CH267223A - Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique. - Google Patents

Description

  Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique.    La présente invention se rapporte à un  procédé de préparation d'un nouvel antibio  tique. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on  inocule un milieu nutritif avec le      St.repto-          myces        venezuelae ,    en ce qu'on fait incuber  le mélange en aérobiose et en ce qu'on sépare  du milieu nutritif le produit antibiotique  formé. Cet antibiotique     est    un nouveau  composé chimique utilisable     comme    agent  thérapeutique.  



  Le nouveau composé antibiotique a la for  mule     empirique        C11pI,O,,N.=Cl,    et un poids  moléculaire de 323,1. Il contient, selon     l'ana-          lyse,        41,01/o        de        carbone,        3,74%        d'hydrogène,          8,64%        d'azote        et.        21,

  7%        de        chlore.        On        obtient     ce composé sous forme     optiquement    active;  son pouvoir rotatoire (a) D est de -2515     C     dans l'acétate d'éthyle et de +19  dans l'étha  nol.

   A raison de son pouvoir rotatoire néga  tif dans l'acétate d'éthyle, on est convenu de  désigner ce composé comme la forme 1 ou  lévogyre. lia formule développée de ce com  posé est  
EMI0001.0025     
    Un tel corps peut exister non seulement  sous les formes lévogyre et de     dextrogy        re,       dues à la présence de deux atomes de car  bone asymétriques, mais aussi sous deux  formes     diastéréomériques:        eis    et     trans    (posi  tion des groupes attachés aux deux atomes de  carbone asymétriques par rapport au plan dans  lequel se trouve ces deux atomes de carbone).

    Le nouvel antibiotique a. une forme structu  relle isomérique analogue à, la     pseudo-éphé-          drine        (y,,-éphédrine),    qui constitue la forme       trans    de     l'éphédrine.    De ce fait, le nom     ehi-          mique    exact du nouveau antibiotique obtenu  par le procédé selon la présente invention est:

         1-iy-1-p-nitrophényl-    2 -     dichloroacétamido    -     pro-          pane-1,3-diol    ou     1-trans-1-p-nitrophényl-2-di-          chloroacétamido-propane-1,3-diol.    Le nouveau  composé constitue donc la forme     1-trans     (ou     1-yp)    du corps représenté par la formule  développée ci-dessus. Il est de pratique cou  rante, pour les nouveaux composés présen  tant une isomérie structurelle, de     désigner     une forme structurelle déterminée selon la  forme structurelle correspondante d'un com  posé dont la structure est bien établie.  



  Le nouvel antibiotique est un solide qu'on  obtient sous forme d'aiguilles ou de lamelles  allongées incolores, fondant à     150-151     C  (non corrigé). Le composé est caractérisé en  outre par le fait qu'il présente une valeur  <I>à</I> 278     mp    et une valeur     F,        i        "O    de 312       (IICl    : 0,1 N) à l'analyse spectrale par ab  sorption dans ].'ultraviolet.  



  Le (1) -     y,    -1- p -     nitrophényl-2-dichloracét-          amidopropane-1,3-diol    est soluble clans l'eau      distillée à la température ordinaire jusqu'à  2,5     mg/cm3        environ.    Il est relativement inso  luble dans une solution froide de bicarbonate       de        sodium    à 5     %,

          mais        il        se        dissout        lente-          ment        dans        une        solution    à 5     %        d'hydroxyde     de sodium. Il peut être recristallisé dans l'eau  ou dans des solvants ou des mélanges de sol  vants organiques tels que le     dichlorure    de  méthylène, le     dichlorure    d'éthylène et le mé  lange     éther-éther    de pétrole.

   Il est soluble  dans un grand nombre de solvants organiques  variés et peut être extrait de ses     solutions     aqueuses par la plupart des     solvants    orga  niques non miscibles avec l'eau. Il est soluble  par exemple dans les corps suivants, qui peu  vent servir à l'extraire de ses     solutions     aqueuses:     cyclohexanone,        méthyl    -     isobutyl-          cétone,        n-butanol,    acétate d'amyle, acétate  d'éthyle, nitrobenzène,     nitrométhane    et éther.

    Cependant, ce composé est pratiquement     inso-          hible    dans les hydrocarbures aromatiques et  aliphatiques comme le benzène, le toluène, le       pentane    et l'éther de pétrole.  



  Contrairement à la plupart des substances  antibiotiques connues, l'antibiotique obtenu  conformément à la présente invention pré  sente une stabilité remarquable à la chaleur,  aux acides et aux alcalis. On a trouvé, par  exemple, qu'on peut le chauffer dans l'eau  distillée à 37  C pendant un mois au moins,  ou à 100 C pendant environ cinq heures, sans  qu'il montre une perte notable d'activité anti  biotique. Dans des conditions semblables, les  antibiotiques bien connus, comme la pénicil  line, la     streptothricine    et la streptomycine,  sont complètement inactivés. Le composé est  stable en solutions aqueuses dans un domaine  de     pl,    allant de 0,4 à 10 pendant 24 h. au  moins, à la température ordinaire.

   Les essais  ont montré qu'il est beaucoup plus stable dans  des solutions aqueuses acides que la strepto  mycine, qui est le plus stable des antibio  tiques connus. Par exemple, la streptomycine       est        inactivée    à     90        %        en        24        heures        par        une     solution normale d'acide chlorhydrique à la  température ordinaire, tandis que le nouveau  composé garde, dans les mêmes conditions, sa  puissance antibiotique complète.

      Ce nouveau composé a un fort pouvoir  bactériostatique contre les bactéries gram  négatives aussi bien que contre les bactéries  gram-positives des types     acido-résistants    ou  non. Il est efficace également contre le micro  organisme responsable du typhus     exanthéma-          tique,    comme      Ricliettsia        prowazelii .    Parmi  les bactéries     gram-positives    contre lesquelles  il est actif, on peut citer:

        Streptococcus          haemolyticus ,        Staphylococcus        aureus ,         Ba-          cillus        subtilis     et      lllycobacterium        tubercu-          losis .    Parmi les nombreuses bactéries     gram-          négatives    contre lesquelles le composé exerce  son action bactériostatique, on trouve les bac  téries telles que      Bscherichia        coli ,     Salmo  nelle     schottmuelleri ,

           Iilebsiella        pneumoniae      et      Shigella    para     dysenteriae     (Sonne).     I:ii     général, l'action bactériostatique de ce nouvel  antibiotique est similaire à celle de la strepto  mycine, mais dans certains cas, notamment  dans le cas de      Shigella        paradysentariae ,    il  est beaucoup plus actif que la streptomycine.  D'une manière générale, il est     phis    actif  contre les bactéries     grain-négatives    que contre  les bactéries gram-positives.

      La toxicité de ce nouvel antibiotique     est     très inférieure à celle des     antibiotiques    con  nus comme la     tyrothricine,        l'actinomycine,    la       clavicine,    etc., mais environ égale à celle de  la streptomycine.  



  On a trouvé que le nouvel antibiotique  peut atteindre dans le sang des concentra  tions thérapeutiques, qu'il soit administré par  voie parentérale ou par voie orale. Le fait  qu'il exerce un effet utile quand il est admi  nistré oralement est     surprenant    quand on  sait que jusqu'à maintenant la pénicilline est  presque le seul antibiotique qui donne des  concentrations sanguines thérapeutiques par  administration orale. Même dans ce cas, la  destruction de la. pénicilline     par    les liquides  digestifs oblige d'administrer une quantité de  pénicilline trois à quatre fois plus élevée que  la dose par voie     intramusculaire    afin d'obte  nir des concentrations sanguines thérapeuti  ques.

   Les antibiotiques les plus actifs contre  les bactéries gram-négatives, comme la     str    ep-           tomycine,    sont complètement inactifs quand  ils sont administrés par voie orale, par le  fait qu'ils ne sont pas absorbés depuis le  tractus intestinal. On voit ainsi que ce nou  veau composé antibiotique est le premier anti  biotique présentant une forte activité contre  les bactéries gram-négatives qui soit     théra-          peutiquement    actif par administration orale.  La posologie ordinaire de ce nouvel antibioti  que par voie orale ou parentérale est d'un à  dix grammes par jour, selon le type et la  gravité de l'infection.

      Le     (L)-y)-1-p-nitrophényl    - 2 -     dichloroacét-          amidopropane-1,3-diol    est préparé par culture  d'un actinomycète appelé  Streptomyces       venezuelae .    Ce micro-organisme se rencontre  en particulier dans le sol et il est caractérisé  par un mince     mycelium    arborescent ne for  mant normalement pas ou ne formant que  rarement de septum, des bourgeons aériens  donnant naissance, apparemment d'une ma  nière endogène, à des chaînes de spores uni  cellulaires normalement non fragmentées en       oïdiums,    par des     sporophores    non arborescentes  et par des chaînes de spores.

   Une culture de  ce micro-organisme a été enregistrée par le   Park, Davis and Company Culture Bureau:>  sous le N  04745. On peut obtenir des cul  tures de ce micro-organisme en mélangeant  des cultures de bactéries spécifiques inhibées  par le micro-organisme avec une solution  aqueuse     d'agar,    et en ajoutant une terre con  tenant le micro-organisme désiré,      Strepto-          myces        venezuelae .    Après incubation du mé  lange pendant un à dix jours, des colonies  de l'actinomycète recherché et d'autres     acti-          nomycètes    antagonistes apparaissent.

   Les co  lonies de  Streptomyces     venezuelae     sont sé  parées, transférées sur un milieu de culture  frais et isolées plus tard sous forme d'une  culture pure selon les méthodes ordinaires.  



  La culture de l'organisme peut s'effectuer  en milieu     aqueux,    d'un grand nombre de ma  nières différentes. Par     exemple,    on peut cul  tiver le micro-organisme en aérobiose à la  surface du milieu, ou on peut le cultiver     au-          dessous    de la surface du milieu, par exemple    en     submersion,    si on fournit simultanément  de l'oxygène.  



  La culture en     surface    du     microorganisnie     comprendra par exemple l'inoculation d'une  mince couche, ordinairement inférieure à 2 cm  environ, d'un milieu de culture aqueux stérile,  avec      Streptomyces        venezuelae     et l'incuba  tion de la culture en aérobiose à une tempé  rature comprise entre 20 et 40  C, de préfé  rence à la température ordinaire (25  C en  viron), pendant une période de dix à quinze  jours, le pH du milieu étant maintenu entre  6 et S.

   On élimine ensuite le     mycelium    du  liquide contenant de     (l)-y-1-p-nitrophényl-2-          dichloroacétamidopropane-1,3-diol    recherché, et  on isole le produit à partir du liquide de  culture par l'un des moyens décrits ci-après.  



  Toutefois, pour la préparation du<I>(d)-y@-1-</I>       p-nitrophényl-2-dichloroacétamidopropane-l,i-          diol    sur une grande échelle, on opère de pré  férence en cultures submergées ou profondes.  A cet effet, on inocule un milieu de culture  aqueux stérile avec  Streptomyces     venezuelae      et on fait incuber sous agitation et aération  à une température de 20 à 40  C, de préfé  rence au voisinage de     25     C, pendant deux à  sept jours. Dans ces conditions, l'organisme  se développe sous forme de particules plus ou  moins discrètes dispersées dans tout le milieu,  contrastant avec la pellicule     phis    ou moins  continue présente à la surface du milieu lors  de la culture en surface.

   Par suite de cette  distribution de l'organisme dans tout le  milieu, on peut cultiver de grands volumes à  la fois du milieu de culture inoculé dans les  grandes cuves utilisées ordinairement dans  l'industrie des fermentations. On a trouvé  que les cuves de fermentation fixes équipées  avec les dispositifs d'agitation et d'aération  appropriés, aussi bien que les tambours de       fermentation    rotatifs horizontaux, sont. par  ticulièrement utiles dans ce cas. Cependant,  pour la préparation de quantités plus petites  de l'antibiotique ou de cultures du micro  organisme, une culture profonde peut être  effectuée dans de petits flacons qui sont se  coués ou agités par un dispositif mécanique  approprié.      On peut réaliser de nombreuses manières  l'agitation et l'aération du milieu de culture.

    L'agitation peut être produite par un. bras  seur ou par un autre dispositif mécanique  d'agitation similaire, en faisant tourner ou en  secouant le récipient de fermentation     lui-          même,    par de nombreux dispositifs de pom  page, ou par passage d'air ou d'autres gaz  contenant de l'oxygène dans le milieu.

   On  petit produire l'aération par injection d'air  ou d'autres gaz     contenant    de l'oxygène dans  le milieu de fermentation à travers des  tuyaux ouverts, des tuyaux perforés, des or  ganes de diffusion poreux tels que des     -ba-          guettes    de charbon, du carborundum, du  verre fritté, etc., ou en vaporisant, en proje  tant     out    en versant le mélange dans     ott    à  travers une atmosphère contenant de l'oxy  gène.    On peut utiliser une grande variété de  milieux de culture pour exécuter le procédé.

    On a trouvé cependant qu'on obtient les meil  leurs résultats avec un milieu aqueux con  tenant une source de carbone assimilable et  une matière protéique. lia source de carbone  assimilable     petit    être un polyol, un mono-,  di- ou polysaccharide, et la matière protéique  une protéine non modifiée ou un produit de  dégradation de protéines, particulièrement un  produit provenant de l'hydrolyse de protéines.  De tels produits de dégradation sont, par  exemple, les     protéoses,    les peptones, les poly  peptides, les peptides et les aminoacides.  



  On peut mentionner comme sources de car  bone assimilable le glycérol, la     sorbite,    le glu  cose, le fructose, le     sucrose,        l'inuline,    les dex  trines et les amidons. Ces sources de carbone  peuvent être utilisées sous forme purifiée ou  sous forme de concentrés tels que les con  centrés de petit-lait, les amidons liquéfiés ou  modifiés, la     liquieur    d'infusion de céréale, les  mélasses, le sirop de céréale, les mélanges de  brasserie, etc.

   Certains mélanges de brasserie,  de même que certains concentrés de céréale  sont suffisamment riches en protéines pour  qu'il ne soit pas nécessaire d'ajouter au mi  lieu des matières protéiques     supplémentaires.       Ces dernières substances contiennent aussi une  quantité appréciable de corps     minéraux        et    de  facteurs de croissance qui sont favorables à  la production de l'antibiotique. On a trouvé  que les alcools sucrés, et en particulier le       glycérol,    sont des constituants très     av        ant    a  geux du milieu, car ils     att;gntentent    la quan  tité de l'antibiotique qui peut être obtenue à  partir d'un milieu donné.  



  On peut citer, à titre d'exemples de ma  tières protéiques pouvant     être    utilisées dans  le milieu de culture:     l'hy        dr        olysat    de caséine  obtenu par acide ou par     enzyme,        les    eaux de  lavage de grains distillés, les principes solu  bles du distillat, la liqueur d'infusion de blé  ou de froment, le petit-lait ou les concentrés  de petit-lait, la farine de soya.,     l'hydrolvsat     acide de blé out le gluten de froment, la pep  tone, la levure de     brasserie,

      les déchets de  viande et les mélanges synthétiques     d'anrirto-          acides.    Il n'est pas nécessaire     d'introduire    ces  matières protéiques sous forme     purifiée,    les  matières impures qui contiennent des traces  de facteurs de croissance et, des quantités con  sidérables d'aliments minéraux étant. très in  diquées.

   Un mélange de peptone ou     d'arrtirto-          acides    avec des     rincures    de distillation (le  grains séchés ou des solubles de distillation  est     particulièrement    avantageux     comme        source     de matière protéique pour le milieu.  



  On peut isoler l'antibiotique cristallisé pur  du milieu de culture d'un grand nombre de  manières différentes. Cependant, le mode     (le     faire préféré consiste à éliminer le matériel  solide présent dans le liquide de     culture    brut  à, un     pli    inférieur à. 10;

   à     traiter    la     solution     avec un solvant organique     avant    un coeffi  cient de distribution     solvant-catt    pour l'anti  biotique     supérieur    à 9, tel que la     eyel.ohexa     none, le     butanol,    l'acétate     d'éthyle    et la       méthyl-butyl-cétone,    à. éliminer le solvant or  ganique de     l'extrait;

      à.     traiter    le résidu avec  un solvant organique     ayant    Lui coefficient de  distribution     solvant-eau    pour     l'antibiotique     compris entre 1 et 9, tel     nue    le.     nit.robenzèrre,     le     nitrométhane,    l'éther     diétlivlique    et. le di  chlorure d'éthylène; à laver l'extrait avec un.

        acide minéral dilué et de l'eau ou, quand on  a utilisé comme solvant d'extraction un sol  vant tel qu'un     dialcoyl-éther    inférieur (éther       diéthylique    et autres) ou le     dichlorure    d'éthy  lène, à faire passer l'extrait sur une colonne  d'adsorption du type à l'oxyde d'aluminium;  à ajouter de l'eau à l'extrait obtenu avec le  solvant organique; à évaporer le solvant orga  nique du mélange; à traiter la solution  aqueuse avec un solvant organique des  graisses dans lequel l'antibiotique soit prati  quement insoluble, tel que le benzène ou  L'éther de pétrole; à évaporer la solution  aqueuse jusqu'au point de cristallisation et à  récupérer l'antibiotique cristallisé de la solu  tion.

   Quand on     utilise    la méthode d'extrac  tion acide, il est préférable aussi de traiter  l'extrait organique avec un alcali dilué tel que  le bicarbonate (le     sodium,    afin d'éliminer les  impuretés acides.  



  Une modification du mode de faire ci-des  sus consiste à épuiser la première extraction  du liquide (le culture clarifié avec un solvant  organique et à évaporer le solvant de l'extrait.  Dans     ee    but, le liquide de culture clarifié  est traité avec un solvant organique ayant un  coefficient de distribution solvant-eau pour  l'antibiotique compris entre 1 et 9, le reste  des opérations étant effectuées comme décrit  ci-dessus.  



  Un autre moyen qui petit être utilisé  pour isoler le     (l)-yp-1-p-nitrophényl-2-dichloro-          acétamidopropane-1.,3-diol    recherché du liquide  de culture clarifié consiste à adsorber l'anti  biotique sur du charbon activé et à le     récu-          pérer        avec        de        l'éther        ou        de        l'acétone    à     80        %.          L'antibiotique    est isolé à partir dit liquide de  récupération par addition d'eau, distillation  du solvant organique,

   élimination de toute  matière gommeuse qui se sépare et concen  tration clé la solution aqueuse jusqu'au point  de cristallisation.  



  La présente     invention    est illustrée par les  exemples suivants:  <I>Exemple 1:</I>  On place un mélange de 180     g    de glycérol,  90 g de peptone, 90 g des eaux de lavage de    grains séchés et distillés, 90 g de chlorure  de sodium et     suffisamment    d'eau distillée  pour amener le volume à 18 litres, dans une  cuve à fermentation fixe en verre pourvue  d'une tête en acier inoxydable et d'un agita  teur. La cuve de fermentation comporte     aussi     des plateaux de chicane verticaux et, près du  fond, un tuyau circulaire perforé pour la dif  fusion d'air.  



  Le     pli    du milieu de culture est ajusté à  7,5 environ avec une solution d'hydroxyde de  sodium et la cuve de fermentation est placée  dans un autoclave. La cuve de fermentation  et le milieu sont stérilisés à la vapeur à  120  C pendant une heure, la cuve est re  froidie et enlevée ensuite de l'autoclave. On  inocule le milieu avec 900 cm' environ d'une  culture en flacon secouée de  Streptomyces       venezuelae ,    préparée par inoculation d'une  portion de 100 cm' d'un milieu de culture  stérile tel que celui décrit plus haut, avec  des spores du champignon et par incubation  du mélange dans des flacons     d'Drlenineyer     de 500     em3    placés sur une machine à secouer  rotative, pendant 72 h. environ à la tempé  rature ordinaire.  



  Après     inoculation,    le milieu de culture est  incubé à     24-25     5 C pendant 65 à 70 h. Pen  dant l'incubation, on fait passer dans le mi  lieu de l'air stérile par le tuyau de diffusion,  à la vitesse clé 0,8 à 1 volume par volume  de milieu par minute, l'agitateur tournant à  une vitesse d'environ 200     timin.     



  La table suivante donne la production  d'antibiotique en fonction du temps:  
EMI0005.0031     
  
    Période <SEP> d'incubation <SEP> Microgrammes <SEP> d'antibiotique
<tb>  (heures) <SEP> par <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> milieu <SEP> de <SEP> culture
<tb>  23 <SEP> 44
<tb>  40 <SEP> 106
<tb>  47 <SEP> 116
<tb>  6.1. <SEP> 133
<tb>  71. <SEP> 132       Le     (l)-y-1-p-nitrophényl-2-dichloroacét-          amidopropane-1,3-cliol    recherché est isolé du      milieu de culture brut ou  bière , contenant  132     microgrammes    d'antibiotique par cm", de  la manière suivante:

    La  bière  brute est acidifiée à     im    pH  de 2 avec de l'acide     chlorhydrique    dilué et  traitée ensuite avec 1050 g environ de silicate  d'aluminium adsorbant. Après brassage pen  dant une demi-heure à une heure environ,  on ajoute encore 1050 g de l'adsorbant et on  filtre le mélange sur une couche filtrante de  silicate d'aluminium. Après lavage avec de  l'eau, on sépare le précipité et on traite la   bière  clarifiée et les portions de lavage  avec un quart de volume d'acétate d'éthyle.  On sépare la couche d'acétate d'éthyle, on ré  pète une fois l'extraction et on élimine la.  solution aqueuse restante.

   On sèche les  extraits d'acétate d'éthyle réunis sur du sul  fate de sodium et on distille l'acétate d'éthyle  sous vide en maintenant la température     dix     résidu au-dessous de 300     environ.    On extrait  l'antibiotique recherché à partir du résidu  brun avec de petites portions d'éther, en uti  lisant au total 450     em3    environ.  



  On verse l'extrait éthéré combiné à tra  vers une colonne     chromatographique    d'oxyde       d'aluminium,    préalablement ajustée à un pH  de 4,7. La colonne utilisée dans ce stade peut  être relativement courte, mais doit contenir  15 g environ d'oxyde d'aluminium pour  100     em3    d'extrait éthéré. Après avoir lavé la  colonne avec 1250     crri3        environ    d'éther pour  éliminer tout l'antibiotique restant, on réunit  les solutions éthérées effluentes et on     évapore     l'éther au vide. On traite le résidu plusieurs  fois avec au total 2200     em3    d'eau distillée  environ et on élimine le résidu insoluble.

   On  réunit les extraits aqueux, on les traite avec  deux volumes et demi d'éther de pétrole et  on élimine les extraits à l'éther de pétrole.  On peut aussi ajouter de l'eau à la solution  éthérée obtenue après le passage sur la co  lonne d'adsorption, distiller l'éther     dii    mé  lange des deux phases et traiter la solution  aqueuse résiduelle avec l'éther de pétrole.

   La  couche     aqueuse    ou l'extrait obtenu par l'une  ou l'autre des méthodes des précédentes est         eoneentré    dans le vide jusqu'au point de cris  tallisation, le concentré est refroidi et le       (Z)-y-1-p-nitrophény        1-2-dichlor        oac6tamidopro-          pane-1,3-diol    cristallisé blanc est recueilli.  On obtient à ce stade 1,54 g environ d'anti  biotique, fondant au voisinage de 144  5 C.  



  On peut récupérer une nouvelle quantité  du produit désiré des     liqueurs-mères    par  extraction à quatre reprises avec un     volume     égal d'éther, élimination de l'éther sous vide,  traitement répété du résidu avec du     diclilo-          rure    de méthylène bouillant et     concentration     des extraits au     dichlorure    de méthylène jus  qu'au point de cristallisation.

   L'extrait au       dichlorure    de méthylène est refroidi à 5  C  environ et on recueille le     (l)-ip-1-p-nitroplié-          nyl    - 2 -     dichlor        oacétaniidopropane-1,        3-diol    re  cherché. On obtient de cette manière 0,18  du produit, fondant à 145  C environ.  



  Après une ou deux     recristallisations    des  substances ci-dessus dans le     dichlorure    de  méthylène, le     dichlorure    d'éthylène ou un  mélange d'éther et d'éther de pétrole, on ob  tient le     (l)-zp-1-p-nitrophényl-2-diehloroacét-          amidopropaiïe-l,3-diol    pur sous forme d'ai  guilles ou de lamelles allongées incolores fon  dant à     150-15l     C (non corrigé) et ayant un  pouvoir rotatoire (a)

   D de     -25'l    5 C dans  l'acétate d'éthyle et     -f-18     C dans     l'éthanol.     L'analyse du produit donne les     résultats        sui-          vants:

          C        41,0%,        11        3,74%,        N        8,64%        et        Cl          organique        21,71%.    A     l'analyse        spectrale        par     absorption dans     .l'ultraviolet,    ce produit pré  sente une valeur à 270     ni, < c    et une     valeur          Ei        "m    de 312 dans l'acide chlorhydrique  0,1 N.  



  Il est évident pour les spécialistes que de  nombreuses modifications peuvent être appor  tées au procédé décrit ci-dessus pour cultiver  l'organisme et isoler l'antibiotique cristallisé  pur du milieu de culture brut. Par exemple,  on peut, dans le processus d'isolement, substi  tuer à l'acétate d'éthyle d'autres solvants tels  que l'acétate     d'amyle,    la     cy        clohexanone,    le       butanol    ou la     méthyl-isobittyl-cétone;    à l'éther,  le     nitrométhane    et à l'éther de pétrole le  benzène ou l'éther     dichloroéthylique.    On peut.

        extraire le produit de la  bière  clarifiée par  l'acétate d'éthyle à un pH de 9 environ au  lieu d'un     pII    de 2 environ et, dans ce cas, il  n'est pas nécessaire de faire passer ensuite  la solution éthérée de l'antibiotique obtenue  sur une colonne d'adsorption à l'oxyde d'alu  minium. On traite simplement la solution  éthérée avec un acide dilué, on ajoute de  l'eau à la couche éthérée et on évapore l'éther  du     mélanbe.    On élimine de la     solution    la  gomme qui se sépare et on concentre la solu  tion aqueuse exempte d'éther pour obtenir  l'antibiotique cristallisé.

   Une antre méthode  encore d'isolement de l'antibiotique consiste à  adsorber l'antibiotique présent dans la  bière   clarifiée sur du charbon activé et à le récu  pérer avec de l'éther ou de l'acétone à 80     0;o.            Exemple   <I>2:</I>  Un mélange de 114 g de maltose, 72 g de  solubles de distillation, 72     g        d'hydrolysat    de  caséine, 72 g de chlorure de sodium et de       suffisamment    d'eau du robinet pour amener  le volume à 14 400 cm, est ajusté à un pH  de 7,5-7,7 avec une solution d'hydroxyde de  sodium 10 N, et réparti à raison de 300 cm'  dans quarante-huit flacons     d'Erlenmeyer    à  large col de 1 litre.

   Les flacons sont bouchés  avec deux couches de disques filtrants de gaze  et de coton, et les bouchons sont fixés avec des  pinces à ressort. Les flacons sont placés dans  un autoclave et stérilisés à 121  C pendant  20 minutes. Après refroidissement, on ouvre  les flacons et on les ensemence avec 5 cm' par  flacon d'une culture en flacon secouée de trois  jours de      Streptomy    ces     venezuelae .    Les fla  cons inoculés sont bouchés et incubés ensuite  pendant trois jours à 22-24" C, placés sur  une machine à secouer du type rotatif  (150     t/min.,    rayon (lu cercle 5 cm).  



  On acidifie 12 litres de culture (pH 7,39),  qui contiennent un total de 600     mg    de l'anti  biotique recherché, avec 190 cm' d'acide chlor  hydrique 3 N, à un pH de 2. On ajoute 304 g  de silicate d'aluminium adsorbant et on brasse  la suspension pendant 30 à 60 minutes. On  ajoute encore 304 g de l'adsorbant et on filtre    le mélange sur une couche de 50 g de silicate  d'aluminium. On lave le précipité avec  1212     cm@    d'eau distillée et on l'élimine. On  réunit le filtrat et les portions de lavage et  on les traite en brassant pendant 10 minutes  avec un quart de volume d'acétate d'éthyle.  On recueille la couche d'acétate d'éthyle et on  répète l'extraction.

   On élimine la couche  aqueuse et on sèche les extraits     d'acétate     d'éthyle réunis sur 50 g de sulfate (le sodium  anhydre à 5  C.  



  On élimine le sulfate de sodium par filtra  tion et on distille l'acétate d'éthyle sous vide  à une température du bain de 30" C. On traite  le résidu brun avec de petites portions d'éther       diéthylique,    au total 300 cm'. L'extrait éthéré  contient 501 mg de l'antibiotique, soit les     8:l010     de l'antibiotique présent dans la culture.  



  On divise l'extrait éthéré en trois portions  et on verse chacune d'elles dans une colonne  (16,5 X 1,9 cm) de 15 g d'oxyde d'aluminium.  qui a été ajustée au préalable au pH 4,7 avec  de l'acide     chlorhydrique.    Dans chaque colonne,  on fait passer 120     cm'    d'éther     diéthylique,    par  portions de 20     em3.    On change les récipients  récepteurs sous chaque colonne pour obtenir  au total cinq fractions dans chaque colonne.

    Les premières fractions réunies contiennent  418     mg    de l'antibiotique, les secondes 65 mg,       et,        les        On        fractions        réunit        les        restantes        premières        17        mg*        et        les        secondes     fractions des colonnes et on distille l'éther  sous vide.

   On traite le résidu brun plusieurs  fois avec de l'eau distillée, en utilisant an  total 625     cm3.    On secoue les extraits aqueux  réunis avec un     demi-volume    d'éther de pétrole  et on répète l'extraction encore une fois. On  élimine les extraits à l'éther de pétrole et on  concentre la phase aqueuse sous vide à une  température du bain de 30" C jusqu'au point  de cristallisation (environ 20     em3).    On refroi  dit la solution à 5" C pendant une nuit, on re  cueille les cristaux, on les lave avec une petite  quantité d'eau froide et on les sèche sous  vide sur du chlorure de calcium. Point de  fusion     144,5-1-h"    C; (a )D = -25" 5 C dans  l'acétate d'éthyle.

        On peut récupérer une nouvelle quantité  de     (l)        -y-1-p-nitrophényl    - 2 -     dichloropropane-          1,3-diol    des     liqueurs-mères    comme décrit dans  l'exemple 1. Le produit cristallisé obtenu  comme il a été dit plus haut peut être purifié,  si on le désire, par recristallisation dans le       diëhlorure    de méthylène ou d'éthylène. Point  de fusion     150-151     C.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation d'un nouvel anti biotique, caractérisé en ce qu'on inocule un milieu nutritif avec le Streptomyces vene- zuelae , en ce qu'on fait incuber le mélange en aérobiose et en ce qu'on sépare du milieu nutritif le produit antibiotique formé. Le nouvel antibiotique est le l-trans-1-p- nitrophényl - 2 - dichlor oacétamido-pr opane-1,3- diol, un corps cristallisé ayant un point de fusion de 150-1.51 C et un pouvoir rotatoire a)<B>D</B> de -\35 5 C dans l'acétate d'éthyle.

   Le (<B>15</B> produit peut être utilisé en thérapeutique. SOUS-REVENDICATION Procédé selon la revendication, earactérisé en ce que la culture se fait à une tempéra ture comprise entre 20 et 40 C, pendant, deux à quinze jours.