CA2152166C - Detection de la mucoviscidose ou d'une mutation du gene cftr - Google Patents

Abstract

La présente demande concerne un procédé pour la détection in vitro d'une affection pancréatique associée à une altération du gène CFTR, caractérisé en ce que l'on dose la concentration de PAP humaine dans un échantillon biologique. Elle vise aussi des anticorps appropriés pour réaliser ce dosage.

Description

~O 94/15218 PCTlFR93/01299 ' DETECTION DE LA MUCOUISCIDOSE OU D'UNE MUTATION DU GENE CFTR
La présente demande a pour obj et la détection de la mucoviscidose ou d'une mutation du gène responsable de la mucoviscidose associée à une affection pancréatique, au moyen d'un dosage de la PAP
(Pancreatitis-Associated Protein) La PAP a été isolée, purifiée et caractérisée chez l'homme et décrite dans la demande de brevet PCT
publiée le 31 Octobre 1991 sous le n° 91/16428. Dans cette demande antérieure, la PAP a été proposée comme moyen de détection d'une pathologie déterminée, la pancréatite aiguë.
Les inventeurs ont à ce jour mis en évidence que des anomalies génétiques susceptibles de donner lieu à
des affections caractéristiques de la mucoviscidose, peuvent être corrélées de façon fiable chez l'homme, avec une expression anormale de la PAP et ce dès la naissance.
La mucoviscidose, encore appelée "cystic fibrosis"
en anglais est une maladie génétique très fréquente chez certaines populations, qui se caractérise par une insuffisance globale des sécrétions exocrines du pancréas et du poumon et d'une manière générale, des glandes exocrines. Cliniquement, la maladie est associée à des sécrétions trop visqueuses, le mucus formé pouvant obstruer les bronches et provoquer des troubles graves ou mortels.
Le gène de la mucoviscidose a été localisé sur le chromosome 7 humain. Ce gène, appelé gène CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator") présente des mutations dans différentes régions, chez les sujets atteints de mucoviscidose. Des mutations du même type WO 94/15218 , PCT/FR93/01299 ~1~2~.~~

2 peuvent être détectées sur un seul des deux chromosomes 7, chez des sujets dits "porteurs" mais ne présentant pas de signes cliniques de la maladie. Ces personnes sont hétérozygotes pour la mutation du gène CFTR.
Dans le cas d'une mutation hétérozygote, le sujet porteur peut toutefois souffrir de certains troubles caractéristiques d'une altération des glandes sécrétoires. Le sujet porteur peut par exemple être atteint de troubles au niveau du pancréas.
Le diagnostic de la mucoviscidose a en premier lieu été effectué par un test appelé "test â la sueur"
consistant à doser le chlore et le sodium dans la sueur de sujets en particulier d'enfants susceptibles d'être atteints par cette maladie. L'indication d'un taux de chlore situé entre 60 et 180 mEq/1 pouvait être corrélée avec la maladie, dans la mesure où ce taux est d'environ 40 mEq/1 chez le nourrisson normal.
Plusieurs tests d'un autre type ont été
successivement proposés (Berry, H.K. et al, Am.J.Dis.Child. 1980 134:930 ; Crossley, J.R., et al, Lancet 1977 ii:1093 ; Forrest, D.C., et al Arch.Dis.Child. 1981 56:156 ; Green, M.N. et al, Pediatrics 1968 41:989 ; Robinson, P.G. et al Arch.Dis.Child. 1976 51:301 ; Shwachman, H._, et al, Pediatrics 1949 4:222), mais seul le dosage sérique de trypsine chez le nouveau-né (Farriaux, J.P., et al, Immunoanal.Biol.Spéc. 1992 33:71) a démontré
suffisamment d'intérêt pour être encore en vigueur dans certains pays (Farrell, P.M., et al, Ped.Pulmonol. 1991 Supplement 7:11). Ce dosage radioimmunologique est réalisé sur des taches de sang déposé sur carton, prélevé chez les nouveau-nés aux fins de dépistage des autres maladies génétiques actuellement dépistées systématiquement, la phénylcétonurie et l'hypothyroïdisme. Le dépistage par la trypsine sérique ~O 94/15218 f PCT/FR93/01299

3 reste cependant très imparfait puisque les résultats i d'un programme français d'évaluation à grande échelle ont récemment amené l'Association Française de Dépistage à ne pas le rendre obligatoire (Farriaux, J.P., et al, Immunoanal.Biol.Spéc. 1992 33:71).
Le principal problème posé par le dosage sérique de trypsine est celui des faux-positifs (environ 1 ~ de la population alors que l'incidence de la maladie est en France d'environ 0.03 %, (Farriaux, J.P., et al, Immunoanal.Biol.Spéc. 1992 33:71).
L'invention propose de nouveaux moyens pour réaliser un test de détection de la mucoviscidose ou d'une affection de certaines glandes exocrines, en particulier du pancréas, affection liée à l'existence d'une mutation hétérozygote du gène CFTR.
Les moyens de l'invention permettent de remédier de façon significative aux inconvénients présentés par les tests connus jusqu'â présent, et en particulier ces moyens offrent la possibilité de diminuer considérablement voire d'abolir statistiquement le nombre de résultats faux positifs.
La possibilité de détecter la mucoviscidose ou une affection pancréatique résultant d'une mutation du gène CFTR, grâce à la recherche de la PAP, a permis la mise au point d'un test suceptible d'être appliqué lors d'un dépistage néonatal ou lors d'un dépistage chez l'enfant ou chez l'adulte de la mucoviscidose.
Ce test peut également être réalisé dans le but de suivre l'évolution de la maladie par exemple pour déterminer l'évolution de l'affection pancréatique.
Un tel test peut également être mis en oeuvre pour détecter la présence d'un gène CFTR muté hétérozygote ne conduisant pas à l'apparition d'une mucoviscidose mais susceptible d'être corrélée à une affection du pancréas, chez un patient adulte ou enfant.

L' invention a c~c~n,._: ~.~oo:.:: ~>~.: -~E_'t r_Lrr ~_>z-c>cédö: p~:~ua_ la déteCtlOn 1n yltr'o Cir Lrrlf-~ ~~:k f ~. ;sri '(.) !r ~'rE ~~~: 1C~LIE~' a~a,~3(-~Clee .a une al.terat10r1 du CjE'_rle i...E'~~~~;,, i:~ x l' <~C't _ t'1',~ ' t;òl C2 ql:iE.' l' Orl dose la concentr3t:ion ~~<~ PA? xour.air-~f~ ~ïa-ms un écam:!ratillon biologique.
L' invention ~~or-!c~erwe ~-~ga.1_E.ment urz yrocédé pour la détection in vitro sur un ~=~~~h ~!rat_i.iL ro k~~_ic>logique dE~ la ' dose la mucoviscidose, c.artacté r r ~~: en ~Mc. qL,zE 1 on concentration de PAP.
L' invention ocuncerne ë,~<~:l.erne:mt ur~ procédé de dé;pïstage in vi r.rc~ de 1~_r muc:..~v~.sc I'aur~~>, cornprenant~ le dosage de ia cc~nc.~.Frrt:r<rtior~ i~~ âv_Rk? r~iarns ~~,r~ éc-harti.l.lon biologique, où l' ob >er_vat ioru ~_ï' .n! 1:_ ~aLa;~ <~nc:rnnal_emerrt élevé
de PAP dans ledi.t~ e~cvluarrt _!.:Llc>r~ k~i :~l.~~y~quE. x:,ar rapport aux valeurs c>btenues dans ',an groui~>~ ~.iét:e,rrn.ï,u; d' échant: il.lons de référenr_e est: L.t~ La.=é ~a<~u:!t~.. ~c" t~>p~..stage de la mucovisci.dos,e .
L' invention ~~.~mcerr.e <~r.~,alE:rr!E.i-rt: >~!ro proüé~.ié de dépistage in uit_r<~ ie l_<~ rnu:.c:~v.ï ~.'.ï_~:.~.c,:;e, a.rac,térâ_sÉ~ par le dosage de =~a c~orucentr.uts_c>rn E,a r'~m,c:rE at.ik :is-~r~:.;sc~ci.ated Protein (PAP) d~~:~s ,an c~cv~,~ irct.i a.l..~rr biolog:ique~, la comparaison de 1a valeur c>bt~~cn.r~ avE~t I~_>:~~; vs~leLzr!.~ ohte~nues dans un group déterrc!iné d' éc k~-~rr.t ï ~.Loro-: d~. ~ é,téren~,~e,, et 1e dépïstagEe de La muc:>vi.sc i.4tc>~~N~ ~:;~rn ï' c:..bsF.r7v~<rt:.i_c>n d' Lan taux 2.5 anormalement élevé de PAP darm l_' ch n~t:i:L:Lcro koiologïque.
L' inventi_c>n c~~~nc:errm~':r~a E:rricr~t:. Barn kit peur 1~-:
dépistagE> in vit.iro oie 1<-~ muccw_:;= :cia.~~E c:cmp.renant:
- au moins c.~eux ant .c:,c~rf>:~ ~ or~cclonaux c..iirigés spécifiquement c_: c::ntrr cté=s tya1.,_>pc, . cii.f f~er~ent,s c~e la PAP
humaine, l' un au rno iru::cie:~ ~r: Lr~: ~!ru t m:~;rps mono~:.-lonaux est un arrt.icoz:y:>s ~e c ~r~;t:i~rv. rv~c::.c~r;rla:i.ssant:. i_a PAP
humaine lorsqu' i_1. est f:ix~. ~w_rr un ~.~c.rp~:ort:. soli.de,: et, - des instructions pou r ~.~3 rrcà er, f~~, u a nc~ d' uru t est de dépistage c,~e 1_a rrtu<<~o~~i;.c~~ .1 v~ c-.
L' inventi..c.~n c~ ,:n~.'errne c .a 1 c rn~Jrct. r.!ru kit pour 1.e dépistage im vitra de 1~3 rruuc~ i_~;C n~,r .Fr .~~~m~:r~eriarlt - des anticor~>s mcsr-aocl_~:rmur :~~~ .:c;:rzr~a ~ ;.sa:~t: la P~~.t' )~rurnaine naturell.e~ puri.fi ee, ï_' un c~~° ::~:. ~ ..-in r. c~ox p:> ét~.rnt=
un anticorps, de rév~~_l_at._iorv rna:.rclué, - un ré actïfrperrruet.t:ant ~~c. rÉ~~.' ~r~:r ~' arat=i.corps de révélation, - un témoin négatif, - des instructions pou.g:. la mïse en cvsc~-~G:Gvre d' un test de dépistage de la muc:ovï:c~ic~c:.>:~e.
L' irnvemtion c 3n~~e .rria e:-;~a 1 :.-avent °~r~ kït ~~c~ur le dépistage in va'.tzwo r"c, la nu.ac~ .vi:~c.i.c~c: ~- conprrenant: .
- un sérum po.l_yclorcr~.l_ : econrir~is ~<~mt 1.v PA:É' hi:rrruaine, - un réacti f permet tant-, de r c'~~,~Fr 1:-~r 1 c- ~ a ut cox~p;~ rrcarqués, - un témoin néga.t:if , - des instruc:tion~: po.ar 7.a rr~:i. e i~r c:o.m,vr~e d' u:n t:est de dépistage de 1,:3 rn~ucovs.sr~idc.~:;~~..
La 2TalEvur de l.a c.->r~cen.t ral_ ic:an c>1'>tE,nue peut E~ns;uite être comparée à ur's~-° va:rle~:rr ~~...za~~~.-z ~~ ~.t: o~>ten-ue da rus les mêmes coradïtions de tes ~r, err l' ~Gk:~;~err~°ce c~e t:caut~e patlwl.ogie ou en l'absence cle mr_rt.at ~c~r~ lrc~tér:v><.y~.;ct~e ._~~.z géne CE'7'R.
Les irzveriteux':~ ont cc~n ;rr~tce a~~...zE ~..ïrx u~:> >ane ~~~ai,lrol.ogïe telle quEe la rnucov~ scici4i,e, :.y~:~. zu' c:~°. p~:>
rléc~essa:rement associée, ric~tarrunent: crie-: 1.e r:c.,urr-i~;.~.-~rr, ~ une panc,.éatite aigûe mêrn.e dans le cvas d' unc. ire ~~~zi.:i ar;~.,e ~~:a-.jâucïréat~i.c.~ue, on remarque une ~r~.xgrruw>rlt~<~t m~r~ r.~_ ctriif ~ c.:.~itr_L~Je,, ~;~oï.re considérable du t.,~u<~ dfe ~'A~ ~~:ao ~t~r~~. c~x:t <~u t aux: normal.
Cette augmentation k>eut ét:rE ~~e~ ' 'r s t ».s p~.~r ra~~port à
la valeur normale, ,iusc_~ù' à Li::~(:) fc~i:~ w.tte valeczr.. La ~IÇ' Valeur n(ormd.LE~ eS'.~ ~étE:'YIT'.7_Cl;',' r <,.'ï. Y~~C ::C'~ r!<~E_~ ci J..<v1 Irlêdlane telle que défïnï~: c.'~ -a~:or~>:>.
Le C~'OSagE. ~J7~'0~~::'S(..te .~_ca ï::(:~ W:y.:'r'it Y -~ C::i .'~rl E'r'ï
L~~~F~ C~al~.S un échantillon biclogi_~~ue, c~~rr~nr~ ïru~~.<at ic:-rv ~.'urm, ,_rLtf:~ration ou d' unf= mucovs r~::°i.dc>~~e:.~," ~.rr~- s~:~rit k L ~ avrantage d' être utilisable dan: 1e c.adre~ cl~.z ~x.i<:~~o :>st 1c: riP~n<~É:_a1.
Malgré le y~hér~oméne c.~rlrr~.~ et r,~r2 ~~athologic~uE~ de j passage transi t o i.re dar:~r a.e ~~a:arir~ z~= v~~=rr ai rues ernzyrnes au moment de .1a nai4.sar.<:e, l e:, d > <rc,(_ <~ö~ ~ ~r ~ò~E:' re:~tE-~ erg effet statistiquement ~z.aa_ le x~our dr~l f~<_t.k>r l :r rnr.ac:ov-i~7cic~ose ou urv:e mutation hét~~:rc~aygo-.c. ~~tz:- lt:~ .~~~zm.

~O 94/15218 PCT/FR93/01299 CFTR associée à une affection pancréatique. En d'autres termes, lorsque le taux de PAP mesuré dans un échantillon biologique, et en particulier dans le sang, lors d'un test néonatal est anormal, on peut en déduire une anomalie du gène CFTR, associée à la mucoviscidose ou dans certains cas à une altération pancréatique. Les inventeurs ont donc constaté que la présence d'un taux anormalement élevé de PAP dans le sang, lors d'un test néonatal ne peut être confondue avec la sécrétion des enzymes dans le sang qui peut accompagner le phénomène de "stress périnatal".
Par l'expression "taux anormalement élevé" de PAP
on entend une valeur de la PAP par exemple supérieure à
deux fois la valeur de la médiane calculée à partir du taux de PAP déterminé sur un groupe d'échantillons de référence.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le procédé de détection in vitro de la mucoviscidose, ou d'une mutation hétérozygote pour le gène CFTR accompagnée d'une affection pancréatique, est caractérisé par .
- le dosage de la concentration de PAP dans l'échantillon biologique, - la comparaison de la valeur obtenue,_ avec la valeur de la médiane, calculée pour un groupe déterminé d'échantillons de référence préalablement soumis au dosage de la PAP, dans les mêmes conditions.
Par "groupe d'échantillons de référence", on entend de préférence des échantillons obtenus chez des ' patients non homozygotes pour la mutation du gène CFTR.
La médiane dont il est uestion q précédemment est la valeur de la mesure obtenue pour un échantillon donné et choisie de telle façon qu'il existe un nombre égal d'observations (mesures) inférieures et supérieures à cette valeur dans le groupe déterminé

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d'échantillons testés. Lorsque le nombre de mesures effectuées est pair, la médiane est indéterminée entre les deux valeurs centrales observées.
Un procédé avantageux de réalisation de l'invention est encore caractérisé en ce que le dosage de la concentration sérique de PAP comprend .
- la mise en contact d'un échantillon biologique, par exemple le sang ou le sérum, avec des anticorps reconnaissant la PAP humaine, - la détection de la formation d'une réaction immunologique de type PAP-anticorps, - le dosage des complexes PAP-anticorps.
Les anticorps utilisés pour la réalisation de ce dosage peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, voire ces deux types d'anticorps lorsque le test est un test immunologique de type sandwich.
De préférence, l'anticorps formant le complexe immunologique avec la PAP est un anticorps monoclonal.
Avantageusement, il s'agit d'un anticorps monoclonal spécifique de la PAP humaine qui est par conséquent dépourvu de réaction immunologique avec les constituants présents dans l'échantillon biologique normal et en particulier dans le sang normal de référence ; cet anticorps est notamment dépourvu de réaction avec les lectines du sang.
On appelle "sang normal" ou "échantillon normal", un échantillon contenant un taux très faible de PAP.
On aura intérêt dans le cadre de la réalisation du test de détection in vitro de l'invention â
sélectionner un anticorps ou des anticorps spécifiques .
de la PAP donnant lieu à un signal de bruit de fond faible (mesurable en mettant en contact un sérum normal .
ou un échantillon normal avec cet anticorps).

~O 94/15218 , . ' PCT/FR93/01299 Un procédé particulièrement avantageux pour la ' réalisation de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
- la mise en contact d'une quantité déterminée d'un échantillon biologique, par exemple d'un échantillon de sang ou de sérum dans lequel on recherche la PAP, avec un anticorps monoclonal (dit "anticorps de capture") reconnaissant spécifiquement la PAP humaine, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immunologique entre l'anticorps de capture et la PAP lorsqu'elle est présente dans l'échantillon dosé, - la mise en contact du milieu de réaction obtenu à l'étape précédente, avec un anticorps monoclonal (dit "anticorps de révélation") reconnaissant un épitope différent de l'épitoge reconnu par l'anticorps de capture, l'anticorps de révélation étant marqué, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immunologique entre l'anticorps de révélation et l'antigène préalablement lié à l'anticorps de capture, - le lavage pour éliminer les anticorps de révélation n'ayant pas réagi, - la détection des complexes anticorps de capture - antigène PAP - anticorps de révélation, - la détermination de la concentration de PAP, et le cas échéant sa comparaison avec une médiane calculée pour un groupe déterminé d'échantillons de référence préalablement soumis au même dosage de la PAP dans les mêmes conditions.
Pour la réalisation du procédé ci-dessus décrit, on pourra mettre en oeuvre un couple anticorps de .
capture/anticorps de révélation dans lequel l'anticorps de capture sera un sérum polyclonal et l'anticorps de révélation sera un anticorps monoclonal. On peut également utiliser un couple anticorps de A
WO 94/15218 ~ PCT/FR93/01299 ..
capture/anticorps de révélation dans lequel tous les anticorps sont monoclonaux, étant entendu que l'anticorps de capture et l'anticorps de révélation reconnaissent des épitoges distincts sur la PAP.
Des résultats tout à fait satisfaisants peuvent aussi être obtenus lorsque l'anticorps de capture est un sérum polyclonal et l'anticorps de révélation est également un sérum polyclonal, de même nature et le cas échéant de même origine s'agissant de sa préparation, ce dernier étant toutefois marqué.
Afin de réaliser le test ELISA de type sandwich ci-dessus décrit pour la PAP, une sélection des anticorps monoclonaux et/ou de sérums polyclonaux doit être faite, sachant que l'anticorps de capture est destiné à revêtir des puits de plaque de microtitration.
L'homme du métier tiendra compte dans la sélection de ces anticorps, du fait que l'absorption d'un anticorps sur un support solide peut conduire à une perte d'activité à des modifications conformationnelles de la molécule. Ainsi il pourra être nécessaire de vérifier dans un premier temps que l'anticorps choisi ou le sérum choisi est capable de reconnaître la PAP
naturelle et/ou la PAP recombinante après avoir été
fixé sur un support., L'homme du métier sera également en mesure de sélectionner un anticorps monoclonal de révélation reconnaissant un épitoge différent sur la PAP par rapport à l'épitoge reconnu par l'anticorps de capture en réalisant par exemple un test de détection de la PAP
par compétition entre les deux anticorps choisis.
De façon générale, . le couple anticorps de capture/anticorps de révélation ou le sérum polyclonal utilisé, tant pour la capture que la révélation, doit présenter une sensibilité satisfaisante ainsi que permettre une reproductibilité des résultats ' intéressante et une bonne stabilité dans le temps (d'environ 6 mois pour un stockage des anticorps â'

4 ° C) .
Ainsi on mettra avantageusement en oeuvre un anticorps monoclonal de capture désigné 6F3E4, produit par l'hybridome déposé à l'ECACC (European Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Salisbury, Wiltshirte SP4 OJG, Grande Bretagne) sous le n°
92122310 le 23 Décembre 1992. De même, un anticorps de révélation particulièrement intéressant est l'anticorps 16F4B8 produit par l'hybridome déposé à l'ECACC sous le n°92122309 le 23 Décembre 1992.
L'anticorps ou le sérum polyclonal de révélation sera marqué avec tout marqueur approprié afin de permettre la détection du complexe anticorps de capture - antigène PAP - anticorps de révélation formé lors du test de détection. A titre indicatif, on pourra utiliser des marqueurs radioactifs ou encore des marqueurs enzymatiques. A titre d'exemple, on citera le marquage à l'aide de la peroxidase de Raifort.
Le procédé de détection dont question ci-dessus faisant appel à des anticorps, peut être modifié de telle façon que l'anticorps de capture et/ou l'anticorps de révélation sont remplacés par leurs fragments variables ou une partie de ces fragments variables. A titre d'exemple, on peut utiliser pour réaliser la réaction des fragments F(ab')2 ou Fab.
L'invention concerne par ailleurs un anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il reconnait la PAP
humaine naturelle purifiée et/ou recombinante, lorsqu'il est adsorbé sur un support solide.
La PAP a été décrite dans la demande PCT -précitée ; sa séquence nucléotidique et sa séquence en acides aminés sont rappelées à la figure 3.

Des anticorps avantageux répondant â ces conditions sont les anticorps FF3E9: ou 16F4B8 décrits ci-dessus.

5 L' invention a enfin pour objet un ki.t comprenant au moins deux anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre ces épitope~; différents de la PAP humaine, l'un au moins des deux anticorps (anticorps de capture) monoclonaux reconnaissant la 10 PAP humaine lor:~qu'il. est fixé sur un support solide.
De manière générales 1"i.nvention vise l'utilisation d'anticorps monoc:Lonaux reconnaissant spécifiquement la PAP humai.rze ou de sérums polyclonaux reconnaissant la PAP ~zuma~.ne, pour la détection in vitro de la mucoviscido~se, ou d' une affection pancréatique liée â une mutation hétérozygote pour le gëne CFTR.
Entre également dans le cadre d.e l'invention, un kit pour la détection in vitro de 1.a mucoviscidose, ou d'une affection pancréatique associée â une mut<~tion hétérozygote pour le gêne CFTR
comprenant .
des anticorps monoclonaux dé~~r.its et/ou polyclonaux ci-dessus, l'un dE: ceps anticorps (anticorps de :rév~~lation) étant marqué, - un réactif permettant. de révéler l'anticorps de :révélation, un témoin négatif.

10a Le kit peut inclure de plus des instructions pour la mise en oeuvre d'un ~~est de la mucoviscidose.
Un kit préféré pour la réalisation de L'invention comprend à titre d'anticorps de capture, l'anticorps 6F3E4 et â titre d'anticorps de révélation, l'anticorps 16F488.
Un autre hait particuli.érement intéressant contient pour 1a détection cae J.a PAP, un sérum polyclonal. Une partïe de ce sérum est destinée à
1.a capture de la PAP, l'autre partie contient des anticorps marqués pour la révélat:.ion dans un test de type sandwich, de la présence d'un complexe de type PAP-anticorps.

Les sérums polyclonaux appropriés peuvent être préparés chez des animaux, par exemple des lapins, auxquels on a administré la PAP purifiée.
Un kit intéressant comprend ainsi .
- un sérum polyclonal reconnaissant la PAP
humaine, - le cas échéant un sérum polyclonal reconnaissant la PAP humaine, dont les anticorps sont marqués, - un réactif permettant de révéler les anticorps marqués, - un témoin négatif.
L'invention vise aussi l'hybridome producteur de l'anticorps 6F3E4, ayant le n° 92122310 à l'ECACC, ainsi que l'hybridome producteur de l'anticorps 16F4B8, ayant le n°92122309 à l'ECACC.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et dans les figures qui suivent.
Figure 1.
Résultat d'un dosage de PAP sérique au moyen d'un test de type ELISA compétitif faisant appel à des anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin et reconnaissant la PAP humaine purifiée. Ce dosage a été réalisé chez des patients atteints de mucoviscidose.
Figure 2.
- Dosage de PAP chez le nouveau-né.
Figure 3.
Séquence de nucléotides et d'acides aminés de la PAP
humaine.

A/ DOSAGE EXPÉRIMENTAL
1. Dosage de PAP chez des patients atteints de mucoviscidose Protocole : Des prëlèvements sanguins ont été
analysés chez 66 patients agés de 15 jours à 40 ans, chez qui le diagnostic de mucoviscidose avait été
confirmé par le test à 1a sueur (Shwachman, H. et al, Ann.N.Y.Acad.Sci. 1962 93:600) et/ou l'analyse génétique (Collins, F.S. Cystic fibrosis . Molecular biology and therapeutic implications. Science 1992 256:774). Une série d'individus sains d'age correspondant a été étudiée en paralléle. La PAP a été
dosée dans ces prélèvements, en utilisant le dosage suivant .
Dosage de PAP sérique . Ce dosage, de type ELISA
compétitif, utilise des anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin par injections répétées de PAP humaine purifiée (Keim, V. et al, Gastroenterology 1992 103:248). Des protéines de suc pancréatique humain contenant de la PAP ont été adsorbées sur plaques de microtit.ration (100 ng de protéines par puits).
L'échant.illon de sérum (50 u1) est mis dans un tube de type Eppendorf*en présence de 0,5 ~1 de sérum immun et incubé dans un volume final de 100 u1 de Tris 100 mM pH
7,4, 1 % Tween 20* 1,5 % albumine sérique bovine, pendant 2 h à température ambiante. Le mélange est ensuite déposé dans un puits de microtitration traité
comme décrit ci-dessus et incubé pendant 2 h à
température ambiante. Le puits est alors 'rincé trois fois avec 300 ~1 de PBS contenant 0,5 $ de Tween 20* La révélation se fait à l'aide d'un anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de lapin, marqué à la péroxydase *marque .de commerce ~O 94/15218 PCT/FR93/01299 (100 u1 à 0,2 /Cg/ml). La courbe de référence est ' établie à l'aide de PAP purifiée.
Résultats . Les résultats présentés à la Figure 1 montrent * que chez les patients atteints de mucoviscidose la concentration sérique de PAP est toujours supérieure à celle des témoins. Les valeurs des témoins s°échelonnent entre 1 et 10 ng/ml, celles des patients entre 11 et 1900 ng/ml.
* que les valeurs les plus élevées sont observées chez les patients les plus jeunes.
2. Dosage de PAP chez les nouveau-nés : L'analyse anatomo-pathologique de foetus atteints de mucoviscidose a montré dans tous les cas une atteinte pancréatique (Boué A et al, Hum. Genet. 1988, 74:288) .
Les inventeurs en ont déduit que la concentration de PAP pouvait défia être élevée dans le sang des nouveau-nés atteints de mucoviscidose.
Protocole . Ceci a pu être démontré par l'expérimentation suivante .
Le dosage de PAP a été réalisé à partir de cartons provenant de centres de dépistage, portant des échantillons de sang séché. Les cartons correspondaient à quatre groupes d'individus .
Groupe 1 . Témoins (trypsine normale à la naissance) (n - 50) .
Groupes 2, 3 et 4 . Enfants présentant une trypsine élevée â la naissance.
Groupe 2 . Enfants "faux-positifs" (pas d'anomalie du gène CFTR, test à la sueur négatif). (n = 60) Groupe 3 . Enfants hétérozygotes pour le gène CFTR
muté (non atteints), test à la sueur négatif. (n = 33) Groupe 4 . Enfants atteints de mucoviscidose (homozygotes pour le gène CFTR muté, test à la sueur positif) (n = 11) .
Dosage . Le dosage a été réaïisé de la manière suivante .
Les dépôts de sang sur les cartons utilisés dataient de moins de deux mois. Les cartons correspondaient aux normes définies par l'Association Française de Dépistage.
Un disque de 6 mm de diamètre a été découpé dans chaque carton, au niveau de la tache de sang. La quantité de sang correspondante est d'environ ZO ~cl.
Chaque disque a été déposé dans un tube de type Eppendorf''de 1,5 ml de volume total, contenant 150 u1 d'une solution de Tris 100 mM, pH 7,4, 1 % Tween 20;
1,5 % albumine sérique bovine et soumis à agitation sur un appareil Multivortexer* (Amersham France S.A.) pendant 8 h. à tempërature ambiante. La totalité de la solution contenant le sang désorbé est ajoutée à 50 u1 de solution de Tris pH 7,4, 1 ä Tween 20; 1,5 %
albumine sérique bovine contenant 0,5 ~1 d'antisérum anti-PAP (volume total 200 ~cl) et incubée pendant 2 h à
température ambiante. La suite du dosage est réalisée exactement comme décrit ci-dessus.
Résultats : Les résultats, présentés dans la Figure 2, peuvent ëtre résumés comme suit .
1) Les enfants ayant une trypsine négative (Témoins, Groupe 1) ont une concentration de PAP sérique comprise entre 0,01 et 0,1 ng/10 ~1 de sang (médiane 0,065).
2) Les enfants du Groupe 2 (Trypsine positive mais non atteints) présentent les mëmes valeurs que les témoins.
*marque de commerce WO 94/15218 ~ ~~ PCT/FR93/01299 3) Un tiers (11/33) des enfants du groupe 3 (Hétérozygotes) ont présenté une concentration sérique de PAP allant de 0,18 à 0,75 ng/10 ~C1 de sang.
' 4) Tous les enfants atteints de mucoviscidose (11/11) ont présenté une concentration sérique de PAP comprise entre 0,22 et 0,90 ng/lo ~,1 de sang.
Conclusion 1) Aucun enfant témoin n'a présenté une concentration sanguine de PAP supérieure à 0,1 ng/10 ~1 de sang.
Cette expérience montre que toute valeur supérieure à 2 fois la médiane (supérieure à 0,11 ng/10 /C1 de sang) est anormale.
2) D'ailleurs, tous les enfants atteints de mucoviscidose ont montré des valeurs de PAP dans le sang supérieures à ce seuil.
3) Contrairement au système basé sur le dosage de trypsine, le dosage de PAP semble ne sélectionner que les enfants ayant une mucoviscidose et ceux, parmi les hétérozygotes pour le gène altéré, dont 1°atteinte pancréatique est la plus prononcée.
Le test proposé présente donc les qualités requises pour son application au dépistage néonatal de la mucoviscidose.
B/ DOSAGE INDUSTRIEL
1. A l'aide d'anticor s monoclonaux La mise au point d'un test ELISA de type "sandwich" pour la PAP a nécessité de sélectionner deux anticorps monoclonaux, reconnaissant deux épitoges différents sur l'antigène .
l' un destiné à revêtir les puits de plaques de microtitration (anticorps de capture), . l'autre, couplé à un enzyme, destiné à révéler l'antigène adsorbé sur les puïts (anticorps de révélation).
Cette sélectïon a été réalisée avec des anticorps monoclonaux produits en ascites et purifiés par chormatographie d'affinité sur colonne de protéine-A
Sépharose*pour les IgG ou sur colonne d'imunoadsorbant pour les IgM (anticorps monoclonal de rat anti-IgM de souris couplé à une matrice de Sépharose~.
L'adsorption d'une immunoglobuline sur un support solide se traduit par des modifications conformationnelles qui peuvent entraïner une perte d'actïvité de la molécule. Tous les anticorps monoclonaux anti-PAP obtenus dans le laboratoire ont donc, dans un premier temps, été testés pour leur capacité, après adsorption sur ,des plaques de microtitration (NUNC maxisorp), à reconnaitre la PAP
naturelle et recombinante. Après incubation, les complexes antigène-anticorps ont été révélés à l'aide de fragments Fab d'immunoglobulines de lapin anti-PAP
conjugués â la peroxydase en utilïsant comme substrat de l'enzyme de l'o-phenylènedïamine.
Toutes les immunoglobulines ayant conservé cette capacité ont été retenues comme antïcarps potentiels de capture et couplées à de la biotine.
Ces anticorps biotinylés ant été utilisés en tests de compétition pour sélectionner un anticorps monoclonal de révélation.
Ces tests ont été réalisés avec de la PAP
(naturelle et recambinante) adsorbée sur .des puits de plaques de microtitration revétus d'IgG de lapin anti-PAP. La fixation des anticorps monaclonau}; biotinylés sur l'antigène (révélée à l'aide d'un complexe avidine-POD) a été mesurée en absence ou en présence *marque ~e commerce d'un excès des différents anticorps monoclonaux à
tester.
Tous les anticorps monoclonaux n'entrant pas en compétition avec au moins un des antïcorps biotinylès (et reconnaissant donc un épitope dïfférent), ont été
sélectionnés comme anticorps potentiels de révélation.
Ils ont ensuite été couplés à la POD sous forme de fragment Fab' avant d'être utilisés poux' la mise au point de la forme finale du test ELISA de dosage de la PA P .
Cette mise au point a nécessité de rechercher le couple anticorps de capture-anticorps de révélation qui permette d'obtenir la meilleure sensïbilitè du test, la meilleure reproductibilité des résultats et la meilleure stabilité des réactifs dans le temps.
Deux anticorps monoclonaux ont répondu à
l'ensemble de ces critères de sélection:
. l'anticorps 6F3E4 utilisé en capture, . l'anticorps 16F488 utilisé en révélation.
2. A l'aide de sérums polyclonaux Un dosage ELISA PAP de type sandwich adapté aux conditions de dépistage a été mis au point. Ses caractéristiques sont les suivantes .
Production des anticorps .
L'antigène était de la PAP humaine hautement purifiée, selon la technique suivante . à partir de suc de pancréas transplanté, lyophilisé, une première séparation par chromatographie d'échange d'ions (HPLC, colonne MonoS'~ a penais de séparer un pic, contenant la PAP ~t un contaminant de haut poids moléculaire. Ce pic a ensuite été résolu par tamisage moléculaire (HPLC, colonne Sephacryl 200 HR'~. La PAP a alors été
recueillie sous forme d'une fraction homogène. Le *marque de commerce contrôle réalisé par électrophorèse en gel SDS et coloration à l'argent a permis de garantir une pureté
supérieure à 98 %.
L'immunisation a été réalisée selon la technique habituelle du laboratoïre, décrite par Reim V. et al (Gastroenterology, 1992, 10:248).
La qualité des immunsérums a èté testée par utilisation en Western blots de dilutïons successives.
Construction de l'ELISA .
Il s'agit d'un ELISA sandwich polyclonal/polyclonal.
Les immunoglobulines de l'immunsérum ont été
purifiées par affinité sur colonne de protéine A-Sépharose Les immunoglobulines destinées à la révélation ont été marquées à la biotine selon la téchnique habituelle connue de l'homme du métier. Le système de révélation faisait intervenir l'avidïne P~D.
La sensibilité du test est de 50 pg/ml.
Résultats obtenus .
Quarante prélëvements sur carton de nouveau-nés sains ont été testés. Les concentrations de PAP y étaient toutes inférieures à 60 pg/ml. Un nouveau né
atteint de mucoviscidose avait une valeur de 800 pg/ml.
Six enfants (âge 3 mois-10 ans) atteints de la maladie, dont le sang a été aussi prélevé sur carton, ont montré
des valeurs s'échelonnant entre 0,5 ng/ml et 1,8 ng/ml.
Ces résultats confirment les différences déjà
observées avec le dosage réalisé avec les anticorps monoclonaux.
*marque de commerce -

Claims (27)

REVENDICATIONS

1. Procédé de dépistage in vitro de la mucoviscidose, comprenant le dosage de la concentration de Pancreatitis-Associated Protein (PAP) dans un échantillon biologique, où l'observation d'un taux anormalement élevé de PAP dans ledit échantillon biologique par rapport aux valeurs obtenues dans un groupe déterminé d'échantillons de référence est utilisée pour le dépistage de la mucoviscidose.

2. Procédé de dépistage in vitro de la mucoviscidose, caractérisé par :

- le dosage de la concentration de Pancreatitis-Associated Protein (PAP) dans un échantillon biologique, - la comparaison de la valeur obtenue avec les valeurs obtenues dans un groupe déterminé
d'échantillons de référence, et - le dépistage de la mucoviscidose par l'observation d'un taux anormalement élevé de PAP
dans l'échantillon biologique.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le dépistage de la mucoviscidose est réalisé
lors d'un test néonatal.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que le taux anormalement élevé de PAP est supérieur à au moins deux fois la valeur de la médiane calculée à partir du taux de PAP déterminé
sur un groupe d'échantillons de référence.

20 Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à
4, caractérisé en ce que le dosage de la concentration de PAP comprend :

- la mise en contact de l'échantillon biologique avec des anticorps reconnaissant la PAP humaine, - la détection de la formation d'une réaction immunologique de type PAP-anticorps, -le dosage des complexes PAP-anticorps.

6.Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les anticorps sont des anticorps monoclonaux.

7.Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les anticorps monoclonaux sont spécifiques de la PAP humaine et sont par conséquent dépourvus de réaction immunologique avec les constituants présents dans le sang normal ou dans un échantillon biologique normal de référence.

8.Procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce que les anticorps reconnaissant la PAP humaine sont contenus dans un sérum polyclonal et en ce que la détection de complexes PAP-anticorps est réalisée à
l'aide d'un sérum polyclonal contenant des anticorps anti-PAP marqués.

9.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- la mise en contact d'une quantité déterminée d'un échantillon biologique avec un anticorp monoclonal de capture, reconnaissant spécifiquement la PAP
humaine, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immunologique entre l'anticorp de capture et la PAP lorsqu'elle est présente dans l'échantillon dosé, - la mise en contact du milieu de réaction obtenu à
l'étape précédente, avec un anticorps monoclonal de révélation reconnaissant un épitope différent de l'épitope reconnu par l'anticorps de capture, l'anticorps de révélation étant marqué, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immunologique entre l'anticorps de révélation et l'antigène préalablement lié à l'anticorps de capture, - le lavage pour éliminer les anticorps de révélation n'ayant pas réagi, - la détection des complexes anticorps de capture-antigène-anticorps de révélation, - la détermination de la concentration de PAP.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'anticorps de révélation est couplé à la peroxydase de raifort.

11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que l'anticorps de révélation est remplacé par ses fragments F(ab')2 ou Fab'.

12. Procédé l'une quelconque des revendications 9 à
11, caractérisé en ce que l'anticorps de capture est l'anticorps 6F3E4 produit par l'hybridome déposé à
l'ECACC sous le numéro 92122310, le 23 décembre 1992.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à
12, caractérisé en ce que l'anticorps de révélation est l'anticorps 16F4B8 produit par l'hybridome déposé

à l'ECACC sous le numéro 92122309, le 23 décembre 1992.

14. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que les anticorps monoclonaux de révélation et de capture, sont remplacés par des sérums polyclonaux reconnaissant la PAP humaine.

15. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il s'agit de l'anticorps 6F3E4 ou de l'anticorps 16F4B8.

16. kit pour le dépistage in vitro de la mucoviscidose comprenant - au moins deux anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre des épitopes différents de la Pancreatitis-Associated Protein (PAP) humaine, l'un au moins des deux anticorps monoclonaux est au anticorps de capture reconnaissant la PAP humaine lorsqu'il est fixé sur un support solide; et, - des instructions pour la mise en ~uvre d'un test de dépistage de la mucoviscidose.

17. Kit pour le dépistage in vitro de la mucoviscidose comprenant :
- des anticorps monoclonaux reconnaissant la Pancreatitis- Associated Protein (PAP) humaine naturelle purifiée, l'un de ces anticorps étant un anticorps de révélation marqué, - un réactif permettant de révéler l'anticorps de révélation, - un témoin négatif, - des instructions pour la mise ~uvre d'un test de dépistage de la mucoviscidose.

18. Kit pour le dépistage in vitro de la mucoviscidose comprenant :

- un sérum polyclonal reconnaissant la Pancreatitis-Associated Protein (PAP) humaine, - un réactif permettant de révéler les anticorps marquées, - un témoin négatif, - des instructions pour la mise en ~uvre d'un test de dépistage de la mucoviscidose.

19. Utilisation d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la Pancreatitis-Associated Protein (PAP) humaine ou de sérums polyclonaux reconnaissant le dépistage in vitro de la mucoviscidose.

20. Procédé selon la revendication 5 ou 9, caractérisé en ce que l'échantillion biologique est un échantillon de sang ou de sérum.

21. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les anticorps monoclonaux sont dépourvus de réaction avec les lectines du sang.

22. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les anticorps anti-PAP marqués sont biotinylés.

23. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la concentration de PAP déterminée est comparée avec une médiane calculée pour un groupe déterminé
d'échantillons de référence préalablement soumis au même dosage de la PAP dans les mêmes conditions.

24. Kit selon la revendication 17, comprenant en outre un sérum polyclonal reconnaissant la PAP humaine, dont les anticorps sont marqués.

25. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les anticorps reconnaissant la PAP sont contenus dans un sérum polyclonal.

26. Hybridome déposé à l'ECACC sous le numéro 92122309 le 23 décembre 1992.

27. Hybridome déposé à l'ECACC sous le numéro 92122310 le 23 décembre 1992.