produzir ARA como descrito abaixo é intensificada também. Otimizando-se a atividade ou aumentando-se o número de um ou mais genes que codifica Δθ-elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δ5-dessaturase que estão envolvidos na ARA de biossíntese, ou destruindo-se a atividade de um ou mais genes que estão envolvidos na degradação de ARA, um rendimento, produção e/ou eficiência aumentados de produção de ácido graxo e moléculas de lipídio em organismos, vantajosamente em plantas, é tornado possível.

Os ácidos nucléicos, que vantajosamente podem ser usados no processo são derivados de bactérias, fungos, diatomáceass, animais tal como, Caenorhabditis ou Oncorhynchus ou plantas tal como algas ou musgos, tal como os gêneros Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusari-um, Phytophthora, Ceratodon, Mantonieila, Ostreococcus, Isochrysis, Aleuri-ta, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, especificamente dos gêneros e espécies Oncorhynchus mykiss, Xenopus lae-vis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonona, Mantonieila squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus Tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Cera. todon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides Viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans ou especialmente vantajosamente de Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonona ou Cryp-thecodinium cohnii.

Em uma modalidade alternativa, o vetor pode ser um vetor de expressão projetado para transformar um organismo no qual o ácido nucléi-co deve ser expressado e o ácido linoléico convertido em ARA.

Estes vetores vantajosos, preferivelmente vetores de expressão, compreendem o(s) ácido(s) nucléico(s) que codifica(m) o A9-elongase, Δ8-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase e que são descritos nos primeiro a quarto aspectos da invenção.

Como usado no presente contexto, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucléico que é capaz de transportar outro ácido nu-cléico ao qual está ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um tipo adicional de vetor é um vetor viral, sendo possível para os segmentos de DNA adicionais serem ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com origem de replicação bacteriana). Outros vetores são vantajosamente integrados no genoma de uma célula hospedeira quando eles são introduzidos na célula hospedeira, e desse modo replicam junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores podem administrar a expressão de genes com a qual eles estão em ligação operável. Estes vetores são referidos no presente contexto como "vetores de expressão". Normalmente, os vetores de expressão são adequados para técnicas de recombinação de DNA que tomam a forma de plasmídeos.

Na presente descrição onde o termo "plasmídeo” é usado, deveria ser entendido que os plasmídeos podem ser substituídos por outros tipos de vetor de expressão, tal como vetores virais, que exercem funções semelhantes. Além disso, o termo "vetor" também é pretendido compreender outros vetores com os quais o trabalhador versado está familiarizado, tal como fagos, vírus tais como SV40, CMV, TMV, transposons, elementos IS, fasmí- deos, fagomídeos, cosmídeos, DNA linear ou circular.

Os vetores de expressão recombinantes vantajosamente usados no processo compreendem os ácidos nucléicos descritos abaixo ou o cons-truto de gene descrito acima em uma forma que é adequada para expressar os ácidos nucléicos usados em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes compreendem uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas em base das células hospedeiras usadas para a expressão, cuja seqüência(s) reguladora é ligada operavelmente com a seqüência de ácido nucléico a ser expressada. Em um vetor de expressão recombinante, "operavelmente ligado" significa que a seqüência de nucleotídeo de interesse é ligada a seqüência(s) reguladora(s) de um tal modo que a expressão da seqüência de nucleotídeo seja possível, e elas são ligadas uma à outra de um tal modo que ambas as seqüências realizam a função predita que é designada para seqüência (por exemplo, em um sistema de transcrição/translação in vitro, ou em uma célula hospedeira se o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "seqüência reguladora" é pretendido compreender os promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Por exemplo, estas seqüências reguladoras são descritas em Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), ou veja: Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Ed.: Glick and Thompson, Capítulo 7, 89-108, incluindo as referências citadas aqui. As seqüências reguladoras compreendem aquelas que administram a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de célula hospedeira e aquelas que administram a expressão direta da seqüência de nucleotídeo somente em células hospedeiras específicas sob condições específicas. O trabalhador versado sabe que o desígnio do vetor de expressão pode depender de fatores tal como a escolha da célula hospedeira ser transformada, o nível de expressão desejado da proteína e similares.

Os vetores de expressão recombinantes usados podem ser projetados para a expressão de Δ9 - elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δ5- dessaturase em células procarióticas ou eucarióticas. Isto é vantajoso uma vez que as etapas intermediárias da construto de vetor freqüentemente são realizadas em microorganismos devido à simplicidade. Por exemplo, o gene de Δθ-elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase pode ser expressado em células bacterianas, células de inseto (usando vetores de expressão de Baculovírus), levedura e outras células fúngicas (veja Romanos, Μ., A., e outros (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488; van den Hondel, CAM. J. J., e outros (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", em: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, C. A.M. J. J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, em: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F., e outros, Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cam-bridge), algae (Falciatore e outros, 1999, Marine Biotechnology.1 , 3:239-251), os ciliatos dos tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Te-trahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Dessaturaseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella e Stylonychia, em particular do gênero Stylonychia lemnae, usando vetores em um método de transformação como descrito no WO 98/01572 e, preferivelmente, em células de plantas de multicelulares (veja Schmidt, R. e Willmitzer, L. (1988) "Hi-gh efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabi-dopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Capítulo 6/7, pp.71-1 19 (1993); F.F. White, B. Jenes e outros, Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (e referências citadas aqui)). As células hospedeiras adequadas são também descritas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como uma alternativa, o vetor de expressão recom-binante pode ser transcrito transladado in vitro, por exemplo, usando as se-qüências reguladoras T7-promotoras e T7-polimerase.

Na maioria dos casos, a expressão de proteínas em procariotas envolve o uso de vetores que compreendem promotores constitutivos ou induzíveis que administram a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Os vetores de expressão de fusão típicos são, inter alia, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., e Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), onde glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação de maltose-E e proteína A, respectivamente, são fundidas com a proteína alvo recombi-nante.

Os exemplos de vetores de expressão de E coli de não fusão induzíveis adequados são, inter alia, pTrc (Amann e outros (1988) gene 69:301-315) e pET 11 d (Studier e outros, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 6089). A expressão de gene alvo do vetor pTrc é com baseado na transcrição de um promotor de fusão trp-lac híbrido pelo RNA polimerase hospedeiro. A expressão de gene alvo do vetor pET 11 d é com base na transcrição de um promotor de fusão T7-gn10-lac que é mediado por um RNA polimerase viral (T7gn1) que é co-expressAdo. Esta polimerase viral é fornecida pelas cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um λ-profago residente que aloja um gene T7 gn1 sob controle transcricional do promotor lacUV 5.

Outros vetores que são adequados para organismos procarióti-cos são conhecidos pelo trabalhador versado, estes vetores estão, por exemplo, em pLG338 de E. coli, pACYC184, as séries pBR, tal como pBR322, as séries pUC tal como pUC18 ou pUC19, as séries M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-111113-B1, Agt11 ou pBdCI, em Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 ou plJ361, em Bacilo pUB1 10, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667.

Em uma outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Os exemplos para vetores para expressão na levedura S.cerevisiae compreendem pYeDessaturased (Baldari e outros (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz e outros (1987) Gene 54:113-123) e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Os vetores e processos para a construto de vetores que são adequados para uso em outros fungos, tal como os fungos filamentosos, compreendem aqueles que são descritos nos detalhes em: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fun-gi, J. F. Peberdy e outros, Ed., pp.. 1-28, Cambridge University Press: Cam-bridge, ou em: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasu-re, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego]. Outros vetores de levedura adequados são, por exemplo, pAG-1, YEp6, YEpl 3 ou pEMBLYe23.

Como uma alternativa, A9-elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δ5-dessaturase podem ser expressados em células de inseto que usam vetores de Baculovirus. Os vetores de expressão de Baculovirus que estão disponíveis para a expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo, células de Sf9) compreendem as séries pAc (Smith e outros (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e as séries pVL (Lucklow e Summers (1989) Virology 170:31-39).

Os vetores de acima mencionados são somente uma pequena avaliação sobre os vetores adequados que são possíveis. Outros plasmí-deos são conhecidos por trabalhadores versados e são descritos, por exemplo, em: Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P. H., e outros, Elsevier, Amsterdam-Nova lorque-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, veja os Capítulos 16 e 17 em Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Em uma modalidade adicional do processo, as A9-elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase podem ser expressadas em células de planta unicelulares (tal como, algas), veja Falciatore e outros, 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 e referências citadas aqui, e em células de planta de plantas mais altas (por exemplo, espermatófitos, tal como colheitas cultiváveis). Os exemplos de vetores de expressão de planta compreendem aqueles que são descritos nos detalhes: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., e Masterson, R., (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; e Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721 ; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Um cassete de expressão de planta preferivelmente compreende sequências reguladoras que são capazes de administrar a expressão de genes em células de planta e são ligadas operavelmente de forma que cada seqüência possa cumprir sua função, tal como terminação transcricional, por exemplo, sinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferidos são aqueles que são derivados de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, tal como gene 3 do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen e outros, EMBO J. 3 (1984) 835 et. seq), que é conhecido como octopina sintase, ou equivalentes funcionais destes, porém todas as outras seqüências terminadoras que são funcionalmente ativas em plantas também são adequadas.

Uma vez que a expressão de gene de planta é muito freqüente-mente não limitada ao nível transcricional, um cassete de expressão de planta preferivelmente compreende outras seqüências que são operavelmente ligadas, tal como intensificadores de translação, por exemplo, a seqüência "overdrive", que realça a seqüência líder 5’-não transladada de vírus em mosaico do tabaco, que aumenta a relação de proteína/RNA (Gallie e outros, 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

Como descrito acima, a expressão de gene de planta deve estar ligada operavelmente com um promotor adequado que ativa a expressão de gene com a temporização correta ou de uma maneira específica de célula ou tecido. Os promotores utilizáveis são os promotores constitutivos (Benfey e outros, EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tal como aqueles esses que são derivados de vírus de planta, tal como 35S CaMV (Franck e outros, Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (também veja EUA 5352605 e WO 84/02913), ou promotores de planta, tal como o promotor do subunidade de Rubisco, que é descrito na Patente US 4.962.028.

Outras seqüências preferidas para uso em ligação operável em cassetes de expressão de gene de planta são seqüências de alvejamento, que são requeridas para guiar o produto de gene em seu compartimento de célula correspondente (veja uma revisão em Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 e referências citadas aqui), por exemplo, no vacúolo, no núcleo, todos os tipos de plastídeos, tais como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, o espaço extracelular, as mitocôndrias, o reticulo de endo-plasmídeo, elaioplastos, peroxisomas e outros compartimentos de células de planta.

Como descrito acima, a expressão de gene de planta também pode ser obtida por um promotor quimicamente induzível (veja revisão em Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Os promotores quimicamente induzíveis são particularmente adequados quando é desejado que a expressão de gene ocorra de uma maneira específica de tempo. Os exemplos de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz e outros (1992) Plant J. 2, 397-404) e um promotor induzível por etanol.

Os promotores que respondem às condições de tensão bióticas ou abióticas também são adequados, por exemplo, o promotor de gene PRP1 induzido por patógeno (Ward e outros, Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361366), o promotor de tomate hsp80 de tomate induzível por calor (US 5.187.267), o promotor de alfa-amilase de batata induzível por (WO 96/12814) ou o promotor pinll induzível por ferida (EP-A-0 375 091).

Especialmente preferidos são aqueles promotores que provocam a expressão de gene em tecidos e órgãos nos quais a biossíntese de ácidos graxos, lipídios e óleos, ocorre, em células de semente, tal como células do endosperma e do embrião em desenvolvimento. Os promotores adequados são o promotor de napin de óleo de semente de colza (US 5.608.152), o promotor de Vicia faba USP (Baeumlein e outros, Mol Gen Genet, 1991,225 (3):459-67), o promotor de oleosina Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor de faseolina Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor de Bce4 Brassi-ca (WO 91/13980) ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein e ou- tros, 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9), e promotores que provocam a expressão específica semente em plantas monocotiledôneas, tal como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e similares. Promotores notáveis adequados são o promotor de gene de cevada Ipt2 ou Ipt1 (WO 95/15389 e WO 95/23230) ou os promotores do gene de proteína de cevada, o gene de glutelina de arroz, o gene de orizina de arroz, o gene de prolamina de arroz, o gene de gliadina de trigo, o gene de glutelina de trigo, o gene de zeína de milho, o gene de glutelina de aveia, o gene de casirina de Sorghum ou o gene de secalina de centeio que são descritos no WO 99/16890.

Como descrito acima, pode ser vantajoso incluir em um cassete de expressão, enzimas de codificação de ácidos nucléicos capazes de converter ARA em ácidos graxos A3-não saturados tal como EPA ou DHA. Desse modo, por exemplo, o cassete de expressão pode também incluir o ácido nucléico que codifica uma Δδ-elongase, oo3-dessaturase e/ou Δ4-dessaturase. Tais cassetes de expressão podem ser introduzidos pela transformação simultânea de uma pluralidade de construtos de expressão individuais ou, preferivelmente, combinando-se uma pluralidade de cassetes de expressão em um construto. Além disso, uma pluralidade de vetores pode ser transformada com, em cada caso, uma pluralidade de cassetes de expressão e então transferida na célula hospedeira.

Outros promotores que são igualmente especialmente adequados são aqueles que realizam uma expressão específica de plastídeo, uma vez que os plastídeos constituem o compartimento no qual os precursores e alguns produtos finais são sintetizados de biossíntese de lipídio. Os promotores adequados, tal como o promotor de RNA polimerase viral, são descritos nos WO 95/16783 e WO 97/06250, e o promotor cIpP de Arabidopsis, descrito no WO 99/46394. O DNA de vetor pode ser introduzido em células procarióticas e eucarióticas por técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Os termos "transformação" e "transfecção", conjugação e transdução, como usado no presente contexto, são pretendidos compreender uma multiplicidade de métodos conhecidos na técnica anterior pela introdução de ácido nu- cléico estrangeiro (por exemplo, o DNA) em uma célula hospedeira, incluindo a co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, lipofecção, competência natural, transferência quimicamente mediada, eletroporação ou bombardeio de partícula. Os métodos adequados para a transformação ou transfecção de células hospedeiras, incluindo células de planta, podem ser encontrados em Sambrook e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e outros livros de laboratório tal como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, Nova Jérsei.

Em um outro aspecto da invenção é fornecido um organismo não humano transgênico que compreende pelo menos um ácido nucléico, construto de gene ou vetor de acordo com um aspecto anterior da invenção. O organismo não humano transgênico pode ser um microorganismo, um animal não humano ou uma planta.

As células hospedeiras que são, em princípio, adequadas para absorver o ácido nucléico de acordo com a invenção, o produto de gene de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção são todos os organismos procarióticos ou eucarióticos. Os organismos hospedeiros que são vantajosamente usados são os microorganismos tais como fungos ou leveduras, ou células de planta, preferivelmente plantas ou partes desta. Os fungos, leveduras ou plantas são preferivelmente usados, especialmente plantas, por exemplo, plantas tal como colheitas de óleo, que têm alto teor em compostos de lipídio tal como óleo de semente de colza, prímula de noite, linho, cardo, amendoim, óleo de colza, linhaça, soja, açafroa, girassol, borragem, ou plantas tal como milho, trigo, centeio, aveias, triticale, arroz, cevada, algodão, mandioca, pimenta, Tagetes, plantas Solanacea tal como batata, tabaco, berinjela e tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfafa, plantas fechadas (café, cacau, chá), espécies de Salix, árvores (óleo de palma, coco), e gramas perenes e colheitas de forragem. As plantas especialmente preferidas de acordo com a invenção são colheitas de óleo tal como soja, amendoim, óleo de semente de colza, óleo de colza, linhaça, linho, prímula de noite, girassol, açafroa, árvores (óleo de palma, coco).

Em uma modalidade vantajosa, o termo "ácido nucléico (molécula)" como usado no presente contexto adicionalmente compreende a sequência não transladada nas extremidades 3' e 5' da região de gene de codificação: pelo menos 500, preferivelmente 200, especialmente preferivelmente 100 nucleotídeos da seqüência a jusante da extremidade 5' da região de codificação e pelo menos 100, preferivelmente 50, especialmente preferivelmente 20 nucleotídeos da seqüência a jusante da extremidade 3' da região de gene de codificação. Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é separada de outras moléculas de ácido nucléico que estão presentes na fonte natural do ácido nucléico. Um ácido nucléico "isolado" preferivelmente não tem nenhuma seqüência que naturalmente flanqueie o ácido nucléico no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucléico é derivado (por exemplo, seqüências que ficam situadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucléico). Em várias modalidades, a molécula de Δθ-elongase, Δ8-dessaturase ou Δδ-dessaturase isolada pode compreender, por exemplo, menos do que aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeo que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucléico é derivado. O mesmo se aplica a outras seqüências de ácido nucléico que podem ser incluídas em um cassete de expressão, por exemplo seqüências que codificam uma Δδ-elongase, co3-dessaturase e/ou A4-dessaturase As moléculas de ácido nucléico da presente invenção, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico com uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou resíduos 7668 a 12077 desta, ou as partes da SEQ ID NO: 1 especificada pelos segundo a quarto aspectos da invenção, podem ser isoladas usando técnicas padrão molecular-biológicas e as informações de seqüência fornecidas nelas. Além disso, por exemplo, uma seqüência homóloga ou regiões de seqüência homóloga, conservadas podem ser identificadas no nível de aminoácido ou DNA com a ajuda de algoritmos comparativos. Eles podem ser usados como sonda de hibridização e técnicas de hibridização padrão (tal como, por exemplo, aquelas descritas em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para isolar seqüências de ácido nucléico adicionais que podem ser usadas no processo.

Além disso, uma molécula de ácido nucléico de Perkinsus mari-nus que compreende uma seqüência completa de SEQ ID NO: 1 ou uma parte desta pode ser isolada através de reação em cadeia de polimerase, onde os iniciadores de oligonucleotídeo são usados sobre a base desta seqüência ou partes desta (por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que compreende a seqüência completa ou parte desta pode ser isolada através de reação em cadeia de polimerase que usa iniciadores de oligonucleotídeo que foram gerados com base nesta mesma seqüência). Por exemplo, mRNA pode ser isolado de células (por exemplo, por meio do método de extração de tiocianato de guanidíneo de Chirgwin e outros (1979) Biochemistry 18:5294-5299) e cDNA por meio de transcriptase reversa (por exemplo, transcriptase reversa Moloney MLV, disponibilizado por Gibco/BRL, Bethes-da, MD, ou transcriptase reversa AMV, disponibilizado por Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL).

Os iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para a amplificação por meio de reação em cadeia de polimerase podem ser gerados com base em uma das seqüências mostradas na SEQ ID NO: 1 ou com a ajuda das seqüências de aminoácido detalhadas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. São mostrados iniciadores particularmente adequados nos Exemplos como SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

Um ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser amplificado por técnicas padrão de amplificação de PCR que usam cDNA ou, alternativamente, DNA genômico como modelo (SEQ ID NO 9) e iniciadores de oligonucleotídeo adequados (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6). O ácido nucléico amplificado desse modo pode ser clonado de em um vetor adequado e pode ser caracterizado por meio de análise de seqüência de DNA. Os oli-gonucleotídeos que correspondem a uma seqüência de nucleotídeo de des- saturase ou elongase podem ser gerados através de métodos sintéticos padrão, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automático.

Os ácidos nucléicos e moléculas de proteína acima mencionados com atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e/ou Δδ-dessaturase, podem ser usados em um processo para a produção de ARA de ácido lino-léico em organismos transgênicos.

Então, em um outro aspecto da invenção, é fornecido um processo para a conversão de ácido linoléico ou um derivado deste em ácido araquidônico ou um derivado deste em um organismo, o processo compreendendo introduz em um organismo que compreende ácido linoléico, pelo menos uma seqüência de ácido nucléico que compreende: a) SEQ ID NO: 1 (seqüência completa 1047306867), seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo de um destes; b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1; c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de A9-elongase, A8-dessaturase e Δδ-dessaturase, em que o polipeptídeos é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS 2, 3 e 4; d) um derivado de uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 que codifica os polipeptídeos com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; em que os referidos polipeptídeos têm atividade de A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δδ-dessaturase. e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

No contexto da presente invenção, um "derivado" de ácido linoléico ou araquidônico é um composto no qual o OH da porção de ácido car-boxílico é substituído por uma porção de R1, em que: R1 é coenzima A (tioéster), lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletano- lamina, lisofosfatidilglicerol, liso - difosfatidiIglicerol, lisofosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, base de esfingo ou um radical da fórmula II <il) em qual R2 = hidrogênio, colina de lisofosfatidila, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglcerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol ou C2-C24-alquilcarbonila saturada ou não saturada, R3 = hidrogênio, C2-C24-alquilcarbonila saturada ou não saturada, ou R2 e R3 são independentemente um do outro um radical da fórmula Ia: (Ia) em que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 9, m = 2, 3, 4, 5 ou 6 e p = 0 ou 3; e em que um oxigênio no radical R1 pode ser substituído enxofre tal que R1 seja ligado ao restante da molécula por uma ligação de tioéster.

Os processos de acordo com a invenção preferivelmente produzem ARA total em um conteúdo de pelo menos 1% em peso, vantajosamente pelo menos 3% em peso, com base nos ácidos graxos totais nos organismos transgênicos, preferivelmente em uma planta transgênica.

Uma vez que uma pluralidade de etapas de reação é realizada pelos compostos de partida, o ácido linoléico de (18:2Δ9,12) no processo de acordo com a invenção, ARA (20:4Δ5,8,11·14) não é obtido como um produto puro; traços menores dos precursores sempre estão presentes no produto final. ARA quimicamente puro também pode ser sintetizado pelo processo descrito acima. Para este fim, ARA ou um derivado deste é isolado dos organismos, tal como os microorganismos ou as plantas ou o meio de cultura dentro ou sobre os quais os organismos foram crescidos, ou do organismo e do meio de cultura, da maneira conhecida, por exemplo, por ex- tração, destilação, cristalização, cromatografia ou uma combinação destes métodos. Estes derivados de ARA ou ARA quimicamente são vantajosos para aplicações no setor de indústria alimentícia, no setor de cosmético e especialmente no setor de indústria farmacológica. O processo pode incluir etapas adicionais de converter o ARA em um ácido graxo ω-3 introduzindo-se no organismo o ácido nucléico que codifica um ω-3 dessaturase e opcionalmente um A5-elongase e/ou um Δ4-elongase e/ou um A4-dessaturase.

Em um outro aspecto a invenção compreende um processo para a conversão de 18:2Δ9,12 (ácido linoléico) em 20:2Δ11, u, o processo compreendendo introduzir em um organismo que compreende ácido linoléico pelo menos uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem atividade de A9-elongase e que compreende: a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 ou um homólogo de um destes; b) uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9; c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de A9-elongase, em que o polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9 que codifica um polipeptídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de amino-ácido com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; em que o referido polipeptídeo tem atividade de A9-elongase; e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

Em um outro aspecto da invenção é fornecido um processo para a conversão de 20:2Δ11,14 em 20:3Δ8,11,14, o processo compreendendo introduzir em um organismo que compreende 20:2Δ11,14, ou que compreende ácido linoléico e um Δ9 elongase, uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de A8-dessaturase e que é selecionado do grupo que consiste em: a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo desta; b) seqüências de ácido nucléico que hibridiza sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1; c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de Δδ-dessaturase, em que o polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 3; d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQ ID NO: 3; em que o referido polipeptídeo tem atividade de A8-dessaturase; e expressando a referida seqüência de ácido nucléico.

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um processo para a conversão de 20:3Δ8,11,14 em 20:4Δ5,8·11,14 (ARA), o processo compreendendo introduzir em um organismo que compreende 20:3Δ8'11'14 ou que compreende 20:2δ11, 14 e um Δδ-dessaturase, ou que compreende ácido linoléico, um A9-elongase e um Δδ-dessaturase, uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo com atividade de Δδ-dessaturase e que é selecionado do grupo que consiste em: a) uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo desta; b) seqüências de ácido nucléico que hibridizam sob condições rigorosas com uma seqüência de ácido nucléico que compreende resíduos 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1; c) uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica polipep-tídeos com atividade de Δδ-dessaturase, em que o polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 4; d) um derivado de um uma seqüência que compreende resíduos de ácido nucléico 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipep-tídeo com pelo menos 40% de identidade no nível de aminoácido com SEQ ID NO: 4; em que o referido polipeptídeo tem atividade de Δδ-dessaturase. e expressando a referida seqüência de ácido nucléico. O processo pode incluir etapas adicionais para converter o ARA em um ácido graxo ω-3 introduzindo no organismo, o ácido nucléico que codifica um ω-3 dessaturase e opcionalmente um Δδ-elongase e/ou um Δ4-elongase e/ou um A4-dessaturase.

Para os processos apresentados acima, descobriu-se que a expressão foi mais efetivamente obtida usando indução com galactose.

Os organismos adequados para a produção no processo de acordo com a invenção são, em princípio, qualquer organismo tais como microorganismos, animais não humanos ou plantas.

As plantas que são adequadas são, em princípio, todas aquelas plantas que são capazes de sintetizar ácidos graxos, tal como todas as plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas, algas ou musgos. Plantas vantajosas são selecionadas do grupo das famílias de planta Adelotheciaceae, A-nacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassica-ceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopo-diaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglanda-ceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Euglenaceae, Prasinophyceae ou plantas vegetais ou ornamentais, tal como Tagetes.

Os exemplos que podem ser mencionados são as seguintes plantas selecionadas do grupo que consiste em: Adelotheciaceae tal como os gêneros Physcomitrella, por exemplo, o gênero e espécies Physcomitrella patens, Anacardiaceae tal como os gêneros Pistacia, Mangifera, Anacardi-um, por exemplo, o gênero e espécies Pistacia vera [pistache], Mangifer indica [manga] ou Anacardium occidentale [cajueiro], Asteraceae, tal como os gêneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, por exemplo, o gênero e espécies Ca- lendula officinalis [calêndula comum], Carthamus tinctorius [açafroa], Centáurea cyanus [centáurea], Cichorium intybus [chicória], Cynara scolymus [alcachofra], Helianthus annus [girassol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lac-tuca esculenta, Lactuca scariola, L. ssp. sativa, Lactuca scariola, L. var. inte-grata, Lactuca scariola, L. var. integrifoiia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [legumes de salada], Tagetes lúcida, Tagetes erecta ou Tagetes tenuifolia [calêndula africana ou de trincheira], Apiaceae, tal como o gênero Daucus, por exemplo o gênero e espécies Daucus carota [cenoura], Betulaceae, tal como o gênero Corylus, por exemplo, os gêneros e espécies Corylus avellana ou Corylus colurna [avelã], Bo-raginaceae, tal como o gênero Borago, por exemplo, o gênero e espécies Borago officinalis [borragem], Brassicaceae, tal como os gêneros Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, por exemplo, os gêneros e espécies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [óleo de semente de colza], Sinapis arvensis, Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica jun-cea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica si-napioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostarda], Brassica oleracea [beterraba de forragem] ou Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, tal como os gêneros Anana, Bromelia (abacaxi), por exemplo, os gêneros e espécies Anana comosus, Ananas ananas ou Bromelia comosa [abacaxi], Ca-ricaceae, tal como o gênero Carica, tal como o gênero e espécies de Carica papaya [mamão], Cannabaceae, tal como a Cannabis de gênero, tal como o gênero e espécies de Canabbis sativa [linho], Convolvulaceae, tal como os gêneros Ipomea, Convolvulus, por exemplo, os gêneros e espécies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba ou Convolvulus pandu-ratus [batata-doce, batata], Chenopodiaceae, tal como o gênero Beta, tal como os gêneros e espécies Beta vulgaris, Beta vulgaris. var altíssima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva ou Beta vulgaris var. esculenta [beterraba doce], Crypthe-codiniaceae, tal como o gênero Crypthecodinium, por exemplo, o gênero e espécies Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, tal como o gênero Cucurbi- ta, por exemplo, os gêneros e espécies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo ou Cucurbita moschata [abóbora], Cymbellaceae, tal como os gêneros Ânfora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, por exemplo, o gênero e espécies Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, tal como os gêneros Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Sa-elania, Trichodon, Skottsbergia, por exemplo os gêneros e espécies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon purpureus, purpureus Ceratodon ssp,. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifo-lius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella Chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum gigan-teum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium ha-genii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium altemifoiium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus ou Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae, tal como o gênero Elaeagnus, por exemplo, o gênero e espécie Olea euro-paea [azeitona], Ericaceae, tal como o gênero Kalmia, por exemplo, o gênero e espécies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros ou Kalmia lúcida [loureiro da montanha], Euglenaceae, tal como o gênero Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalaphacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas, Trachelomonas, por exemplo, o gênero e espécie Euglena gracilis; Euphorbiaceae, tal como o gênero Manihot, Jani-pha, Jatropha, Ricinus, por exemplo, o gênero e espécies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [mandioca] ou Ricinus communis [planta de óleo de rícino], Fabaceae, tal como o gênero Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medica-jo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, soybean, por exemplo, o gênero e espécies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [pea], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Serican-rda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbeck, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa, Medicago sativa, Medicago fal-cata, Medicago varia [alfafa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida ou Soja max [soja], Funariace-ae, tal como o gênero Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrel-la, Physcomitrium, por exemplo, o gênero e espécies Aphanorrhegma serra-tum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplan-dii, Entosthodon califomicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jame-sonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrise-tus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometri-ca, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexe, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serra-ta, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium califomicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitri- um hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, pyriforme Physcomitrium var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washíngtoniense, Geraniaceae, tal como os gêneros Pelargonium, Cocos, Oleum, por exemplo, os gêneros e espécies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides ou Oleum cocois [coco], Gramineae, tal como o gênero Sac-charum, por exemplo, o gênero e espécies Saccharum officinarum, Juglan-daceae, tal como os gêneros Juglans, Wallia, por exemplo, os gêneros e espécies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra ou Wallia nigra [noz], Lauraceae, tal como os gêneros Persea, Laurus, por exemplo, os gêneros e espécies Laurus nobilis [baía], Persea americana, Persea gratíssima ou Persea persea [abacate], Leguminosae, tal como o gênero Arachis, por exemplo, o gênero e espécies Arachis hypogaea [amendoim], Linaceae.tal como os gêneros Adenolinum, por exemplo, os gêneros e espécies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense ou Linum trigy-num [linhaça], Lythrarieae, tal como o gênero Punica, por exemplo, o gênero e espécies Punica granatum [romã], Malvaceae, tal como o gênero Gossypi-um, por exemplo, os gêneros e espécies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum ou Gossypium thurberi [algodão], Marchantiaceae, tal como o gênero Marchantia, por exemplo, os gêneros e espécies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, tal como o gênero Musa, por exemplo os gêneros e espécies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisíaca, Musa spp. [banana], Onagraceae, tal como os gêneros Camissonia, Oenothera, por exemplo, os gêneros e espécies Oenothera biennis ou Camissonia bre-vipes [prímula de noite], Palmae, tal como o gênero Elaeis, por exemplo, o gênero e espécies Elaeis guineensis [óleo de palma], Papaveraceae, tal como, por exemplo, o gênero Papaver, por exemplo, os gêneros e espécies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [papoula], Pedatiaceae, tal como o gênero Sesamum, por exemplo, o gênero e espécies Sesamum indicum [gergelim], Piperaceae, tal como o gênero Piper, Artanthe, Pepero-mia, Steffensia, por exemplo, os gêneros e espécies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betei, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elonga-ta, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [pimenta], Po-aceae, tal como os gêneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropo-gon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea [milho], Triticum, por exemplo, os gêneros e espécies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexasti-chon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cevada], Secale cereale [centeio], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [aveias], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Sorghum Holcus, Sorghum ae-thiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineen-se, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [milho miúdo], Oryza sativa, Oryza latifolia de [arroz], Zea mays [milho] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum ou Triticum vulgare [trigo], Porphyridiaceae, tal como os gêneros Chroo-thece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanho-effenia, por exemplo, o gênero e espécies Porphyridium cruentum, Protea-ceae, como o gênero Macadamia, por exemplo, o gênero e espécies Maca-damia intergrifolia [macadâmia], Prasinophyceae, tal como os gêneros Nep-hroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococ-cus, por exemplo, os gêneros e espécies, Olivacea de Nephroselmis, Prasi- nococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis sueci-ca, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, tal como o gênero Coffea, por exemplo, os gêneros e espécies Coffea spp., Coffea Arabica, Coffea canephora ou Coffea liberica, Scrophulariaceae, tal como o gênero Verbascum, por exemplo, os gêneros e espécies Verbascum blattaria, Ver-bascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum ou Verbascum thapsus [verbascum], Solanaceae, tal como os gêneros Cap-sicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, por exemplo, os gêneros e espécies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimenta], Capsicum annuum [páprica], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rústica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [batata], Solanum me-longena [berinjela], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon Pyriforme, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum [tomate], Sterculiaceae, tal como o gênero Theobroma, por exemplo, o gênero e espécies Theobroma cacau [cacau] ou Theaceae, tal como o gênero Camellia, por exemplo, o gênero e espécies de Camellia sinensis [chá].

Os microorganismos vantajosos são, por exemplo, fungos selecionados do grupo das famílias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Crypto-coccaceae, Cunninghameliaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellace-ae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schi-zosacharomycetaceae, Sodariaceae ou Tuberculariaceae.

Os exemplos de microorganismos que podem ser mencionados são aqueles dos grupos: Choanephoraceae, tal como os gêneros Blakeslea, Choanephora, por exemplo, os gêneros e espécies Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mor-tierellaceae, tal como o gênero Mortierella, por exemplo, os gêneros e espécies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae, tal como os gêneros, Phytium, Phytophthora, por exemplo, os gêneros e espécies Pythium debar-yanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora pal-mivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetace-ae, tal como os gêneros Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomy-codes, Yarrowia, por exemplo, os gêneros e espécies Hansenula anômala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anômala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgen-sis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Paradoxus, Saccharomyces, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomyce-taceae tal como os gêneros Schizosaccharomyces, por exemplo, as espécies Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccha-romyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schi-zosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae tal como os gêneros Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, por exemplo as espécies Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrove, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboídeum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimenta-le, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, T-hraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multi-rudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum ou Thraustochytrium visurgense.

Outros microorganismos vantajosos são, por exemplo, bactérias selecionadas do grupo das famílias Bacillaceae, Enterobacteriacae ou Rhi-zobiaceae.

Os exemplos que podem ser mencionados são os seguintes microorganismos selecionados do grupo que consiste em: Bacillaceae, tal como o gênero de Bacillus, por exemplo, os gêneros e espécies de Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amylo-liquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp, fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Ba- cillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis. subsp. spizizenii, Bacillus subsp subtilis. subtilis ou Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae tal como os gêneros Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escheri-chia, Klebsiella, Salmonela ou Serratia, por exemplo, os gêneros e espécies Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subsp. odori-fera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cy-pripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nighfluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. com-munior, Escherichia coli-mutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia her-mannii, Escherichia sp., Escherichia Vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiella edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmonela abony, Salmonela arizonae, Salmonela bongori, Salmonela cholerae-suis subsp. arizonae, Salmonela choleraesuis subsp. bongori, Salmonela choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonela choleraesuis subsp. diarizona-e, Salmonela choleraesuis subsp. houtenae, Salmonela choleraesuis subsp. indica, Salmonela choleraesuis subsp. salamae, Salmonela daressalaam, Salmonela enterica subsp. houtenae, Salmonela enterica subsp. salamae, Salmonela enteritidis, Salmonela gallinarum, Salmonela heidelberg, Salmo- nela panama, Salmonela senftenberg, Salmonela typhimurium, Serratia en-tomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia lique-faciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia piymu-thica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp,. quinovora, Serratia quinivorans ou Serratia rubidaea; Rhizobiaceae, tal como os gêneros Agrobacterium, Carbophilus, Cheiatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhi-zobium, por exemplo, os gêneros e espécies Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium lar-rymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Cheiatobacter heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium cice, Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuif, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizogenes, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizo-bium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli ou Sinorhizobium xinjiangense.

Outros exemplos de microorganismos vantajosos para o processo de acordo com a invenção são protistas ou diatomáceas selecionadas do grupo das famílias Dinophyceae, Turaniellidae ou Oxytrichidae, tal como os gêneros e espécies: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum ou Colpidium sp.

Aqueles que são vantajosamente aplicados no processo de acordo com a invenção são organismos transgênicos, tal como fungos, tal como mortierella ou thraustrochytrium, leveduras tal como Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, musgos tal como Physcomitrella ou Ceratodon, animais não humanos tal como Caenorhabditis, algas tal como Nephrosel-mis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniel-la, Ostreococcus, Crypthecodinium ou Phaeodactylum ou plantas tal como plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os organismos que são especialmente vantajosamente usados no processo de acordo com a invenção são organismos que pertencem aos organismos produtores de óleo, quer dizer que são usados para a produção de óleo, tal como fungos, tal como Mortierella ou Thraustochytrium, algas tal como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium, Phaeodactylum, ou plantas, em particular plantas, preferivelmente plantas de semente de óleo ou de colheita de óleo que compreendem quantidades grandes de compostos de lipídio, tal como amendoim, óleo de semente de colza, óleo de colza, girassol, açafroa (Carthamus tinctoria), papoula, mostarda, linho, planta de óleo de rícino, azeitona, gergelim, Ca-lêndula, Punica, prímula de noite, verbascum, cardo, rosas selvagens, avelã, amêndoa, macadâmia, abacate, baía, abóbora, linhaça, soja, pistaches, bor-ragem, árvores (óleo de palma, coco ou noz) ou colheitas cultiváveis tal como milho, trigo, centeio, aveias, triticale, arroz, cevada, algodão, mandioca, pimenta, plantas Tagetes, Solanaceae, tal como batata, tabaco, berinjela e tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfafa ou plantas fechadas (café, cacau, chá), espécies de Salix, e gramas perenes e colheitas de forragem. As plantas preferidas de acordo com a invenção são plantas de colheita de óleo tal orno amendoim, óleo de semente de colza, óleo de colza, girassol, açafroa, papoula, mostarda, linho, planta de óleo de rícicno, azeitona, Calêndula, Punica, prímula de noite, abóbora, linhaça, soja, borragem, árvores (óleo de palma, coco). Especialmente preferido para o processo são plantas que têm o teor alto de ácidos graxos C18:2-, tal como girassol, açafroa, tabaco, verbascum, gergelim, algodão, abóbora, papoula, prímula de noite, noz, linhaça, linho ou cardo. Muito especialmente preferidas plantas são plantas tal como açafroa, girassol, papoula, prímula de noite, noz, linhaça ou linho.

Também deve ser vantajoso para o método acima descrito de acordo com a invenção adicionalmente introduzir, no organismo, outros ácidos nucléicos que codificam as enzimas do metabolismo de ácido graxo ou lipídio, além dos ácidos nucléicos dos primeiro a quarto aspectos da invenção.

Tais ácidos nucléico são vantajosamente derivados de plantas tal como algas, por exemplo, algas da família do Prasinophyceae tal como os gêneros Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephrosel-mis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pyc-nococcus, Pyramimonas, Scherffelia ou Tetraselmis, tal como os gêneros e espécies Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephro-selmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp,. Prasinocladus Ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, P-yramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculata, Tetraselmis carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolu-tae, Tetraselmis desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Tetraselmis impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordi-formis, Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens ou Tetraselmis sp. ou de algas da família Euglenaceae tal como o gênero Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas ou Trachelomonas, tal como o gênero e espécie Euglena acus, Euglena geniculate, Euglena gracilis, Euglena mixoc-ylindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas cylindrica ou Trachelomonas volvocina. São derivados os ácidos nucléicos usados vantajosamente de algas dos gêneros Euglena, Mantoniella ou Ostreococcus.

Outras plantas vantajosas são algas tal como Isochrysis ou Crypthecodinium, algas/diatomáceas, tal como Thalassiosira ou Phaeodact-ylum, musgos tal como Physcomitrella ou Ceratodon, ou plantas mais altas tal como Primulaceae, tal como Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens ou Osteospermum hyoseroides, microorganismos tal como fungos, tal como Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor ou Mortierella, bactérias tal como Shewanella, leveduras ou animais tal como nematódeos como Caenorhabditis, insetos, rãs, abalone, ou peixe. As seqüências de ácido nucléico isoladas de acordo com a invenção são vantajosamente derivadas de um animal da ordem dos vertebrados. Preferivelmente, as seqüências de ácido nucléico são derivadas das classes do Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae ou Oncorhynchus ou Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus ou Evertebrata tal como Proto-chordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae tal como Amaroucium constella-tum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhat-tensis, Perophora viridis ou Styela partita. Os ácidos nucléicos são especialmente vantajosamente derivados de fungos, animais, ou de plantas tal como algas ou musgos, preferivelmente da ordem do Salmoniformes, tal como a família do Salmonidae, tal como o gênero Salmo, por exemplo, dos gêneros e espécies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta ou Salmo trutta fario, de algas, tal como os gêneros Mantoniella ou Ostreococcus, ou das diatomá-ceas tal como os gêneros Thalassiosira ou Phaeodactylum ou de algas tal como Crypthecodinium.

Em uma modalidade preferida, o processo compreende a etapa de obter uma célula ou um organismo intacto que compreende as seqüências de ácido nucléico usadas no processo, onde a célula e/ou organismo é transformado com uma seqüência de ácido nucléico de acordo com a invenção que codifica o A9-elongase, e/ou Δδ-dessaturase e/ou A5-dessaturase, um construto de gene ou um vetor como descrito acima, sozinho ou em combinação com outras seqüências de ácido nucléico que codificam as proteínas do metabolismo de ácido graxo ou lipídio. Em uma outra modalidade preferida, este processo também compreende a etapa de obter os óleos, lipídios ou ácidos graxos livres do organismo ou da cultura. A cultura pode, por exemplo, tomar a forma de uma cultura de fermentação, por exemplo, no caso do cultivo de microorganismos, tal como, por exemplo, Mortierella, Tha-lassiosira, Mantoniella, Ostreococcus, Saccharomyces ou Thraustochytrium, ou uma cultura de crescimento em estufa ou campo de uma planta. A célula ou o organismo produzido desse modo é vantajosamente uma célula de um organismo produtor de óleo, tal como uma colheita de óleo, tal como, por exemplo, amendoim, óleo de semente de colza, óleo de colza, linhaça, linho, amendoim, soja, açafroa, linho, girassóis ou borragem.

No caso de células de planta, tecido de planta ou órgãos de planta, "crescer" é entendido como significando, por exemplo, o cultivo dentro ou sobre um meio de nutriente, ou da planta intacta sobre ou dentro de um substrato, por exemplo, em uma cultura hidropônica, composto de plantação ou em terra cultivável.

Para os propósitos da invenção, "transgênico" ou "recombinante" significa com respeito a, por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico, um cassete de expressão (=construto de gene) ou um vetor que compreende a seqüência de ácido nucléico ou um organismo transformado com as se-qüências de ácido nucléico, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, todas essas construtos são realizadas através de métodos recombinantes nos quais ou a) a seqüência de ácido nucléico de acordo com a invenção, ou b) uma seqüência de controle genética que é operavelmente ligada com a seqüência de ácido nucléico de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor, ou c) a) e b) não ficam situadas no seu ambiente genético natural ou foi modificada através de métodos recombinantes, isto sendo possível para a modificação tomar a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural é compreendido como significando o loco genômico ou cromossômico natural no organismo original ou a presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da seqüência de ácido nucléico é preferivelmente retido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucléico pelo menos em um lado e tem um comprimento de seqüência de pelo menos 50 pb, preferivelmente pelo menos 500 pb, especialmente preferivelmente pelo menos 1000 pb, preferivelmente pelo menos 5000 pb. Um cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das seqüências de ácido nucléico com o gene de Δ5-dessaturase correspondente - se torna um cassete de expressão transgêni-co quando este cassete de expressão é modificado por métodos não-naturais, sintéticos ("artificial") tal como, por exemplo, tratamento mutagêni-co. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, na US 5.565.350 ou WO 00/15815.

Um organismo transgênico ou plantas transgênicas para os propósitos da invenção é então compreendido como significando, como acima, que os ácidos nucléico usados no processo não estão no seu lugar natural no genoma de um organismo, sendo possível que os ácidos nucléicos sejam expressados homologamente ou heterologamente. Porém, como mencionado, transgênico também significa que, ao mesmo tempo em que os ácidos nucléicos de acordo com a invenção estão em sua posição natural no genoma de um organismo, a seqüência foi modificada com respeito à seqüência natural, e/ou que as seqüências reguladoras das seqüências naturais foram modificadas. Transgênico é preferivelmente entendido como significando a expressão dos ácidos nucléicos de acordo com a invenção em um lugar antinatural no genoma, isto é, homólogo ou, preferivelmente, a expressão hete-róloga dos ácidos nucléicos ocorre. Os organismos transgênicos preferidos são fungos tal como Mortierella ou Phytophtora, musgos tal como Physcomi-trella, algas tal como Mantoniella, Euglena, Crypthecodinium ou Ostreococ-cus, diatomáceas tal como Thalassiosira ou Phaeodactylum, ou plantas tal como as colheitas de óleo.

Os organismos ou organismos hospedeiros para os ácidos nu- cléico, o cassete de expressão ou o vetor usado no processo de acordo com a invenção são, em princípio, vantajosamente todos os organismos que são capazes de sintetizar ácidos graxos, especificamente ácidos graxos não saturados, e/ou que são adequados para a expressão de genes recombinan-tes. Os exemplos que podem ser mencionados são plantas tal como Arabi-dopsis, Asteraceae tal como Calendula ou plantas de colheita tal como soja, amendoim, planta de óleo de rícino, girassol, milho, algodão, linho, óleo de semente de colza, coco, óleo de palma, açafroa (Carthamus tinctorius) ou semente de cacau, microorganismos, tal como fungos, por exemplo, o gênero Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia, Phytophtora ou Pythium, bactérias, tal como o gênero Escherichia ou Shewanella, leveduras, tal como o gênero Saccharomyces, cyanobacteria, ciliates, algas tal como Mantoniella, Euglena, Thalassiosira ou Ostreococcus, ou protozoários tal como dinofla-gellates, tal como Crypthecodinium. Os organismos preferidos são aqueles que são naturalmente capazes de sintetizar quantidades significativas de óleo, tal como fungos, tal como Mortierella alpina, Pythium insidiosum, Phytophtora infestans, ou plantas tal como soja, óleo de semente de colza, coco, óleo de palma, açafroa, linho, linho, planta de óleo de rícino, calêndula, amendoim, semente de cacau ou girassol, ou leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, tal com soja, linho, óleo de semente de colza, açafroa, girassol, Calêndula, Mortierella ou Saccharomyces cerevisiae que são especialmente preferidos. Em princípio, os organismos hospedeiros são, além dos organismos transgênicos acima mencionados, também animais transgê-nicos, vantajosamente os animais não humanos, por exemplo, C. elegans, Ciona intestinalis ou Xenopus laevis.

Também utilizáveis são as células hospedeiras detalhadas em: Goeddel, Gene Expression Technology·. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). A expressão cepas que pode ser usada, por exemplo, aquelas com uma atividade de protease mais baixa, é descrita em: Gottesman, Sr, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119-128.

Estes incluem células de planta e certos tecidos, órgãos e partes de plantas em todas suas formas fenotípicas tal como anteras, fibras, cabelos da raiz, talos, embriões, caule, cotiledôneas, pecíolos, material colhido, tecido de planta, tecido reprodutivo e culturas de célula que sejam derivados da planta transgênica atual e/ou possam ser usados para realizar a planta transgênica.

As plantas transgênicas que compreendem os ácidos graxos poliinsaturados sintetizados no processo de acordo com a invenção podem ser comercializadas vantajosamente e diretamente sem haver qualquer necessidade de que os óleos, lipídios ou ácidos graxos sintetizados sejam isolados. As plantas para o processo de acordo com a invenção são listadas como significando plantas intactas e todas as partes da planta, órgãos de planta ou partes de planta tal como folha, talo, sementes, raiz, tubérculos, anteras, fibras, cabelos da raiz, talos, embriões, caule, cotiledôneas, pecíolos, material colhido, tecido de planta, tecido reprodutivo e cultura de célula que são derivados da planta transgênica atual e/ou podem ser usados para realizar a planta transgênica. Neste contexto, a semente compreende todas as partes da semente tal como a casca da semente, células epidérmicas, células da semente, endosperma ou tecido embrionário. Porém, os compostos produzidos no processo de acordo com a invenção também podem ser isolados dos organismos, vantajosamente plantas, na forma de seus óleos, gorduras, lipídios e/ou ácidos graxos livres. Os ácidos graxos poliinsaturados produzidos por este processo podem ser obtidos colhendo-se os organismos, ou da colheita na qual eles crescem, ou do campo. Isto pode ser feito por pressão ou extração das partes da planta, preferivelmente as sementes de planta. Neste contexto, os óleos, gorduras, de lipídios e/ou ácidos graxos livres podem ser obtidos pelo que é conhecido como batimento a frio ou pressionamento a frio sem aplicar calor. Para permitir maior facilidade de rompimento das partes da planta, especificamente as sementes, elas são previamente fragmentadas, cozidas em vapor ou assadas. As sementes que foram pré-tratadas desta maneira podem ser subseqüentemente apertadas ou extraídas com solventes como hexano quente. O solvente é subseqüen- temente removido. No caso de microorganismos, os últimos são, após colheita, por exemplo, extraídos diretamente sem outras etapas de processamento ou ainda, após rompimento, extraídos por vários métodos com os quais o operário qualificado está familiarizado. Desta maneira, pode ser isolado mais que 96% dos compostos produzidos no processo. Depois disso, os produtos resultantes são processados mais adiante, isto é, refinados. Neste processo, substâncias como as mucilagens de planta e substâncias suspensas são primeiro removidas. O que é conhecido como desenlamea-mento pode ser realizado enzimaticamente ou, por exemplo, quimio-fisicamente por adição de ácido tal como ácido fosfórico. Depois disso, os ácidos graxos livres são removidos através de tratamento com uma base, por exemplo, solução de hidróxido de sódio. O produto resultante é lavado completamente com água para remover o álcali que permanece no produto e então é secado. Para remover o pigmento que permanece no produto, os produtos são sujeitados a branqueamento, por exemplo, usando a terra da carga ou carvão ativo. No final, o produto é desodorizado, por exemplo, usando vapor.

Os ácidos graxos produzidos pelos processos da presente invenção podem ser isolados do organismo na forma de um óleo, um lipídio ou um ácido graxo livre. Por exemplo, os organismos adequados são aqueles mencionados acima. Os organismos preferidos são plantas transgênicas.

Uma modalidade da invenção é então óleos, lipídios ou ácidos graxos da fórmula I ou frações destes que foram produzidos pelo processo acima descrito, especialmente preferivelmente óleo, lipídio ou uma composição de ácido graxo que compreendem um composto de fórmula I e sendo derivado de plantas transgênicas.

Uma outra modalidade de acordo com a invenção é o uso do óleo, lipídio, dos ácidos graxos e/ou da composição de ácido graxo em produtos alimentícios, comestíveis, cosméticos ou farmacêuticos. Os óleos, lipídios, ácidos graxos ou misturas de ácido graxo de acordo com a invenção podem ser usados da maneira com a qual o trabalhador versado está familiarizado para misturar com outros óleos, lipídios, ácidos graxos ou misturas de ácido graxo de origem animal, tal como, por exemplo, óleos de peixe. Também podem ser usados estes óleos, lipídios, ácidos graxos ou misturas de ácido graxo que sejam compostos de legume e componentes de animais para a preparação de produtos alimentícios, comestíveis, cosméticos ou farmacológicos. O termo "óleo", "lipídio" ou "gordura" é entendido como significando uma mistura de ácido graxo que compreende ácido(s) graxo não saturado, saturado, preferivelmente esterificado. O óleo, lipídio ou gordura é preferivelmente elevado em ácido(s) graxo poliinsaturado livre ou, vantajosamente, esterificado, em particular ácido linoléico, ácido γ-linolênico, ácido di-homo- γ-linolênico, ácido araquidônico, ácido α-linolênico, ácido estearidôni-co, ácido eicosatetraenóico, ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentae-nóico ou ácido docosaexaenóico. A quantidade de ácidos graxos esterificados não saturados preferivelmente quantidades de aproximadamente 30%, um conteúdo de 50% é mais preferido, um conteúdo de 60%, 70%, 80% ou mais é ainda mais preferido. Para a análise, o conteúdo de ácido graxo pode, por exemplo, ser determinado por cromatografia de gás depois de converter os ácidos graxos nos ésteres de metila através de transesterificação. O óleo, lipídio ou gordura podem compreender vários outros ácidos graxo saturados ou não saturados, por exemplo ácido calendúlico, ácido palmítico, ácido palmitoléico, ácido esteárico, ácido oléico e outros. O conteúdo dos vários ácidos graxos no óleo ou gordura pode variar, em particular dependendo do organismo de partida. O ARA produzido no processo pode estar, como descrito acima, na forma de derivado de ácido graxo, por exemplo, esfingolipídeos, fosfogli-cerídeos, lipídios, glicolipídeos, fosfolipídeos, monoacilglicerol, diacilglicerol, triacilglicerol ou outros ésteres de ácido graxo. O ARA e outros ácidos graxos poliinsaturados que estão presentes podem ser liberados, por exemplo, por tratamento com álcali, por exemplo, KOH ou NaOH aquoso, ou hidrólise de ácido, vantajosamente na presença de um álcool tal como metanol ou etanol, ou por divagem enzimática, e isolado por, por exemplo, separação de fase e acidificação subseqüente por, por exemplo, H2SO4. Os ácidos graxos também podem ser liberados diretamente sem a etapa de processamento acima descrita.

Depois da sua introdução em um organismo, vantajosamente uma célula de planta ou planta, os ácidos nucléicos usados no processo, ou podem estar presentes em um plasmídeo separado ou, vantajosamente, integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de integração no geno-ma, a integração pode ser aleatória ou então pode se efetuar através de re-combinação tal que o gene nativo seja substituído pela cópia introduzida, por meio do que a produção do composto desejado pela célula é modulada, ou pelo uso de um gene em trans, de forma que o gene seja operavelmente ligado com uma unidade de expressão funcional que compreende pelo menos uma seqüência que garante a expressão de um gene, e pelo menos uma seqüência que garante a poliadenilação de um gene funcionalmente transcrito. Os ácidos nucléicos são introduzidos vantajosamente nos organismos por cassetes de multiexpressão ou construtos para expressão multi-paralela, vantajosamente nas plantas para a expressão específica de semente multiparalela de genes.

Se os microorganismos tal como leveduras, tal como Saccha-romyces ou Schizosaccharomyces, fungos tal como Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor ou Thraustochytrium, algas tal como Isochrysis, Mantoniella, Euglena, Ostreococcús, Phaeodactylum ou Crypthe-codinium forem usados como organismos no processo de acordo com a invenção, estes organismos serão vantajosamente crescidos em culturas de fermentação.

Se os microorganismos forem usados como organismos no processo de acordo com a invenção, eles são crescidos ou cultivados da maneira com qual 0 trabalhador versado está familiarizado, dependendo do organismo hospedeiro. Como uma regra, os microorganismos são crescidos em um meio líquido que compreende uma fonte de carbono, normalmente na forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio, normalmente na forma de fontes de nitrogênio orgânico tal como extrato de levedura ou sais tal como sul- fato de amônio, elementos traço, tal como sais de ferro, manganês e magnésio e, se apropriado, vitaminas, a temperaturas de entre 0°C e 100°C, preferivelmente entre 10°C e 60°C, ao mesmo tempo em que passando em oxigênio. O pH do meio líquido pode ou ser qualquer um mantido constante, quer dizer regulado durante o período de cultivo, ou não. As culturas podem ser cultivadas em bateladas, semibateladas ou continuamente. Os nutrientes podem ser fornecidos no começo da fermentação ou podem ser alimentados semicontinuamente ou continuamente. Os ácidos graxos poliinsaturados produzidos podem ser isolados dos organismos como descrito acima por processos conhecidas pelo trabalhador versado, por exemplo, através de extração, destilação, cristalização, precipitação apropriada com sal, e/ou cromatografia. Para este fim, os organismos podem ser rompidos vantajosamente anteriormente.

Se os organismos hospedeiros forem microorganismos, o processo de acordo com a invenção é realizado vantajosamente a uma temperatura de entre 0°C e 95°C, preferivelmente entre 10°C e 85°C, especialmente preferivelmente entre 15°C e 75°C, muito especialmente preferivelmente entre 15°C e 45°C.

Neste processo, o valor de pH é mantido vantajosamente entre pH 4 e 12, preferivelmente entre pH 6 e 9, especialmente preferivelmente entre pH 7 e 8. O processo de acordo com a invenção pode ser operado em bateladas, semibateladas ou continuamente. Uma avaliação sobre os métodos de cultivo conhecidos pode ser encontrada no livro de Chmiel (Bioprozeptechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrich-tungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Braunsch-weig/Wiesbaden, 1994)). O meio de cultura a ser usado tem que satisfazer adequadamente às exigências das cepas em questão. As descrições dos meios de cultura para vários microorganismos podem ser encontradas no livro "Manual of Methods fur General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981).

Como descrito acima, estes meios que normalmente podem ser empregados de acordo com a invenção compreendem uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e/ou elementos traços.

As fontes de carbono preferidas são açúcares, tal como mono-, di- ou polissacarídeos. Os exemplos de fontes de carbono muito boas são glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, mal-tose, sacarose, rafinose, amido ou celulose. Os açúcares também podem ser adicionados aos meios por compostos complexos tal como melados ou outros subprodutos de refinação de açúcar. A adição de misturas de uma variedade de fontes de carbono também pode ser vantajosa. Outras possíveis fontes de carbono são óleos e gorduras tal como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e/ou gordura de coco, ácidos gra-xos tal como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e/ou ácido lino-léico, poliálcoois e/ou álcoois tal como, por exemplo, glicerol, etanol e/ou metanol, e/ou ácidos orgânicos tal como, por exemplo, ácido láctico e/ou ácido acético.

As fontes de nitrogênio são compostos de nitrogênio normalmente orgânicos ou inorgânicos ou materiais compreendendo estes compostos. Os exemplos de fontes de nitrogênio compreendem amônio na forma líquida ou na forma gasosa ou sais de amônio tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio ou nitrato de amônio, nitrato, uréia, aminoácidos ou fontes de nitrogênio complexas tal como licor macerado de milho, carne de soja, proteína de soja, extrato de levedura, extrato de carne e similares. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

Os compostos de sal inorgânicos que podem estar presentes nos meios compreendem os sais de cloreto, fósforo e sulfato de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro.

Os compostos contendo enxofre inorgânico tal como, por exemplo, sulfatos, sulfetos, ditionetos, tetrationatos, tiossulfatos, sulfetos, ou então compostos de enxofre orgânico tal como mercaptanos e tióis, podem ser usados como fontes de enxofre para a produção de substâncias químicas finas contendo enxofre, em particular de metionina. Ácido fosfórico, fosfato de díidrogênio de potássio ou fosfato de hidrogênio de dipotássio ou sais contendo sódio podem ser usados sais como fontes de fósforo.

Os agentes de quelação podem ser adicionados ao meio para manter os íons de metal na solução. Os agentes de quelação particularmente adequados incluem diidroxifenóis, tal como catecol ou protocatecuato e ácidos orgânicos tal como ácido cítrico.

Os meios de fermentação usados de acordo com a invenção para cultivar microorganismos normalmente também compreendem outros fatores de crescimento, por exemplo, tal como vitaminas ou promotores de crescimento que incluem, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido ni-cotínico, pantotenato e piridoxina. Os fatores de crescimento e sais freqüen-temente são derivados de componentes de meios complexos tal como extrato de levedura, melados, licor macerado de milho e similares. Também é possível adicionar precursores adequados ao meio de cultura. A composição exata dos compostos do meio pesadamente depende da experiência particular e é decidida individualmente para cada caso específico. Informações sobre a otimização do meio podem ser encontradas no livro "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Os meios de crescimento também podem ser obtidos de fornecedores comerciais, por exemplo Standard 1 (Merck) ou BHI (infusão de cérebro coração, DIFCO) e similares.

Todos os componentes do meio são esterilizados, ou através de calor (20 min a 1,5 bar e 121°C) ou através de esterilização de filtro. Os componentes ou podem ser esterilizados juntos ou, se preciso for, separadamente. Todos os componentes do meio podem estar presentes no começo do cultivo ou adicionados continuamente ou em batelada, como desejado. A temperatura de cultura normalmente está entre 15°C e 45°C, preferivelmente de 25°C a 40°C, e pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante a experiência. O pH do meio deveria estar na faixa de 5 a 8,5, preferivelmente em cerca de 7,0. O pH para cultivo pode ser controlado durante cultivo adicionando-se compostos básicos tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônio e amônia aquosa ou compostos ácidos tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. A espumação pode ser controlada empregando antiespumantes tal como, por exemplo, ésteres de poliglicol de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos é possível adicionar ao meio, substâncias adequadas que têm um efeito seletivo, por exemplo, antibiótico. As condições aeróbias são mantidas introduzindo oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio tal como, por exemplo, ar ambiente na cultura. A temperatura da cultura normalmente é 20° a 40°C e preferivelmente 25°C a 40°C. A cultura é continuada até que formação do produto desejado esteja em um máximo. Este objetivo normalmente é alcançado dentro de 10 a 160 horas.

Os caldos de fermentação obtidos deste modo, em particular aqueles contendo ácidos graxos poliinsaturados, normalmente contêm uma massa seca de 7,5 a 25% em peso. O caldo de fermentação pode então ser processado também. A biomassa pode, de acordo com a exigência, ser removida completamente ou parcialmente do caldo de fermentação através de métodos de separação tal como, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma combinação destes métodos ou ser deixada completamente no referido caldo. É vantajoso processar a biomassa após sua separação.

Porém, o caldo de fermentação também pode ser engrossado ou pode ser concentrado sem separar as células, usando métodos conhecidos tal como, por exemplo, com a ajuda de um evaporador giratório, evaporador de película fina, evaporador de película de queda, por osmose inversa ou através de nanofiltração. Finalmente, este caldo de fermentação concentrado pode ser processado para obter os ácidos graxos presentes nele.

Os ácidos graxos obtidos no processo também são adequados como material de partida para a síntese química de produtos adicionais de interesse. Por exemplo, eles podem ser usados em combinação com um outro ou sozinhos para a preparação de farmacêuticos, comestíveis, alimentos animais ou cosméticos. Todas as seqüências de ácido nucléico usadas no processo de acordo com a invenção são vantajosamente derivadas de um organismo eucariótico, tal como uma planta, um microorganismo ou um animal. As seqüências de ácido nucléico são derivadas preferivelmente da ordem Salmoniformes, algas tal como Mantoniella, Crypthecodinium, Eugle-na ou Ostreococcus, fungos tal como o gênero Phytophthora ou de diatomá-ceas tal como os gêneros Thalassiosira ou Phaeodactylum. A invenção será descrita agora em maiores detalhes com referência aos seguintes Exemplos e aos desenhos nos quais: Figura 1 mostra várias séries de reação sintéticas para a bios-síntese de ácidos graxo ω-6 e u>-3.

Figura 2 é um traço de cromatografia de gás que mostra a conversão de Δ9, 12-18:2 (ácido linoléico) em Δ11 ,14-20:2 por expressão hete-róloga da seqüência de A9-elongase de P. marinus (SEQ ID NO: 1, resíduos 7668 a 9200) em levedura ou induzido por galactose (Figura 2A) ou glicose (Figura 2B).

Exemplo 1 - Clonagem de um elonqase de FAE1 de Perkinsus marinus Perkinsus marinusi é um parasita de protozoário de ostra capaz de sintetizar ácidos graxos saturados e não saturados incluindo o ácido graxo essencial, ácido araquidônico [20:4(n-6)j. P. marinus emprega a série de reação delta-8 (Δ -8) dessaturase para sintetizar o ácido araquidônico. Materiais e Métodos.

Crescimento e colheita de P. marinus Perkinsus marinus meronts foram cultivados a 28°C em um meio preparado como descrito por La Peyre e outros (J Eukaryot Microbiol 1993;40:304-10) e conteve aminoácidos, nucleotídeos, carboidrato, e vitaminas, porém nenhum soro bovino fetal.

Manipulação de ácido nucléico e clonagem com base em PCR O DNA foi extraído de células usando um minikit de DNA DNeasy (Qiagen). O DNA foi amplificado com iniciadores específicos para gene de del-ta5 dessaturase como segue: as reações foram aquecidas a 95°C durante 2 min seguido por 35 ciclos a 95°C durante 1 minutos, 2 minutos a 52 e 72°C durante 4 minutos, em seguida uma única etapa a 72°C durante 5 minutos. Os produtos de amplificação de PCR foram clonados em vetor de TOPO (Invitro-gen) e verificados através de sequenciamento. O gen FAE elongase foi amplificado com iniciadores específicos de gene (Tabela I) designados para as extremidades 5' e 3' da região de codificação, com locais de restrição para facilitar a clonagem no vetor de levedura (Tabela I). Os iniciadores dianteiros para clonagem em vetor de expressão de levedura pYES2 (Invitrogen) foram projetados para conter um G/A na posição -3 e um G na posição +4 para melhorar a iniciação de translação em células eucarióticas.

Iniciadores de oligonucleotídeo usados neste estudo As transcrições de Perkinsus marinus foram analisadas através de transcriptase reversa PCR (RT - PCR). O RNA total foi extraído de células que usam um minikit de planta RNeasy (Qiagen). Primeiro o cDNA do filamento foi sintetizado de RNA total que usa o kit de Amplificação de cDNA SMARTE RACE (BD-Clontech, Basingstoke, UK) de acordo com as instruções do fabricante. Os cDNAs de filamento único foram amplificados com os seguintes iniciadores.

FAEoperon dianteiro 5’ - GGAATTCGAGGAGTAGGATCTTATCTGAGGATAGTC A-CACTAGTCGTACT-3' FAEoperon reverso 5'-CATCTGCGAATACTAACCATACATT

As reações foram aquecidas a 95°C durante 2 minutos seguidos por 30 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 30 segundos em temperaturas que variam de 55 a 72 de acordo com o iniciador designado e 72°C durante 2 minutos, em seguida uma única etapa a 72°C durante 10 minutos. Os produtos de amplificação de PCR foram clonados em vetor TOPO (Invitrogen) e verificados através de sequenciamento. Surpreendentemente foi mostrado que as transcrições da A9-elongase, Δδ-dessaturase e Δδ-dessaturase são todas encontradas no mesmo mRNA. Este é o primeiro exemplo mostrando os genes de PUFA a serem organizados em uma estrutura tipo operon.

Em uma investigação adicional foi analisada a especificidade da A9-elongase. Para este propósito a sequência de codificação deste gene foi amplificada por RT-PCR como descrito acima usando os seguintes iniciado- res.

Elo2For: 5' - ATGCAAGTTCCCGCGGAGCATCACTCC -3' Elo2Rev: 5' - CGTT ACGCAT C AAT ATT AT GCAT AGCCAACC -3' O produto de PCR amplificado foi então clonado em um vetor de pCRscript de acordo com as recomendações do fabricante (Stratagen). Em uma segunda etapa de PCR as sequências modificadas para expressão de levedura foram introduzidas usando os seguintes iniciadores.

Expressão de levedura Kpn Elo2 dianteira 5' - TTGGTACCATGGGATTTCCTGCGGAG -3' Sac Elo1 Reversa 5' - GGG AGCT CTT ACGCAT CAAT ATT AT GCAT AGC-3’ A seqüência dos iniciadores é determinada na orientação 5' a 3'. Os sítios de restrição usados para clonagem estão em negrito. RESULTADOS

Isolamento de elonqase de FAE1 de P.marinus Usando dados publicamente disponíveis derivados de um projeto de sequenciamento de genoma de P.marinus realizado por TIGR (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/pmg /) foi identificado um contig (1047306867) que mostrou homologia significante a elongases conhecidas, com a seqüência alvo (designada Elol Para, SEQ ID NO: 9) consistindo em uma estrutura de leitura aberta de 511 resíduos e nenhum íntron. O aminoácido putativo derivado da seqüência designada é SEQ ID NO: 10.

Caracterização funcional em Saccharomvces cerevisiae O cDNA de tamanho natural que corresponde a Δ9 elongase de ácido graxo putativo (SEQ ID NO: 9) foi clonado em vetor expressão de levedura pYES2 para determina um construto pYPmFAE designada. A cepa de S. cerevisiae W303-1A foi transformada com o pYPmFAE ou o vetor vazio como um controle. As células transformadas foram crescidas em um meio mínimo que contém rafinose, e foram induzidas com 2% de galactose. Depois de 48 horas de crescimento os ácidos graxos de levedura totais foram extraídos e os FAMEs resultantes analisados por GC. A análise de GC (Figura 2) revelou que as células de levedura transformadas com pYPmFAE produziram um ácido graxo adicional que foi identificado como ácido eicosadienóico que indica que o gene que foi clona-do codificou um ácido graxo delta 9 elongase. A célula de levedura que expressa o ácido graxo delta 9 elongase de P. marinus é capaz de reconhecer o C18:2 (c9,12) substrato com uma porcentagem de 8,2% de taxa de conversão. A tabela 1 mostra o conteúdo de ácido graxo das células de levedura após a transformação com pYPmFAE (+) ou com o vetor vazio pYES2 (-) e indução com 2% de galactose. A porcentagem de conversão em 18:2δ9,12 a 20:2δ11,14, por exemplo, é calculado pela equação: Tabela 1 Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram que nenhuma atividade de elongase foi detectada com 20:4Δ5,8' 11,14, e uma atividade mínima (1% de conversão) em 18:3A6ISI12. Portanto parece que o ácido graxo Δ9 elongase é seletivo para ácido linoléico e não age para prolongar outros PUFAs.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Construto de gene, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico operavelmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras heterólogas à sequência de ácido nucleico, em que a sequência de ácido nucleico codifica um poli-peptídeo com atividade de A9-elongase e é selecionada a partir do grupo consistindo em: uma sequência compreendendo SEQ ID NO: 9 e sequências de ácido nucleico degeneradas da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

2. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um construto de gene, como definido na reivindicação 1.

3. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende um construto de gene, como definido na reivindicação 1, ou um vetor, como definido na reivindicação 2.

4. Processo para a conversão de 18:2Δ9,12 (ácido linoléico) em 20:2δ11,14, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em um microrganismo que compreende ácido linoléico pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem atividade de A9-elongase e que compreende: uma sequência compreendendo SEQ ID NO: 9 e sequências de ácido nucleico degeneradas da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos; e expressar a referida sequência de ácido nucléico.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que inclui ainda a etapa de indução com galactose.