ES2367220T3

ES2367220T3 - Ácido nucleico.

Info

Publication number: ES2367220T3
Application number: ES07731971T
Authority: ES
Inventors: Johnathan Napier; Olga Sayanova; Monica Venegas Caleron
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2006-02-16
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2011-10-31
Anticipated expiration: 2027-02-13
Also published as: GB0603160D0; ATE510923T1; AU2007216359B2; CN101421399A; WO2007093776A3; EP1984502B1; CA3006116A1; BRPI0707944A2; EP1984502A2; EP2380984B1; AR059554A1; CN101421399B; CA2641425A1; EP2380984A3; BRPI0707944B1; EP2380984A2; CA2641425C; DK1984502T3; AU2007216359A1; US20090019559A1

Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa y que se selecciona del grupo constituido por: a) una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa, en la que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 2; c) un derivado de una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 que codifica para un polipéptido con al menos el 85% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2 a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO: 2; en el que dicho polipéptido tiene actividad Δ9-elongasa.

Description

La presente invención se refiere a ácido nucleico derivado de Perkinsus marinus que codifica para una enzima 9elongasa, Δ8-desaturasa y una Δ5-desaturasa. Todas las secuencias codificantes pueden transcribirse en un único transcrito, lo que simplifica el procedimiento de transformar células requeridas para expresar las tres proteínas. La invención también se refiere a las secuencias codificantes individuales y a las proteínas codificadas por esas secuencias así como a un procedimiento para convertir ácido linoleico en ácido araquidónico.

Los ácidos grasos y triacilglicéridos tienen una multitud de aplicaciones en la industria alimenticia, en la nutrición de animales, en la cosmética y en el sector farmacológico. Dependiendo de si son ácidos grasos saturados o insaturados libres, o bien triacilglicéridos con un elevado contenido en ácidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para aplicaciones muy diferentes. Los ácidos grasos poliinsaturados, tales como ácido linoleico y ácido linolénico son esenciales para los mamíferos, ya que estos últimos no pueden producirlos. Por tanto, los ácidos grasos ω3 y los ácidos grasos ω6 poliinsaturados son un constituyente importante en la nutrición de animales y seres humanos.

A continuación en el presente documento, los ácidos grasos poliinsaturados se denominan PUFA, PUFAs, LCPUFA

o LCPUFAs (ácidos grasos poliinsaturados, PUFA, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, LCPUFA).

Los diversos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente de microorganismos tales como Mortierella y Schizochytrium o de plantas productoras de aceite tales como semilla de soja, colza, algas tales como Crypthecodinium o Phaeodactylum y otras, en las que se obtienen, como norma, en forma de sus triacilglicéridos (= triglicéridos = trigliceroles). Sin embargo, también pueden obtenerse a partir de animales, tales como, por ejemplo, los peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante hidrólisis. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga tales como ácido docosahexanoico (= DHA, C22: 6Δ4,7,10,13,16,19), ácido eicosapentaenoico (= EPA, C20:5Δ5,8,11,14,17), ácido araquidónico (= ARA, C20:4Δ5,8,11,14), dihomo-ácido γ-linolénico (C20-3Δ8,11,14) o ácido docosapentaenoico (DPA, C22:5Δ7,10,13,16,19) no se sintetizan en cultivos de aceite tales como colza, semilla de soja, girasol o cártamo. Las fuentes naturales convencionales de estos ácidos grasos son los peces tales como arenque; salmón, sardina, gallineta, anguila, carpa, trucha, fletán, caballa, lucioperaca o atún, o algas.

Dependiendo del uso previsto, se prefieren aceites con ácidos grasos saturados o insaturados. En la nutrición de seres humanos, por ejemplo, se prefieren lípidos con ácidos grasos insaturados, específicamente ácidos grasos poliinsaturados. Se dice que los ácidos grasos ω3 poliinsaturados tienen un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en la sangre y por tanto sobre la posibilidad de prevenir la cardiopatía. El riesgo de cardiopatía, accidente cerebrovascular o hipertensión puede reducirse notablemente añadiendo estos ácidos grasos ω3 a la comida. Además, los ácidos grasos ω3 tienen un efecto positivo sobre procesos inflamatorios, específicamente inflamatorios crónicos, en asociación con enfermedades inmunológicas tales como artritis reumatoide. Por tanto se añaden a los productos alimenticios, específicamente a productos alimenticios dietéticos, o se emplean en medicamentos. Los ácidos grasos ω6 tales como ácido araquidónico tienden a tener un efecto negativo sobre estos trastornos en relación con esas enfermedades reumáticas debido a nuestra ingesta dietética habitual.

Los ácidos grasos ω3y ω6 son precursores de hormones tisulares, conocidas como eicosanoides, tales como las prostaglandinas, que son derivados de dihomo-ácido γ-linolénico, ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico, y de los tromboxanos y los leucotrienos, que se derivan de ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico. Los eicosanoides (conocidos como la serie PG2) que se forman a partir de ácidos grasos ω6 fomentan generalmente reacciones inflamatorias, mientras que los eicosanoides (conocidos como la serie PG3) procedentes de ácidos grasos ω3 tienen poco o ningún efecto proinflamatorio.

Debido a las características positivas de los ácidos grasos poliinsaturados, no han faltado intentos en el pasado por disponer de genes que participan en la síntesis de estos ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos con un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Así, el documento WO 91/13972 y su equivalente estadounidense describen una Δ9-desaturasa. El documento WO 93/11245 reivindica una Δ15desaturasa y el documento WO 94/11516 una Δ12-desaturasa. Se describen desaturasas adicionales, por ejemplo, en los documentos EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lípidos 34, 1999: 649-659. Sin embargo, la caracterización bioquímica de las diversas desaturasas ha sido insuficiente hasta la fecha ya que las enzimas, al ser proteínas unidas a membrana, presentan una gran dificultad para su aislamiento y caracterización (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Como norma, las desaturasas unidas a membrana se caracterizan introduciéndose en un organismo adecuado que posteriormente se analiza para determinar la actividad enzimática analizando los materiales de partida y los productos. Se describen Δ6-desaturasas en los documentos WO 93/06712, US 5.614.393, US5614393, WO 96/21022, WO 00/21557 y WO 99/27111 y la aplicación para la producción de ácidos grasos en organismos transgénicos se describe en los documentos WO 98/46763, WO 98/46764 y WO 98/46765. En este contexto, la expresión de diversas desaturasas y la formación de ácidos grasos poliinsaturados también se describen y se reivindica en los documentos WO 99/64616 o WO 98/46776. En cuanto a la eficacia de expresión de las desaturasas y su efecto sobre la formación de ácidos grasos poliinsaturados, debe observarse que la expresión de una única desaturasa tal como se ha descrito hasta la fecha sólo ha dado como resultado bajos contenidos de ácidos grasos insaturados/lípidos tales como, por ejemplo, ácido γ-linolénico y ácido estearidónico. Además, se obtuvo, como norma, una mezcla de ácidos grasos ω3y ω6.

Las microalgas son microorganismos especialmente adecuados para la producción de PUFA, tales como Phaeodactylum tricornutum, la especie Porphiridium, la especie Thraustochytrium, la especie Schizochytrium o la especie Crypthecodinium, ciliados tales como Stylonychia o Colpidium, hongos tales como Mortierella, Entomophthora o Mucor y/o musgos tales como Physcomitrella, Ceratodon y Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269-278). La selección de cepas ha dado como resultado el desarrollo de varias cepas mutantes de los microorganismos en cuestión que producen una serie de compuestos deseables incluyendo PUFA. Sin embargo, la mutación y selección de cepas con una producción mejorada de una molécula particular tal como los ácidos grasos poliinsaturados es un procedimiento difícil y que requiere mucho tiempo. Por ello se prefieren métodos recombinantes tal como se describió anteriormente cuando es posible.

Sin embargo, sólo pueden producirse cantidades limitadas de los ácidos grasos poliinsaturados deseados tales como DPA, EPA o ARA con la ayuda de los microorganismos mencionados anteriormente, y, dependiendo del microorganismo usado, se obtienen generalmente como mezclas de ácidos grasos de, por ejemplo, EPA, DPA y ARA.

Está comentándose una variedad de rutas sintéticas para la síntesis de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) (figura 1). Así, EPA o DHA se producen en bacterias marinas tales como Vibrio sp. o Shewanella sp. Mediante la ruta de poliquétido (Yu, R. et al. Lípidos 35:1061-1064, 2000; Takeyama, H. et al. Microbiology 143:2725-2731, 1997).

Una estrategia alternativa es la actividad alternante de desaturasas y elongasas (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:255-268, 2002; Sakuradani, E. et al. Gene 238:445-453, 1999). Una modificación de la ruta descrita anteriormente mediante Δ6-desaturasa, Δ6-elongasa, Δ5-desaturasa, Δ5-elongasa y Δ4-desaturasa es la ruta de Sprecher (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486:219-231) en mamíferos. En vez de la desaturación Δ4, se realiza una etapa de elongación adicional en este caso para dar C24, seguido por una desaturación Δ6 adicional y finalmente β-oxidación para dar la longitud de cadena C22. Por tanto, sin embargo, lo que se conoce como ruta de Sprecher (véase la figura 1) no es adecuado para la producción en plantas y microorganismos ya que se desconocen los mecanismos reguladores.

Dependiendo del patrón de desaturación, los ácidos grasos poliinsaturados pueden dividirse en dos grandes clases, a saber, ácidos grasos ω6o ω3, que se diferencian con respecto a sus actividades metabólicas y funcionales (figura 1).

El material de partida para la ruta metabólica ω6 es el ácido graso ácido linoleico (18:2Δ9,12) mientras que la ruta ω3 procede mediante ácido linolénico (18:3Δ9,12,15). El ácido linolénico se forma mediante la actividad de una ω3desaturasa (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117; Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 41054113).

Los mamíferos, y por tanto los seres humanos, no tienen una actividad desaturasa correspondiente (Δ12-y ω3desaturasa) y deben captar esos ácidos grasos (ácidos grasos esenciales) mediante la comida. A partir de esos precursores, se sintetizan los ácidos grasos poliinsaturados fisiológicamente importantes ácido araquidónico (= ARA, 20:4Δ5,8,11,14), un ácido graso ω6 y los dos ácidos grasos ω3 ácido eicosapentaenoico (= EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17) y ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6Δ4,7,10,13,17,19) mediante la secuencia de reacciones de desaturasa y elongasa. La aplicación de ácidos grasos ω3 muestra la actividad terapéutica descrita anteriormente en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108), Entzündungen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345-358) y Arthritis (Cleland y James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307).

La elongación de ácidos grasos, por elongasas, en 2 ó 4 átomos C es de crucial importancia para la producción de PUFA C20 y C22, respectivamente. Este procedimiento procede mediante 4 etapas. La primera etapa es la condensación de malonil-CoA con la ácido graso-acil-CoA mediante quetoacil-CoA sintasa (KCS, denominada a continuación en el presente documento elongasa). Esto va seguido por una etapa de reducción (quetoacil-CoA reductasa, KCR), una etapa de deshidratación (deshidratasa) y una etapa de reducción final (enoil-CoA reductasa). Se ha postulado que la actividad elongasa afecta a la especificidad y la velocidad del procedimiento entero (Millar y Kunst, 1997 Plant Journal 12:121-131).

Ha habido un gran número de intentos en el pasado por obtener genes de elongasa. Millar y Kunst, 1997 (Plant Journal 12:121-131) y Millar et al. 1999, (Plant Cell 11:825-838) describen la caracterización de elongasas de plantas para la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados de cadena larga (C22:1) y para la síntesis de ácidos grasos de cadena muy larga para la formación de ceras en plantas (C28-C32). Se encuentran descripciones referentes a la síntesis de ácido araquidónico y EPA, por ejemplo, en los documentos WO0159128, WO0012720, WO02077213 y WO0208401. La síntesis de ácidos grasos C24 poliinsaturados se describe, por ejemplo, en Tvrdik et al. 2000, JCB 149:707-717 o el documento WO0244320.

Las plantas superiores comprenden ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido linoleico (18:2Δ9,12) y ácido linolénico (18:3Δ9,12,15). ARA, EPA y DHA no se encuentran en absoluto en el aceite de semillas de plantas superiores, o tan sólo en cantidades minúsculas (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales [Nuevo diccionario de aceites vegetales]. Technique & Documentation -Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Sin embargo, la producción de LCPUFA en plantas superiores, preferiblemente en cultivos de aceite tales como colza, lino, girasol y semillas de soja, sería ventajosa ya que podrían obtenerse de manera económica grandes cantidades de LCPUFA de alta calidad para la industria alimenticia, la nutrición de animales y fines farmacéuticos. Para ello, es ventajoso introducir, en cultivos de aceite, genes que codifican para enzimas de la biosíntesis de LCPUFA mediante métodos recombinantes para expresarlos en los mismos. Estos genes pueden codificar por ejemplo para Δ9elongasas, Δ8-desaturasas y/o Δ5-desaturasas. Estos genes pueden aislarse ventajosamente de microorganismos y plantas inferiores que producen LCPUFA e incorporarse en las membranas o triacilglicéridos. Por tanto, ya ha sido posible aislar genes de Δ6-desaturasa a partir del musgo Physcomitrella patens y genes de Δ6-elongasa a partir de

P. patens y a partir del nematodo C. elegans.

Las primeras plantas transgénicas que comprenden y expresan genes que codifican para enzimas de la biosíntesis de LCPUFA y que, como consecuencia, producen LCPUFA, se describieron por primera vez, por ejemplo, en el documento DE-A-102 19 203 (procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en plantas). Sin embargo, estas plantas producen LCPUFA en cantidades que requieren una optimización adicional para el procesamiento de los aceites que están presentes en las plantas.

Tal como puede observarse en la figura 1, pueden modificarse productos de la ruta ω6 usando desaturasas apropiadas y, si es necesario, elongasas para dar ácidos grasos ω3. Por tanto, sería extremadamente valioso desarrollar un producto que hiciera posible la producción de ARA en un organismo genéticamente modificado.

El parásito protozoario de la ostra Perkinsus marinusi puede sintetizar ácidos grasos saturados e insaturados, incluyendo el ácido graso esencial, ácido araquidónico [20:4(n-6)], mediante la ruta de Δ-8 desaturasa. Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que P. marinusi contiene ácido nucleico que codifica para una Δ9-elongasa, una Δ8-desaturasa y una Δ5-desaturasa que pueden transcribirse todos en un único transcrito. La secuencia de longitud completa se muestra como SEQ ID NO: 1.

Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa y que se selecciona del grupo constituido por:

a) una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa, en la que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 2;

c) un derivado de una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 que codifica para un polipéptido con al menos el 85% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2 a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO: 2; en el que dicho polipéptido tiene actividad Δ9-elongasa.

También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para polipéptidos con actividad Δ9elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa y que se selecciona del grupo constituido por:

a) una secuencia de ácido nucleico que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo de la misma;

b) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1;

c) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para polipéptidos con actividad Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa, en la que los polipéptidos se seleccionan del grupo constituido por SEQ ID NOS 2, 3 y 4;

d) un derivado de una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que codifica para polipéptidos con al menos el 40% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; en el que dichos polipéptidos tienen actividad Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa.

La ventaja de la secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente es que, aunque codifica para tres enzimas separadas, puede transcribirse como una única secuencia, lo que hace mucho más sencillo preparar vectores de clonación y expresión que expresan las tres enzimas.

La secuencia de ácido nucleico aislada puede no ser idéntica a la propia SEQ ID No 1 (secuencia 1047306867).

En el contexto de la presente invención se pretende que “se hibrida en condiciones rigurosas” describa las condiciones de hibridación y lavado en las que secuencias de nucleótidos con al menos el 60% de homología entre sí permanecen habitualmente hibridadas entre sí. Las condiciones son preferiblemente tales que las secuencias con al menos aproximadamente el 65%, preferiblemente al menos aproximadamente el 70% y de manera especialmente preferible al menos el 75% o más de homología entre sí permanecen habitualmente hibridadas entre sí. El experto en la técnica conoce estas condiciones rigurosas y se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido no limitativo de condiciones de hibridación rigurosas son las hibridaciones en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (= SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por una o más etapas de lavado en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a de 50 a 65ºC. El experto en la técnica conoce que estas condiciones de hibridación difieren dependiendo del tipo de ácido nucleico y, por ejemplo cuando hay disolventes orgánicos presentes, con respecto a la temperatura y la concentración del tampón. En “condiciones de hibridación rigurosas”, por ejemplo, la temperatura de hibridación es, dependiendo del tipo de ácido nucleico, de entre 42ºC y 58ºC en tampón acuoso con una concentración de 0,1 a 5 x SSC (pH 7,2). Si están presentes disolventes orgánicos, por ejemplo formamida al 50%, en el tampón mencionado anteriormente, la temperatura en condiciones convencionales es de aproximadamente 42ºC. Las condiciones de hibridación para híbridos de ADN:ADN, por ejemplo, son de 0,1 x SSC y de 20ºC a 45ºC, preferiblemente de 30ºC a 45ºC. Las condiciones de hibridación para híbridos de ADN:ARN son, por ejemplo, de 0,1 x SSC y de 30ºC a 55ºC, preferiblemente de 45ºC a 55ºC. Las condiciones de hibridación mencionadas anteriormente se determinan a modo de ejemplo para un ácido nucleico con aproximadamente 100 pb (= pares de bases) de longitud y con un contenido en G + C del 50% en ausencia de formamida. El experto en la técnica sabe cómo determinar las condiciones de hibridación requeridas basándose en los libros de texto mencionados anteriormente o en libros de texto tales como Sambrook et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames y Higgins (Ed.) 1985, “Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, “Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Además, cuando la presente memoria descriptiva se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas de una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o con una parte de las mismas en condiciones rigurosas, se entiende que “una parte de las mismas” significa, según la invención, que se usan para la hibridación al menos 25 pares de bases (= pb), 50 pb, 75 pb, 100 pb, 125 pb o 150 pb, preferiblemente al menos 175 pb, 200 pb, 225 pb, 250 pb, 275 pb o 300 pb, de manera especialmente preferible 350 pb, 400 pb, 450 pb, 500 pb o más pares de bases.

En el contexto de la presente invención “homólogos” de la secuencia de ácido nucleico con la secuencia SEQ ID NO: 1 significa, por ejemplo, variantes alélicas con al menos aproximadamente el 50 o el 60%, preferiblemente al menos aproximadamente el 60 o el 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 70 o el 80%, el 90% o el 95% e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad u homología con una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.

“Variantes alélicas” comprende en particular variantes funcionales que pueden obtenerse mediante deleción, inserción o sustitución de nucleótidos de/en la secuencia, pretendiéndose, sin embargo, que se conserve ventajosamente la actividad enzimática de las proteínas resultantes que se sintetizan para la inserción de uno o más genes.

“Homólogos” también significa homólogos de bacterias, hongos y plantas, secuencias truncadas, ARN o ADN monocatenario de la secuencia de ADN codificante y no codificante y derivados tales como, por ejemplo, variantes promotoras. Los promotores en sentido 5’ de las secuencias de nucleótidos detalladas pueden modificarse mediante uno o más intercambios de nucleótido, mediante inserción/inserciones y/o deleción/deleciones sin que sin embargo se vea afectada de forma adversa la funcionalidad o la actividad de los promotores. Además, es posible que la modificación de la secuencia promotora potencie su actividad o que se sustituya completamente por promotores más activos, incluyendo los de organismos heterólogos.

Con el fin de determinar el porcentaje de homología (= identidad) de dos secuencias de aminoácidos, se escriben las secuencias una debajo de la otra para una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una proteína o de un ácido nucleico con el fin de generar una alineación óptima con la otra proteína o el otro ácido nucleico). Después, se comparan los residuos de aminoácido o los nucleótidos en las posiciones de aminoácido o las posiciones de nucleótido correspondientes. Si una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esa posición (es decir “homología” de aminoácido o ácido nucleico tal como se usa en el presente contexto corresponde a “identidad” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones que comparten las secuencias (es decir % de homología = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100). Los términos homología e identidad deben considerarse por tanto sinónimos.

Se calculó la homología a lo largo de la región completa de secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico. El experto en la técnica dispone de una serie de programas que se basan en diversos algoritmos para la comparación de diversas secuencias. En este caso, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente fiables. El programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que forman parte del paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], se usaron para la alineación de secuencias. Los valores de 0gy de secuencia que se indicaron anteriormente como porcentaje se determinaron a lo largo de la región de secuencia completa usando el programa GAP y las siguientes configuraciones: peso de hueco: 50, peso de longitud: 3, coincidencia promedio: 10,000 y coincidencia errónea promedio: 0,000. A menos que se especifique lo contrario, siempre se usaron estas configuraciones como configuraciones convencionales para la alineación de secuencias.

En el contexto de la presente invención se entiende que “actividad Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa” significa que una proteína codificada por un derivado de SEQ ID NO:1 o los residuos de ácido nucleico de 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 conserva una actividad enzimática de al menos el 10%, preferiblemente el 20%, de manera especialmente preferible el 30% y muy especialmente el 40% en comparación con las proteínas/enzimas codificadas por la secuencia SEQ ID NO: 1 o los residuos de ácido nucleico de 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 y por tanto puede catalizar la conversión de ácido linoleico en ácido araquidónico.

Aunque con frecuencia es extremadamente útil transcribir ácido nucleico que codifica para polipéptidos con actividad Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa como una única secuencia, puede haber algunas circunstancias en las que sea preferible usar ácido nucleico que codifica para una única enzima, es decir una Δ9-elongasa, una Δ8desaturasa o una Δ5-desaturasa.

Con respecto a esto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada según el primer aspecto de la invención que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa.

También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ8desaturasa y que se selecciona del grupo constituido por:

a) una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo de la misma;

b) secuencias de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico que comprende los residuos de 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1;

c) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para polipéptidos con actividad Δ8-desaturasa, en la que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 3;

d) un derivado de una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 9351 a 10724 de SEQ ID NO: 1 que codifica para un polipéptido con al menos el 40% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 3; en el que dicho polipéptido tiene actividad Δ8-desaturasa.

También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ5desaturasa y que se selecciona del grupo constituido por:

a) una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo de la misma;

b) secuencias de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico que comprende los residuos de 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1;

c) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para polipéptidos con actividad Δ5-desaturasa, en la que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 4;

d) un derivado de una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 10842 a 12077 de SEQ ID NO: 1 que codifica para un polipéptido con al menos el 40% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 4; en el que dicho polipéptido tiene actividad Δ5-desaturasa.

En otro aspecto de la invención se proporciona un polipéptido que se codifica por una secuencia de ácido nucleico del primer aspecto de la invención.

Ventajosamente, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la presente invención tiene al menos el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 2.

Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se introducen ventajosamente en un casete de expresión que hace posible la expresión de los ácidos nucleicos en organismos tales como microorganismos o plantas.

Por tanto, en otro aspecto de la invención se proporciona un constructo génico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para actividad Δ9-elongasa tal como se expuso anteriormente, operativamente unida a una o más secuencias reguladoras.

En el casete de expresión, la secuencia de ácido nucleico que codifica para Δ9-elongasa y opcionalmente Δ8desaturasa y/o Δ5-desaturasa, está operativamente unida a una o más secuencias reguladoras, ventajosamente para potenciar la expresión génica. Se pretende que estas secuencias reguladoras hagan posible la expresión específica de los genes y las proteínas. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gen se expresa y/o se sobreexpresa sólo después de que haya tenido lugar la inducción, o bien que se expresa y/o se sobreexpresa inmediatamente. Por ejemplo, estas secuencias reguladoras adoptan la forma de secuencias a las que se unen inductores o represores, controlando así la expresión del ácido nucleico. Además de estas secuencias reguladoras novedosas, o en vez de estas secuencias, los elementos reguladores naturales de estas secuencias todavía pueden estar presentes antes de los genes estructurales reales y, si es apropiado, pueden haberse modificado genéticamente de tal manera que se elimina su regulación natural y se potencia la expresión de los genes. Sin embargo, el casete de expresión (= constructo de expresión = constructo génico) también puede ser de construcción más sencilla, es decir que no se han insertado señales reguladoras adicionales antes de la secuencia de ácido nucleico o sus derivados, y no se retiró el promotor natural junto con su regulación. En vez de eso, se ha mutado la secuencia reguladora natural de tal manera que ya no tiene lugar la regulación y/o se potencia la expresión génica. Estos promotores modificados también pueden colocarse por sí mismos antes del gen natural en forma de secuencias parciales (= promotor con partes de las secuencias de ácido nucleico usado según la invención) con el fin de potenciar la actividad. Además, el constructo génico también puede comprender ventajosamente una o más de lo que se conocen como secuencias potenciadoras en unión operativa con el promotor, lo que hace posible una expresión potenciada de la secuencia de ácido nucleico.

También pueden insertarse secuencias ventajosas adicionales, tales como elementos reguladores adicionales o secuencias terminadoras, en el extremo 3’ de las secuencias de ADN. También pueden estar presentes una o más secuencias que codifican para enzimas que catalizan la conversión de ARA en un ácido graso insaturado ω3 tal como EPA o DHA. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias que codifican para una Δ5-elongasa, ω3-desaturasa y/o Δ4-desaturasa, en una o más copias del casete de expresión (= constructo génico). Preferiblemente, sólo está presente una copia de los genes en cada casete de expresión. Este constructo génico o los constructos génicos pueden expresarse juntos en el organismo huésped. En este contexto, el/los constructo(s) génico(s) puede(n) insertarse en uno o más vectores y estar presente(s) en la célula en forma libre, o bien insertarse en el genoma. Resulta ventajoso para la inserción de genes adicionales en el genoma cuando los genes que van a expresarse están presentes juntos en un constructo génico.

En este contexto, los factores o las secuencias reguladoras pueden tener preferiblemente, tal como se describió anteriormente, un efecto positivo sobre la expresión génica de los genes introducidos, potenciándola de este modo. Por tanto, puede tener lugar una potenciación de los elementos reguladores, ventajosamente a nivel transcripcional, usando fuertes señales de transcripción tales como promotores y/o potenciadores. Además, sin embargo, también es posible la traducción potenciada, por ejemplo mejorando la estabilidad del ARNm.

Las secuencias reguladoras incluyen, en particular, secuencias de plantas tales como secuencias promotora y terminadora. Ventajosamente, los constructos pueden propagarse de manera estable en microorganismos, en particular en E. coli y Agrobacterium tumefaciens, en condiciones selectivas y hacer posible la transferencia de ADN heterólogo al interior de plantas o microorganismos.

Hay secuencias reguladoras útiles presentes, por ejemplo, en promotores tales como el promotor de cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laciq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR o λ-PL y se emplean ventajosamente en bacterias Gram-negativas. Hay secuencias reguladoras ventajosas adicionales presentes, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de levaduras u hongos ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores de plantas CaMV/35S [Franck et al., Célula 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o en el promotor de ubiquitina o faseolina. También son ventajosos en este contexto los promotores inducibles, tales como los promotores descritos en el documento EP-A-0 388 186 (inducibles por bencenosulfonamida), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz et al., inducibles por tetraciclina), el documento EP-A-0 335 528 (inducibles por ácido abscísico) o el documento WO 93/21334 (inducibles por etanol o ciclohexenol). Promotores de plantas adecuados adicionales son el promotor de FBPasa citosólico o el promotor de ST-LSI de la patata (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), el promotor de glicina max fosforibosil-pirofosfato amidotransferasa (n.º de registro de Genbank U87999) o el promotor específico del nodo descrito en el documento EP-A-0 249 676.

Son promotores especialmente ventajosos los promotores que hacen posible la expresión en tejidos que participan en la biosíntesis de ácidos grasos. Son muy especialmente ventajosos los promotores específicos de semillas, tales como el promotor de USP tal como se describe, pero también otros promotores tales como el promotor de LeB4, DC3, faseolina o napina. Son promotores especialmente ventajosos adicionales los promotores específicos de semillas que pueden usarse para plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas y que se describen en los documentos US 5.608.152 (promotor de napina de colza), WO 98/45461 (promotor de oleosina de Arabidopsis), US 5.504.200 (promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (promotor de Bce4 de Brassica), por Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (promotor de LeB4 de una legumbre), siendo estos promotores adecuados para dicotiledóneas. Ejemplos de promotores que son adecuados para monocotiledóneas son el promotor de lpt-2 o lpt-1 de la cebada (documentos WO 95/15389 y WO 95/23230), el promotor de hordeína de la cebada y otros promotores adecuados descritos en el documento WO 99/16890.

En principio, es posible usar todos los promotores naturales junto con sus secuencias reguladoras, tales como los mencionados anteriormente. También es posible y ventajoso usar promotores sintéticos, o bien además de o bien solos, en particular cuando median la expresión específica de semillas, tal como los descritos en el documento WO 99/16890.

Con el fin de lograr un contenido en ARN particularmente alto, especialmente en plantas transgénicas, los genes deben expresarse ventajosamente en cultivos de aceite de una manera específica de semillas. Para ello, pueden usarse promotores específicos de semillas, o los promotores que son activos en el embrión y/o en el endosperma. En principio, pueden aislarse promotores específicos de semillas tanto de plantas dicotiledóneas como de monocotiledóneas. A continuación en el presente documento se indican promotores preferidos: USP (= proteína de semilla desconocida) y vicilina (Vicia faba) [Bäumlein et al., Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], napina (colza) [documento US 5.608.152], proteína portadora de acilo (colza) [documentos US 5.315.001 y WO 92/18634], oleosina (Arabidopsis thaliana) [documentos WO 98/45461 y WO 93/20216], faseolina (Phaseolus vulgaris) [documento US 5.504.200], Bce4 [documento WO 91/13980], B4 de legumbres (promotor de LegB4) [Bäumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 y lpt1 (cebada) [documentos WO 95/15389 y WO95/23230], promotores específicos de semillas del arroz, el maíz y el trigo [documento WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 y aleuraína [documento US 5.677.474], Bce4 (colza) [documento US 5.530.149], glicina (semilla de soja) [documento EP 571 741], fosfoenol piruvato carboxilasa (semilla de soja) [documento JP 06/62870], ADR12-2 (semilla de soja) [documento WO 98/08962], isocitrato liasa (colza) [documento US 5.689.040] o α-amilasa (cebada) [documento EP 781 849].

También puede facilitarse la expresión génica en plantas mediante un promotor químicamente inducible (véase la revisión en Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Los promotores químicamente inducibles son particularmente adecuados cuando se desea que la expresión génica tenga lugar de una manera específica del tiempo. Ejemplos de tales promotores son el promotor inducible por ácido salicílico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) y un promotor inducible por etanol.

Para garantizar la integración estable de los genes de biosíntesis en la planta transgénica a lo largo de una pluralidad de generaciones, habitualmente es necesario que cada uno de los ácidos nucleicos que codifican para una proteína de interés se expresen bajo el control de un promotor separado, preferiblemente un promotor que se diferencia de los otros promotores, ya que la repetición de motivos de secuencia puede conducir a inestabilidad del ADN-T, o a acontecimientos de recombinación.

Pueden transcribirse secuencias que codifican para Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa como una única unidad que sólo necesita un promotor. Por supuesto, será necesario que otros genes que codifiquen, por ejemplo, para Δ5-elongasa, ω3-desaturasa y/o Δ4-desaturasa estén bajo el control de promotores separados.

En este contexto, el casete de expresión se construye ventajosamente de tal manera que un promotor va seguido por un sitio de escisión adecuado, ventajosamente en un poliligador, para la inserción del ácido nucleico que va a expresarse y, si es apropiado, se coloca una secuencia terminadora detrás del poliligador. Esta secuencia se repite varias veces, preferiblemente tres, cuatro o cinco veces, de modo que pueden combinarse hasta cinco genes en un constructo e introducirse en la planta transgénica en el orden que van a expresarse. Ventajosamente, la secuencia se repite hasta tres veces. Para expresar las secuencias de ácido nucleico, estas últimas se insertan detrás del promotor mediante un sitio de escisión adecuado, por ejemplo en el poliligador. Ventajosamente, cada secuencia de ácido nucleico tiene su propio promotor y, si es apropiado, su propia secuencia terminadora. Tales constructos ventajosos se dan a conocer, por ejemplo, en los documentos DE 101 02 337 o DE 101 02 338. Sin embargo, también es posible insertar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico detrás de un promotor y, si es apropiado, antes de una secuencia terminadora. En este caso, el sitio de inserción, o la secuencia, de los ácidos nucleicos insertados en el casete de expresión no son de importancia crítica, es decir que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico en la primera o la última posición en el casete sin que su expresión se vea sustancialmente influida por ellos. Ventajosamente, pueden usarse diferentes promotores tales como, por ejemplo, el promotor de USP, LegB4 o DC3, y diferentes secuencias terminadoras en el casete de expresión. Sin embargo, también es posible usar sólo un tipo de promotor en el casete. Sin embargo, esto puede conducir a acontecimientos de recombinación no deseados.

Tal como se describió anteriormente, la transcripción de los genes que se han introducido debe terminarse ventajosamente mediante secuencias terminadoras adecuadas en el extremo 3’ de los genes de biosíntesis que se han introducido (detrás del codón de parada). Un ejemplo de una secuencia que puede usarse en este contexto es la secuencia terminadora de OCS 1. Como es el caso con los promotores, deben usarse diferentes secuencias terminadoras para cada gen.

El constructo génico de la presente invención también puede comprender genes biosíntesis del metabolismo de lípidos o ácidos grasos seleccionados del grupo de acil-CoA deshidrogenasa(s), acil-ACP [= proteína portadora de acilo] desaturasa(s), acil-ACP tioesterasa(s), ácido graso aciltransferasa(s), acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferasa(s), ácido graso sintasa (s), ácido graso hidroxilasa(s), acetil-coenzima A carboxilasa(s), acil-coenzima A oxidasa(s), ácido graso desaturasa(s), ácido graso acetilenasas, lipoxigenasas, triacilglicerol lipasas, alenoxido sintasas, hidroperóxido liasas o ácido graso elongasa(s) y desaturasa(s) tales como Δ4-desaturasa, Δ5-desaturasa, Δ6-desaturasa, Δ8-desaturasa, Δ9-desaturasa, Δ12-desaturasa o Δ6-elongasa.

Estos ácidos nucleicos o genes adicionales pueden clonarse dentro de los casetes de expresión, que entonces se usan para transformar plantas con ayuda de vectores tales como Agrobacterium.

En este caso, los factores o las secuencias reguladoras pueden tener preferiblemente, tal como se describió anteriormente, un efecto positivo sobre, y por tanto potenciar, los genes de expresión que se han introducido. Por tanto, puede tener lugar ventajosamente la potenciación de los elementos reguladores a nivel transcripcional usando señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o potenciadores. Sin embargo, también es posible una traducción potenciada, por ejemplo mejorando la estabilidad del ARNm. En principio, los casetes de expresión pueden usarse directamente para su introducción en las plantas o bien pueden introducirse en un vector.

Por tanto, en aún otro aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico o un constructo génico en cualquiera de los aspectos de la invención descritos anteriormente.

En una realización, el vector puede ser un vector de clonación.

La(s) secuencia(s) de ácido nucleico de la invención puede(n) introducirse sola(s), o preferiblemente, en combinación con un casete de expresión (constructo de ácido nucleico) en un organismo. Para introducir los ácidos nucleicos, estos últimos se amplifican ventajosamente y se ligan de una manera conocida. Preferiblemente, se sigue un procedimiento según el protocolo de Pfu ADN polimerasa o una mezcla de Pfu/Taq ADN polimerasa. Los cebadores se seleccionan teniendo en consideración la secuencia que va a amplificarse. Los cebadores deben elegirse ventajosamente de tal manera que el producto amplificado comprenda la secuencia codogénica completa desde el codón de iniciación hasta el codón de parada. Tras la amplificación, se analiza convenientemente el producto amplificado. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una separación electroforética en gel, que va seguida por un análisis cuantitativo o cualitativo. Posteriormente, puede purificarse el producto amplificado siguiendo un protocolo convencional (por ejemplo Qiagen). Entonces se dispone de una alícuota del producto amplificado purificado para la etapa de clonación posterior.

El experto en la técnica conoce generalmente vectores de clonación adecuados. Incluyen, en particular, vectores que pueden replicarse en sistemas microbianos, es decir principalmente vectores que garantizan la clonación eficaz en levaduras u hongos y que hacen posible la transformación estable de plantas. Los que deben mencionarse en particular son diversos sistemas de vectores binarios y cointegrados que son adecuados para la transformación mediada por ADN-T. Tales sistemas de vectores se caracterizan, como norma, porque comprenden al menos los genes vir requeridos para la transformación mediada por Agrobacterium y las secuencias delimitadoras de ADN-T (borde de ADN-T). Estos sistemas de vectores también comprenden ventajosamente regiones reguladoras en cis adicionales tales como promotores y secuencias terminadoras y/o marcadores de selección, por medio de los cuales pueden identificarse organismos transformados adecuadamente. Aunque en el caso de sistemas de vectores cointegrados los genes vir y las secuencias de ADN-T están dispuestos en el mismo vector, los sistemas binarios se basan en al menos dos vectores, uno de los cuales lleva los genes vir, pero no ADN-T, mientras que el segundo lleva ADN-T, pero ningún gen vir. Debido a esto, los últimos vectores mencionados son relativamente pequeños, fáciles de manipular y de replicar tanto en E. coli como en Agrobacterium. Estos vectores binarios incluyen vectores de la serie pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Según la invención; preferiblemente se usan Bin19, pBl101, pBinAR, pGPTV y pCAMBIA. Se encuentra un resumen de los vectores binarios y su uso en Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Con el fin de preparar los vectores, en primer lugar pueden linealizarse los vectores con endonucleasa(s) de restricción y después modificarse enzimáticamente de una manera adecuada. Posteriormente, se purifica el vector, y se emplea una alícuota para la etapa de clonación. En la etapa de clonación, el producto amplificado enzimáticamente escindido y, si es apropiado, purificado se clona con fragmentos de vector que se han preparado de una manera similar, usando ligasa. En este contexto, un constructo de ácido nucleico particular, o constructo de vector o plásmido, puede tener un o bien más de un segmento génico codogénico. Preferiblemente los segmentos génicos codogénicos en estos constructos están operativamente unidos a secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras incluyen, en particular, secuencias de plantas tales como los promotores y las secuencias terminadoras descritos anteriormente. Ventajosamente, los constructos pueden propagarse de manera estable en microorganismos, en particular en E. coli y Agrobacterium tumefaciens, en condiciones selectivas y hacer posible la transferencia de ADN heterólogo en plantas o microorganismos.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden introducirse en organismos tales como microorganismos o ventajosamente plantas, ventajosamente usando vectores de clonación, y por tanto pueden usarse en la transformación de plantas tales como las publicadas y citadas en: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Ratón, Florida), capítulo 6/7, p. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225). Por tanto, los ácidos nucleicos, ácidos nucleicos y constructos de ácido nucleico de la invención, y/o los vectores usados en el procedimiento pueden usarse para la modificación recombinante de un amplio espectro de organismos, ventajosamente plantas, de modo que estos últimos se vuelven productores de ARA mejores y/o más eficaces.

Existe una serie de mecanismos mediante los cuales es posible la modificación de las proteínas Δ9-elongasa, Δ8desaturasa y Δ5-desaturasa, de modo que el rendimiento, la producción y/o la eficacia de producción de ARA en una planta, preferiblemente en una planta de cultivo de aceite o un microorganismo, pueden verse influidos directamente debido a estas proteínas modificadas. Puede aumentarse el número o la actividad de las proteínas o los genes, de modo que se producen mayores cantidades de los productos génicos y, en última instancia, mayores cantidades de los compuestos de fórmula general I. También es posible una síntesis de novo en un organismo que carecía de la actividad y la capacidad para biosintetizar los compuestos antes de la introducción del/de los gen(es) correspondiente(s). Esto se aplica de manera análoga a la combinación con desaturasas o elongasas adicionales o enzimas adicionales del metabolismo de ácidos grasos y lípidos. El uso de diversas secuencias divergentes, es decir secuencias que se diferencian a nivel de la secuencia de ADN, también puede ser ventajoso en este contexto, o bien el uso de promotores para la expresión génica que hacen posible una expresión génica diferente en el transcurso del tiempo, por ejemplo como función del grado de madurez de una semilla o un tejido de almacenamiento de aceite.

Debido a la introducción de un gen que codifica para Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y/o Δ5-desaturasa en un organismo, solo o en combinación con otros genes en una célula, no sólo es posible aumentar el flujo de biosíntesis hacia el producto final, sino también aumentar, o crear de novo, la composición de triacilglicerol correspondiente. Asimismo, puede aumentarse el número o la actividad de otros genes que participan en la importación de nutrientes que se requieren para la biosíntesis de uno o más ácidos grasos, aceites, lípidos polares y/o neutros, de modo que se aumenta la concentración de estos precursores, cofactores o productos intermedios dentro de las células o dentro de los compartimentos de almacenamiento, mediante lo cual se potencia adicionalmente la capacidad de las células para producir ARA tal como se describe a continuación. Optimizando la actividad o aumentando el número de uno o más genes que codifican para Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y/o Δ5-desaturasa que participan en la biosíntesis de ARA, o destruyendo la actividad de uno o más genes que participan en la degradación de ARA, se hace posible un rendimiento, producción y/o eficacia de producción potenciados de moléculas de ácido graso y lípido en organismos, ventajosamente en plantas.

Los ácidos nucleicos que pueden usarse ventajosamente en el procedimiento se derivan de bacterias, hongos, diatomeas, animales tales como Caenorhabditis u Oncorhynchus o plantas tales como algas o musgos, tales como los géneros Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, específicamente de los géneros y especies Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans o de manera especialmente ventajosa de Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonona o Crypthecodinium cohnii.

En una realización alternativa, el vector puede ser un vector de expresión diseñado para transformar un organismo en el que debe expresarse el ácido nucleico y convertirse ácido linoleico en ARA.

Estos vectores ventajosos, preferiblemente vectores de expresión, comprenden el/los ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) para Δ9-elongasa y opcionalmente Δ8-desaturasa y/o Δ5-desaturasa y que se describieron anteriormente.

Tal como se usa en el presente contexto, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar a otro ácido nucleico al que está unida. Un tipo de vector es un “plásmido”, un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Un tipo adicional de vector es un vector viral, siendo posible ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores pueden realizar replicación autónoma en una célula huésped en la que se han introducido (por ejemplo vectores bacterianos con origen de replicación bacteriano). Otros vectores se integran ventajosamente en el genoma de una célula huésped cuando se introducen en la célula huésped, y por tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores pueden gobernar la expresión de genes a los que están operativamente unidos. Estos vectores se denominan en el presente contexto “vectores de expresión”. Habitualmente, los vectores de expresión que son adecuados para técnicas de recombinación de ADN adoptan la forma de plásmidos.

En la presente descripción, cuando se usa el término “plásmido”, debe entenderse que los plásmidos pueden ser adecuados para otros tipos de vectores de expresión, tales como vectores virales, que ejercen funciones similares. Además, también se pretende que el término “vector” comprenda otros vectores con los que el experto en la técnica está familiarizado, tales como fagos, virus tales como SV40, CMV, TMV, transposones, elementos de IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular.

Los vectores de expresión recombinantes usados ventajosamente en el procedimiento comprenden los ácidos nucleicos descritos a continuación o el constructo génico descrito anteriormente en una forma que es adecuada para expresar los ácidos nucleicos usados en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes comprenden una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en la células huésped usadas para la expresión, secuencia(s) reguladora(s) que está(n) operativamente unida(s) a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. En un vector de expresión recombinante, “operativamente unido” significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de tal manera que la expresión de la secuencia de nucleótidos es posible y están unidas entre sí de tal manera que ambas secuencias llevan a cabo la función predicha que se atribuye a la secuencia (por ejemplo en un sistema de transcripción/traducción in vitro, o en una célula huésped si el vector se introduce en la célula huésped). Se pretende que la expresión “secuencia reguladora” comprenda promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo señales de poliadenilación). Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), o véase: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Ratón, Florida, Ed.: Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, incluyendo las referencias citadas en los mismos. Las secuencias reguladoras comprenden aquellas que gobiernan la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que gobiernan la expresión directa de la secuencia de nucleótidos sólo en células huésped específicas en condiciones específicas. El experto en la técnica sabe que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión deseado de la proteína y similares.

Los vectores de expresión recombinantes usados pueden diseñarse para la expresión de Δ9-elongasa, Δ8desaturasa y/o Δ5-desaturasa en células procariotas o eucariotas. Esto es ventajoso porque con frecuencia se llevan a cabo etapas intermedias de la construcción del vector en microorganismos por motivos de simplicidad. Por ejemplo, el gen de Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y/o Δ5-desaturasa puede expresarse en células bacterianas, células de insecto (usando vectores de expresión de Baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (véase Romanos, M.A., et al. (1992) “Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) “Heterologous gene expression in filamentous fungi”, en: More Gene Manipulations in Fungi,

J.W. Bennet & L.L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt,

P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3:239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturasaudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella y Stylonychia, en particular de los géneros Stylonychia lemnae, usando vectores en un método de transformación tal como se describe en el documento WO 98/01572 y, preferiblemente, en células de plantas multicelulares (véase Schmidt, R. y Willmitzer, L. (1988) “High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, capítulo 6/7, pp.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (y referencias citadas en los mismos)). Además, se comentan células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.

En la mayoría de los casos, la expresión de proteínas en procariotas implica el uso de vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles que gobiernan la expresión de proteínas de fusión o no de fusión. Vectores de expresión de fusión típicos son, entre otros, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), en los que se fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa-E y proteína A, respectivamente, con la proteína diana recombinante.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli no de fusión, inducibles, adecuados, son, entre otros, pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) y pET 11 d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión del gen diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido por la ARN polimerasa del huésped. La expresión del gen diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción de un promotor de fusión T7-gn10-lac, que está mediada por una ARN polimerasa viral (T7 gn1), que se coexpresa. Esta polimerasa viral la proporcionan las cepas huésped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) a partir de un λ-profago residente que alberga un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

El experto en la técnica conoce otros vectores que son adecuados para organismos procariotas, estos vectores son, por ejemplo en E. coli pLG338, pACYC184, la serie de pBR tales como pBR322, la serie de pUC tales como pUC18

o pUC19, la serie de M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 o pBdCl, en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667.

En una realización adicional, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Ejemplos para vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae comprenden pYeDesaturasac1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y procedimientos para la construcción de vectores que son adecuados para su uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, comprenden los que se describen en detalle en: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics de fungi, J.F. Peberdy et al., Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, o en: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego]. Vectores de levaduras adecuados adicionales son, por ejemplo, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23.

Como alternativa, Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y/o Δ5-desaturasa pueden expresarse en células de insecto usando vectores de Baculovirus. Los vectores de expresión de Baculovirus que están disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (por ejemplo células Sf9) comprenden la serie de pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie de pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

Los vectores mencionados anteriormente sólo son un pequeño resumen de vectores adecuados que son posibles. El experto en la técnica conoce plásmidos adicionales y se describen, por ejemplo, en: Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Para sistemas de expresión adecuados adicionales para células procariotas y eucariotas véanse los capítulos 16 y 17 en Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En una realización adicional del procedimiento, la Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y/o Δ5-desaturasa pueden expresarse en células de plantas unicelulares (tales como algas), véase Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 y referencias citadas en el mismo, y en células de plantas a partir de plantas superiores (por ejemplo espermatofitos tales como cultivos herbáceos). Ejemplos de vectores de expresión en plantas comprenden los que se describen en detalle en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., y Masterson, R. (1992) “New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; y Bevan, M.W. (1984) “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, p. 15-38.

Un casete de expresión en plantas comprende preferiblemente secuencias reguladoras que pueden gobernar la expresión de genes en células de plantas y que están operativamente unidas de modo que cada secuencia puede cumplir su función, tal como terminación transcripcional, por ejemplo señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se derivan de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, tal como gen 3 del plásmido de Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 y sig.), que se conoce como octopina sintasa, o equivalentes funcionales del mismo, pero todas las demás secuencias terminadoras que sean funcionalmente activas en plantas también son posibles.

Ya que con mucha frecuencia la expresión de genes en plantas no se limita al nivel transcripcional, un casete de expresión en plantas comprende preferiblemente otras secuencias que están operativamente unidas, tales como potenciadores de traducción, por ejemplo la secuencia directa (“overdrive”), que potencia la secuencia líder no traducida en 5’ del virus del mosaico del tabaco, lo que aumenta la razón proteína/ARN (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

Tal como se describió anteriormente, la expresión génica en plantas debe operativamente unida con un promotor adecuado que activa la expresión génica con la correcta sincronización o de una manera específica de célula o de tejido. Promotores que pueden usarse son promotores constitutivos (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tales como los que se derivan de virus de plantas, tales como 35S CaMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (véanse también los documentos US 5352605 y WO 84/02913), o promotores de plantas, tales como el promotor de la subunidad de Rubisco, que se describe en el documento US 4.962.028.

Otras secuencias preferidas para su uso en la unión operativa en casetes de expresión génica en plantas son las secuencias de selección como diana, que se requieren para dirigir el producto génico a su correspondiente compartimento celular (véase una revisión en Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 y referencias citadas en el mismo), por ejemplo en la vacuola, en el núcleo, todos los tipos de plastos, tales como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplasmático, elaioplasto, peroxisomas y otros compartimentos de células de plantas.

Tal como se describió anteriormente, la expresión génica en plantas también puede lograrse mediante un promotor químicamente inducible (véase una revisión en Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Los promotores químicamente inducibles son particularmente adecuados cuando se desea que la expresión génica tenga lugar de una manera específica del tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) y un promotor inducible por etanol.

Promotores que responden a condiciones de estrés biótico o abiótico también son adecuados, por ejemplo el promotor del gen PRP1 inducido por patógeno (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor de hsp80 del tomate inducido por calor (documento US 5.187.267), el promotor de la alfa-amilasa de la patata inducible por heladas (documento WO 96/12814) o el promotor de pinII inducible por heridas (documento EP-A-0 375 091).

Se prefieren especialmente los promotores que provocan la expresión génica en tejidos y órganos en los que tiene lugar la biosíntesis de ácidos grasos, lípidos y aceites, en células de semillas, tales como células del endosperma y el embrión en desarrollo. Son promotores adecuados el promotor de napina de la colza (documento US 5.608.152), el promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (documento US 5.504.200), el promotor de Bce4 de Brassica (documento WO 91/13980) o el promotor de B4 de las leguminosas (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9), y promotores que provocan la expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Promotores dignos de mención adecuados son el promotor del gen lpt2 o lpt1 de la cebada (documentos WO 95/15389 y WO 95/23230)

o los promotores del gen de hordeína de la cebada, el gen de glutelina del arroz, el gen de orizina del arroz, el gen de prolamina del arroz, el gen de gliadina del trigo, el gen de glutelina del trigo, el gen de zeína del maíz, el gen de glutelina de la avena, el gen de kasirina del sorgo o el gen de secalina del centeno, que se describen en el documento WO 99/16890.

Tal como se describió anteriormente, puede ser ventajoso incluir en un casete de expresión ácido nucleico que codifica para enzimas que pueden convertir ARA en ácidos grasos ω3 insaturados tales como EPA o DHA. Por tanto, por ejemplo el casete de expresión puede incluir ácido nucleico que codifica para una Δ5-elongasa, ω3desaturasa y/o Δ4-desaturasa. Tales casetes de expresión pueden introducirse mediante la transformación simultánea de una pluralidad de constructos de expresión individuales o, preferiblemente, combinando una pluralidad de casetes de expresión en un constructo. Además, puede transformarse una pluralidad de vectores en cada caso con una pluralidad de casetes de expresión y después transferirse en la célula huésped.

Otros promotores que también son especialmente adecuados son los que provocan la expresión específica de plastos, ya que los plastos constituyen el compartimento en el que se sintetizan los precursores y algunos productos finales de la biosíntesis de lípidos. Se describen promotores adecuados, tales como el promotor de la ARN polimerasa viral, en los documentos WO 95/16783 y WO 97/06250, y el promotor de clpP de Arabidopsis, descrito en el documento WO 99/46394.

Puede introducirse ADN vector en células procariotas y eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Se pretende que los términos “transformación” y “transfección”, conjugación y transducción, tal como se usan en el presente contexto, comprendan una multitud de métodos conocidos en la técnica para la introducción de ácido nucleico extraño (por ejemplo ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada químicamente, electroporación o bombardeo de partículas. Pueden encontrarse métodos adecuados para la transformación o transfección de células huésped, incluyendo células de plantas, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros libros de texto de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un organismo no humano transgénico que comprende al menos un transgén que comprende un ácido nucleico según un aspecto anterior de la invención, o que comprende al menos un constructo génico o vector según un aspecto previo de la invención.

El organismo no humano transgénico puede ser un microorganismo, un animal no humano o una planta.

Células huésped que son adecuadas en principio para captar el ácido nucleico según la invención, el producto génico según la invención o el vector según la invención son organismos procariotas o eucariotas. Los organismos huésped que se usan ventajosamente son microorganismos tales como hongos o levaduras, o células de plantas, preferiblemente plantas o partes de las mismas. Preferiblemente se usan hongos, levaduras o plantas, especialmente plantes, por ejemplo plantes tales como cultivos de aceite, que tienen alto contenido en compuestos lipídicos, tales como colza, onagra, cáñamo, cardo, cacahuete, canola, lino, semilla de soja, cártamo, girasol, borraja, o plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, algodón, tapioca, pimienta, Tagetes, plantas Solanacea tales como patata, tabaco, berenjenas y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas tupidas (café, cacao, té), especies de Salix, árboles (palmera, coco), e hierbas perennes y cultivos de forraje. Plantas especialmente preferidas según la invención son los cultivos de aceite tales como semilla de soja, cacahuete, colza, canola, lino, cáñamo, onagra, girasol, cártamo, árboles (palmera, coco).

En una realización ventajosa, la expresión “(molécula de) ácido nucleico” tal como se usa en el presente contexto comprende adicionalmente la secuencia no traducida en el extremo 3’ y 5’ de la región del gen codificante: al menos 500, preferiblemente 200, de manera especialmente preferible 100 nucleótidos de la secuencia en sentido 5’ del extremo 5’ de la región codificante y al menos 100, preferiblemente 50, de manera especialmente preferible 20 nucleótidos de la secuencia en sentido 3’ del extremo 3’ de la región del gen codificante. Una molécula de ácido nucleico “aislada” está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Un ácido nucleico “aislado” no tiene preferiblemente ninguna secuencia que flanquea de manera natural al ácido nucleico en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico (por ejemplo secuencias que están ubicadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico). En diversas realizaciones, la molécula de Δ9-elongasa, ΔB-desaturasa o Δ5-desaturasa aislada puede comprender por ejemplo menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de manera natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Lo mismo se aplica a otras secuencias de ácido nucleico que pueden incluirse en un casete de expresión, por ejemplo secuencias que codifican para una Δ5-elongasa, ω3-desaturasa y/o Δ4-desaturasa

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden aislarse usando técnicas convencionales de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en las mismas. Además, pueden identificarse por ejemplo una secuencia homóloga o regiones de secuencia conservadas homólogas a nivel de ADN o aminoácido con ayuda de algoritmos comparativos. Pueden usarse como sonda de hibridación y pueden usarse técnicas de hibridación convencionales (tales como, por ejemplo, las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para aislar secuencias de ácido nucleico adicionales en el procedimiento.

Además, una molécula de ácido nucleico de Perkinsus marinus que comprende una secuencia completa de SEQ ID NO: 1 o una parte de la misma puede aislarse mediante reacción en cadena de la polimerasa, en la que cebadores oligonucleotídicos que se usan se basan en esta secuencia o partes de la misma (por ejemplo una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia completa o parte de la misma puede aislarse mediante reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores oligonucleotídicos que se han generado basándose en esta misma secuencia). Por ejemplo, puede aislarse ARNm a partir de células (por ejemplo por medio del método de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) y ADNc por medio de transcriptasa inversa (por ejemplo transcriptasa inversa de Moloney MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., San Petersburgo, FL).

Pueden generarse cebadores oligonucleotídicos sintéticos para la amplificación por medio de reacción en cadena de la polimerasa basándose en una de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1 o con ayuda de las secuencias de aminoácidos detalladas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Se muestran cebadores particularmente adecuados en los ejemplos como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

Un ácido nucleico según la invención puede amplificarse mediante técnicas de amplificación de PCR convencionales usando ADNc o, alternativamente, ADN genómico como molde (SEQ ID NO 9) y cebadores oligonucleotídicos adecuados (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6). Por tanto, el ácido amplificado puede clonarse en un vector adecuado y caracterizarse por medio de análisis de secuencia de ADN. Pueden generarse oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de desaturasa o elongasa mediante métodos sintéticos convencionales, por ejemplo usando un sintetizador de ADN automático.

Los ácidos nucleicos y las moléculas de proteína mencionados anteriormente con actividad Δ9-elongasa, Δ8desaturasa y/o Δ5-desaturasa pueden usarse en un procedimiento para la producción de ARA a partir de ácido linoleico en organismos transgénicos.

Se describe un procedimiento para la conversión de ácido linoleico o un derivado del mismo en ácido araquidónico o un derivado del mismo en un organismo, comprendiendo el procedimiento introducir en un organismo que comprende ácido linoleico al menos una secuencia de ácido nucleico que comprende:

a) SEQ ID NO: 1 (secuencia completa 1047306867), secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo de una de ellas;

b) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 12077 de SEQ ID NO: 1;

5 c) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para polipéptidos con actividad Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa, en la que los polipéptidos se seleccionan del grupo constituido por SEQ ID NOS 2, 3 y 4;

d) un derivado de una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que codifica para polipéptidos con al menos el 10 40% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; en el que dichos polipéptidos tienen actividad Δ9-elongasa, Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa;

y expresar dicha secuencia de ácido nucleico.

15 En el contexto de la presente invención, un “derivado” de ácido linoleico o araquidónico es un compuesto en el que el OH del resto ácido carboxílico se sustituye por un resto R1, en el que:

R1 es coenzima A (tioéster), lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol, base de esfingo o un radical de la fórmula II 20

imagen1

en la que

R2

25 = hidrógeno, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol o alquilcarbonilo C2-C24 saturado o insaturado,

R3 = hidrógeno, alquilcarbonilo C2-C24 saturado o insaturado, o R2 y R3 independientemente uno del otro son un radical de la fórmula Ia: 30

imagen1

en laquen =2, 3,4, 5, 6,7 ó9, m =2,3, 4,5 ó6 y p =0 ó 3;

35 y en el que un oxígeno del radical R1 puede sustituirse por azufre de tal manera que R1 está unido al resto de la molécula mediante un enlace tioéster.

Los procedimientos proporcionan preferiblemente ARA total en un contenido de al menos el 1% en peso, ventajosamente al menos el 3% en peso, basándose en los ácidos grasos totales en los organismos transgénicos, 40 preferiblemente en una planta transgénica.

Dado que se realiza una pluralidad de etapas de reacción por los compuestos de partida ácido linoleico (18:2Δ9,12) en el procedimiento, ARA (20:4Δ5,8,11,14) no se obtiene como producto puro; siempre están presentes restos menores de los precursores en el producto final.

45 También puede sintetizarse ARA químicamente puro mediante el procedimiento descrito anteriormente. Para ello, se aísla ARA o un derivado del mismo de los organismos, tales como los microorganismos o las plantas o el medio de cultivo en o sobre el cual se han hecho crecer los organismos, o del organismo y el medio de cultivo, de una manera conocida, por ejemplo mediante extracción, destilación, cristalización, cromatografía o una combinación de estos

50 métodos. Estos ARA químico o derivados de ARA son ventajosos para aplicaciones en el sector de la industria alimenticia, el sector cosmético y especialmente el sector de la industria farmacológica.

El procedimiento puede incluir etapas de convertir el ARA en un ácido graso ω-3 introduciendo en el organismo ácido nucleico que codifica para una ω-3 desaturasa y opcionalmente una Δ5-elongasa y/o una Δ4-elongasa y/o una Δ4-desaturasa.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento para la conversión de 18:2Δ9,12 (ácido linoleico) en 20:2Δ11,14, comprendiendo el procedimiento introducir en un organismo que comprende ácido linoleico al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad Δ9-elongasa y que comprende:

a) una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 o un homólogo de una de ellas;

b) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa, en la que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 10;

c) un derivado de una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 9 que codifica para un polipéptido con al menos el 40% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 10; en el que dicho polipéptido tiene actividad Δ9-elongasa;

y expresar dicha secuencia de ácido nucleico.

El procedimiento puede incluir etapas adicionales de convertir el ARA en un ácido graso ω-3 introduciendo en el organismo ácido nucleico que codifica para una ω-3 desaturasa y opcionalmente una Δ5-elongasa y/o una Δ4elongasa y/o una Δ4-desaturasa.

Para los procedimientos expuestos anteriormente, se ha encontrado que la expresión se ha logrado de la manera más eficaz usando inducción con galactosa.

Organismos adecuados para la producción en el procedimiento según la invención son, en principio, cualquier organismo tal como microorganismos, animales no humanos o plantas.

Plantas que son adecuadas son, en principio, todas las plantas que pueden sintetizar ácidos grasos, tales como todas las plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas, algas o musgos. Se seleccionan plantas ventajosas del grupo de las familias de plantas Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Euglenaceae, Prasinophyceae o plantas de hortalizas u ornamentales tales como Tagetes.

Ejemplos que pueden mencionarse son las siguientes plantas seleccionadas del grupo constituido por: Adelotheciaceae tal como los géneros Physcomitrella, por ejemplo el género y especie Physcomitrella patens, Anacardiaceae tal como los géneros Pistacia, Mangifera, Anacardium, por ejemplo el género y especie Pistacia vera [pistacho], Mangifer indica [mango] o Anacardium occidentale [anacardo], Asteraceae, tal como los géneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, por ejemplo el género y especie Calendula officinalis [margarita común], Carthamus tinctorius [cártamo], Centaurea cyanus [clavel de San Juan], Cichorium intybus [achicoria], Cynara scolymus [alcachofa], Helianthus annus [girasol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [hortalizas de ensalada], Tagetes lucida, Tagetes erecta o Tagetes tenuifolia [margarita africana o francesa], Apiaceae, tal como el género Daucus, por ejemplo el género y especie Daucus carota [zanahoria], Betulaceae, tal como el género Corylus, por ejemplo los géneros y especies Corylus avellana o Corylus colurna [avellana], Boraginaceae, tal como el género Borago, por ejemplo el género y especie Borago officinalis [borraja], Brassicaceae, tal como los géneros Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, por ejemplo los géneros y especies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [colza], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostaza], Brassica oleracea [remolacha forrajera] o Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, tal como los géneros Anana, Bromelia (piña), por ejemplo los géneros y especies Anana comosus, Ananas ananas o Bromelia comosa [piña], Caricaceae, tal como el género Carica, tal como el género y especie Carica papaya [papaya], Cannabaceae, tal como el género Cannabis, tales como el género y especie Cannabis sativa [cáñamo], Convolvulaceae, tal como los géneros Ipomea, Convolvulus, por ejemplo los géneros y especies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba o Convolvulus panduratus [boniato, batata], Chenopodiaceae, tal como el género Beta, tal como los géneros y especies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva o Beta vulgaris var esculenta [remolacha azucarera], Crypthecodiniaceae, tal como el género Crypthecodinium, por ejemplo el género y especie Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, tal como el género Cucurbita, por ejemplo los géneros y especies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo o Cucurbita moschata [calabaza], Cymbellaceae, tal como los géneros Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, por ejemplo el género y especie Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, tal como los géneros Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, por ejemplo los géneros y especies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus o Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae, tal como el género Elaeagnus, por ejemplo el género y especie Olea europaea [aceituna], Ericaceae, tal como el género Kalmia, por ejemplo los géneros y especies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros o Kalmia lucida [laurel de montala], Euglenaceae, tal como los géneros Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalaphacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas, Trachelomonas, por ejemplo el género y especie Euglena gracilis; Euphorbiaceae, tal como los géneros Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, por ejemplo los géneros y especies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [yuca] o Ricinus communis [planta de aceite de ricino], Fabaceae, tal como los géneros Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, semilla de soja, por ejemplo los géneros y especies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [guisante], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbeck, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [alfalfa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida o Soja max [semilla de soja], Funariaceae, tal como los géneros Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, por ejemplo los géneros y especies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae; tal como los géneros Pelargonium, Cocos, Oleum, por ejemplo los géneros y especies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides u Oleum cocois [coco], Gramineae, tal como el género Saccharum, por ejemplo el género y especie Saccharum officinarum, Juglandaceae, tal como los géneros Juglans, Wallia, por ejemplo los géneros y especies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra o Wallia nigra [nuez], Lauraceae, tal como los géneros Persea, Laurus, por ejemplo los géneros y especies Laurus nobilis [laurel], Persea americana, Persea gratissima o Persea persea [aguacate], Leguminosae, tal como el género Arachis, por ejemplo el género y especie Arachis hypogaea [cacahuete], Linaceae, tal como los géneros Adenolinum, por ejemplo los géneros y especies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense o Linum trigynum [lino], Lythrarieae, tal como el género Punica, por ejemplo el género y especie Punica granatum [granada], Malvaceae, tal como el género Gossypium, por ejemplo los géneros y especies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum o Gossypium thurberi [algodón], Marchantiaceae, tal como el género Marchantia, por ejemplo los géneros y especies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, tal como el género Musa, por ejemplo los géneros y especies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [plátano], Onagraceae, tal como los géneros Camissonia, Oenothera, por ejemplo los géneros y especies Oenothera biennis o Camissonia brevipes [onagra], Palmae, tal como el género Elaeis, por ejemplo el género y especie Elaeis guineensis [palmera], Papaveraceae, tal como, por ejemplo, el género Papaver, por ejemplo los géneros y especies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [amapola], Pedaliaceae, tal como el género Sesamum, por ejemplo el género y especie Sesamum indicum [sésamo], Piperaceae, tal como los géneros Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, por ejemplo los géneros y especies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [pimienta de cayena], Poaceae, tal como los géneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (maíz), Triticum, por ejemplo los géneros y especies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cebada], Secale cereale [centeno], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [avenas], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [mijo], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [maíz] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare [trigo], Porphyridiaceae, tal como los géneros Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, por ejemplo el género y especie Porphyridium cruentum, Proteaceae, tal como el género Macadamia, por ejemplo el género y especie Macadamia intergrifolia [macadamia], Prasinophyceae, tal como los géneros Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, por ejemplo los géneros y especies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, tal como el género Coffea, por ejemplo los géneros y especies Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora o Coffea liberica [café], Scrophulariaceae, tal como el género Verbascum, por ejemplo los géneros y especies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum o Verbascum thapsus [verbasco], Solanaceae, tal como los géneros Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, por ejemplo los géneros y especies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimienta], Capsicum annuum [pimentón dulce], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorlfii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [patata], Solanum melongena [berenjena] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum [tomate], Sterculiaceae, tal como el género Theobroma, por ejemplo el género y especie Theobroma cacao [cacao] o Theaceae, tal como el género Camellia, por ejemplo el género y especie Camellia sinensis [té].

Son microorganismos ventajosos, por ejemplo, hongos seleccionados del grupo de las familias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae o Tuberculariaceae.

Ejemplos de microorganismos que pueden mencionarse son los de los grupos: Choanephoraceae, tal como los géneros Blakeslea, Choanephora, por ejemplo los géneros y especies Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae, tal como el género Mortierella, por ejemplo los géneros y especies Mortierella isabellina, Mortierella policephala , Mortierella ramanniana , Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae, tal como los géneros Phytium, Phytophthora, por ejemplo los géneros y especies Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae, tal como los géneros Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, por ejemplo los géneros y especies Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polimorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polimorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolitica, Schizosacharomycetaceae tal como los géneros Schizosaccharomyces por ejemplo las especie Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae tal como los géneros Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium por ejemplo las especies Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum o Thraustochytrium visurgense.

Microorganismos ventajosos adicionales son, por ejemplo, bacterias seleccionadas del grupo de las familias Bacillaceae, Enterobacteriacae o Rhizobiaceae.

Ejemplos que pueden mencionarse son los siguientes microorganismos seleccionados del grupo constituido por: Bacillaceae, tal como el género Bacillus, por ejemplo los géneros y especies Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polimyxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis o Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae tal como los géneros Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella o Serratia, por ejemplo los géneros y especies Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subsp. odorifera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia colimutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp., Escherichia vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiella edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis subsp. bongori, Salmonella choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae, Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella choleraesuis subsp. salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subsp. houtenae, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp. quinovora, Serratia quinivorans o Serratia rubidaea; Rhizobiaceae, tal como los géneros Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium, por ejemplo los géneros y especies Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Chelatobacter heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium ciceri Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuii, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizogenes, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli o Sinorhizobium xinjiangense.

Ejemplos adicionales de microorganismos ventajosos para el procedimiento según la invención son protistas o diatomeas seleccionadas del grupo de las familias Dinophyceae, Turaniellidae u Oxytrichidae, tal como los géneros y especies: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum o Colpidium sp.

Los que se aplican ventajosamente en el procedimiento según la invención son organismos transgénicos tales como hongos, tales como Mortierella o Thraustrochytrium, levaduras tales como Saccharomyces o Schizosaccharomyces, musgos tales como Physcomitrella o Ceratodon, animales no humanos tales como Caenorhabditis, algas tales como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium o Phaeodactylum o plantas tales como plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas. Los organismos que se usan de manera especialmente ventajosa en el procedimiento según la invención son organismos que pertenecen a los organismos productores de aceite, es decir que se usan para la producción de aceite, tales como hongos, tales como Mortierella o Thraustochytrium, algas tal como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium, Phaeodactylum, o plantas, en particular plantas, preferiblemente plantas de semilla de aceite o de cultivo de aceite que comprenden grandes cantidades de compuestos lipídicos, tales como cacahuete, colza, canola, girasol, cártamo (Carthamus tinctoria), amapola, mostaza, cáñamo, planta de aceite de ricino, aceituna, sésamo, Calendula, Punica, onagra, verbasco, cardo, rosas silvestres, avellana, almendra, macadamia, aguacate, laurel, calabaza, lino, semilla de soja, pistachos, borraja, árboles (palmera, coco o nuez) o cultivos herbáceos tales como maíz, trigo, centeno, avenas, tritical, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, Tagetes; plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa o plantas tupidas (café, cacao, té), especies de Salix,e hierbas perennes y cultivos de forraje. Plantas preferidas según la invención son plantas de cosechas de aceite tales como cacahuete, colza, canola, girasol, cártamo, amapola, mostaza, cáñamo, planta de aceite de ricino, aceituna, Calendula, Punica, onagra, calabaza, lino, semilla de soja, borraja, árboles (palmera, coco). Se prefieren especialmente para el procedimiento plantas que tienen alto contenido en ácidos grasos C18:2, tales como girasol, cártamo, tabaco, verbasco, sésamo, algodón, calabaza, amapola, onagra, nuez, lino, cáñamo o cardo. Son plantas muy especialmente preferidas plantas tales como cártamo, girasol, amapola, onagra, nuez, lino o cáñamo.

También es ventajoso para el método descrito anteriormente según la invención introducir adicionalmente, en el organismo, ácidos nucleicos adicionales que codifican para enzimas del metabolismo de ácidos grasos o lípidos, además de los ácidos nucleicos de los aspectos primero a cuarto de la invención.

Tales ácidos nucleicos se derivan ventajosamente de plantas tales como algas, por ejemplo algas de la familia de Prasinophyceae tales como los géneros Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia o Tetraselmis tales como los géneros y especies Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephroselmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp. Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculata, Tetraselmis carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolutae, Tetraselmis desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Tetraselmis impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordiformis, Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens o Tetraselmis sp. o de algas de la familia Euglenaceae tales como los géneros Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas o Trachelomonas, tales como los géneros y especies Euglena acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocylindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas cylindrica

o Trachelomonas volvocina. Los ácidos nucleicos usados se derivan ventajosamente de algas de los géneros Euglena, Mantoniella u Ostreococcus.

Plantas ventajosas adicionales son algas tales como Isochrysis o Crypthecodinium, algas/diatomeas tales como Thalassiosira o Phaeodactylum, musgos tales como Physcomitrella o Ceratodon, o plantas superiores tales como Primulaceae tales como Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens u Osteospermum hyoseroides, microorganismos tales como hongos, tales como Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor o Mortierella, bacterias tales como Shewanella, levaduras o animales tales como nematodos tales como Caenorhabditis, insectos, ranas, abulones o peces. Las secuencias de ácido nucleico aisladas según la invención se derivan ventajosamente de un animal del orden de los vertebrados. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico se derivan de la clase de los Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae u Oncorhynchus o Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus

: o Evertebrata tales como Protochordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae tales como Amaroucium constellatum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhattensis, Perophora viridis o Styela partita. Los ácidos nucleicos se derivan de manera especialmente ventajosa de hongos, animales, o de plantas tales como algas

: o musgos, preferiblemente del orden de los Salmoniformes, tales como la familia de Salmonidae, tales como el género Salmo, por ejemplo de los géneros y especies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta o Salmo trutta fario, de algas, tales como los géneros Mantoniella u Ostreococcus, o de las diatomeas tales como los géneros Thalassiosira

: o Phaeodactylum o de algas tales como Crypthecodinium.

En una realización preferida, el procedimiento comprende además la etapa de obtener una célula o un organismo intacto que comprende las secuencias de ácido nucleico usadas en el procedimiento, en el que la célula y/o el organismo se transforman con una secuencia de ácido nucleico según la invención que codifica para la Δ9-elongasa y opcionalmente Δ8-desaturasa y/o la Δ5-desaturasa, un constructo génico o un vector tal como se describió anteriormente, solo o en combinación con secuencias de ácido nucleico adicionales que codifican para proteínas del metabolismo de ácidos grasos o lípidos. En una realización preferida adicional, este procedimiento comprende además la etapa de obtener los aceites, lípidos o ácidos grasos libres del organismo o del cultivo. El cultivo puede adoptar la forma, por ejemplo, de un cultivo de fermentación, por ejemplo en el caso del cultivo de microorganismos, tales como, por ejemplo, Mortierella, Thalassiosira, Mantoniella, Ostreococcus, Saccharomyces o Thraustochytrium,

o un cultivo de una planta que se hace crecer en invernadero o en el campo. La célula o el organismo producido es por tanto ventajosamente una célula de un organismo que produce aceite, tal como una cosecha de aceite, tal como, por ejemplo, cacahuete, colza, canola, lino, cáñamo, cacahuete, semilla de soja, cártamo, cáñamo, girasoles o borraja.

En el caso de células de plantas, tejido de plantas u órganos de plantas, se entiende que “crecer” significa, por ejemplo, el cultivo sobre o en un medio de nutrientes, o de la planta intacta sobre o en un sustrato, por ejemplo en un cultivo hidropónico, mantillo o sobre tierra arable.

Para los fines de la invención, “transgénico” o “recombinante” significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión (= constructo génico) o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión o vectores según la invención, todas aquellas construcciones provocadas mediante métodos recombinantes en las que o bien

a) la secuencia de ácido nucleico según la invención, o bien

b) una secuencia de control genético que está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico según la invención, por ejemplo un promotor, o bien

c) a) y b)

no se encuentran en su entorno genético natural o se han modificado mediante métodos recombinantes, siendo posible que la modificación adopte la forma, por ejemplo, de una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. Se entiende que el entorno genético natural significa el locus cromosómico o genético natural en el organismo original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, preferiblemente se conserva el entorno genético natural de la secuencia de ácido nucleico, al menos en parte. El entorno flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferiblemente al menos 500 pb, de manera especialmente preferible al menos 1000 pb, lo más preferiblemente al menos 5000 pb. Un casete de expresión que se produce de manera natural (por ejemplo la combinación que se produce de manera natural del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con el correspondiente gen de Δ5-desaturasa) se convierte en un casete de expresión transgénico cuando se modifica ese casete de expresión mediante métodos no naturales, sintéticos (“artificiales”) tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen métodos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

Por tanto, se entiende que un organismo transgénico o planta transgénica para los fines de la invención significa, como anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento no están en su locus natural en el genoma de un organismo, siendo posible expresar los ácidos nucleicos homóloga o heterólogamente. Sin embargo, tal como se mencionó, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos según la invención están en su posición natural en el genoma de un organismo, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Se entiende preferiblemente que transgénico significa la expresión de los ácidos nucleicos según la invención en un locus no natural en el genoma, es decir tiene lugar expresión homóloga o, preferiblemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. Organismos transgénicos preferidos son hongos tales como Mortierella o Phytophtora, musgos tales como Physcomitrella algas tales como Mantoniella, Euglena, Crypthecodinium u Ostreococcus, diatomeas tales como Thalassiosira o Phaeodactylum, o plantas tales como las cosechas de aceite.

Organismos u organismos huésped para los ácidos nucleicos, el casete de expresión o el vector usados en el procedimiento según la invención son, en principio, ventajosamente todos los organismos que pueden sintetizar ácidos grasos, específicamente ácidos grasos insaturados, y/o que son adecuados para la expresión de genes recombinantes. Ejemplos que pueden mencionarse son plantas tales como Arabidopsis, Asteraceae tales como Calendula o plantas de cosecha tales como semilla de soja, cacahuete, planta de aceite de ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza, coco, palmera, cártamo (Carthamus tinctorius) o semilla de cacao, microorganismos, tales como hongos, por ejemplo el género Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia, Phytophtora o Pythium, bacterias, tales como el género Escherichia o Shewanella, levaduras, tales como el género Saccharomyces, cianobacterias, ciliados, algas tales como Mantoniella, Euglena, Thalassiosira u Ostreococcus, o protozoos tales como dinoflagelados, tales como Crypthecodinium. Organismos preferidos son aquellos que pueden sintetizar naturalmente cantidades sustanciales de aceite, tales como hongos, tales como Mortierella alpina, Pythium insidiosum, Phytophtora infestans,

o plantas tales como semilla de soja, colza, coco, palmera, cártamo, lino, cáñamo, planta de aceite de ricino, caléndula, cacahuete, semilla de cacao o girasol, o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae prefiriéndose especialmente semilla de soja, lino, colza, cártamo, girasol, caléndula, Mortierella o Saccharomyces cerevisiae. En principio, los organismos huésped también son, además de los organismos transgénicos mencionados anteriormente, animales transgénicos, ventajosamente animales no humanos, por ejemplo C. elegans, Ciona intestinalis o Xenopus laevis.

Se detallan células huésped utilizables adicionales en: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Se describen cepas de expresión que pueden usarse, por ejemplo aquellas con una actividad proteasa inferior, en: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Incluyen células de plantas y determinados tejidos, órganos o partes de plantas en todas sus formas fenotípicas tales como anteras, fibras, pelos radiculares, pedúnculos, embriones, callos, cotiledóneas, peciolos, material cosechado, tejido de plantas, tejido reproductor y cultivos celulares que se derivan de la planta transgénica real y/o pueden usarse para provocar la planta transgénica.

Ventajosamente las plantas transgénicas que comprenden los ácidos grasos poliinsaturados sintetizados en el procedimiento según la invención pueden comercializarse directamente sin que haya necesidad de aislar los aceites, lípidos o ácidos grasos sintetizados. Se indican plantas para el procedimiento según la invención como que significan plantas intactas y todas las partes de plantas, órganos de plantas o partes de plantas tales como hoja, tallo, semillas, raíz, tubérculos, anteras, fibras, pelos radiculares, pedúnculos, embriones, callos, cotiledóneas, peciolos, material cosechado, tejido de plantas, tejido reproductor y cultivos celulares que se derivan de la planta transgénica real y/o pueden usarse para provocar la planta transgénica. En este contexto, la semilla comprende todas las partes de la semilla tales como envueltas de semilla, células epidérmicas, células de semilla, endosperma

o tejido embrionario. Sin embargo, los compuestos producidos en el procedimiento según la invención también pueden aislarse a partir de los organismos, ventajosamente plantas, en forma de sus aceites, grasas, lípidos y/o ácidos grasos libres. Pueden obtenerse ácidos grasos poliinsaturados producidos mediante este procedimiento recogiendo los organismos, o bien de la cosecha en la que crecen o bien del campo. Esto puede realizarse mediante prensado o extracción de las partes de planta, preferiblemente las semillas de planta. En este contexto, los aceites, grasas, lípidos y/o ácidos grasos libres pueden obtenerse mediante lo que se conoce como batido en frío o prensado en frío sin aplicar calor. Para permitir una mayor facilidad de alteración de las partes de planta, específicamente las semillas, previamente se trituran, cuecen al vapor o se calcinan. Las semillas que se han tratado previamente de esta manera pueden posteriormente prensarse o extraerse con disolventes tales como hexano caliente. Posteriormente se elimina el disolvente. En el caso de microorganismos, estos últimos, tras la recogida, por ejemplo se extraen directamente sin etapas de procedimiento adicionales o bien, tras la disrupción, se extraen mediante diversos métodos con los que está familiarizado el experto en la técnica. De esta manera, puede aislarse más del 96% de los compuestos producidos en el procedimiento. Posteriormente, se procesan adicionalmente los productos resultantes, es decir, se refinan. En este procedimiento, en primer lugar se eliminan sustancias tales como los mucílagos de plantas y materia suspendida. Puede realizarse lo que se conoce como desenlodadura de manera enzimática o, por ejemplo, de manera fisicoquímica mediante adición de ácido tal como ácido fosfórico. Posteriormente, se retiran los ácidos grasos libres mediante tratamiento con una base, por ejemplo disolución de hidróxido de sodio. Se lava exhaustivamente el producto resultante con agua para eliminar los álcalis restantes en el producto y después se seca. Para eliminar el pigmento restante en el producto, se someten los productos a blanqueamiento, por ejemplo usando tierra de Fuller o carbón activado. Al final, se desodoriza el producto, por ejemplo usando vapor.

Los ácidos grasos producidos mediante los procedimientos de la presente invención pueden aislarse del organismo en forma de un aceite, un lípido o un ácido graso libre. Organismos adecuados son, por ejemplo, los mencionados anteriormente. Organismos preferidos son planta transgénicas.

Se describen aceites, lípidos o ácidos grasos de fórmula 1 o fracciones de los mismos que se han producido mediante el procedimiento descrito anteriormente, de manera especialmente preferible aceite, lípido o una composición de ácidos grasos que comprende un compuesto de fórmula I y que se deriva de plantas transgénicas.

También se describe el uso del aceite, lípido, los ácidos grasos y/o la composición de ácidos grasos en piensos, productos alimenticios, productos cosméticos o productos farmacéuticos. Los aceites, lípidos, ácidos grasos o mezclas de ácidos grasos según la invención pueden usarse de la manera con la que está familiarizado el experto en la técnica para mezclarse con otros aceites, lípidos, ácidos grasos o mezclas de ácidos grasos de origen animal, tal como, por ejemplo, aceites de peces. Estos aceites, lípidos, ácidos grasos o mezclas de ácidos grasos, que están compuestos por constituyentes vegetales y animales, también pueden usarse para la preparación de piensos, productos alimenticios, productos cosméticos o productos farmacológicos.

Se entiende que el término “aceite”, “lípido” o “grasa” significa una mezcla de ácidos grasos que comprende ácido(s) graso(s) insaturado(s), saturado(s), preferiblemente esterificado(s). El aceite, lípido o grasa tiene preferiblemente alto contenido en ácido(s) graso(s) libre(s) poliinsaturado(s) o, ventajosamente, esterificado(s), en particular ácido linoleico, ácido γ-linolénico, dihomo-ácido γ-linolénico, ácido araquidónico, ácido α-linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico.

La cantidad de ácidos grasos insaturados esterificados preferiblemente representa aproximadamente el 30%, se prefiere más un contenido del 50%, se prefiere incluso más un contenido del 60%, 70%, 80% o más. Para el análisis, el contenido en ácidos grasos puede determinarse, por ejemplo, mediante cromatografía de gases tras convertir los ácidos grasos en los ésteres metílicos mediante transesterificación. El aceite, lípido o grasa puede comprender varios otros ácidos grasos saturados o insaturados, por ejemplo ácido calendúlico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico y similares. El contenido de los diversos ácidos grasos en el aceite o grasa puede variar, en particular dependiendo del organismo de partida.

El ARA producido en el procedimiento puede estar, tal como se describió anteriormente, en forma de derivados de ácido graso, por ejemplo esfingolípidos, fosfoglicéridos, lípidos, glicolípidos, fosfolípidos, monoacilglicerol, diacilglicerol, triacilglicerol u otros ésteres de ácido graso.

El ARA y otros ácidos grasos poliinsaturados que están presentes pueden liberarse por ejemplo mediante tratamiento con álcali, por ejemplo KOH o NaOH acuosos, o hidrólisis ácida, ventajosamente en presencia de un alcohol tal como metanol o etanol, o mediante escisión enzimática, y aislarse mediante, por ejemplo, separación de fases y posterior acidificación mediante, por ejemplo, H2SO4. Los ácidos grasos también pueden liberarse directamente sin la etapa de procedimiento descrita anteriormente.

Tras su introducción en un organismo, ventajosamente una célula de planta o planta, los ácidos nucleicos usados en el procedimiento pueden o bien estar presentes en un plásmido separado o bien, ventajosamente, integrarse en el genoma de la célula huésped. En el caso de integración en el genoma, la integración puede ser al azar o bien realizarse mediante recombinación de tal manera que el gen nativo se sustituye por la copia introducida, mediante lo cual se modula la producción del compuesto deseado por la célula, o mediante el uso de un gen en trans, de modo que el gen está operativamente unido a una unidad de expresión funcional que comprende al menos una secuencia que garantiza la expresión de un gen y al menos una secuencia que garantiza la poliadenilación de un gen transcrito funcionalmente. Los ácidos nucleicos se introducen ventajosamente en los organismos mediante casetes de multiexpresión o constructos para la expresión multiparalela, ventajosamente en las plantas para la expresión de genes específica de semillas multiparalela.

Si se usan microorganismos tales como levaduras, tales como Saccharomyces o Schizosaccharomyces, hongos tales como Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor o Thraustochytrium, algas tales como Isochrysis, Mantoniella, Euglena, Ostreococcus, Phaeodactylum o Crypthecodinium como organismos en el procedimiento según la invención, estos organismos se hacen crecer ventajosamente en cultivos de fermentación.

Si se usan microorganismos como organismos en el procedimiento según la invención, se hacen crecer o se cultivan de la manera con la que está familiarizado el experto en la técnica, dependiendo del organismo huésped. Como norma, se hacen crecer microorganismos en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, habitualmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, habitualmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de levadura o sales tales como sulfato de amonio, oligoelementos tales como sales de hierro, manganeso y magnesio y, si es apropiado, vitaminas, a temperaturas de entre 0ºC y 100ºC, preferiblemente entre 10ºC y 60ºC, mientras se hace pasar oxígeno. El pH del medio líquido puede o bien mantenerse constante, es decir regularse durante el periodo de cultivo, o no. Los cultivos pueden hacerse crecer de manera discontinua, semicontinua o continua. Pueden proporcionarse nutrientes al comienzo de la fermentación o alimentarse de manera semicontinua o continua. Los ácidos grasos poliinsaturados producidos pueden aislarse de los organismos tal como se describió anteriormente mediante procedimientos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo mediante extracción, destilación, cristalización, si es apropiado precipitación con sal, y/o cromatografía. Para ello, ventajosamente pueden alterarse previamente los organismos.

Si los organismos huésped son microorganismos, el procedimiento según la invención se lleva a cabo ventajosamente a una temperatura de entre 0ºC y 95ºC, preferiblemente entre 10ºC y 85ºC, de manera especialmente preferible entre 15ºC y 75ºC, de manera muy especialmente preferible entre 15ºC y 45ºC.

En este procedimiento, el valor del pH se mantiene ventajosamente entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 6 y 9, de manera especialmente preferible entre pH 7 y 8.

El procedimiento según la invención puede llevarse a cabo de manera discontinua, semicontinua o continua. Puede encontrarse un resumen de métodos de cultivo conocidos en el libro de texto de Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Tecnología de bioprocedimientos 1. Introducción a la tecnología de bioprocedimientos] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y equipo auxiliar] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que va a usarse debe cumplir adecuadamente los requisitos de las cepas en cuestión. Pueden encontrarse descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos en el libro de texto “Manual of Methods für General Bacteriology” de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D. C., EE.UU., 1981).

Tal como se describió anteriormente, estos medios que pueden emplearse según la invención comprenden habitualmente una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/u oligoelementos.

Fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono, di o polisacáridos. Ejemplos de fuentes de carbono muy buenas son glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. También pueden añadirse azúcares a los medios mediante compuestos complejos tales como molasas u otros subproductos del refinado del azúcar. La adición de mezclas de una variedad de fuentes de carbono también puede ser ventajosa. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y/o grasa de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido linoleico, alcoholes y/o polialcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol y/o etanol, y/o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético y/o ácido láctico.

Fuentes de nitrógeno son habitualmente compuestos de nitrógeno orgánico o inorgánico o materiales que comprenden estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden amoniaco en forma líquida o gaseosa o sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno complejas tales como licor de maceración de maíz, harina de soja, proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse individualmente o como mezcla.

Los compuestos de sales inorgánicas que pueden estar presentes en los medios comprenden las sales de cloruro, fósforo y sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, cinc, cobre e hierro.

Pueden usarse compuestos que contienen azufre inorgánicos tales como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, o bien compuestos de azufre orgánicos tales como mercaptanos y tioles, como fuentes de azufre para la producción de productos químicos finos que contienen azufre, en particular de metionina.

Pueden usarse ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes como fuentes de fósforo.

Pueden añadirse agentes quelantes al medio con el fin de mantener los iones metálicos en disolución. Agentes quelantes particularmente adecuados incluyen dihidroxifenoles tales como catecol o protocatecuato y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico.

Los medios de fermentación usados según la invención para cultivar microorganismos también comprenden habitualmente otros factores de crecimiento tales como vitaminas o promotores del crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales se derivan con frecuencia de componentes de medios complejos tales como extracto de levadura, molasas, licor de maceración de maíz y similares. Además es posible añadir precursores adecuados al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos de los medios depende enormemente del experimento particular y se decide individualmente para cada caso específico. Puede encontrarse información sobre la optimización de medios en el libro de texto “Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) págs. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). También pueden obtenerse medios de crecimiento a partir de proveedores comerciales, por ejemplo patrón 1 (Merck) o BHI (infusión cerebro corazón, DIFCO) y similares.

Todos los componentes de medios se esterilizan, o bien mediante calor (20 min a 1,5 bar y 121ºC) o bien mediante esterilización mediante filtración. Los componentes pueden esterilizarse o bien juntos o bien, si se requiere, por separado. Todos los componentes de medios pueden estar presentes al comienzo del cultivo o añadirse continua o discontinuamente, según se desee.

La temperatura de cultivo es normalmente de entre 15ºC y 45ºC, preferiblemente de desde 25ºC hasta 40ºC, y puede mantenerse constante o puede alterarse durante el experimento. El pH del medio debe estar en el intervalo de desde 5 hasta 8,5, preferiblemente de aproximadamente 7,0. El pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo añadiendo compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco y amoniaco acuoso o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Puede controlarse la espumación empleando antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácido graso. Para mantener la estabilidad de plásmidos es posible añadir al medio sustancias adecuadas que tienen un efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Se mantienen condiciones aeróbicas introduciendo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire ambiental en el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente de 20º a 40ºC y preferiblemente de 25ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que la formación del producto deseado alcanza un máximo. Este objetivo se logra normalmente en el plazo de 10 a 160 horas.

Los caldos de fermentación obtenidos de esta manera, en particular los que contienen ácidos grasos poliinsaturados, contienen habitualmente una masa seca de desde el 7,5 hasta el 25% en peso.

Entonces puede procesarse adicionalmente el caldo de fermentación. Según requisitos, esta biomasa puede retirarse completa o parcialmente del caldo de fermentación mediante métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de esos métodos o dejarse completamente en dicho caldo. Resulta ventajoso procesar la biomasa tras su separación.

Sin embargo, el caldo de fermentación también puede espesarse o concentrarse sin separar las células, usando métodos conocidos tales como, por ejemplo, con ayuda de un evaporador giratorio, evaporador de película delgada, evaporador de película descendente, mediante osmosis inversa o mediante nanofiltración. Finalmente, este caldo de fermentación concentrado puede procesarse para obtener los ácidos grasos presentes en el mismo.

Los ácidos grasos obtenidos en el procedimiento también son adecuados como material de partida para la síntesis química de productos de interés adicionales. Por ejemplo, pueden usarse en combinación entre sí o solos para la preparación de productos farmacéuticos, productos alimenticios, alimentos para animales o productos cosméticos.

Todas las secuencias de ácido nucleico usadas en el procedimiento según la invención se derivan ventajosamente de un organismo eucariota tal como una planta, un microorganismo o un animal. Las secuencias de ácido nucleico se derivan preferiblemente del orden Salmoniformes, algas tales como Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena u Ostreococcus, hongos tales como el género Phytophthora o de diatomeas tales como los géneros Thalassiosira o Phaeodactylum.

Ahora se describirá la invención con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos y los dibujos en los que:

la figura 1 muestra diversas rutas sintéticas para la biosíntesis de ácidos grasos ω-6 y ω-3;

la figura 2 es un perfil de cromatografía de gases que muestra la conversión de Δ9,12-18:2 (ácido linoleico) en Δ11,14-20:2 mediante expresión heteróloga de la secuencia de Δ9-elongasa de P. marinus (SEQ ID NO: 1, residuos de 7668 a 9200) en levadura inducida o bien mediante galactosa (figura 2A) o bien mediante glucosa (figura 2B).

Ejemplo 1 – Clonación de una elongasa FAE1 a partir de Perkinsus marinus

Perkinsus marinusi es un parásito protozoario de las ostras que puede sintetizar ácidos grasos saturados e insaturados incluyendo el ácido graso esencial, ácido araquidónico [20:4(n-6)]. P. marinus emplea la ruta de la delta8(Δ-8) desaturasa para sintetizar ácido araquidónico.

Materiales y métodos.

Crecimiento y recogida de P. marinus.

Se cultivaron merontes de Perkinsus marinus a 28ºC en un medio preparado tal como se describe por La Peyre et al. (J Eukaryot Microbiol 1993; 40:304-10) y que contenía aminoácidos, nucleótidos, hidratos de carbono, y vitaminas, pero no suero bovino fetal.

Manipulación de ácido nucleico y clonación basada en PCR.

Se extrajo ADN de células usando un minikit de ADN DNeasy (Qiagen). Se amplificó ADN con cebadores específicos para el gen de la delta5 desaturasa de la siguiente manera: se calentaron las reacciones hasta 95ºC durante 2 min seguido por 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 2 min a 52 y 72ºC durante 4 min, después una única etapa a 72ºC durante 5 min. Se clonaron productos de amplificación por PCR en un vector TOPO (Invitrogen) y se verificaron mediante secuenciación. Se amplificó el gen de la FAE elongasa con cebadores específicos de gen (tabla I) diseñados para los extremos 5’ y 3’ de la región codificante, con sitios de restricción para facilitar la clonación en el vector de levadura (tabla I). Se diseñaron cebadores directos para la clonación en el vector de expresión de levadura pYES2 (Invitrogen) para contener un G/A en la posición -3 y un G en la posición +4 para mejorar el inicio de la traducción en células eucariotas.

Cebadores oligonucleotídicos usados en este estudio.

Se analizaron transcritos de Perkinsus marinus mediante PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR). Se extrajo ARN total de células usando un minikit de plantas RNeasy (Qiagen). Se sintetizó ADNc de primera cadena a partir del ARN total usando el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (BD-Clontech, Basingstoke, R.U.) según las instrucciones del fabricante. Se amplificaron ADNc monocatenarios con los siguientes cebadores.

Operón FAE inverso 5’-CATCTGCGAATACTAACCATACATT Se calentaron las reacciones hasta 95ºC durante 2 min seguido por 30 ciclos a 94ºC durante 30 s, 30 s a temperaturas que oscilaban desde 55 hasta 72 según el diseño del cebador y 72ºC durante 2 min, después una única etapa a 72ºC durante 10 min. Se clonaron productos de amplificación por PCR en un vector TOPO (Invitrogen) y se verificaron mediante secuenciación. Sorprendentemente se mostró que todos los transcritos de la Δ9-elongasa,

imagen2

5 Δ8-desaturasa y Δ5-desaturasa se encuentran en el mismo ARNm. Este es el primer ejemplo que muestra que los genes de PUFA se organizan en una estructura de tipo operón.

En una investigación adicional se analizó la especificidad de la Δ9-elongasa. Con este fin se amplificó la secuencia codificante de este gen mediante RT-PCR tal como se describió anteriormente usando los siguientes cebadores. 10 Elo2For: 5’-ATGCAAGTTCCCGCGGAGCATCACTCC-3’

Elo2Rev: 5’-CGTTACGCATCAATATTATGCATAGCCAACC-3’

15 Entonces se clonó el producto de PCR amplificado en un vector pCRscript según las recomendaciones del fabricante (Stratagen). En una segunda etapa de PCR se introdujeron las secuencias modificadas para la expresión en levaduras usando los siguientes cebadores.

Expresión en levaduras. 20 Kpn Elo2For 5’-TTGGTACCATGGGATTTCCTGCGGAG-3’

Sac Elo1 Rev 5’-GGGAGCTCTTACGCATCAATATTATGCATAGC-3’

25 La secuencia de los cebadores se facilita en la orientación de 5’ a 3’. Los sitios de restricción usados para la clonación están en negrita.

RESULTADOS

30 Aislamiento de FAE1 elongasa a partir de P. marinus.

Usando datos públicamente disponibles derivados de un proyecto de secuenciación del genoma de P. marinus llevado a cabo por TIGR (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/pmg/) se identificó un cóntigo (1047306867) que mostraba homología significativa con elongasas conocidas, con la secuencia diana (denominada Elo1 For, SEQ ID NO: 9) que

35 consistía en un marco de lectura abierto de 511 residuos y ningún intrón. El supuesto aminoácido derivado de la secuencia diana es SEQ ID NO: 10.

Caracterización funcional en Saccharomyces cerevisiae.

40 Se clonó el ADNc de longitud completa correspondiente a la supuesta Δ9 ácido graso elongasa (SEQ ID NO: 9) en un vector de expresión de levadura pYES2 para dar un constructo denominado pYPmFAE. Se transformó la cepa W303-1A de S. cerevisiae con el pYPmFAE o el vector vacío como control. Se hizo crecer la célula transformada en un medio mínimo que contenía rafinosa y se indujo con galactosa al 2%. Tras 48 h de crecimiento se extrajeron ácidos grasos de levadura totales y se analizaron los FAME resultantes mediante CG.

45 El análisis de CG (figura 2) reveló que las células de levadura transformadas con pYPmFAE produjeron un ácido graso adicional, que se identificó como ácido eicosadienoico lo que indica que el gen que se había clonado codificaba para una delta 9 ácido graso elongasa. Células de levadura que expresan la delta 9 ácido graso elongasa de P. marinus pueden reconocer el sustrato C18:2 (c9,12) con un porcentaje de tasa de conversión del 8,2%.

50 La tabla 1 muestra el contenido en ácidos grasos de las células de levadura tras la transformación con pYPmFAE (+)

o con el vector vacío pYES2 (-) y la inducción con galactosa al 2%. La conversión en porcentaje para 18:2Δ9,12 en 20:2Δ11,14, se calcula por ejemplo mediante la ecuación:

Δ11,14

[20:2 ]

55 % de conversión =

Δ9,12 Δ11,14

[18:2 ] + [20:2 ]

TABLA 1 Los resultados presentados en la tabla 1 muestran que no se detectó ninguna actividad elongasa con 20:4Δ5,8,11,14,y una actividad mínima (1% de conversión) para 18:3Δ6,9,12 . Por tanto parece que la Δ9 ácido graso elongasa es selectiva para ácido linoleico y no actúa para alargar otros PUFA.

ÁCIDOS GRASOS

%: 16:0 16:1Δ9 18:0 18:1Δ9 18:2Δ9,12 20:2Δ11,14 18:3Δ6,9,12 20:3Δ8,11,14 20:4Δ5,8,11,14 22:4Δ7,10,13,16 % conv

FAE 18:2+: 19,05 22,79 5,15 12,54 37,14 3,33 0,00 0,00 0,00 0,00 8,2

FAE 18:2: 20,81 19,50 5,50 12,11 42,07 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,0

FAE 18:3+: 18,86 19,77 4,81 11,15 0,00 0,00 44,93 0,48 0,00 0,00 1,1

FAE 18:3: 20,35 18,15 4,84 10,33 0,00 0,00 46,27 0,07 0,00 0,00 0,1

FAE 20:4+: 20,84 31,09 5,48 15,91 0,00 0,00 0,00 0,00 26,68 0,00 0,0

FAE 20:4: 22,13 31,00 4,55 14,65 0,00 0,00 0,00 0,00 27,67 0,00 0,0

5

LISTA DE SECUENCIAS

<110> BASF 10 <120> Ácido nucleico

<130> DY-03

<160> 10

15

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1 20 <211> 18342

<212> ADN

<213> Perkinsus marinus 25

<220>

<221> CDS 30 <222> (7668)..(9200)

<223>

<220>

35

<221> CDS

<222> (9351)..(10724) 40 <223>

<220>

<221> CDS

45

<222> (10842)..(12077)

<223> 50 <400> 1

imagen1

<210> 2 5 <211> 510

<212> PRT

<213> Perkinsus marinus

10

<400> 2

imagen1

<210> 3 5 <211> 457

<212> PRT

<213> Perkinsus marinus

10

<400> 3

imagen1

<210> 4 5 <211> 411

<212> PRT

<213> Perkinsus marinus

10

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador con sitios de restricción para su clonación en un vector de expresión de levadura

<400> 7 <210> 8

imagen1

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 1533

<212> ADN

<213> Perkinsus marinus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1533)

<223>

<400> 9

imagen1

imagen3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<400> 10

imagen4

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa y que se selecciona del grupo constituido por:

a) una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa, en la que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 2;

c) un derivado de una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 que codifica para un polipéptido con al menos el 85% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2 a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO: 2; en el que dicho polipéptido tiene actividad Δ9-elongasa.
2.

Polipéptido con actividad Δ9-elongasa que se codifica por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.
3.

Constructo génico que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 operativamente unida a una o más secuencias reguladoras.
4.

Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 o un constructo génico según la reivindicación 3.
5.

Organismo no humano transgénico que comprende al menos un transgén que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, un constructo génico según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4.
6.

Organismo no humano transgénico según la reivindicación 5, que es un microorganismo, un animal no humano o una planta.
7.

Organismo no humano transgénico según la reivindicación 6, que es una planta. 20:2Δ11,14

18:2Δ9,12
8.

Procedimiento para la conversión de (ácido linoleico) en , comprendiendo el procedimiento introducir en un organismo que comprende ácido linoleico al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad Δ9-elongasa y que comprende:

a) una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido con actividad Δ9-elongasa, en la que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 2;

c) un derivado de una secuencia que comprende los residuos de ácido nucleico de 7668 a 9200 de SEQ ID NO: 1 que codifica para un polipéptido con al menos el 85% de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2 a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO:2, en el que dicho polipéptido tiene actividad Δ9-elongasa;

y expresar dicha secuencia de ácido nucleico.
9.

Procedimiento según la reivindicación 8, que incluye además la etapa de inducción con galactosa.
10.

Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que el organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta.