BRPI1011144B1

BRPI1011144B1 - proteína precursora, sequência de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor recombinante, método para produzir um peptídeo desejado, e, uso de um peptídeo anfifílico

Info

Publication number: BRPI1011144B1
Application number: BRPI1011144-1A
Authority: BR
Inventors: Daniel Hümmerich; Burghard Liebmann; Markus Fehr; Carsten Schwalb; Heike Brüser
Original assignee: Basf Se
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2021-02-02
Also published as: US20120088268A1; EP2437769B1; NZ615847A; TW201103981A; US9481719B2; BRPI1011144A2; ECSP12011577A; MX2011012906A; CN102724992A; ES2763168T3; AR076977A1; AU2010255732A8; NZ596735A; CN102724992B; RU2548815C2; CR20110619A; KR101834018B1; KR101812842B1; BRPI1011144B8; AU2010255732A1

Abstract

PROTEÍNA PRECURSORA, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR UM PEPTÍDEO DESEJADO, E, USO DE UM PEPTÍDEO ANFIFÍLICO A presente invneção diz respeito a proteínas precursoras de auto-montagem repetitiva, sequências de ácido nucleico e contruções de expressões codificando-as, e a métodos para produção recombinante de peptídeos com o uso de tais proteínas precursoras.

Description

A presente invenção diz respeito a proteínas precursoras de auto-montagem repetitiva, sequências de ácido nucleico e construções de expressões codificando-as, e a métodos de produzir recombinantemente peptídeos pelo uso de tais proteínas precursoras.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Existem diferentes métodos conhecidos de produzir peptídeos por meios biotecnológicos. Tendo em vista que a estabilidade das cadeias curtas de polipeptídeos nas células hospedeiras microbianas é usualmente baixa, e uma vez que os peptídeos livres podem ter um efeito tóxico possível sobre o organismo hospedeiro (por exemplo, peptídeos antimicrobianos), a maioria dos métodos envolve a produção de maiores proteínas precursoras das quais o peptídeo é extirpado após a proteína precursora ter sido purificada.

Uma possibilidade de se obter uma proteína precursora estável compreende expressar um peptídeo junto com uma proteína estável por meio de uma proteína de fusão. As propriedades da referida proteína de fusão, que muito influenciam as etapas de processamento subsequentes, são determinadas pelo parceiro de fusão amplamente de forma independente da sequência de peptídeos, e são, portanto, facilmente controláveis e adequadas para produzir peptídeos com diferentes sequências.

A WO 2008/085543 descreve um método especial de produzir proteínas e peptídeos com o auxílio de uma proteína de fusão. Esta proteína de fusão compreende, com exceção da sequência de peptídeos desejada, um parceiro de fusão que assegura que a proteína de fusão apresente um comportamento de transição de fase inversa. Este comportamento primeiramente envolve a proteína de fusão a ser purificada do contexto celular de uma maneira simples e não dispendiosa. Em segundo lugar, o parceiro de fusão pode da mesma forma ser removido mediante clivagem proteolítica. Embora uma proteína de fusão possa ser frequentemente obtida com bons rendimentos, a porção de peptídeo da proteína precursora é usualmente pequena, e a eficácia do processo é, portanto, subótima.

Outra abordagem envolve proteínas precursoras repetitivas que compreendem cópias múltiplas do peptídeo desejado sendo recombinantemente produzido. A WO 03/089455 descreve a produção de proteínas precursoras multiméricas das quais as sequências de peptídeos desejadas que tenham propriedades antimicrobianas são excisadas por clivagem ácida.

Existem várias outras abordagens publicadas [exemplos: Metlitskaya et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 39; 339-345 (2004); Wang & Cal. Appl. Biochem. and Biotechnol. 141; 203-213 (2007)] que foram usadas para demonstrar que as sequências de peptídeos ou famílias de sequências de peptídeos podem ser produzidas por um método específico com o auxílio das proteínas precursoras repetitivas. Em alguma extensão, o uso de sequências auxiliares especiais que sejam localizadas entre as repetições das sequências de peptídeos desejadas tem sido descrito. Mais especificamente, sequências auxiliares aniônicas têm sido propostas, as quais aparentemente reduzem a ação nociva das sequências de peptídeos antimicrobianos catiônicos dentro de uma respectiva proteína precursora na célula hospedeira (conforme, por exemplo, a WO 00/31279 e a U.S. 2003/0219854). Enquanto a proteína precursora nesta abordagem repetitiva tem uma proporção mais elevada da sequência de peptídeos desejada, do que é o caso com as proteínas de fusão, as propriedades das proteínas precursoras repetitivas são grandemente influenciadas pela sequência do peptídeo catiônico desejado.

Os inventores não têm nenhum conhecimento de qualquer método anterior que envolva a possibilidade de produzir quaisquer sequências de peptídeos com o auxílio das proteínas precursoras repetitivas de acordo com um protocolo simples de baixo custo que pode ser realizado de uma maneira eficaz.

Vários peptídeos antimicrobianos foram descritos na literatura e são resumidos em Reviews (Hancock, R. E. W. e Lehrer, R. 1998 em Trends in Biotechnology, 16: 82-88; Hancock, R. E. W. e Sahl, H. G. 2006 em Nature Biotechnology, 24: 1551-1557).

Os peptídeos de fusão, nos quais dois peptídeos ativos são combinados, são da mesma forma descritos na literatura. Wade et al. relata a ação antibacteriana de várias fusões de Hyalophora cecropia cecropin A e a melitina venenosa (Wade, D. et al., 1992, International Journal of Peptide and Protein Research, 40: 429-436). Shin et al. descreve a ação antibacteriana de um peptídeo de fusão de Hyalophora cecropia cecropin A e a Xenopus laevis magainin 2, consistindo em 20 aminoácidos. O cecropin A consiste em 37 aminoácidos e apresenta atividade contra bactérias Gram-negativas que reduz a atividade contra bactérias Gram-positivas, o magainin 2 consiste em 23 aminoácidos e é ativo contra bactérias, mas também linhagens de células tumorais. Em comparação com a fusão do cecropin A e da melitina, esta fusão apresenta uma atividade hemolítica distintamente inferior com uma ação antibacteriana comparável (Shin, S. Y., Kang, J. H., Lee, M. K., Kim, S. Y., Kim, Y., Hahm, K. S., 1998, Biochemistry and Molecular Biology International, 44: 1119-1126). As U.S. 2003/0096745 Al e U.S. 6.800.727 B2 reivindicam estes peptídeos de fusão, consistindo em 20 aminoácidos, e variantes da referida fusão que, por causa da substituição dos aminoácidos, em particular dos aminoácidos positivamente carregados e dos aminoácidos hidrofóbicos, são mais positivamente carregadas e mais hidrofóbicas.

Shin et al., 1999, descrevem outros desenvolvimentos deste peptídeo de fusão de cecropin A-magainin 2. Eles demonstraram que o peptídeo tendo a SEQ ID NO: 6 tinha uma atividade hemolítica inferior em comparação com a fusão de partida, mas que a atividade antibacteriana em relação a Escherichia coli e Bacillus subtilis não era negativamente afetada (Shin et al. 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90).

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

E, portanto, um objeto da presente invenção prover um método amplamente aplicável de produzir peptídeos com o auxílio de proteínas precursoras repetitivas.

O objeto foi alcançado por uma nova abordagem de produzir peptídeos por meios biotecnológicos, com as proteínas precursoras repetitivas sendo produzidas, que compreendem uma alta proporção da sequência de peptídeos desejada e que compreendem as sequências auxiliares que dominam as propriedades da proteína precursora de uma maneira previsível. Referido método pode ser usado para produzir diferentes sequências de peptídeos sem que se tenha de restabelecer fundamentalmente as condições para expressar a molécula precursora ou o procedimento subsequente de processamento para cada uma das diferentes sequência de peptídeos. E, além disso, possível produzir peptídeos para os quais os métodos anteriormente usados não sejam eficazes.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Nas figuras que acompanham este relatório descritivo,

A Figura 1 apresenta uma representação de uma roda helicoidal de sequências de aminoácidos por meio da projeção de uma estrutura de hélice alfa. A sequência de aminoácidos contida na proteína precursora repetitiva, Al a A7 (A) é descrita sobre um círculo (B). Esta disposição visualiza a posição dos aminoácidos em uma alfa-hélice;

A Figura 2 apresenta o cromatograma de fase reversa do peptídeo “ZnO” após a clivagem ácida;

A Figura 3 apresenta o espectro de massa do peptídeo “ZnO” após a clivagem ácida e a HPLC de fase reversa; os números mostrados indicam o valor m/z do pico monoisotópico específico;

A Figura 4 apresenta um cromatograma de fase reversa do peptídeo “PI8” após a clivagem ácida e a cromatografia de troca de cátions;

A Figura 5 apresenta o espectro de massa do peptídeo “PI8” após a clivagem ácida, a cromatografia de troca de cátions e a HPLC de fase reversa; os números mostrados indicam o valor de m/z do pico monoisotópico específico;

A Figura 6 apresenta o cromatograma de fase reversa do peptídeo “Min” após a clivagem ácida;

A Figura 7 apresenta o espectro de massa do peptídeo “Min” após a clivagem ácida e a HPLC de fase reversa; os números mostrados indicam o valor de m/z do pico monoisotópico específico;

A Figura 8 apresenta o cromatograma de fase reversa do peptídeo SEQ ID NO: 6 após a clivagem ácida e a cromatografia de troca de cátions;

A Figura 9 apresenta o espectro de massa do peptídeo SEQ ID NO: 6 após a clivagem ácida, a cromatografia de troca de íons e a HPLC de fase reversa; os números mostrados indicam o valor de m/z do pico monoisotópico específico;

A Figura 10 apresenta o cromatograma de troca de cátions de HPLC do peptídeo “P18” antes e após a amidação de acordo com o Exemplo 6; o cromatograma de um peptídeo de referência quimicamente sintetizado e amidado com a sequência do peptídeo “PI8” é mostrado para comparação;

A Figura 11 apresenta o cromatograma de troca de cátions de HPLC do peptídeo “P18” antes e após a amidação de acordo com o Exemplo 7; o cromatograma de um peptídeo de referência quimicamente sintetizado e amidado com a sequência do peptídeo “PI8” é mostrado para comparação.

FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

A invenção particularmente diz respeito às seguintes formas de realização:

1. Uma proteína precursora sintética, em particular recombinantemente preparada, compreendendo uma sequência repetitiva enzimática e/ou quimicamente clivável de repetições dos elementos de peptídeo desejado (Pep) e dos elementos de peptídeos auxiliares (Aux) da fórmula geral (Pep-Aux)x ou (Aux-Pep)x onde x > 1, em que os elementos Aux são idênticos ou diferentes e compreendem elementos de sequências de aminoácidos que comunicam à referida proteína precursora propriedades de auto-montagem; e os elementos Pep são idênticos ou diferentes e compreendem a sequência de aminoácidos de moléculas de peptídeos idênticas ou diferentes.

2. Uma proteína precursora de acordo com a forma de realização 1, em que os elementos Pep e Aux são peptidicamente ligados entre si diretamente ou através de uma sequência de peptídeos cliváveis, e a ligação peptídica é especificamente clivável química ou enzimaticamente, isto é, exclusiva ou essencialmente clivável em um aminoácido definido ou sequência de aminoácidos de uma sequência.

3. Uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização precedentes, que tenha propriedades de auto-montagem de modo a formar espontaneamente, isto é, por si própria, associações ou indutivelmente estáveis, não covalentes, que não possam ser dissolvidas na temperatura ambiente sob condições padrão, tais como, em particular, por NaOH 0,2 M dentro de uma hora, ou por uréia 2 M ou cloridreto de guanidínio 1 M em cada caso dentro de 10 minutos. Uma associação estável de acordo com a invenção resulta de pelo menos um destes três critérios mencionados ter sido satisfeito.

4. Uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização precedentes, em que pelo menos um elemento Aux compreende um elemento de peptídeo de auto-montagem (SA), em que referido elemento SA compreende pelo menos um motivo de sequência de pelo menos 8, tal como, por exemplo, 8al0, 8 a 12, 8 a 14, 8al6, 8al8ou 8 a 20, aminoácidos contínuos, que compreendam pelo menos 50 %, por exemplo, 50 a 100 %, 60 a 90 % ou 70 a 80 %, de resíduos de alanina, pelo menos 50 %, por exemplo, 50 a 100 %, 60 a 90 % ou 70 a 80 %, de resíduos de valina, ou pelo menos 50 %, por exemplo, 50 a 100 %, 60 a 90 % ou 70 a 80 %, de resíduos de glutamina, ou pelo menos 80 % dos quais consistam de pelo menos um destes resíduos; o elemento SA pode compreender, por exemplo, em particular, pelo menos um dos seguintes motivos de sequência: An (motivo 1) (GA)m (motivo 2) Vn (motivo 3) (VA)m (motivo 4) (VVAA)0 (motivo 5) em que A é alanina, G é glicina, V é valina, “n” é um número inteiro de 2 a 12, “m” é um número inteiro de 2 a 10, e “o” é um número inteiro de 1 a 6, em que mais especialmente n = 5 a 10, m = 4a 8, eo = 2 a 4, por exemplo, n = 7 a 9, m = 6 a 7 e o = 2 a 3. As sequências SA acima podem ser C- e/ou N-terminalmente alongadas, em cada caso por 1 a 3 resíduos de aminoácido randômicos. Exemplos de alongamentos N-terminais adequados são os motivos de sequência “G-”, “GS-”, “GAG-”, “GPG-”, “GPS-”, “GAS-”, “GQQ-” e GSS-”; exemplos de alongamentos C-terminais adequados compreendem o motivo de sequência “-SGP”, “-GGA”, “-GPG”, “-SGA”, “-GGQ”, “-GGY” e “-GGL”.

5. Uma proteína precursora de acordo com a forma de realização 4, em que o elemento SA compreenda uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 73.

6. Uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização precedentes, em que pelo menos um peptídeo Aux adicionalmente compreende um elemento de peptídeo protetor (SU).

7. Uma proteína precursora de acordo com a forma de realização 6, em que o elemento SU tem uma “proporção aumentada” de aminoácidos carregados, isto é (por exemplo, em pH = 7) uma carga global diferente de 0, por exemplo de +20 a -20 ou de +10 a -10 ou de +5 a -5, resíduos de aminoácidos, em particular carregados negativamente, por exemplo em pH = 7, uma carga global diferente de 0, por exemplo de -1 a - 20, em particular de -4 a -10.

8. Uma proteína precursora de acordo com a forma de realização 7, em que o elemento SU na proteína precursora é capaz de formar uma estrutura helicoidal anfifílica.

9. Uma proteína precursora de acordo com a forma de realização 8, em que o elemento SU é um peptídeo anfifílico que compreende um segmento de sequência de pelo menos sete aminoácidos peptidicamente ligados capazes de formar uma alfa-hélice anfifílica, em que os resíduos de aminoácidos da referida hélice em sua projeção vertical são separados em uma metade hidrofóbica e uma metade hidrofílica da hélice, a metade hidrofóbica da hélice tendo pelo menos 3 resíduos de aminoácidos hidrofóbicos adjacentes, por exemplo 3 ou 4 na projeção vertical, idênticos ou diferentes, e a metade hidrofílica da hélice tendo pelo menos 3 resíduos de aminoácidos hidrofílicos adjacentes, por exemplo 3 ou 4 na projeção vertical, idênticos ou diferentes.

10. Uma proteína precursora de acordo com as formas de realização 7, 8 ou 9, em que a proporção dos resíduos de aminoácidos carregados do elemento SU é escolhida de tal modo que a carga líquida global da proteína precursora em pH = 7 seja mais elevada do que -10 e mais baixa do que +10, por exemplo mais elevada do que -8 e mais baixa do que +8; mais elevada do que -5 e/ou mais baixa do que +5, mais elevada do que -2 e mais baixa do que +2.

11. A proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização 7 a 10, em que o elemento SU compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 68.

12. Uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização precedentes, em que o elemento Pep compreende uma sequência de peptídeo antimicrobiano tendo uma carga global positiva catiônica.

13. Uma proteína precursora de acordo com a forma de realização 12, em que o elemento Pep compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos catiônicos SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 72 ou qualquer das formas destas C-terminalmente e/ou N- terminalmente modificadas indicadas abaixo.

14. Uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização 1 a 5, em que o peptídeo Pep compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos catiônicos SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 29 a SEQ ID NO: 67 ou qualquer das suas formas C-terminalmente e/ou N-terminalmente modificadas indicadas abaixo.

15. Uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização precedentes, em que os elementos Aux independentemente um do outro têm qualquer dos seguintes significados: SA, SA-SU, SU-SA, SA-SU-SA, SU-SA-SU, em que os elementos SA e SU são peptidicamente ligados entre si, e os elementos Aux são peptidicamente ligados de forma terminal a pelo menos um elemento Pep peptidicamente, isto é, diretamente ou por via de uma sequência de peptídeos clivável, em que pelo menos a ligação peptídica aos elementos Pep é especificamente clivável química ou enzimaticamente.

16. Uma sequência de ácido nucleico codificando para pelo menos uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização precedentes.

17. Uma sequência de ácido nucleico de acordo com a forma de realização 16, compreendendo pelo menos uma sequência de codificação de SEQ ID NOs: 21, 24, 27, 74 e 76.

18. Um cassete de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico de acordo com as formas de realização 16 ou 17, operativamente ligado a pelo menos uma sequência de ácido nucleico reguladora.

19. Um vetor recombinante para transformar um hospedeiro eucariótico ou procariótico, compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer das formas de realização 16 e 17, ou um cassete de expressão de acordo com a forma de realização 18.

20. Um método de produzir um peptídeo desejado (Pep), que 25 compreende: a) produzir uma proteína precursora de acordo com qualquer das formas de realização 1 a 15, b) remover os peptídeos Pep da proteína precursora; e c) opcionalmente de forma enzimática ou química modificar, tal como, por exemplo, amidar, esterificar, oxidar, alquilar, o peptídeo, ou ligá-lo (por exemplo por ligação química natural ou por uma adição de Michael) a outra molécula; em que, por exemplo, o peptídeo é modificado com uma molécula que aumente a hidrofobicidade do referido peptídeo, por exemplo modificado com uma molécula compreendendo um radical de alquila; em que seja possível para referida modificação ser realizada antes ou após a purificação opcional do peptídeo, como também será ilustrado ainda pelos exemplos anexos. Exemplos de radicais alquila adequados são os radicais alquila C2-C]6 tais como etila, isopropila ou n-propila, n-butila, isobutila, see- ou terobutila, n-pentila ou isopentila; também n-hexila, n- heptila, n-octila, n-nonila, n-decila, n-undecila, n-dodecila, n-tridecila, n- tetradecila, n-pentadecila e n-hexadecila, e os seus análogos simplesmente ou multiplamente ramificados, e suas modificações não substituídas ou substituídas que podem ter um ou mais, por exemplo 1, 2 ou 3, substituintes halógenos (tais como, por exemplo, F, Cl, BR), hidroxila, mercapto, amino, alquilamino C1-C4, ou podem ser interrompidos por um ou mais, por exemplo, 1, 2 ou 3, heteroátomos tais como O ou N na cadeia alquila. Mais especificamente, alquila C1-C4 é metila, etila, isopropila ou n-propila, n- butila, isobutila, see- ou ferc-butila.

21. Um método de acordo com a forma de realização 20, em que a proteína precursora é produzida em um microorganismo recombinante carregando pelo menos um vetor de acordo com a forma de realização 19.

22. Um método de acordo com a forma de realização 21, em que a proteína precursora é produzida em uma cepa de E. coli recombinante.

23. Um método de acordo com qualquer das formas de realização 20 a 22, em que a proteína precursora expressa, opcionalmente após ter sido convertida em uma forma estavelmente associada, é purificada e clivada química ou enzimaticamente para liberar o peptídeo desejado (Pep).

24. Uma proteína precursora compreendendo uma sequência clivável de elementos de peptídeos desejados (Pep) e elementos de peptídeos auxiliares (Aux’) da fórmula geral: (Pep-Aux’)x ou (Aux’-Pep)x onde x > 1, em que os elementos Aux’ são idênticos ou diferentes e compreendem um peptídeo anfifílico formador da alfa-hélice, referido peptídeo anfifílico compreendendo um segmento de sequência de pelo menos sete aminoácidos peptidicamente ligados capazes de formar uma alfa-hélice anfifílica, em que os resíduos de aminoácidos da referida hélice em sua projeção vertical são separado em uma metade hidrofóbica e uma metade hidrofílica da hélice, a metade hidrofóbica da hélice tendo pelo menos 3 resíduos de aminoácidos hidrofóbicos adjacentes, por exemplo 3 ou 4, na projeção vertical, idênticos ou diferentes, e a metade hidrofílica da hélice tendo pelo menos 3 resíduos de aminoácidos hidrofílicos adjacentes, por exemplo 3 ou 4, na projeção vertical, idênticos ou diferentes; e os elementos Pep são idênticos ou diferentes e compreendem a sequência de aminoácidos de moléculas peptídicas idênticas ou diferentes.

25. Uma proteína precursora de acordo com a forma de realização 24, em que os elementos Aux’ compreendem pelo menos um elemento de peptídeo de auto-montagem (SA) conforme definido em qualquer das formas de realização 4 e 5.

26. A proteína precursora de acordo com as formas de realização 24 ou 25, em que o peptídeo desejado (Pep) é um peptídeo antimicrobiano catiônico, e o elemento Aux’ é um peptídeo aniônico formando uma alfa-hélice anfifílica.

27. O uso de um peptídeo anfifílico como peptídeo protetor para produzir recombinantemente um peptídeo antimicrobiano desejado dele diferente; em que referido peptídeo anfifílico compreende uma seção de sequência de pelo menos sete aminoácidos peptidicamente ligados capazes de formar uma alfa-hélice anfifílica, em que os resíduos de aminoácido da referida hélice em sua projeção vertical são separados em uma metade hidrofóbica e uma metade hidrofílica da hélice, a metade hidrofóbica da hélice tendo pelo menos 3 resíduos hidrofóbicos de aminoácidos adjacentes idênticos ou diferentes (na projeção vertical), e a metade hidrofílica da hélice tendo pelo menos 3 resíduos adjacentes (na projeção vertical) de aminoácidos hidrofílicos idênticos ou diferentes.

28. O uso de acordo com a forma de realização 27, em que o peptídeo desejado (Pep) é um peptídeo antimicrobiano catiônico, e o elemento Aux’ é um peptídeo aniônico formando uma alfa-hélice anfifílica.

29. Um método de acordo com qualquer das formas de realização 20 a 22, em que uma proteína precursora de acordo com as formas de realização 12 ou 13, tal como, por exemplo, uma proteína precursora compreendendo blocos de construção de peptídeo P18 de acordo com a SEQ ID NO: 23 ou a SEQ ID NO: 6, é produzida.

30. Um método de acordo com a forma de realização 29, que inclui as seguintes etapas de processamento: - Lavar os associados da proteína precursora com um solvente que dissolva as proteínas contaminantes, mas não, ou essencialmente não, referidos associados, tais como NaOH 0,1 M a 1,0 M, por exemplo. - Clivar as proteínas precursoras, por exemplo com um ácido, se o peptídeo desejado, por exemplo PI8, for incorporado na proteína precursora através de grupos cliváveis por ácido.

31. Um método de acordo com a forma de realização 30, que inclui pelo menos uma das seguintes etapas de processamento adicional: - Tratar os associados da proteína precursora com um precipitante auxiliar tal como o ácido fosfórico, por exemplo, após o rompimento da célula; - Purificar a mistura de reação de clivagem do peptídeo com o uso de um método cromatográfico; - Lavar o peptídeo purificado e secado com um solvente ácido ou mistura de solventes.

32. Método de acordo com qualquer das formas de realização 20 a 23 e 29 a 31, para produzir o peptídeo da SEQ ID NO: 23, método este que inclui as seguintes etapas de processamento: - Tratar os associados da proteína precursora após o rompimento celular, mediante a adição de ácido fosfórico de 85 % de potência, até pH = 3. - Lavar os associados da proteína precursora com uma solução de hidróxido de sódio, por exemplo NaOH 0,4 M. - Clivar a proteína precursora com ácido fosfórico ou ácido fórmico, por exemplo, ácido fosfórico a 2 %. - Opcionalmente, lavar o peptídeo seco com ácido hexanóico ou uma mistura de 99 partes de hexano e uma parte de ácido acético.

33. Método de acordo com qualquer das formas de realização 20 a 23 e 29 a 31, para produzir o peptídeo da SEQ ID NO: 6, método este que inclui as seguintes etapas de processamento: - Hidrolisar ou clivar as pelotas, por exemplo por meio de H3PO4 com potência de 5 %; - Centrifugação; - Ajustar o pH do sobrenadante a cerca de 4,0, por exemplo com NaOH a 25 %; - Purificar o sobrenadante com o uso de cromatografia de troca de cátions; - Precipitar o peptídeo desejado, por exemplo pela adição de NaOH ao eluato; - Centrifugação; - Recolocar em suspensão a pelota na água; - Dissolver o peptídeo, por exemplo pela adição de ácido acético; - Liofílização.

34. A invenção, outrossim, diz respeito ao peptídeo PI8 (SEQ ID NO: 23) e ao peptídeo da SEQ ID NO: 6 e à sua produção de acordo com a invenção, e ao seu uso em cosméticos e em meios farmacêuticos para tratar ou prevenir escamas, em particular caspas; ou para inibir o crescimento e/ou a atividade de fangos lipofílicos, em particular Malassezia SSP, particularmente Malassezia furfur. Isto é também descrito, por exemplo, no pedido internacional mais antigo PCT/EP2008/010912, depositado em 19 de dezembro de 2008, cujo teor é por este meio explicitamente referido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOSASPECTOS INDIVIDUAIS DA INVENÇÃO 1. PEPTÍDEOS

Os peptídeos (Pep) de acordo com a presente invenção, que podem também ser referidos como “peptídeos desejados” ou “peptídeos alvo”, são cadeias de aminoácidos nas quais de 2 a 100, por exemplo de 5 a 70 e, em particular, de 7 a 50, por exemplo de 10 a 40, de 12 a 35 ou de 15 a 25, aminoácidos são ligados através de ligações peptídicas. Os peptídeos podem ser compostos de quaisquer a-aminoácidos, em particular os aminoácidos proteinógenos.

Os peptídeos podem ter propriedades particulares biológicas e químicas desejadas e, em particular, também propriedades farmacologicamente utilizáveis. Exemplos de tais propriedades são: a atividade antimicrobiana, a ligação específica a cercas superfícies, as propriedades de nucleação nos processos de cristalização e na formação de partículas, controle das estruturas de cristal, ligação de metais ou íons de metais, propriedades tensoativas, propriedades emulsificantes, propriedades de estabilização de espuma, influência à adsorção celular.

Referidos peptídeos podem ter uma ou mais destas propriedades.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um método de produzir peptídeos antimicrobianos. Tais “peptídeos antimicrobianos” são distinguidos pelo crescimento e/ou propagação de pelo menos um tipo de bactérias gram-positivas e/ou gram-negativas e/ou pelo menos um tipo de levedura e/ou pelo menos um tipo de fungos filamentosos e/ou pelo menos um tipo de algas sendo inibidas e/ou as células do respectivo organismo sendo destruídas na presença de concentrações do peptídeo antimicrobiano de < 100 μM.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito ao fornecimento de peptídeos antimicrobianos catiônicos. Os peptídeos antimicrobianos catiônicos são distinguidos por terem uma ação antimicrobiana conforme definido acima e uma carga líquida de mais do que 0 em pH 7.

Os peptídeos catiônicos desta espécie compreendem, por exemplo, a seguinte sequência: X! X2K X3 X4 X5KIP XIO KFX6X7 X8 AX9KF (SEQ ID NO: 7) nas quais Xio é uma ligação de peptídeo ou qualquer um ou dois resíduos de aminoácidos hidrofóbicos ou um ou dois resíduos de prolina, eX] a X9 são quaisquer resíduos de aminoácidos hidrofóbicos que não a prolina e/ou mutantes ou derivados destes;em que os motivos de sequência respectivos presentes na proteína precursora podem ser idênticos ou diferentes.

Em uma outra forma de realização especial, a invenção diz respeito à produção de peptídeos compreendendo a seguinte sequência: X! X2K X3 X4 X5K1P X]) x12 KFX6X7 X8 AX9KF (SEQ ID NO: 8) na qual: Xi é lisina, arginina ou fenilalanina, X2 é lisina ou triptofano, X3 é leucina ou lisina, X4 é fenilalanina ou leucina, X5 é leucina ou lisina, X6 é leucina ou lisina, X7 é histidina ou lisina, X8 é alanina, leucina, valina ou serina, X9 é leucina ou lisina, Xn é prolina ou uma ligação química, e X12 é prolina ou uma ligação química, e/ou seus mutantes e derivados, em que os motivos de sequência repetitivos presentes na proteína precursora são idênticos ou diferentes.

Exemplos não limitativos das sequências acima, ou motivos das sequências repetitivas são SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, e/ou um mutante ou seus derivados.

Outros peptídeos adequados são descritos, por exemplo, no pedido internacional do presente requerente, PCT/EP2008/010912, data de depósito 19 de dezembro de 2008, o qual é por este meio explicitamente aqui incluído.

2. PROTEÍNAS PRECURSORAS REPETITIVAS

As proteínas precursoras repetitivas de acordo com a presente invenção são distinguidas por pelo menos 60 %, em particular pelo menos 80 %, de sua sequência de aminoácidos, por exemplo 60 a 99 %, 70 a 95 %, 75 a 85 %, em cada caso com base no comprimento total da sequência, consistem em repetições peptídicas (como aqui mais abaixo definido). A porção remanescente pode compreender, por exemplo, peptídeos não repetitivos tais como, por exemplo, peptídeos de sinal, marcadores e outros.

3. REPETIÇÕES

As repetições peptídicas compreendem pelo menos um peptídeo produzido vantajosamente de acordo com a presente invenção, e, em princípio, são construídas como segue (Pep-Aux)x ou (Aux-Pep)x em que x > 1, e com Pep sendo o peptídeo denotado acima e Aux sendo como aqui definido.

Uma repetição (Pep-Aux, ou Aux-Pep) de acordo com a presente invenção é uma sequência de aminoácidos de 10 a 200, por exemplo de 20 a 130 e/ou de 30 a 80, aminoácidos de comprimento, a qual se acha presente em uma proteína precursora uma pluralidade de vezes, ou como sequências idênticas ou como variações de uma sequência particular tendo pelo menos 70 %, por exemplo pelo menos 80 % e, em particular, pelo menos cerca de 90 % de identidade, por exemplo 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade. As proteínas precursoras repetitivas de acordo com a presente invenção podem, assim, compreender, por exemplo, cópias idênticas ou variações de uma sequência de aminoácidos única, ou de múltiplas sequências de aminoácidos diferentes, por exemplo dos blocos de construção do Pep e/ou do Aux.

Além disso, qualquer quantidade das repetições acima, por exemplo, de 1 a 100, de 1 a 50 ou de 2 a 32 e, em particular, de 4 a 16, podem ser reunidas entre si em uma proteína precursora repetitiva.

A proporção do peptídeo de acordo com a invenção na repetição, com base na massa molar, é de 20 % a 80 %, por exemplo de 30 % a 70 %. A parte remanescente da repetição é composta pelas sequências Aux, em particular as sequências SA e SU definidas acima, e, opcionalmente, sequências de clivagem específicas quanto à seletividade removendo o bloco de construção Pep.

4. SEQUÊNCIAS AUXILIARES

Sequências auxiliares no sentido mais amplo são sequências de aminoácidos em uma proteína precursora de acordo com a invenção, que influenciam as propriedades da referida proteína precursora de modo a melhorar a expressão, a estabilidade e/ou o processamento da referida proteína precursora. Sequências auxiliares em uma proteína precursora repetitiva podem fazer parte de uma repetição (os blocos de construção Aux indicados acima) ou podem ser ligadas ao término amino ou ao término carbóxi da proteína precursora, tal como, por exemplo, 6 x o rótulo His (HHHHHH), o rótulo T7 (MASMTGGQQMG), o rótulo S (KETAAAKFERQHMDS), o rótulo c-Myc (EQKLISEEDL), o rótulo Strep (WSHPQFEK) ou o rótulo HA (YPYDVPDYA), glutationa S-transferase, proteína de ligação da maltose, proteína de ligação da celulose. Estas e outras sequências auxiliares são descritas em Terpe: Appl Microbiol Biotechnol', 60(5): 523-533 (2003). Além disso, as sequências auxiliares CanA (Mai Nn Vitro Untersuchungen zum extrazellulãren Netzwerk von Pyrodictium abyssi TAG 11” [“In Vitro of the Extracellular Network of Pyrodictium abyssi TAG 11”}, PhD Theses, Regensburg University (1998)] e yaaD [publicação em linha Wohlleben Eur Biophys J. (2009)] são úteis para serem ligadas ao término amino ou ao término carbóxi da proteína precursora.

Em uma forma de realização, a proteína precursora compreende sequências auxiliares que influenciam a solubilidade da referida proteína precursora.

Em uma forma de realização preferida, as sequências auxiliares comunicam propriedades de “auto-montagem” à proteína precursora. Referidas propriedades de auto-montagem da proteína precursora são distinguidas pela referida proteína precursora formando associações estáveis “espontaneamente”, isto é, por si próprias, sem adicionalmente medidas requeridas, seja durante a expressão ou pela formação de tais associações estáveis das proteínas precursoras solúveis, possivelmente sendo iniciadas de uma maneira “induzível”, isto é, por um ativador. As proteínas precursoras que tenham propriedades de auto-montagem são vantajosamente através de outras proteínas precursoras no fato de que elas podem ser purificadas de uma maneira simples e eficaz. As associações desta espécie usualmente compreendem exclusivamente, ou essencialmente, a formação de ligações não covalentes tais como, por exemplo, ligações de hidrogênio, interações iônicas e/ou hidrofóbicas.

As sequências de auto-montagem podem ser, por exemplo, de pelo menos 8 aminoácidos contíguos de comprimento. Sequências adequadas podem ser localizadas, por exemplo, nas proteínas por si conhecidas nas quais a montagem nos associados de peso molecular mais elevado tenha sido detectada anteriormente. Exemplos de tais associados são as fibrilas amilóides, os filamentos de actina ou de miosina, as fibras de proteínas tais como as fibras de elastina, as fibras de colágeno, os filamentos de secreções filamentosas dos mexilhões, fibras de ceratina ou filamentos de seda. Estas e outras proteínas compreendendo sequências de auto-montagem são descritas em Schelbel, Current Opinion in Biotechnology 16; 1-7 (2005), que é aqui explicitamente referida.

Soluções de sais cosmotrópicos podem ser empregadas como “ativadores”. Sais cosmotrópicos que podem ser aqui mencionados por meio de exemplo são aqueles que compreendam pelo menos um tipo de íon que tenha propriedades cosmotrópicas mais pronunciadas do que os íons de sódio ou de cloreto, de acordo com a série de “Hofmeister”. Exemplos de tais sais são o fosfato de potássio e o sulfato de amónio. Exemplos de tais soluções de sal são o fosfato de potássio 0,5 Me o sulfato de amónio 0,8 M.

Associados estáveis de acordo com a invenção de proteínas precursoras são distinguidos pela manutenção de sua fonna associada através de um certo período durante o tratamento com soluções tipicamente capazes de solubilizar uma multiplicidade de proteínas agregadas, e desta maneira sendo capazes de ser separadas das contaminações de proteínas. Exemplos de tais soluções são soluções de bases, ácidos, uréia, sais e detergentes. Mais especificamente, os associados estáveis de acordo com a invenção são insolúveis através de um certo período em soluções de hidróxidos de metais alcalinos, uréia, sais de guanidínio ou detergentes carregados tais como, por exemplo, os sais de alquiltrimetilamônio ou sulfatos de alquila.

Mais especificamente, os associados estáveis são insolúveis por um certo período em soluções de hidróxido de sódio > 0,2 M, uréia > 2 M, cloridreto de guanidínio > 1 M, tiocianato de guanidínio > 1 M, ou dodecil sulfato de sódio >0,1 % ou brometo de cetiltrimetilamônio >0,1 %. Mais especificamente, os associados estáveis das proteínas precursoras são estáveis nas soluções acima por > 10 minutos, por exemplo >30 minutos e, em particular, > 60 minutos.

Um associado estável se acha presente em particular, se ele não puder ser dissolvido a) por NaOH 0,2 M dentro de uma hora, e/ou b) por uréia 2 M e/ou c) por cloridreto de guanidínio 1 M dentro de 10 minutos, na temperatura ambiente (isto é, cerca de 20 °C).

Em uma outra forma de realização especial, a proteína precursora compreende sequências auxiliares (SU) que protegem a célula hospedeira contra influências nocivas da proteína precursora repetitiva.

Em uma forma de realização especial, a proteína precursora compreende sequências auxiliares SU que protegem a célula hospedeira contra influências nocivas das sequências catiônicas de peptídeo antimicrobiano presentes na proteína precursora repetitiva. Mais especificamente, estas sequências protetoras compreendem aminoácidos negativamente carregados (Asp, Glu). Mais especificamente, a sequência auxiliar compreende vários aminoácidos de glutamato e/ou aspartato negativamente carregados, resultando em uma carga líquida global em pH = 7 de mais do que -10 e menos do que +10, especialmente mais do que -5 e menos do que +5, por exemplo mais do que -2 e menos do que +2 dentro da proteína precursora repetitiva.

Em uma outra forma de realização especial, a sequência protetora negativamente carregada forma uma hélice anfipática. Uma hélice anfipática de acordo com a presente invenção é formada se, na disposição circular [isto é, em sua projeção axial (ao longo do eixo helicoidal) ou vista de topo] de uma sequência de 7 aminoácidos consecutivos na estrutura primária (A1-A7), na seguinte ordem: Al - A5 - A2 - A6 - A3 - A7 - A4 (Figura 1), pelo menos 3 aminoácidos adjacentes sobre o referido círculo, forem aminoácidos hidrofóbicos (Ala, Met, Cya, Phe, Leu, Vai, Ile) ou glicina, e 3 aminoácidos adjacentes sobre o referido círculo forem aminoácidos hidrofílicos (Thr, Ser, Trp, Tyr, Pro, His, Glu, Gin, Asp, Asn, Lys, Arg) ou glicina. Esta disposição circular é também referida como “projeção da roda helicoidal”.

Em uma forma de realização preferida, a sequência protetora negativamente carregada corresponde a qualquer das sequências SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 19.

5. SEQUÊNCIAS DE CLIVAGEM

Sequências de clivagem são sequências de aminoácidos que são dispostas a montante e a jusante das sequências de peptídeos (Pep) desejadas de acordo com a invenção. Estas sequências possibilitam que os blocos de construção de Pep sejam removidos da proteína precursora repetitiva mediante clivagem “específica”. Neste contexto, “específica” significa que referida clivagem ocorre na proteína precursora essencialmente, em particular exclusivamente, em uma ou mais posições definidas, por meio do que o peptídeo desejado ou um seu precursor é removido.

Um “precursor”, por exemplo, pode consistir em uma cadeia de peptídeos que compreenda, sobre uma extremidade ou sobre ambas as extremidades, resíduos de aminoácidos que não façam parte da sequência de peptídeos original nativa, mas que não interfiram com seu uso e funcionalidade adicionais, ou que sejam removíveis por clivagem, se necessário, com o uso de métodos químicos ou bioquímicos convencionais.

As sequências de clivagem podem atuar por meio de uma sequência de reconhecimento específica para enzimas proteoliticamente ativas que se liguem à referida sequência e clivem a ligação peptídica entre dois aminoácidos específicos. Exemplos são as sequências de reconhecimento para Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, caspases, quimotripisina, clostripaína, enterocinase, fator Xa, glutamil endopeptidase, granzima B, LysC lisil endopeptidase {Achromobacter proteinase I), LysN Peptidil-Lys metaloendopeptidase, pepsina, prolina endopeptidase, proteinase K, Peptidase I Estafilocócica, termolisina, trombina, tripsina. As sequências de reconhecimento correspondentes são descritas na literatura, por exemplo em Keil, "Specificity of proteolysis’" p. 335 Springer-Verlag (1992).

Altemativamente, sequências de aminoácidos particulares permitem que a estrutura do polipeptídeo seja seletivamente clivada por produtos químicos específicos tais como, por exemplo, Escatóis de BNPS (2- (2’-nitrofenilsulfenil)-3-metil-3-bromoinolenina), brometo de cianogênio, ácidos, hidroxilamina, ácido iodobenzóico, NTCB (ácido 2-nitro-5- tiocianobenzóico).

Mais especificamente, as sequências de clivagem usadas permitem que as proteínas precursoras repetitivas sejam clivadas por produtos químicos. Sequências de clivagem particularmente adequadas compreendem os motivos de sequência Asn-Gly, que possibilitam a clivagem com hidroxilamina, ou Asp-Pro ou Asp-Xxx, que permitem a clivagem com ácido, Xxx sendo qualquer aminoácido proteinogênico.

6. DESENVOLVIMENTOS ADICIONAIS DE SEQUÊNCIAS DE ACORDO COM A INVENÇÃO 6.1 SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

Além das sequências para peptídeos (Pep) especificamente aqui apresentadas, e sequências auxiliares (Aux, SA, SU), sequências repetitivas, sequências de clivagem e sequências para proteínas precursoras repetitivas, a invenção também diz respeito a equivalentes funcionais, derivados funcionais e sais das referidas sequências.

De acordo com a invenção, “equivalentes funcionais” significa, em particular, também mutantes que, em pelo menos uma posição de sequência das sequências de aminoácidos acima mencionadas, têm um aminoácido diferente daquele especificamente mencionado, mas ainda têm as mesmas propriedades dos peptídeos originalmente não modificados. “Equivalentes funcionais”, portanto, compreendem os mutantes obteníveis por uma ou mais adições, substituições, deleções e/ou inversões de aminoácidos, sendo possível, quanto às referidas modificações, ocorrerem em qualquer posição de sequência, contanto que resultem em um mutante que tenha o perfil de propriedade de acordo com a invenção. Mais especificamente, a equivalência funcional se acha presente mesmo que os padrões de reatividade entre o polipeptídeo mutante e o não modificado se correspondam qualitativamente.

“Equivalentes funcionais” no sentido acima são também “precursores” dos polipeptídeos descritos e também “derivados funcionais” e “sais” dos referidos polipeptídeos.

“Precursores” aqui são precursores naturais ou sintéticos dos referidos polipeptídeos, com ou sem a atividade biológica desejada.

Exemplos de substituições de aminoácidos adequadas podem ser encontrados na seguinte tabela:

Resíduo original Exemplos de substituições

A expressão “sais” significa tanto sais dos grupos carboxila quanto sais de adição de ácido dos grupos amino das moléculas de peptídeos da invenção. Os sais dos grupos carboxila podem ser preparados de uma maneira por si conhecida e compreendem sais inorgânicos tais como, por exemplo, os sais de sódio, cálcio, amónio, ferro e zinco, e também sais com bases orgânicas, por exemplo aminas tais como a trietanolamina, arginina, lisina, piperidina e outros. A invenção, da mesma forma, diz respeito a sais de adição de ácido tais como, por exemplo, sais com ácidos minerais como o ácido clorídrico ou o ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos tais como o ácido acético e o ácido oxálico.

“Derivados funcionais” (ou “derivados”) de polipeptídeos de acordo com a invenção podem,da mesma forma, ser produzidos em grupos laterais de aminoácidos funcionais ou na sua extremidade de terminal-N ou -C com o auxílio de técnicas conhecidas. Exemplos de derivados desta espécie compreendem os ésteres alifáticos de grupos de ácido carboxílico, grupos de amidas de ácido carboxílico, obteníveis pela reação com amónia ou com uma amina primária ou secundária; derivados de N-acila de grupos amino livres, preparados pela reação com grupos acila; ou derivados de O-acila de grupos hidroxila livres, preparados pela reação com grupos acila. Além disso, de 1 a 5, por exemplo 2, 3 ou 4, resíduos randômicos de ácido D- ou L-amino podem adicionalmente ser ligados covalentemente (peptidicamente) aos N- e/ou C- terminais.

6.2 ÁCIDOS NUCLEICOS, CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, VETORES E MICROORGANISMOS COMPREENDENDO-OS ÁCIDOS NUCLEICOS

A invenção, além disso, compreende as moléculas de ácido nucleico que codificam para as sequências de peptídeos e de proteínas empregadas de acordo com a invenção.

Todas as sequências de ácido nucleico mencionadas neste relatório descritivo (sequências de DNA e RNA de filamento único e duplo, por exemplo cDNA e mRNA) podem ser preparadas de uma maneira por si conhecida mediante a síntese química dos blocos de construção de nucleotídeos, por exemplo por fusão de fragmento de sobreposição individual, blocos de construção complementares de ácido nucleico da hélice dupla. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser quimicamente sintetizados de maneira conhecida pelo método de fosfoamidita (Voet, 2 a edição, Wiley Press New York, páginas 896-897). Oligonucleotídeos sintéticos de montagem e aberturas de enchimento com o auxílio do fragmento de Klenow de DNA polimerase e reações de ligação, bem como métodos gerais de clonagem, são descrito em Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

A invenção diz respeito tanto a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam para polipeptídeos ou proteínas de acordo com a invenção ou seus segmentos biologicamente ativos, quanto a fragmentos de ácido nucleico que possam ser usados, por exemplo, como sondas de hibridização ou iniciadores para identificar ou amplificar ácidos nucleicos codificadores de acordo com a invenção.

As moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem, além disso, compreender sequências não transladadas das extremidades 3’ e/ou 5’ da região de genes codificadores.

Uma molécula de ácido nucleico “isolada” é removida das outras moléculas de ácido nucleico presentes na fonte natural do referido ácido nucleico e, adicionalmente, pode ser essencialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando preparado por técnicas recombinantes, ou livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente.

Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser isolada por meio de técnicas moleculares-biológicas padrão e a informação de sequência fornecida de acordo com a invenção. Por exemplo, cDNA pode ser isolado de uma biblioteca de cDNA adequada mediante o uso de qualquer das sequências concretas especificamente apresentadas ou de qualquer de seus segmentos, como sonda de hibridização e técnicas padrão de hibridização (como descrito, por exemplo, em Sambrook, L, Fritsh, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2~ edição, Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Além disso, uma molécula de ácido nucleico que compreenda qualquer das sequências apresentadas ou um seu segmento, isolada pela reação em cadeia da polimeraze com o uso dos iniciadores de oligonucleotídeos gerados com base nesta sequência, pode ser usada. Os ácidos nucleicos amplificados desta maneira podem ser clonados em um vetor adequado e caracterizado por análise de sequência de DNA. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem também ser preparados por métodos de síntese padrão, por exemplo com o uso de um sintetizador de DNA.

A invenção, além disso, compreende as moléculas de ácido nucleico complementares às sequências de nucleotídeos especificamente descritas ou um segmento destas.

As sequências de nucleotídeos de acordo com a invenção possibilitam que as sondas e iniciadores a serem gerados possam ser usados para identificar e/ou clonar sequências homólogas em outros tipos de células e organismos. Tais sondas e iniciadores comumente compreendem uma região de sequência de nucleotídeos que hibridize a pelo menos cerca de 12, preferivelmente pelo menos cerca de 25, por exemplo cerca de 40, 50 ou 75 nucleotídeos consecutivos de um filamento de sentido de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção ou de um filamento anti-sentido correspondente, sob condições estringentes.

A invenção também diz respeito àquelas sequências de ácido nucleico que compreendam “mutações silenciosas” ou que tenham sido modificadas em comparação com uma sequência especificamente mencionada de acordo com a utilização de códon de um organismo especial original ou hospedeiro, bem como variantes de ocorrência natural tais como, por exemplo, variantes de enlace ou suas variantes de alelo. A invenção também diz respeito a sequências obteníveis por substituições conservativas de nucleotídeos (isto é, o aminoácido em questão é substituído por um aminoácido de igual carga, tamanho, polaridade e/ou solubilidade).

A invenção também diz respeito a moléculas derivadas dos ácidos nucleicos especificamente apresentados devidos a polimorfismos de sequência. Estes polimorfismos genéticos podem existir entre indivíduos dentro de uma população única devido à variação natural. Estas variações naturais usualmente resultam em uma variância de 1 a 5 % na sequência de nucleotídeos de um gene.

A invenção, além disso, também compreende sequências de ácido nucleico que hibridizam às sequências codificadoras acima mencionadas ou são a elas complementares Estes polinucleotídeos podem ser encontrados por triagem genômica ou bibliotecas de cDNA e, opcionalmente, ser delas amplificados por meio de iniciadores adequados de uso da PCR e depois ser isolados, por exemplo, com o uso de sondas adequadas. Outra possibilidade é aquela de transformar microorganismos adequados com polinucleotídeos ou vetores de acordo com a invenção, propagando referidos microorganismos e, portanto, referidos polinucleotídeos, e subsequentemente isolando-os. Além disso, os polinucleotídeos de acordo com a invenção também podem ser sintetizados quimicamente.

A propriedade de ser capaz de “hibridizar” a polinucleotídeos significa a capacidade de um poli- ou oligonucleotídeo ligar-se a uma sequência virtualmente complementar sob condições estringentes, enquanto as reações de ligação não específica entre parceiros não complementares não ocorram sob estas condições. Para este fim, as sequências devem ser 70 a 100 %, preferivelmente 90 a 100 %, complementares. A propriedade das sequências complementares de serem capazes de especificamente se ligarem entre si é utilizada, por exemplo, na técnica de Northern ou Southern blot ou com iniciador ligando-se em PCR ou RT-PCR. Usualmente, oligonucleotídeos de pelo menos 30 pares de base de comprimento são empregados com esta finalidade. Condições estringentes significa, por exemplo, na técnica de Northern blot, usar uma solução de lavagem de 50 a 70 °C, preferível de 60 a 65 °C, por exemplo de tampão de 0,1 x SSC contendo 0,1 % de SDS (20 x SSC: NaCl 3 M, citrato de sódio 0,3 M, pH 7,0) para eluição não especificamente de sondas de cDNA hibridizadas ou oligonucleotídeos. Como mencionado acima, apenas ácidos nucleicos altamente complementares permanecem ligados um ao outro neste caso. O ajuste das condições estringentes é conhecido do técnico versado e é descrito por exemplo em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6.

“Identidade” entre dois ácidos nucleicos significa a identidade dos nucleotídeos através, em cada caso, do comprimento inteiro dos ácidos nucleicos, em particular a identidade calculada por meio de comparação com o auxílio do Vetor NTI Suíte 7.1 Software da Informax (USA) e aplicando-se o método Clustal (Higgins, D. G., Sharp, P. M. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. Abril de 1989; 5(2): 151-1), e estabelecendo-se os seguintes parâmetros:

Parâmetro de alinhamento múltiplo: Penalidade de descontinuidade aberta 10 Penalidade de extensão da abertura 10

Faixa da penalidade de separação da abertura 8 Penalidade de separação da aberturafora % de identidade para retardar alinhamento 40 Intervalos específicos dos resíduos fora Intervalo de resíduos hidrofílicos fora Peso de transição 0 Parâmetro de alinhamento aos pares: Algoritmo FAST ligado Tamanho K-tuplo 1 Panalidade de descontinuidade 3 Tamanho da janela 5 Quantidade das melhores diagonais 5

CONSTRUÇÕES E VETORES DE EXPRESSÃO

A invenção adicionalmente diz respeito a construções de expressão que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica para um peptídeo ou proteína precursora de acordo com a invenção sob controle genético mediante sequências reguladoras de ácido nucleico, e a vetores que compreendem pelo menos uma das referidas construções de expressão. Tais construções de acordo com a invenção preferivelmente compreendem um promotor 5’ a montante da sequência codificadora particular, e uma sequência terminal 3’ a jusante, e opcionalmente outros elementos reguladores comuns que, em cada caso, sejam operativamente ligados à sequência codificadora. “Ligação operativa” significa a disposição sequencial do promotor, da sequência codificadora, do terminador e, opcionalmente, outros elementos reguladores de uma maneira tal que cada um dos referidos elementos reguladores possam realizar sua função pretendida durante a expressão da sequência codificadora. Exemplos de sequências operativamente ligáveis são as sequências alvo e também, reforçadores, sinais de poliadenilação e outros. Outros elementos reguladores compreendem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e outros. Sequências reguladoras adequadas são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

A sequência reguladora natural pode ainda estar presente a montante do gene estrutural real, além das sequências reguladoras artificiais. Esta regulação natural pode opcionalmente ser desligada por modificação genética, por esse meio aumentando ou reduzindo a expressão dos genes. Entretanto, a construção dos genes pode também ter uma estrutura mais simples, isto é, nenhum sinal regulador adicional é introduzido a montante do gene de estrutura, e o promotor natural com sua regulação não é removido. Ao invés, a sequência reguladora natural é transformada de uma maneira tal que a regulação não mais tenha lugar e a expressão de genes seja aumentada ou reduzida. A construção de genes pode compreender uma ou mais cópias das sequências de ácido nucleico.

Exemplos de promotores utilizáveis são: cos, TAC, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, lambda-PR ou no promotor lambda-PL, os quais são vantajosamente usados em bactérias gram- negativas; e também os promotores gram-positivos amy e SPO2, os promotores de levedura ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, ou os promotores de plantas CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, not, ou o promotor de ubiquitina ou o promotor de faseolina. Preferência particular é dada ao uso de promotores induzíveis tais como por exemplo promotores induzíveis pela luz e particularmente pela temperatura, tais como o promotor PrPb Em princípio, quaisquer promotores naturais com suas sequências reguladoras podem ser usados. Além disso, promotores sintéticos podem também ser vantajosamente usados.

Referidas sequências reguladoras tenciona-se sejam capazes de possibilitar que as sequências de ácido nucleico e as proteínas sejam expressas de uma maneira específica. Dependendo do organismo hospedeiro, isto pode significar que o gene seja expresso ou super-expresso apenas após a indução ou que ele seja expresso ou super-expresso imediatamente, por exemplo.

Preferência é dada aqui às sequências reguladoras ou fatores que sejam capazes de positivamente influenciar e por esse meio aumentar ou reduzir a expressão. Assim, é possível quanto aos elementos reguladores serem reforçados vantajosamente no nível transcricional pelo uso de fortes sinais de transcrição tais como promotores e/ou “reforçadores”. Além disso, entretanto, é também possível intensificar a translação, por exemplo, pela melhora da estabilidade do mRNA.

Um cassete de expressão é preparado pela fusão de um promotor adequado a uma sequência de nucleotídeos codificadora adequada e a um sinal de terminação ou de poliadenilação. Para esta finalidade, as técnicas familiares de recombinação e de clonagem são usadas como descrito, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) e em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, e Wiley Interscience (1987).

Para expressar a construção de ácido nucleico recombinante ou construção de gene em um organismo hospedeiro adequado, ela é vantajosamente introduzida em um vetor específico do hospedeiro que possibilite que os genes sejam otimamente expressos no hospedeiro. Os vetores são bem conhecidos do técnico habilitado e podem ser encontrados, por exemplo, em “Cloning Vectors" (Pouwels, P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Os vetores são entendidos incluírem além dos plasmídeos também quaisquer outros vetores conhecidos do técnico versado, tais como fagos, vírus tais como SV40, CMV, baculovírus e adenovirus, transposons, elementos IS, plasmídeos, cosmídeos, e DNA linear ou circular, por exemplo. Referidos vetores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou cromossomicamente.

Exemplos de vetores de expressão adequados que podem ser mencionados são:

Vetores de expressão de fusão comuns tais como pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D. B. e Johnson, K. B. (1988) Gene 67: 31- 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT 5 (Pharmacia,

Piscataway, NJ), nos quais a glutationa S transferase (GST), a proteína de ligação à maltose E e a proteína A, respectivamente, são fundidas à proteína recombinante alvo.

Vetores de expressão da proteína não de fusão, tais como pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) e pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89).

Vetor de expressão de levedura para expressão na levedura S. cerevisiae,tal como pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123) e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vetores e métodos de vetores de construção adequados para uso em outros fungos tais como os fungos filamentosos, compreendem aqueles que são descritos em detalhes em van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P. J. (1991)

“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”, em Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., eds., pp 1 a 28, Cambridge University Press: Cambridge.

Vetores baculovírus disponíveis para expressar proteínas em células de insetos cultivadas (por exemplo, células Sf9) compreendem a série pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers, (1989) Virology 170: 31-39).

Vetores de expressão de plantas tais como aqueles descritos em detalhes em Becker, D., Kemper, E., Schell, J. e Masterson, R. (1992) “Yew plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; e Bevan, M. W. (1984) “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12: 8711- 8721,

Vetores de expressão de mamíferos tais como pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195.

Outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas são descritos nos capítulos 16 e 17 de Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

MICROORGANISMOS RECOMB INANTES

E possível produzir, com o auxílio dos vetores de acordo com a invenção, microorganismos recombinantes que tenham sido transformados, por exemplo, com pelo menos um vetor de acordo com a invenção e que possam ser empregados para produzir os polipeptídeos conforme a invenção. Vantajosamente, as construções recombinantes acima descritas de acordo com a invenção são introduzidas em um sistema hospedeiro adequado e expressas. Preferência é dada aqui ao uso de métodos de clonagem e de transfecção familiares ao técnico versado, tais como a co-precipitação, a fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção retroviral e outros, por exemplo, de modo a realizar a expressão doso referidos ácidos nucleicos no respectivo sistema de expressão. Sistemas adequados são descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, ou Sambrook et al., Molecular Cloning'. A Laboratory Manual, edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

De acordo com a invenção, é também possível produzir microorganismos homologamente recombinados. Com esta finalidade, é preparado um vetor que compreenda pelo menos um segmento de um gene de acordo com a invenção ou de uma sequência de codificação, dentro da qual opcionalmente pelo menos uma deleção, adição ou substituição de aminoácido tenha sido introduzida de modo a modificar, por exemplo funcionalmente romper (vetor “silenciado”), a sequência de acordo com a invenção. A sequência introduzida também pode ser, por exemplo, um homólogo de um microorganismo relacionado ou derivado de uma fonte de mamífero, levedura ou inseto. O vetor usado para recombinação homóloga pode alternativamente ser projetado de uma maneira tal que após a recombinação homóloga o gene endógeno seja alterado ou modificado de outro modo, mas ainda codifique a proteína funcional (por exemplo, a região reguladora de montante possa ter sido modificada de maneira tal que isto altere a expressão da proteína endógena). O segmento modificado do gene de acordo com a invenção se ache presente no vetor de recombinação homóloga. A construção de vetores adequados para recombinação homóloga é descrita, por exemplo, em Thomas, K. R. e Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Organismos hospedeiros adequados são, em princípio, quaisquer organismos que permitam que os ácidos nucleicos de acordo com a invenção, suas variantes alélicas, seus equivalentes funcionais ou derivados, sejam expressos. Organismos hospedeiros significam, por exemplo, células de bactérias, fungos, leveduras, plantas ou animais.

Exemplos não limitativos de organismos de expressão procariótica são o Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Corynebacterium glutamicum, e outros. Exemplos não limitativos de organismos de expressão eucariótica são as leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e outros, fungos filamentosos tais como Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei, Acremonium chrysogenum, e outros, células de mamíferos tais como as células HeLa, células COS, células CHO, e outras, células de insetos tais como as células Sf9, as células MEL e outras, plantas ou células de plantas tais como Solarium tuberosum, Nicotiana e outras.

Organismos transformados com sucesso podem ser selecionados por meio de genes marcadores que estejam da mesma forma presentes no vetor ou no cassete de expressão. Exemplos de tais genes marcadores são os genes para resistência a antibióticos e para enzimas catalisando uma reação de coloração que resulte no manchamento das células transformadas. A última mencionada pode então ser selecionada por meio de escolha automática das células. Os microorganismos transformados com sucesso com um vetor, que carreguem um gene de resistência a antibiótico apropriado (por exemplo, G418 ou higromicina), podem ser selecionados por meio de meios de cultura líquidos ou sólidos contendo antibióticos correspondentes. Proteínas marcadoras apresentadas sobre a superfície celular podem ser utilizadas para seleção por meio de cromatografia de afinidade.

7. PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE PROTEÍNAS PRECURSORAS E PEPTÍDEOS

Os peptídeos e proteínas precursoras usados de acordo com a invenção podem, em princípio, ser produzidos recombinantemente de uma maneira por si conhecida, que envolve cultivar um material orgânico produtor de peptídeo/proteína precursora opcionalmente induzindo a expressão dos referidos polipeptídeos e isolando estes últimos da cultura, Desta maneira, é também possível produzir os peptídeos e proteínas precursoras em uma escala industrial, se desejável.

O microorganismo recombinante pode ser cultivado e fermentado de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, as bactérias podem ser propagadas em meio TB ou LB e em 20 a 40 °C e em pH de 6 a 9. Condições de cultura adequadas são descritas em detalhes, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989).

A menos que os peptídeos ou as proteínas precursoras sejam secretadas dentro do meio de cultura, as células são então rompidas e o produto é recuperado do lisado por métodos de isolamento protéico conhecidos. As células podem opcionalmente ser rompidas por ultra-som de alta frequência, por alta pressão, por exemplo em uma célula de pressão francesa, por osmólise, pela ação de detergentes, enzimas líticas ou solventes orgânicos, por homogeneizadores, ou por combinação de uma pluralidade dos métodos listados.

Os peptídeos ou proteínas precursoras podem ser purificados com o uso de métodos cromatográficos conhecidos, tais como a cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), tal como a cromatografia Q-Sefarose, a cromatografia de troca de íons, e a cromatografia hidrofóbica, e por outros métodos comuns tais como ultrafiltração, cristalização, salting out, diálise e eletroforese em gel nativo. Métodos adequados são descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden (título original: The Tools of Biochemistry), Verlag Walter de Gruyter, Berlim, New York ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New Yorl, Heidelberg, Berlin.

Além disso, o peptídeo recombinante ou a proteína precursora podem ser isolados pelo uso de sistemas de vetor ou oligonucleotídeos que estendem o cDNA por sequências específicas de nucleotídeos e, portanto, codificam para polipeptídeos modificados ou proteínas de fusão que sejam usados para purificação mais simples, por exemplo. Exemplos de modificações adequadas desta espécie são “traçadores” agindo como âncoras, por exemplo a modificação conhecida como âncora de hexa-histidina, ou epítopos que possam ser reconhecidos como antígenos por anticorpos [descritos, por exemplo, em Harlow, E. e Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press], Estas âncoras podem ser usadas para fixar as proteínas a um suporte sólido, tal como, por exemplo, uma matriz polimérica que possa ser introduzida, por exemplo, em uma coluna cromatográfica ou possa ser usada sobre uma placa microtituladora ou outro suporte.

Ao mesmo tempo, estas âncoras podem também ser usadas para reconhecer as proteínas. As proteínas podem, além disso, ser reconhecidas pelo uso de marcadores comuns tais como os corantes fluorescentes, marcadores enzimáticos formando um produto de reação detectável após a reação de um substrato, ou marcadores radiativos, ou isolados ou em combinação ou referidas âncoras, de modo a derivar as proteínas.

Mais especificamente, as proteínas precursoras repetitivas são produzidas por expressarem sequências de genes sinteticamente preparadas que codifiquem para as proteínas precursoras repetitivas de acordo com a invenção. Uma preparação possível de sequências de genes sintéticos é descrita em Hummerich et al. Biochemistry 43; 13604-13612 (2004).

As proteínas precursoras repetitivas podem estar presentes na célula hospedeira em uma forma solúvel ou insolúvel. Em ambos os casos, as células são rompidas. Mais especificamente, o rompimento é realizado por meio de um homogeneizador de alta pressão em 1000 a 1500 bar. Com proteínas precursoras repetitivas solúveis, uma grande parte das proteínas celulares é precipitada pelo aquecimento do lisado até 60 a 100 °C, tal como 70 a 90 °C ou 75 a 85 °C, e removida da proteína precursora repetitiva solúvel por um método de separação adequado (por exemplo, sedimentação ou filtração). A proteína precursora repetitiva é então precipitada pela adição de um sal cosmotrópico (conforme descrito acima). As proteínas precursoras repetitivas formam associados estáveis no processo. Dependendo do associado, as concentrações finais dos sais cosmotrópicos adicionados podem variar e situam-se aproximadamente em uma faixa de cerca de 0,2 a 3 M ou, por exemplo, de 0,8 a 2 M. As concentrações ótimas podem ser determinadas de uma maneira simples familiar ao químico protéico.

Proteínas precursoras repetitivas podem também ser montadas sem um acionador externo. Neste caso, as proteínas precursoras repetitivas já se montam na célula hospedeira para dar os associados estáveis correspondentes. Após o rompimento das células, referidos associados são separados dos componentes solúveis por um método de separação adequado (por exemplo sedimentação ou filtração).

A remoção dos associados pode ser melhorada pela adição de precipitantes auxiliares após rompimento das células. Referidos precipitantes auxiliares causam outra coagulação dos associados, como um resultado do que as acelerações inferiores são requeridas para sedimentação, por exemplo, de modo a separar os associados do meio aquoso. Precipitantes auxiliares que podem ser usados são ácidos, lixívias, soluções poliméricas, em particular soluções aquosas de polímeros carregados. Exemplos de precipitantes auxiliares são o ácido fosfórico ou as soluções de polietilenoimina.

Os associados estáveis das proteínas precursoras repetitivas podem ser purificados ainda. Para este fim, as soluções nas quais os associados estáveis são insolúveis, mas outras contaminações são dissolvidas, são usadas para esta purificação. Mais especificamente, as soluções aquosas de bases, ácidos, uréia, sais e detergentes são usadas. Particularmente adequado é o uso de soluções de hidróxidos de metal alcalino, uréia, sais de guanidínio ou detergentes carregados tais como, por exemplo, os sais de alquiltrimetilamônio ou sulfatos de alquila. Mais especificamente, é feito uso de soluções de hidróxido de sódio de > 0,2 M, uréia de > 2 M, cloridreto de guanidínio de > 1 M, tiocianato de guanidínio de > 1 M ou > 0,1 % de dodecil sulfato de sódio ou > 0,1 % de brometo de cetiltrimetilamônio. Para purificação, os associados estáveis são colocados em suspensão nas soluções correspondentes e depois separados da solução por um método simples de separação (por exemplo, sedimentação ou filtração). As proteínas precursoras repetitivas são então lavadas com água e secadas com o uso de métodos familiares ao técnico versado.

A fim de recuperar os peptídeos das proteínas precursoras repetitivas, estas sequências devem ser clivadas fora das referidas proteínas precursoras e separadas das sequências auxiliares. A clivagem tem lugar nas sequências de clivagem presentes nas proteínas precursoras repetitivas. Métodos para clivagem específica das cadeias de aminoácidos são descrito na literatura. As proteínas precursoras repetitivas podem ser clivadas enzimática ou quimicamente. Exemplos de enzimas que podem ser usadas para especificamente clivar cadeias de aminoácidos são a Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, caspases, quimotripsina, clostripaína, enterocinase, fator Xa, glutamil endopeptidase, granzima B, LysC lisil endopeptidase {Achromobacter proteinase I), LysN Peptidil-Lys metaloendopeptidase, pepsina, prolina endopeptidase, proteinase K, Peptidase I Estafilocócica, termolisina, trombina, tripsina. Exemplos de produtos químicos que podem ser usados, para especificamente clivar cadeias de aminoácidos, são escatóis BNPS (2-(2’-nitrofenilsulfenil)-3-metil-3-bromoinolenina), bromociano, ácidos, hidroxilamina, ácido iodobenzóico, NTCB (ácido 2-nitro-5- tiocianobenzóico).

Mais especificamente, as proteínas precursoras repetitivas são clivadas quimicamente, por exemplo, por clivagem com hidroxilamina ou ácido. Qualquer ácido inorgânico ou orgânico tendo um pKs de menos do que 5 e mais do que 0, preferivelmente de menos do que 4 e de mais do que 1, é adequado para clivagem ácida. Mais especificamente, 1 a 5 % de ácido fosfórico ou 1 a 5 % de ácido fórmico são usados para a referida clivagem. Dependendo das condições da clivagem ácida, ou uma clivagem simples que ocorra entre os aminoácidos Asp e Pro ou Asp e Xxx, Xxx sendo qualquer aminoácido proteinogênico, ou primeiro uma divagem ocorra entre os aminoácidos Asp e Pro ou Asp e Xxx e depois o aspartato seja completamente clivado para fora do aminoácido N-terminalmente a montante do referido aspartato na sequência de aminoácidos do peptídeo.

A clivagem pode ser realizada com o uso da proteína precursora repetitiva purificada ou com o uso de uma fração celular que compreenda a proteína precursora repetitiva (por exemplo, componentes solúveis da célula hospedeira ou componentes insolúveis de uma célula hospedeira), ou com o uso de células hospedeiras intactas que compreendam a proteína precursora repetitiva. O agente de clivagem deve ser inativado após a clivagem. Métodos com esta finalidade são conhecidos do técnico versado.

Após a inativação, a mistura de reação de clivagem compreende, inter alia, o peptídeo desejado, sequências auxiliares separadas por clivagem e agentes de clivagem inativados. Nesta solução, os peptídeos podem já possuir sua atividade desejada. Se maior pureza for necessária, peptídeos liberados das proteínas precursoras repetitivas podem ser removidos das sequências auxiliares após clivagem. Uma vantagem das sequências auxiliares de auto-montagem é o fato de que referidas sequências auxiliares são montadas durante ou após a clivagem. Elas podem ou ser montadas espontaneamente durante a clivagem sob as condições de clivagem escolhidas, ou devido à adição de substâncias que suportem a montagem das referidas sequências auxiliares. Tais substâncias promotoras da montagem são, por exemplo, sais cosmotrópicos compreendendo pelo menos um tipo de íons que tenha mais propriedades cosmotrópicas do que os íons de sódio ou de cloreto, de acordo com a série de Hofmeister. Outras substâncias promotoras da montagem são os ácidos ou lixívias ou solventes orgânicos miscíveis com água, tais como os álcoois, por exemplo. As sequências auxiliares montadas podem ser removidas do peptídeo liberado solúvel por sedimentação ou filtração. Outras etapas de purificação podem ser necessárias de modo a remover as contaminações da proteína ou peptídeo remanescentes ou sais ou outras substâncias adicionadas durante ou após a clivagem do peptídeo desejado. Com esta finalidade, por exemplo, métodos cromatográficos, precipitações, diálise, extrações de duas fases e outros métodos familiares do técnico habilitado, podem ser empregados.

A solução contendo peptídeo pode, então, ser empregada diretamente para a aplicação desejada, ou a solução pode ser secada com o uso de métodos familiares ao técnico versado (por exemplo, secagem por pulverização ou secagem por congelamento) com o produto seco correspondente sendo usado.

Após secagem, é possível remover contaminações que não possam ser removidas do peptídeo, contanto que este último seja dissolvido em água, por lavagem com solventes nos quais o referido peptídeo seja insolúvel. Adequados para isto são os solventes orgânicos tais como, por exemplo, n-hexano, N-metilpirrolidona, ou misturas de solventes e ácidos tais como, por exemplo, misturas de n-hexano e ácido acético, ou ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, o ácido acético ou o ácido hexanóico. Para esta etapa de purificação, o peptídeo seco é recolocado em suspensão no solvente apropriado/mistura de solventes e depois removido novamente por sedimentação ou filtração. A mistura de solvente residual/solvente pode ser removida por secagem.

Os peptídeos desejados na forma obtida por clivagem podem ter a atividade desejada. Entretanto, pode também ser necessário ainda modificar os peptídeos após a clivagem. Por exemplo, o peptídeo pode ser amidado, esterificado, oxidado, alquilado ou quimicamente ligado a quaisquer moléculas. Exemplos de moléculas que podem ser usadas para tais modificações são álcoois, ésteres de cisteína alcoólica, ácidos carboxílicos, tioésteres ou maleimidas. Mais particularmente, as moléculas usadas para tais modificações são aquelas que aumentam a hidrofobicidade do peptídeo. Tais moléculas podem compreender radicais de alquila modificados ou não modificados, como definido acima. Tais moléculas preferivelmente compreendem radicais alquila C2-Ci6, em particular C6-Ci4. Métodos correspondentes são conhecidos do técnico versado. A modificação pode ser realizada em qualquer tempo: por exemplo diretamente após o rompimento celular, após a purificação da proteína precursora, após a clivagem da proteína precursora, ou após a purificação do peptídeo.

As soluções peptídicas tendo o grau desejado de pureza podem ser usadas diretamente. Alternativamente, diferentes métodos de preservação podem ser aplicados para armazenagem de prazo mais longo. Exemplos de métodos de preservação citam-se o esfriamento, congelamento, a adição de preservativos. Altemativamente, os peptídeos podem ser secados. Exemplos de métodos de secagem são a liofilização ou a secagem por pulverização. Os peptídeos secos podem então ser armazenados. A fim de usar os peptídeos, a substância secada é dissolvida em um solvente adequado, preferivelmente uma solução aquosa. Referida solução aquosa pode compreender sais ou substâncias tampão ou nenhuma outra adição.

8. DEFINIÇÃO DOS VÁRIOS OUTROS TERMOS GERAIS

A menos que de outra forma estabelecido, uma sequência “derivada” de uma sequência especificamente apresentada ou a ela “homóloga”, por exemplo uma sequência derivada de aminoácido ou ácido nucleico, significa, de acordo com a invenção, uma sequência que seja pelo menos 80 %, ou pelo menos 90 %, em particular 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % e 99 %, idêntica à sequência de partida.

SEÇÃO EXPERIMENTAL

A aplicabilidade universal do método descrito na presente invenção, de produzir quaisquer sequências de peptídeos (Pep), é demonstrada com base na produção de três peptídeos com sequências diferentes e composições de aminoácidos (ZnO, PI8, Min).

A menos que de outra forma estabelecido, métodos padrão de análise orgânica e bioquímica e de produção recombinante de proteínas e cultivo de microorganismos, são usados.

EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DO PEPTÍDEO ZnO (SEQ ID NO: 20).

O peptídeo ZnO é um peptídeo derivado de uma sequência publicada, que influencia a formação de partículas de óxido de zinco [Umetsu et al. Adv. Mat. 17: 2571-2575 (2005)]. Um gene sintético, ZnO4 (SEQ ID NO: 21), foi clonado no vetor pAZL, descrito em Hummerich et al. Biochemistry 43, 13604-13612 (2004), com o uso das endonucleases de restrição BamHI e Hindlll, e dimerizado de acordo com o protocolo ali 5 descrito, e clonado no vetor pET21 (Novagen). A sequência se acha subsequentemente presente no referido vetor e codifica para a proteína precursora repetitiva ZnO8 (SEQ ID NO: 22). Referida proteína precursora repetitiva compreende 8 repetições, cada uma das quais compreende uma cópia do peptídeo ZnO e uma sequência auxiliar. Referida sequência auxiliar 10 compreende uma sequência de poli-alanina e comunica propriedades de auto- montagem à proteína precursora repetitiva. Os aminoácidos Asp-Pro que se pretende permitam que o peptídeo ZnO seja seletivamente separado por clivagem da proteína precursora com o uso de ácidos, são localizados entre as sequências auxiliares e as sequências de peptídeos. A expressão foi realizada 15 na cepa E. coZz’BL21 [DE3] (Novagen).

O cultivo e a síntese protéica foram realizados em pO2>20 % e pH = 6,8 em um processo de batelada alimentada. MEIO:

SOLUÇÃO SALINA DE TRAÇO

SOLUÇÃO DE ALIMENTAÇÃO

Após o glicerol presente no meio básico ter sido exaurido, uma alimentação constante em uma taxa de 100 ml/h foi iniciada.

A síntese protéica foi induzida pela adição de isopropil β-D- tiogalactopiranosídeo 1 mM após a cultura bacteriana ter alcançado uma densidade óptica de OD600 = 60. Neste ponto, a temperatura da cultura foi reduzida de 37 °C a 30 °C. As células foram colhidas 5 horas após a indução. ZnO8 foi purificado de acordo com o seguinte protocolo: - Recolocação em suspensão da pelota celular em 5 ml de MOPS [3-(ácido (N-morfolino)propanossulfônico] 20 mM, pH 7,0, por grama de massa úmida. - Rompimento das células em um homogeneizador de alta pressão em 1400 bar. - Centrifugação, 30 minutos em 5000xg. - Incubação do sobrenadante, 30 minutos em 80 °C. - Centrifugação, 30 minutos em 5000xg. - Precipitação de ZnCfi do sobrenadante pela adição de sulfato de amónio 1,8 M (concentração final) em 4 °C durante a noite. - Lavagem da pelota com uréia 8 M. - 2 x lavagem da pelota com água. - Liofilização - O ZnO8 liofilizado foi levado a -20 °C.

De cada litro de meio de cultura, 2,2 g de ZnO8 puro foram recuperados.

Para a clivagem, 250 mg da proteína precursora de ZnO8 liofilizada foram recolocados em suspensão em 5 ml de ácido fórmico a 1 % e incubados em 90 °C por 6 horas. Durante esta incubação o liofilizado foi dissolvido, resultando em uma substância como gel. Após o esfriamento até a temperatura ambiente, a substância como gel foi removida dos componentes solúveis por sedimentação em 18000 x g. A solução remanescente foi neutralizada com NaOH 2 M. A solução foi então liofilizada. O liofilizado compreendia o produto de clivagem desejado e o formiato de sódio da neutralização do ácido fórmico.

O produto liofilizado foi analisado por meio de HPLC: com esta finalidade, o produto foi dissolvido em uma concentração de 1 mg/ml em água e analisado com o uso de uma coluna cromatográfica de fase reversa (Júpiter Proteo 4,6 x 250 mm; Phenomenex). O eluente usado foi 0,1 de ácido trifluoroacético em água, o qual foi substituído com 0,1 % de ácido trifluoroacético em acetonitrila, com o uso de um gradiente linear. A detecção foi realizada em 206 nm (Figura 2). Para outra análise, as frações do pico principal foram coletadas e a substância nelas presentes foi estudada novamente. A sequenciação N-terminal confirmou que este componente era o peptídeo de ZnO. Estudos por meio de espectrometria de massa (MALDI- TOF) estabeleceram uma massa de 2002, que era idêntica à massa teórica do peptídeo de ZnO (Figura 3). A análise de HPLC revelou uma pureza de 62 % com base nos componentes ativos em UV.

EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DO PEPTÍDEO PI8 (SEQ ID NO: 23)

O peptídeo P18 é um peptídeo derivado de uma sequência de peptídeos antimicrobianos altamente ativos descrita por Shin et al. J. Peptide Res. 58: 504-514 (2001). Um gene sintético, AHeAP182 (SEQ ID NO: 24), foi clonado no vetor pAZL descrito em Hummerich et al. Biochemistry 43; 13604-13612 (2004) com o uso das endonucleases de restrição BamHI e HindIII, e dimerizado de acordo com o protocolo ali descrito, e clonado no vetor pET21 (Novagen). A sequência subsequentemente presente no referido vetor codifica para a proteína precursora repetitiva AHeAPlδ, (SEQ ID NO: 25). Referida proteína precursora repetitiva compreende 4 repetições, cada uma das quais compreende uma cópia do peptídeo PI8 e uma sequência auxiliar. Referida sequência auxiliar compreende duas sequências de poli- alanina e comunica propriedades de auto-montagem à proteína precursora repetitiva. Além disso, a sequência auxiliar compreende uma sequência protetora helicoidal negativamente carregada. Os aminoácidos Asp-Pro que se pretende sejam capazes de permitir que o peptídeo PI8 seja seletivamente excluído por clivagem da proteína precursora pelos ácidos, são localizados entre as sequências auxiliares e as sequências de peptídeo PI8. A expressão foi realizada na cepa £. coli BL21 (DE3) (Novagen).

O cultivo e a síntese protéica foram realizados em um processo de batelada alimentada em pO2 > 20 % e pH = 6,8. O meio, a solução salina de traço e a solução de alimentação tinham a composição descrita no Exemplo 1.

Após o glicerol presente no meio básico ter sido exaurido, uma alimentação constante em um índice de 100 ml/h foi iniciada.

A síntese protéica foi induzida pela adição de isopropil β-D- tiogalactopiranosídeo 1 mM, após a cultura bacteriana ter alcançado uma densidade óptica de OD60o = 60. 10 horas após a indução, as células foram colhidas por sedimentação em 5000 x g por 30 minutos. A biomassa úmida foi de 1932 g.

A biomassa úmida foi purificada de acordo com o seguinte protocolo: - Recolocação em suspensão da pelota celular: para cada grama de biomassa, 6 g de tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 7,5) foram adicionados e misturados completamente. - Rompimento das células em um homogeneizador de alta pressão em 1500 bar. - Adição de ácido fosfórico em pH = 3 ± 0,5. - Incubação de 10 minutos em 23 °C com agitação. - Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 x g. - Recolocação em suspensão da pelota: para cada g de massa úmida, adicionar 25 ml de NaOH 0,2 M, homogeneizar e incubar com agitação em 23 °C por 4 horas. - Neutralização: ajustar o pH de 8,5 ± 0,5 com H3PO4 de 85 % de potência. - Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg. - A pelota consistindo de corpos de inclusão lavados contendo a proteína precursora PI8 foi hidrolisada ou clivada por meio de H3PO4 de 2 % de potência.

Condições de clivagem: i. usar 5 ml de H3PO4 para cada grama de pelota ii. homogeneizar iii. incubar com agitação em 90 °C por 16 horas. - Deixar a mistura de reação de clivagem esfriar. - Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg - Neutralização: ajustar o pH de 5,5 ± 0,5 com NaOH 10 M - Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg - Diluir o sobrenadante com água até a condutividade de menos do que 10 mS/cm. - Purificar o PI8 do sobrenadante através de cromatografia de troca de cátions (Fractogel COO; Merck), eluição com NaCl 450 mM. - Acumular frações contendo peptídeo e diluir com água até que a condutividade seja de menos do que 10 mS/cm. - Purificar P18 das frações acumuladas através de cromatografia de troca de cátions (Fractogel COO; Merck); eluição com HC1 50 mM; - O eluato foi neutralizado com NaOH 2 M. - A solução neutralizada foi liofilizada.

O produto liofilizado foi analisado por meio de HPLC: para isto, o produto foi dissolvido em uma concentração de 1 mg/ml em água e analisado com o uso de uma coluna cromatográfica de fase reversa (Jupiter Proteo 4,6 x 250 mm; Phenomenex). O eluente usado foi o ácido trifluoroacético 0,1 % em água, o qual foi substituído por ácido trifluruoacético 0,1 % em acetonitrila, com o uso de um gradiente linear. A detecção foi realizada em 280 nm (Figura 4). Para outra análise, as frações do pico principal foram coletadas e a substância nele presente foi novamente estudada. A sequenciação N-terminal confirmou que este componente é o peptídeo PI8.

Estudos por meio de espectrometria de massa (MALDI-TOF) estabeleceram uma massa de 2512 para o peptídeo, a qual é idêntica à massa teórica do peptídeo PI8 (Figura 5). A análise de HPLC revelou uma pureza de 85 % com base nos componentes ativos em UV. De 30 g de biomassa úmida, 52 mg de peptídeo PI8 foram obtidos. Portanto, aproximadamente 330 mg de peptídeo PI8 puro puderam ser recuperados de cada litro de cultura de fermentação.

Para pesquisar a atividade do peptídeo Pl8, culturas de E. coli B em meio LB (5 g/litro de extrato de levedura, 10 g/litro de triptona, 5 g/litro de cloreto de sódio), cujas culturas tinham uma densidade óptica de 0,1 medida em 600 nm, foram incubadas com agitação em 37 °C com diferentes concentrações do peptídeo PI8. O crescimento bacteriano foi monitorado medindo-se a densidade óptica após 24 horas. A inibição completa do crescimento (densidade óptica em 600 nm após 24 horas <0,15) foi obtida em uma concentração de peptídeo de 31 ppm. Foi possível melhorar a atividade antimicrobiana ainda pela amidação do grupo carboxila C-terminal. Para isto, referidos grupos carboxila foram ativados com cloridreto de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida e N-hidróxi-sulfossuccinimida, e amidados pela subsequente adição de amónia.

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE PEPTÍDEO MIN (SEQ ID NO: 26)

Um gene sintético, AEMin4 (SEQ ID NO: 27), foi clonado no vetor pAZL, descrito em Hummerich et al. Biochemistry 43; 13604-13612 (2004), com o uso das endonucleases de restrição BamHI e HindIII e dimerizado de acordo com o protocolo ali descrito, e clonado no vetor pET21 (Novagen). A sequência subsequentemente presente no referido vetor codifica para a proteína precursora repetitiva AEMin8 (SEQ ID NO: 28). Referida proteína precursora repetitiva compreende 8 repetições, cada das quais compreende uma cópia do peptídeo Min e uma sequência auxiliar. A sequência auxiliar compreende uma sequência de polialanina e comunica propriedades de auto-montagem à proteína precursora repetitiva. A sequência auxiliar, além disso, compreende uma sequência protetora negativamente carregada. Os aminoácidos Asp-Pro, que se pretende possibilite que o peptídeo PI 8 seja seletivamente separado por clivagem da proteína precursora com o uso de ácidos, são localizados entre as sequências auxiliares e as sequências de peptídeos. A expressão foi realizada na cepa E. coli BL21 (DE3) (Novagen).

O cultivo e a síntese protéica foram realizados em um processo de batelada de alimentação em pO2 > 20 % e pH 6,8. O meio, a solução salina de traço e a solução de alimentação tiveram a composição descrita no Exemplo 1.

Após o glicerol presente no meio básico ter sido exaurido, uma alimentação constante em um índice de 100 ml/hora foi iniciada.

A síntese protéica foi induzida pela adição de isopropil β-D- tiogalactopiranosídeo 1 mM, após a cultura bacteriana ter alcançado uma densidade óptica de OD600 = 60. Neste ponto, a temperatura da cultura foi reduzida de 37 °C para 30 °C. As células foram colhidas 5 horas após a indução.

AEMin8 foi purificado de acordo com o seguinte protocolo:

Re-suspensão da pelota células em 5 ml de MOPS [ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico] 20 mM, pH 7,0, por grama de massa úmida.

Rompimento das células em um homogeneizador de alta pressão em 1400 bar.

Centrifugação, 30 minutos em 5000 xg.

Incubação do sobrenadante, 20 minutos em 80 °C. Centrifugação, 30 minutos em 5000 xg. Precipitação de AEMin8 do sobrenadante pela adição de sulfato de amónio 2 M (concentração final) em 4 °C durante a noite. Lavagem da pelota com uréia 8 M. 2 x lavagem da pelota com água. Liofilização

O AEMin8 liofilizado foi levado a -20 °C.

De cada litro de meio de cultura, 0,4 g de AEMin8 puro foi recuperado.

Para clivagem, 250 mg da proteína precursora AEMin8 liofilizada foram recolocados em suspensão em 12,5 ml de ácido fosfórico a 1 % e incubados em 90 °C por 8 horas. Após esfriar até a temperatura ambiente, as substâncias insolúveis foram removidas dos componentes solúveis por sedimentação em 18000 x g. A solução remanescente foi neutralizada com NaOH 2 M. A solução foi então liofilizada. O liofilizado compreendeu o produto de clivagem desejado e fosfato hidrogenado de sódio da neutralização do ácido fosfórico.

O produto liofilizado foi analisado por meio de HPLC: para isto, o produto foi dissolvido em uma concentração de 1 mg/ml em água e analisado com o uso de uma coluna cromatográfíca de fase reversa (Jupiter Proteo 4,6 x 250 mm; Phenomenex). O eluente usado foi ácido trifluoroacético 0,1 % em água, que foi substituído por 0,1 % de ácido trifluoroacético em acetonitrol, com o uso de um gradiente linear. A detecção foi realizada em 206 nm (Figura 6). Para outra análise, as frações do pico principal foram coletadas e a substância nele presente foi estudada novamente. A sequenciação N-terminal confirmou que o componente é o peptídeo Min. Estudos por meio de espectrometria de massa do peptídeo (MALDI-TOF) estabeleceram uma massa de 1900, que é idêntica à massa teórica do peptídeo Min (Figura 7). A análise de HPLC revelou uma pureza de 68 % com base nos componentes ativos em UV.

EXEMPLO 4 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DO PEPTÍDEO PI8 (SEQ ID NO: 23)

De modo a aumentar a produção do peptídeo P18 do Exemplo 2, a influência de diferentes sequências Aux sobre a produção de peptídeos foi estudada. A expressão e o rendimento global foram marcadamente aumentados com o uso do gene sintético AHe2AP182 (SEQ ID NO: 74), que, após a clonagem no vetor pET21 de acordo com o Exemplo 2, codifica para a proteína precursora tendo a SEQ ID NO: 75. A fermentação foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 2.

A biomassa úmida foi purificada de acordo com o seguinte protocolo:

Recolocação em suspensão da pelota celular: para cada grama de biomassa, 6 g de água foram adicionados e misturados completamente.

Rompimento das células em um homogeneizador de alta pressão em 1500 bar.

Adição de ácido fosfórico até pH = 3 ± 0,5. minutos de incubação em 23 °C com agitação. Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg.

Recolocação da pelota em suspensão: para cada grama de massa úmida, adicionar 20 ml de NaOH 0,4 M, homogeneizar e incubar com agitação em 23 °C por 1 hora.

Neutralização: ajustar o pH de 8,5 ± 0,5 com também de fosfato de potássio 1 M em pH 6,0.

Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg.

A pelota consistindo de corpos de inclusão lavados compreendendo a proteína precursora PI 8 foi hidrolisada ou clivada por meio de H3PO4 com 2 % de potência.

Condições de clivagem: i. usar 7 ml de H3PO4 para cada grama de pelota ii. homogeneizar iii. incubar com agitação em 90 °C por 16 horas. Deixar a mistura de reação de clivagem esfriar. Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg Ajustar o pH de 4,0 ± 0,5 com NaOH 25 % Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg.

Diluir o sobrenadante com água até a condutividade de menos do que 30 mS/cm.

Purificar PI8 do sobrenadante através de cromatografia de troca de cátions (SP-Sepharose High Performance, GE Healthcare); tampão de lavagem: tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4 + NaCl 450 mM; tampão de eluição: tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4 ± NaCl 1100 mM.

Precipitação de peptídeo pela adição de NaOH 25 % ao eluato até pH = 10,5 ± 0,3.

Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg.

Recolocação em suspensão da pelota em 5 ml de água para cada grama da massa úmida. Dissolução do peptídeo: adição do ácido acético até pH 6,0 pH - 10,5 ±0,5. Liofilização

De cada litro de cultura de fermentação, aproximadamente 1 g de peptídeo PI8 puro pode ser obtido na forma descrita.

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DO PEPTÍDEO DA SEQ ID NO: 6

Os peptídeos listados nos Exemplos 1 a 4 foram originados da proteína precursora repetitiva por clivagem acídica. Isto envolve a hidrólise da ligação de peptídeos entre um aspartato e uma prolina. Consequentemente, como mostrado no Exemplo 1, a sequência de peptídeos inicia N- terminalmente com uma prolina e termina C-terminalmente com um aspartato. Sob certas circunstâncias, o aspatato C terminal, como mostrado nos Exemplos 2 e 3, pode da mesma forma ser separado por clivagem, por esse meio permitindo a produção das sequências de peptídeos com uma sequência C-terminal de livre escolha.

O peptídeo que tem a SEQ ID NO: 6 foi produzido de modo a demonstrar que o método da invenção pode também ser usado para produzir peptídeos cujo término N não se inicie com uma prolina, mas com o primeiro aminoácido N-terminal do qual pode ser escolhido livremente. Para isto, a proteína precursora tendo a SEQ ID NO: 77 foi produzida com o uso do gene sintético AHe2AP182-P-G (SEQ ID NO: 76), de acordo com o Exemplo 4. Esta proteína precursora difere da proteína precursora de SEQ ID NO: 75 do Exemplo 4 apenas no fato de que os aminoácidos N-terminais do peptídeo PI8, Pro-Gly, e o Gly C-terminal foram deletados. A clonagem e a fermentação foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 4.

A biomassa úmida foi purificada de acordo com o seguinte protocolo:

Recolocação em suspensão da pelota celular: para cada grama da biomassa, 6 gramas de água foram adicionados e completamente misturados. Rompimento das células em um homogeneizador de alta pressão em 1500 bar. Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg

A pelota consistindo de corpos de inclusão contendo a proteína precursora PI8 foi hidrolisada ou clivada por meio de H3PO4 de 5 % de potência.

Condições de clivagem: i. usar 5 ml de H3PO4 para cada grama de pelota. ii. homogeneizar iii. incubar com agitação em 90 °C por 16 horas Deixar a mistura de reação da clivagem esfriar Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg Ajustar o pH de 4,0 ± 0,5 com 25 % de NaOH Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg Diluir o sobrenadante com água até condutividade de menos do que 30 mS/cm

Purificar peptídeo do sobrenadante através de cromatografia de troca de cátions (SP-Sepharose Fligh Performance; GE Healthcare); tampão de lavagem: tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4 + NaCl 450 mM; tampão de eluição: tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4 + NaCl HOOmM. Precipitação do peptídeo pela adição de NaOH 25 % ao eluato até pH = 10,5 ± 0,3 Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg Recolocação em suspensão da pelota em 5 ml de água para cada grama de massa úmida Dissolução do peptídeo pela adição de ácido acético até pH = 6,0 ± 0,5 Liofilização

O produto liofilizado foi analisado por meio de HPLC. Para isto, o produto foi dissolvido em uma concentração de 1 mg/ml em água e analisado com o uso de uma coluna cromatográfica de fase reversa (Jupiter Proteo 4,6 x 250 mm; Phenomenex). O eluente usado foi o ácido trifluoroacético 0,1 % em água, o qual foi substituído por ácido trifluruoacético 0,1 % em acetonitrila, com o uso de um gradiente linear. A detecção foi realizada em 280 nm (Figura 8). Para outra análise, as frações do pico principal foram coletadas e a substância nele presente foi novamente estudada. Os estudos usando a espectrometria de massa (MALDI-TOF) revelaram uma massa de 2300,6 para o peptídeo, que é igual à massa teórica do peptídeo da SEQ ID NO: 6 (Figura 9).

EXEMPLO 6 AMIDAÇÃO DO PEPTÍDEO LIOFILIZADO PI 8 (SEQ ID NO: 23)

Em alguns casos, pode ser vantajoso para a atividade de um peptídeo que o término C seja amidado ao invés de ser um grupo carboxila livre. Para demonstrar este fato, o peptídeo PI8 liofilizado do Exemplo 4 foi amidado de acordo com o protocolo abaixo: 0 10 mg/ml de peptídeo P18 0 30 % de EtOH 0 Cloreto de amónio 3 M 0 N-hidroxissuccinimida 2,5 mM 0 1 -etil-3 -(3 -dimetilaminopropil)carbodiimida 0 Incubação por 2 horas na temperatura ambiente 0 Neutralização com NaOH, pH 7,0

A amostra amidada foi analisada por HPLC com o uso de uma coluna cromatográfica Luna SCX 5μ 100A (Phenomenex, Torrance, CA, USA): o eluente usado foi KH2PO4 20 mM pH 2,5 com acetonitrila a 25 %, o qual foi substituído por KH2PO4 20 mM pH 2,5, acetonitrila a 25 % e KC1 1 M, com o uso de um gradiente linear. A detecção foi realizada em 280 nm (Figura 10). A Figura 10 apresenta, para comparação, o cromatograma de um peptídeo de referência quimicamente sintetizado e amidado com a sequência do peptídeo “PI8” (produzido por encomenda pela Bachem AG, Bubendorf, Suíça).

O peptídeo foi purificado ainda por cromatografia de troca de cátions como descrito no Exemplo 4.

EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DO PEPTÍDEO PI8 (SEQ ID NO 23) COM AMIDAÇÃO INTEGRADA

Para melhorar a eficácia de custo da produção do peptídeo PI8 amidado, a amidação foi integrada no procedimento de processamento ao invés de realizada após a purificação de um peptídeo, como descrito no Exemplo 6. Para isto, a proteína precursora SEQ ID NO: 75 foi obtida por fermentação de acordo com o Exemplo 4,e o peptídeo foi liberado da proteína precursora por clivagem acídica. Subsequentemente, as seguintes etapas foram realizadas:

Deixar esfriar a mistura de reação da clivagem.

Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg Ajustar pH de 10,5 ± 0,5 com NaOH 25 % Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg Dissolver a pelota em 3 ml de etanol para cada grama de massa úmida Centrifugar; determinação do peptídeo no sobrenadante (diluindo)

Mistura dos seguintes componentes: a. 12,5 ml de peptídeo dissolvido em etanol b. 4,2 ml de água c. Adição de 400 μl de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico 500 mM d. Ajustar a pH 5,0 com HC1. e. Adição de 2,14 g de cloreto de amónio f. 200 μl de N-hidroxissuccinimida 500 mM g. 1 ml de 1 MY de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida Incubação por 2 horas na temperatura ambiente

Diluir a mistura com água até condutividade de menos do que 30 mS/cm

Purificar o peptídeo PI8 modificado através de cromatografia de troca de cátions (SP-Sepharose High Performance, GE Healthcare); tampão de lavagem: tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4 + NaCl 450 mM; tampão de eluição: tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4 + NaCl 1100 mM.

Precipitação de peptídeo pela adição de NaOH 25 % ao eluato atépH= 10,5 ±0,3.

Centrifugação: 20 minutos, pelo menos 5000 xg.

Recolocação em suspensão da pelota em 5 ml de água para cada grama da massa úmida.

Dissolução do peptídeo: adição do ácido acético até pH 6,0 ± 0,5. Liofilização

A amostra amidada foi analisada por HPLC com o uso de uma coluna cromatográfica Luna SCX 5μ 100A (Phenomenex, Torrance, CA, USA).

O eluente usado foi KH2PO4 20 mM pH 2,5 com acetonitrila a 25 %, o qual foi substituído por KH2PO4 20 mM pH 2,5, acetonitrila a 25 % e KC1 1 M, com o uso de um gradiente linear. A detecção foi realizada em 280 nm (Figura 11). A Figura 11 apresenta, para comparação, o cromatograma de um peptídeo de referência quimicamente sintetizado e amidado com a sequência do peptídeo “PI8” (pr°duzido por encomenda pela Bachem AG, Bubendorf, Suíça).

VISTA GERAL DAS SEQUÊNCIAS DE ACORDO COM A INVENÇÃO

Sequência - Nome Tipo - helicoidal - construção de ZnO4 - peptídeo precursor - construção de AheAP182 - peptídeo precursor AheAP184 - ZnO curto - SU não helicoidal - Min curto construção de AHe2AP 18-P-G2

Além das sequências de aminoácidos Pep específicas acima descritas, as sequências listadas podem ser alteradas para C-terminalmente e/ou N- terminalmente devido à adição de sequências de clivagem específicas (por exemplo, entre os resíduos “DP” quanto a uma clivagem acídica, ou entre os resíduos “NG” quanto a uma clivagem de hidroxilamina) ou devido aos resíduos de aminoácidos remanescentes resultantes de tais clivagens. Opcionalmente, um resíduo espaçador tal como, por exemplo, um resíduo G, pode também adicionalmente ser introduzido entre a sequência de clivagem e as sequências Pep. Menção particular deve ser feita das seguintes alterações às sequências Pep acima, que podem resultar da clivagem acídica ou de hidroxilamina das sequências Pep produzidas de acordo com a invenção: N-terminalmente: adição de um resíduo PG; P ou G; C-terminalmente: adição de um resíduo GD; GN; G; N; ou D; Tais alterações se aplicam, em particular, a cada uma das 5 sequências Pep acima, em particular aquelas das SEQ ID NO: 6 a 15, 29 a 67, e 72. Referência é explicitamente feita à descrição da literatura aqui citada.

Claims

1. Proteína precursora, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência repetitiva clivável de elementos de peptídeo (Pep) desejados e elementos de peptídeo (Aux) auxiliares da fórmula geral (Pep-Aux)x ou (Aux-Pep)x onde x > 1, em que os elementos Aux são idênticos ou diferentes e compreendem elementos de sequências de aminoácidos que provêm à referida proteína precursora propriedades de auto-montagem, em que um ou mais do que um elemento Aux compreende um peptídeo de auto-montagem elemento (SA), compreendendo um ou mais dos seguintes motivos de sequência: An (motivo 1) (GA)m (motivo 2) Vn (motivo 3) (VA)m (motivo 4) (VVAA)o (motivo 5) em que A é alanina, G é glicina, V é valina, “n” é um número inteiro de 8 a 12, “m” é um número inteiro de 4 a 10, e “o” é um número inteiro de 2 a 6; e os elementos Pep são idênticos ou diferentes e compreendem a sequência de aminoácidos de moléculas de peptídeos idênticas ou diferentes tendo um comprimento de sequência de 5 a 70 resíduos de aminoácidos, e os elementos Pep são flanqueados por sequências de clivagem que permitem os elementos Pep serem clivados especificamente fora da proteína precursora, em que os elementos Pep e Aux são peptidicamente ligados entre si e a ligação peptídica é especificamente clivável química ou enzimaticamente.

2. Proteína precursora de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que forma associados estáveis que não podem ser dissolvidos na temperatura ambiente por NaOH 0,2 M dentro de uma hora, ou por uréia 2 M ou cloridreto de guanidínio 1 M dentro de 10 minutos.

3. Proteína precursora de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o elemento SA compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 73.

4. Proteína precursora de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que um ou mais do que um peptídeo Aux adicionalmente compreende um elemento de peptídeo protetor (SU) tendo uma proporção aumentada de resíduos de aminoácidos negativamente carregados.

5. Proteína precursora de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o elemento SU na proteína precursora é capaz de formar uma estrutura helicoidal anfifílica.

6. Proteína precursora de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o elemento SU é um peptídeo anfifílico que compreende um segmento de sequência de sete ou mais aminoácidos peptidicamente ligados capazes de formar uma alfa-hélice anfifílica, em que os resíduos de aminoácidos da referida hélice em sua projeção vertical são separados em uma metade hidrofóbica e uma metade hidrofílica da hélice, a metade hidrofóbica da hélice tendo 3 ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos adjacentes (na projeção vertical) idênticos ou diferentes, e a metade hidrofílica da hélice tendo 3 ou mais resíduos de aminoácidos hidrofílicos adjacentes (na projeção vertical) idênticos ou diferentes.

7. Proteína precursora de acordo com as reivindicações 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que a proporção dos resíduos de aminoácidos carregados do elemento SU é escolhida de tal modo que a carga líquida global da proteína precursora em pH = 7 seja mais elevada do que -10 e mais baixa do que +10.

8. Proteína precursora de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7, caracterizada pelo fato de que o elemento SU compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 68.

9. Proteína precursora de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o elemento Pep compreende uma sequência de peptídeo antimicrobiano catiônico.

10. Proteína precursora de acordo com reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o elemento Pep compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos catiônicos SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 72.

11. Proteína precursora de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o elemento Pep compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 29 a SEQ ID NO: 67.

12. Proteína precursora de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os elementos Aux independentemente um do outro têm qualquer dos seguintes significados: SA, SA-SU, SU-SA, SA-SU-SA, SU-SA-SU, em que os elementos SA e SU são peptidicamente ligados entre si, e os elementos Aux são peptidicamente ligados de forma terminal a um ou mais do que um elemento Pep, e esta ligação peptídica aos elementos Pep é especificamente clivável química ou enzimaticamente.

13. Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequência de codificação de sequências SEQ ID NOs: 21, 24, 27, 74 e 76.

14. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 13, operativamente ligada a uma ou mais sequência de ácido nucleico reguladora.

15. Vetor recombinante para transformar um hospedeiro eucariótico ou procariótico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definido na reivindicação 13, ou um cassete de expressão como definido na reivindicação 14.

16. Método para produzir um peptídeo desejado (Pep), o método caracterizado pelo fato de que compreende: a) produzir uma proteína precursora como definida em qualquer das reivindicações 1 a 12, e b) remover os peptídeos Pep da proteína precursora.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora é produzida em um microorganismo recombinante que carrega um ou mais vetor como definido na reivindicação 15.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora é produzida em uma cepa de E. COLI recombinante.

19. Método de acordo com qualquer das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora expressa, opcionalmente após ter sido convertida em uma forma estavelmente associada, é purificada e clivada química ou enzimaticamente para liberar o peptídeo desejado (Pep).

20. Proteína precursora, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência clivável de elementos de peptídeos desejados (Pep) e elementos de peptídeos auxiliares (Aux’) da fórmula geral: (Pep-Aux’)x ou (Aux’-Pep)x onde x > 1, em que os elementos Aux’ são idênticos ou diferentes e compreendem um peptídeo anfifílico formador da alfa-hélice, referido peptídeo anfifílico compreendendo um segmento de sequência sete ou mais aminoácidos peptidicamente ligados capazes de formar uma alfa-hélice anfifílica, em que os resíduos de aminoácidos da referida hélice em sua projeção vertical são separado em uma metade hidrofóbica e uma metade hidrofílica da hélice, a metade hidrofóbica da hélice tendo 3 ou mais do que 3 resíduos de aminoácidos hidrofóbicos adjacentes (na projeção vertical) idênticos ou diferentes, e a metade hidrofílica da hélice tendo 3 ou mais do que 3 resíduos de aminoácidos hidrofílicos adjacentes (na projeção vertical) idênticos ou diferentes; e os elementos Pep são idênticos ou diferentes e compreendem a sequência de aminoácidos de moléculas peptídicas idênticas ou diferentes tendo um comprimento de sequência de 5 a 70 resíduos de aminoácidos, e os elementos Pep são flanqueados por sequências de clivagem que permitem os elementos Pep serem clivados especificamente fora da proteína precursora quimicamente ou enzimaticamente, e em que Pep é um peptídeo antimicrobiano catiônico, e Aux’ é um peptídeo aniônico que forma uma alfa-hélice anfifílica.

21. Proteína precursora de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que os elementos Aux’ compreendem um ou mais elemento de peptídeo de auto-montagem (SA) conforme definido em qualquer das reivindicações 1 e 3.

22. Proteína precursora de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que Pep tem a seguinte sequência: X1 X2K X3 X4 X5KIP X11 X12 KFX6X7 X8 AX9KF (SEQ ID NO: 8) no qual X1 é lisina, arginina ou fenilalanina, X2 é lisina ou triptofano, X3 é leucina ou lisina, X4 é fenilalanina ou leucina, X5 é leucina ou lisina, X6 é leucina ou lisina, X7 é histidina ou lisina, X8 é alanina, leucina, valina ou serina, X9 é leucina ou lisina, X11 é prolina ou uma ligação química, e X12 é prolina ou uma ligação química, e em que Aux’ é selecionado de SEQ ID NO: 16, 17, 18 ou 19.

23. Uso de um peptídeo anfifílico, caracterizado pelo fato de ser como peptídeo protetor para produzir recombinantemente um peptídeo antimicrobiano desejado dele diferente, em que o referido peptídeo anfifílico compreende uma seção de sequência de sete ou mais aminoácidos peptidicamente ligados capazes de formar uma alfa-hélice anfifílica, em que os resíduos de aminoácido da referida hélice em sua projeção vertical são separados em uma metade hidrofóbica e uma metade hidrofílica da hélice, a metade hidrofóbica da hélice tendo 3 ou mais resíduos hidrofóbicos de aminoácidos adjacentes idênticos ou diferentes (na projeção vertical), e a metade hidrofílica da hélice tendo 3 ou mais resíduos adjacentes (na projeção vertical) de aminoácidos hidrofílicos idênticos ou diferentes, em que o peptídeo desejado (Pep) é um peptídeo antimicrobiano catiônico tendo um comprimento de sequência de 5 a 70 resíduos de aminoácidos, e o elemento Aux’ é um peptídeo aniônico que forma uma alfa-hélice anfifílica.