TW201726702A - 生產胰島素之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及自胰島素原製備胰島素的方法、純化胰島素的方法、和自其製備的胰島素，該自胰島素原製備胰島素的方法包括藉由酶促裂解將高濃度胰島素原轉化成胰島素。
Description
本發明涉及自胰島素原製備胰島素的方法、純化胰島素的方法、和使用相同方法製備的胰島素，該自胰島素原製備胰島素的方法包括藉由酶裂解將高濃度胰島素原轉化成胰島素。
製備重組胰島素的方法已從製備半合成胰島素的方法至兩鏈方法(two-chain method)以及自胰島素原製備胰島素的方法持續開發。
在自胰島素原製備胰島素的方法(排除兩鏈方法和半合成方法)中，使用胰蛋白酶和羧肽酶B將胰島素原轉化成胰島素的過程已經使用多年之久[見Kemmler,W.,Clark,j.,Steiner,D.F.,Fed.Proc.30(1971)1210；Kemmler,W.,Peterson,J.D.,Steiner,D.F.,J.Biol.Chem.,246(1971)6788-6791]。然而，在藉由此方法製備胰島素時，藉由通用的純化方法，諸如使用柱等難以除去的雜質，特別是B鏈中的最後一個胺基酸蘇胺酸被刪除的一種人胰島素[Des-Thr(B30)-胰島素]，與胰島素生產期間產生的其它雜質相比通常以大量(4%至10%)形成，儘管
雜質的含量隨條件而變化。
當使用半合成方法時，將C-肽修飾為與野生型形式不同的形式，使得它可以藉由在給定胰島素原類似物中用胰蛋白酶的簡單處理除去，並且該方法產生B鏈中的最後一個胺基酸蘇胺酸被刪除的形式。然後，經由合成將L-蘇胺酸第三丁酯附著於如此製備的胰島素的B鏈的最後一個胺基酸，並且單離如此製備的胰島素-酯和B鏈中的最後一個胺基酸(蘇胺酸)被刪除的人胰島素形式[Des-Thr(B30)-胰島素]。比較而言，當使用人胰島素原作為中間體時，在酶促轉化過程期間大量產生Des-Thr(B30)-胰島素，並且如此已經做出各種嘗試以抑制其生成。
例如，美國專利No.5457066披露了藉由在酶轉化過程中引入第二種金屬離子降低Des-Thr(B30)-胰島素生成的量。
另外，依照Son YJ et al.(Biotechnol Prog.2009 Jul-Aug；25(4)：1064-70)和美國專利申請公開文本No.2012-0214964，在實施經由“檸康醯化”阻斷B30蘇胺酸附近的B29賴胺酸位點的反應後，藉由實施酶轉化過程降低Des-Thr(B30)-胰島素生成的量。
然而，這些方法可能由於酶轉化過程後實施的純化過程期間的添加劑而引起潛在的問題。另外，這些方法還可能具有的問題在於在上述過程中需要進一步添加添加劑以抑制Des-Thr(B30)-胰島素的生成和/或解阻斷(unblock)添加劑的步驟，由此增加規程的複雜性並且導致
生產成本的增加。
本發明人已經努力開發在使用胰島素原作為中間體製備胰島素的方法中使雜質的生成最小化的方法，並且因此，已經開發出對高濃度胰島素原樣品實施酶轉化過程的方法。因而，可以藉由本發明中開發的方法有效降低Des-Thr(B30)-胰島素的生成。
本發明的一個目的是提供自胰島素原製備胰島素的方法，其包括藉由酶促裂解將高濃度胰島素原轉化成胰島素。
本發明的另一個目的是提供用於純化胰島素的方法，其包括(a)藉由酶促裂解將高濃度胰島素原轉化成胰島素，從而製備含有胰島素的樣品；並且(b)將樣品進行純化過程。
本發明的又一個目的是提供藉由上述方法製備的胰島素。
本發明的方法可以製備胰島素樣品，其中有效調控雜質，並且如此可以顯著改善胰島素純化效率。因而，本發明的方法可以應用於胰島素的大規模生產，並且如此能夠降低用於除去雜質的成本。
第1圖顯示了在用酶處理時，隨胰島素原濃度的雜質減少效應的分析結果。
第2圖顯示了在用酶處理時，隨反應溫度條件的雜質減少效應的分析結果。
第3圖顯示了在用酶處理時，隨pH的雜質減少效應的分析結果。
第4圖顯示了藉由胰島素類似物樣品的逆相層析的分析結果，該胰島素類似物樣品含有過量的Des-Thr(B30)-胰島素類似物。
第5A至5C圖顯示了藉由高壓層析(HPLC)純化的胰島素類似物的純度的分析結果；即，第5a圖藉由C18 RP-HPLC，第5b圖藉由C4 RP-HPLC，和第5c圖藉由SEC-HPLC。
在實現上述目的的一個方面中，本發明提供了用於自胰島素原製備胰島素的方法，其包括藉由酶促裂解將50mg/mL或更高的濃度的胰島素原轉化成胰島素。
在一個例示性的具體實施例中，酶是胰蛋白酶、羧肽酶B、或其組合。
在另一個例示性的具體實施例中，胰島素原的濃度在50mg/mL至300mg/mL的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，胰島素
原的濃度在100mg/mL至300mg/mL的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，胰島素原的濃度在200mg/mL至300mg/mL的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/7,500至1/40,000(重量/重量)的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/15,000至1/40,000(重量/重量)的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/20,000至1/40,000(重量/重量)的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/30,000至1/40,000(重量/重量)的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，羧肽酶B相對於胰島素原的百分比在1/600至1/20,000(重量/重量)的範圍中。
在又一個例示性的具體實施例中，羧肽酶B相對於胰島素原的百分比在1/600至1/15,000(重量/重量)的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，酶反應中的pH是6.5至9.0的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，酶反應
中的pH是7.0至8.5的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，酶反應中的溫度是4.0℃至25.0℃的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，酶反應的反應時間是4.0小時至55小時的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，酶反應中的緩衝液在1mM至100mM Tris-HCl的範圍。
在又一個例示性的具體實施例中，酶反應中的緩衝液可以不包含金屬離子。
在又一個例示性的具體實施例中，胰島素原或胰島素為類似物類型。
在又一個例示性的具體實施例中，方法進一步包括藉由將包含自該胰島素原轉化的該胰島素的樣品進行層析純化胰島素。
在又一個例示性的具體實施例中，層析是陽離子交換層析或逆相層析。
在又一個例示性的具體實施例中，方法包括實施逆相層析或陰離子交換層析。
在又一個例示性的具體實施例中，方法進一步包括在藉由將包含自該胰島素原轉化的該胰島素的樣品進行陽離子交換層析純化胰島素後，實施逆相層析。
在又一個例示性的具體實施例中，藉由陽離子交換柱或逆相柱部分純化胰島素原。
在又一個例示性的具體實施例中，藉由該
方法製備的含有胰島素的樣品包含小於5%的量的Des-Thr(B30)-胰島素雜質。
在實現目的的另一個方面中，本發明提供了用於純化胰島素的方法，其包括：藉由酶促裂解將高濃度胰島素原轉化成胰島素，從而製備含有胰島素的樣品；並且將如此製備的樣品進行純化過程。
在一個例示性的具體實施例中，層析是陽離子交換層析或逆相層析。
在另一個例示性的具體實施例中，方法包括藉由將含有從胰島素原轉化的胰島素的樣品進行陽離子交換層析，接著實施逆相層析純化胰島素。
在實現目的的又一個態樣中，本發明提供了藉由上述方法製備的胰島素。
在下文將參考所附圖式更為詳細描述本發明較佳的具體實施例。然而，本發明可以以不同形式體現，並且本發明不應限於本文中列出的具體實施例。確切地，藉由提供這些具體實施例，從而本公開內容會是徹底且完整的，並且將本發明的範圍完全傳遞給本領域技術人員。
在實現上述目的的一個方面中，本發明提供了自胰島素原製備胰島素的方法，其包括藉由酶促裂解將高濃度胰島素原轉化成胰島素。
在本發明的方法中，可以以高濃度使用胰島素原。
特別地，可以在酶促轉化中使用50mg/mL或更高的濃度的胰島素原。更特別地，在上述方法中，胰島素原的濃度可以在50mg/mL至300mg/mL，甚至更特別地100mg/mL至300mg/mL，並且最特別地200mg/mL至300mg/mL的範圍使用，但是它不限於此。
在本發明中，藉由酶促裂解將胰島素原轉化成胰島素又稱作酶促轉化。
如本文中使用的，術語“酶促轉化”指使用酶將含有A鏈和B鏈之間的C肽的胰島素原轉化成胰島素。
在本發明中，可以使用選自胰蛋白酶、羧肽酶B、和其組合的任一種實施酶促轉化。
在本發明中，胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比可以在1/7,500至1/40,000(重量/重量)，特別是1/15,000至1/40,000(重量/重量)，更特別是1/20,000至1/40,000(重量/重量)，並且甚至更特別是1/30,000至1/40,000(重量/重量)的範圍使用，但是它不限於此。
在本發明中，羧肽酶B相對於胰島素原的百分比在1/600至1/20,000(重量/重量)，並且特別是1/600至1/15,000(重量/重量)的範圍，但是它不限於此。
具體而言，當使用胰蛋白酶和羧肽酶B兩者時，可以適當組合並使用上文描述的胰蛋白酶和羧肽酶B的比率。
本發明的酶促轉化中的pH可以沒有特別限
制，只要將胰島素原有效轉化成胰島素是可能的，並且特別是在6.5至9.0，並且特別是7.0至8.5的範圍，但是它不限於此。
在本發明中，酶反應中的溫度可以在4.0℃至25.0℃的範圍，但是它不限於此。
在本發明中，反應時間可以在4.0小時至55小時的範圍，但是它不限於此。
在本發明中，酶反應中的緩衝液可以在1mM至100mM Tris-HCl的範圍，但是它不限於此。
在本發明中，酶反應中的緩衝液可以不包含金屬離子。
在本文中，會更為詳細描述胰島素原和胰島素。
如本文中使用，術語“胰島素原”指胰島素的前體分子。胰島素可以包含胰島素A鏈和胰島素B鏈，以及其間的C肽。胰島素原可以是人胰島素原。
如本文中使用，術語“胰島素”指在體內調節血液葡萄糖位準中牽涉的蛋白質。
天然的胰島素是一種由胰分泌的激素，其一般在藉由在抑制脂肪裂解的情況中促進胞內葡萄糖的吸收而調節體內血液葡萄糖位準中發揮作用。
沒有血液葡萄糖位準調節能力的胰島素原的形式的胰島素經加工成具有調節血液葡萄糖位準能力的胰島素。胰島素由2條多肽鏈，即A鏈和B鏈構成，它們
分別包含21個胺基酸和30個胺基酸，並且是藉由二硫化物橋互連的。A鏈和B鏈之每種可以包含以下文顯示的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2代表的胺基酸序列。
A-鏈：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：1)
B-鏈：
(SEQ ID NO：2)
在本發明中，將胰島素原和胰島素設想為包含天然的胰島素和那些胰島素類似物形式的胰島素兩者。
在本發明中，胰島素原類似物或胰島素類似物包含如下那些其中B鏈或A鏈中的胺基酸，與天然類型的那些胺基酸相比，是經修飾的。胰島素類似物可以與天然胰島素擁有等同或對應的體內血液葡萄糖位準調控能力。
特別地，胰島素原類似物或胰島素類似物可以包括如下那些其中藉由選自替代、添加、刪除、修飾、及其組合所成群組的任何一種修飾天然胰島素中的至少一個胺基酸，但是它們不限於此。
藉由遺傳重組技術製備本發明的實施例中使用的胰島素類似物，並且這些胰島素類似物包括反向胰
島素、胰島素變體、胰島素片段等的構思。
這些作為具有與天然胰島素為等同或對應的體內血液葡萄糖位準調控能力的肽之胰島素類似物，包括胰島素激動劑、胰島素衍生物、胰島素片段、胰島素變體等的所有構思。
胰島素衍生物具有體內血液葡萄糖位準調控能力，與天然胰島素的A鏈和B鏈的胺基酸序列之每種具有同源性，並且包括下述形式的肽，其中胺基酸殘基中的部份基團係藉由化學替代(例如α-甲基化，α-羥基化)、刪除(例如脫胺基)、或修飾(例如N-甲基化)所修飾。這些胰島素片段指對胰島素插入或刪除至少一個胺基酸的形式的那些胰島素片段，並且插入的胺基酸可以是那些在自然界中不存在的胺基酸(例如D型胺基酸)，並且這些胰島素片段擁有體內血液葡萄糖位準調控能力。
這些作為其中至少一個胺基酸序列與胰島素的胺基酸序列不同的肽之胰島素變體擁有體內血液葡萄糖位準調控能力。
製備本發明的胰島素激動劑、胰島素衍生物、胰島素片段、和胰島素變體的方法可以獨立或組合使用。例如，本發明的範圍中也包括具有體內血液葡萄糖位準調控能力的肽，其中至少一個胺基酸序列不同於胰島素的胺基酸序列，並且對N端胺基酸殘基引入脫胺作用(deamination)。
特別地，胰島素原類似物或胰島素類似物
可以是那些其中選自下列所成群組的至少一個胺基酸可以用另一種胺基酸替代的：B鏈中的位置1、2、3、5、8、10、12、16、23、24、25、26、27、28、29、和30的胺基酸；和A鏈中的位置1、2、5、8、10、12、14、16、17、18、19、和21處的胺基酸；並且更特別是那些其中選自下列所成群組的至少一個胺基酸可以用另一種胺基酸替代的：B鏈中的位置8、16、23、24、和25的胺基酸；和A鏈中的位置1、2、14、和19的胺基酸。特別地，在上述胺基酸中，1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個、20或更多個、21或更多個、22或更多個、23或更多個、24或更多個、25或更多個、26或更多個、或27或更多個胺基酸可以用另一種胺基酸替代，但是不限於此。
位置於上文所描述位置的胺基酸殘基也可以用丙胺酸、谷胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸、纈胺酸、穀胺醯胺、甘胺酸、賴胺酸、組胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、和/或天冬胺酸替代。例如，可以用谷胺酸替代天然胰島素的A鏈第14位置的胺基酸(即酪胺酸)。
對於胺基酸的替代或插入，不僅可以使用人蛋白質中常規觀察到的20種胺基酸，而且還可以使用非
典型或非天然的胺基酸。可以自Sigma-Aldrich、ChemPep、Genzymepharmaceuticals等商業獲得非典型胺基酸。可以由商業公司合成或者自商業公司購買含有這些胺基酸和典型肽序列的肽，諸如肽合成公司American Peptide Company、Bachem(USA)、和Anygen(Korea)。
更特別地，胰島素類似物可以是如下那些包含以下述通式1代表的SEQ ID NO：3的A鏈和/或以下述通式2代表的SEQ ID NO：4的B鏈，並且另外，A鏈和B鏈可以藉由二硫鍵互連，但是不限於此。
[通式1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa3-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa4-Cys-Asn(SEQ ID NO：3)
在通式1中，Xaa1是甘胺酸或丙胺酸，Xaa2是異亮胺酸或丙胺酸，Xaa3是酪胺酸、谷胺酸、天冬醯胺、組胺酸、賴胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸，並且Xaa4是酪胺酸、谷胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或丙胺酸。
[通式2]
(SEQ ID NO：4)
在通式2中，Xaa5是甘胺酸或丙胺酸，
Xaa6是酪胺酸、谷胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或天冬胺酸，Xaa7是甘胺酸或丙胺酸，Xaa8是苯丙胺酸或丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸、天冬胺酸、谷胺酸、丙胺酸或刪除。
更特別地，胰島素類似物可以是包含如下者：(i)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是丙胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸；(ii)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是丙胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸；(iii)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是谷胺酸天冬醯胺，組胺酸，賴胺酸，丙胺酸或天冬胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸；(iv)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是丙胺酸，谷胺酸、絲胺酸或蘇胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸；
(v)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是丙胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸；(vi)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是谷胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或天冬胺酸，Xaa7是甘胺酸，並且Xaa8是苯丙胺酸Xaa9是苯丙胺酸；(vii)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是丙胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸；(viii)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是丙胺酸，並且Xaa9是苯丙胺酸；(ix)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是酪胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是丙胺酸、天冬胺酸或谷胺酸；(x)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是谷胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B
鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是酪胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是刪除；和(xi)A鏈，其中在通式1中，Xaa1是甘胺酸，Xaa2是異亮胺酸，Xaa3是丙胺酸，並且Xaa4是酪胺酸；並且B鏈，其中在通式2中，Xaa5是甘胺酸，Xaa6是谷胺酸，Xaa7是甘胺酸，Xaa8是苯丙胺酸，並且Xaa9是刪除，但是不限於此。
例如，那些如下的肽也屬於本發明的範圍，該肽包含上文描述的特徵性胺基酸序列並且與相應的胰島素類似物具有至少70%，特別是至少80%，更特別是至少90%，並且甚至更特別是至少95%的序列同源性，同時具有血液葡萄糖位準調控能力。
如本文中使用，術語“同源性”指與天然野生型蛋白質的給定胺基酸序列或編碼其的多核苷酸序列的相似性程度，並且包括那些與本發明的胺基酸序列或多核苷酸序列具有上文描述的百分比的同一性的序列。可以藉由由裸眼比較兩種給定的序列測定或者可以使用生物資訊演算法測定同源性，該生物資訊演算法藉由排列用於比較的主題序列實現同源性分析。可以以百分比表示兩種給定的胺基酸序列間的同源性。有用的自動演算法可用於在Wisconsin遺傳學套裝軟體(Genetics Computer Group,Madison,WI,USA)的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA電腦軟體模組中使用。
上述模組中自動化的排列演算法包括藉由
Needleman & Wunsch、Pearson & Lipman、和Smith & Waterman的序列排列演算法。在包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST、和CLUSTAL W的軟體中自動化關於序列排列和同源性測定的其它有用的演算法。
胰島素類似物可以具有修飾，諸如A1G→A，A2I→A，A19Y→A，B8G→A，B23G→A，B24F→A，B25F→A，A14Y→E，A14Y→N，A14Y→H，A14Y→K，A19Y→E，A19Y→S，A19Y→T，B16Y→E，B16Y→S，B16Y→T，A14Y→A，A14Y→D，B16Y→D，B25F→D，B25F→E，A14Y→D/B25F→刪除，和/或A14Y→D/B16Y→E/B25F→刪除，但是不限於此(具體而言，起始字元中描述的A或B指胰島素的A鏈或B鏈，並且其中描述的數字標示相應的鏈中的胺基酸編號。最後的字母代表依照IUPAC命名的縮寫胺基酸，例如，G→A標示甘胺酸用丙胺酸替代)。
適用於本發明的胰島素類似物的例子可以不限於上文描述的那些，而是本領域中公開的各種胰島素類似物可以適用於本發明的方法。
另外，以胰島素原類似物設計和應用這些胰島素類似物對於本領域技術人員會是容易的。
本發明的方法中使用的胰島素原可以是在微生物中表現，然後藉由部分純化獲得的，但是它不限於此。具體而言，胰島素原可以是使用陽離子交換柱部分純化的。
特別地，胰島素原可以進行純化步驟，其包括：(a)以包涵體形式在微生物中表現胰島素原，接著從中分離該包涵體；(b)自含有分離的胰島素原的包涵體重折疊(refold)胰島素原；並且(c)純化步驟(b)中獲得的胰島素原。
例如，可以藉由以下過程實施純化。
特別地，可以藉由以包涵體的形式在微生物中發酵表現並形成胰島素原。使用高壓微流化器(microfluidizer)壓碎微生物的細胞膜以分離微生物內形成的包涵體。細胞膜被壓碎的微生物進行離心和清洗，並且僅分離並獲得含有胰島素原的包涵體。
在使胰島素前體蛋白質與甘胺酸緩衝液中的還原劑起反應以還原於經此獲得的包涵體團粒中所含有的胰島素前體蛋白質的二硫鍵後，將所得物與離液劑(chaotropic agent)添加在一起以使胰島素前體蛋白質的結構線性化。然後，藉由離心除去剩餘部分，並且藉由用蒸餾水稀釋降低離液劑和還原劑的濃度，從而形成具有胰島素前體的精確結構的蛋白質。
隨後，為了分離正確形成的胰島素原，可以應用陽離子交換層析或陰離子交換層析。
本發明的方法可以進一步包括純化含有胰島素的樣品，該胰島素藉由酶促轉化從胰島素原轉化。
特別地，可以藉由將含有從胰島素原轉化的胰島素的樣品進行層析將方法應用於胰島素。
只要層析能有效純化，層析可以沒有特別限制，並且可以是陽離子交換層析或逆相層析。
如本文中使用，術語“陽離子交換層析”指利用填充有陽離子交換樹脂的柱的層析。陽離子交換樹脂是添加入不同水性溶液中並且將其自身的陽離子與水性溶液中存在的陽離子交換的合成樹脂。對於陽離子交換樹脂，可以使用本領域中常規使用的各種樹脂，並且特別地，可以使用具有COO-或SO32-的官能團的柱，例如，那些具有甲磺酸根(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、多天冬胺酸、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)、磺酸根(S)等的柱，儘管不限於此。
陽離子交換層析可以藉由將樣品於經受平衡的陽離子交換柱，將胰島素附著於柱，然後使用洗脫緩衝溶液從中將它洗脫而實施。
可以使用各種緩衝溶液，例如檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、MOPS或MES緩衝溶液等實施陽離子交換柱的平衡。
可以使用各種鹽溶液，例如NaCl或KCl鹽緩衝溶液實施洗脫緩衝溶劑。可以使用線性濃度梯度、逐步濃度梯度等實施洗脫，但是不限於此。
另外，胰島素的純化可以進一步包括在實施陽離子交換層析後實施逆相層析。
如本文中使用，術語“逆相層析”指使得能夠使用具有高極性的固定相和具有低極性的流動相的組
合分開混合物的層析。
對於逆相層析樹脂，可以使用本領域中常規使用的各種樹脂，並且特別地，可以使用在矽土或聚合物基質中具有碳體形式的官能團的柱或聚合物基質自身能起官能團作用的柱，例如具有C2、C4、C8、C18或聚苯乙烯/二乙烯基苯的柱，儘管不限於此。
逆相層析可以藉由將樣品於經受平衡的柱，將胰島素附著於柱，然後使用洗脫緩衝溶液從中洗脫胰島素而實施。
可以使用各種緩衝溶液，例如磷酸鹽、含有TFA/TAE的水等等實施逆相層析的平衡。
可以使用各種有機溶劑，例如乙醇、異丙醇、乙腈等實施洗脫緩衝溶液。可以使用線性濃度梯度、逐步濃度梯度等實施上述洗脫，但是不限於此。
另外，胰島素原和胰島素的純化可以進一步包括在實施陽離子交換層析後實施陰離子交換層析。
如本文中使用，術語“陰離子交換層析”指利用填充有陰離子交換樹脂的柱的層析。陰離子交換樹脂是添加入不同水性溶液中並且將其自身的陰離子與水性溶液中存在的陰離子交換的合成樹脂。對於陰離子交換樹脂，可以使用本領域中常規使用的各種樹脂，並且特別地，可以使用具有N+官能團的柱，例如那些具有四級銨(Q)、四級胺基乙基(QAE)、二乙基胺基乙基(DEAE)、聚伸乙亞胺(PEI)、二甲基胺基乙基(DMAE)、三甲基胺基乙基(TMAE)
等的柱，但不限於此。
陰離子交換層析可以藉由將樣品於經受平衡的陰離子交換柱，將胰島素原和胰島素附著於柱，然後使用洗脫緩衝溶液從中洗脫而實施。
可以使用各種緩衝溶液，例如Tris、bis-Tris、組胺酸、HEPES緩衝溶液等實施陰離子交換柱的平衡。
可以使用各種鹽溶液，例如NaCl或KCl鹽緩衝溶液實施洗脫緩衝溶液。可以使用線性濃度梯度、逐步濃度梯度等實施洗脫，但是不限於此。
另外，可以藉由陽離子交換柱或反相柱部分純化用於藉由本發明的酶促裂解製備胰島素的胰島素原。
同時，依照本發明的方法，可以製備胰島素，使得Des-Thr(B30)-胰島素雜質的含量可以小於5%，特別地小於3%，更特別地小於2%，並且甚至更特別地小於1%，儘管不特別限於此。
在實現上述目的的另一個方面中，本發明提供了純化胰島素的方法，其包括藉由酶促裂解將高濃度胰島素原轉化成胰島素，製備含有胰島素的樣品；並且將該樣品進行純化過程。
可以藉由層析過程進行純化過程。
製備含有胰島素的樣品的步驟，純化樣品的步驟，和層析過程與上文的描述相同。
在實現上述目的的又一個方面中，本發明
提供了藉由上述方法製備的胰島素。
上述製備方法和胰島素與上文的描述相同。
在下文中，會參考以下實施例更加詳細描述本發明。然而，這些實施例僅僅為了例示的目的，並且本發明並不意圖限於這些實施例。
在T7啟動子的調節下實施重組胰島素原類似物的表現。下文表1中顯示了與每種胰島素類似物對應的序列。
用每種重組胰島素類似物的表現載體轉形大腸桿菌(E.coli)BL21-DE3((大腸桿菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)gal λ DE3)；Novagen)。依照由Novagen推薦的方法實施轉形。將用每種重組表現載體轉形的單一大腸桿菌菌落接種入含有胺苄青黴素(50μg/mL)的2X Luria Broth(LB)培養基中，並且於37℃培養15小時。以1：1(v/v)比率混合重組大腸桿菌培養物和2X LB培養基，並且以1mL的量分別對混合物等分取樣入冷凍管中，並且於-140℃貯存。使用所得物作為用於生成重組胰島素原蛋白質的
細胞儲液(cell stocks)。
為了表現重組胰島素原類似物，將1管形瓶的每種細胞儲液接種入500mL的2X LB培養基中，並且在搖動水浴的情況中於37℃培養10小時至18小時。分別將以200mL的量收集的所得的培養物接種入兩個含有500mL新鮮的2X LB培養基的燒瓶中，並且在搖動水浴的情況中於37℃培養1小時至5小時。使用所得物作為儲液培養物(stock cultures)。將儲液培養物接種入使用50L發酵罐(MSJ-U2,B.E.MARUBISHI,JAPAN)的17L發酵培養基中，並且進行初始分批發酵。培養條件是：37℃，20L/min(1vvm)的空氣供應，500rpm的攪拌速度，和使用30%氨水調節的pH 6.70。在培養基中的營養物受限時，藉由在添加補料溶液後的補料-分批培養進行發酵。基於OD值監測細菌的生長，並且在OD值達到100或更高時引入終濃度500μM的IPTG。在引入後進一步繼續培養約20小時至25小時。在完成培養後，藉由SDS PAGE確認過度表現的胰島素原類似物。藉由離心收集具有胰島素原類似物的過度表現的重組細菌，並且在使用前於-80℃貯存。
為了將實施例1中表現的重組胰島素原類似物改變為可溶性形式，壓碎細胞，並且重折疊類似物。分別在1L溶解緩衝溶液(50mM Tris-HCl(pH9.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl、和0.5% Triton X-100)中重懸170g(濕重)的量
的細胞團粒。在15,000psi的壓力下使用M-110EH(M1475C型，AC Technology Corp.)(一種微流化器處理器)壓碎細胞。於4℃以12,000g離心壓碎的細胞裂解物30分鐘，棄去上清液，並且分別在1L清洗緩衝溶液(0.5% Triton X-100、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl和1mM EDTA)中重懸團粒。於4℃以12,000g離心所得物30分鐘，並且分別在蒸餾水中重懸團粒，並且以相同的方式離心。收集團粒，並且在600mL緩衝溶液(1M甘胺酸和3.78g半胱胺酸-HCl(pH 10.6))中重懸，並且於室溫攪拌1.5小時。藉由加入尿素以收集重懸的重組胰島素原類似物，然後於室溫攪拌。為了重折疊溶解的重組胰島素原類似物，於4℃將它們離心40分鐘。分別回收所得的上清液，並且於4℃至8℃攪拌至少17小時，期間使用蠕動泵添加入3L至12L蒸餾水中。
將完成重折疊的樣品附著於SP-FF(GE healthcare,USA)柱，其使用含有乙醇的20mM檸檬酸鈉(pH 3.0)緩衝溶液平衡，然後藉由使用含有0.5mM氯化鉀和乙醇的20mM檸檬酸鈉(pH 3.0)緩衝溶液的0%至100%的線性濃度梯度洗脫胰島素原類似物蛋白質。
使用實施例1中列出的類似物中的No.8類似物作為用於藉由酶處理將胰島素原轉化成胰島素的實驗的代表性
樣品。調節藉由SP-FF柱洗脫的胰島素原類似物樣品以具有7.0至8.5的最終pH，並且濃縮以具有5mg/mL至300mg/mL的蛋白質濃度。依照製造商的方案實施酶反應。相對於樣品的蛋白質量，在具有對應於約1/3,900至1/62,400的重量/重量比率的胰蛋白酶(Roche,Germany)和對應於約1/644至1/19,300的重量/重量比率的羧肽酶B(Roche,Germany)的50mM Tris-HCl中添加蛋白質樣品，並且於4℃至25℃攪拌0小時至55小時。為了終止酶反應，將pH降低至3.5或以下。
在實施例4中，建立優化的高濃度條件以使Des-Thr(B30)-胰島素類似物雜質最小化。相對於樣品的蛋白質量，用對應於約1/3,900至1/62,400的重量/重量比率的胰蛋白酶，和對應於約1/644至1/19,300的重量/重量比率的羧肽酶B加入5mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL和300mg/mL濃度的胰島素原，攪拌，並且以與實施例4中相同的方式實施反應的終止。藉由RP-HPLC(C4)分析確認每個濃度的Des-Thr(B30)-胰島素雜質含量。
因此，在5mg/mL至50mg/mL胰島素原時，顯示了在用胰蛋白酶(對應於約1/3,900至1/62,400的重量/重量比率)和羧肽酶B(相對於蛋白質量，對應於約1/644的重量/重量比率)處理時的Des-Thr(B30)-胰島素類似物雜質以約1.6%至6.4%發生，而在100mg/mL至300mg/mL胰島
素原時，發生率顯著降低至約1%，暗示了顯著的抑制(表2和第1圖)。
依照反應溫度，自0小時至36小時或更多(最大值55小時)的優化時間實施實驗，並且第2圖中顯示了每個溫度的條件。因此，確認了反應速度從低溫至室溫變化，儘管減少效應保持相同。確認了依照pH條件的用於胰蛋白酶的最佳條件，並且第3圖中顯示了結果。
另外，確認了也藉由羧肽酶B的重量比率調控Des-Thr(B30)-胰島素類似物雜質的生成。
確認了當用胰蛋白酶(對應於1/31,200的重量比率)和羧肽酶B(相對於樣品的蛋白質量，對應於1/644至1/19,300的重量比率)處理時，在100mg/mL的高濃度時，雜質發生率是約1%，如此提示了可以抑制Des-Thr(B30)-胰島素類似物雜質的發生(表3)。
在終止反應後，將樣品再附著到SP-HP(GE healthcare,USA)柱，其用20mM檸檬酸鈉(pH 3.0)緩衝溶液平衡，並且藉由使用含有0.5M KCl和乙醇的20mM檸檬酸鈉(pH 3.0)緩衝溶液的線性濃度梯度洗脫胰島素類似物蛋白質。
為了在附著於用含有磷酸鈉和異丙醇的緩衝液平衡的逆相層析Source30 RPC(GE healthcare,USA)後從實施例6中獲得的樣品純分離胰島素類似物，藉由使用含有磷酸鈉和異丙醇的緩衝溶液的線性濃度梯度洗脫胰島素類似物。
藉由HPLC分析含有過量(約10%)的Des-Thr(B30)-胰島素類似物的胰島素類似物(第4圖)。藉由HPLC分析確認最終胰島素類似物(其係藉由應用酶轉化以使Des-Thr(B30)-胰島素雜質最小化而純化)的純度和雜質(第5圖)。因此，顯示了作為主要雜質的Des-Thr(B30)-胰島素類似物和脫胺(deamination)形式的胰島素類似物分別是約小於1%，並且總純度是98.5%或更高。
本領域普通技術人員會認可本發明可以在不偏離其精神或必要特徵的前提下以其它具體形式體現。在所有方面應當認為描述的具體實施例僅是例示性而非限制性的。因此，本發明的範圍係所附申請專利範圍，而非前文所描述之。本發明的範圍內係應當涵蓋進入申請專利範圍的等同性的意義和範圍內的所有變化。
<110> 韓美藥品股份有限公司(HANMI PHARM.Co.,LTD.)
<120> 生產胰島素之方法
<130> OPA16228
<150> KR 10-2015-0135872
<151> 2015-09-24
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<170> KopatentIn 2.0
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<223> 胰島素類似物，式1
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<222> (1)
<223> Xaa為甘胺酸或丙胺酸
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<222> (2)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa為酪胺酸，谷胺酸，天冬醯胺，組胺酸，賴胺酸，丙胺酸，或天冬胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa為酪胺酸，谷胺酸，絲胺酸，蘇胺酸或丙胺酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物，式2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)
<223> Xaa為甘胺酸或丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa為酪胺酸，谷胺酸，絲胺酸，蘇胺酸或天冬胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)
<223> Xaa為甘胺酸或丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)
<223> Xaa為苯丙胺酸或丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)
<223> Xaa為苯丙胺酸，天冬胺酸，谷胺酸，丙胺酸或刪除
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<223> 類似物1
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<223> 類似物3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 類似物24
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由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。
Claims (26)
- 一種自胰島素原製備胰島素的方法，其包括藉由酶促裂解將50mg/mL或更高的濃度的胰島素原轉化成胰島素。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該酶是胰蛋白酶、羧肽酶B、或其組合。
- 如申請專利範圍第1或2項所述的方法，其中該胰島素原的濃度在50mg/mL至300mg/mL的範圍。
- 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該胰島素原的濃度在100mg/mL至300mg/mL的範圍。
- 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該胰島素原的濃度在200mg/mL至300mg/mL的範圍。
- 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/7,500至1/40,000(重量/重量)的範圍。
- 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/15,000至1/40,000(重量/重量)的範圍。
- 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/20,000至1/40,000(重量/重量)的範圍。
- 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中胰蛋白酶相對於胰島素原的百分比在1/30,000至1/40,000(重量/重量)的範圍。
- 如申請專利範圍第2和6至9項任一項所述的方法，其 中羧肽酶B相對於胰島素原的百分比在1/600至1/20,000(重量/重量)的範圍。
- 如申請專利範圍第2和6至9項任一項所述的方法，其中羧肽酶B相對於胰島素原的百分比在1/600至1/15,000(重量/重量)的範圍。
- 如申請專利範圍第1或2項所述的方法，其中該酶促裂解中的pH是6.5至9.0。
- 如申請專利範圍第1或2項所述的方法，其中該酶促裂解中的pH是7.0至8.5。
- 如申請專利範圍第1或2項所述的方法，其中該酶促裂解中的溫度是4.0℃至25.0℃。
- 如申請專利範圍第1或2項所述的方法，其中該酶促裂解實施4.0小時至55小時。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該胰島素原或胰島素是類似物型。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法，其進一步包括藉由將包含該自胰島素原轉化的胰島素的樣品進行層析來純化胰島素。
- 如申請專利範圍第17項所述的方法，其中該層析是陽離子交換層析或逆相層析。
- 如申請專利範圍第18項所述的方法，其進一步包括實施逆相層析或陰離子交換層析。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中藉由陽離子交換柱或逆相柱部分純化該胰島素原。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中藉由該方法製備的含有胰島素的樣品包含小於5%的量的Des-Thr(B30)-胰島素雜質。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在範圍為1mM至100mM的Tris-HCl緩衝液中進行該酶促裂解。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該酶促裂解中的緩衝液不含金屬離子。
- 一種用於純化胰島素的方法，其包括：(a)藉由申請專利範圍第1項所述的方法製備含有胰島素的樣品；並(b)將該樣品應用於層析過程。
- 如申請專利範圍第24項所述的方法，其中該層析是陽離子交換層析或逆相層析。
- 如申請專利範圍第25項所述的方法，其進一步包括將該樣品進行逆相層析或陰離子交換層析。
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