BRPI1008145B1 - Proteína de ligação de antígeno biespecífica, método para preparar uma proteína de ligação de antígeno biespecífica, micro-organismo transgênico, composição farmacêutica e uso da proteína de ligação de antígeno biespecífica - Google Patents

Abstract

proteínas de ligação de antígeno biespecíficas, método para preparar uma proteína de ligação de antígeno biespecífica, micro-organismo transgênico, composição farmacêutica, usos da proteína de ligação de antígeno biespecífica e método para o tratamento de um paciente a presente invenção se refere a proteínas de ligação de antígeno biespecífica, métodos para sua produção, composições farmacêuticas contendo os ditos anticorpos, e usos dos mesmos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a proteínas de ligação de antígeno biespecífica, métodos para sua produção, composições farmacêuticas contendo ditos anticorpos, e uso dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As proteínas modificadas, como anticorpos bi- ou multiespecíficos capazes de ligar dois ou mais antígenos são conhecidos na técnica. Tais proteínas de ligação multiespecíficas podem ser geradas com o uso de técnicas de fusão celular, conjugação química ou DNA recombinante.

[003] Uma ampla variedade de formatos de anticorpo multiespecífico recombinante foi desenvolvida no passado recente, por exemplo, anticorpos biespecíficos tetravalentes por fusão de, por exemplo, um formato de anticorpo IgC e domínios de cadeia única (vide, por exemplo, Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159 a 163; WO 2001/077342; e Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233 a 1234.

[004] Também vários outros novos formatos nos quais a estrutura de núcleo de anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) não é mais retida como dia-, tria- ou tetracorpos, minicorpos, vários formatos de cadeia única (scFv, Bis-scFv), que são capazes de ligar dois ou mais antígenos, foram desenvolvidos (Holliger, P., et. al., Nature Biotech 23 (2005) 1126 a 1136; Fischer, N., e Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3 a 14; Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65 a 74; Wu, C, et al., Nature Biotech 25 (2007) 1290 a 1297).

[005] Todos esses formatos utilizam ligadores ou para fundir o núcleo de anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) em uma proteína de ligação adicional (por exemplo, scFv) ou para fundir, por exemplo, dois fragmentos Fab ou scFv (Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3 a14). Embora seja evidente que os ligadores possuem vantagens para a modificação de anticorpos biespecíficos, os mesmos também podem causar problemas nos ajustes terapêuticos. De fato, estes peptídeos estranhos podem obter uma imunorresposta contra o próprio ligador ou a junção entre a proteína e o ligador. Mais adicionalmente, a natureza flexível destes peptídeos os torna mais inclinados à clivagem proteolítica, levando potencialmente a uma estabilidade menos satisfatória de anticorpo, agregação e imunogenicidade aumentada. Além disso, pode-se querer reter funções efetoras, como, por exemplo, citotoxidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC), que são mediadas através da parte Fc ao manter um alto grau de similaridade em anticorpos de ocorrência natural.

[006] Deste modo, de forma ideal, deve-se ajudar no desenvolvimento de anticorpos biespecíficos que são muito similares na estrutura geral aos anticorpos de ocorrência natural (como IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) com desvio mínimo de sequências humanas.

[007] Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos que são muito similares a anticorpos naturais foram produzidos com o uso da tecnologia quadroma (vide Milstein, C. e Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537 a 540) baseada na fusão somática de duas diferentes linhagens celulares de hibridoma e expressam anticorpos monoclonais de murino com as especificidades desejadas do anticorpo biespecífico. Devido ao emparelhamento aleatório de duas cadeias pesada e leve de anticorpo diferentes na linhagem celular de hibridoma híbrido resultante (ou quadroma), até dez espécies de anticorpo diferentes são geradas e das quais apenas uma é a desejada, o anticorpo biespecífico funcional. Devido à presença de subprodutos desemparelhados, e rendimentos de produção significantemente reduzidos, são necessários procedimentos de purificação de meio sofisticados (vide, por exemplo, Morrison, S. L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233 a 1234). Em geral, o mesmo problema de subprodutos desemparelhados permanece se forem usadas técnicas de expressão recombinante.

[008] Uma abordagem para evitar o problema de subprodutos desemparelhados, que é conhecido 'botões-nos-furos', ajuda a forçar o emparelhamento de duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes ao introduzir mutações no domínio CH3 a fim de modificar a interface de contato. Em uma cadeia, os aminoácidos volumosos foram substituídos por aminoácidos com cadeias laterais curtas a fim de criar um 'furo'. De maneira oposta, os aminoácidos com cadeias laterais longas foram introduzidos no outro domínio CH3, a fim de criar um 'botão'. Ao co-expressar estas duas cadeias pesadas (e duas cadeias leves idênticas, que devem ser apropriadas para ambas as cadeias pesadas), altos rendimentos de formação de heterodímero ('botão- furo') versus formação de homodímero ('furo-furo' ou 'botão-botão') foram observados (Ridgway, J. B., Protein Eng. 9 (1996) 617 a 621; e WO 96/027011). A porcentagem de heterodímero poderia ser adicionalmente aumentada ao remodelar as superfícies de interação dos dois domínios CH3 com o uso de uma abordagem de exibição de fago e da introdução de uma ponte de dissulfeto para estabilizar os heterodímeros (Merchant A. M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677 a 681; Atwell, S., et al., J. MoI. Biol. 270 (1997) 26 a 35). Novas abordagens para a tecnologia botões-em-furos são descritas, por exemplo, no documento EP 1870459A1. Embora este formato pareça muito atraente, nenhum dado descrevendo o progresso para a clínica está atualmente disponível. Uma restrição importante desta estratégia é que as cadeias leves de dois anticorpos parentais devem ser idênticas a fim de evitar o desemparelhamento e a formação de moléculas inativas. Deste modo, esta técnica não é apropriada para desenvolver facilmente anticorpos biespecíficos recombinantes contra dois antígenos começando de dois anticorpos contra o primeiro e o segundo antígeno, já que ambas as cadeias pesadas destes anticorpos e/ou as cadeias leves idênticas devem ser otimizadas.

[009] Outra abordagem para evitar o problema de subprodutos desemparelhados na preparação de anticorpos biespecíficos, é comutar de heterodímeros para homodímeros ao usar um anticorpo de extensão completa que especificamente se liga a um primeiro antígeno e que fundiu em seu N- terminal de cadeias pesadas dois fragmentos Fab fundidos que especificamente de ligam a um segundo antígeno conforme descrito, por exemplo, no documento WO2001/077342. Uma desvantagem importante desta estratégia é a formação de subprodutos inativos indesejados através do desemparelhamento das cadeias leves do anticorpo de extensão completa com os domínios CH1-VH dos fragmentos Fab e através do desemparelhamento das Cadeias leves do fragmento Fab com Domínios CH1-VH do anticorpo de extensão completa.

[010] O documento WO 2006/093794 refere-se a composições de ligação de proteína heterodimeroica. O documento WO 99/37791 descreve derivados de anticorpo com propósitos múltiplos. Morrison, S., L., et al the J. Immunolog, 160(1998) 2802 a 2808 se refere à influência da troca de domínio de região variável nas propriedades funcionais de IgG.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção compreende proteína de ligação de antígeno biespecífica, que compreende: (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que se ligam especificamente a um primeiro antígeno e compreendem dois fragmentos Fab; (b) dois fragmentos Fab adicionais de um anticorpo que se ligam especificamente a um segundo antígeno, em que ditos fragmentos Fab adicionais são ambos fundidos por meio de um conector de peptídeo ou no C- ou N-terminal das cadeias pesadas ou cadeias leves de (a); e em que as seguintes modificações são realizadas nos fragmentos Fab: (i) em ambos os fragmentos Fab de (a), ou em ambos os fragmentos Fab de (b), os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (ii) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (iii) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (iv) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, ou (v) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro. Uma realização adicional da presente invenção é um método para preparar uma proteína de ligação de antígeno, de acordo com a presente invenção que compreende as etapas de: (a) transformar uma célula hospedeira com -vetores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de ligação de antígeno biespecífica, de acordo com a presente invenção; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitam a síntese de dita molécula de anticorpo; e (c) recuperar dita molécula de anticorpo a partir de dita cultura. Uma realização adicional da presente invenção é uma célula hospedeira que compreende -vetores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de ligação de antígeno, de acordo com a presente invenção.

[012] Uma realização adicional da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno, de acordo com a presente invenção, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[013] Uma realização adicional da presente invenção é um método para o tratamento de um paciente que necessita de terapia, caracterizado pela administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção.

[014] De acordo com a presente invenção, a razão de uma proteína de ligação de antígeno biespecífica desejada comparada a produtos secundários indesejados pode ser aprimorada através da substituição de determinados domínios (a) no fragmento Fab do anticorpo de extensão completa que especificamente se liga ao primeiro antígeno e/ou (b) nos dois fragmentos Fab fundidos adicionais. Desta forma, o desemparelhamento indesejado das cadeias leves com os domínios CH1- VH errados pode ser reduzido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[015] A presente invenção compreende uma proteína de ligação de antígeno biespecífica, que compreende: (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo, que especificamente se ligam ao primeiro antígeno e compreendem dois fragmentos Fab; (b) dois fragmentos Fab adicionais de um anticorpo que se ligam especificamente ao segundo antígeno, em que os ditos fragmentos Fab adicionais são fundidos por meio de um conector de peptídeo ou ao C- ou N- terminal das cadeias pesadas de (a); e em que as seguintes modificações foram realizadas nos fragmentos Fab: (i) em ambos os fragmentos Fab de (a), ou em ambos os fragmentos Fab de (b), os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (ii) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (iii) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (iv) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, ou (v) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

[016] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que os ditos fragmentos Fab adicionais são fundidos através de um conector de peptídeo ou ao C-terminal das cadeias pesadas de (a), ou ao N-terminal das cadeias pesadas de (a).

[017] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que os ditos fragmentos Fab adicionais são fundidos através de um conector de peptídeo ou ao C-terminal das cadeias pesadas de (a).

[018] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que os ditos fragmentos Fab adicionais são fundidos através de um conector de peptídeo ao N-terminal das cadeias pesadas de (a).

[019] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que nos fragmentos Fab, as seguintes modificações são realizadas: (i) em ambos os fragmentos Fab de (a), ou em ambos os fragmentos Fab de (b), os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

[020] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que nos fragmentos Fab, as seguintes modificações são realizadas: (i) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

[021] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que nos fragmentos Fab, as seguintes modificações são realizadas: (i) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

[022] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que nos fragmentos Fab, as seguintes modificações são realizadas: (i) em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

[023] Em uma realização da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que nos fragmentos Fab, as seguintes modificações são realizadas: (i) em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

[024] De acordo com a presente invenção, a razão de uma proteína de ligação de antígeno biespecífica desejada comparada aos produtos secundários indesejados (devido ao desemparelhamento das cadeias leves com domínios CH1-VH fortes) pode ser reduzida através da substituição de determinados domínios (a) no fragmento Fab do anticorpo de extensão completa que especificamente se liga ao primeiro antígeno e/ou (b) nos dois fragmentos Fab fundidos adicionais. O desemparelhamento nesta conexão significa a associação (i) da cadeia leve do anticorpo de extensão completa sob (a) com domínios CH1-VH dos fragmentos Fab sob (b); ou (ii) da cadeia leve dos fragmentos Fab sob (b) com os domínios CH1-VH do anticorpo de extensão completa sob (a) (vide Figura 3) que leva a subprodutos inativos indesejados ou não completamente funcionais.

[025] O termo "anticorpo", para uso no presente documento, denota um anticorpo de extensão completa que consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo (vide Figura 1). Uma cadeia pesada de anticorpo de extensão completa é um polipeptídeo que consiste na direção N-terminal a C-terminal de um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio de cadeia pesada constante de anticorpo 1 (CH1), uma região de dobradiça de anticorpo (HR), um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo 2 (CH2), e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo 3 (CH3), abreviado como VH-CH 1-HR-CH2-CH3; e opcionalmente um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo 4 (CH4) no caso de um anticorpo da subclasse IgE. De preferência, a cadeia pesada do anticorpo de extensão completa é um polipeptídeo que consiste na direção N- terminal a C-terminal de VH, CH1, HR, CH2 e CH3. A cadeia leve de anticorpo de extensão completa é um polipeptídeo que consiste na direção N-terminal a C-terminal de um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL), abreviado como VL-CL. O domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) pode ser K (kappa) ou À (lambda). As cadeias de anticorpo são ligadas juntas através de ligações de dissulfeto de inter-polipeptídeo entre o domínio CL e o domínio CH1 (isto é, entre a cadeia leve e a pesada) e entre as regiões de dobradiça das cadeias pesadas de anticorpo de extensão completa. Os exemplos de anticorpos de extensão completa típicos são anticorpos naturais como IgG (por exemplo, IgG 1 e IgG2), IgM, IgA, IgD, e IgE.) Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser de uma única espécie, por exemplo, humano, ou podem ser anticorpos quimerizados ou humanizados. Os anticorpos de extensão completa de acordo com a presente invenção compreendem dois sítios de ligação de antígeno cada um formado por um par de VH e VL, que especificamente se ligam ao mesmo (primeiro) antígeno. O C-terminal da cadeia leve ou pesada do dito anticorpo de extensão completa denota o último aminoácido no C-terminal da dita cadeia leve ou pesada. O dito anticorpo compreende dois fragmentos Fab idênticos que consistem no domínio CH1 e VH da cadeia pesada e no domínio CL e VL da cadeia leve, (vide Figura 1 e 2).

[026] Um "fragmento Fab adicional" (vide Figura 2) de um anticorpo que especificamente se liga a um segundo antígeno se refere a um fragmento Fab adicional que consiste no domínio CH1 e VH da cadeia pesada e no domínio CL e VL da cadeia leve do dito segundo anticorpo. Os fragmentos Fab adicionais são fundidos em sua forma não modificada (vide Figura 3) através da parte da cadeia pesada (ou domínio CH1 ou VH) para o C- ou N- terminal das cadeias pesadas ou cadeias leves do anticorpo que se ligam especificamente a um primeiro antígeno.

[027] O termo "conector de peptídeo", para uso na presente invenção, denota um peptídeo com sequências de aminoácido, que são, de preferência, de origem sintética. Estes conectores de peptídeo de acordo com a presente invenção são usados para fundir os peptídeos de ligação de antígeno ao C- ou N-terminal das cadeias de anticorpo de extensão completa e/ou de extensão completa modificada para formar uma proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção. De preferência, os ditos conectores de peptídeo abaixo c) são peptídeos com uma sequência de aminoácido com uma extensão de pelo menos 5 aminoácidos, de preferência com uma extensão de 5 a 100, mais preferencialmente de 10 a 50 aminoácidos. Em uma realização, o dito conector de peptídeo é (GxS)n ou (GxS)nGm com G = glicina, S = serina, e (x = 3, n= 3, 4, 5 ou 6, e m= 0, 1, 2 ou 3) ou (x = 4,n= 2, 3, 4 ou 5 e m= 0, 1, 2 ou 3), de preferência x = 4 e n= 2 ou 3, mais preferencialmente com x = 4, n= 2. Em uma realização, o dito conector de peptídeo é (G4S)2.

[028] Os termos "sítio de ligação" ou "sítio de ligação de antígeno", para uso no presente documento, denota(m) a(s) região(s) de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção a qual um ligando (por exemplo, o antígeno ou fragmento de antígeno disto) realmente se liga e deriva de uma molécula de anticorpo ou um fragmento disto (por exemplo, um fragmento Fab). O sítio de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreende domínios variáveis de cadeia pesada de anticorpo (VH) e domínios variáveis de cadeia leve de anticorpo (VL).

[029] Os sítios de ligação de antígeno (isto é, os pares de VH/VL) que especificamente se ligam ao antígeno desejado podem derivar (a) de anticorpos conhecidos em relação ao antígeno ou (b) de novos anticorpos ou fragmentos de anticorpo obtidos através de novos métodos de imunização com o uso, a propósito, da proteína de antígeno ou ácido nucleico ou fragmentos disto ou através de exibição de fago.

[030] Um sítio de ligação de antígeno de uma proteína de ligação de antígeno da presente invenção contém seis regiões de determinação complementares (CDRs) que contribuem, em graus variantes, para a afinidade do sítio de ligação para antígeno. Há três CDRs de domínio variável de cadeia pesada (CDRH1, CDRH2 e CDRH3) e três CDRs de domínio variável de cadeia leve (CDRL1, CDRL2 e CDRL3). A extensão de CDR e regiões de arcabouço (FRs) são determinadas através de comparação a um banco de dados compilado de sequências de aminoácido no qual estas regiões foram definidas de acordo com a variabilidade dentre as sequências.

[031] A especificidade de anticorpo refere-se a reconhecimento seletivo do anticorpo ou proteína de ligação de antígeno para um epítopo particular de um antígeno. Os anticorpos naturais, por exemplo, são monoespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm duas especificidades de ligação de antígeno diferentes. Onde um anticorpo tem mais de uma especificidade, os epítopos reconhecidos podem estar associados a um único antígeno ou com mais que um antígeno.

[032] O termo anticorpo "monoespecífico" ou proteína de ligação de antígeno, para uso no presente documento, denota um anticorpo ou proteína de ligação de antígeno que tem um ou mais sítios de ligação sendo que cada um se liga ao mesmo epítopo do mesmo antígeno.

[033] O termo "valente", para uso no pedido atual, denota a presença de um número específico de sítios de ligação em uma molécula de anticorpo. Um anticorpo natural, por exemplo, ou um anticorpo de extensão completa de acordo com a presente invenção tem dois sítios de ligação e é bivalente. O termo "tetravalente" denota a presença de quatro sítios de ligação em uma proteína de ligação de antígeno. O termo "tetravalente biespecífico", para uso no presente documento, denota proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção que tem quatro sítios de ligação de antígeno dos quais dois se ligam a outro antígeno (ou outro epítopo do antígeno). As proteínas de ligação de antígeno da presente invenção têm quatro sítios de ligação e são tetravalentes.

[034] Os anticorpos de extensão completa da presente invenção compreendem regiões constantes de imunoglobulina de uma ou mais classes de imunoglobulina. As classes de imunoglobulina incluem isótopos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE e, no caso de IgG e IgA, seus subtipos. Em uma realização preferencial, um anticorpo de extensão completa da presente invenção tem uma estrutura de domínio constante de um anticorpo do tipo IgG.

[035] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", para uso no presente documento, se referem a uma preparação de moléculas de anticorpo ou anticorpo ou proteína de ligação de antígeno de uma única composição de aminoácido.

[036] O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo que compreende uma região variável, isto é, região de ligação, de uma fonte ou espécie e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte diferente ou espécie, usualmente preparada através de técnicas de DNA recombinante. Os anticorpos quiméricos que compreendem uma região variável de murino e uma região constante humana são preferenciais. Outras formas preferencias de "anticorpos quiméricos" abrangidas pela presente invenção são aquelas nas quais a região constante foi modificada ou mudada daquela do anticorpo original a fim de gerar as propriedades de acordo com a presente invenção, especialmente em relação à ligação de CIq e/ou ligação de receptor Fc (FcR). Tais anticorpos quiméricos também são denominados como "anticorpos de classe comutada". Os anticorpos quiméricos são o produto de genes de imunoglobulina expressos que compreende segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de imunoglobulina e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos envolvem técnicas de DNA recombinante e de transfecção de gene são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, S., L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851 a 6855; U.S. 5.202.238 e U.S. 5204.244.

[037] O termo "anticorpo humanizado" se refere a anticorpos nos quais o arcabouço ou "regiões de determinação complementares" (CDR) foram modificadas para compreender o CDR de uma imunoglobulina de diferente especificidade conforme comparado ao da imunoglobulina parental. Em uma realização preferencial, um CDR de murino é enxertado na região de arcabouço de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado." Vide, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323 a 327; e Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268 a 270. Os CDRs particularmente preferenciais correspondem àqueles que representam as sequências que reconhecem os antígenos registrados acima para anticorpos quiméricos. Outras formas de "anticorpos humanizados" abrangidas pela presente invenção são aquelas nas quais a região constante foi adicionalmente modificada ou mudada daquela do anticorpo original a fim de gerar as propriedades de acordo com a presente invenção, especialmente em relação à ligação de CIq e/ou ligação de receptor Fc (FcR).

[038] O termo "anticorpo humano", para uso no presente documento, se destina a incluir anticorpos que têm regiões constantes e variáveis derivadas de sequências de imunogloblina de linhagem de germe humano. Os anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M.A., e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368 a 374). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. A transferência do arranjo de gene de imunoglobulina de linhagem de germe humano em tais camundongos mutantes de linhagem de germe resultará na produção de anticorpos humanos mediante estímulo de antígeno (vide, por exemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551 a 2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255 a 258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33 a 40). OS anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom, H. R., e Winter, G., J. MoI. Biol. 227 (1992) 381 a 388; Marks, J.D., et al., J. MoI. Biol. 222 (1991) 581 a 597). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos humanos monoclonais (Cole, S., P., C, et al., Monoclonal Antibodies e Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) 77 a 96; e Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86 a 95). Conforme já mencionado para anticorpo quiméricos e humanizados, de acordo com a presente invenção, o termo "anticorpo humano", para uso no presente documento, também compreende tais anticorpos que são modificados na região constante a fim de gerar as propriedades de acordo com a presente invenção, especialmente em relação à ligação CIq e/ou ligação FcR, por exemplo, por "comutação de classe", isto é, mudança ou mutação de partes de Fc (por exemplo, de IgGl em IgG4 e/ou mutação IgGl/IgG4.)

[039] O termo "anticorpo humano recombinante", para uso no presente documento, se destina a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como anticorpos isolados de uma célula hospedeira como a NSO ou célula CHO ou de um animal (por exemplo, um rato) que é transgênico para genes imunoglobulina humana ou anticorpos expressos com o uso de um vetor de expressão recombinante transfectado para uma célula hospedeira. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões constantes e variáveis em uma forma reorganizada. Os anticorpos humanos recombinantes, de acordo com a presente invenção, foram submetidos à hipermutação somática in vivo. Deste modo, as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas a sequências VH e VL de linhagem de germe humano, não podem existir naturalmente no repertório de linhagem de germe humano de anticorpo in vivo.

[040] O "domínio variável" (domínio variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH), para uso no presente documento, denota cada um dentre os pares de cadeias pesadas e leves que está envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios de cadeias pesadas e leves humanas variáveis têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de arcabouço (FR) cujas sequências estão amplamente conservadas, conectadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões de determinação complementares, CDRs). As regiões de arcabouço adotam uma conformação β-folha e as CDRs podem formar laços que conectam a estrutura β-folha. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões de arcabouço e formam juntas com as CDRs de outra cadeia o sítio de ligação de antígeno. As regiões CDR3 de cadeia leve e pesada de anticorpo têm uma função particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a presente invenção e, portanto, fornecem um objeto adicional da presente invenção.

[041] Os termos "região hipervariável" ou "porção de ligação de antígeno de um anticorpo" quando usados no presente documento se referem a resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido das "regiões de determinação complementares" ou "CDRs". Regiões de "arcabouço" ou "FR" são aquelas regiões de domínio variável que não os resíduos de região hipervariável conforme definido no presente documento. Portanto, as cadeias leves e pesadas de um anticorpo compreende de N- a C- terminal, os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. CDRs em cada cadeia são separadas por tais aminoácidos de arcabouço. Especialmente, CDR3 da cadeia pesada é a região que contribui mais para a ligação de antígeno. As regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[042] Para uso no presente documento, o termo "ligação" ou "ligação específica" se refere à ligação do anticorpo a um epítopo do antígeno em um ensaio in vitro, de preferência, em um ensaio de ressonância de plásmon (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suécia) com antígeno de tipo selvagem purificado. A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (taxa constante para a associação do anticorpo (ou anticorpo ou proteína de ligação de antígeno) do complexo de anticorpo/antígeno), kD (constante de dissociação), e KD (ko/ka). Ligação ou ligação específica significa uma afinidade de ligação (KD) de 10-8 mol/l ou menos, de preferência 10-9 M a 1013 mol/l. Deste modo, uma proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é ligada especificamente a cada antígeno para o qual há uma afinidade específica (KD) de 10-8 mol/l ou menos, de preferência 10-9 M a 10-13 mol/l.

[043] A ligação do anticorpo ao FCYRIII pode ser investigada por um ensaio BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suécia). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante da taxa para a associação do anticorpo do complexo anticorpo/antígeno), ko (constante da dissociação), e KD (kD/ka).

[044] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Em determinadas realizações, o determinante de epítopo inclui agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas como aminoácidos, cadeia laterais de açúcar, fosforil, ou sulfonil, e, em determinadas realizações, pode ter características estruturais tridimensionais, e ou características de carga específica. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo.

[045] Em determinadas realizações, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando o mesmo reconhece, de preferência, seu antígeno alvo em uma mistura de complexo de proteínas e/ou macromoléculas.

[046] Em uma realização adicional, a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo de extensão completa é de classe de IgG1 humano, ou de subclasse IgG1 humano com as mutações L234A e L235A.

[047] Em uma realização adicional, a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo de extensão completa é de subclasse IgG2 humano.

[048] Em uma realização adicional, a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo de extensão completa é de subclasse IgG3 humano.

[049] Em uma realização adicional, a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo de extensão completa é de subclasse IgG4 humano ou, de subclasse IgG4 humano com a mutação S228P adicional.

[050] De preferência, a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo de extensão completa é de subclasse IgG1 humano, de subclasse IgG4 humano com a mutação S228P adicional.

[051] Verificou-se, agora, que as proteínas de ligação de antígeno biespecíficas de acordo com a presente invenção apresentam características melhoradas como atividade biológica ou farmacológica, propriedades famacocinéticas ou toxicidade. As mesmas podem ser usadas, por exemplo, para o tratamento de doenças como câncer.

[052] O termo "região constante" para uso no pedido atual denota a soma dos domínios de um anticorpo que não a região variável. A região constante não está envolvida diretamente na ligação de um antígeno, mas exibe várias funções efetoras. Dependendo da sequência de aminoácido da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversas dentre as mesmas podem ser divididas em subclasses, como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de anticorpos são denominadas α, δ, ε, Y e μ, respectivamente. As regiões constantes de cadeia leve (CL) que podem ser encontradas em todos as cinco classes de anticorpo são denominadas K (kappa) e À (lambda).

[053] O termo "região constante derivado de origem humana" para uso no pedido atual denota uma região constante cadeia pesada de um anticorpo humano da subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 e/ou uma constante região de cadeia leve kappa ou lambda. Tais regiões constantes são bem conhecidas no estado da técnica e, por exemplo, descritas por Kabat, E. A., (vide, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214 a 218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785 a 2788).

[054] Embora os anticorpos da subclasse IgG4 mostrem ligação de receptor Fc (FcyRIIIa), os anticorpos de outras subclasses IgG mostram forte ligação. No entanto, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (perda de carboidrato Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, e His435 são resíduos que, se forem alterados, também fornecem ligação de receptor Fc reduzida (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591 a 6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115 a 119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319 a 324; EP 0 307 434).

[055] Em uma realização, uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção tem uma ligação de FcR reduzida comparada a um anticorpo IgG1 e o anticorpo parental de extensão completa é em relação à ligação de FcR da subclasse IgG4 ou da subclasse IgG1 ou IgG2 com uma mutação em S228, L234, L235 e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Em uma realização as mutações no anticorpo parental de extensão completa são S228P, L234A, L235A, L235E e/ou PVA236. Em outra realização, as mutações no anticorpo parental de extensão completa estão em IgG4 S228P e em IgG1 L234A e L235A.

[056] A região constante de um anticorpo está diretamente envolvida em ADCC (citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo) e CDC (citotoxidade dependente de complemento). A ativação complementar (CDC) é iniciada pela ligação do fator complementar CIq à região constante da maioria das subclasses de anticorpos IgG. A ligação de CIq a um anticorpo é causada por interações proteína-proteína definidas no assim chamado sítio de ligação. Tais sítios de ligação de região constante são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, por Lukas, TJ., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2.555 a 2.560; Brunhouse, R. e Cebra, J., J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907 a 917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338 a 344; Thommesen, J., E., et al., MoI. Immunol. 37 (2000) 995 a 1004; Idusogie, E., E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4.178 a 4.184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12.161 a 12.168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319 a 324; e EP 0 307 434. Tais sítios de ligação de região constante são, por exemplo, caracterizados pelos aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com índice EU de Kabat).

[057] O termo "citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC)" refere-se à lise das células alvo humanas por uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção na presença de células efetoras. A ADCC é medida preferivelmente pelo tratamento de uma preparação de células que expressam antígeno com uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção na presença de células efetoras tais como PBMC recém-isoladas ou células efetoras purificadas de camadas de células brancas, como monócitos ou células exterminadoras naturais (NK) ou uma linhagem celular NK de crescimento permanente.

[058] O termo "citotoxidade dependente de complemento (CDC)" denota um processo iniciado pela ligação de fator complementar CIq à parte Fc da maioria das subclasses de anticorpos IgG. A ligação de CIq a um anticorpo é causada por interações proteína-proteína definidas no assim chamado sítio de ligação. Tais sítios de ligação de parte Fc são conhecidos no estado da técnica (consulte acima). Tais sítios de ligação de parte Fc são, por exemplo, caracterizados pelos aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com índice EU de Kabat). Os anticorpos da subclasse IgG1, IgG2 e IgG3 usualmente mostram ativação de complemento incluindo CIq e ligação C3, apesar de que IgG4 não ativa o sistema complementar e não liga CIq e/ou C3.

[059] As funções efetoras mediadas por célula de anticorpos monoclonais podem ser acentuadas por modificação de seu componente oligossacarídeo como descrito em Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176 a 180, e US 6.602,684. Os anticorpos tipo IgG1, os anticorpos terapêuticos mais comumente utilizados, são glicoproteínas que têm um sítio de glicosilação ligado a N conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacarídeos biantenários complexos anexados a Asn297 são enterrados entre os domínios CH2, que formam contatos extensos com cadeia principal de polipeptídeo, e sua presença é essencial para o anticorpo mediar as funções efetoras tais como citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (Lifely, M., R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813 a 822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59 a 76; Wright, A., e Morrison, S., L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26 a 32). Umana, P., et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176 a 180 e WO 99/54342 mostraram que a superexpressão em células de ovário de hamster chinês (CHO) de β(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III ("GnTIII"), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de oligossacarídeos bifurcados, aumenta significantemente a atividade de ADCC in vitro de anticorpos. As alterações na composição do carboidrato Asn297 ou sua eliminação afetam também a ligação a FCYR e CIq (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176 a 180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45.539 a 45.547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16.478 a 16.483; Shields, R., L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6.591 a 6.604; Shields, R., L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26.733 a 26.740; Simmons, L., C, et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133 a 147).

[060] Métodos para atenuar as funções efetoras mediadas por célula de anticorpos monoclonais são relatados, por exemplo, em WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/1 14700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739.

[061] Em uma realização preferida da presente invenção, a proteína de ligação de antígeno biespecífica é glicosilada (se a mesma compreende uma parte Fc da subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, preferivelmente da subclasse IgG1 ou IgG3) com uma cadeia de açúcar em Asn297 de acordo com o qual a quantidade de fucose dentro da cadeia de açúcar é igual a 65% ou menor (numeração de acordo com Kabat). Em outra realização é a quantidade de fucose dentro da cadeia de açúcar que está entre 5% e 65%, preferivelmente entre 20% e 40%. O "Asn297" de acordo com a presente invenção significa aminoácido asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc. Com base em variações de sequência de anticorpos menores, o Asn297 pode ser localizado em alguns aminoácidos (usualmente não mais do que ±3 aminoácidos) a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre a posição 294 e 300. Em uma realização a proteína glicosilada de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção a subclasse IgG é da subclasse IgG1 humana, da subclasse IgG1 humana com as mutações L234A e L235A ou da subclasse IgG3. Em uma realização adicional, a quantidade de ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) é igual a 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose de N-terminal é igual a 1 % ou menos dentro da cadeia de açúcar. A cadeia de açúcar mostra preferivelmente as características de glicanos ligados a N anexado a Asn297 de um anticorpo expressado de modo recombinante em uma célula CHO.

[062] O termo "as cadeias de açúcar mostram características de glicanos ligados a N anexados a Asn297 de um anticorpo expressado de modo recombinante em uma célula CHO" denota que a cadeia de açúcar em Asn297 do anticorpo parental de extensão completa de acordo com a presente invenção tem a mesma estrutura e sequência de resíduo de açúcar exceto pelo resíduo de fucose como aqueles do mesmo anticorpo expressado nas células CHO não modificadas, por exemplo, como aqueles relatados em WO 2006/103100.

[063] O termo "NGNA" como utilizado dentro deste pedido denota o ácido N-glicolilneuramínico de resíduo de açúcar.

[064] A glicosilação de IgG1 ou IgG3 humano ocorre em Asn297 como glicosilação de oligossacarídeo complexo biantenário fucosilado de núcleo terminado com até dois resíduos Gal. As regiões de cadeia pesada constante humana da subclasse IgG1 ou IgG3 são relatadas em detalhe por Kabat, E., A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), e por Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1.351 a 1.361; Love, T., W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515 a 527. Estas estruturas são designadas como resíduos de glicanos G0, G1 (α-1,6- ou α -1,3-), ou G2, dependendo da quantidade de resíduos Gal terminais (Raju, T., S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44 a 53). A glicosilação do tipo CHO de partes Fc de anticorpos é, por exemplo, descrita por Routier, F., H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201 a 207. Os anticorpos os quais são expressos de modo recombinante em células hospedeiras de CHO não glicomodificadas usualmente são fucosiladas em Asn297 em uma quantidade de pelo menos 85%. Os oligossacarídeos modificados do anticorpo parental de extensão completa podem ser híbridos ou complexos. Preferivelmente os oligossacarídeos bifurcados, reduzidos/não fucosilados são híbridos. Em outra realização, os oligossacarídeos bifurcados, reduzidos/não fucosilados são complexos.

[065] De acordo com a presente invenção, "quantidade de fucose" significa a quantidade do dito açúcar dentro da cadeia de açúcar em Asn297, relacionada à soma de todas as glicoestruturas anexadas em Asn297 (por exemplo, estruturas de manose alta, híbrida e complexa) medida por espectrometria de massa MALDI-TOF e calculada como valor médio. A quantidade relativa de fucose é a porcentagem de estruturas que contêm fucose relacionada a todas as glicoestruturas identificadas em uma amostra tratada de N-Glicosidase F (por exemplo, estruturas de manose elevadas e oligo-estruturas e complexas, híbridas, respectivamente) por MALDI-TOF.

[066] A proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção é produzida por meio recombinante. Assim, um aspecto da presente invenção é um ácido nucleico que codifica a proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção e um aspecto adicional é uma célula que compreende o dito ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção. Métodos para produção recombinante são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem a expressão de proteína em células procarióticas e eucarióticas com isolação subsequente da proteína de ligação de antígeno e usualmente purificação a uma pureza aceitável farmaceuticamente. Para a expressão dos anticorpos como previamente mencionado em uma célula hospedeira, sendo que os ácidos nucleicos codificam as respectivas cadeias leves e pesadas modificadas são inseridos nos vetores de expressão por métodos padrão. A expressão é realizada em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levedura, ou células E.coli, e a proteína de ligação de antígeno é recoberta a partir das células (sobrenadante ou células após a lise). Os métodos gerais para produção recombinante de anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, nos artigos de revisão de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183 a 202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271 a 282; Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16 (2000) 151 a 160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870 a 880.

[067] As proteínas de ligação de antígeno biespecíficas de acordo com a presente invenção são separadas adequadamente do meio de cultura por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em fase de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. DNA ou RNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais. As células hibridoma podem servir como uma fonte de tal DNA e RNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser inserido nos vetores de expressão, os quais são depois transfectados para as células hospedeiras tais como células HEK 293, células CHO, ou células do mieloma que não produzem de outra forma a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

[068] As variantes (ou mutantes) de sequência de aminoácido da proteína de ligação de antígeno biespecífica são preparadas mediante a introdução de alterações de nucleotídeo apropriadas no DNA da proteína de ligação de antígeno, ou mediante a síntese de nucleotídeo. Tais modificações podem ser realizadas, entretanto, apenas em uma faixa muito limitada, por exemplo, como descrito acima. Por exemplo, as modificações não alteram as características do anticorpo mencionadas acima tais como o isótopo IgG e ligação de antígeno, mas podem melhorar o rendimento da produção recombinante, a estabilidade da proteína ou facilitar a purificação.

[069] O termo "célula hospedeira", como utilizado no presente pedido, denota qualquer tipo de sistema celular o qual possa ser modificado para gerar os anticorpos de acordo com a presente invenção. Em uma realização, as células HEK293 e células CHO são utilizadas como células hospedeiras. Como utilizado no presente documento, as expressões "célula," "linhagem celular" e "cultura celular" são utilizadas de modo passível de mudança e todas as tais designações incluem progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária em questão e culturas derivadas a partir deste ponto sem levar em conta o número de transferências. Entende-se também que toda progênie pode não ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie variante que tem a mesma função ou atividade biológica como triado na célula originalmente transformada é incluída.

[070] A expressão em células NSO é descrita por, por exemplo, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109 a 123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261 a 270. A expressão transiente é descrita por, por exemplo, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. A clonagem de domínios variáveis é descrita por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3.833 a 3.837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4.285 a 4.289; e Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77 a 87. Um sistema de expressão transiente preferido (HEK 293) é descrito por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71 a 83 e por Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191 a 199.

[071] As sequências de controle que são adequadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, acentuadores e sinais de poliadenilação.

[072] Um ácido nucleico é "ligado de modo operacional" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para um líder secretor ou pré-sequência é ligado de modo operacional ao DNA por um polipeptídeo se o mesmo é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou acentuador é ligado de modo operacional a uma sequência de codificação se a mesma afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo é ligado de modo operacional a uma sequência de codificação se a mesma é posicionada para facilitar a tradução. Geralmente, "ligado de modo operacional" significa que as sequências de DNA que são ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguo e no quadro de leitura. Entretanto, os acentuadores não têm que ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligadores são utilizados de acordo com a prática convencional.

[073] A purificação de anticorpos é realizada a fim de eliminar os componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outras proteínas ou ácidos nucleicos celulares, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandeamento CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose, e outros bem conhecidos na técnica. Consulte Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, New York (1987). Diferentes métodos são bem estabelecidos e expandidos utilizados para a purificação de proteína, tais como cromatografia de afinidade com proteínas microbianas (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A ou proteína G), cromatografia de troca iônica (por exemplo, troca de cátion (resinas de carboximetila), troca de ânion (resinas de amino etila) e troca de modos misturados), adsorção tiofílica (por exemplo, com beta-mercaptoetanol e outros ligantes SH), interação hidrofóbica ou cromatografia de adsorção aromática (por exemplo, com resinas de fenil- sefarose, aza-arenofílica, ou ácido m-aminofenilborônico), cromatografia de afinidade de quelato de metal (por exemplo, com Ni(II)- e Cu(II)-material de afinidade), cromatografia de exclusão por tamanho e métodos eletroforéticos (tais como eletroforese em gel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93 a 102).

[074] Um aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção. Outro aspecto da presente invenção é o uso de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção para a fabricação de uma composição farmacêutica. Um aspecto adicional da presente invenção é um método para a fabricação de uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção. Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que contém uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção, formulada junto com um veículo farmacêutico.

[075] Outro aspecto da presente invenção é a dita composição farmacêutica para o tratamento de câncer.

[076] Outro aspecto da presente invenção é a proteína de ligação de antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção para o tratamento de câncer.

[077] Outro aspecto da presente invenção é o uso de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[078] Outro aspecto da presente invenção é um método de tratamento de um paciente que sofre de câncer mediante a administração de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção ao dito paciente com necessidade de tal tratamento.

[079] Como utilizado no presente documento, "veículo farmacêutico" inclui qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão).

[080] Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelos versados na técnica, a rota e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Para administrar um composto da presente invenção por determinadas rotas de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para prevenir sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo em um veículo apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Os diluentes aceitáveis farmaceuticamente incluem soluções tamponadas salinas e aquosas. Os veículos farmacêuticos incluem dispersões ou soluções aquosas estéreis e pós-estéreis para a preparação extemporânea de dispersão ou soluções injetáveis estéreis. O uso de tal meio e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

[081] As frases "administração parenteral" e "parenteralmente administrado", como utilizadas no presente documento, significam modos de administração diferente de administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção intraesternal, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e infusão.

[082] O termo câncer, como utilizado no presente documento, refere-se a doenças proliferativas, tais como linfomas, leucemias linfocíticas, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCL), câncer de pulmão de célula bronquíoloalveolar, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma intraocular ou cutâneo, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer do cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula suprarrenal, sarcoma do tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer de próstata, câncer da bexiga, câncer do rim ou uréter, carcinoma da célula renal, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer das vias biliares, neoplasmas do sistema nervoso central (CNS), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de epitélio escamoso, adenoma pituitário e sarcoma de Ewing, incluindo versões refratárias de qualquer um dos cânceres acima, ou uma combinação de um ou mais dos cânceres.

[083] Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser garantida tanto por procedimentos de esterilização, supra, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Em adição, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser produzida pela inclusão de agentes os quais atrasam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[084] Independentemente da rota de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hidratada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica.

[085] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados, de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem que sejam tóxicos ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade empregada das composições particulares da presente invenção, a rota de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular empregado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[086] A composição deve ser estéril e fluida na medida em que a composição é aplicável por seringa. Em adição à água, o veículo, preferencialmente, é uma solução salina tamponada isotônica.

[087] A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de revestimento como lecitina, manutenção do tamanho de partícula desejado no caso de dispersão e uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol ou sorbitol e cloreto de sódio na composição.

[088] Conforme usado no presente documento, as expressões "célula," "linhagem celular" e "cultura celular" são usadas de modo intercambiável e todas essas designações incluem progênie. Dessa forma, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária em questão e culturas derivadas da mesma sem levar em consideração o número de transferências. Também é entendido que toda a progênie não precisa ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie variante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme exibida na célula originalmente transformada é incluída. Estará evidente a partir do contexto onde designações distintas são pretendidas.

[089] O termo "transformação" conforme usado no presente documento se refere ao processo de transferência de vetores/ácido nucleico para uma célula hospedeira. Se células sem barreiras de parede celular formidáveis forem usadas como células hospedeiras, a transfecção é executada, por exemplo, pelo método de precipitação de fosfato de cálcio conforme descrito por Graham, F., L., e Van der Eb, A., J., Virology 52 (1973) 456 a 467. Entretanto, outros métodos para introduzir DNA em células como por injeção nuclear ou fusão de protoplastos também podem ser usados. Se células procarióticas ou células que contenham construções de parede celular substanciais forem usadas, por exemplo, um método de transfecção é o tratamento de cálcio com uso de cloreto de cálcio conforme descrito por Cohen, S., N., et al, PNAS. 69 (1972) 2110 a 2114.

[090] Conforme usado no presente documento, "expressão" se refere ao processo através do qual um ácido nucleico é transcrito em mRNA e/ou ao processo através do qual o mRNA transcrito (também denominado como transcrito) é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Os transcritos e os polipeptídeos codificados são denominados coletivamente como produto de gene. Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão em uma célula eucariótica pode incluir a junção do mRNA.

[091] Um "vetor" é uma molécula de ácido nucleico, em particular, de auto-replicação, que transfere uma molécula de ácido nucleico inserida para e/ou entre células hospedeiras. O termo inclui vetores que funcionam primeiramente para a inserção de DNA ou RNA em uma célula (por exemplo, integração cromossomal), replicação de vetores que funcionam primeiramente para a replicação de DNA ou RNA e vetores de expressão que funcionam para a transcrição e/ou tradução do DNA ou RNA. Também são incluídos vetores que fornecem mais de uma dentre as funções conforme descritas.

[092] Um "vetor de expressão" é um polinucleotídeo que, quando introduzido em uma célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido em um polipeptídeo. Um "sistema de expressão" se refere usualmente a uma célula hospedeira adequada composta por um vetor de expressão que pode funcionar para produzir um produto de expressão desejado.

[093] Os exemplos, listagem de sequência e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, sendo que o escopo real da mesma é apresentado nas reivindicações em anexo. É entendido que as modificações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da presente invenção.

DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[094] SEQ ID NO:1 cadeia pesada não modificada <Ang-2> com domínios VH-CL <VEGF> fundidos de C-terminal de fragmento Fab modificado (troca CH1-CL)

[095] SEQ iD NO:2 domínios VL-CH1 <VEGF> de fragmento Fab modificado (troca CH1-CL)

[096] SEQ iD NO:3 cadeia leve não modificada <Ang-2>

[097] SEQ iD NO:4 cadeia pesada não modificada <Ang-2> com domínios VH-CL <VEGF> fundidos de N-terminal de fragmento Fab modificado (troca CH1-CL)

[098] SEQ iD NO:5 cadeia pesada modificada <VEGF> (troca CH1-CL) com domínios VH-CH1 <Ang-2> fundidos de C-terminal de fragmento Fab não modificado

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[099] Figura 1 Estrutura esquemática de um anticorpo de extensão completa sem domínio CH4 que se liga especificamente a um primeiro antígeno 1 com dois pares de cadeia pesada e leve que compreende domínios variáveis e constantes em uma ordem típica.

[0100] Figuras 2a e 2b Estrutura esquemática de fragmentos Fab não modificados típicos que se ligam especificamente a um segundo antígeno 2 com o conector de peptídeo ou no C-terminal (Figura 2a) ou N-terminal (Figura 2b) da cadeia CH1-VH.

[0101] Figura 3 Estrutura esquemática de um anticorpo de extensão completa que se liga especificamente a um primeiro antígeno 1 que foi fundido ao N-terminal de seus dois fragmentos Fab não modificados de cadeia pesada que se ligam especificamente a um segundo antígeno 2 (Fig 3a) e aos produtos secundários indesejados devido ao malpareamento (Fig 3b e Fig 3c).

[0102] Figuras 4a, 4b e 4c Estrutura esquemática de proteínas de ligação de antígeno biespecíficas, de acordo com a presente invenção, em que o malpareamento é reduzido pela substituição de determinados domínios a) no fragmento Fab do anticorpo de extensão completa que se liga especificamente a um primeiro antígeno 1 e/ou b) nos dois anticorpos de fragmentos Fab fundidos adicionais que se ligam especificamente a um segundo antígeno 2. A Figura 4a mostra proteínas de ligação de antígeno biespecíficas. As Figuras 4b e 4c mostram toda a combinação de trocas de domínio VH/VL e/ou CH1 /CL dentro dos fragmentos Fab de extensão completa e dos fragmentos Fab adicionais que levam às proteínas de ligação de antígeno biespecíficas, de acordo com a presente invenção, com malpareamento reduzido.

[0103] Figura 5 Estrutura esquemática de proteínas de ligação de antígeno biespecíficas, de acordo com a presente invenção, que reconhecem Ang-2 e VEGF (Exemplo 1).

[0104] Figura 6 Estrutura esquemática de proteínas de ligação de antígeno biespecíficas, de acordo com a presente invenção, que reconhecem Ang-2 e VEGF (Exemplo 2).

[0105] Figura 7 Estrutura esquemática de proteínas de ligação de antígeno biespecíficas, de acordo com a presente invenção, que reconhecem Ang-2 e VEGF (Exemplo 3). EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS

[0106] Informações gerais relacionadas às sequências nucleotídicas de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas humanas são dadas em: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA (1991). Os aminoácidos de cadeias de anticorpo são numerados e comentados de acordo com a numeração EU (Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78 a 85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA (1991)). TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[0107] Os métodos padrão são usados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EUA, 1989. Os reagentes biológicos moleculares são usados de acordo com as instruções do fabricante. SÍNTESE DE GENE

[0108] Os segmentos de gene desejados são preparados a partir de oligonucleotídeos produzidos por síntese química. Os segmentos de gene, que são flanqueados por sítios de clivagem de endonuclease com restrição singular, são unidos por recozimento e ligação de oligonucleotídeos incluindo amplificação por PCR e, subsequentemente, clonados por meio dos sítios de restrição indicados, por exemplo, Kpnl/Sad ou Ascl/Pacl em um vetor de clonagem Pga4 baseado em pPCRScript (Stratagene). As sequências de DNA dos fragmentos de gene subclonado são confirmadas através do sequenciamento de DNA. Os fragmentos de síntese de gene são ordenados de acordo com as especificações dadas em Geneart (Regensburg, Alemanha). DETERMINAÇÃO DE SEQUÊNCIA DE DNA

[0109] As sequências de DNA são determinadas por sequenciamento de filamento duplo desempenhado em MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemanha) ou Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemanha). ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA E DNA E GERENCIAMENTO DE DADOS DE SEQUÊNCIA

[0110] O pacote de software de GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EUA) versão 10.2 e suite Infomax's Vector NTl Advance versão 8.0 são usados para criação de sequências, mapeamento, análise, anotações e ilustração. VETORES DE EXPRESSÃO

[0111] Para a expressão das variantes de anticorpos tetravalentes biespecíficos descritas de plasmídeos de expressão para expressão transiente (por exemplo, em HEK293 EBNA ou HEK293-F), células baseadas em uma organização de cDNA com ou sem um promotor CMV-Intron A ou em uma organização genômica com um promotor CMV promoter são aplicadas.

[0112] Além do cassete de expressão de anticorpo, os vetores contêm: - uma origem de replicação que permite a replicação desse plasmídeo em E. coli e - um gene de β-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli. A unidade de transcrição do gene de anticorpo é composta dos elementos a seguir: - sítio(s) de restrição única na extremidade 5' - o promotor ou acentuador de resposta imediata do citomegalovírus humano, - seguido pela sequência Intron A no caso da organização de cDNA, - uma região não traduzida 5' de um gene de anticorpo humano, - uma sequência de sinal de cadeia pesada de imunoglobulina, - a cadeia de anticorpo tetravalente biespecífico humano (do tipo selvagem ou com troca de domínio) ou como cDNA ou como organização genômica com a organização éxon-íntron de imunoglobulina, - uma região não traduzida 3' com uma sequência de sinal de poliadenilação, e - sítio(s) de restrição única na extremidade 3'.

[0113] Os genes de fusão que compreendem as cadeias do anticorpo descrito conforme descritas abaixo são gerados por PCR e/ou síntese de gene e unidos com técnicas e métodos recombinantes conhecidos por conexão dos segmentos de ácido nucleico, por exemplo, usando sítios de restrição única nos vetores respectivos. As sequências de ácido nucleico subclonado são verificadas por sequenciamento de DNA. Para transfecções transientes, quantidades maiores dos plasmídeos são preparadas por preparação de plasmídeo a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel). TÉCNICAS DE CULTURA CELULAR

[0114] As técnicas de cultura celular padrão são usadas conforme descrito em Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J. B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc..

[0115] Os anticorpos tetravalentes biespecíficos são expressos por co-transfecção transiente dos três plasmídeos de expressão respectivos em células HEK29-F que crescem em suspensão e HEK293-EBNA que crescem de forma aderente conforme descrito abaixo. TRANSFECÇÕES TRANSIENTES EM SISTEMA HEK293-EBNA

[0116] Os anticorpos tetravalentes biespecíficos são expressos por co-transfecção transiente dos três plasmídeos de expressão respectivos (por exemplo, codificando a cadeia pesada modificada, bem como a cadeia leve correspondente e cadeia leve modificada) em células HEK293-EBNA que crescem de forma aderente (linhagem celular 293 de rim embriônico humano que expressa antígeno nuclear do vírus Epstein-Barr; número de depósito de coleta de cultura do tipo americana ATCC n° CRL-10852, Lote 959 218) cultivadas em DMEM (meio Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementadas com 10% de FCS (soro fetal de vitelo, Gibco) de IgG Ultra Baixo, 2 mM de L-Glutamina (Gibco) e 250 μg/ml de Geneticina (Gibco). Para a transfecção, o reagente de transfecção FuGENE™ 6 (Roche Molecular Biochemicals) é usado em uma razão entre o reagente FuGENE™ (μl) e o DNA (μg) de 4:1 (na faixa de 3:1 a 6:1). As proteínas são expressas a partir dos plasmídeos respectivos usando uma razão molar entre plasmídeos que codificam cadeia pesada modificada e cadeia leve (modificada e do tipo selvagem) de 1:1:1 (equimolar) na faixa de 1:1:2 a 2:2:1, respectivamente. As células são alimentadas no dia 3 com 4 mM de L-Glutamina, Glicose [Sigma] e NAA [Gibco]. Os sobrenadantes de cultura celular contendo anticorpo tetravalente biespecífico são colhidos do dia 5 a 11 após a transfecção por centrifugação e armazenados a -20 °C. As informações gerais relativas à expressão recombinante de imunoglobulinas humanas em, por exemplo, células HEK293 são dadas em: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197 a 203. TRANSFECÇÕES TRANSIENTES EM SISTEMA HEK293-F

[0117] Alternativamente, anticorpos tetravalentes biespecíficos são gerados por transfecção transiente dos plasmídeos respectivos (por exemplo, que codificam a cadeia pesada modificada, bem como a cadeia leve correspondente e cadeia leve modificada) usando o sistema HEK293-F (Invitrogen) de acordo com a instrução do fabricante. Brevemente, as células HEK293-F (Invitrogen) que crescem em suspensão em um frasco agitado ou em um fermentador agitado em meio de expressão FreeStyle 293 de soro livre (Invitrogen) são transfectadas com uma mistura dos três plasmídeos de expressão conforme descrito acima e fectina 293 ou fectina (Invitrogen). Para um frasco de agitação de 2 l (Corning), as células HEK293-F são semeadas em uma densidade de 1,0E*6 células/ml em 600 ml e incubadas a 120 rpm, 8% de CO2. No dia seguinte, as células são transfectadas em uma densidade celular de ca. 1,5E*6 células/ml com mistura de ca. 42 ml de A) 20 ml de Opti-MEM (Invitrogen) com 600 μg de DNA de plasmídeo total (1 μg/ml) que codifica a cadeia pesada modificada, a cadeia leve correspondente e a cadeia leve modificada correspondente em uma razão equimolar e B) 20 ml de Opti-MEM + 1,2 ml de fectina 293 ou fectina (2 μl/ml). De acordo com o consumo de glicose, a solução de glicose é adicionada durante o curso da fermentação. O sobrenadante que contém o anticorpo secretado é colhido após 5 a 10 dias e os anticorpos são diretamente purificados a partir do sobrenadante ou o sobrenadante é congelado e armazenado. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA

[0118] A concentração de proteína de anticorpos tetravalentes biespecíficos purificados e derivados é determinada pela determinação da densidade óptica (OD) a 280 nm, usando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácido de acordo com Pace, C, N., et al., Protein Science 4 (1995) 2411 a 1423. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO EM SOBRENADANTES

[0119] A concentração de anticorpos tetravalentes biespecíficos em sobrenadantes de cultura celular é estimada por imunoprecipitação com esferas de Proteína A Agarose (Roche). 60 μl de esferas de Proteína A Agarose foram lavadas três vezes em TBS-NP40 (50 mM de Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de Nonidet-P40). Subsequentemente, 1 a 15 ml de sobrenadante de cultura celular são aplicados às esferas de Proteína A Agarose pré-equilibradas em TBS-NP40. Após a incubação por 1 h em temperatura ambiente, as esferas são lavadas em uma coluna de filtro Ultrafree-MC (Amicon] uma vez com 0,5 ml de TBS-NP40, duas vezes com 0,5 ml de salina tamponada com fosfato 2x (2xPBS, Roche) e, brevemente, quatro vezes com 0,5 ml de citrato de Na a 100 mM pH 5,0. O anticorpo aglutinado é eluído pela adição de 35 μl de tampão de amostra NuPAGE®LDS (Invitrogen). Metade da amostra é combinada com Agente de Redução de Amostra NuPAGE® ou mantida sem redução, respectivamente, e aquecida por 10 min a 70 °C. Consequentemente, 5 a 30 μl são aplicados em um NuPAGE®Bis-Tris SDS-PAGE de 4 a 12% (Invitrogen) (com tampão de MOPS para SDS-PAGE não reduzido e tampão MES com Antioxidante NuPAGE® que executa aditivo de tampão (Invitrogen) para SDS-PAGE reduzido) e manchados com Azul de Coomassie.

[0120] A concentração de anticorpos tetravalentes biespecíficos em sobrenadantes de cultura celular é quantitativamente medida por cromatografia de HPLC de afinidade. Brevemente, os sobrenadantes de cultura celular que contêm anticorpos e derivados que se ligam à Proteína A são aplicados a uma coluna de Applied Biosystems Poros A/20 em 200 mM de KH2PO4, 100 mM de citrato de sódio, pH 7,4 e eluídos a partir da matriz com 200 mM de NaCl, 100 mM de ácido cítrico, pH 2,5 em um sistema Agilent HPLC 1100. A proteína eluída é quantificada por absorvância de UV e integração de áreas de pico. Um anticorpo IgGI padrão purificado serviu como um padrão.

[0121] Alternativamente, a concentração de anticorpos tetravalentes biespecíficos em sobrenadantes de cultura celular é medida por ELISA IgGI de sanduíche. Brevemente, as placas de microtitulação de 96 cavidades de Estrepatavidina A de Alta Ligação com StreptaWell (Roche) são revestidas com 100 μl/cavidade de molécula F(ab')2<h-FcY> BI (Dianova) de captura de IgG anti-humano biotinilado em 0,1 μg/ml por 1 h à temperatura ambiente ou, alternativamente, de um dia para outro a 4 °C e, subsequentemente, lavadas três vezes com 200 μl/cavidade de PBS, 0,05% de Tween (PBST, Sigma). 100 μl/cavidade de uma série de diluição em PBS (Sigma) dos sobrenadantes de cultura celular que contêm anticorpo respectivo são adicionados às cavidades e incubados por 1 a 2 h em um agitador de placa de microtitulação à temperatura ambiente. As cavidades são lavadas três vezes com 200 μl/cavidade de PBST e o anticorpo aglutinado é detectado com 100 μl de F(ab')2<hFcY>POD (Dianova) a 0,1 μg/ml como anticorpo d detecção por 1 a 2 h em um agitador de placa de microtitulação à temperatura ambiente. O anticorpo de detecção não aglutinado é lavado três vezes com 200 μl/cavidade de PBST e o anticorpo de detecção aglutinado é detectado pela adição de 100 μl de ABTS/cavidade. A determinação de absorvância é realizada em um espectrômetro de flúor Tecan em um comprimento de onda de medição de 405 nm (comprimento de onda de referência 492 de nm). PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

[0122] As proteínas são purificadas a partir de sobrenadantes de cultura celular filtrados com referência a protocolos padrão. Em resumo, os anticorpos tetravalentes biespecíficos são aplicados a uma coluna de Proteína A Sefarose (GE healthcare) e lavados com PBS. A eluição de anticorpos tetravalentes biespecíficos é alcançada em pH 2,8, seguida por neutralização imediata da amostra. A proteína agregada é separada de anticorpos monomélicos por cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em PBS ou em 20 mM de Histidina, 150 mM de NaCl pH 6,0. As frações monomélicas são agruconcentradas, se for desejado, com o uso de, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), congeladas e armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Parte das amostras é fornecida para caracterização analítica e analíticos de proteína subsequentes, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão de tamanho ou espectrometria de massa. SDS-PAGE

[0123] O sistema NuP AGE®Pre-Cast gel (Invitrogen) é usado de acordo com a instrução do fabricante. Em particular, 10% ou 4 a 12% de géis NuP AGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) e um NuPAGE® MES (géis reduzidos, com aditivo de tampão que executa NuPAGE® Antioxidant) ou tampão que executa MOPS (géis não reduzidos) é usado. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHO ANALÍTICA

[0124] A cromatografia de exclusão de tamanho para a determinação da agregação e estado oligomérico de anticorpos tetravalentes biespecíficos é realizada por cromatografia de HPLC. Brevemente, os anticorpos purificados de Proteína A são aplicados a uma coluna Tosoh TSKgel G3000SW em 300 mM de NaCl, 50 mM de KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 em um sistema Agilent HPLC 1100 ou em uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) em 2x PBS em um sistema Dionex HPLC. A proteína eluída é quantificada por absorvância de UV e integração de áreas de pico. O padrão de filtração de gel BioRad 151- 1901 serviu como um padrão. ESPECTROMETRIA DE MASSA

[0125] A massa deglicosilada total dos anticorpos tetravalentes biespecíficos é determinada e confirmada por meio de espectrometria de massa de ionização por eletroaspersão (ESI-MS). Brevemente, 100 μg de anticorpos purificados são deglicosilados com 50 mU de N-Glicosidase F (PNGaseF, ProZyme) em 100 mM de KH2PO4/K2HPO4, pH 7 a 37 °C por 12 a 24 h em uma concentração de proteína de até 2 mg/ml e, subsequentemente, dessalgados por meio de HPLC em uma coluna de Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa da cadeia leve, pesada modificada respectiva e cadeia leve modificada é determinada por ESI-MS após deglicosilação e redução. Em resumo, 50 μg de anticorpo tetravalente biespecífico em 115 μl são incubados com 60 μl de TCEP a 1M e 50 μl de cloridrato de Guanidina a 8 M, subsequentemente dessalgados. A massa total e a massa das cadeias leve e pesada reduzidas são determinadas por meio de ESI-MS em um sistema Q- Star Elite MS equipado com uma fonte NanoMate. ELISA DE LIGAÇÃO DE VEGF

[0126] As propriedades de ligação dos anticorpos tetravalentes biespecíficos são avaliadas em um ensaio ELISA com proteína VEGF165-His de extensão completa (Sistemas R&D). Para esse propósito, placas de microtitulação acentuadas com poliestireno límpido Falcon são revestidas com 100 μl de 2 μg/ml de VEGF 165 humano recombinante (Sistemas R&D) em PBS por 2 h à temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 °C. As cavidades são lavadas três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e bloqueadas com 200 μl de 2% de BSA, 0,1% de Tween 20 por 30 min à temperatura ambiente e, subsequentemente, lavadas três vezes com 300μl de PBST. 100 μl/cavidade de uma série de diluições dos anticorpos tetravalentes biespecíficos purificados em PBS (Sigma) são adicionados às cavidades e incubados por 1 h em um agitador de placa de microtitulação à temperatura ambiente. As cavidades são lavadas três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e o anticorpo aglutinado é detectado com 100 μl/cavidade de 0,1 μg/ml de F(ab') <hFcY>POD (pesquisa Immuno) em 2% de BSA, 0,1% de Tween 20 como anticorpo de detecção por 1 h em um agitador de placa de microtitulação à temperatura ambiente. O anticorpo de detecção não aglutinado é lavado três vezes com 300 μl/cavidade de PBST e o anticorpo de detecção aglutinado é detectado por adição de 100 μl de ABTS/cavidade. A determinação de absorvância é realizada em um espectrômetro de flúor Tecan em um comprimento de onda de medição de 405 nm (comprimento de onda de referência de 492 nm). LIGAÇÃO DE VEGF: CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA DE LIGAÇÃO DE VEGF A 37 °C POR RESSONÂNCIA DE PLÁSMON DE SUPERFÍCIE (BIACORE)

[0127] Com a finalidade de corroborar ainda mais com as conclusões de ELISA, a ligação dos anticorpos tetravalentes biespecíficos ao VEGF é quantitativamente analisada com o uso da tecnologia de ressonância de plásmon de superfície em um instrumento T100 Biacore de acordo com o protocolo a seguir e analisada com o uso de pacote do software T100: Brevemente, os anticorpos tetravalentes biespecíficos são capturados em um chip CM5 por meio da ligação com um IgG anti-humano de cabra (JIR 109-005098). O anticorpo de captura é imobilizado por acoplamento de amino com o uso de acoplamento de amino padrão conforme a seguir: o tampão HBS-N serviu como tampão de execução, a ativação é feita por mistura de EDC/NHS com o objetivo de uma densidade de ligante de 700 RU. O anticorpo de captura é diluído em tampão de acoplamento NaAc, pH 5,0, c = 2 μg/ml, finalmente, ainda ativados, os grupos carboxila são bloqueados por injeção de etanolamina a 1 M. A captura de anticorpos <VEGF> tetravalentes biespecíficos é feita em um fluxo de 5 μl/min e c = 10 nM, diluído com tampão de execução + 1 mg/ml de BSA; um nível de captura de aproximadamente 30 RU deve ser atingido. O rhVEGF (rhVEGF, Sistemas R&D Cat.-N°, 293-VE) é usado como analito. A caracterização cinética de ligação de VEGF com anticorpos <VEGF> tetravalentes biespecíficos é realizada a 25 °C ou 37 °C em PBS + 0,005 % (v/v) de Tween20 como tampão de execução. A amostra é injetada com um fluxo de 50 μl/min e um tempo de associação de 80 s e um tempo de dissociação de 1.200 s com uma série de concentrações de rhVEGF de 300 a 0,29 nM. A regeneração da superfície de anticorpo de captura livre é realizada com 10 mM de Glicina, pH 1,5 e um tempo de contato de 60 s após cada ciclo de analito. As constantes cinéticas são calculadas com o uso do método de referência dupla usual (referência de controle: ligação de rhVEGF para capturar a molécula IgG anti-humano de cabra, vazios na célula de fluxo de medição, concentração "0" de rhVEGF, Modelo: ligação de Langmuir 1:1, (Rmax ajustado para o local devido à ligação de molécula de captura). ELISA DE LIGAÇÃO DE ANG-2

[0128] As propriedades de ligação dos anticorpos tetravalentes biespecíficos são avaliadas em um ensaio ELISA com proteína Ang-2-His de extensão completa (Sistemas R&D). Para esse propósito, placas de microtitulação acentuadas com poliestireno límpido Falcon são revestidas com 100 μl de 1 μg/ml de Ang-2 humano recombinante (Sistemas R&D, livre de veículo) em PBS por 2 h à temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 °C. As cavidades são lavadas três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e bloqueadas com 200 μl de 2% de BSA, 0,1% de Tween 20 por 30 min à temperatura ambiente e, subsequentemente, lavadas três vezes com 300μl de PBST. 100 μl/cavidade de uma série de diluições dos anticorpos tetravalentes biespecíficos purificados em PBS (Sigma) são adicionados às cavidades e incubados por 1 h em um agitador de placa de microtitulação à temperatura ambiente. As cavidades são lavadas três vezes com 300μl de PBST (0,2% de Tween 20) e o anticorpo aglutinado é detectado com 100 μl/cavidade de 0,1 μg/ml de F(ab') <hk>POD (Biozol Cat.N°. 206005) em 2% de BSA, 0,1% de Tween 20 como anticorpo de detecção por 1 h em um agitador de placa de microtitulação à temperatura ambiente. O anticorpo de detecção não aglutinado é lavado três vezes com 300 μl/cavidade de PBST e o anticorpo de detecção aglutinado é detectado por adição de 100 μl de ABTS/cavidade. A determinação de absorvância é realizada em um espectrômetro de flúor Tecan em um comprimento de onda de medição de 405 nm (comprimento de onda de referência de 492 nm). BIACORE DE LIGAÇÃO DE ANG-2

[0129] A ligação dos anticorpos tetravalentes biespecíficos ao Ang-2 humano é investigada por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento T100 BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Brevemente, para medições de afinidade, anticorpos policlonais <hIgG-FcY> de cabra são imobilizados em um chip CM5 por meio de acoplamento de amina para apresentação dos anticorpos tetravalentes biespecíficos contra Ang-2 humano. A ligação é medida em tampão HBS (HBS- P (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,005% de Tween 20, ph 7,4), 25 °C. O Ang-2-His purificado (sistemas R&D ou purificado localmente) é adicionado em várias concentrações em solução. A associação é medida por uma injeção de Ang-2 de 3 minutos; a dissociação é medida pela lavagem da superfície do chip com tampão HBS por 3 minutos e um valor KD é estimado com o uso de um modelo de ligação Langmuir de 1:1. Devido à heterogeneidade da preparação de Ang-2 nenhuma ligação 1:1 pode ser observada; os valores KD são, dessa forma, apenas estimações relativas. Os dados de controle negativo (por exemplo, curvas de tampão) são subtraídos das curvas de amostra para a correção do desvio de linha base intrínseco no sistema e para a redução de sinal de ruído. O software de avaliação T100 Biacore versão 1.1.1 é usado para a análise de sensogramas e para o cálculo de dados de afinidade. Alternativamente, o Ang-2 poderia ser capturado com um nível de captura de 2.000 a 1.700 RU por meio de um anticorpo PentaHisAntibody (PentaHis-Ab livre de BSA, Qiagen N° 34660) que é imobilizado em um chip CM5 por meio de acoplamento de amina (livre de BSA) (ver abaixo). ELISA DE LIGAÇÃO POR PONTE DE ANG-2-VEGF

[0130] As propriedades de ligação dos anticorpos tetravalentes biespecíficos são avaliadas em um ensaio ELISA com proteína VEGF165-His de extensão completa imobilizada (Sistemas R&D) e proteína Ang-2-His humano (Sistemas R&D) para a detecção de anticorpo biespecífico aglutinado. Apenas um anticorpo tetravalente biespecífico <VEGF-Ang-2> é capaz de se ligar simultaneamente ao VEGF e ao Ang-2 e, dessa forma, fazer uma ponte dos dois antígenos enquanto que anticorpos IgGI “padrão” monoespecíficos não são capazes de se ligar simultaneamente ao VEGF e ao Ang-2 (Figura 7).

[0131] Para esse propósito, placas de microtitulação acentuadas com poliestireno límpido Falcon são revestidas com 100 μl de 2 μg/ml de VEGF 165 humano recombinante (sistemas R&D) em PBS por 2 h à temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 °C. As cavidades são lavadas três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e bloqueadas com 200 μl de 2% de BSA, 0,1% de Tween 20 por 30 min à temperatura ambiente e, subsequentemente, lavadas três vezes com 300 μl de PBST. 100 μl/cavidade de uma série de diluições de anticorpos tetravalentes biespecíficos purificados em PBS (Sigma) são adicionados às cavidades e incubados por 1 h em um agitador de placa de microtitulação à temperatura ambiente. As cavidades são lavadas três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e o anticorpo aglutinado é detectado por adição de 100 μl de 0,5 μg/ml de Ang-2-His humano (Sistemas R&D) em PBS. As cavidades são lavadas três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e o Ang-2 aglutinado é detectado com 100 μl de 0,5 μg/ml de anticorpo <Ang-2>mIgGl-Biotina (BAM0981, Sistemas R&D) por 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo de detecção não aglutinado é lavado três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e o anticorpo aglutinado é detectado por adição de 100 μl de 1:2.000 de conjugado de estreptavidinaPOD (Roche Diagnostics GmbH, Cat. N° 11089153) 1:4 diluído em tampão de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente. O conjugado de estreptavidina-POD não aglutinado é lavado de três a seis vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e o conjugado de estrepatavidina-POD aglutinado é detectado por adição de 100 μl de ABTS/cavidade. A determinação de absorvância é realizada em um espectrômetro de flúor Tecan em um comprimento de onda de medição de 405 nm (comprimento de onda de referência de 492 nm). DEMONSTRAÇÃO DE LIGAÇÃO SIMULTÂNEA DE ANTICORPO TETRAVALENTE BIESPECÍFICO <VEGF-ANG-2> A VEGF-A E ANG-2 POR BIACORE

[0132]Com a finalidade de corroborar adicionalmente com os dados do ELISA de ligação por ponte, um ensaio adicional é estabelecido para confirmar a ligação simultânea com VEGF e Ang-2 com o uso da tecnologia de ressonância de plásmon de superfície em um instrumento T100 Biacore de acordo com o protocolo a seguir e analisado com o uso do pacote de software T100 (T100 Control, Versão 2.01, T100 Evaluation, Versão 2.01, T100 Kinetics Summary, Versão 1.01): o Ang-2 é capturado com um nível de captura de 2.000 a 1.700 RU em PBS, 0,005 % (v/v) de tampão de execução Tween20 por meio de um anticorpo PentaHisAntibody (PentaHis-Ab livre de BSA, Qiagen N° 34660) que é imobilizado em um chip CM5 por meio de acoplamento de amina (livre de BSA). O tampão HBS-N serviu como tampão de execução durante o acoplamento, a ativação é feita pela mistura de EDC/NHS. O anticorpo de captura livre de BSA PentaHis-Ab é diluído em tampão de acoplamento NaAc, pH 4,5, c = 30 μg/ml, finalmente, os grupos carboxila ainda ativados são bloqueados pela injeção de 1 M de Etanolamina; as densidades de ligante de 5.000 e 17.000 RU são testadas. O Ang-2 com uma concentração de 500 nM é capturado pelo PentaHis-Ab em um fluxo de 5 μl/min diluído com tampão de execução + 1 mg/ml de BSA. Subsequentemente, o anticorpo tetravalente biespecífico <Ang-2, VEGF> que se liga a Ang-2 e a VEGF é demonstrado por incubação com rhVEGF e formação de um complexo de sanduíche. Para esse propósito, o anticorpo tetravalente biespecífico <VEGF-Ang-2> é aglutinado ao Ang-2 em um fluxo de 50 μl/min e uma concentração de 100 nM, diluído com tampão de execução + 1 mg/ml de BSA e a ligação simultânea é detectada pela incubação com VEGF (rhVEGF, Sistemas R&D Cat.N°, 293-VE) em PBS + 0,005 % (v/v) de tampão de execução Tween20 em um fluxo de 50 μl/min e uma concentração VEGF de 150 nM. O tempo de associação é de 120 s, tempo de dissociação de 1.200 s. A regeneração é feita após cada ciclo em um fluxo de 50 μl/min com 2 x 10 mM de Glicina, pH 2,0 em um tempo de contato de 60 s. Os sensogramas são corrigidos com o uso da referência dupla usual (referência de controle: ligação de anticorpo biespecífico e rhVEGF para capturar a molécula PentaHisAb). Os espaços vazios para cada Ab são medidos com concentração "0" de rhVEGF. GERAÇÃO DE LINHAGEM CELULAR HEK293-TIE2

[0133] Com a finalidade de determinar a interferência de anticorpos tetravalentes biespecíficos <Ang-2, VEGF> com fosforilação de Tie2 estimulada por Ang-2 e a ligação de Ang-2 com Tie2 em células, uma linhagem celular HEK293-Tie recombinante foi gerada. Brevemente, uma codificação de plasmídeo baseada em pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Topo hTie2) para Tie2 humano de extensão completa sob o controle de um promotor CMV e um marcador de resistência de Neomicina foram transfectados com o uso de Fugeno (Roche Applied Science) como reagente de transfecção em células HEK293 (ATCC) e células resistentes foram selecionadas em DMEM de 10 % de FCS, 500 μg/ml de G418. Os clones individuais foram isolados por meio de um cilindro de clonagem e, subsequentemente, analisados para a expressão de Tie2 por FACS. O Clone 22 foi identificado como clone com expressão de Tie2 alta e estável mesmo na ausência de G418 (HEK293-Tie2 clone 22). O HEK293-Tie2 clone22 é subsequentemente usado para ensaios celulares: fosforilação de Tie2 induzida por Ang-2 e Ensaio de ligação de ligante celular. ENSAIO DE FOSFORILAÇÃO DE TIE2 INDUZIDA POR ANG-2

[0134]A inibição da fosforilação de Tie2 induzida por Ang-2 através de anticorpos tetravalentes biespecíficos <Ang-2, VEGF> é medida de acordo com o principal ensaio a seguir. O HEK293-Tie2 clone 22 é estimulado com Ang-2 por 5 minutos na ausência ou presença do anticorpo Ang-2 e P-Tie2 é quantificado por um ELISA de sanduíche. Brevemente, 2x105 células de HEK293-Tie2 clone 22 por cavidade são cultivadas de um dia para o outro em uma placa de microtitulação com 96 cavidades revestidas com Poli-D-Lisina em 100 μl de DMEM, 10% de FCS, 500 μg/ml de Geneticina. No dia seguinte, uma fileira de titulação de anticorpos tetravalentes biespecíficos <Ang-2, VEGF> é preparada em uma placa de microtitulação (concentrada 4 vezes, 75 μl de volume final/cavidade, duplicatas) e misturada com 75μl de uma diluição de Ang-2 (sistemas R&D n° 623-AN] (3,2 μg/ml como solução 4 vezes concentrada). Os anticorpos e Ang-2 são pré-incubados por 15 min à temperatura ambiente. 100 μl da mistura são adicionados às células de HEK293-Tie2 clone 22 (pré- incubadas por 5 min com 1 mM de NaV3O4, Sigma n° S6508) e incubados por 5 min a 37 °C. Subsequentemente, as células são lavadas com 200 μl de PBS em gelo + 1 mM de NaV3O4 por cavidade e lisados pela adição de 120 μl de tampão de lise (20 mM de Tris, pH 8,0, 137 mM de NaCl, 1% de NP-40, 10% de glicerol, 2mM de EDTA, 1 mM de NaV3O4, 1 mM de PMSF e 10 μg/ml de Aprotinina) por cavidade em gelo. As células são lisadas por 30 min a 4 °C em um agitador de placa de microtitulação e 100 μl de lisato são transferidos diretamente em uma placa de microtitulação de ELISA p- Tie2 (Sistemas R&D, R&D n° DY990) sem centrifugação prévia e sem determinação de proteína total. As quantidades de P-Tie2 são quantificadas de acordo com as instruções do fabricante e valores IC50 para a inibição são determinados com o uso de conexão de análise XLfit4 para Excel (um sítio de resposta de dose, modelo 205). Os valores IC50 podem ser comparados dentro de um experimento, mas podem variar de experimento para experimento. ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO HUVEC INDUZIDA POR VEGF

[0135]A proliferação HUVEC (Células Endoteliais de Veia Umbilical Humana, Promocell n° C-12200) induzida por VEGF é escolhida para medir a função celular de <Ang-2, VEGF> anticorpos tetravalentes biespecíficos. Brevemente, são incubadas 5.000 células HUVEC (baixo número de passagens, <) por 96 cavidades em 100 μl de meio de estarvação (meio basal endotelial EBM-22, Promocell n° C-22211, FCS a 0,5%, Penicilina/Estreptomicina) em uma placa de microtitulação com 96 cavidades de colágeno BD Biocoat revestidas com colágeno I (BD n°354407 / 35640 de um dia para o outro. As concentrações variantes de <Ang-2, VEGF> anticorpo tetravalente biespecífico são misturadas com rhVEGF (30 ngl/ml de concentração final, BD n° 354107) e pré-incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, a mistura é adicionada às células HUVEC e são incubadas por 72 horas a 37°C, CO2 a 5%. No dia da análise, a placa é equilibrada à temperatura ambiente por 30 minutos e a viabilidade /proliferação celular é determinada com o uso do kit de Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-GloTM de acordo com o manual (Promega, n° G7571/2/3). A luminescência é determinada em um espectrofotômetero. EXEMPLO 1 PRODUÇÃO, EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM ANTICORPO BIESPECÍFICO E TETRAVALENTE DE RECONHECIMENTO DE ANG-2 E VEGF-A

[0136] Em um primeiro exemplo, um anticorpo tetravalente biespecífico sem um ligador entre as respectivas cadeias de anticorpo de reconhecimento de Ang-2 e VEGF-foi produzido ao fundir, através de um (G4S)4-connector, uma fusão de domínio VH-CL contra VEGF-A ao C- terminal da cadeia pesada de um anticorpo de reconhecimento de Ang-2 (SEQa ou um alótipo IgG1 correspondente). A fim de obter o anticorpo tetravalente biespecífico, este construto de cadeia pesada foi co-expresso com plasmídeos que codificam a respectiva cadeia leve do anticorpo Ang-2 (SEQ3) e uma fusão de domínio VL-CH1 de reconhecimento de VEGF-A (SEQ2). O esquema do respectivo anticorpo é dado na Figura 5.

[0137]O anticorpo tetravalente biespecífico, descrito na seção de métodos gerais, é gerado através de técnicas de biologia molecular clássica e é expresso de forma transiente em células HEK293F conforme descrito acima. Subsequentemente, o mesmo foi purificado do sobrenadante através de uma combinação de cromatografia por afinidade de Proteína A e cromatografia por exclusão de tamanho. O produto obtido foi caracterizado pela identidade através de espectrometria de massa e propriedades analíticas como pureza por SDS-PAGE, estabilidade e conteúdo de monômero.

[0138] Estes dados mostram que o anticorpo tetravalente biespecífico pode ser produzido em rendimentos satisfatórios e é estável.

[0139]Subsequentemente, a ligação a Ang-2 e VEGF-A bem como a ligação simultânea foram estudadas por ELISA e ensaios Biacore descritos acima e propriedades funcionais como inibição de fosforilação de Tie2 e a inibição de proliferação de HUVEC induzida por VEGF são analisadas mostrando que o anticorpo tetravalente biespecífico gerado é capaz de se ligar a Ang-2 e VEGF-A e bloquear sua atividade simultaneamente. EXEMPLO 2 PRODUÇÃO, EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM ANTICORPO BIESPECÍFICO E TETRAVALENTE DE RECONHECIMENTO DE ANG-2 E VEGF-A

[0140] Em um segundo exemplo, um anticorpo tetravalente biespecífico sem um ligador entre as respectivas cadeias de anticorpo de reconhecimento de Ang-2 e VEGF-A foi produzido ao fundir, através de um (G4S)4-connector, uma fusão de domínio VH-CL contra VEGF-A ao N- terminal da cadeia pesada de um anticorpo de reconhecimento de Ang-2 (SEQ4 ou um alótipo de IgG1 correspondente). A fim de obter o anticorpo tetravalente biespecífico, este construto de cadeia pesada foi co-expresso com plasmídeos que codificam a cadeia leve respectiva do anticorpo Ang-2 (SEQ3) e uma fusão de domínio VL-CH1 de reconhecimento de VEGF-A (SEQ2). O esquema do anticorpo respectivo é dado na Figura 6.

[0141]O anticorpo tetravalente biespecífico foi gerado conforme descrito na seção de métodos gerais através de técnicas de biologia molecular clássica e é expresso de forma transiente em células HEK293F conforme descrito acima. Subsequentemente, o mesmo foi purificado do sobrenadante através de uma combinação de cromatografia por afinidade de Proteína A e cromatografia por exclusão de tamanho. O produto obtido foi caracterizado pela identidade através de espectrometria de massa e propriedades analíticas como pureza por SDS- PAGE, estabilidade e conteúdo de monômero.

[0142] Estes dados mostram que o anticorpo tetravalente biespecífico pode ser produzido em rendimentos satisfatórios e é estável.

[0143]Subsequentemente, a ligação a Ang-2 e VEGF-A bem como a ligação simultânea foram estudadas por ELISA e ensaios Biacore descritos acima e as propriedades funcionais como inibição de fosforilação de Tie2 e inibição de proliferação de HUVEC induzida por VEGF são analisadas mostrando que o anticorpo tetravalente biespecífico gerado é capaz de se ligar a Ang-2 e VEGF-A e bloquear sua atividade simultaneamente. EXEMPLO 3 PRODUÇÃO, EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM ANTICORPO TETRAVALENTE E BIESPECÍFICO QUE RECONHECE ANG-2 E VEGF-A

[0144] Em um terceiro exemplo, um anticorpo tetravalente biespecífico sem um ligador entre as cadeias de anticorpo respectivas que reconhece Ang-2 e VEGF-A foi feito através da fusão por meio de um conector (G4S)4 de um domínio Fab VH-CH1 contra Ang-2 com o C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo de troca CH1-CL que reconhece VEGF (SEQ5 ou um alotipo de IgGl correspondente). Com a finalidade de obter o anticorpo tetravalente biespecífico, esse construto de cadeia pesada foi co-expresso com codificação de plasmídeos para a cadeia leve respectiva do anticorpo Ang-2 (SEQ3) e uma fusão de domínio VL-CH1 que reconhece VEGF-A (SEQ2). O esquema do anticorpo respectivo é dado na Figura 7.

[0145] O anticorpo tetravalente biespecífico foi gerado conforme descrito na seção de métodos gerais através de técnicas de biologia molecular clássicas e é expresso de maneira transiente em células HEK293F conforme descrito abaixo. Subsequentemente, esse foi purificado a partir do sobrenadante por uma combinação de cromatografia de afinidade de Proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho. O produto obtido foi caracterizado por identificação através de espectrometria de massa e propriedades analíticas como pureza por SDS- PAGE, teor de monômero de estabilidade.

[0146] Esses dados mostram que o anticorpo tetravalente biespecífico pode ser produzido em bons rendimentos e é estável.

[0147]Subsequentemente, a ligação com Ang-2 e VEGF-A, bem como a ligação simultânea foram estudadas por ELISA e ensaios Biacore descritos acima e as propriedades funcionais como inibição de fosforilação de Tie2 e inibição de proliferação de HUVEC induzida por VEGF são analisadas mostrando que o anticorpo tetravalente biespecífico gerado é capaz de se ligar a Ang-2 e a VEGF-A e bloquear sua atividade simultaneamente.

Claims (11)

1. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO BIESPECÍFICA, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo, que se ligam especificamente a um primeiro antígeno e compreendem dois fragmentos Fab; (ii) dois fragmentos Fab adicionais de um anticorpo que se ligam especificamente a um segundo antígeno, em que ditos fragmentos Fab adicionais são ambos fundidos por meio de um conector de peptídeo ou no C- terminal ou no N-terminal das cadeias pesadas de (a); em que as seguintes modificações são realizadas nos fragmentos Fab: (iii) em ambos os fragmentos Fab de (a), ou em ambos os fragmentos Fab de (b), os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (iv) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (v) i) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, (vi) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, ou (vii) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro, e em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ditos fragmentos Fab adicionais são ambos fundidos por meio de um conector de peptídeo ou ao C-terminal das cadeias pesadas de (a), ou ao N-terminal das cadeias pesadas de (a).

3. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que as seguintes modificações são realizadas nos fragmentos Fab: (1) em ambos os fragmentos Fab de (a), ou em ambos os fragmentos Fab de (b), os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

4. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as seguintes modificações são realizadas nos fragmentos Fab: (1) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

5. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as seguintes modificações são realizadas nos fragmentos Fab: (1) em ambos os fragmentos Fab de (a) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

6. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as seguintes modificações são realizadas nos fragmentos Fab: (1) em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e/ou os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

7. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que as seguintes modificações são realizadas nos fragmentos Fab: (1) em ambos os fragmentos Fab de (b) os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

8. MÉTODO PARA PREPARAR UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO BIESPECÍFICA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) transformar uma célula hospedeira com vetores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de ligação de antígeno biespecífica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitam síntese de dita molécula de proteína de ligação de antígeno; e (c) recuperar dita molécula de proteína de ligação de antígeno a partir de dita cultura.

9. MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, caracterizado pelo fato de que compreende os vetores conforme definidos na reivindicação 8.

10. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de ligação de antígeno biespecífica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

11. USO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO BIESPECÍFICA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

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