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PERFECTIONNEMENTS A LA PURIFICATION DE SOLUTIONS AQUEUSES IMPURES
CONTENANT DE LA VITAMINE B12 ET SES VARIANTES.
La présente invention concerne la purification de solution a- queuse impure contenant de la vitamine B12 et ses variantes.
Récemment on a isolé, sous forme cristalline, une substance ayant une activité vitaminique à partir d'extraits de foie et de certaines liqueurs de fermentation. On a caractérisé cette substance d'une façon géné- rale comme un complexe de coordination du cobalt et on l'a désignée sous le nom de vitamine B12. On a poursuivi des efforts pour obtenir cette matière sous forme cristalline depuis la découverte par Minot et Murphy en 1926 (J.
A.M.A. 1926, 87, 470) que le foie contient une substance efficace dans le traitement de l'anémie pernicieuse. De nombreux chercheurs ont obtenu des préparations de pureté et d'efficacité thérapeutique accrues, jusqu'à ce qu'on obtienne la vitamine sous forme cristallisée.
Malheureusement des tentatives d'isolement de la vitamine d'a- vec les impuretés qui lui sont associées ont été compliquées par le fait que la vitamine B12 existe dans les matières naturelles en quantités extrêmement faibles, de 1 ordre d'un mg par litre. De plus, il semble que la vitamine B12 existe sous différentes formes et il est possible qu'elle soit conjuguée avec des matières protéinées. D'autres substances présentes dans le foie pos- sèdent également des propriétés physiologiques semblables, ce qui rend dif- ficile à évaluer les résultats des essais des préparations.
Les procédés de concentration et de purification ont générale- ment fait intervenir des techniques physiques, telles que l'adsorption de la vitamine sur des agents adsorbants tels que le charbon de bois, l'alumine, le gel de silice, les terres siliceuses et analogues, puis une élution par divers solvants. Dans ces processus d'adsorption, la matière active est or- dinairement adsorbée tandis que les impuretés restent en solution. On a employé
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avec succès des modifications de ce processus d'adsorption telles que la chromatographie. D'autres techniques qui emploient la solubilité différen- tielle de la vitamine dans des solvants spécifiques ont également été uti- lisées dans une certaine mesure.
On a également essayé la précipitation de la vitamine. En fait, la récupération.de la vitamine sous forme cristalli-'' sée nécessite une combinaison de procédés physiques compliqués et difficiles à employer à une échelle industrielle.
Comme on dispose maintenant de sources relativement illimitées de vitamine B12 dans les liqueurs fermentées produites par divers micro-or- ganismes et comme on accepte la vitamine B12 en tant que facteur anti-anémie pernicieuse, et qu'on l'utilise largement en médecine, il s'est créé un sé- rieux besoin d'un processus simplifié pour l'obtention de plus grandes quan- tités de la vitamine sous une forme convenant à l'utilisation thérapeutique.
Les sources de vitamine B12 utilisées dans la présente inven- tion comprennent de nombreuses solutions aqueuses contenant la vitamine.
Celles-ci comprennent les extraits aqueux de foie. Une source plus abondante est la liqueur de rebut résultant de la préparation d'antibiotique par cer- taines des espèces de Streptomyces comprenant en particulier le S-aureofa- ciens et le S-griseus. D'autres microorganismes tels que S-rimosus. le Clos- tridium butyricum, le Bacillus megatherium, l'Eremothecium. ashbii, le fla- vobacterium solare et beaucoup d'autres bactéries, levure et fongi produi- sent de la vitamine B12 par fermentation et on peut utiliser ici ces li- queurs. On trouve également que les eaux d'égouts contiennent de la vitami- ne B12 et il se peut que ces liqueurs clarifiées se révèlent une source com- mercialement pratique de la vitamine en utilisant le procédé de la présente invention.
Comme on l'a noté ci-dessus, la plupart des procédés antérieurs de purification de la vitamine B12 ont employé des techniques dans lesquelles on l'isole des impuretés qui lui sont associées par adsorption sur des matiè- res actives. On a découvert cependant que l'on peut grandement simplifier le procédé de purification de la vitamine B12 par un processus en une phase dans laquelle sont adsorbées les impuretés ordinairement trouvées avec la vitamine B12 et on laisse en solution la vitamine. Dans ce procédé, les matières indésirables, principalement des pigments de composition inconnue, sont presque complètement adsorbées tandis que l'on récupère la substance vitaminique active inchangée en rendement presque quantitatif dans sa solu- tion aqueuse initiale.
Le procédé selon l'invention de purification de solutions a- queuses impures contenant de la vitamine B12 et ses variantes consiste à mettre en contact la solution aqueuse impure avec un composé de zirconium pratiquement insoluble dans l'eau, de sorte que les impuretés sont adsorbées par celui-ci et à séparer la solution aqueuse purifiée contenant la vitamine B12 d'avec le composé de zirconium et les impuretés adsorbées sur celui-ci.
Bien que l'on ait utilisé depuis de nombreuses années des com- posés de zirconium insolubles dans l'eau comme agents adsorbants, il est en fait étrange que ces matières n'adsorbent pas la vitamine B12 qui est si fa- cilement adsorbée par la plupart des agents adsorbants ordinaires actuelle- ment utilisés. Parmi les composés insolubles de zirconium que l'on peut uti- liser dans ce procédé, se trouvent le bioxyde de zirconium, le carbonate de zirconium, l'hydroxyde de zirconium, le silicate de zirconium et autres com- posés insolubles de zirconium. Par insolubles, on désigne ceux de ces compo- sés qui ne sont pas solubles en solution aqueuse à un degré gênant le proces- sus d'adsorption.
Quand on utilise les diverses techniques applicables, il est préférable que le composé de zirconium ne soit pas soluble à plus d'en- viron 1 % en poids en solution aqueuse aux concentrations en ions hydrogène du procédé exposé ci-après.
On dispose du bioxyde de zirconium sous forme d'un hydrate, de formule ZrO2, xH2O dans laquelle x est une quantité variable continuelle- ment. La matière est une boue blanche à consistance modérée telle qu'on l'ob-
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tient chez le fabricant et il ne faut pas non plus laisser 'cette matière 'sé- cher car elle semble perdre sa faculté d'adsorber les impuretés par séchage.
On dispose de carbonate de zirconium sous forme d'un hydrate désigné par le fabricant sous le nom d'hydrate de zirconium (carbonate).'La matière est une boue blanche de consistance modérée et que l'on ne doit pas laisser sécher car elle semble perdre sa faculté d'adsorber les impuretés par séchage. On peut préparer l'hydroxyde de zirconium susceptible d'être utilisé dans le procédé de la présente invention à partir du carbonate de zirconium ci-dessus de la façon suivante : à 105 kg d'hydrate de zirconium (carbonaté) on ajoute 200 litres d'eau, puis on met le mélange en suspen- sion et on l'agite suffisamment pour former un mélange homogène. En conti- nuant l'agitation, on ajoute 61 kg d'acide sulfurique à 93 %. Ce procédé donne une solution de sulfate de zirconium blanche comme l'eau.
On ajoute ensuite 65 kg d'hydroxyde d'ammonium (26-28%) pour obtenir un pH de 8,0, à - la suite de quoi on obtient un précipité blanc gélatineux d'hydroxyde de zir- conium. On filtre le mélange et on recueille le gâteau. On met alors en sus- pension ce gâteau dans 350 litres d'eau et on filtre à nouveau. On considère que le gâteau résultant est l'hydroxyde de zirconium. On ne doit pas laisser sécher l'hydroxyde de zirconium comme dans le cas du carbonate de zirconium.
Le zirconium est un élément tétravalent et comme on le trouve dans les ma- nuels, il est capable de former divers complexes en plus de ceux précités.
On peut employer dans le procédé décrit ceux qui sont insolubles dans les limites de la présente invention.
Dans la mise en pratique de l'invention on peut provoquer l'ad- sorption des impuretés par plusieurs procédés. Dans un procédé, on met en suspension la solution aqueuse contenant la vitamine B12 avec la quantité désirée de composé de zirconium, puis on filtre. Le filtrat contient la vi- tamine B12 car la plupart des impuretés sont retenues dans le gâteau filtré.
Dans un autre procédé, on prépare une colonne du composé de zirconium géné- ralement en mélange avec un adjuvant de filtration et on fait passer à tra- vers la colonne la solution aqueuse à traiter. On peut purifier le composé de zirconium utilisé dans l'un ou l'autre procédé par des moyens classiques et le recycler. On illustrera ci-après ces deux procédés.
Evidemment, la quantité de composé de zirconium varie avec la quantité d'impuretés contenues dans la solution de vitamine B12. Comme la vitamine B12 n'est pas adsorbée dans une mesure notable par le composé de zirconium dans les conditions du procédé, l'excès est sans importance. D'au- tre part, si la quantité d'impuretés est élevée, et que la totalité n'est pas adsorbée, on peut facilement les déceler dans le filtrat et on peut les éliminer par un nouveau contact avec le composé de zirconium dans une secon- de opération.
On peut modifier la température du processus d'adsorption dans un large intervalle de 0 à 75 C, mais on le conduit de préférence à la tem- pérature ambiante. Le pH pendant le processus d'adsorption peut varier entre 5 et 9. On doit maintenir la solution aqueuse de B12 avant traitement, dans l'intervalle de pH 2,5-8,5, de préférence à pH 4,5, ceci en raison du fait que la vitamine B12 n'est pas stable sous de fortes concentrations en acide ou en alcali.
Il est bien entendu que le terme "vitamine B12" utilisé ici est générique et désigne les diverses formes physiologiquement actives de la vitamine B12 décrites dans la littérature. Il semble que la vitamine B12, telle qu'on l'a initialement décrite contient un radical cyano. On remplace facilement ce groupement par d'autres radicaux tels que les radicaux hydro- xydes et sulfates et on a ainsi chimiquement modifié la vitamine B12 de di- verses façons sans affecter sérieusement son activité physiologique. En fait, il semble que la vitamine B12 se rencontre dans la nature sous diverses de ses formes et certaines liqueurs de fermentation contiennent un mélange des différentes formes de la vitamine B12.
Les chercheurs ont désigné de fagon variée ces dernières, sous les noms de vitamine B12a, B12b, B12c, cobalami- ne, hydroxyde de cobalamine, sulfate de cobalamine et analogues Par chance,
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ces modifications de la molécule de la vitamine B12 se comportent de façon semblable dans le procédé de la présente invention et ne sont pas adsorbees sur la zircone hydratée, ni n'affectent sur celle-ci l'adsorptiôn des diver- ses impuretés. Par suite, le terme "vitamine B12" est utilisé ici pour dési- gner toutes ces formes connues voisines, physiologiquement actives et adsor- bables que l'on vient de citer.
On donne les exemples suivants pour illustrer plus particuliè- rement l'invention. Il est bien entendu naturellement qu'il ne s'agit que des techniques préférées actuellement et que les spécialistes de la question pourront y apporter des modifications et améliorations évidentes. L'inven- tion n'est pas limitée au traitement d'aucune solution particulière conte- nant de la vitamine B12 sauf en ce qui concerne les limites de pH précitées, pas plus qu'aux quantités ou aux concentrations particulières indiquées ci- dessous.
Exemple 1.
On obtient une solution aqueuse contenant de la vitamine B12 à partir de liqueur de fermentation produite par le S. Aureofaciens dans la préparation de l'auréomycine. On traite la liqueur de fermentation, de pré- férence après l'extraction de l'auréomycine par le butanol, et contenant en- viron 200 gammas de vitamine B12 par litre, par du charbon de bois activé (2 à 4 g. de charbon par litre de liqueur de fermentation). On lave le char- bon de bois à l'eau du robinet pour éliminer les sels solubles dans la li- queur de fermentation, après quoi on soumet à une élution l'activité vitami- nique B12. Ceci s'effectue par traitement de 1053 kg du charbon de bois par 15. 000 litres d'une solution aqueuse contenant environ 7 % en volume d'al- cool amylique et 5 % d'alcool isopropylique.
On évapore l'éluat jusqu'à 280 litres sous vide pour concen- trer l'activité à environ 100 gammas de vitamine B12 par cc. A 500 cc du goudron brun foncé épais ainsi obtenu, on ajoute 2.000 cc d'une solution a- queuse saturée de sulfate d'ammonium et 10 g d'adjuvant de filtratIon. A- près agitation à la température ambiante pendant 1 heure, on laisse repo- ser le mélange jusqu'au lendemain à 4 C. On sépare le précipité quise for- me et on l'extrait par 2.000 cc d'alcool éthylique à 65 %. On ajuste alors l'extrait à pH 1,5 par de l'acide chlorhydrique et on laisse reposer jus-- qu'au lendemain. On ajuste ensuite la solution à pH 4,5 et on la concentre pour éliminer l'alcool éthylique. On traite par le processus suivant la so- lution aqueuse qui en résulte.
On mélange 350 parties de zircone hydratée en volume (25-30 % ZrO2, x H2O) avec 350 parties en volume d'adjuvant de filtration et suffisamment d eau, 3 parties en volume, pour former une suspension. On place ce mélange dans une colonne chromatographique et on le laisse déposer à la pression atmosphérique pendant 30 minutes. On applique le vide à l'extrémité inférieure de la colonne, après quoi on lave avec un peu d'eau.
On fait passer à travers la colonne de zircone 700 cc de l'ex- trait à l'alcool éthylique concentré contenant environ 70 gammas de vitamine B12 par cc, après quoi on la lave à l'eau jusqu'à élimination de toute la couleur rose qu'elle avait retenue. La solution rose clair contient environ 30 gammas de vitamine B12 par cc; on la trouve exempte de la plupart des im- puretés qui lui étaient initialement associées et elle convient pour de nom- breuses applications pharmaceutiques sans autre concentration ou purifica- tion.
Exemple 2.
Dans ce processus, on met en suspension la même quantité de zircone hydratée qu'à l'exemple 1 avec une quantité égale de l'extrait à l'al- cool éthylique concentré pendant 20 minutes, puis on filtre. On lave le ga- teau brun avec un peu d'eau pour éliminer la vitamine B12 qu'il contient.
On trouve de même que ce filtrat a une pureté très améliorée.
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Exemple 3.
On extrait un adsorbat sur charbon de bois obtenu par le trai- tement d'une liqueur de fermentation de S. Aureofaciens en le traitant par une solution aqueuse d'alcools inférieurs mixtes comme il est décrit à l'e- xemple 1 et on concentre l'extrait. On fait ensuite passer cette solution concentrée contenant environ 100 gammas de vitamine B12 par cc à travers une colonne de zircone et on obtient une solution rose qui est propre et convient pour l'application pharmaceutique. Ce processus élimine les phases de préci- pitation au sulfate d'ammonium et d'extraction alcoolique de l'exemple 1 que l'on n'utilise que quand on estime nécessaire d'éliminer des quantités excessives de substances peptoniques et autres impuretés solubles dans le sulfate d'ammonium saturé qui peut être présent.
Exemple 4.
A 480 litres de l'extrait de B12 hydrolysé par l'alcool éthy- lique à 65 %, décrit à l'exemple 1, on ajoute 200 litres d'eau et 175 kg (poids humide) d'hydroxyde de zirconium. On ajuste le pH de ce mélange à
8,7 par de l'hydroxyde d'ammonium (26-28 %). On agite ensuite le mélange pendant 1 heure, on le laisse reposer pendant approximativement 14 heures, puis on le filtre. On lave le gâteau filtré par 100 litres d'eau. On combi- ne alors les eaux de lavage et le filtrat, ce qui donne une solution rose claire d'un volume de 850 litres, et contenant 50 gammas de vitamine B12 par cc. On concentre cette solution de vitamine B12 pour éliminer le solvant.
La solution résultante convient aux nombreuses applications pharmaceutiques sans autre concentration ou purification.
Le gâteau filtré résultant contenant les impuretés brunes est régénéré de la fagon suivante; on le met en suspension avec 200 litres d'eau; et à ce mélange on ajoute lentement 95 kg d'acide sulfurique à 93 % en agi- tant. On agite le mélange pendant 1 heure. A cette solution acide de zirco- nium, on ajoute 34 kg de charbon de bois activé, on poursuit l'agitation pendant 1 heure, puis on filtre et on lave le gâteau pressé par 50 litres d'eau. On rejette le gâteau filtré. On transforme le filtrat, sulfate de zirconium blanc comme l'eau, en hydroxyde de zirconium en ajoutant lentement en agitant une solution à 40 % de soude (61 kg de NaOH ajusté à 154 litres par de l'eau). On sépare par filtration le précipité gélatineux blanc d'hy- droxyde de zirconium, on le met en suspension avec 350 litres d'eau et on le filtre.
Le gâteau pressé d'hydroxyde de zirconium est prêt à être recy- clé.
Exemple 5.
A 444 gr. d'hydrate de zirconium (carbonaté) on ajoute 1 litre de l'extrait à l'alcool éthylique concentré décrit à l'exemple 1 et on pour- suit l'agitation pendant 1 heure, à pH 6,1. On filtre ensuite le mélange et on lave le gâteau filtré à l'eau jusqu'à élimination de toute la couleur rose, comme le montre l'obtention d'un filtrat incolore. On combine et on concen- tre le filtrat et les eaux de lavage pour éliminer le solvant à un volume de 250 ce et un essai en vitamine B12 de 116 gammas par cc.
Comme on l'a noté ci-dessus le processus d'adsorption utili- sant le composé de zirconium est applicable aux solutions aqueuses contenant de la vitamine B12 et ayant un pH compris entre 2,5 et 8,5. La quantité de vitamine B12 en solution aqueuse peut aller de quelques gammas de vitamine B12 par cc jusqu'à des solutions relativement concentrées. Par suite, l'in- vention est utilisable dans la purification de solutions de vitamine B12 ob- tenues à partir de la liqueur de fermentation initiale jusqu'à des phases précédant juste le processus de cristallisation si celui-ci est désiré.
En raison de l'efficacité extrêmement élevée des composés de zirconium pour l'élimination des impuretés, la cristallisation finale n'est généralement pas nécessaire ni désirable. Le produit de l'invention après les essais pharmacologiques usuels pour sa puissance, sa pureté, sa teneur
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en produits pyrogènes et analogues quand ils sont indiqués, peut être u- tilisé tel qu'il est obtenu.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de purification de solutions aqueuses impures con- tenant de la vitamine B12 et ses variantes, caractérisé en ce qu'on met en contact la solution impure avec un composé de zirconium pratiquement inso- luble dans l'eau, de sorte que les impuretés sont adsorbées sur celui-ci et on sépare la solution aqueuse purifiée contenant la vitamine B12 d'avec le composé de zirconium et les impuretés adsorbées sur celui-ci.