BRPI0923064B1

BRPI0923064B1 - meios condicionados e métodos de preparação de um meio condicionado

Info

Publication number: BRPI0923064B1
Authority: BR
Inventors: Ang Abel; M Harmon Alexander
Original assignee: Advanced Tech And Regenerative Medicine Llc
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2019-11-26
Also published as: ES2551732T3; EP2379700B1; JP5791111B2; AU2009335962B2; CA2747727A1; JP2012512654A; US20100159588A1; EP2379700A2; PL2379700T3; BRPI0923064A2; CA2747727C; WO2010080364A3; CN102325871A; WO2010080364A2; US10179900B2; AU2009335962A1; CN102325871B

Abstract

meios condicionados e métodos de preparação de um meio condicionado a presente invenção refere-se a um processo estável e escalonável para a preparação de meio condicionado derivado de tecido de cordão umbilical (utc) de soro reduzido. o método inclui a cultura da utc sob condições de soro reduzido. subsequentemente, a utc é lavada e desenvolvida em meio basal livre de soro. após aproximadamente 24 horas, o meio condicionado é coletado, filtrado e concentrado pelo uso de uma membrana de aproximadamente 5 kda ou de corte similar.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MEIOS CONDICIONADOS E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE UM MEIO CONDICIONADO.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido incorpora por referência o Pedido de Patente não provisório U.S. N° 10/877.012, depositado em 25 de junho de 2004; Pedido de Patente não provisório U.S. N° 10/877.446, depositado em 25 de junho de 2004; e Pedido de Patente não provisório U.S. N° 11/939.360, depositado em 13 de novembro de 2007. Os conteúdos destes pedidos estão aqui in10 corporados por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de meios condicionados e métodos de preparar os mesmos. Especificamente, a invenção refereV se a um meio condicionado de soro reduzido de células derivadas de pos4, 15 parto e células derivadas de tecido umbilicais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O uso potencial de célula-tronco mesenquimatosa (MSC) como uma forma de terapia em várias doenças foi estudado extensivamente. Entretanto, há um corpo crescente de evidência que sugere que as proprieda20 des benéficas de MSCs podem ser mostradas através de um efeito parácrino. Foi constatado que meios nos quais MSCs foram cultivadas, são enriquecidos com fatores tróficos e citocinas segregadas pelas células. Isto gerou numerosos estudos que utilizam os meios condicionados por MSCs cultivadas em vários modelos de doença de lesão cardíaca, de pulmão e de 25 rim, bem como muitos outros.

Células derivadas de pós-parto (PPDCs) e células derivadas do tecido do cordão umbilical (UTCs), como MSCs, foi constatado segregar quantidades significantes de fatores tróficos e citocinas. Desse modo, processos estáveis e escaláveis são necessários para fabricar meios condicio30 nados de PPDC e UTC.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade particular, um método de preparar um meio

2/71 condicionado inclui semear uma UTC em um meio de cultura; reduzir o teor de soro dos meios de cultura; transferir a UTC dos meios de cultura para um meio basal livre de soro; cultivar a UTC nos meios basais livres de soro; e isolar a UTC dos meios basais livres de soro que deixam um meio condicionado.

Em certas modalidades, a UTC é cultivada nos meio basal livre de soro por até 24 horas. Em outras modalidades, o meio condicionado é filtrado, tal como utilizando-se um filtro de aproximadamente 22 microns. Em certas modalidades, o meio condicionado é concentrado tal como com uma membrana de corte; um exemplo seria uma membrana de corte de aproximadamente 5 kDa.

Em outras modalidades, reduzir o teor de soro inclui desmame da UTC do meio de cultura. Em outras modalidades, o desmame inclui reduzir o teor de soro do meio de cultura em incrementos, tais como incrementos de cerca de 5% a cerca de 60% e/ou incrementos de cerca de 50%. Em certas modalidades, a UTC cresce por cerca de 1 a 3 inoculações em cada incremento ou por cerca de 2 inoculações em cada incremento. Em outras modalidades, os meios de cultura podem ser cultura estática ou cultura de conta de microveículo. Certas modalidades podem incluir preliminarmente cultivar UTC em um meio de cultura padrão e isolar a UTC dos meios de cultura padrão antes de semear.

Em algumas modalidades de um método, um meio condicionado é preparado fornecendo-se uma UTC em um meio de cultura; reduzindo-se o teor de soro do meio de cultura em uma ou mais etapas com incremento; transferindo-se a UTC do meio de cultura com teor de soro reduzido para um meio basal livre de soro quando o teor de soro alcança um nível predeterminado; cultivando-se a UTC no meio basal livre de soro por não mais do que 24 horas; e isolando-se a UTC do meio basal livre de soro que deixa um meio condicionado.

Em certas modalidades, a transferência compreende desmamar a UTC do meio de cultura ou substituir o meio de cultura de soro reduzido com o meio basal livre de soro. O meio condicionado pode ser filtrado e con3/71 centrado.

Em outras modalidades, um meio condicionado é gerado pela semeadura de uma UTC em um meio de cultura, em que o teor de soro do meio de cultura é reduzido antes da transferência da UTC para um meio ba5 sal livre de soro, e em que a UTC é em seguida isolada do meio basal livre de soro que deixa um meio condicionado. O meio condicionado pode ser filtrado e concentrado.

Outras características e vantagens da invenção serão entendidas por referência à descrição detalhada e exemplos que seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra o resultado do Exemplo 2.

A figura 2 mostra o resultado do Exemplo 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Na seguinte descrição detalhada das modalidades ilustrativas, 15 referência é feita aos desenhos acompanhantes que formam uma parte destes. Estas modalidades são descritas em detalhes suficientes para permitir aqueles versados na técnica praticar a invenção, e entende-se que outras modalidades podem ser utilizadas, e que alterações estruturais, mecânicas, elétricas e químicas lógicas podem ser feitas sem afastar-se do espírito ou 20 escopo da invenção. Para evitar detalhes não necessários para permitir aqueles versados praticar as modalidades aqui descritas, a descrição pode omitir certa informação conhecida por aqueles versados na técnica. Portanto, a seguinte descrição detalhada, portanto não deve ser considerada em um sentido limitante, e o escopo das modalidades ilustrativas é definido pe25 Ias reivindicações anexas.

Para melhor esclarecer a invenção, as definições abaixo são fornecidas.

Células-tronco são células não diferenciadas definidas pela capacidade de uma única célula tanto se autorrenovar, quanto se diferenciar 30 produzir células progênies, incluindo progenitores autorrenovadores, progenitores não renovadores, e células terminalmente diferenciadas. As célulastronco também são caracterizadas por sua capacidade de se diferenciar in

4/71 vitro em células funcionais de várias linhagens celulares de múltiplas camadas germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma), bem como para dar origem aos tecidos de múltiplas camadas germinativas depois do transplante, e para contribuir substancialmente com a maioria, se não todos, os 5 tecidos depois da injeção em blastocistos.

As células-tronco são classificadas de acordo com seu potencial de desenvolvimento como: (1) totipotente; (2) pluripotente; (3) multipotente; (4) oligopotente; e (5) unipotente. As células totipotentes são capazes de dar origem a todos os tipos de célula embriônica e extraembriônica. As células 10 pluripotentes são capazes de dar origem a todos os tipos de célula embriônica. As células multipotentes incluem aquelas capazes de dar origem a um subgrupo de linhagens celulares, porém todas em um sistema de tecido, órgão ou fisiológico particular. Por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas (HSC) podem produzir progênie que inclui HSC (autorrenovação), progenito15 res oligopotentes restritos à células sanguíneas, e todos os tipos de célula e elementos (por exemplo, plaquetas) que são componentes normais do sangue. As células que são oligopotentes podem dar origem a um subgrupo mais restrito de linhagens celulares do que as células-tronco multipotentes. As células que são unipotentes são capazes de dar origem a uma linhagem 20 de célula única (por exemplo, células-tronco espermatogênicas).

As células-tronco também são categorizadas com base na fonte da qual elas são obtidas. Uma célula-tronco adulta é geralmente uma célula não diferenciada multipotente encontrada no tecido compreendendo múltiplos tipos de célula diferenciada. A célula-tronco adulta pode se autorreno25 var. Sob circunstâncias normais, também pode se diferenciar para produzir os tipos de célula especializadas do tecido do qual ela se originou, e possivelmente/ a/.s tipos de tecido. Uma célula-tronco embriônica é uma célula pluripotente da massa celular interna de um embrião em estágio de blastocisto. Uma célula-tronco fetal é uma que se origina de tecidos ou membra30 nas fetais. Uma célula-tronco pós-parto é uma célula multipotente ou pluripotente que se origina substancialmente do tecido extraembriônico disponível após o nascimento, isto é, a placenta e o cordão umbilical. Descobriu-se que

5/71 estas células possuem aspectos característicos de células-tronco pluripotentes, incluindo proliferação rápida e o potencial para diferenciação em muitas linhagens celulares. As células-tronco pós-parto podem ser derivadas do sangue (por exemplo, quando são aquelas obtidas do sangue do cordão umbilical) ou não derivadas do sangue (por exemplo, quando obtidas dos tecidos não sanguíneos do cordão umbilical e placenta).

Diferenciação é o processo pelo qual uma célula não especializada (não associada) ou menos especializada adquire as características de uma célula especializada, tal como uma célula nervosa ou uma célula do músculo, por exemplo. Uma célula diferenciada é uma que tenha assumido uma posição mais especializada (associada) na linhagem de uma célula. O termo associado, quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se a uma célula que prosseguiu na série de reação de diferenciação para um ponto onde, sob circunstâncias normais, continuará a diferenciar em um tipo de célula específico ou subgrupo de tipos de célula, e não pode, sob circunstâncias normais, se diferenciar em um tipo de célula diferente ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado. Desdiferenciação refere-se ao processo pelo qual uma célula se reverte para uma posição menos especializada (ou associada) dentro da linhagem de uma célula. Quando aqui usado, a linhagem de uma célula define a hereditariedade da célula, isto é, cujas células vêm de e cujas células podem dar origem a. A linhagem de uma célula coloca a célula dentro de um esquema hereditário de desenvolvimento e diferenciação.

Em um amplo sentido, uma célula progenitora é uma célula que tem a capacidade de criar progênie que são mais diferenciados do que o próprio, e ainda mantém a capacidade de reabastecer o conjunto de progenitores. Por esta definição, as células-tronco propriamente ditas também são células progenitoras, uma vez que são os precursores mais imediatos para células terminalmente diferenciadas. Ao referir-se como células da presente invenção, como descrito em maiores detalhes abaixo, esta ampla definição de célula progenitora pode ser utilizada. Em um sentido mais estreito, uma célula progenitora é geralmente definida como uma célula que é intermediá

6/71 ria na série de reação de diferenciação, isto é, surge de uma célula-tronco e é intermediária na produção de um tipo de célula madura ou subgrupo de tipos de célula. Este tipo de célula progenitora geralmente não é capaz de se autorrenovar. Consequentemente, se este tipo de célula é referido aqui, ela será referida como uma célula progenitora não renovadora ou como uma célula precursora ou progenitora intermediária.

Quando aqui usada, a frase diferencia em uma linhagem mesodérmica, ectodérmica ou endodérmica refere-se a uma célula que vem a estar associada a uma linhagem mesodérmica, ectodérmica ou endodérmica específica, respectivamente. Exemplos de células que diferenciam em uma linhagem mesodérmica ou dão origem a células mesodérmicas específicas incluem, porém não estão limitados a, células que são adipogênicas, condrogênicas, cardiogênicas, dermatogênicas, hematopoiéticas, hemangiogênicas, miogênicas, nefrogênicas, urogenitogênicas, osteogênicas, pericardiogênicas ou estromais. Exemplos de células que diferenciam em linhagem ectodérmica incluem, porém não estão limitados a, células epidérmicas, células neurogênicas e células neurogliagênicas. Exemplos de células que diferenciam em linhagem endodérmica incluem, porém não estão limitados a, células pleurigênicas, células hepatogênicas, células que dão origem ao revestimento do intestino, e células que dão origem a células pancreogênicas e esplancogênicas.

As células são mais especificamente células derivadas do umbigo ou células derivadas do cordão umbilical (UDCs) ou células derivadas do tecido do cordão umbilical (UTCs). Além disso, as células podem ser descritas como sendo células-tronco ou progenitoras, o último termo sendo usado no amplo sentido. O termo derivado é usado para indicar que as células foram obtidas de sua fonte biológica e cultivadas ou de outra maneira manipuladas in vitro (por exemplo, cultivadas em um Meio de Cultura para ampliar a população e/ou para produzir uma linhagem celular). As manipulações in vitro de células-tronco umbilicais e as características únicas das células derivadas do umbigo da presente invenção são descritas em detalhes abaixo.

Vários termos são usados para descrever células em cultura.

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Cultura de célula refere-se geralmente às células tiradas de um organismo vivo e cultivadas sob condição controlada (em cultura ou cultivadas). Uma cultura de célula primária é uma cultura de células, tecidos ou órgãos tirados diretamente de um organismo(s) antes da primeira subcultura. As células são expandidas em cultura quando elas são colocadas em um Meio de Cultura sob condições que facilitem a divisão e/ou crescimento celular, resultando em uma maior população das células. Quando as células são expandidas em cultura, a taxa de proliferação celular é algumas vezes medida pela quantidade de tempo necessário para as células dobrarem de número. Isto é chamado tempo de duplicação.

O termo linhagem celular geralmente refere-se a uma população de células formada por um ou mais subcultivos de uma cultura celular primária. Cada rodada de subcultivo é referida como uma passagem. Quando as células são subcultivadas, elas são referidas como tendo sido passadas. Uma população específica de células, ou uma linhagem celular, é algumas vezes referida ou caracterizada pelo número de vezes que ela tenha sido passada. Por exemplo, uma população de célula cultivada que foi passada dez vezes pode ser referida como uma cultura P10. A cultura primária, isto é, a primeira cultura depois do isolamento de células de tecido, é designada P0. Depois da primeira subcultura, as células são descritas como uma cultura secundária (P1 ou passagem 1). Depois da segunda subcultura, as células se tornam uma cultura terciária (P2 ou passagem 2), e assim por diante. Será entendido por aqueles versados na técnica que podem haver muitas duplicações de população durante o período de passagem; portanto o número de duplicações de população de uma cultura é maior do que o número de passagem. A expansão de células (isto é, o número de duplicações de população) durante o período entre a passagem depende de muitos fatores, incluindo, porém não limitados a, densidade da semeadura, substrato, meio, condições de cultura e tempo entre a passagem.

Um meio condicionado é um meio no qual uma célula específica ou população de células foi cultivada, e em seguida removida. Quando as células são cultivadas em um meio, elas podem secretar fatores celulares

8/71 que podem fornecer suporte trófico a outras células. Tais fatores tróficos incluem, porém não estão limitados a, hormônios, citocinas, matriz extracelular (ECM), proteínas, vesículas, anticorpos e grânulos. O meio contendo os fatores celulares é o meio condicionado.

Geralmente, um fator trófico é definido como uma substância que promove sobrevivência, crescimento, proliferação e/ou maturação de uma célula, ou estimula a atividade aumentada de uma célula.

Ao referir-se a células vertebradas cultivadas, o termo senescência (também senescência replicativa ou senescência celular) refere-se a uma propriedade atribuível a culturas de célula finitas; isto é, sua incapacidade de crescer além de um número finito de duplicações de população (às vezes chamado limite de Hayflick). Embora a senescência celular tenha sido a primeira descrita usando células semelhantes a fibroblasto, a maior parte dos tipos de célula humana normais que podem ser cultivados sucessidamente em cultura passa por senescência celular. O período de vida in vitro de tipos de célula diferentes varia, porém o período de vida máximo é tipicamente menos que 100 duplicações de população (este é o número de duplicações para todas as células na cultura para se tornarem senescentes e desse modo preparar a cultura incapaz de se dividir). Senescência não depende do tempo cronológico, porém de preferência é medida pelo número de divisões de célula ou duplicações de população, que a cultura sofreu. Desse modo, células tornadas inativas pela remoção dos fatores de crescimento essenciais podem retomar o crescimento e divisão, quando os fatores de crescimento são reintroduzidos, e depois disso realiza o mesmo número de duplicações como células equivalentes cultivadas continuamente. Similarmente, quando as células são congeladas em nitrogênio líquido depois de vários números de duplicações de população e em seguida descongeladas e cultivadas, elas sofrem substancialmente o mesmo número de duplicações, assim como as células mantidas descongeladas em cultura. Células senescentes não são células mortas ou agonizantes; elas são realmente resistentes a morte celular programada (apoptose), e foram mantidas em seu estado de não divisão por tanto tempo quanto três anos. Estas células estão muito

9/71 vivas e metabolicamente ativas, porém elas não se dividem. O estado de não divisão de células senescentes ainda não foi constatado ser reversível por qualquer agente biológico, químico ou viral.

Quando aqui usado, o termo meio de cultura geralmente referese a um meio suficiente para o cultivo de células. Em particular, um meio atualmente preferido para o cultivo das células da invenção compreende Meio Essencial Modificado de Dulbecco (DMEM). Particularmente preferido é DMEM com baixo teor de glucose (DMEM-LG) (Invitrogen, Carlsbad, CA). O DMEM-LG é preferivelmente suplementado com soro, mais preferivelmente soro bovino fetal ou soro humano. Tipicamente, 15% (v/v) de soro bovino fetal (por exemplo, soro bovino fetal definido, Hyclone, Logan UT) é adicionado, junto com antibióticos/antimicóticos (preferivelmente 100 Unidades/mililitro de penicilina, 100 miligramas/mililitro de estreptomicina e 0,25 micrograma/mililitro de anfotericina B; (Invitrogen, Carlsbad, CA)) e 0,001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis MO). Em alguns casos, diferentes meios de cultura são usados ou diferentes suplementações são fornecidas, e estas são normalmente indicadas no texto como suplementações para o Meio de Cultura. Em certos meios quimicamente definidos, as células podem ser cultivadas sem soro presente de modo algum. Em tais casos, as células podem requerer certos fatores de crescimento, que podem ser adicionados ao meio para suportar e manter as células. Os fatores atualmente preferidos a serem adicionados para a cultura em meios livres de soro incluem um ou mais dentre bFGF, EGF, IGF-I e PDGF. Em modalidades mais preferidas, dois, três ou todos os quatro fatores são adicionados ao meio quimicamente definido ou livre de soro. Em outras modalidades, LIF é adicionado ao meio livre de soro para suportar ou melhorar o crescimento das células.

Da mesma forma referindo-se à presente invenção, o termo condições de cultura padrão, quando aqui usado, refere-se ao cultivo de células a 37°C, em uma atmosfera padrão compreendendo 5% de CO2. A umidade relativa mantida em cerca de 100%. Ao mesmo tempo em que as condições anteriores são úteis para o cultivo, deve ser ser entendido que tais

10/71 condições são capazes de ser variadas pelo versado, o qual apreciará as opções disponíveis na técnica para o cultivo de células.

O termo quantidade eficaz refere-se a uma concentração ou quantidade de um composto, material ou composição, como aqui descrito, 5 que é eficaz para obter um resultado biológico particular. Tais resultados incluem, porém não estão limitados à regeneração, reparo ou melhora do tecido esquelético, a melhora do fluxo sanguíneo e/ou o estímulo e/ou o suporte da angiogênese em pacientes com isquemia periférica. Tal atividade eficaz pode ser obtida, por exemplo, administrando-se as células e/ou com10 posições da presente invenção a pacientes com isquemia periférica. Com respeito à administração de UTC a um paciente in vivo, uma quantidade eficaz pode variar de tão pouco quanto várias centenas ou menos, a tanto quanto vários milhões ou mais. Em modalidades específicas, uma quantidade eficaz pode variar de 10³-10¹¹, mais especificamente pelo menos cerca ζ» 15 de 10⁴ células. Será apreciado que o número de células a ser administrado variará dependendo das especificidades da distúrbio a ser tratado, incluindo, porém não limitado ao tamanho ou volume total/área de superfície a ser tratada, e a proximidade do sítio de administração ao local da região a ser tratada, entrei a/.s fatores familiares ao biólogo medicinal.

Os termos tratar, tratando ou tratamento refere-se a qualquer sucesso ou indícios de sucesso na atenuação ou melhora de uma lesão, patologia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, tal como moderação, remissão, diminuição de sintomas ou tornar a lesão, patologia ou condição mais tolerável ao paciente, tornar mais lenta a taxa de degeneração ou declínio, tornar o ponto final de degeneração menos debilitante, melhorar um bem-estar mental ou físico do paciente, ou prolongar a duração da sobrevivência. O tratamento ou melhora dos sintomas pode ser com base nos parâmetros objetivos ou subjetivos; incluir os resultados de um exame físico ou exame neurológico e/ou avaliações psiquiátricas.

Os termos período eficaz (ou tempo) ou condições eficazes referem-se geralmente a um período de tempo ou outras condições controláveis (por exemplo, temperatura, umidade para métodos in vitro), necessárias ou

11/71 preferidas para um agente ou composição farmacêutica para obter seu resultado pretendido.

Os termos paciente ou indivíduo são usados alternadamente aqui, e referem-se aos animais, preferivelmente mamíferos, e mais preferi5 velmente humanos, os quais são tratados com as composições farmacêuticas ou terapêuticas ou de acordo com os métodos aqui descritos.

O termo meio ou veículo farmaceuticamente aceitável, que podem ser usados alternadamente com o termo meio ou veículo biologicamente compatível, refere-se a reagentes, células, compostos, materiais, compo10 sições e/ou formas de dosagem que são não somente compatíveis com as células et al.s agentes a serem administrados terapeuticamente, porém também estão, dentro do escopo do diagnóstico médico seguro, adequado para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade ' excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outra complicação comensurada t, 15 com uma relação de benefício/risco razoável. Como descrito aqui em maiores detalhes, veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso na presente invenção incluem materiais líquidos, semissólidos (por exemplo, géis) e sólidos (por exemplo, andaimes e matrizes de célula, tubos, folhas et al.s tais materiais conhecidos na técnica e descritos aqui em maiores deta20 lhes). Estes materiais semissólidos e sólidos podem ser designados para resistir a degradação no corpo (não biodegradável) ou eles podem ser designados para degradar no corpo (biodegradável, bioerosível). Um material biodegradável também pode ser biorreabsorvível ou bioabsorvível, isto é, pode ser dissolvido e absorvido em fluidos corpóreos (implantes solúveis em 25 água são um exemplo), ou degradados e por último eliminados do corpo, ou por conversão em outros materiais ou quebrados e eliminados através de série de reações naturais. A taxa de biodegradação pode variar de acordo com a taxa de liberação desejada uma vez implantada no corpo. A matriz desejável também pode agir como um andaime temporário até que substitu- ida por, músculo esquelético, pericitos, músculo liso vascular ou tecido endotelial vascular recentemente cultivados. Em algumas modalidades, a matriz pode fornecer a liberação prolongada de fatores tróficos ou outros agentes

12/71 usados em conjunto com as células, e pode fornecer uma estrutura para o desenvolvimento de cultura de tecido no paciente. Em outras modalidades, a matriz simplesmente fornece um andaime temporário para o desenvolvimento de tecido. A matriz pode estar na forma particulada (macropartículas mai5 ores do que 10 microns em diâmetro ou micropartículas menores do que 10 microns em diâmetro), ou pode estar na forma de um implante tridimensional estruturalmente estável (por exemplo, um andaime). O implante pode ser, por exemplo, um cubo, cilindro, tubo, bloco, película, folha ou uma forma anatômica apropriada.

Vários termos são aqui usados com respeito ao transplante de tecido ou célula. Os termos transferência autóloga, transplante autólogo, autoenxerto e similares, referem-se ao transplante em que o doador do transplante também é o receptor do transplante. Os termos transferência alogênica, transplante alogênico, aloenxerto e similares referem-se ao transplante em que o doador do transplante é da mesma espécie do receptor do transplante, porém não é o receptor. Um transplante de célula no qual as células do doador foram histocompativelmente pareados com um receptor às vezes chamado como uma transferência singênica. Os termos transferência xenogênica, transplante xenogênico, xenoenxerto e similares, referem-se ao 20 transplante em que o doador do transplante é de uma espécie diferente do receptor do transplante.

Células, populações de célula e preparações, inclusive lisados de célula e similares são descritos em detalhes em Publicação de Patente U.S. N^os. 20050054098 e 20050058631.

Meio condicionado de uma UTC cultivada pode ser usado in vitro e in vivo. O uso da UTC ou outro meio condicionado pode permitir os fatores tráficos benéficos segregados pela UTC ser usados alogênicamente em um paciente sem introduzir células intatas que poderíam ativar a rejeição, ou outras respostas imunológicas adversas. O meio condicionado é preparado cultivando-se células em um meio de cultura, em seguida remover as células do meio.

O meio condicionado preparado a partir das populações de célu

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Ias, pode ser usado no estado em que se encontra, também concentrado, por exemplo, por ultrafiltração ou liofilização, ou até mesmo seco, parcialmente purificado, combinado com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis como são conhecidos na técnica, ou combinados com outros compostos tais como biológicos, por exemplo, composições de proteína farmaceuticamente úteis. O meio condicionado pode ser usado in vitro ou in vivo, sozinho ou combinado com células vivas autólogas ou singênicas, por exemplo. O meio condicionado, se introduzido in vivo, pode ser introduzido localmente em um sítio de tratamento, ou remotamente para fornecer o crescimento celular necessário ou fatores tróficos a um paciente.

De acordo com as modalidades da presente invenção, um processo escalável e estável é fornecido para fabricar o meio condicionado por UTC de soro reduzido. Brevemente, o método inclui a cultura de uma UTC sob condições de soro reduzido. Subsequentemente, a UTC é lavada e cultivada em meio basal livre de soro. Depois de aproximadamente 24 horas, o meio condicionado é coletado, filtrado e concentrado por uso de um peso molecular de aproximadamente 5 kDa ou similar de membrana de corte.

Uma célula derivada de tecido umbilical mamífero (UTC) pode ser isolada seguindo os métodos descritos na Publicação de Patente U.S. N^oS. 20050054098 e 20050058631. A célula isolada pode em seguida ser cultivada em cultura estática seguindo os métodos como descrito na Publicação de Patente U.S. N^oS. 20050054098 e 20050058631 até o tempo em que o meio condicionado é preparado.

Os meios condicionados podem ser preparados em qualquer duplicação de população das células. Em outra modalidade, os meios condicionados são preparados de cerca da duplicação de população 20 a cerca da duplicação da população 44. Em ainda outra modalidade, o meio condicionado é preparado em cerca da duplicação da população 30.

Os meios condicionados são preparados isolando-se primeiro as células de um meio de cultura padrão em que as células foram cultivadas. As células são em seguida semeadas em cultura estática em qualquer densidade de semedura. Em uma modalidade, as células são semeadas em

14/71 uma densidade de cerca de 1.000 células por cm quadrado a cerca de 10.000 células por cm quadrado. Em ainda outra modalidade, as células foram semeadas em uma densidade de cerca de 5.000 células por cm quadrado.

Depois da semeadura da célula, em aproximadamente 5.000 células/cm², as células são desmamadas dos meios de cultura padrão tendo um teor de soro bovino de cerca de 15% reduzindo-se o teor de soro bovino nos meios em incrementos até que as células sejam cultivadas apenas em meios basais. O soro bovino pode ser reduzido em incrementos de cerca de 5 a cerca de 60%. Em uma modalidade, o soro bovino é reduzido em incrementos de cerca de 50% (isto é, 15%, 7,5%, 3,25%, e 0% de soro bovino nos meios). As células são permitidas cultivar em cada meio de soro reduzido a cerca de 1 a cerca de 3 inoculações. Em uma modalidade, as células são cultivadas em cada meio de soro reduzido a cerca de 2 inoculações. Antes de adicionar os meios de soro de bovino reduzidos finais, as células são semeadas em aproximadamente 10.000 células/cm². Quando os meios basais (0% de soro bovino) são adicionados às células, as células são mantidas nos meios por não mais do que 24 horas.

O meio condicionado é em seguida isolado das células e filtrado usando um filtro de aproximadamente 0,22 micron ou similar. O filtro pode ou não pode ser esterilizado. O meio condicionado filtrado é em seguida concentrado usando um filtro de corte de aproximadamente 5K ou dispositivo similar. O filtrado é descartado enquanto o meio condicionado concentrado mantido no filtro é coletado.

Em outra modalidade, a célula de UTC isolada é cultivada em cultura de conta de microveículo seguindo os métodos como descrito na Publicação de Patente U.S. N° 20080166328 (vide Exemplos) até o tempo ao qual o meio condicionado é preparado.

O meio condicionado pode ser preparado em qualquer duplicação de população das células. Em outra modalidade, o meio condicionado é preparado de cerca da duplicação de população 20 a cerca da duplicação de população 44. Em ainda outra modalidade, o meio condicionado é preparado

15/71 em cerca da duplicação de população 30.

Depois da semeadura da célula, em aproximadamente 10.000 células/cm² em cultura de conta de microveículo, o meio de cultura padrão é adicionado às células e cultivado durante cerca de 2 dias. Subsequentemente, o meio de cultura padrão é removido e substituído com meios basais. Alternadamente, a cultura de conta de microveículo pode ser desmamada similarmente do meio de cultura padrão à cultura estática. Quando o meio basal (0% de soro bovino) é adicionado às células, as células são mantidas nos meios por não mais do que 24 horas.

O meio condicionado convencional, embora rico em proteínas do tipo de célula cultivada é também rico em proteínas do soro bovino presente no meio. O meio condicionado preparado pelos métodos descritos acima são concentrados em proteínas humanas. As proteínas bovinas estão presentes em uma quantidade que está abaixo da detecção dos métodos de caracterização padrões, tal como SDS-PAGE e análise de Western Blot. As baixas quantidades de detecção de proteína bovina no meio condicionado são vantajosas devido ao risco reduzido subsequente para transmissão de doenças bovinas e vírus bem como risco reduzido para reação xenoimune.

O meio condicionado preparado como aqui descrito é útil em lugar do meio condicionado convencional.

Os exemplos seguintes descrevem a invenção em maior detalhe. É pretendido que estes exemplos sejam para ilustrar, não para limitar, os aspectos descritos da invenção aqui.

EXEMPLO 1

Fatores que Afetam a Geração de Meio Condicionado das Células Cultivadas em Frascos Estáticos

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O propósito deste estudo foi determinar se a variação de fatores diferentes (volume médio, densidade de semeadura de célula, duração da cultura, duplicação de população de células, estado proliferativo de desmame de células e soro) na geração de meio condicionado afetaria a quantida5 de de proteína bem como o perfil de expressão de proteína no meio condicionado.

Como o protocolo geral, pelo menos uma UTC (isolamento e caracterização de uma UTC podem ser constatados nos Exemplos 5-14) foi semeada em 10.000 células/cm² (a menos que declarado de outra maneira) 10 em frascos T-225 cm² (Corning Inc, Corning NY) em meios de cultura (DMEM com Baixo teor de glicose (Gibco, Carlsbad, Ca), 15% (v/v) de soro bovino fetal gama irradiado (Hyclone, Logan, UT), Glutamax a 4 mM (Gibco, Carlsbad, Ca), 50 lU/mL de Penicilina (Gibco, Carlsbad, Ca) e 50 pg/mL de Estreptomicina (Gibco, Carlsbad, Ca). Depois de 48 horas, os meios gastos - 15 foram aspiradas e o frasco foi lavado duas vezes com 10mL de D-PBS (Gibco, Carlsbad, CA) de cada vez. Durante cada lavagem, o frasco foi estimulado duas vezes com uma pipeta sorológica. 20 mL (a menos que declarado de outra maneira) de meios basais (DMEM com baixo teor de glicose (Gibco, Carlsbad, Ca) e Glutamax a 4 mM (Gibco, Carlsbad, Ca)) foram em seguida 20 adicionados e as células foram cultivadas durante mais 24 horas (a menos que declarado de outra maneira). Depois de 24 horas, o meio condicionado foi coletado e filtrado com um frasco de filtro de 0,22 pm (Corning, Corning NY) e subsequentemente concentrado em um tubo de filtro centrífugo (Centricon Plus-70, Millipore, Billerica, Ma) com um corte de peso molecular de 25 expansão de 5 kDa. As amostras foram centrifugadas em 3200 g durante 30 minutos a 20-25°C nestes tubos de filtro centrífugos. Os retentados foram coletados por uma centrifugação invertida dos tubos de filtro em 913 g durante 5 minutos a 20-25°C. Os meios concentrados resultantes foram em seguida julgados como o produto final.

Para um estudo de volume de meios, as células foram cultivadas durante 48 horas antes de trocar em três volumes diferentes de meios basais (10, 25 e 40 mL). Para o estudo de densidade de semeadura de célula,

17/71 as células foram semeadas em 1.000, 5.000 e 10.000 células/cm² durante 48 horas antes de trocar para os meios basais. Durante a duração do estudo de cultura, as células foram cultivadas em meios basais durante 24, 48, e 72 horas antes de colher os meios condicionados. Para a duplicação de população de estudo de células, as células foram cultivadas em duplicações de população diferente antes de trocar nos meios basais. A duplicação de população final de células no momento da coleção de meios foi 20, 35 e 44. Dois grupos foram usados para comparar o afeto do estado proliferativo das células. O primeiro grupo consistiu em proliferar as células que foram semeadas em 5,000 células/cm² e cultivadas em meios de cultura padrão antes de trocar para os meios basais. O segundo grupo consistiu em não proliferar as células que foram semeadas em 10.000 células/cm² e cultivadas em meios contendo 2% de soro antes de trocar para os meios basais. O estudo de desmame de soro teve dois grupos. O primeiro grupo consistiu em células que foram desmamadas para 2 inoculações sucessivas de 15% a 7,5% e finalmente meios contendo 3,25% de soro com uma densidade de semeadura constante de 5.000 células/cm² com exceção da última passagem que foi semeada em 10.000células/cm² 48 horas antes de trocar para os meios basais. O segundo grupo seguiu o protocolo geral.

Estimativa de Proteína. A concentração de proteína total em cada amostra de meios concentrados foi estimada pelo Ensaio de Bradford. O Reagente de Tintura 1 x de Bradford de Começo Rápido e Conjunto Padrão de Albumina de Soro Bovino de Começo Rápido foram obtidos de Bio-Rad (Hercules, Ca). As amostras foram diluídas adequadamente com água MilliQ a incluir dentro da faixa linear da curva padrão e conduzida em duplicata. A mistura de tintura de Bradford e amostra foi brevemente agitada e incubada no escuro durante 5 minutos antes de ler em uma densidade ótica (OD) de 595 nm em um espectrofotômetro (Molecular Devices, SpectraMax 190 com Software Pro v4.0). A leitura de OD das amostras foram convertidas em concentração de proteína com base na Curva Padrão gerada das leituras de OD dos Padrões de BSA. A concentração de proteína foi convertida à quantidade total da proteína presente multiplicando-se a concentração ao volume

18/71 do retentado coletado após a etapa de concentração.

SDS-PAGE. 5 pg de cada amostra foram preparados em um Tampão de Amostra de Tris-Glicina SDS Novex® (2X) (Invitrogen, Carlsbad, Ca) com 5% (v/v) de β-mercaptoetanol. Após a misturação, as amostras foram aquecidas a 95°C durante 5 minutos e resfriadas em gelo antes de adicionar no poço. Para separação de proteína, urn gel a 4-20% pré-fundido de Tris-Glicina Novex® e sistema foram usados (Invitrogen, Carlsbad, Ca) com Tampão Fluente de Tris-Glicina Novex® (Invitrogen, Carlsbad, Ca) de acordo com o protocolo do fabricante. Os géis foram manchados com SIMPLYBLUE Safe Stain e secos usando um Sistema de Secagem DRYEASE MiniGel (Invitrogen, Carlsbad, Ca) de acordo com o protocolo do fabricante. TABELA 1-1

Quantidade de proteína total no produto de meio condicionado final Fator Quantidade de Proteína Média

1. Volume
a) 10mL	0,1413 + 0,0390
b) 25mL	0,1450 ±0,0165
c) 40ml_	0,1607 + 0,0393
2. Densidade e semeadura de célula
a) 1.000 células/cm²	0,0505 + 0,0083
b) 5.000 células/cm²	0,1123 ±0,0161
c) 10.000 células/cm²	0,1602 + 0,0469
3. Duração da cultura
a) 24 horas	0,1141 ±0,0121
b) 48 horas	0,2411 ±0,0257
c) 72 horas	0,3515 ±0,0487
4. Duplicação de população de células
a) PD20	0,0806 ±0,0154
b) PD35	0,0978 ±0,0123
c) PD44	0,1384 ±0,0337
5. Estado de proliferação de células
a) Proliferação	0,1046 ±0,0137

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b) Não proliferação

6. Desmame de soro

a) Não desmamado

b) Desmamado

TABELA 1-2

0,1040 ±0,0336

0,1312 ±0,0300

0,0633 ±0,0170

Perfil de proteína do produto de meio condicionado final Fator

1. Volume

2. Densidade de semeadura de célula

Padrão de banda da proteína Nenhuma diferença Perda do padrão de banda em 1.000 e 5.000 células/cm² quando comparada a 10.000 células/cm²

3. Duração de cultura

4. Duplicação de população de células

5. Estado de proliferação de células

6. Desmame de soro

Nenhuma diferença Nenhuma diferença Nenhuma diferença Nenhuma diferença

Entre os fatores estudados, apenas a densidade de semeadura de célula inicial e duração de cultura afetou o teor de proteína total com o teor de proteína crescente junto com a densidade de célula crescente e duração de cultura. Padrão de banda de proteína foi muito consistente entre as amostras com exceção das amostras no estudo de densidade de semeadura de células onde densidades de semeadura mais baixas resultaram em uma perda do padrão de banda de proteína.

EXEMPLO 2

Proteínas de Soro Reduzido em Meios Condicionados Seguindo uma Etapa de Redução de Soro

Durante a produção do meio condicionado, a presença de proteínas de FBS no produto final é inevitável. Nossos resultados mostram uma quantidade significativa de proteínas de FBS presentes no produto final. A quantidade de proteínas de FBS presentes no produto final é substancialmente reduzida através de uma redução de soro de uma etapa antes da geração do meio condicionado.

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Geração de meio condicionado. Havia três grupos de estudo. No primeiro grupo, as células foram semeadas sobre frascos T-225 e alimentadas com 50 mL de meios de cultura contendo FBS a 15%. O segundo grupo consistiu em células semeadas sobre frascos T-225 e alimentadas com 50 mL de meio contendo FBS a 2%. O último grupo consistiu em um frasco T225 não semeado com células porém preenchido com 50 mL de meio de cultura contendo FBS a 15%. Depois de 48 horas, o meio de cada frasco foi coletado e armazenado a -80°C. Os frascos foram em seguida lavados duas vezes com D-PBS (10mL de cada vez) e cada lavagem foi coletada e armazenada a -80°C. 20mL de meios basais foram em seguida adicionados a cada frasco e seguiu-se o protocolo exato detalhado no Exemplo 1.

Análise de proteína. Uma estimativa de proteína foi realizada para os meios e as lavagens para determinar quantidade de proteínas presentes; a metodologia é descrita no Exemplo 1. Um SDS-PAGE do meio condicionado final também foi realizado para comparar o padrão de banda de proteína entre os grupos; a metodologia é descrita no Exemplo 1. Western Blot foi usado para comparar a quantidade de Albumina de Soro Bovina (BSA) presente no produto de meio condicionado final de cada grupo. As amostras foram preparadas em um tampão de amostra 2x (Invitrogen, Carlsbad, Ca) com β-mercaptoetanol a 5%. Após a misturação, as amostras foram aquecidas a 95°C durante 5 minutos e resfriadas em gelo antes de adicionar no poço. Para separação de proteína, um gel NOVEX Mini 4-20% pré-fundido e sistema foram usados (Invitrogen). O gel foi transferido sobre uma membrana de PVDF (Invitrogen) em um sistema de transferência úmido (Bio-Rad, Hercules, CA) usando o Tampão de Towbin padrão com Metanol a 20% e SDS a 0,01%. A transferência foi feita em 100V durante 2 horas a 4°C. Depois da transferência, a membrana foi bloqueada com um tampão de bloqueio com base em não proteína (Pierce, Rockford, IL) e incubada durante a noite com o anticorpo primário durante a noite em um oscilador a 4°C. AntiBSA monoclonal de camundongo (Sc-80705, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) foi usado em uma diluição de 1:1000 feita em tampão de bloqueio fresco. A membrana foi lavada subsequentemente 3 vezes durante 5 minu

21/71 tos cada qual com PBST (Bio-Rad, Hercules, Ca) e incubada com o anticorpo anticamundongo de cabra secundário (HAF007, Sistemas de RnD, Minneapolis, MN). A mancha foi em seguida lavada 3 vezes durante 5 minutos cada qual em PBST e incubada em um substrato quimioluminescente (SuperSignal West Dura, Pierce, Rockford, IL) durante 1 minuto e em seguida detectado com um sistema de imageamento digital (Bio-Rad, Hercules, CA). TABELA 2-1

Concentração de proteína nas lavagens e produto de meio condicionado final

Amostra Concentração de Proteína Média (mg/mL)

1. Células+ FBS a 15%

a) Meio gasto	8,125 + 0,423
b) Lavagem 1	0,335 + 0,045
c) Lavagem 2	0,040 ± 0,002
Células + FBS a 2%
a) Meio Gasto	1,239 + 0,098
b) Lavagem 1	0,043 ± 0,004
c) Lavagem 2	0,017 ±0,002
Nenhuma Célula + FBS a 15%
a) Meio Gasto	7,597
b) Lavagem 1	0,303
c) Lavagem 2	0,033

Vide também figura 1.

Foi mostrado que o uso de meios contendo FBS a 15% em um frasco de cultura estático com ou sem a presença de células resulta em uma quantidade significativa de proteínas deixada para trás nas lavagens. A preocupação se estas proteínas foram derivadas de bovino foi confirmada por SDS-PAGE e Western Blot por meio de qual uma quantidade significante de BSA foi detectada no meio condicionado. Entretanto, foi constatado que reduzindo-se a quantidade de soro no meio de cultura de 15% a 2% justamente antes de trocar para os meios basais, a quantidade de BSA presente nos meios condicionados foi substancialmente reduzida. Com BSA sendo a pro

22/71 teína de soro mais abundante, pode ser deduzido que outras proteínas de soro também foram substancialmente reduzidas.

EXEMPLO 3

Comparação de Meios Condicionados feitos de Frascos Estáticos e Frascos Giratórios com o Método de Soro Reduzido de Uma Etapa

Geração de meio condicionado de frascos giratórios. Pelo menos uma UTC foi semeada em 5.000 células/cm² sobre microveículos Hillex II (12g/L) (Solohill Engineering Inc, Ml) em um frasco giratório inutilizado de 100 mL (Corning, Corning, NY) e alimentada com meio de cultura (DMEM com baixo teor de glicose (Gibco, Carlsbad, Ca), soro bovino fetal gama irradiado a 15% (v/v) (Hyclone, Logan, UT), Glutamax a 4mM (Gibco, Carlsbad, Ca), 50 lU/mL de Penicilina (Gibco, Carlsbad, Ca) e 50 pg/mL de Estreptomicina (Gibco, Carlsbad, Ca) com uma rotação constante de 60 rpm. Depois de 4 dias, as células foram inoculadas em um frasco giratório de 500 mL reconstituindo-se os microveículos contendo células com microveículos frescos em uma relação de divisão de 1:5 junto com meios de cultura frescas. Depois de 4 dias, o meio gasto foi aspirado e os microveículos lavados duas vezes com D-PBS. A primeira lavagem consistiu em 200 mL de PBS com uma agitação breve. Depois da aspiração da primeira lavagem, a segunda lavagem consistiu em 500 mL de PBS e uma incubação de 10 minutos em um agitador magnético durante 10 minutos em 60 rpm. Depois de ambas as lavagens, as células foram alimentadas com um meio de cultura contendo FBS a 2%. Depois de 24 horas, os microveículos foram lavados novamente com D-PBS de acordo com o procedimento exato descrito acima e alimentados com meios basais em uma relação de volume para área de superfície de microveículo de 0,09 mL/cm. Depois de 24 horas, o meio condicionado foi coletado e filtrado com um frasco de filtro de 0,22 pm (Corning, Corning NY) e subsequentemente concentrado em um tubo de filtro centrífugo (Centricon Plus-70, Millipore, Billerica, Ma) com um peso molecular de expansão de 5 kDa. As amostras foram centrifugadas em 3200 g durante 30 minutos a 2025°C nestes tubos de filtro centrífugos. Os retentados foram coletados por uma centrifugação invertida dos tubos de filtro em 913 g durante 5 minutos a

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20-25°C. O meio concentrado resultante foi julgado em seguida como o produto final.

Geração de meios condicionados de frascos estáticos. Uma ou mais UTC foram semeadas em 30.000 células/cm² sobre T-225 cm² e alimentadas com meios de cultura (DMEM com baixo teor de glicose (Gibco, Carlsbad, Ca), soro bovino fetal gama irradiado a 2% (v/v) (Hyclone, Logan, UT), Glutamax a 4mM (Gibco, Carlsbad, Ca), 50 lU/mL de Penicilina (Gibco, Carlsbad, Ca) e 50 pg/mL de Estreptomicina (Gibco, Carlsbad, Ca). Depois de 48 horas, os meios gastos foram aspirados e o frasco foi lavado duas vezes com 10 mL de D-PBS (Gibco, Carlsbad, CA) de cada vez. Durante cada lavagem, o frasco foi estimulado duas vezes com uma pipeta sorológica. Meio basal (DMEM com baixo teor de glicose (Gibco, Carlsbad, Ca) e Glutamax a 4 mM (Gibco, Carlsbad, Ca)) foi em seguida adicionado a uma relação de volume para área de superfície de 0,09 mL/cm² e as células foram cultivadas durante mais 24 horas (a menos que declarado de outra maneira). Depois de 24 horas, o meio condicionado foi coletado e filtrado com um frasco de filtro de 0,22 pm (Corning, Corning NY) e subsequentemente concentrado em um tubo de filtro centrífugo (Centricon Plus-70, Millipore, Billerica, Ma) com um peso molecular de expansão de 5 kDa. As amostras foram centrifugadas em 3200 g durante 30 minutos a 20-25°C nestes tubos de filtro centrífugos. Os retentados foram coletados por uma centrifugação invertida dos tubos de filtro em 913 g durante 5 minutos a 20-25°C. O meio concentrado resultante foi em seguida julgado como o produto final.

Determinação da densidade de célula final. Depois que os meio condicionados foram colhidas, as células restantes foram lavadas com DPBS (sem Ca e Mg) (Gibco, Carlsbad, Ca) e tripsinizadas fora do frasco ou microveículos com TrypLE Select (Gibco, Carlsbad, Ca). As células destacadas foram em seguida neutralizadas em meios de cultura completos e contadas quanto aos números e viabilidade com um contador de célula com base em fluxo (GUAVA Technologies). Uma alíquota da mistura celular é diluída 20x com a tintura fluorescente que mancha as células mortas e é em seguida alimentada na máquina. O número de célula final foi calculado e corri

24/71 gido quanto à área de superfície de cultura total disponível para obter a densidade de célula final. No caso dos microveículos Hillex II, 1,2 g de microveiculos têm uma área de superfície total aproximada de 515 cm².

Análise de proteína. Uma estimativa de proteína foi realizada para os meios e lavagens para determinar a quantidade de proteínas presentes; a metodologia é descrita no Exemplo 1. Um SDS-PAGE do meio condicionado final foi também realizado para comparar o padrão de banda de proteína entre os grupos; a metodologia é descrita no Exemplo 1. Western Blot de BSA, como descrito no Exemplo 1, foi terminada no meio condicionado. TABELA 3-1

Quantidade de proteína no produto de meio condicionado final e densidade de célula final

Amostra Quantidade de Proteína Densidade Célula

Média(mg) (células/cm²)

Frasco estático 0,1040 ± 0,0335 33233

Frasco Giratório* 0,4314 + 0,1058 27780 * Extrapolado a partir dos valores derivados da concentração de 70mL de meios condicionados à mesma quantidade usada na cultura de frasco estático (20mL)

Vide também figura 2.

Quando cultivada em frascos giratórios, a proteína total recuperada no meio condicionado foi cerca de 4 vezes mais do que os frascos estáticos e a densidade de célula final em ambos os frascos estáticos e giratórios foi quase comparável. A presença de BSA no meio condicionado de frasco giratório foi substancialmente mais baixo quando comparado àquela do frasco estático.

EXEMPLO 4

Determinação de Proteínas de Interesse Presentes nos Meios Condicionados por ELISA Multiplex

Geração de meio condicionado. O meio condicionado foi feito de frascos estáticos e frascos giratórios de acordo com os métodos descritos no Exemplo 3.

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Descoberta de proteínas de interesse. As amostras foram diluídas em 100 pg/mL com meios basais em tubos microcentrífugos siliconizados para reduzir a perda de proteínas por adesão e transportadas congeladas por Pierce Biotechnology, Inc, Woburn, MA para a determinação de quantidade de proteínas humanas e bovinas de interesse presente por Ensaio ELISA Multiplexado SERCHLIGHT. Proteínas de interesse foram medidas usando disposições SERCHLIGHT Proteom. As disposições de proteoma são ELISAs sanduíche multiplexados para a medida quantitativa de duas a 16 proteínas por poço. As disposições são produzidas manchando-se um padrão de 2x2, 3x3 ou 4x4 de quatro a 16 anticorpos de captura diferentes em cada poço de uma placa de 96 poços. Depois de um procedimento ELISA sanduíche típico, a placa inteira é imageada para capturar o sinal quimioluminescente gerado em cada mancha dentro de cada poço da placa. A quantidade de sinal gerado em cada mancha é proporcional à quantidade de proteína-alvo na amostra ou padrão original.

TABELA 4-1

Concentração de proteínas específicas em meio condicionado

Proteína específica	Concentração	Proteína específica	Concentração
humana	(pg/mL)	bovina	(pg/mL)
1. Frasco estático		1. Frasco estático
(a) BDNF	3755	(a) IFN-γ	ND
(b) HGF	56799	(b) IL-Ιβ	ND
(c) IL-6	247585	(c) IL-2	ND
(d) TIMP-1	27274212	(d) IL-4	ND
(e) TIMP-2	2003995	(e) IL-6	ND
(f) VEGF	885	(f) TNF- α	ND
(g) FGFb	2440
(h) IL-8	250434
(i) MMP-7	126
0) PDGF-AB	803

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Proteína específica	Concentração	Proteína específica	Concentração
humana	(pg/mL)	bovina	(pg/mL)
2. Frasco giratório		2. Frasco giratório
(a) BDNF	4001	(a) IFN-γ	ND
(b) HGF	181928	(b) IL-Ιβ	ND
(c) IL-6	685722	(c) IL-2	ND
(d) TIMP-1	21747883	(d) IL-4	ND
(e) TIMP-2	9010533	(e) IL-6	ND
(f) VEGF	475	(f) TNF- α	ND
(g) FGFb	103
(h) IL-8	521599
(i) MMP-7	127
G) PDGF-AB	485
ND - Não detectável

A concentração por meio de filtração com uma membrana de corte de 5 kDa mostrou ser um método possível. Este processo é escalável com o uso de sistemas de filtração ATF. A análise dos teores do meio condicionado revelou quantidades significantes de fatores de cultura humanos e citocinas (BDNF, IL-8, HGF, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, FGFb, IL-6 e MMP-7) e quantidades não detectávels de proteínas bovinas (IFN-γ, ΙΙ_-1β, IL-2, IL-4, IL-6 e TNF-α), com exceção de BSA que foi constatada estar presente em quantidades variadas que dependem da condição de cultura de soro inicial antes de preparar o meio condicionado.

A presente invenção não está limitada às modalidades descritas e exemplificadas acima. É capaz de variação e modificação dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 5

Isolamento de Células

Isolamento de célula umbilical. Os cordões umbilicais foram obtidos de National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Os tecidos foram obtidos depois das liberações normais. Os protocolos de isolamento de célula foram realizados assepticamente em um cabo de fluxo

27/71 laminar. Para remover o sangue e os resíduos, o cordão foi lavado em solução salina tamponada por fosfato (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) na presença de penicilina em 100 Unidades/mililitro e estreptomicina em 100 miligramas/mililitro e anfotericina B em 0,25 micrograma/mililitro (Invitrogen Carlsbad, CA). Os tecidos foram em seguida mecanicamente dissociados em placas de cultura de tecido de 150 cm² na presença de 50 mililitros de meio (DMEM com baixo teor de glicose ou DMEM com elevado teor de glicose; Invitrogen), até que o tecido tenha sido picado em uma polpa fina. Os tecidos picados foram transferidos para tubos cônicos de 50 mililitros (aproximadamente 5 gramas de tecido por tubo).

O tecido foi em seguida digerido em meio de DMEM com baixo teor de glicose ou meio de DMEM com alto teor de glicose, cada qual contendo penicilina em 100 Unidades/mililitro, estreptomicina em 100 milligramas/mililitro, anfotericina B em 0,25 micrograma/mililitro e as enzimas de digestão. Em alguns experimentos uma mistura de enzima de colagenase e dispase foi usada (C:D) (colagenase (Sigma, St Louis, MO), 500 Unidades/mililitro; e dispase (Invitrogen), 50 Unidades/mililitro, em meio de DMEM com baixo teor de glicose). Em outros experimentos, uma mistura de colagenase, dispase e hialuronidase (C:D:H) foi usada (C:D:H = colagenase, 500 Unidades/mililitro; dispase, 50 Unidades/mililitro; e hialuronidase (Sigma), 5 Unidades/mililitro, em DMEM com baixo teor de glicose). Os tubos cônicos contendo o tecido, veículo e enzimas de digestão foram incubados a 37°C em um agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) em 225 rpm durante 2 horas.

Após a digestão, os tecidos foram centrifugados em 150 x g durante 5 minutos, o sobrenadante foi aspirado. O pélete foi ressuspenso em 20 mililitros de Meio de Cultura (DMEM:baixo teor de glicose e (Invitrogen), 15 por cento (v/v) de soro bovino fetal (FBS; soro bovino fetal definido; Lote n°AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma), penicilina em 100 Unidades por mililitro, estreptomicina em 100 microgramas por mililitro, e anfotericina B em 0,25 micrograma por mililitro (cada qual de Invitrogen, Carlsbad, CA)). A suspensão de célula foi filtrada através

28/71 de um Coador de Célula BD FALCON de náilon de 70 microns (BD Biosciences, San Jose, CA). Um adicional de 5 mililitros de enxágue compreendendo Meio de Cultura foi passado através do coador. A suspensão de célula foi em seguida passada através de um coador de célula de náilon de 40 micrômetros (BD Biosciences, San Jose, CA) e perseguida com um enxague de um adicional de 5 mililitros de Meio de Cultura.

O filtrado foi ressuspenso em Meio de Cultura (volume total de 50 mililitros) e centrifugado em 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado, e as células foram ressuspensas em 50 mililitros de meio de cultura fresco. Este processo foi repetido mais duas vezes.

Após a centrifugação final, o sobrenadante foi aspirado, e o pélete de célula foi ressuspenso em 5 mililitros de meio de cultura fresco. O número de células viáveis foi determinado utilizando manchamento de azul tripano. As células foram em seguida cultivadas sob condições padrão.

As células isoladas a partir de tecido de cordão umbilical, foram semeadas em 5.000 células/cm² em frascos T-75 revestidos com gelatina (Corning Inc., Corning, NY) em Meio de Cultura. Após dois dias, o meio gasto e as células não aderidas foram aspirados dos frascos. As células aderentes foram lavadas com PBS três vezes para remover os resíduos e as células derivadas do sangue. As células foram em seguida reabastecidas com Meio de Cultura e permitidas crescer para confluência (cerca de 10 dias de passagem 0) a passagem 1. Em passagens subsequentes (de passagem 1 a 2 etc), células alcançaram subconfluência (75-85 por cento de confluência) em 4-5 dias. Para estas passagens subsequentes, as células foram semeadas em 5.000 células/cm². As células foram cultivadas em uma incubadora umidificada com 5 por cento de dióxido de carbono a 37°C.

As células foram isoladas de tecidos em meio de DMEM com baixo teor de glicose após a digestão com LIBERASE (2,5 miligramas por mililitro, Blendzima 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) e hialuronidase (5 Unidades/mililitro, Sigma). A digestão do tecido e isolamento das células foi como descrito para outras digestões de protease acima, entretanto, a mistura de LIBERASE/hialuronidase foi usada ao invés da mistura de

29/71 enzima C:D ou C:D:H. A digestão de tecido com LIBERASE resultou no isolamento de populações de célula de tecido que expandiram facilmente.

Os procedimentos foram comparados para isolar células do cordão umbilical usando combinações diferentes de enzima. As enzimas comparadas para digestão incluíram: i) colagenase; ii) dispase; iii) hialuronidase; iv) mistura de colagenase:dispase (C:D); v) mistura de colagenase:hialuronidase (C:H); vi) mistura de dispase:hialuronidase (D:H); e vii) mistura de colagenase:dispase:hialuronidase (C:D:H). As diferenças no isolamento de célula usando estas condições de digestão de enzima diferentes foram observadas (Tabela 5-1).

Outras tentativas foram feitas para isolar conjuntos de células de cordão umbilical por métodos diferentes. Em um caso, o cordão umbilical foi fatiado e lavado com meio de cultura para desalojar os coágulos de sangue e material gelatinoso. A mistura de sangue, material gelatinoso e meio de cultura foi coletada e centrifugada em 150 x g. O pélete foi ressuspenso e semeado em frascos revestidos com gelatina em meio de cultura. A partir destes experimentos, uma população de célula foi isolada, a qual facilmente expandiu.

As células também foram isoladas de amostras de sangue do cordão obtidas de NDRI. O protocolo de isolamento usado foi aquele do Pedido de Patente Internacional PCT/US2002/029971 por Ho eta/.s. As amostras (50 mililitros e 10,5 mililitros, respectivamente) de sangue de cordão umbilical (NDRI, Philadelphia PA) foram misturadas com tampão de lise (cloreto de amônio de 155 milimolares esterilizado por filtro, 10 milimolares de bicarbonato de potássio, 0,1 milimolar de EDTA tamponado para pH 7,2 (todos os componentes de Sigma, St. Louis, MO)). As células foram lisadas em uma relação de 1:20 de sangue do cordão para tampão de lise. A suspensão de célula resultante foi vortexada durante 5 segundos e incubada durante 2 minutos em temperatura ambiente. O lisado foi centrifugado (10 minutos a 200 x g). O pélete de célula foi ressuspenso em Meio Essencial Mínimo Completo (Gibco, Carlsbad CA) contendo 10 por cento de soro bovino fetal (Hyclone, Logan UT), 4 milimolares de glutamina (Mediatech Herndon, VA),

30/71 penicilina em 100 Unidades por mililitro e estreptomicina em 100 microgramas por mililitro (Gibco, Carlsbad, CA). As células ressuspensas foram centrifugadas (10 minutos em 200 x g), o sobrenadante foi aspirado, e o pélete de célula foi lavado em meio completo. As células foram semeadas diretamente em frascos T75 (Corning, NY), frascos revestidos com laminina T75, ou frascos revestidos com fibronectina T175 (ambos de Becton Dickinson, Bedford, MA).

Para determinar se as populações de célula podem ser isoladas sob condições diferentes e expandidas sob uma variedade de condições imediatamente após o isolamento, as células foram digeridas em Meio de Cultura com ou sem 0,001 por cento (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), usando a combinação de enzima de C:D:H, de acordo com os procedimentos fornecidos acima. Todas as células foram cultivadas na presença de penicilina em 100 Unidades por mililitro e estreptomicina em 100 microgramas por mililitro. Sob todas as condições testadas, as células se prenderam e expandiram bem entre as passagens 0 e 1 (Tabela 5-2). As células em condições 5-8 e 13-16 demonstraram proliferar bem até 4 passagens após a semeadura, no ponto em que elas foram crioconservadas.

A combinação de C:D:H, forneceu a melhor produção de célula depois do isolamento, e gerou células que expandiram para muito mais gerações em cultura do que as outras condições (Tabela 5-1). Uma população de célula expandível não foi obtida usando colagenase ou hialuronidase apenas. Nenhuma tentativa foi feita para determinar se este resultado é específico para a colagenase que foi testada.

Tabela 5-1: Isolamento de células de tecido de cordão umbilical usando combinações de enzima variantes

Digestão de Enzima	Células Isoladas	Expansão de Célula
Colagenase	X	X
Dispase	+(>10 h)	+
Hialuronidase	X	X
Colagenase: Dispase	++(<3h)	++

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Digestão de Enzima	Células Isoladas	Expansão de Célula
Colagenase: Hialuronidase	++ (<3h)	+
Dispase:Hialuronidase	+(>10 h)	+
Colagenase: Dispase: Hialuronidase	+++(<3h)	+++

Código: + = Bom, ++ = muito bom, +++ = excelente, X = nenhum sucesso

As células se prenderam e expandiram bem entre as passagens e 1 sob todas as condições testadas para cultivo e digestão de enzima (Tabela 5-2). As células nas condições experimentais 5-8 e 13-16 prolifera5 ram bem até 4 passagens após a semeadura, no ponto em que elas foram crioconservadas. Todas as células foram crioconservadas para outra análise.

Tabela 5-2: Isolamento e expansão de cultura de células sob condições variantes:

Condição	Meio	15% de FBS	BME	Gelatina	20% de o₂	Fatores de Cultura
1	DMEM-Lg	Y	Y	Y	Y	N
2	DMEM-Lg	Y	Y	Y	N (5%)	N
3	DMEM-Lg	Y	Y	N	Y	N
4	DMEM-Lg	Y	Y	N	N (5%)	N
5	DMEM-Lg	N (2%)	Y	N (Laminina)	Y	EGF/FGF (20 ng/ml)
6	DMEM-Lg	N (2%)	Y	N (Laminina)	N (5%)	EGF/FGF (20 ng/ml)
7	DMEM-Lg	N (2%)	Y	N (Fibronectina)	Y	PDFG/VEGF
8	DMEM-Lg	N (2%)	Y	N (Fibronectina)	N (5%)	PDFG/VEGF
9	DMEM-Lg	Y	N	Y	Y	N
10	DMEM-Lg	Y	N	Y	N (5%)	N
11	DMEM-Lg	Y	N	N	Y	N
12	DMEM-Lg	Y	N	N	N (5%)	N
13	DMEM-Lg	N (2%)	N	N (Laminina)	Y	EGF/FGF (20 ng/ml)
14	DMEM-Lg	N (2%)	N	N (Laminina)	N (5%)	EGF/FGF (20 ng/ml)
15	DMEM-Lg	N (2%)	N	N (Fibronectina)	Y	PDFG/VEGF
16	DMEM-Lg	N (2%)	N	N (Fibronectina)	N (5%)	PDFG/VEGF

As células nucleadas se prenderam e cresceram rapidamente.

32/71

Estas células foram analisadas por citometria de fluxo e foram similares às células obtidas por digestão de enzima.

As preparações contiveram plaquetas e células de sangue vermelhas. Nenhuma célula nucleada se prendeu e dividiu durante as 3 primeiras semanas. O meio foi mudado 3 semanas após a semeadura e nenhuma célula foi observada se prender e crescer.

As populações de células podem ser isoladas do tecido umbilical eficientemente usando a combinação de enzima colagenase (uma metaloprotease), dispase (protease neutral) e hialuronidase (enzima mucolítica que quebra o ácido hialurônico). LIBERASE, que é uma mistura de colagenase e uma protease neutra, também pode ser usada. Blendzima 3, que é colagenase (4 Wunsch Unidades/grama) e termolisina (1714 Unidades/grama de caseína), foi também usado junto com hialuronidase para isolar as células. Estas células se expandiram facilmente sobre muitas passagens quando cultivadas em meio de expansão de cultura em plástico revestido de gelatina.

As células também foram isoladas de sangue residual nos cordões, porém não o sangue do cordão. A presença de células em coágulos de sangue lavados do tecido, que aderem e crescem sob as condições usadas, pode ser devido às células que são liberadas durante o processo de operação.

Referência

Ho et ai., W02003025149 A2, CELL POPULATIONS WHICH CO-EXPRESS CD49C AND CD90, NEURONYX, INC. Pedido N° PCT/US02/29971, depositado 20020920, A2 Publicado 20030327, A3 Publicado 20031218.

EXEMPLO 6

Características de Cultura de Células

O potencial de expansão de célula de células foi comparado com outras populações de células-tronco isoladas. O processo de expansão de célula para senescência é chamado limite de Hayflick. (Hayflick, The longevity of cultured human cells, J. Am. Geriatr. Soc, 1974; 22(1): 1-12; Hayflick,

33/71

The strategy of senescence, Gerontologist, 1974; 14(1):37-45).

Os frascos plásticos de cultura de tecido foram revestidos adicionando-se 20 mililitros de 2% (p/v) de gelatina (Tipo B: 225 Bloom; Sigma, St Louis, MO) a um frasco T75 (Corning Inc., Corning, NY) durante 20 minutos em temperatura ambiente. Após remover a solução de gelatina, 10 mililitros de salina tamponada por fosfato (PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram adicionados e em seguida aspirados.

Para comparação de potencial de expansão de cultura, as seguintes populações de célula foram usadas; i) células-tronco mesenquimatosas (MSC; Cambrex, Walkersville, MD); ii) células derivadas de adipose (Patente U.S. N° 6.555.374 B1; Publicação de Patente U.S. US20040058412); iii) fibroblastos de pele dérmica normais (cc-2509 lote n° 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD); e iv) células derivadas do umbigo. As células foram inicialmente semeadas em 5.000 células/cm² em frascos T75 revestidos com gelatina em Meio de Cultura. Para passagens subsequentes, as culturas de célula foram tratadas como segue. Após tripsinização, células viáveis foram contadas após o manchamento de azul tripano. A suspensão de célula (50 microlitros) foi combinada com azul tripano (50 microlitros, Sigma, St. Louis MO). Os números de célula viáveis foram estimados usando um hemocitômetro.

Depois da contagem, as células foram semeadas em 5.000 células/cm² sobre frascos T75 revestidos com gelatina em 25 mililitros de Meio de Cultura fresco. As células foram cultivadas em uma atmosfera padrão (5 por cento de dióxido de carbono (v/v)) a 37°C. O Meio de Cultura foi mudado duas vezes por semana. Quando as células alcançaram cerca de 85 por cento de confluência, elas foram passadas; este processo foi repetido até que as células alcançassem a senescência.

Em cada passagem, as células foram tripsinizadas e contadas. A produção de célula viável, duplicações de população [In (células finais/células iniciais)/ln2], e tempo de duplicação (tempo em cultura/duplicação de população) foram calculados. Para o propósito de determinar a expansão de célula ideal, o rendimento de célula total por passagem

34/71 foi determinado multiplicando-se o rendimento total pela passagem prévia pelo fator de expansão para cada passagem (isto é, fator de expansão = células finais/células iniciais).

O potencial de expansão de células bancadas na passagem 10 também foi testado. Um conjunto diferente de condições foi usado. Os fibroblastos de pele dérmica normal (cc-2509 lote n° 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD), células derivadas do umbigo e células derivadas da placenta, foram testados. Estas populações de células foram bancadas na passagem 10 previamente, tendo sido cultivadas em 5.000 células/cm² em cada passagem por aquele ponto. O efeito da densidade celular nas populações de célula depois do descongelamento da célula na passagem 10 foi determinado. As células foram descongeladas sob condições padrão e contadas usado manchamento de azul tripano. As células descongeladas foram em seguida semeadas em 1.000 células/cm² em Meio de Cultura. As células foram cultivadas sob condições atmosféricas padrão a 37°C. O Meio de Cultura foi mudado duas vezes por semana. As células foram passadas uma vez que elas alcançaram cerca de 85% de confluência. As células foram subsequentemente passadas até a senescência, isto é, até que elas não pudessem ser ainda mais expandidas. As células foram tripsinizadas e contadas em cada passagem. O rendimento de célula, duplicação de população (In (células finais/células iniciais)/ln2) e tempo de duplicação (tempo em cultura)/duplicação de população) foram calculados. O rendimento de célula total por passagem foi determinado multiplicando-se o rendimento total pelas passagens prévias pelo fator de expansão para cada passagem (isto é, fator de expansão = células finais/células iniciais).

O potencial de expansão de culturas de célula derivada de tecido do cordão umbilical recentemente isoladas sob baixas condições de semeadura de célula foi testado em outro experimento. As células derivadas do umbigo foram isoladas como descrito em no Exemplo 5. As células foram semeadas em 1.000 células/cm² e passadas como descrito acima até a senescência. As células foram cultivadas sob condições atmosféricas padrão a 37°C. O Meio de Cultura foi mudado duas vezes por semana. As células fo

35/71 ram passadas uma vez que elas alcançaram cerca de 85% de confluência. Em cada passagem, as células foram tripsinizadas e contadas por manchamento de azul tripano. O rendimento de célula, duplicação de população (In (célula final/célula inicial)/ln 2) e tempo de duplicação (tempo em cultura/duplicação de população) foram calculados para cada passagem. O rendimento de célula total por passagem foi determinado multiplicando-se o rendimento total pelas passagens prévias pelo fator de expansão para cada passagem (isto é, fator de expansão = célula final/célula inicial). As células foram cultivadas em gelatina e frascos revestidos com não gelatina.

Foi demonstrado que as condições de cultura de célula com O2 baixo podem melhorar a expansão de célula em certas circunstâncias (Csete, Marie; Doyle, John; Wold, Barbara J.; McKay, Ron; Studer, Lorenz. Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells. US20040005704). Para determinar se a expansão de célula de células derivadas do umbigo pode ser melhorada alterando-se as condições de cultura de célula, as culturas de células derivadas do umbigo foram cultivadas em condições de baixo teor de oxigênio. As células foram semeadas em 5.000 células/cm² em Meio de Cultura em frascos revestidos com gelatina. As células foram inicialmente cultivadas sob condições atmosféricas padrão através da passagem 5, na qual elas foram transferidas para condições de cultura com baixo teor de oxigênio (5% de O2).

Em outros experimentos, as células foram expandidas em placas não revestidas, revestidas com colágeno, revestidas com fibronectina, revestidas com laminina e revestidas com matrigel. As culturas foram demonstradas expandir bem nestas matrizes diferentes.

As células derivadas do umbigo expandiram para mais do que 40 passagens gerando rendimentos de célula de > 1E17 células em 60 dias. Em contraste, MSCs e fibroblastos senesceram após < 25 dias e < 60 dias, respectivamente. Embora ambas células derivadas de adiposo e omentais tenham expandido durante quase 60 dias, elas geraram rendimentos de célula totais de 4.5E12 e 4.24E13, respectivamente. Desse modo, quando semeadas em 5.000 células/cm² sob condições experimentais usadas, as célu

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Ias derivadas do umbigo expandiram muito melhor do que o outro tipo de células cultivadas sob as mesmas condições (Tabela 6-1).

Tabela 6-1: Características de cultura para Diferentes Populações de Célula cultivada para Senescência

Tipo de Célula	Senescência	Duplicações de População Totais	Rendimento (Células Totais)
MSC	24 d	8	4,72 E7
Célula Derivada de Adiposo	57 d	24	4,5 E12
Fibroblastos	53 d	26	2,82 E13
Umbilical	65 d	42	6,15 E17

As células de fibroblastos e derivadas de umbigo expandiram para mais do que 10 passagens gerando rendimentos de célula de > 1E11 células em 60 dias (Tabela 6-2). Depois de 60 dias sob condições, os fibroblastos envelheceram; ao passo que as células derivadas do umbigo envelheceram após 80 dias, completando > 50 duplicações de população.

Tabela 6-2: Características de cultura para diferentes populações de célula usando expansão de cultura de baixa densidade de passagem 10 através da Senescência

Tipo de Célula (N° da Passagem)	Senescência	Duplicações de População Totais	Rendimento (Células Totais)
Fibroblastos (P10)	80 dias	43,68	2,59 E11
Umbilical (P10)	80 dias	53,6	1,25 E14

As células expandiram bem sob as condições de oxigênio reduzido, entretanto, a cultura sob condições de oxigênio baixo não parece ter um efeito significante sobre a expansão de célula para células derivadas de tecido do cordão umbilical. As condições atmosféricas padrão já provaram ter sucesso para cultivar números suficientes de células, e a cultura de baixo teor de oxigênio não é requerida para o cultivo de células derivadas do cordão umbilical.

As condições de expansão de célula atuais de cultura de células derivadas do cordão umbilical isoladas em densidades de cerca de 5.000 células/cm², em meio de cultura em frascos não revestidos ou revestidos

37/71 com gelatina, sob oxigênio atmosférico padrão, são suficientes para gerar grandes números de células na passagem 11. Além disso, os dados sugerem que as células podem ser facilmente expandidas usando condições de cultura de densidade mais baixa (por exemplo, 1.000 células/cm²). A expansão de célula derivada do tecido do cordão umbilical em condições de baixo teor de oxigênio também facilita a expansão de célula, embora nenhuma melhora incremental no potencial de expansão de célula já tenha sido observada quando usando estas condições para o cultivo. Atualmente, a cultura de células derivadas do tecido do cordão umbilical sob condições atmosféricas padrão é preferida para gerar grandes grupos de células. Entretanto, quando as condições de cultura são alteradas, a expansão de célula pode de outro modo ser alterada. Esta estratégia pode ser usada para realçar a capacidade proliferativa e diferenciativa destas populações de célula.

Sob as condições usadas, ao mesmo tempo em que o potencial de expansão de MSC e células derivadas de adiposo é limitado, as células derivadas do tecido do cordão umbilical expandem facilmente para números maiores Referências

Hayflick, The longevity of cultured human cells, J Am Geriatr Soc., 1974; 22; 1-12. Hayflick, The strategy of senescence, Gerontologist, 1974; 14(1); 37-45.

Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 20040058412. Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 20040048372. Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 20040005704. EXEMPLO 7

Cultivo de Células em Meio Contendo D-Valina

As linhagens celulares usadas na terapia de célula são preferivelmente homogêneas e livres de tipo de célula contaminante. As células usadas na terapia de célula teria um número normal (46) de cromossomas com estrutura normal. Para identificar as linhagens celulares derivadas do cordão umbilical que são homogêneas e livres de células de origem de tecido não pós-parto, os cariótipo de amostras de célula foram analisados.

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As células derivadas do umbigo (P5) e fibroblastos (P9) foram semeadas em 5.000 células/cm² em frascos T75 revestidos com gelatina (Corning, Corning, NY). Após 24 horas, o meio foi removido e as células foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) para remover o meio residual. O meio foi substituído com um Meio de Cultura modificado (DMEM com D-valina (ordem especial Gibco), 15% (v/v) de soro bovino fetal dializado (Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) de betamercaptoetanol (Sigma), penicilina em 50 Unidades/mililitro e estreptomicina em 50 milligramas/mililitro (Gibco)).

As células derivadas do umbigo e células de fibroblasto semeadas no meio contendo D-valina não proliferaram, diferente das células semeadas em meio de cultura contendo soro dializado. As células de fibroblastos mudaram morfologicamente, aumentando em tamanho e mudando a forma. Todas as células morreram e eventualmente se desprenderam da superfície do frasco após quatro semanas. Desse modo, pode ser concluído que as células derivadas do tecido de cordão umbilical requerem L-valina para o cultivo celular e para manter a viabilidade por longo prazo. L-valina é preferivelmente não removida do meio de cultura para células derivadas de tecido do cordão umbilical.

Referências

Hongpaisan, Inhibition of proliferation of contaminating fibroblasts by Dvaline in cultures of smooth muscle cells from human myometrium, Cell Biol Int., 2000; 24; 1-7.

Sordillo et al., Culture of bovine mammary epithelial cells in D-valine modified medium: selective removal of contaminating fibroblasts, Cell Biol Int Rep., 1988; 12; 355- 64.

EXEMPLO 8

Análise de Cariótipo das Células

As linhagens celulares usadas em terapia de célula são preferivelmente homogêneas e livres de qualquer tipo de célula contaminante. As células humanas usadas na terapia de célula devem ter um número normal (46) de cromossomas com estrutura normal. Para identificar as linhagens

39/71 celulares derivadas do tecido do cordão umbilical que são homogêneas e livres de células de origem de tecido não pós-parto, os cariótipo de amostras de célula foram analisados.

Células derivadas do tecido do cordão umbilical do tecido do cordão umbilical de um recém-nascido de sexo masculino foram cultivadas em Meio de Cultura. O tecido do cordão umbilical de um recém-nascido do sexo masculino (X, Y) foi selecionado para permitir a distinção entre células derivadas de recém-nascidos e células de origem materna (X,X). As células foram semeadas em 5.000 células por centímetro quadrado em Meio de Cultura em um frasco T25 (Corning, Corning, NY) e expandiram para 80% de confluência. Um frasco T25 contendo células foi preenchido até o gargalo com Meio de Cultura. As amostras foram liberadas para um laboratório citogenético clínico pelo correio (o tempo de transporte estimado de laboratório para laboratório é uma hora). A análise do cromossoma foi realizada por Center for Human & Molecular Genetics at the New Jersey Medical School, Newark, NJ. As células foram analisadas durante a metáfase quando os cromossomas são mais bem visualizados. De vinte células em metáfase contada, cinco foram analisadas quanto ao número de cariótipo homogêneo normal (dois). Uma amostra de célula foi caracterizada como homogênea, se dois cariótipos foram observados. Uma amostra de célula foi caracterizada como heterogênea se mais do que dois cariótipos foram observados. As células de metáfase adicionais foram contadas e analisadas quando um número de cariótipo heterogêneo (quatro) foi identificado.

Todas as amostras de célula enviadas para análise de cromossoma foram interpretadas pela equipe de laboratório de citogenética como exibindo uma aparência normal. Três das dezesseis linhagens celulares analisadas exibiram um fenótipo heterogêneo (XX e XY) indicando a presença de células derivadas tanto de origem neonatal quanto materna (Tabela 8-1). Cada uma das amostras de célula foi caracterizada como homogênea. (Tabela 8-1).

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Tabela 8-1: Resultados de Cariótipos de Células derivadas do tecido do cordão umbilical.

Tecido	Passagem	Células de Metáfase Contadas	Células de Metáfase Analisadas	Número de Cariótipos	Cariótipos de ISCN
Umbilical	23	20	5	2	46, XX
Umbilical	6	20	5	2	46, XY
Umbilical	3	20	5	2	46, XX

Código: N- Lado neonatal; V- região vilosa; M- lado materno; C- clone

A análise do cromossoma identificou células derivadas do umbigo cujos cariótipos parecem normais quando interpretados por um laboratório de citogenética clínico. A análise de cariótipo também identificou linhagens celulares livres de células maternas, como determinado por cariótipo homogêneo.

EXEMPLO 9

Avaliação Citométrica de Fluxo de Marcadores de Superfície de Célula

A caracterização de proteínas de superfície de célula ou marcadores por citometria de fluxo pode ser usada para determinar uma identidade de linhagem celular. A consistência da expressão pode ser determinada a partir de múltiplos doadores, e em células expostas para diferenciar as condições de processamento e cultura. As linhagens celulares isoladas do umbigo foram caracterizadas por citometria de fluxo, fornecendo um perfil para a identificação destas linhagens celulares.

As células foram cultivadas em Meio de Cultura, em frascos de cultura de tecido T75, T150 e T225 tratados com plasma (Corning, Corning, NY) até confluentes. As superfícies de cultura dos frascos foram revestidas com gelatina incubando-se 2% (p/v) de gelatina (Sigma, St. Louis, MO) durante 20 minutos em temperatura ambiente.

As células aderentes em frascos foram lavadas em solução salina tamponada por fosfato (PBS); (Gibco, Carlsbad, MO) e desprendidas com Tripsina/EDTA (Gibco). As células foram colhidas, centrifugadas e ressuspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS em uma concentração de célula de 1x10⁷ por mililitro. De acordo com as especificações do fabricante, o anticor

41/71 po para o marcador de superfície de célula de interesse (vide abaixo) foi adicionado a 100 microlitros de suspensão de célula, e a mistura foi incubada no escuro durante 30 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo não ligado. As 5 células foram ressuspensas em 500 microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo.

A análise de citometria de fluxo foi realizada com um instrumento de FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Os seguintes anticorpos para marcadores de superfície de célula 10 foram usados.

Tabela 9-1: Anticorpos usados na caracterização de marcadores de superfície de célula de UDCs.

Anticorpo	Fabricante	Número do Catálogo
CD10	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555375
CD13	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555394
CD31	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555446
CD34	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555821
CD44	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555478
CD45RA	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555489
CD73	BD Pharmingen (San Diego, CA)	550257
CD90	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555596
CD117	BD Biosciences(San Jose, CA)	340529
CD141	BD Pharmingen (San Diego, CA)	559781
PDGFr-alpha	BD Pharmingen (San Diego, CA)	556002
HLA-A, B, C	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555553
HLA-DR, DP, DQ	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555558
IgG-FITC	Sigma (St. Louis, MO)	F-6522
IgG- PE	Sigma (St. Louis, MO)	P-4685

As células do umbigo foram analisadas nas passagens 8, 15 e

20.

Para comparar diferenças entre os doadores, as células derivadas do cordão umbilical de diferentes doadores foram comparadas mutua42/71 mente.

As células derivadas do cordão umbilical cultivadas em frascos revestidos com gelatina foram comparadas com células derivadas do cordão umbilical cultivadas em frascos não revestidos.

Quatro tratamentos usados para isolamento e preparação de células foram comparados. As células derivadas de tecido por tratamento com: 1) colagenase; 2) colagenase/dispase; 3) colagenase/hialuronidase; e 4) colagenase/hialuronidase/dispase, foram comparadas.

As células derivadas do cordão umbilical nas passagens 8, 15 e 20 analisadas por citometria de fluxo todas expressaram CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, indicados por fluorescência aumentada relativo ao controle de IgG. Estas células foram negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 e HLA-DR, DP, DQ, indicado por valores de fluorescência de acordo com o controle de IgG.

As células derivadas de cordão umbilical isoladas de doadores separados analisadas por citometria de fluxo, cada qual mostrou-se positiva para a produção de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, refletido nos valores aumentados de fluorescência relativo ao controle de IgG. Estas células foram negativas para a produção de CD31, CD34, CD45, CD117, CD 141 e HLA-DR, DP, DQ com valores de fluorescência de acordo com o controle de IgG.

As células derivadas do cordão umbilical expandiram em frascos não revestidos e revestidos com gelatina analisados por citometria de fluxo, todas foram positivas para a produção de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, com valores aumentados de fluorescência relativo ao controle de IgG. Estas células foram negativas para a produção de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 e HLA-DR, DP, DQ, com valores de fluorescência de acordo com o controle de IgG.

A análise de células derivadas do cordão umbilical por citometria de fluxo estabeleceu uma identidade destas linhagens celulares. Células derivadas do cordão umbilical são positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa e HLA-A,B,C; e negativas para CD31, CD34, CD45,

43/71

CD117, CD141 e HLA-DR, DP, DQ. Esta identidade foi consistente entre as variações em variáveis incluindo o doador, passagem, revestimento de superfície do vaso de cultura, enzimas de digestão e camada placentária. Alguma variação nas faixas e médias da curva de histograma de valor de fluorescência individual foram observadas, porém todas as curvas positivas sob todas as condições testadas foram normais, e os valores de fluorescência expressos maiores do que o controle de IgG, desse modo confirmando que as células compreendem uma população homogênea que tem expressão positiva dos marcadores.

EXEMPLO 10

Análise de Células por Disposição de Oligonucleotídeo

As disposições de oligonucleotídeo foram usadas para comparar os perfis de expressão de gene de células derivadas de placenta e derivadas do umbigo com fibroblastos, células-tronco mesenquimatosas humanas, e outra linhagem celular derivada da medula óssea humana. Esta análise forneceu uma caracterização das células e identificou marcadores moleculares únicos para estas células.

Células Derivadas de Tecido:

A placenta e o cordão umbilical humano foram obtidos de National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) de liberações normais de termo completo com o consentimento do paciente. Os tecidos foram recebidos, e as células foram isoladas como descrito no Exemplo 5. As células foram cultivadas em meio de cultura em frascos plásticos de cultura de tecido revestidos com gelatina. As culturas foram incubadas a 37°C com 5% de CO2.

Fibroblastos:

Os fibroblastos dérmicos humanos foram adquiridos de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; Número do Lote 9F0844) e ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Ambas as linhagens foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 10% (v/v) de soro bovino fetal (Hyclone) e penicilina/estreptomicina (Invitrogen)). As células foram cultivadas em plástico tratado para tecido padrão.

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Células-tronco Mesenquimatosas Humanas (hMSC):

hMSCs foram adquiridas de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; Números do Lote 2F1655, 2F1656 e 2F1657) e cultivadas de acordo com as especificações do fabricante em Meio MSCGM (Cambrex). As células foram cultivadas em plástico de cultura de tecido padrão em 37°C com 5% de CO₂.

Células da Medula Óssea da Crista llíaca Humana (ICBM):

A medula óssea de crista ilíaca humana foi recebida de NDRI com o consentimento do paciente. A medula foi processada de acordo com o método descrito por Ho et al. (W003/025149). A medula foi misturada com tampão de lise (NH₄CI a 155 mM, KHCO3 a 10 mM e EDTA a 0,1 mM, pH 7,2) em uma relação de 1 parte de medula óssea para 20 partes de tampão de lise. A suspensão de célula foi vortexada, incubada durante 2 minutos em temperatura ambiente e centrifugada durante 10 minutos em 500 x g. O sobrenadante foi descartado e o pélete de célula foi ressuspenso em Meio-alfa Essencial Mínimo (Invitrogen) suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal e glutamina a 4 mM. As células foram centrifugadas novamente, e o pélete de célula foi ressuspenso em meio fresco. As células mononucleares viáveis foram contadas usando exclusão de azul tripano (Sigma, St. Louis, MO). As células mononucleares foram semeadas em frascos plásticos de cultura de tecido em 5 x 10⁴ células/cm². As células foram incubadas a 37°C com 5% de CO₂ em O₂ atmosférico padrão ou em 5% de O₂. As células foram cultivadas durante 5 dias sem uma mudança de meio. O meio e células não aderentes foram removidos após 5 dias de cultivo. As células aderentes foram mantidas em cultura.

As culturas ativamente crescentes de células foram removidas dos frascos com um raspador de célula em solução salina tamponada por fosfato fria (PBS). As células foram centrifugadas durante 5 minutos em 300 x g. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em PBS fresco e centrifugadas novamente. O sobrenadante foi removido e o pélete de célula foi imediatamente congelado e armazenado a -80°C. O mRNA celular foi extraído e transcrito em cDNA. O cDNA foi em seguida transcrito em

45/71 cRNA e rotulado com biotina. O cRNA rotulado com biotina foi hibridizado com disposições de oligonucleotideo Affymetrix GENECHIP HG-U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA). As hibridizações e coleção de dados foram realizadas de acordo com as especificações do fabricante. As análises de 5 dados foram realizadas usando software de computador Significance Analysis of Microarrays (SAM) versão 1.21 (Tusher et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5116-5121).

Diferentes populações de células foram analisadas neste estudo.

As células, junto com a informação de passagem, substrato de cultura e 10 meios de cultura são listados na Tabela 10-1.

Tabela 10-1: Células analisadas pelo estudo de microdisposição. As linhagens celulares são listadas por seu código de identificação junto com a passagem no tempo da análise, substrato de cultura de célula e meios de cultura.

População das Células	Passagem	Substrato	Meiod
Umbilical (022803)	2	Gelatina	DMEM, 15% FBS, βΜΕ
Umbilical (042103)	3	Gelatina	DMEM, 15% FBS, βΜΕ
Umbilical (071003)	4	Gelatina	DMEM, 15% FBS, βΜΕ
Placenta (042203)	12	Gelatina	DMEM, 15% FBS, βΜΕ
Placenta (042903)	4	Gelatina	DMEM, 15% FBS, βΜΕ
Placenta (071003)	3	Gelatina	DMEM, 15% FBS, βΜΕ
ICBM (070203) (5% O₂)	3	Plástico	MEM 10% FBS
ICBM (062703) (std O₂)	5	Plástico	MEM 10% FBS
ICBM (062703 )(5% O₂)	5	Plástico	MEM 10% FBS
hMSC (Lot2F1655)	3	Plástico	MSCGM
hMSC (Lot2F1656)	3	Plástico	MSCGM
hMSC (Lot2F1657)	3	Plástico	MSCGM
hFibroblastos (9F0844)	9	Plástico	DMEM-F12, 10% FBS
hFibroblastos (CCD39SK)	4	Plástico	DMEM-F12, 10% FBS

Os dados foram avaliados por Análise de Componente Principal com software SAM como descrito acima. A análise revelou 290 genes que foram expressos em diferentes quantidades relativas nas células testadas. Esta análise forneceu comparações relativas entre as populações.

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A Tabela 10-2 mostra as distâncias euclidianas que foram calculadas para a comparação dos pares de célula. As distâncias euclodianas foram baseadas na comparação das células baseadas nos 290 genes, que foram diferentemente expressos entre os tipos de célula. A distância euclidi5 ana é inversamente proporcional a similaridade entre a expressão dos 290 genes.

Tabela 10-2: As Distâncias euclidianasEuclidianas para os Pares de Célula. A distância euclidiana foi calculada para os tipos de célula usando os 290 genes que foram expressos diferencialmente entre os tipos de célula. A simi10 laridade entre as células é inversamente proporcional à distância euclidiana.

Par de Célula	Distância Euclidiana
ICBM-hMSC	24,71
Placenta-umbilical	25,52
ICBM-Fibroblasto	36,44
ICBM-placenta	37,09
Fibroblasto-MSC	39,63
ICBM-Umbilical	40,15
MSC-Umbilical	46,86

As Tabelas 10-3, 10-4 e 10-5 mostram a expressão de genes aumentada em células derivadas do tecido umbilical (Tabela 10-3), aumentada em células derivadas de placenta (Tabela 10-4) e reduzida em células derivadas do cordão umbilical e placenta (Tabela 10-5).

Tabela 10-4: Genes que são especificamente aumentados na expressão nas células derivadas do cordão umbilical quando comparado com as outras linhagens celulares ensaiadas.

Genes aumentados em células derivadas do umbigo
ID do Conjunto de Sonda	Nome do gene	Número de Acessão NCBI
202859 x at	Interleucina 8	NM 000584
211506 s at	Interleucina 8	AF043337
210222 s at	reticulon 1	BC000314

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Genes aumentados em células derivadas do umbigo
204470_at	Ligante 1 de quimiocina (motivo C-XC) (atividade de estimulação de cultura de melanoma)	NM001511


206336_at	Ligante 6 de quimiocina (motivo C-XC) (proteína 2 quimiotática de granulócito)	NM_002993
207850_at	Ligante 3 de quimiocina (motivo C-XC)	NM_002090
203485 at	reticulon 1	NM021136
202644_s_at	Fator de necrose tumoral, proteína 3 alfa-induzida	NM 006290

Tabela 10-3: Genes que são especificamente aumentados na expressão nas células derivadas de placenta quando comparado com as outras linhagens celulares ensaiadas.

Genes aumentados em células derivadas de placenta
ID do Conjunto de Sonda	Nome do gene	Número de Acessão NCBI
209732_at	Lecitina tipo C (domínio de reconhecimento de carboidrato, dependente de cálcio), membro 2 da superfamília (induzido por ativação)	AF070642
206067_s_a t	Tumor de Wilms 1	NM_024426
207016_s_a t	Família de aldeído deidrogenase 1, membro A2	AB015228
206367 at	Renina	NM 000537
210004_at	Receptor 1 de lipoproteína de baixa densidade oxidado (semelhante a lectina)	AF035776
214993_at	Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, cds parcial	AF070642
202178 at	proteína cinase C, zeta	NM 002744
209780 at	proteína hipotética, DKFZp564F013	AL136883
204135 at	Sub-regulado em câncer ovariano 1	NM 014890
213542_at	mRNA de Homo sapiens, (de clone DKFZp547K1113)	AI246730

Tabela 10-5: Genes que foram diminuídos na expressão nas células de cor48/71 dão umbilical e placenta quando comparado com outras linhagens celulares ensaiadas.

Genes diminuídos em células derivadas do umbigo e placenta
ID do Conjunto de Sonda	Nome do gene	Número de Acessão NCBI
210135 s at	Homeobox 2 de estatura curta	AF022654.1
205824 at	Proteína 2 de 27 kDa de choque térmico	NM 001541.1
209687_at	chemoquina (tema C-X-C) ligante 12 (célula estroma-fator derivado 1)	U 19495.1
203666_at	Ligante 12 de quimiocinba (motivo C-X-C) (fator 1 derivado de célula estromal)	NM_000609.1
212670_at	elastina (estenose aórtica supravalvular síndrome de Williams-Beuren de clone)	AA479278
213381_at	elastina (estenose aórtiva supravalvular, síndrome de Williams-Beuren de clone DKFZp586M2022	N91149
206201_s_at	Homeobox 2 de mesênquima (homeobox específica de interrupção do cultivo)	NM_005924.1
205817_at	Homólogo 1 de homeobox sine oculis (Drosophila)	NM_005982.1
209283 at	cristalina, alfa B	AF007162.1
212793_at	ativador associado desgrenhado de morfogênese 2	BF513244
213488 at	proteína DKFZP586B2420	AL050143.1
209763 at	similar a neuralina 1	AL049176
205200_at	Tetranectina (proteína de ligação de plasminogênio)	NM_003278.1
205743_at	domínio rico em cisteína e três homologias src (SH3)	NM_003149.1
200921_s_at	gene 1 de translocação de célula B, antiproliferativo	NM_001731.1
206932 at	colesterol 25-hidroxilase	NM 003956.1
204198 s at	fator 3 de transcrição relacionado com runt	AA541630
219747 at	proteína hipotética FLJ23191	NM 024574.1
204773 at	receptor de interleucina 11, alfa	NM 004512.1
202465 at	realçador de procolágeno C-endopeptidase	NM 002593.2
203706 s at	homólogo 7 frizado (Drosophila)	NM 003507.1
212736 at	Gene hipotético BC008967	BE299456
214587 at	Colágeno, Tipo VIII, alfa 1	BE877796
201645 at	Tenascina C (hexabraquiona)	NM 002160.1

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Genes diminuídos em células derivadas do umbigo e placenta
ID do Conjunto de Sonda	Nome do gene	Número de Acessão NCBI
210239 at	proteína 5 de Iroquois homeobox	U90304.1
203903 s at	Hefaestina	NM 014799.1
205816 at	integrina, beta 8	NM 002214.1
203069 at	glicoproteína 2 de vesículo sináptico	NM 014849.1
213909_at	Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744	AU147799
206315 at	fator 1 semelhante ao receptor de citocina	NM 004750.1
204401_at	canal ativado por cálcio de condutância pequena/intermediária de potássio, subfamília N, membro 4	NM_002250.1
216331 at	integrina, alfa 7	AK022548.1
209663 s at	integrina, alfa 7	AF072132.1
213125 at	proteína DKFZP586L151	AW007573
202133_at	coativador transcricional com motivo de ligação de PDZ (TAZ)	AA081084
206511_s_at	homólogo 2 de homeobox sine oculis (Drosophila)	NM_016932.1
213435 at	proteína KIAA1034	AB028957.1
206115 at	resposta 3 de cultura precoce	NM 004430.1
213707 s at	distal-less homeobox 5	NM.005221.3
218181 s at	proteína hipotética FLJ20373	NM 017792.1
209160_at	família 1 de aldo-ceto reductase, membro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deidrogenase, tipo II)	AB018580.1
213905 x at	Biglicano	AA845258
201261 x at	Biglicano	BC002416.1
202132_at	coativador transcricional com motivo de ligação de PDZ (TAZ)	AA081084
214701 s at	fibronectina 1	AJ276395.1
213791 at	Proencefalina	NM 006211.1
205422_s_at	Integrina, beta tipo 1 (com domínios de repetição tipo EGF)	NM_004791.1
214927_at	Clone de cDNA de inserção de tamanho natural de mRNA de Homo sapiens EUROIMAGE 1968422	AL359052.1
206070 s at	EphA3	AF213459.1
212805 at	proteína KIAA0367	AB002365.1

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Genes diminuídos em células derivadas do umbigo e placenta
ID do Conjunto de Sonda	Nome do gene	Número de Acessão NCBI
219789_at	receptor C de peptídeo natriurético/guanilato ciclase C (receptor C de peptídeo atrionatriurético)	AI628360
219054 at	proteína hipotética FJL14054	NM 024563.1
213429_at	mRNA de Homo sapiens, (de clone DKFZp564B222)	AW025579
204929_s_at	Proteína 5 de membrana associada à vesícula (miobrevina)	NM_006634.1
201843_s_at	Proteína 1 de matriz extracelular semelhante a fibulina contendo EGF	NM_004105.2
221478_at	BCL2/adenovírus E1B 19kDa interagindo com proteína tipo 3	AL132665.1
201792 at	proteína 1 de ligação de AE	NM 001129.2
204570_at	polipeptídeo 1 de subunidade Vila de citocroma c oxidase (músculo)	NM_001864.1
201621_at	neuroblastoma, supressão de tumorigenicidade 1	NM_005380.1
202718_at	proteína 2 de ligação de fator de crescimento semelhante a insulina, 36 kDa	NM_000597.1

Tabelas 10-6, 10-7 e 10-8 mostram a expressão de genes aumentados em fibroblastos humanos (Tabela 10-6), células ICBM (Tabela 107) e MSCs (Tabela 10-8).

Tabela 10-6: Genes que foram aumentados em expressão em fibroblastos quando comparado com as outras linhagens celulares ensaiadas.

Genes aumentados em fibroblastos fosfatase 2 de especificidade dual proteína KIAA0527 dineína, citopiásmico, polipeptídeo 1 intermediário ancirina 3, nó de Ranvier (ancirina G) inibina, beta A (Activina A, activina AB alfa polipeptídeo) ectonucleotídeo oirofosfatase/fosfodiesterase 4 (função putativa) proteína 1A associada ao microtúbulo proteína 41 de dedo de zinco proteína LIM (similar ao enigma de ligação de proteína cinase C de rato)

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Genes aumentados em fibroblastos

inibidor de realçador de gene de polipeptídeo leve de capa em células B, proteína associada ao complexo de cinase

proteína hipotética FLJ22004

sequência de mRNA humano (clone CTG-A4)

ESTs, Moderadamente similar ao fator 2 semelhante do receptor de citocina; precursor de receptor CRL2 de citocina

transformação do fator de crescimento; beta 2

proteína hipotética MGC29643

antígeno identificado por anticorpo monoclonal MRC OX-2

Genes aumentados em fibroblastos

fosfatase 2 de especificidade dual

proteína KIAA0527

dineína, citoplásmico, polipeptídeo 1 intermediário

Tabela 10-7: Genes que foram aumentados na expressão nas células derivadas de ICBM quando comparado com outras linhagens celulares ensaiadas.

Genes aumentados em células ICBM proteína de repetição de ancirina cardíaca

ORF de região de classe I de MHC integrina, alfa 10 proteína hipotética FLJ22362

UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:polipeptídeo Nacetilgalactosaminiltransferase 3 (GalNAc-T3)

Proteína 44 induzida por interferon

SRY (região Y de determinação do sexo)-caixa 9 (displasia campomélica, reversão de sexo autossômica) proteína 1-1 asociada a ceratina hipocalcina tipo 1 denteado 1 (síndrome de Alagille) proteogliano 1, grânulo secretor

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Tabela 10-8: Genes que foram aumentados na expressão nas células MSC quando comparado com outras linhagens celulares ensaiadas

Genes Aumentados em células MSC interleucina 26 maltase-glicoamilase (alfa-glicosidase) subfamília 4 de receptor nuclear, grupo A, membro 2 homólogo de oncogene viral de osteossarcoma de murino de v-fos FBJ proteína hipotética DC42 subfamília 4 de receptor nuclear, grupo A, membro 2 homólogo B de oncogene viral de osteossarcoma de murino de FBJ proteína 1 de série de reações de sinalização induzível por de WNT1 sequência de transformação derivada de linhagem celular MCF.2 canal de potássio, subfamília K, membro 15 homeoproteína 1 de classe pareada de cartilagem

CDNA de Homo sapiens FLJ12232 fis, clone MAMMA 1001206 CDNA de Homo sapiens FLJ34668 fis, clone LIVER2000775 jun B proto-oncogene

CLL de célula B/linfoma 6 (proteína do dedo de zinco 51) proteína do dedo de zinco 36, tipo C3H, homóloga (camundongo)

O presente exemplo foi realizado para fornecer uma caracterização molecular das células derivadas de cordão umbilical e placenta. Esta 5 análise incluiu células derivadas de três cordões umbilicais diferentes e três placentas diferentes. O estudo também incluiu diferentes linhagens de fibroblastos dérmicos, três linhagens de células-tronco mesenquimatosas e três linhagens das células da medula óssea de crista ilíaca. O mRNA que foi expresso por estas células foi analisado em uma disposição de oligonucleotí10 deo GENECHIP que continha sondas de oligonucleotídeo para 22.000 genes.

A análise revelou que as transcrições para 290 genes estavam presentes em diferentes quantidades nestes cinco tipos de célula diferentes. Estes genes incluem sete genes que são especificamente aumentados nas 15 células derivadas de umbigo e dez genes especificamente aumentados nas células derivadas de placenta. Descobriu-se que cinquenta e quatro genes

53/71 têm níveis de expressão menores em células derivadas de placenta e derivadas do cordão umbilical.

A expressão de genes selecionados foi confirmada por PCR, como mostrado no Exemplo 11. As células geralmente, e células derivadas do umbigo, em particular, têm perfis de expressão de gene distintos, por exemplo, quando comparado com outras células humanas, tais como as células derivadas da medula óssea e fibroblastos aqui testados.

EXEMPLO 11

Marcadores de Célula

Os perfis de expressão de gene de células derivadas do cordão umbilical foram comparados com aqueles de células derivadas de outras fontes usando um Affymetrix GENECHIP. Seis genes assinatura foram identificados: receptor 1 de LDL oxidado, interleucina-8 (IL-8), renina, reticulon, ligante 3 de receptor de quimiocina (ligante 3 CXC) e proteína 2 quimiotática de granulócitos (GCP-2). Estes genes assinatura foram expressos em níveis relativamente elevados em células derivadas do umbigo.

Os procedimentos descritos neste exemplo foram conduzidos para verificar os dados de microdisposição e comparar os dados com expressão de gene e proteína, bem como para estabelecer uma série de ensaios seguros para detecção de identificadores únicos para células derivadas do tecido do cordão umbilical.

As células derivadas do umbigo (quatro isolados), e fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF; neonatal e adulto) foram cultivados em meio de cultura em frascos T75 revestidos com gelatina. As células-tronco mesenquimatosas (MSCs) foram cultivadas em kit Bullet de meio de cultura de célula-tronco mesenquimatosa (MSCGM; Cambrex, Walkerville, MD).

Para experimentos com IL-8, as células foram descongeladas de nitrogênio líquido e semeadas em frascos revestidos com gelatina em 5.000 células/cm², cultivadas durante 48 horas em meio de cultura e em seguida cultivadas também durante 8 horas em 10 mililitros de meio de privação de soro [DMEM com baixo teor de glicose (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina (50 Unidades/mililitro), estreptomicina (50 microgramas/mililitro)(Gibco) e 0,1%

54/71 (peso/v) de albumina de soro bovino (BSA; Sigma, St. Louis, MO)]. RNA foi em seguida extraído, e os sobrenadantes foram centrifugados em 150 x g durante 5 minutos para remover os resíduos de célula. Os sobrenadantes foram congelados a -80°C até a análise por ELISA.

O cordão umbilical, bem como fibroblastos humanos derivados de prepúcio humano neonatal, foram cultivados em meio de cultura em frascos T75 revestidos com gelatina. As células foram congeladas na passagem 11 em nitrogênio líquido. As células foram descongeladas e transferidas para tubos centrífugos de 15 mililitros. Após a centrifugação em 150 x g durante 5 minutos, o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 4 mililitros de meio de cultura e contadas. As células foram cultivadas em um frasco de 75 cm² contendo 15 mililitros de meio de cultura em 375.000 célula/frasco durante 24 horas. O meio foi mudado para um meio de privação de soro durante 8 horas. O meio de privação de soro foi coletado no final da incubação, centrifugado em 14.000 x g durante 5 minutos e armazenado em -20°C.

Para estimar o número de células em cada frasco, 2 mililitros de tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA) foram adicionados a cada frasco. Após as células desprenderem do frasco, a atividade de tripsina foi neutralizada com 8 mililitros de meio de cultura. As células foram tranferidas para um tubo centrífugo de 15 mililitros e centrifugadas em 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e 1 mililitro de meio de cultura foi adicionado a cada tubo para ressuspender as células. O número de célula foi determinado com um hemocitômetro.

A quantidade de IL-8 secretada pelas células no meio de privação de soro foi analizada usando os ensaios ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todas os ensaios foram conduzidos de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

O RNA foi extraído de fibroblastos e células derivadas de cordão umbilical confluente, ou para a expressão de IL-8, de células tratadas como descrito acima. As células foram lisadas com 350 microlitros de tampão RLT contendo beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) de acordo com as ins

55/71 truções do fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA). O RNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA) e submetido ao tratamento com DNase (2,7 Unidades/amostra) (Sigma St. Louis, MO). RNA foi eluido com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80°C. O RNA também foi extraído do cordão umbilical humano. O tecido (30 miligramas) foi suspenso em 700 microlitros de tampão RLT contendo beta-mercaptoetanol. As amostras foram mecanicamente homogeneizadas, e a extração de RNA prosseguiu de acordo com a especificação do fabricante. O RNA foi extraído com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80°C.

O RNA foi transcrito reverso usando hexâmetros aleatórios com os reagentes de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 60 minutos, e 95°C durante 10 minutos. As amostras foram armazenadas a -20°C.

Os genes identificados por microdisposição de cDNA como unicamente regulado em células do cordão umbilical (genes assinatura - incluindo receptor de LDL oxidado, interleucina-8, renina e reticulon), também foram investigados usando PCR em tempo real e convencional.

PCR foi realizada em amostras de cDNA usando os produtos de expressão de gene vendidos sob o nome comercial produtos de expressão de gene ASSAYS-ON-DEMAND (Applied Biosystems). O receptor de LDL oxidado (Hs00234028); renina (Hs00166915); reticulon (Hs00382515); ligante 3 de CXC (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); e GAPDH foram misturados com mistura master de PCR e cDNA TaqMan Universal de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems) usando um sistema de detecção de sequência 7000 com software ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems). As condições de ciclo térmicas foram inicialmente 50°C durante 2 minutos e 95°C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 1 minuto. Os dados de PCR foram analisados de acordo com as especificações do fabricante (User Bulletin n° 2 de Applied Biosystems for ABI Prism 7700 Sequence Detection System).

56/71

A PCR convencional foi realizada usando um ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, MA) para confirmar os resultados de PCR em tempo real. O PCR foi realizado usando 2 microlitros de solução de cDNA (1x Taq polimerase (nome comercial AMPLITAQ GOLD) tampão 5 de reação de PCR de mistura universal (Applied Biosystems) e desnaturação inicial a 94°C durante 5 minutos. A amplificação foi otimizada para cada conjunto de iniciador. Para IL-8, ligante 3 CXC, e reticulon (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos e 72°C durante 30 segundos para 30 ciclos); para renina (94°C durante 15 segundos, 53°C durante 15 segundos e 72°C durante 30 segundos para 38 ciclos); para receptor de LDL oxidado e GAPDH (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos e 72°C durante 30 segundos para 33 ciclos). Os iniciadores usados para amplificação são listados na Tabela 11-1. A concentração de iniciador na reação de PCR final foi 1 micromolar exceto para GAPDH que foi 0,5 micromolar. Os inicia·· 15 dores de GAPDH foram os mesmos como para PCR em tempo real, exceto que a sonda TaqMan do fabricante não foi adicionada a reação de PCR final.

As amostras foram separadas em 2% (p/v) de gel agarose e manchadas com brometo de etídio (Sigma, St. Louis, MO). As imagens foram capturadas em película 667 (Universal Twinpack, VWR International, South Plainfield,

NJ) usando câmera de comprimento focal fixo POLAROID (VWR International, South Plainfield, NJ).

Tabela 11-1: Iniciadores usados

Iniciadores

S: 5'- GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3 (SEQ ID NO: 1)' A: 5'-AGAATGGAAAACTGGAATAGG -3’ (SEQ ID NO:2) S: 5'-TCTTCGATGCTTCGGATTCC -3^r (SEQ ID NO:3) A: 5^r-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG -3' (SEQ ID NO:4) S: S’- TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3' (SEQ ID NO:5) A: 5'- AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3' (SEQ ID NO:6)

S: 5'- TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3’ (SEQ ID NO:7) A; 5 -CTTCAAAAACTTCTCCACAACC- 3' (SEQ ID NO:8) S: S’- CCCACGCCACGCTCTCC-3’ (SEQ ID NO:9) A: 5’-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC -3’ (SEQ ID NO: 10)

Nome do Iniciador

Receptor LDL oxidado

Renina

Reticulon lnterleucina-8

Ligante 3 de quimiocina

As células derivadas do cordão umbilical foram fixadas com 4%

57/71 (p/v) de paraformaldeído frio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos em temperatura ambiente. Um isolado de cada das células derivadas do cordão umbilical na passagem 0 (P0) (diretamente após o isolamento) e passagem 11 <P11) (dois isolados de células derivadas de cordão umbilical) 5 e fibroblastos (P11) foram usados. A imunocitoquímica foi realizada usando anticorpos direcionados contra os seguintes epítopos: vimentina (1:500, Sigma, St. Louis, MO), desmina (1:150; Sigma - aumentado contra coelho; ou 1:300; Chemicon, Temecula, CA - aumentado contra camundongo), alfaactina de músculo liso (SMA; 1:400; Sigma), citoceratina 18 (CKI 8; 1:400;

Sigma), Fator von Willebrand (vWF; 1:200; Sigma), e CD34 (CD34 humano Classe III; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, CA). Além disso, os seguintes marcadores foram testados na passagem 11 de células derivadas de cordão umbilical: GROalfa anti-humano-PE (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 anti-humano (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, ·· 15 CA), receptor 1 de LDL oxidado anti-humano (ox-LDL Rl; 1:100; Santa Cruz Biotech), e NOGA-A anti-humano (1 :100; Santa Cruz, Biotech).

As culturas foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de proteína contendo PBS, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, CA), e 0,3% (v/v) de 20 Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutos para acessar os antígenos intracelulares. Onde o epítopo de interesse foi localizado na superfície de célula (CD34, ox-LDL Rl), Triton X-100 foi omitido em todas as etapas do procedimento para prevenir perda de epítopo. Além disso, em casos onde o anticorpo primário foi aumentado contra cabra (GCP-2, ox-LDL 25 Rl, NOGO-A), 3% (v/v) de soro de asno foi usado no lugar de soro de cabra em todo o processo. Os anticorpos primários, diluídos em solução de bloqueio, foram em seguida aplicados às culturas durante um período de 1 hora em temperatura ambiente. As soluções de anticorpo primárias foram removidas e as culturas foram lavadas com PBS antes da aplicação de soluções de 30 anticorpo secundárias (1 hora em temperatura ambiente) contendo bloqueio junto com IgG anticamundongo de cabra- Texas Red (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR) e/ou IgG anticoelho de cabra- Alexa 488 (1:250; Molecular

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Probes) ou IgG anticabra de asno-FITC (1:150, Santa Cruz Biotech). As culturas foram em seguida lavadas e 10 micromolares de DAPI (Molecular Probes) aplicados durante 10 minutos para visualizar os núcleos da célula.

Depois do imunomanchamento, a fluorescência foi visualizada usando um filtro de fluorescência apropriado em um microscópio epifluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). Em todos os casos, o manchamento positivo representou sinal de fluorescência acima do manchamento de controle onde o procedimento total descrito acima foi seguido com a exceção de aplicação de uma solução de anticorpo primária (sem o 1^ocontrole). As imagens representativas foram capturadas usando uma videocâmera de cor digital e software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para amostras triplamente manchadas, cada imagem foi tomada usando somente um filtro de emissão de cada vez. As montagens em camadas foram então preparadas usando software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

As células aderentes nos frascos foram lavadas em solução salina tamponada por fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) e desprendidas com Tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA). As células foram colhidas, centrifugadas, e ressuspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS em uma concentração de célula de 1x10⁷/mililitro. Alíquotas de cem microlitros foram liberadas para os tubos cônicos. As células manchadas para antígenos intracelulares foram permeabilizadas com tampão Perm/de lavagem (BD Pharmingen, San Diego, CA). O anticorpo foi adicionado às alíquotas como pelas especificações do fabricante, e as células foram incubadas no escuro durante 30 minutos a 4°C. Após incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo em excesso. As células requerendo um anticorpo secundário foram ressuspensas em 100 microlitros de 3% de FBS. O anticorpo secundário foi adicionado como pela especificação do fabricante, e as células foram incubadas no escuro durante 30 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo secundário em excesso. As células lavadas foram ressuspensas em 0,5 mililitro de PBS e analisada por citometria de fluxo. Os seguintes an59/71 ticorpos foram usados: receptor 1 de LDL oxidado (sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, MA), IgG de Camundongo capa, (P-4685 e M-5284; Sigma), e IgG de asno contra cabra (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.). Análise de citometria de fluxo foi realizada com FACScali5 bur (Becton Dickinson San Jose, CA).

Os resultados de PCR em tempo real para genes assinatura selecionados realizados em cDNA de células derivadas de cordão umbilical humano, fibroblastos de adulto e neonatal e células-tronco mesenquimatosas (MSCs) indicam que ambas expressões de receptores de reticulon e 10 LDL oxidado foram mais elevadas em células derivadas do umbigo quando comparado com as outras células. Os dados obtidos de PCR em tempo real foram analisados pelo método ΔΔΟΤ e expressos em uma escala logarítmica. Nenhuma diferença significante nos níveis de expressão de ligante 3 de CXC e GCP-2 foi encontrada entre as células e controles. Os resultados de ·· 15 PCR em tempo real foram confirmados por PCR convencional. O sequenciamento de produtos de PCR também validou estas observações. Nenhuma diferença significante no nível de expressão de ligante 3 de CXC foi encontrada entre as células e os controles usando iniciadores de ligante 3 de CXC de PCR convencional listados na Tabela 11-1.

A expressão da citocina, IL-8 em células derivadas de tecido de cordão umbilical foi elevada em ambas as células cultivadas em meio de cultura e privadas de soro derivadas de tecido de cordão umbilical. Todos os dados de PCR em tempo real foram validados com PCR convencional e por sequenciamento dos produtos de PCR.

Após o cultivo nos meios livres de soro, os meios condicionados foram examinados quanto à presença de IL-8. As quantidades maiores de IL-8 foram detectadas em meios nos quais as células do umbigo foram cultivadas (Tabela 11-2). Nenhuma IL-8 foi detectada no meio no qual os fibroblastos dérmicos humanos foram cultivados.

Tabela 11-2: Expressão de proteína IL-8 medida por ELISA

Tipo de célula	IL-8
Fibroblastos humanos	ND

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Tipo de célula	IL-8
UMBC Isolado 1	2058.42+144.67
UMBC Isolado 2	2368.86+22.73
Os resultados do ensaio ELISA para interleucina-8 (IL-8) realizados nas células derivadas do cordão umbilical, bem como fibroblastos de pele humana. Os valores são apresentados aqui como picograma/milhão de células, n=2, sem

N.D. = Não Detectado

As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem 0 foram sondadas para a produção de proteínas selecionadas por análise imunocitoquímica. Imediatamente após o isolamento (passagem 0), as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído e expostas aos anticorpos para seis proteínas: Fator de von Willebrand, CD34, citoceratina 18, desmina, alfa-actina de músculo liso, e vimentina. As células derivadas de cordão umbilical foram positivas para alfa-actina de músculo liso e vimentina, com o padrão de manchamento consistente através da passagem 11.

A produção de GROalfa, GCP-2, receptor 1 de LDL oxidado e reticulon (NOGO-A) em células derivadas de cordão umbilical na passagem 11 foi investigada por imunocitoquímica. As células derivadas de cordão umbilical foram GCP-2 positivo, porém a produção de GRO alfa não foi detectada por este método. Além disso, as células foram NOGO-A positivo.

O acordo entre os níveis de expressão de gene medidos por microdisposição e PCR (tanto convencional quanto em tempo real) foi estabelecido para quatro genes: receptor 1 de LDL oxidado, renina, reticulon, e IL-

8. A expressão destes genes foi diferencialmente regulada no nível de mRNA nas células derivadas de cordão umbilical, com IL-8 também diferencialmente regulada no nível de proteína. A expressão diferencial de GCP-2 e ligante 3 de CXC não foi confirmada no nível de mRNA. Embora este resultado não suporte os dados originalmente obtidos do experimento de microdisposição, isto pode ser devido a uma diferença na sensibilidade das metodologias.

As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem 0 foram sondadas para a expressão de alfa-actina de músculo liso e vimen

61/71 tina, e foram positivas para ambas. O padrão de manchamento foi conservado através da passagem 11.

Na conclusão, os dados de mRNA completo pelo menos parcialmente verificam os dados obtidos dos experimentos de microdisposição.

EXEMPLO 12

Caracterização Imuno-histoquímica de Fenótipos Celulares

Os fenótipos de células encontrados dentro do cordão umbilical humano foram analisados por imuno-histoquímica.

O tecido de cordão umbilical humano foi colhido e fixado por i10 mersão em 4% (p/v) de paraformaldeído durante a noite a 4°C. A imunohistoquímica foi realizada usando anticorpos direcionados contra os seguintes epítopos (vide, Tabela 12-1): vimentina (1:500; Sigma, St. Louis, MO), desmina (1:150, aumentado contra coelho; Sigma; ou 1:300, aumentado contra camundongo; Chemicon, Temecula, CA), alfa-actina de músculo liso ·· 15 (SMA; 1 :400; Sigma), citoqueratina 18 (CKI 8; 1:400; Sigma), Fator de von Willebrand (vWF; 1:200; Sigma), e CD34 (Casse III de CD34 humano; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, CA). Além disso, os seguintes marcadores foram testados: GROalfa-PE anti-humano (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 anti-humano (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz,

CA), receptor 1 de LDL oxidado anti-humano (ox-LDL Rl; 1:100; Santa Cruz Biotech), e NOGO-A anti-humano (1:100; Santa Cruz Biotech). Os espécimes fixos foram aparados com um bisturi e colocados em composto embebido com OCT (Tissue- Tek OCT; Sakura, Torrance, CA) em um banho de gelo seco contendo etanol. Os blocos congelados foram em seguida seccio25 nados (10 microns de espessura) usando um criostato padrão (Leica Microsystems) e montados em lâminas de vidro para o manchamento.

A imuno-histoquímica foi realizada similar aos estudos prévios, (por exemplo, Messina etal., Exper. Neurol, 2003; 184: 816-829). As seções de tecido foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de proteína contendo PBS, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, CA), e 0,3% (v/v) de Triton (Triton X100; Sigma) durante 1 hora para acessar os antígenos intracelulares. Em

62/71 casos onde o epítopo de interesse seria localizado na superfície da célula (CD34, ox-LDL RI), triton foi omitido em todas as etapas do procedimento para prevenir a perda de epítopo. Além disso, em casos onde o anticorpo primário foi aumentado contra cabra (GCP-2, ox-LDL RI, NOGO-A), 3% (v/v) 5 de soro de asno foi usado no lugar de soro de cabra em todo o procedimento. Os anticorpos primários, diluídos em solução de bloqueio, foram em seguida aplicados às seções, durante um período de 4 horas em temperatura ambiente. As soluções de anticorpo primário foram removidas, e as culturas lavadas com PBS antes da aplicação de soluções de anticorpo secundário (1 10 hora em temperatura ambiente) contendo bloco junto com exas Red de IgGT anti-camundongo de cabra (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR) e/ou IgG-Alexa 488 anticoelho de cabra (1:250; Molecular Probes) ou IgG-FITC anticabra de asno (1:150; Santa Cruz Biotech). As culturas foram lavadas, e 10 micromolares de DAPI (Molecular Probes) foram aplicados durante 10 .· 15 minutos para visualizar os núcleos da célula.

Depois do imunomanchamento, a fluorescência foi visualizada usando um filtro de fluorescência apropriado em um microscópio epifluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). O manchamento positivo foi representado pelo sinal de fluorescência acima do manchamento de con20 trole. As imagens representativas foram capturadas usando uma videocâmera colorida digital e software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para amostras triplamente manchadas, cada imagem foi tomada usando somente um filtro de emissão de cada vez. As montagens em camadas foram então preparadas usando software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, 25 CA).

Tabela 12-1: Sumário de Anticorpos Primários Usados

Anticorpo	Concentração	Vendedor
Vimentina	1:500	Sigma, St. Louis, MO
Desmina (rb)	1:150	Sigma
Desmina (m)	1:300	Chemicon, Temecula, CA
alfa-actina de músculo liso (SMA)	1:400	Sigma

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Anticorpo	Concentração	Vendedor
Citoqueratina 18 (CK18)	1:400	Sigma
fator de von Willebrand (vWF)	1:200	Sigma
CD34 III	1:100	DakoCytomation, Carpinteria, CA
GROalfa-PE	1:100	BD, Franklin Lakes, NJ
GCP-2	1:100	Santa Cruz Biotech
Οχ-LDL R1	1:100	Santa Cruz Biotech
NOGO-A	1:100	Santa Cruz Biotech

Os marcadores de vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF e

CD34 foram expressos em um subgrupo das células encontradas no cordão umbilical (dados não mostrados). Em particular, as expressões de vWF e CD34 foram restritas aos vasos sanguíneos contidos no cordão. As células CD34+ ficaram na camada mais interna (lado do lúmen). A expressão de vimentina foi encontrada em toda a matriz e vasos sanguíneos do cordão. SMA foi limitado à matriz e paredes externas da artéria & veia, porém não contido nos vasos sozinhos. CK18 e desmina foram observados nos vasos sozinhos, desmina sendo restrita às camadas do meio e externas.

Vimentina, desmina, alfa-actina de músculo liso, citoqueratina 18, Fator de von Willebrand e CD 34 são expressos em células dentro do cordão umbilical humano. Com base nos estudos de caracterização in vitro mostrando que somente vimentina e alfa-actina de músculo liso são expressos, os dados sugerem que o processo atual de isolamento de célula derivada do cordão umbilical colhe uma subpopulação de células ou que as células isoladas mudam a expressão de marcadores para expressar vimentina e alfa-actina de músculo liso.

EXEMPLO 13

Secreção de Fatores Tróficos

A secreção de fatores tróficos selecionados de células derivadas do umbigo foi medida. Os fatores foram selecionados, os quais têm atividade angiogênica, por exemplo, fator de crescimento de hepatócito (HGF) (Rosen et al., Ciba Found. Symp., 1997; 212:215-26); proteína 1 quimiotática de

64/71 monócito (MCP-1) (Salcedo et al., (2000) Blood 96;34-40); interleucina-8 (IL8) (Li et al. (2003) J. Immunol. 170:3369-76); fator de crescimento de ceratinócito (KGF); fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Hughes et al., Ann. Thorac. Surg.

2004; 77:812-8); inibidor 1 de tecido de metaloproteinase de matriz (TIMP1);

angiopoietina 2 (ANG2); fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFbb); trombopoietina (TPO); fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB- EGF); fator 1 alfa derivado de estromal (SDF-I alfa), atividade neurotrófica/neuroprotetora (fator neurotrófico derivado de cérebro 10 (BDNF) (Cheng et al., Dev. BioL, 2003; 258;319-33); interleucina-6 (IL-6);

proteína-2 quimiotática de granulócito (GCP-2); fator beta2 de cultura transformador (TGFbeta2)); ou atividade de quimiocina (proteína 1 alfa inflamatória de macrófago (MIP1 alfa); proteína 1 beta inflamatória de macrófago (MlPlbeta); quimioatraente-1 de monócito (MCP-1); Rantes (regulado na .· 15 ativação, célula T normal expressa ou secretada); 1309; quimiocina regulada por ativação e timo (TARC); Eotaxina; quimiocina derivada de macrófago (MDC), (IL-8).

As células derivadas de cordão umbilical, bem como fibroblastos humanos derivados de prepúcio humano neonatal, foram cultivadas em meio 20 de cultura em frascos T75 revestidos com gelatina. As células foram crioconservadas na passagem 11 e armazenadas em nitrogênio líquido. Após o descongelamento, o meio de cultura foi adicionado às células, seguido por transferência para um tubo centrífugo de 15 mililitros e centrifugação das células em 150 x g durante 5 minutos. O pélete de célula foi ressuspenso em 25 4 mililitros de meio de cultura, e as células foram contadas. As células foram semeadas em 5.000 células/cm² em frascos T75 cada contendo 15 mililitros de meio de cultura, e cultivadas durante 24 horas. O meio foi mudado para um meio livre de soro (baixo teor de glicose de DMEM (Gibco), 0,1% (p/v) de albumina de soro bovino (Sigma), penicilina (50 Unidades/mililitro) e estrep30 tomicina (50 microgramas/mililitro, Gibco)) durante 8 horas. O meio livre de soro condicionado foi coletado no final da incubação por centrifugação em 14.000 x g durante 5 minutos e armazenado a -20°C.

65/71

Para estimar o número de células em cada frasco, as células foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) e desprendidas usando 2 mililitros de tripsina/EDTA (Gibco). A atividade de tripsina foi inibida pela adição de 8 mililitros de meio de cultura. As células foram centri5 fugadas em 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido, e as células foram ressuspensas em 1 mililitro de Meio de cultura. O número de célula foi estimado com um hemocitômetro.

As células foram cultivadas a 37°C em 5% de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico. A quantidade de MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1 alfa , 10 GCP-2 , IL-8 e TGF-beta2 produzidos por cada amostra de célula foi determinada por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Mn.). Todos os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Os valores apresentados são picogramas por mililitro por milhão de células (n=2, sem).

As quimiocinas (MIP1 alfa, MlPIbeta, MCP-1, Rantes, 1309, .· 15 TARC, Eotaxin, MDC, IL8), BDNF, e fatores angiogênicos (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGFbb, TPO, HB-EGF foram medidos usando Disposições Searchlight Proteome (Pierce Biotechnology Inc.). As disposições de proteoma são ELISAs sanduíches multiplexados para a medição quantitativa de duas a dezesseis proteínas por poço. As disposições são produzidas manchando-se um padrão de 2 x 2, 3 x 3, ou 4 x 4 de quatro a dezesseis anticorpos de captura diferentes em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida a um procedimento ELISA sanduíche, a placa total é imageada para capturar o sinal quimioluminescente gerado em cada ponto em cada poço da placa. O sinal gerado em cada ponto é proporcional à quantidade de proteína alvo na amostra ou padrão original.

MCP-1 e IL-6 foram secretados por PPDCs derivados de umbigo e fibroblastos dérmicos (Tabela 13-1). SDF-lalfa e GCP-2 foram secretados por fibroblastos. GCP-2 e IL-8 foram secretados por PPDCs derivados de umbigo. TGF-beta2 não foi detectado de qualquer tipo de célula por ELISA.

66/71

Tabela 13-1: Resultados de ELISA: Detecção de Fatores Tróficos

	MCP-1	IL-6	VEGF	SDF1α	GCP-2	IL-8	TGFbeta2
Fibroblasto	17+1	61+3	29+2	19+1	21+1	ND	ND
Umbilical (022803)	1150+74	4234+289	ND	ND	160+11	2058+145	ND
Umbilical (071003)	2794+84	1356+43	ND	ND	2184+98	2369+23	ND

Código: ND: Não Detectado, =/sem

Ensaio ELISA Multiplexado Searchlight. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIPIbeta, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC e

IL-8 foram secretados a partir de células (Tabelas 13-2 e 13-3). Nenhum Ang2, VEGF ou PDGFbb foi detectado.

Tabela 13-2: Resultados do ensaio ELISA Multiplexado Searchlight

	TIMP1	ANG2	PDGFbb	TPO	KGF	HGF	FGF	VEGF	HBEGF	BDNF
hFB	19306,3	ND	ND	230,5	5,0	ND	ND	27,9	1,3	ND
U1	57718,4	ND	ND	1240,0	5,8	559,3	148,7	ND	9,3	165,7
U3	21850,0	ND	ND	1134,5	9,0	195,6	30,8	ND	5,4	388,6

Código: hFB (fibroblastos humanos), U1 (derivado do umbigo (022803)), U3 (derivado do umbigo (071003)).

ND: Não Detectado.

Tabela 13-3: Resultados do ensaio ELISA Multiplexado Searchlight

	MIP1a	MIP1b	MCP1	RANTES	I309	TARC	Eotaxin	MDC	IL8
hFB	ND	ND	39,6	ND	ND	0,1	ND	ND	204,9
U1	ND	8,0	1694,2	ND	22,4	37,6	ND	18,9	51930,1
U3	ND	5,2	2018,7	41,5	11,6	21,4	ND	4,8	10515,9

Código: hFB (fibroblastos humanos), U1 (derivado do umbigo (022803)), U3 (PPDC derivado do umbigo (071003)).

ND: Não Detectado.

As células derivadas do umbigo segregaram vários fatores tróficos. Alguns destes fatores tróficos, tais como HGF, bFGF, MCP-1 e IL-8, desempenham papéis importantes na angiogênese. Outros fatores tróficos, tais como BDNF e IL-6, têm fatores importantes na proteção ou regeneração

67/71 neural.

EXEMPLO 14

Imunologia In vitro

Linhagens celulares do cordão umbilical foram avaliadas in vitro quanto às suas características imunológicas em um esforço para prognosticar a resposta imunológica, se houver, estas células eliciariam no transplante in vivo. Linhagens celulares do cordão umbilical foram avaliadas por citometria de fluxo para a expressão de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86 e B7-H2. Estas proteínas são expressas por células de apresentação 10 de antígeno (APC) e são requeridas para a estimulação direta de células CD4⁺ T que não receberam tratamento (Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5^a Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171). As linhagens celulares também foram analisadas por citometria de fluxo para a expressão de HLA-G (Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MO15 LECULAR IMMUNOLOGY, 5^a Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171);

CD 178 (Coumans etal., Journal of Immunological Methods 224: 185-196); e PD-L2 (Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5^a Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171; Brown et al. (2003) The Journal of Immunology 170: 1257-1266). A expressão destas proteínas por célula 20 que residem nos tecidos placentários acredita-se que mediam o estado imunopriviligiado de tecidos placentários in utero. Para prognosticar a extensão a qual as linhagens celulares derivadas de umbigo eliciaram uma resposta imune in vivo, as linhagens celulares foram testadas em uma reação de linfócito mista unidirecional (MLR).

As células foram cultivadas em meio de cultura (DMEM com baixo teor de glicose 15% (v/v) de soro bovino fetal (FBS); (Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) de betamercaptoetanol (Sigma, St., Louis, MO), 50 Unidades/mililitro de penicilina, 50 microgramas/mililitro de estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA)) até confluente em frascos T75 (Corning, Corning, NY) reves30 tidos com 2% de gelatina (Sigma, St., Louis, MO).

As células foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) e separadas com Tripsina/EDTA (Gibco,

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Carlsbad, MO). As células foram colhidas, centrifugadas e ressuspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS em uma concentração de célula de 1x10⁷ por mililitro. Anticorpo (Tabela 14-1) foi adicionado a cem microlitros de suspensão celular de acordo com as especificações do fabricante e incubado no escuro 5 durante 30 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com

PBS e centrifugadas para remover o anticorpo não ligado. As células foram ressuspensas em 500 microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo usando um instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Tabela 14-1: Anticorpos

Anticorpo	Fabricante	Número do Catálogo
HLA-DRDPDQ	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555558
CD80	BD Pharmingen (San Diego, CA)	557227
CD86	BD Pharmingen (San Diego, CA)	555665
B7-H2	BD Pharmingen (San Diego, CA)	552502
HLA-G	Abeam (Cambridgeshire, UK)	ab 7904-100
CD 178	Santa Cruz (San Cruz, CA)	sc-19681
PD-L2	BD Pharmingen (San Diego, CA)	557846
Camundongo lgG2a	Sigma (St. Louis, MO)	F-6522
Camundongo lgG1 kappa	Sigma (St. Louis, MO)	P-4685

Frasconetes crioconservados de passagem 10 rotulados como linhagem celular A foram enviados em gelo seco para CTBR (Senneville, Quebec) para conduzir uma reação de linfócito mista usando CTBR SOP no. CAC-031. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram coletadas de múltiplos doadores voluntários masculinos e femininos. PBMC alo15 gênica estimuladora (doadora), PBMC autóloga e linhagens celulares, foram tratadas com mitomicina C. Células estimuladoras tratadas com mitomicina C e autólogas foram adicionadas às PBMCs respondedoras (receptoras) e

69/71 cultivadas durante 4 dias. Depois da incubação, [³H]timidina foi adicionada a cada amostra e cultivada durante 18 horas. Após a colheita das células, o DNA radiorrotulado foi extraído, e a incorporação de [³H]-timidina foi medida usando um contador de cintilação.

O índice de estimulação para o doador alogênico (SIAD) foi calculado como a proliferação média do receptor mais doador alogênico tratado com mitomicina C dividido pela proliferação de referência do receptor. O índice de estimulação das células derivadas do cordão umbilical foi calculado como a proliferação média do receptor mais linhagem celular tratada com mitomicina C dividido pela proliferação de referência do receptor.

Seis doadores de sangue voluntários humanos foram avaliados para identificar um único doador alogênico que exibirá uma resposta à proliferação forte em uma reação de linfócito mista com os outros cinco doadores de sangue. Este doador foi selecionado como o doador de controle positivo alogênico. Os cinco doadores de sangue restantes foram selecionados como receptores. As linhagens celulares derivadas do cordão umbilical e de doador de controle positivo alogênico foram tratadas com mitomicina C e cultivadas em uma reação de linfócito mista com os cinco receptores alogênicos individuais. As reações foram realizadas em triplicata usando duas placas de cultura de célula com três receptores por placa (Tabela 14-2). O índice de estimulação médio variou de 6,5 (placa 1) para 9 (placa 2) e os controles positivos de doador alogênico variaram de 42,75 (placa 1) para 70 (placa 2) (Tabela 14-3).

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Tabela 14-2: Dados de Reação de Linfócito Mista - Linhagem Celular A (Cordão Umbilical)

DPM para Ensaio de Proliferação

Placa ID: Placa 1

Número Analítico	Sistema de Cultura	Replica ções 1 2 3		Média	SD	CV
IM04-2478	Referência de proliferação do receptor Controle de autoestimulação (células autólogas tratadas com Mitomicina C) Doador alogênico de MLR IM04-2477 (tratado com Mitomicina C) MLR com linhagem celular (Célula tratada com mitomicina C tipo A)	1074 406 391 672 510 1402 43777 48391 38231 2914 5622 6109		623.7 861,3 43466,3 4881.7	390,07 475,19 5087,12 1721,36	62,5 55.2 11.7 35.3
SI (Doador) SI (Linhagem celular			70 8
IM04-2479	Referência de proliferação do receptor Controle de autoestlmulação (células autólogas tratadas com Mitomicina C) Doador alogênico de MLR 1M04-2477 (tratado com Mitomicina C) MLR com linhagem celular (Célula tratada com mitomicina C tipo A)	530 508 527 701 567 1111 25593 24732 22707 5086 3932 1497		521,7 793,0 24344,0 3505,0	11,93 283,43 1481,61 1832,21	2.3 35,7 6.1 52.3
SI (Doador) SI (Linhagem celular			47 7
IM04-2480	Referência de proliferação do receptor Controle de autoestimulação (células autólogas tratadas com Mitomicina C) Doador alogênico de MLR IM04-2477 (tratado com Mitomicina C) MLR com linhagem celular (Célula tratada com mitomicina C tipo A)	1192 854 1330 2963 993 2197 25416 29721 23757 2596 5076 3426		1125.3 2051,0 26298,0 3699.3	244,90 993,08 3078,27 1262,39	21,8 48,4 11.7 34,1
SI (Doador) SI (Linhagem celular			23 3
IM04-2481	Referência de proliferação do receptor Controle de autoestimulação (células autólogas tratadas com Mitomicina C) Doador alogênico de MLR IMO4-2477 (tratado com Mitomicina C) MLR com linhagem celular (Célula tratada com mitomicina C tipo A)	695 451 555 738 1252 464 13177 24885 15444 4495 3671 4674		567,0 818,0 17835,3 4280,0	122,44 400,04 6209,52 534,95	21,6 48,9 34,8 12,5
SI (Doador) SI (Linhagem celular			31 8

Tabela 14-3: índice de estimulação médio de células derivadas do cordão umbilical e um doador alogênico em uma reação de linfócito mista com cinco receptores alogênicos individuais.

	Recipiente	Cordão Umbilical
Placa 1 (receptores 1-4)	42,75	6,5
Placa 2 (receptor 5)	70	9

Histogramas de células derivadas de cordão umbilical analisadas por citometria de fluxo mostram a expressão negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86 e B7-H2, como notado por valor de fluorescência consis10 tente com o controle de IgG, indicando que as linhagens celulares derivadas de cordão umbilical necessitam das moléculas de superfície de célula exigidas para diretamente estimular as PBMCs alogênicas (por exemplo, células CD4⁺ T).

Histogramas de células derivadas de cordão umbilical analisa15 das por citometria de fluxo mostram a expressão negativa de PD-L2, como notado pelo valor aumentado de fluorescência relativa ao controle de IgG, e

71/71 expressão negativa de CD178 e HLA-G, como notado pelo valor de fluorescência consistente com o controle de IgG.

Nas reações de linfócito mistas conduzidas com linhagens celulares derivadas de cordão umbilical, o índice de estimulação médio variou de

6,5 para 9, enquanto aquele dos controles positivos alogênicos variaram de 42,75 para 70. Linhagens celulares derivadas de cordão umbilical foram negativas para a expressão das proteínas estimulantes HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86 e B7-H2, quando medidas por citometria de fluxo. Linhagens celulares derivadas de cordão umbilical foram negativas para a expressão das proteínas imunomoduladoras HLA-G e CD178 e positivas para a expressão de PD-L2, quando medidas por citometria de fluxo. PBMCs doadoras alogênicas continham células de apresentação de antígeno que expressam HLA-DP, DR, DQ, CD80, CD86 e B7-H2, desse modo permitindo a estimulação de PBMCs alogênicAs (células CD4⁺ T que não receberam tratamento). A ausência de moléculas de superfície celular de apresentação de antígeno em células derivadas do cordão umbilical requeridas para a estimulação direta de PBMCs alogênicas (por exemplo, células CD4⁺T que não receberam tratamento) e a presença de PD-L2, uma proteína imunomoduladora, pode responder ao baixo índice de estimulação exibido por estas células em uma MLR quando comparado aos controles alogênicos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar um meio condicionado, caracterizado pelo fato de que compreende:

semear uma célula derivada de tecido de cordão umbilical humano (UTC) em um meio de cultura de esfera de microveículo;

reduzir o teor de soro do meio de cultura em uma ou mais etapas incrementais;

transferir a UTC do meio de cultura com teor de soro reduzido para um meio basal livre de soro;

cultivar a UTC no meio basal livre de soro durante não mais de 24 horas; e isolar a UTC do meio basal livre de soro deixando um meio condicionado, em que as proteínas de soro no meio condicionado estão presentes em uma quantidade abaixo do limite detectável de SDS-PAGE e/ou Western blot.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio condicionado é filtrado.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio condicionado é concentrado.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o teor de soro é reduzido em incrementos de 5% a 60%.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o teor de soro é reduzido em incrementos de 50%.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a UTC cresce durante 1 a 3 passagens em cada incremento.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda preliminarmente cultivar a UTC em um meio de cultura padrão e isolar a UTC do meio de cultura padrão antes da semeadura.
8. Método para preparar um meio condicionado, caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer uma célula derivada de tecido de cordão umbilical

Petição 870190081194, de 21/08/2019, pág. 4/11

2/3 humano isolada (UTC) em um meio de cultura de esfera de microveículo;

reduzir o teor de soro do meio de cultura em uma ou mais etapas incrementais;

transferir a UTC do meio de cultura de teor de soro reduzido para um meio basal livre de soro quando o teor de soro atinge um nível predeterminado;

cultuvar a UTC no meio basal livre de soro durante não mais do que 24 horas; e isolar a UTC do meio basal livre de soro deixando um meio condicionado, em que as proteínas de soro no meio condicionado estão presentes em uma quantidade abaixo do limite detectável de SDS-PAGE e/ou Western blot.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda filtrar o meio condicionado.
10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda concentrar o meio condicionado.
11. Meio condicionado gerado por semeadura de uma célula derivada de tecido umbilical humano (UTC) em um meio de cultura de esfera de microveículo, caracterizado pelo fato de que o teor de soro do meio de cultura é reduzido em uma ou mais etapas incrementais antes da transferência da UTC do meio de cultura com teor de soro reduzido para um meio basal livre de soro, e em que a UTC é cultivada no meio basal livre de soro durante até 24 horas e então isolada do meio basal livre de soro deixando um meio condicionado, em que as proteínas de soro no meio condicionado estão presentes em uma quantidade abaixo do limite detectável de SDS-PAGE e/ou Western blot.
12. Meio condicionado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio condicionado é filtrado.
13. Meio condicionado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio condicionado é concentrado.
14. Meio condicionado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o teor de soro é reduzido em incrementos de

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5% a 60%.
15. Meio condicionado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o teor de soro é reduzido em incrementos de 50%.

5
16. Meio condicionado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a UTC cresce durante 1 a 3 passagens em cada incremento.
17. Meio condicionado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda preliminarmente cultivar a 10 UTC em um meio de cultura padrão e isolar a UTC do meio de cultura padrão antes da semeadura.