CH298331A - Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique. - Google Patents

Description

Procede de preparation d'un nouvel antibiotique. L'invention se rapporte ä iun procede de preparation d;'un nouvel antibiotique, que Fon denommera par la Suite sistomycosine .

La sistomycosine est un compose orga- nique neutre, contenant seulement les ele- ments carbone, hydrogene, azote et oxygene. C'est un Corps solide Couleur chamois ou legerement jaune, qui parait microcristallin au microscope polarisant. Par chauffage, la substance commenee ä brunir ä environ 130 L, mais ne Fond pas au-dessous d'environ 230 C. La sistomycosine est tres soluble ;d@ans 1'eau et 1e methanol, un peu moins soluble dans 1'ace- tone humide et dann les melanges aqueux des alcools aliphatiques plus eleves; eile est pra- tiquement insoluble dans les solvants ayant un caractere non polaire plus accentue tels que 1e chloroforme, 1'ether diethylique, l'ace- tate d'6thy1e, ' 1e benzene, 1'ether de petrole et semblables. 0n peut l'extraire de ses solu- tions aqueuses d'un p$ de 2 ä 9 avee du n-butanol @et autres alcools aliphatiques supe- rieurs semblables.

La sistomycosine reduit rapidement les solutions froides de permanganate de potas- sium et la solution bouillante de Benedict, donne une reaction positive de Molisch pour les hydrates de carbone, donne une reaction negative de Beilstein pour les halogenes, et une reaction negative au Chlorure ferrique. L'addition dune tres petite quantit6 de 1'antibiotique, 1 ä 2 mg, ä de 1'acide sulfu- rique concentre chaud, donne ä la solution une Couleur foncee rouge cerise ä chocolat. L'addition dune petite quantite de 1'antibio- tique aux acides nitrique et chlorhydrique concentr@s chauds satuxes avee du thymol ne produit pas de changement de eouleur.

Le nouvel antibiotique est caracterise en outre par ses spectres remarquables dans 1'ultraviolet et 1'infrarouge. Le spectre d'a;b- sorption dann 1'ultraviolet (fig. 1) pr4sente un maximum au voisinage de 300 mu et un autre ä 218 my. Le maximum au voisinage de 300 mu est forme de trois sommets d'ab- sorption distincts ä 292,5, 306 et 320,5 m,u, et de deux minima entre Ces sommets ä 298 et 314 my. Le minimum 1e plus prononc6 Jans 1'absorption ultraviolette est situ6 ä 253 my. La courbe d'absorption representee ä la fig. 1 est celle obtenue dann 1'eau, et la sistomycosine est remarquable en ceci que le spectre West pas modifie de fa@on appre- ciable par des variations modArees de 1'aci- dit6 ou de la basicite de 1a solution, e'est ä-dire par des variations allant de la neutra- lit4 jusqu'ä des concentrations 0,05 N d'a,cide ou de Base.

La fig. 2 montre 1a region denomm4e empreinte digitale (fingerprint) dans 1e spectre d'absorption infrarouge de la sisto- mycosine en Suspension neutre dann une huile minerale. Les sommets ä ou pres d6'.6,88 et 7,30 ,ü sont attribuables ä 1'huile minerale servant de vehicule. Les Bandes d'absorption les plus intenses, caraeteristiques de la sisto- mycosine, sont celles situees ä ou pres de 6,34 et 9,4-4 ,u. Des banden d'intensite faible ou moderee sont situees ä ou pres de 7,70, 7,86, 8,55, 11,16, 11,85 et 12,4,u avec d'autres apparaissant comme epaulements des prece- dentes ä ou pres de 7,08, 7,16, 8,95, 9,89, 10,25 et 10,6 ,u. Une autre banale caract'eris- tique de la sistomycosine, qui se trouve en dehors de la region dite empreinte digitale , est ä ou pres de 2,96,u.

La sistomycosine, et .en particulier ses solutions, subit une decömposition photochi- mique par exposition ä la lumiere. Elle est decomposee par les aeides et les alcalis, mais est plus stable en solutions neutres ou legere- ment basiques, dun pg de 7 ä 9, qu'en solu- tions acides. Elle est tont ä fait stable dann 1'eau au-dessous de 25 C et ses solutions aqueuses peuvent meme etre chaufMes ä 50 C pendant 1 heure sann perte de 1'activite anti- biotique. En solution aqueu se ä 100 C, elle conserve apres 1 heure plus de 50% de Bon aetivite antibiotique. Contraireinent _ aux antibiotiques connus, la sistomycosine possede un haut degre d'ac- tivit6 cantre les diverses levures et moisis- sures, mais elle est pour ainsi dire depourvue d'activite contre les bacteries gram-negatives et gram-positives. Ainsi, elle est pratiquement depourvue d'activite contre des bactkries telles que les Escherichia coli, Salmonella schottmuelleri, Shigella Bonnei, Klebsiella pneumoniae; Micrococcus pyogenes var. aureus et Streptococeus haemolyticus, mais est extreinement active et de Brande valeur pour 1e traitement d'infections fongiques causees par les Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Histoplasma capsiLlatum, Microspo- r-um canis, Sporotrichum schenekii, Tricho- phyton interdigitale et Trichophyton rubrum. La table qui suit montre de faeon plus frap pante 1e spectre antibiotique remarquable de la, sistomycosine en comparaison avee les spectres d'antibiotiques connus produits par des actinomycetes, y inclus ceux caracterises par une activite antifongique.

Activite antibiotique Micro-organisme Sisto- Chloro- Chlor- Strepto- Strepto- Hydroxy mycosine Actidione tetra- amphe- mycine thricine tetra cycline mcol cycline Bacteries Gram-positives (la plupart) - - + -f- + -f Gram-negatives (la plupart) - - + + -f Resistant- aux acides (la plup-art) - - -E- -± -+ Aetinomycetes Nocardia asteroides - - .+ -i- + -+ Eumycetes (Levures et moisissures) Blastomyces dermatitidis -f- - - - - -f- Candida albicans - - - - Signifie que la croissance est empechee par moins de 25 microgrammes d'antibiotique par ml. de bouillon ou agar. - Signifie que la croissance West pas empächee par 100 microgrammes d'antibiotique par ml. de bouillon ou agar.

<I>(Suite du tableaic):</I> Aetivite antibiotique Hydrogy. Micro_ -or ganisme Sisto- Actidione Chloro- tetrn- anphe- Chlor- Strepto- Strepto- tera mycosine cycline nieol mycme thricme cycline Cryptococcus neoformans - -f- - - - + Histoplasma capsulatum -E- - - - - Microsporum canis -E- - - - - - Sporotrichum schenckii - - - - Triehophyton rubrum -f- - - - - - -f- Signifie que la croissance est empechee par moins de 25 microgrammes d'antibiotique par ml. de Bouillon ou agar. - Signifie que la croissance West pas empechee par 100 microgrammes d'antibiotique par ml. de Bouillon ou agar. 0n peut voir d'apHs la table ei-dessus que Beul 1'antibiotique aetidione ressemble ä 7.a sistomycosine quant ä son inactivite contre les bacteries et son aetivite contre des cumy- cetes. L'actidione est cependant actif contre 1e Cryptococcus neoformans, tandis que la sistomycosine ne fest pas, et la sistomycosine est active contre les autres eumycetes men tionnes dann cette :liste, tandis que 1'aeti- dione ne lest pas. Il en resulte donc bien qu'il s'agit lä,de deux substances differentes.

La toxieite de la sistomycosine est presqüe negligeable. Pour la souris, 1e LD5o intravei- neux est de 90 mg/kg et 1e MA.D. est de 80 mg/kg. .

Le procede selon 1'invention, pour la pre- paration de ce nouvel antibiotique, est carac- t6ris6 en ce que 1'on inoeule un milieü nu- tritif avec du Streptomyces viridosporus, soumet 1e inilieu inocule ä une incubation dans des conditions aerobies; ä une tempera- ture de 20 ä 35 C, pendant au moins un jour, et isole du melange de culture 1'antibiotique ainsi produit.

Le Streptomyces viridosporus est un nou- vel actinomycete qui so rencontre entre autres dann les sols. 0n peut en obtenir des cultures melangees des eumycetes specifiques inhibes par la sistomycosine avee de 1'agar aqueux et en y ajoutant une terre contenant 1e Strepto- myces viridosporus cherche. ApHs incuba- tion du melange pendant 1 ä environ <B><U>10</U></B> jours, apparaissent des colonies de 1'ac- tinomyeete cherche et d'autres antagonistes. Los colonies de Streptomyces viridosporus sont separees, tranderees sur un milieu nu- tritif frais, puis isoMes comme cultures pures selon les methodes usuelles. Une eulture vi- vante de ce micro-organisine a ete deposee au Bureau de Culture Parke, Davis & Cie., ä Detroit (Michigan), sous numero 04889.

a'xamine au microscope, 1e mycelium pri- maire humide du Streptomyces vzridosporus est hyalin, et excessivement ramifie, les par- ties distales 6tant incurvees ou legereinem ondulees. Le mycelium secondaire aerien est de meme fortement ramifie. Il y a aussi des ramifications primaires, secondaires et ter- tiaires, lesquelles peuvent etre alternes, oppo- s6es et parfois verticilleas. Les parties dis tales du mycelium Serien se subdivisent en chaines de conidies. Los chaines conidiennes se presentent en courbes RTI ID="0003.0262" WI="12" HE="4" LX="1473" LY="2059"> spirales libres dune longueur axiale d'approximativement 10 ä 20 microns. Los conidies sont hyalines, sphe- rodales ou ovoidales, de 1,3 ä 1,9 mieron de diamUre; en moyenne d'approximativement 1,5 ä 1,6 micron. Quand <B>11</B> a crü Sur un mi- lieu glucose-tryptone-agar, 1e jeune myceliiim Primaire hmnide du Streptomyces viridospo- ras apparait incolore, prenant. plus tard un häle ja-Lane Lerne; 1e mycglittm secondaire aerien est blaue et Porte des spores qui, en masse, apparaissent d'im vert olive fonce. Il n'y a que peu ou pas de Pigments dann 1'agar. Les colonies de surface sont circulaires, bom- bges, ridees ou ä Gretes radiales, avec une marge ,d'ondidation.

L'organisme liqu efie la gelatine saus for- mation de Pigments et peptonise le lait tournesole avec un leger changement du p$. En milieu synthetique (de Gottlieb), 1'orga- nisme utilise facilement de nombreuses sources de carbone telles que arabinose, Fruc tose, galactose, inosite, lactose, maltose, man- nite, rhamnose, xylose; il utilise moins faeile- ment 1'acetate de sodium, 1e citrate de so- diiun, 1e suecinate de sodiiun et 1e saccharose; il ne peut utiliser la dulcite, 1'inuline, 1e raf- finose et la sorbite.

En milieu synthetique, 1'organisme utilise les sources inorganiques d'azote, y compris les sels d'ammonium et les nitrates, ainsi que des composäs organiques azotes tels que 1'uree, la glycine, 1'alanine, la ss-alanine, la valine, la leucine, la serine, la threonine, la phenylala- nine, la tyrosine, 1e tryptophane, la cystine, 1'aeide glutamique, l'aeide aspartique, 1'as- paragine, la lysine, 1'arginine, 1'histidine et 1e sulfate d'adenine.

Lorsque 1e present procede est execute en milieux nutritifs aqueux, an enleve la ma- tiere solide presente dann 1e milie-cu de cul- ture et 1'antibiotique cherche est isole du liquide de culture par des methodes decrites dans la suite. Quand an emploie -an milieu nutritif solide, 1e me1ange de culture est bien lave avec ui solvant pour l'antibiotique tel que 1'eau ou 1e methanol, et la sistomycosine cherchee isolee de 1'extrait. Pendant la Phase d'incubation, la temperature est de prefe- rence maintenue au voisinage de 25 ä 28 C. Lorsqu'on emploie des milieüx nutritifs aqueux, 1e pH initial optimum est entre 6 et 8,2, .de preference du. eöte alcalin entre 7,3 et 7,7. Pour obtenir un rendement maximum de sistomycosine, il faut eviter autaut que possible 1a. huuiere Pendant 1'incubation du melange de culture et 1'isolement de 1'anti- biotique. Lorsqu'on inocule 1e milieu de cul- ture avec des suspensions de spores, an peut utiliser les subcultures ou des cultures en pente de Streptomyces viridosporus.

La culture du micro-organisme en milieu nutritif aqueux peut eire effectuee de diffe rentes fagons. Par exemple, RTI ID="0004.0274" WI="3" HE="4" LX="1607" LY="665"> 1e micro-orga- nisme peut etre cultive en conditions aArobies ä la surface du milieu, ou bien il peut etre cultive sous la surface du milieu, c'est-ä-dire ä 1'etat submerge, ä condition de fournir en meme temps de 1'oxygene. La methode pre- feree pour produire la sistomycosine sur une Brande echelle consiste dann 1'usage de cul tures@submergees ou en profondeur du Strep- tomyces viridosporus. Dann cette maniere d'exeeuter 1'invention, Zn milieu nutritif aqueux sterile est inocule avec du Strepto- myces viridosporus et incube avec agitation et aeration ä une temperature entre 20 et 35 C, de preference au voisinage de 25 ä 28 C Pendant environ 1 ä 4 jours. Dans Ges conditions, 1'organisme se developpe sous forme de particules plus ou moins separees, dispersees dans 1e milieu, ce qui est bien dif- fETent des pellicules plus ou moins continues presentes ä la surface du milieu dann la methode de culture en surface. Du Fait de la repartition de 1'organisme dans tout 1e mi- lleu, an peut faire la culture en une fois dans de Brands voliunes de milieu nutritif inocule disposes dans les Brands rAservoirs ou cuves employes usuellement dans les indus- tries de Fermentation. Des cuves stationnaires de Fermentation, munies de moyens conve- nables d'agitation et d'aeration, de meme que des tambours rotatifs de Fermentation, ont ete trouves particulierement utilisables ä Ges fins. Cependant, pour la preparation de petites quantites de 1'antibiotique ou,de cultitres du micro-organisme, cette methode de culture subiuergee peut etre realisee dann de petites bouteilles secouees ou agitees par des moyens mecaniques convenables. L'agitation et l'aeration des melanges de culture peuvent etre obtenues de nombreuses manieres. L'agitation peut etre produite par des propulseurs ou autres dispositifs simi- laires d'agitation mecanique, ou en. faisant tourner et en secouant 1e recipient lui-meme de fermentation, ou par divers dispositifs de pompage ou encore par pa sage ä travers 1e milieu d'air ou de gaz contenant de 1'oxy- gene. L'aeration peut eire produite par injec- tion d'air ou autres gaz contenant de 1'oxy- gene dann 1e melange en fermentation, ä 1'aide de tuyaux ouverts, de tuyaux perfores, de moyens de ddfusion poreux tels que des bougies de carbone, du carborundum, de verre agglomere ou semblables; elle peut aussi eire produite en pulverisant, projetant ou ver- sant 1e melange ä travers une atmosphere contenant de 1'oxygene.. Le gaz contenant 1'oxygene devrait etre libere de spores, bae- t6ries ou autres agents de contamination avant d'etre introduit dans 1e melange de cul- ture. Ceei peut etre obtenu tres commodA- ment en 1e filtrant ä travers un lit de noir animal active: L'intensite de 1'aeration assu- rant une production optimum de sistomyco- sIne dependra, il va de soi, quelque peu du genre de reservoir employe, de 1'intensite et du genre d'agitation, du pA, de la temp6ra- ture et d'autres conditions de ce genre. En tout Gas, le gaz contenant 1'oxygene est de preference fourni en quantite suffisante pour maintenir xme Faible Pression positive dans 1e vase de fermentation et eliminer ainsi toute possibilite de contamination de la cul- ture par rentree d'air exterieur. Avec des vases du type ä reservoim dune capaeite de 210 litres, an a constate qu'une quantite de 10 ä 1.5 litres d'air par minute donne de Bons resultats, en 1'employant avec un propulseur mecanique type turbine ä six Aales, de 10 cm de diametre, tournant ä 100-200 tours ä la minute, vis-ä-vis de quatre deflecteurs verti- caux peripheriques de 2;5 cm sur'40.

0n peut employer une Brande variete de milieux nutritifs contenant une source de carbone assimilable, une matiere proteique, des sels mineraux et des traces de diverses substances nutritives, vitamines et autres sti- mulants de croissance, qui se trouvent en ge- nAral comme impuretes dans les autres cons- tituants du milieu. Pour une production op- timum de sistomycosine, 1e milieu nutritif contient aussi avantageusement une source de graisse. Comme source de carbone ässimilable, il y a lieu de citer ici les alcools polyhydro- xyliques et les mono-, di- et polysaccharides, tandis que comme matiere proteique, an peut mentionner les.proteines non modifiees et les produits de degradation des proteines, en particulier ceux provenant de 1'hydrolyse de protknes. De teils produits de degradation sont les proteases, les peptones, les polypep- tides, les peptides et les aeides amines.

Comme source de carbone assimilable, an peut employer 1'arabinose, 1e friictose, 1e ga- lactose, 1e lactose, 1e maltose, 1e rhamnose, 1e xylose, la glycerine, la mannite, la rhamnite et sein- blables. Des hydrates de carbone comme les amidons, la dextrine, des produits complexes comme les lavasses de Fermentation et de distillation, des cereales trempees ä 1'eau, des liquides de trempage de cereales, des residus seches de fermentation et autres produits semblables peuvent aussi etre utiI@i- s6s. Parmi les maueres proteiques utilisables Jans les divers mi@lieux, an peut eher 1'extrait de boeuf, la Gaseine hydrolysee ä 1'acide, la peptone de boeuf, de la farine de tourteau de f@ves de soya, des residus secs de fermen- tation, la farine de feves de s,oya soluble ä 1'eau, degraissee et partieslement hydrolysee, des melanges d'acides amines - provenant de sources naturelles ou synthetiques, 1'uree, les purines et semblables. L'emploi de farine de tourteau de soya ou de derives de proteines de soya comme .constituant du milieu est avantageux et pourvoit ä une Faible quan- tite de graisse utilisable par 1e micro-orga- nisme.

0n peut satisfaire aux principaux besoins en constituants mineraux par addition de 0,1 ä 0,51/o dun ou plusieurs sels inorganiques tels que 1e chlorure de sodium, 1e carbonate de ealcium, le Phosphate dipotassique, 1e Phosphate monopotassique et semblables. Les Gutres eonstituants du milieu nutritif, c'est- ä-dire les vitamines, les stimulants de crois- sance et semblables sont generalement pre- sents en quantite suffisante dans les sources de carbone assimilable impures et/ou les ma- tieres proteiques. La sistomycosine peut ätre isolee du me- lange Brut de calture par de nombreuses voies differentes. Lorsque 1'on a utilise un milieu de eulture solide, 1e mycelium est traite pour extraction avec un solvant de la sisto- mycosine tel que Peau, et 1e produit est isole de l'extrait comme decrit dans la suite. Dans 1e cas de eultüres liquides, le mycelium est separe, blen lave ä Peau, et 1e filtrat et les eaux de lavage sont titilises dans les Stades d'isolement subsequents. fJne methode pour isoler la sistomycosine @d'tin liquide de cul- .ture brat ou d'extraits de ettlturas comprend 1e traitement de la solution, pour extraction, avec un alcool non miscible ä Peau, tel que 1e n-butanol, 1'elimination du solvant par dis- tillation, l'extraction du residu avec un sol- vant des graisses, comme 1e chloroforme, la mise de cöte de cet extrait, 1'extraction du reste solide insolubl e au chloroforme, avec du chloroforme contenant environ 1011/o d'un alcool aliphatique inferieur, tel que 1e me- thanol, et 1e Passage de 1'extrait resultant Sur un agent d'echanges d'ions du type silieate inorganique. La matiere d'echange d'ions est lavee d'abord avec du chloroforme contenant des proportions eroissantes dun alcool ali- phatique inferieur; tel que 1e methanol, puls 1'antibiotique est 61u6 avec ledit alcool. Les eluats alcooliques sont evapores ä siccite, et 1e residu, extrait ä Peau. L'extrait aqueux est filtre, 1e filtrat est geie et la glace est eliminee par Sublimation dans 1e vide, pour obtenir 1'antibiotique cherche.

Les exemples suivants servent ä illustrer l'invention.

Exemple <I>1:</I> Un melange consistant en 180 g de ght- eose commercial, 180g dune Proteine pär- tiellement hydrolysee derivee de feves de soya, 90 g -de liquide de trempage de grains, 90 g de chlorure de sodium, 18 g de carbo- nate de calcium et suffisamment d'eau chaude pour porter le volume ä 18 litres, est pl:ace dann une ctive stationnaire en verre de 30 litres, pourvues dune calotte d'acier inoxydable, dun agitateur du type ä propul- sion, de quatre deflecteurs interieurs verti- caux de 2,5 cm sur 40, .et dun anneau circu- laire perfore de .diffusion d'air.

La cuve est placee Jans un autoclave et son contenu est sterilise ä la vapeur ä 121 C Pendant une heure. Cuve et contenu sont refroidis puls sortis de 1'autoclave. Le milicu est inocule de fa@on aseptique avec 900 cm3 dune subculture de Streptomyces viridospo- rus, preparee Jans une Bouteille ä secousses, en 72 heures, par culture Sur 1e meme mi- lieu que decrit ei-dessus, ensemence avec une culture en tube couche de Streptomyces viri- dosportts sporulee, Sur glucose-tryptone-agar.

Apres inoculation, 1e milieu de culture est incube ä 23-27 C Pendant 88 heures. Pen dant Pincubation, an fait arriver de Pair ste rile par 1'anneau .de diffusion, ä raison de 1.5,6 ä 17,8 litres par miaute, et 1'agitateur est mis en rotation ä une vitesse d'environ <B>150</B> tours par minnte.

0n suit la production de 1'antibiotique du rant 1'incubation ä Paide d'eehantillons que 1'on retire de temps en temps et que 1'on essaye par rapport au Candida albicans par la methode de .diffusion en agar en Plaques circulaires. La teneur en antibiotique .est in diqu6e par 1e diametre, en millimetres, .de la tone d'inhibition. La table qui suit indique la production de l'antibiotique par la methode decrite ei-dessus:

Inhibition du Periode d'incubation Candida albicans en heue es Diametre de la zone en millimätres 40 <B>16,6</B> 47 19,2 64 22,1 71 21,9 88 23,4 A la fin de la periode d'ineubation, an ajoute 25 g par litre d'un Silicate adjuvant de fi@ltration et 1e m61ange de culture est filtre. Le gäteau du filtre est lave avec deux portions de 25 cm3 d'eau par litre du m6- lange de culture et les eaux de lavage sont ajoutees au Filtrat principal.

31,46 litres du filtrat de la culture ou biere , prepare comme decrit ei-dessus, et donnant 18,5 mm ä 1'essai par rapport au Candida albicans ä une düution de 1 6, 2, sont extraits .deux fois avee 10 litres de n-butanol. La solution aqueuse est mise de cöte, et les extraits sont concentr6s dans 1'obscurite et sous vide, au=dessous de 45 C, presque jusqu'ä, siccite. Le residu est extrafit avec qu.atre portions de 50 cms et une por- tion de 100 cm3 de chloroforme ä 40 C, et les extraits sont mis de cöt6. Le residu inso- Juble au chloroforme est secoue avec 300 cm3 d'eau et filtre, ce qui donne 3,39 g d'un so lide (solide A) et un filtrat (Filtrat A). Le Filtrat A est gele et 1ä glace en est elimin6e par Sublimation dans 1e vide, ce qui donne 3,725 g de sistomycosine. 500 gamma de cette substance Jans 1 cms d'eau produit des zones d'inhibition du Candida albicans de 1.6,8 et 11,5 ä des dilutions de 1:1 et 1:2 res pectivement. .

Le solide A (3;39 g) est extrafit avee deux portions de 100 em3 et six portions de 150 cm3 d'eau. Les extraits sont filtres, essayes Apa- rement, et ceux de titres semblables sont combines @et geles. La glace est eliminee des extraits geles par Sublimation dans 1e vide et 3'on obtient au total 3,5 g de sistomycosine brute. Les quantites et les puretes des di verses fractions brutes sont indiquees dans la table qui suit

Cone. du Resultats des essais avec 1e Candida albicans Poids du produit brut Solide produit dans les Dilution 1: 1 1: 2 1: 4 1: 8 Brut solutions Diamätre (en mg) stockees de la zone MM MM mm mm 7# / oms d'inhibition B 1623 200 17,1 14,1 <B>10,6</B> C 1613 400 20,1 1.7,5 14;4 12,0 D 114 200 15,9 11,3 *` E 100 330 16,0 13,5 11,6 ** F 60 550 13,9 11,9 * Inhibition ä 1'interieur du cylindre. * * Legere inhibition imxneäiatement ä 1'entour du cylindre. 995 mg du solide B sont extraits pendant une demi-heure avec 199 cm3 de chloroforme contenant 101/o en volume @de methanol, et 1e melange est filtre. Le residu insoluble pese 770,5 -mg. L'extrait est verse Sur une co- lonne chromatographique contenant 21,1 g d'un materiel d'6change ä Base de Silicate, par -exemple 1e prödkuit marque Florisil , lavd pr6alablement ä fond avec du chloro- forme contenant 10 /m en volume de methanol. 0n Fait ensiüte passer ä travers la colonne les m6langes solvants dann S'ordre indiqu6, form6s :de chloroforme contenant 10, 20, 30 et 50<B>%</B> en volume .de methanol. Les 61uats sont mis de cöte, et 50 cm3# de methanol sont envoyes ä travers la colonne. Le premier eluat au methanol est mis de cöt6, et Von Fait passer alors ä travers la colonne, en pe- tites portions, environ 2050 em3 ;de methanol. 0n recueille ainsi au total huit fractions, dont les cinq premieres sont evaporees ä siccite @dans 1e vide. Le residu jaune est extrafit avec au total 35 cm3 @d'eau, 1'extrait est geie et la glace en est sublimee, et 1'on obtient 85,4 mg de sistomycosine saus forme solide legerement jaune. 400 gamma de ce solide dissous danS 1 cm3 d'eau produit une Zone -d'inhibition de 22 mm de diametre ä une dilution 1:1, pour 1e Candida albicans.

Les trois autres fractions sont melangees et evaporees ä siccite et 1'on obtient 131,1 mg de sistomycosine saus forme dun solide legerement jaune. 400 gamma de cette subs- tance Jans 1 ems d'eau produit une zone d'inhibition de 16 mm ä Lme dilution de 1:1 dann 1'essai ;avec 1e Candida albicans. Avec la mUhode d'essai turbidimetriqiie 7,14 y/cm3 produit une'inhibition de 50% danss la crois- sance de Candida albicans: 1,435 g,du solide C sont .extraits Pendant une demi-heure avee 287 ems de chloroforme contenant 10% en volume de methanol. Le residu insoluble (solide G) pese 1,084 g. L'extrait est versd sur inne colonne d'absorp- tion contenant 32 g dune matiere silicatee ä, Achange d'ions (produit marque Decalso ), lavee prealablement ä Fond avec du chloro- forme contenant 101/9 en volume de m6tha- noT. 0n fait ensuite percoler ä travers la co- lohne, et dans fordre indique, des portions de 700 em3 des melanges solo ants suivants chloroforme contenant 10, 20, 30, 40 et 501/o en volume de methanol. 0n met .de cöte les percolats. La colonne est alors eluee avec 840 em3 ,de methanol divises en six portions, et les eluats sont combines. La solution est evaporee ä siccite dans 1e vide et 1e residu est extrait avec au total 30 em3 d'eau. L'ex- trait aqueux est congele et la glace en est sublimee sous Pression reduite, ce qui :Bonne 107 mg de sistomycosine soiis forme .dun so lide Couleur chamois. Cette substance produit une zone d'inhibition de 23,6 mm ä une eon- eentration de 400 y/cms avec 1e Candida albicans.

La colonne est soumise ä 1'elution avee encore cinq portions,de 700 em3 de methanol et les extraits combines sont evapores ä sic- cit6 dans 1e vide. Le residu est extrait ä 1'eau, 1'extrait est congele et seche ä partir de 1'etat congele, ce qui Bonne 85 mg @de sistomycosine sous forme d'un solide Iegere- ment jaüne produisant ä 1'essai avec 1e Can- dida albicans une zone d'inhibition de 20,3 mm .ä iune concentration de 400 y/em3. Par i'essai turbidimetrique, 3,47 y/emg du produit ont occasionne une inhibition de 50 % Jans la croissance de Candida albicans.

Le solide G est extrait avec du ehloro- forme contenant 10i /o en volume de methanol et 1'extrait est verse dans une colonne chro- matographique contenant du Decalso . La colonne est lavee avec .des portions @de ehloro- form.e RTI ID="0008.0276" WI="15" HE="4" LX="1220" LY="579"> contenant 10, 20, 30, 40 et 50% :en vo- hime :de metlianol, et les liquides de lavage sont mis de cöte. La colonne est soumise ä 1'elution avec 600 em3 de m@ethanol, divises en six portions egales. Les Premiers 50 ems sont mis de eöt:e, et les fractions restantes sont combinees et evaporees ä s:iccite dans 1e vide. Le residlu est extrait ä 1'eau, 1'extrait est congele et la glace en est etiminee par subli- mation dann 1e vide, ce qui Bonne 92 mg de sistomycosine pure. 400 y/cm3 de cette subs- tance solide iegerement jaune produit une tone d'inhibition de 23,8 mm, ä une .dilution de 1:1, avec 1e Candida albicans. 0n peut encore obtenir un supplement de 60 mg de sistomycosine en lavant la colonne d'äbsorp- tion avee davantage de methanol et traitant 1'eluat comme dejä decrit.

Exemple <I>2:</I> Un milieu nutritif consistant en 5 g de glucose commercial, 2;5 g d'extrait de boeuf, 2,5 g de peptorne, <B>2,5</B> g de Chlorure de sodium et suffisamment d'cau pour porter 1e volume ä 500 em3, est rendii alcalin ä un p$ de 7,7, avec une solution 10N de soude caustique. Le liquide est mis. Jans une fiole de Fernbach fermee avee un tampon de cot.on et sterilise sous Pression de vapeur de 1,2'5 kg/cm2 pen- dant vingt minutes. Le milieu est inocule avee 1. cin3 dune suspension de spores de Strept.o- myces viridosponis provenant dune culture en tube couche de dix jours sur glücose-tryp- tone-agar. Le melange resultant est incube ä 2.4 C Pendant huit jours. Au- bout de ee temps, 1e liquide de culture au-dessous du myceliiun ä la surface a un pH de 6,8 et pro- d'uit une zone -d'inhibitlon de 22 min de dia- metre quand an 1'essaye pour la s'istomycosine avec 1e Gandida albicans par la methode ä Plaques circitlaires. La sistomycosine contenue Jans 1e liquide :de culture peilt etre isol'ee de la maniere decrite ä 1'exemple 1.

Exemple <I>3:</I> Un melange conssistant en 180 g de mal tose technique, 1'80 g de liquide de maceration de cereales düns Feau, 90g de chlor-Lire de sodium, 36 g de phosphatt de potassiiim diba- siqLie et sau ,en suffisance pour faire un vo- lume de 18 litres, est introduit dann une cuve de 115 litres du_type decrit ä 1'exemple 1. 0n regle 1e pa de la solution ä 7;5 avec une solu- tion lON de soude caustique, et ajoiite 18 g de earbonate de caleiiun; la cuve et 1e milieu sont alors sterilises Pendant deux Neures ä 250 C, puis 1e milieu nutritif .est refroidi et inocule aseptiquement avec 10 cm2 d'un@e sus- pension de spores de Streptomyces viridospo- rus preparee en, secouant une culture en tobe couche de Streptomyces viridosporus de 7 jours sur glucose-trypt.'one-agar, avec 10 cm3 d'ilne solution aqueuse ä 0,0'1% de savon blanc, dit de Cast.ille. ' Le melange de culture est incube ä, 28-29 C pendlant 13'6 h:eures durant les- quelles an faut tourner 1'agitateur ä une vi- tesse de 150 tours-ninute et an faut passer de, Fair sterile dann 1e melange ä raison de 7,2 ä 18 lit#res par minnte. A la fin de la Periode d'incubation, 1e myceliiun est enleve .du et l-a Biere claire de culture est essayee quant ä sa teneur en. sistomycosine par la methode turbidimetrique, par rapport au Candida albicans. Dans cette experience, la Biere de culture a ete trouvee produnre une inhibition de croissance du Candida albicans de 50% ä iuie @dilütion de 1 ä 135. La s.istomy- cosine presente Jans la bdere de culture peut eire isolee ä Fetal pur par la method'e d'isole- ment decrite ä 1'exemple 1.

Exemple <I>4:</I> 125 cm3 d'un milieu die culture forme de 0,5% de glucose commercial, 0,5'% de glyce- rine, 0,3"/@ de Gaseine hydrolysee, 0"251/o de peptone, 0,1II/o de levure de brasserie, 0,25% de solides de maceration de cereales dass l'eau, 0,9-51/o de farRne de tourteau die soya, 0;25 % de residus de Fermentation but;anol- aeetone, 0,25 % de chlorure de sodiiun, 0',1% de carbonate de calcium, 1e rest:e etant de Feau, est reparti en plusieurs flacons d'Erlenmeyer, que' 1'0n Ferme avec du coton recouvert de gaze et sterilise ä la vapear sous une Pression de 1;25 kg/cm2 Pendant '25 mi- nutes. Chaque flacon est inocule de fa@on aseptique avec 1 ems dune suspension de spores de Streptomyces. viridosporus preparee avee une culture en tube couche deRTI ID="0009.0275" WI="7" HE="4" LX="1635" LY="690"> sept jours sur glucose-tryptone-agar. Les flacons sont secoues sur une machine secoueuse du type ä rotation, ä 150 tours par minnte, peridant quatre jours. Durant la Periode d'incubation, la temperature est maintenue ä, 22-24 C. A la fin .de la Periode d'Rncubation, la Biere de calture avait un pjj d@environ 6;4. Par essai tiirbidimetrique avec 1e C-andida albi- cans, la Biere de culture a ete troüvee con- tenir suffisamment de sistomycosine pour pro- duire une inhibition @de, @50 % dans la crois- sance. de 1'organisme d'epreuve ä une dilu- tion de 1 ä 135.

Les melanges de enlture .düns les flacons peuvent etre combines, filtres et 1ä sistomy- cosine peut etre isolee par la methode decrite ä 1'exemple 1.

Exemple <I>5:</I> 125 cm3 d'iin milieu nnitritif compose de 19/o de mallose, 1 /o de -liquide de maceration de cdrea'les .dans de. l'eau, 0',2 % de Phosphate dipotassique, 0,5 %- ,die chlorure de sodium, et d'eau jusqii'ä 1001/o (amene ä un PI, de 7,5 avec une solution lON de soude caustique), est reparti en plusieurs flacons d'Erlenmeyer, que Fon Bouche avec du coton, recouvert de gaze. Les flacons contenant 1e milieu nutritif sont sterilises, inociiles et inciibes comme de- crit ä 1'exemple 4. A 1a fin de la Periode d'in- cubation, 1e myceliiim est enleve par filtration, et les liquides de culture ou Bieres sont com- bines. La Biere die culture a i-un p$ d'environ 6,3'5 et, essayee par la niethode- turbidime- trique, -eile est trouvee contenir suffisamment de sistomycosine pour prodiüre u ne inhibition de 50e/0 dann 1a croissance de Candida albi- i eans ä une dilution de 1 ä 130. La 3ist0my- cosine peut etre isolee ä I'etat pur de cette biere de culture par la methode decrite ä 1'exemple 1.

Claims (2)

1. REVENDICATION: Proc'ede pour la production d"un nouvel antibiotique, caracterise en ce quo Von, inocule un milieu nutritif avec du Streptomyces viri- dosportis, soumet je milieu inocule ä une incu- bation .d'ans es conditions aerabies, ä ..uze temperature de 20 ä 35 C, pendant au moins un jour, et isole du me1ange de culture 1'anti- biotique ainsi produit. Le nouvel antibiotique obtenu est une substance neuere, apte ä inhiber la croissance d'eiunycetes, et sann effet sur la croissance de la phipart des bacteries gram-negatives et gram-positives; olle contient seutement los elements carbone, hydrogene, oxygene et azote; olle est tres soluble dann 1'eau et 1e methanal, moins solirble dann 1'acetone hu mide et los melanges aqueux des alcools ali- phatiques stiperieurs, et insoluble Jans 1e chloroforme, 1'ether diethylique, 1'acetate d'ethyle, 1e benzene et 1'Uher de petrole; olle subit une decomposition photoelnmique par exposition ä la liunAre, räduit rapIdement la solution aqueuse froide de permanganate de potassium, et la solution aqueiise boiüllante de Benedict, donne une reaction .de 1VIolisch posi tive, et une reactiorn negative au chlorure fer- rique; olle communzque ttne Couleur foncee rouge cerise ä chocolat ä 1'acidie sulfurique concentre chaud, ne donne pa.s de couleur ä. une soliition chaude de thymol @dans de 1'acide nitrique concentre, et de meme pas de cou- leur ä une solution chaude de thymol dann 1'acide chlorhydrique concentre; dans 1'eau, olle presente des bandes .d''absorption maxi- mum caracteristiques Jans la region ultravio lette du spectre, ä 218, 29'2,5, 306 et 320,5 mu avec des band-es d'absorption minimum ä 253, 298: et 314 m@,c, et, lorsqu'elle est sous forme solide en suspenssion dann eine huil.e d'hydro- carbures, eile presente des bandes caracteris- tiques d'absorption dann la region de 1'inTra- rouge, ä 6,34,<B>7,08,</B> 7,16, 7,70, 7,86, 8,55, 8,9'5., 9,44, 9,89, 10,2!5, 10,6, 11,16; 11,85 et 12,4 ,cc; une autre Bande earaeteristiqu.e se trouve ä ou pres de 2,9,6 ,u. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procede selon la revenflication, dans le- quel la culture est @effectuee ä 1'etat submerge, en milieu nutritif aqueux ayant, un pl, initial de 6 ä 8,2 et contenant une source de carbone assimilable, des substances proteiques et des sels mineraux.
2. 2. Procede selon la sous-revendication 1, dann lequel 1e milieu nutritif liquide a un pH initial de 7,3 ä 7,7, et. la temperature durant 1'incubation est maintenue ä. 25-28 C.