CH289537A - Procédé pour la préparation de la vitamine B12. - Google Patents

Description

  Procédé pour la préparation de la vitamine     Blz.       La présente invention concerne un procédé  pour la préparation de la vitamine     B1.r     (science 107; 396 [1948] ), un facteur re  connu efficace dans la thérapeutique de  l'anémie pernicieuse, et possédant des pro  priétés nutritives (J.     Biol.        Chem.    174; 1047  [1948] ), particulièrement quand il est utilisé  dans une alimentation pour animaux compre  nant des protéines végétales.  



  La. vitamine Bit, comme les agents théra  peutiques contre l'anémie pernicieuse em  ployés antérieurement (par exemple de  l'extrait de foie), a été extraite jusqu'ici des  l'oies de mammifères de boucherie. Il est quel  quefois difficile de se procurer les quantités  nécessaires de cet organe, qui n'est pas une  source économique de vitamine     B12.     



  La présente invention prévoit un nouveau  procédé simple et avantageux pour la produc  tion de la vitamine     B1@.     



  Le procédé selon l'invention est basé sur la  découverte que, dans la production de la  streptomycine par fermentation, une quantité  relativement grande de vitamine 1312 est égale  ment produite et que celle-ci peut être écono  miquement récupérée du produit de fermen  tation soit comme produit primaire, soit comme  sous-produit de la streptomycine.  



  Le procédé selon l'invention est caracté  risé en ce qu'on inocule un milieu nutritif  liquide avec un micro-organisme susceptible  de produire la streptomycine, en ce qu'on       laisse    se développer ledit micro-organisme en    contact avec ledit milieu et en ce qu'on sé  pare la vitamine Bit ainsi formée des autres       produits    contenus dans la culture. De manière  préférable, l'organisme utilisé est une souche  de  streptomyces     griseus     reconnue comme  étant bonne productrice de streptomycine;  l'organisme est habituellement développé en  culture submergée et sous d'autres conditions  connues pour augmenter la production de  streptomycine.

   Le milieu nutritif liquide peut  comprendre     essentiellement    une farine de soja  (ou une source équivalente d'azote et de subs  tances activant la croissance, comme décrit  dans le brevet suisse N  268688), un hydrate  de carbone assimilable par la     moisissure    (par  exemple du dextrose) et éventuellement un  sel.  



  Dans le procédé de concentration     etiou    de  purification de la     streptomycine    généralement  employé, la culture est filtrée et le déchet  de     mycelium    et autres résidus solides écartés,  le filtrat est traité sur du charbon activé pour  adsorber la streptomycine (le filtrat épuisé  étant écarté), la streptomycine adsorbée est  extraite du charbon par     élution    avec une so  lution acide aqueuse (et le déchet de charbon  écarté), et     l'éluat    est traité alors. pour concen  trer     et/ou    purifier la streptomycine.

   On a  trouvé     qué,    par ce procédé, presque toute la  vitamine     B12    est séparée de la streptomycine  dans la phase du lavage, c'est-à-dire que la  vitamine     B12    dans la culture     passe    sous des  concentrations relativement élevées dans les      diverses fractions écartées dont il a été fait  mention et que presque rien n'apparaît dans       l'éluat    acide riche en streptomycine.

   Aussi, au  cours des différentes phases de ce procédé de  purification de la streptomycine, en partant    d'une culture de  streptomyces     riseus ,    qui  g  contient entre 1100 et 1500 unités par     emi    de  vitamine 1312, la" vitamine     B12    apparaît dans  les fractions écartées dans les proportions sui  vantes:

      Déchet de     mycelium    : 1050 à 2400 unités/- (poids net)  Filtrat épuisé: 975 à 1550     unités/millilitre     Déchet de charbon: 1877 à 7140 unités/- (poids net)    La. teneur en vitamine     B12    a été mesurée de  façon     microbiologique,    en utilisant le     lactoba-          cillus         lactis        Dorner     comme organisme témoin  (Science 107;

   396, 397, 398 [1948] ), l'unité       microbiologique    de référence ayant une va  leur déterminée de<B>100000</B>     unités/cm3,    soit  15     U.S.P.        unités/cm3    d'un concentré de foie  injectable choisi comme étalon.  



  Dans la. pratique de l'invention, la vita  mine     B12    peut être récupérée de la culture  comme produit primaire, mais, du fait que 'Le  déchet de     mycelium,    le filtrat épuisé et le dé  chet de charbon contiennent des quantités  relativement élevées et rapidement     récupéra-          bles    de     vitamine        B12,    la vitamine est de pré  férence récupérée de ces déchets (spécialement  du déchet de charbon) comme sous-produit de  la streptomycine.

   Aussi, la quantité de vita  mine     B12    contenue dans le déchet de charbon  peut. être récupérée avantageusement par le  lavage de ce déchet avec un solvant de la  vitamine 1312 (particulièrement de l'alcool, de  l'acétone ou du phénol), et par concentration  de     l'éluat    par évaporation sous pression ré  duite; le produit ainsi obtenu peut, si on le  désire, être traité pour concentrer et/ou pour  purifier davantage la vitamine     B12.     



       l=ies    exemples suivants illustrent l'invention.       Exemple   <I>1:</I>  a)     .1164    litres d'un agent, aqueux (eau du       robinet)        contenant        2,25%        de        farine        de        soja          et        1,

  62%        de        dextrose        sont.        placés        dans        un     récipient de fermentation en acier au carbone  de 5000 litres équipé d'un agitateur et d'un  vaporisateur d'air; le récipient est     stérilisé     une heure à l20  C.

   Quand la température  atteint 25  C, on ajoute 189 litres d'un inocu  lai de  streptomyces     griseus     et le milieu    inoculé est, incubé à 25  C sous une pression  de 210 à 420 g par     em2    (une moyenne de  7,5 litres d'air par litre de milieu et par  heure étant passé à     travers    le milieu), tandis  que l'on agite (à la vitesse de 120 rotations  par minute). Pendant l'incubation, 5,6 litres  d'huile de saindoux sont ajoutés goutte à  goutte comme     antimousse.    Après une incuba  tion de 40 à 50 heures, on atteint. une teneur  en streptomycine de     1.50-200        unités/cm3    dans  le bouillon de culture (dont. le pH est de 6,7).

    On ajuste alors ce pH à. 2,0 avec de l'acide  sulfurique concentré et (de préférence après  adjonction d'un agent auxiliaire de filtrage)  on filtre alors le mélange à, travers un     filtre-          presse.    Le filtrat (I) a une teneur en strepto  mycine d'environ 300     à.100        unités/cm3.    A la.

    fin de la fermentation, la. vitamine     B12    est  sous une forme telle que seulement une petite       quantité        (soit        environ        10%)        est        précipitée     par     l'addition    de l'acide à la. culture, ainsi que  ce peut, être déterminé par la neutralisation  du déchet de     mycelium    et d'autres corps so  lides (II) et. par examen du filtrat résultant.

    Le déchet de     my        celium    et d'autres corps so  lides peut être traité pour récupérer son con  tenu en vitamine     B12.        Ion    variante, on peut  omettre la phase de l'addition de l'acide, uti  lisée pour faciliter la filtration de la culture,  et effectuer la. filtration à un pH d'environ 7.

    et ainsi augmenter le taux de streptomycine  dans le bouillon de culture, de sorte que la  vitamine 1312, au lieu d'être précipitée, soit       transportée    dans les autres fractions éliminées  pendant la purification de la     streptomycine.     Après la filtration à un     PH    d'environ 7, on  peut, d'une part, récupérer la.

   vitamine     Bly     dans les déchets du     myeelium    et les autres  résidus et, d'autre part., traiter le filtrat avec      (lit charbon de bois activé, pour adsorber la       streptomycine,    et récupérer     ia    vitamine     B12     du filtrat épuisé, par exemple par extraction  avec une solution aqueuse concentrée de phénol.  



  b) Un filtrat de 3785 litres d'une culture  contenant la streptomycine obtenue comme il  vient d'être décrit, et présentant une teneur  en vitamine     B12    d'environ 1100     unités/em3,     est. ajusté à un pH de 7,5 avec une solution  diluée d'hydroxyde de sodium,_ et agité avec  <B>108</B> hg d'un charbon de bois activé (marque        Nuchar        C-145-A )    pendant 15 minutes à la  température ambiante; ensuite le charbon  (contenant la streptomycine et une partie de  la vitamine     B12    adsorbées) est séparé par  filtration, de préférence après avoir enduit.

    préalablement le filtre avec un agent auxi  liaire de filtrage (par exemple le produit  marque      Célite ).    Le filtrat de culture ne  contenant plus de streptomycine (III) ren  ferme par contre encore environ 975     unités(em3     de vitamine     B12.     



  c) Le charbon de bois est lavé par por  tions successives d'une solution aqueuse 0,1 N  d'acide nitrique à 50  C pour     éluer    la strepto  mycine adsorbée. Le charbon lavé, qui avait  recueilli     environ    10 à 15% de la quantité de  vitamine     B12    du filtrat de la culture, est  réutilisé pour adsorber la streptomycine  d'une nouvelle portion du filtrat de culture  et accumule ainsi une     plats    grande quantité de  vitamine     B12.    Dans la, purification de la  streptomycine, le charbon est réemployé     ail     moins deux fois avant d'être abandonné.

   De  préférence, on emploie un mélange de char  bons activés (par exemple un mélange de       ='/3    du produit marque      Nuchar        C-145-A     et       1/3    du produit marque      Darco    G-60 ) ; de  préférence, on ajoute, à part du charbon  réemployé, encore une certaine quantité de  charbon frais, pas encore utilisé. La. teneur du  charbon résiduel en l'agent auxiliaire de fil  trage est comprise entre 10 à 20  /o.     (L'éluat     contenant la streptomycine est traité pour  récupérer la streptomycine y contenue, par  exemple par précipitation à l'aide d'un agent  tensioactif comme décrit dans le brevet suisse  285944).

      Le résidu de charbon (IV) contenant en  viron 4860     unités/g    (poids du produit humide)  de vitamine     B12    peut être séché et être utilisé  tel quel comme supplément de nourriture pour  les animaux, par exemple mélangé à des ali  ments contenant des protéines végétales, ou  bien la vitamine     B12    peut en être récupérée ;  par un des procédés décrits ci-après.  



  Bien que l'adsorption de la vitamine     B12     par du charbon activé du type utilisé dans  la purification de la streptomycine (plus un  agent auxiliaire de filtrage) ne soit pas un ,  procédé efficace de récupération de la vita  mine, en considérant la teneur élevée du fil  trat épuisé de la culture en vitamine     B12,     les grandes quantités d'un tel résidu de char  bon qu'on peut se procurer gratuitement dans ,  le procédé de purification de la streptomycine  rend très économique cette récupération de la  vitamine     B12.    Si la vitamine     B12    doit être  récupérée comme produit primaire,

   on em  ploiera avantageusement un charbon activé  du type utilisé dans la fabrication de     pr6pa-          rations    injectables de foie contre l'anémie per  nicieuse (par exemple le charbon activé  marque      Sutcliffe        Speakman    N  5 ).  



  d) On élue 1028 g de déchet de charbon  avec deux portions de 900     cm3    de phénol.  aqueux à 88 %. Les     éluats    phénoliques sont  combinés avec 1800     em3    d'éther, et on  extrait le mélange avec trois portions de  900     cm3    d'eau pour enlever la plus grande  partie de la vitamine     B12.    Les extraits  aqueux sont réunis, lavés à l'éther pour enle  ver le phénol et concentrés sous pression ré  duite pour fournir un concentré de vitamine  1112 utilisable en thérapeutique.  



       Variante   <I>1:</I> 405 g de déchets de charbon  activé sont lavés avec un litre d'éthanol absolu  (à un pH de 7,0) pendant 15 minutes, à 60  C,  et     l'éluat    obtenu est concentré par évapora  tion sous pression réduite pour donner 170 cm  d'une solution ayant. une teneur en vitamine       B12    de 5330     unités/em3.    Le produit peut être  utilisé en thérapeutique comme préparation  de vitamine     B12,    sans purification ultérieure.  



       Variante   <I>2:</I> 90 kg de déchet humide de  charbon activé (pH 2,9) sont mis en suspen-      lion dans de l'eau et la suspension est rapi  dement portée     a."'    pH 6,0 par adjonction d'une  solution d'hydroxyde de sodium, le charbon  en est séparé par filtrage (pour diminuer la  quantité de vitamine B12 retenue dans des       conditions    fortement acides).

   Le charbon est  ensuite lavé (dans un récipient muni d'un  agitateur) avec 132 litres d'éthanol aqueux à  60 %, à 60  C pendant 30 minutes.     L'éluat,     après concentration .à 4,5 litres par évapora  tion sous pression réduite, a une activité en  vitamine B12 d'environ 21500 unités     lcm3    (ce  qui représente une récupération d'environ  534200 unités par 500 g de charbon humide),  et une teneur totale en matières     solides    de  163     mg/cm3;    le concentré peut être utilisé en  thérapeutique comme préparation de vitamine  B12, sans purification ultérieure.  



       Variante   <I>3:</I> 90 g de déchets humides de  charbon activé préalablement traités comme  dans la. variante 2 sont lavés avec 132 litres  d'acétone aqueuse à 60 %, à 25  C pendant  30 minutes.     L'éluat,    après concentration à.  4,0 litres par évaporation sous pression ré  duite, a une activité en vitamine B12 de  43 000     unitéslcm3    (ce qui représente une récu  pération d'environ 945 000 unités par 500     g     de charbon humide) et une teneur totale en  substances solides de 50     mg(em3;    ce concentré  peut être utilisé en thérapeutique comme  vitamine 1312, sans purification ultérieure.

         Exemple   <I>?:</I>  100 g de déchets de     mycelium    et autres  solides (II) obtenus comme décrit dans le  paragraphe a,) de l'exemple 1 sont mis en  suspension dans de l'eau pour donner un vo  lume de 1 litre; le     pli    est ajusté à. 7,0 par  adjonction d'une solution d'hydroxyde de  sodium, et après agitation pendant 30 minutes  le mélange est filtré. Le filtrat, qui contient  105     unitésjem3    de vitamine B12 est ensuite  concentré sous faible pression pour fournir  une préparation de vitamine B12 utilisable en  thérapeutique.  



       Exennple   <I>3:</I>  1 litre de filtrat de culture épuisé de  streptomycine (III) obtenu     comme    décrit au    paragraphe b) de l'exemple 1 est ajusté au       p1,    6,0 et extrait avec deux portions de 500 cm  d'une solution aqueuse de phénol à 88%;  l'extrait de phénol est. traité ensuite comme  indiqué au     paragraphe    d) de l'exemple 1  pour donner une vitamine     B1-2    utilisable en  thérapeutique.  



  Dans une variante de ce procédé, le  filtrat III est ajusté au pH 6-8 et traité  avec 0,5 à 4     1/o    d'un charbon activé, apte à  bien adsorber la vitamine B12 (par exemple  le produit marque      Sutcliffe        Speakman     N  5 ) ; le produit d'adsorption est. traité de  la même     façon    que le résidu de charbon de  l'exemple 1, pour récupérer la vitamine     B1.2     utilisable en thérapeutique.  



       Exemple     1. litre d'un filtrat de     culture    contenant  de la streptomycine, obtenu comme indiqué  au paragraphe     cc)    de l'exemple 1 et conte  nant environ 1100     unités/em3    de vitamine     B1,          est    ajusté au pH 6,0 par une solution     diluée     d'hydroxyde de sodium et traité selon l'un  ou l'autre des procédés de     l'exemple    3, pour  obtenir la vitamine B12 comme produit pri  maire, utilisable en thérapeutique.

           Exemple   <I>5:</I>  Les différentes conditions de culture qui  ont été choisies du point de vue de la pro  duction optimum de la streptomycine et/ou  de la récupération peuvent être modifiées en  vue d'une production     et(ou    d'une récupéra  tion optima de la vitamine B12, soit. que       eelle-ci    doive être le produit primaire, soit     1-11r     sous-produit clé la streptomycine.

   On a trouvé,  par exemple, que certains sels de cobalt non  toxiques présents dans le milieu de fermen  tation en concentration non toxique     augmen-          tent    considérablement la formation de vita  mine 1312 sans affecter sensiblement la pro  duction de     streptomycine.     



       a)        0,005%        de        CoCI        .6II20        est        incorporé     dans le milieu décrit dans le paragraphe     a)     de l'exemple 1, et le  streptomyces     griseus      est développé dans ce milieu comme indiqué  dans ce     paragraphe.    Après 192 heures d'in  cubation, la culture est traitée avec un acide      comme indiqué dans ce paragraphe, et filtrée.

    lie filtrat de culture a une teneur en strepto  mycine d'environ 375     unités/em3    et une teneur       cri    vitamine     B12    d'environ 7000 unités     lem3.     



  b) Le filtrat de culture est traité pour  récupérer la vitamine     B12    comme produit Pri  maire, comme indiqué dans l'exemple 4.  



  <I>Variante:</I> Le filtrat de culture est traité  comme décrit dans les paragraphes b) et sui  vants de l'exemple 1 pour récupérer à la fois  la streptomycine et la vitamine     B12;    le rende  ment en vitamine     B12    est augmenté par la  récupération additionnelle de la vitamine 1312  du résidu de     mycelium    II (voir exemple 2)  et/ou du filtrat de culture épuisé de     strepto-          mj7eine    (voir exemple 3).  



  La vitamine     B12    obtenue par le     pro-          eédé    selon l'invention est utilisée en théra  peutique dans les mêmes buts et de la  même manière que la vitamine     B12    obte  nue selon des procédés antérieurs par  extraction de foie. Elle sert contre l'anémie  pernicieuse ou comme facteur     protéinique     pour les animaux.

   Par exemple, la prépara  tion clé vitamine     B12    décrite au paragraphe       (1),    variante 3, de l'exemple 1 est obtenue  dans une solution stérile, aqueuse, très     con-          centrée,        conservée        par        0,5%        de        phénol,        et     vendue dans des fioles munies d'un bouchon  de caoutchouc; cette préparation est utilisée  pour le traitement de l'anémie pernicieuse par  injection journalière intramusculaire d'une  quantité équivalente à 15 unités U. S. P.  d'extrait de foie.  



  Bien que la quantité des produits solides  dans les préparations de vitamine     B12    obte  nues comme décrit ci-dessus soit du même  ordre que celle de beaucoup des agents théra  peutiques contre l'anémie pernicieuse utilisés       jusqu'ici,    ces préparations de vitamine     B1_,     peuvent être purifiées davantage si on le dé  sire; par exemple:

    1  par addition d'éthanol absolu au con  centrai de vitamine     B12    en quantité suffi  sante pour obtenir une concentration en     étha-          nol        (le        $0%,        par        séparation        des        produits        so-          lides    inactifs précipités et par évaporation  de l'alcool sous pression réduite,    2  par     réadsorption    de la vitamine     BIL,

       du     concentrat    sur du charbon activé et nou  velle     élution    avec un. solvant de la vitamine  1312 (par exemple l'alcool, l'acétone ou le  phénol),  3  par extraction de la vitamine 1312 du       concentrat    à l'aide de phénol, ,  4  par une combinaison des traitements  susmentionnés.

Claims (1)

1. REVENDICATION: Procédé pour la préparation de la vita mine B12, caractérisé en ce qu'on inocule un milieu nutritif liquide avec un micro-orga nisme susceptible de produire la streptomycine, en ce qu'on laisse se développer ledit micro organisme en contact avec ledit milieu et en ce qu'on sépare la vitamine B12 ainsi formée des autres produits contenus .dans la culture. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce que le micro-organisme utilisé est le streptomyces griseus . 2. Procédé selon la revendication et la.

   sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on développe le streptomyces griseus en culture submergée dans un milieu nutritif compre nant une source d'azote et de substances favo risant la croissance et un hydrate de carbone assimilable par cet. organisme. 3. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le milieu nutritif comprend de la farine de soja et du dextrose. 4. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on filtre la culture après le dé veloppement et en ce qu'on récupère la vita mine 1312 dans les déchets du mycelium et les autres résidus solides. 5.

   Procédé selon la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé en ce que le filtrat est traité avec du charbon de bois activé, pour adsorber la streptomycine, et que la vitamine B12 contenue dans le filtrat épuisé est récupérée. 6. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 4 et 5, caractérisé en ce que la streptomycine adsorbée est éluée avec une solution acide aqueuse et en ce que la vitamine B12 contenue dans le résidu du char bon est récupérée. 7.

   Procédé selon la revendication et les sous-revendications 4, 5 et 6, caractérisé en ce que le résidu du charbon est élué avec un solvant de la vitamine B12. 8. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 4 à 7, caractérisé en ce que l'éluat du résidu du charbon est concen tré par évaporation sous pression réduite. 9. Procédé ;selon la revendication et les sous-revendications 4 à 7, caractérisé en ce que le résidu du charbon de bois est élué avec une solution concentrée de phénol. 10.

   Procédé selon la revendication et les sous-revendications 4 à 7, caractérisé en ce que le résidu du charbon de bois est élué avec de l'éthanol aqueux à 60 %. 11. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 4 à 7, caractérisé en ce que le résidu du charbon de bois est élué avec de l'acétone aqueuse à 60 0/0. 12.

   Procédé selon la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé en ce que la culture contenant les déchets du mvcelium et les autres résidus solides est, ajustée à un pli d'environ 7, puis est filtrée. 13. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 4, 5 et 12, caractérisé en ce que le filtrat épuisé est extrait avec une solution aqueuse concentrée de phénol. 14. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 1. et 2, caractérisé en ce que la culture est filtrée et en ce que la vita mine 1312 contenue dans le filtrat est récu pérée. 15.

   Procédé selon la revendication et les sous-revendications 1, 2 et 14, caractérisé en ce que le filtrat est traité par un charbon de bois activé capable d'adsorber la vitamine B12. 16. Procédé selon la revendication, carac térisé en ce que le milieu nutritif liquide con tient un sel de cobalt non toxique en concen tration non toxique. 17. Procédé selon la revendication, carac térisé en ce qu'on acidifie la. culture et en ce qu'on récupère la vitamine B12 clé la culture acidifiée.