CH334472A

CH334472A - Procédé de purification de la cyclosérine

Info

Publication number: CH334472A
Authority: CH
Inventors: Lee Harned Roger
Original assignee: Commercial Solvents Corp
Priority date: 1954-08-03
Filing date: 1955-08-03
Publication date: 1958-11-30

Description


  <B>Procédé de</B>     purification   <B>de</B>     la        cyclosérine       La présente     invention    se rapporte à un  procédé de purification de l'antibiotique     cyclo-          sérine,    notamment à partir d'un milieu nutritif  dans lequel cet antibiotique s'est formé.  



  La     cyclosérine    est un agent bactéricide à  spectre étendu dont l'activité s'exerce vis-à-vis  des bactéries Gram négatives et des bactéries  Gram positives, y compris des mycobactéries  telles que le     Mycobacterium        rance.    La     cyclo-          sérine    est produite à partir du<I>Streptomyces</I>       orchidaceaus.    Cet antibiotique est une subs  tance amphotère possédant des groupes faible  ment acides et des groupes faiblement basiques,  très soluble dans l'eau, partiellement soluble  dans les     glycols,    dans l'alcool     isopropylique,     dans le méthanol,

       dans    l'éthanol et dans l'acé  tone. Il est insoluble dans     l'hexane,    le benzène,  le chloroforme, l'éther, l'éther de pétrole, le       dioxane,    le     1-butanol,    l'acétate d'éthyle et le       dichloréthylène.    Il fond avec décomposition à  environ     153o    C, et s'hydrolyse à     140     C avec  de l'acide chlorhydrique 1 N.  



  Lors de la production de la     cyclosérine,    on  cultive le micro-organisme<I>Streptomyces</I>     orchi-          daceaus    dans un milieu nutritif contenant une  source appropriée de protéine et une source  appropriée d'hydrate de carbone, de l'air étant  fourni au milieu que l'on met à     incuber    à une  température comprise entre environ 200 et en  viron 300 C.

      On a actuellement découvert un procédé de  purification de la     cyclosérine    à     partir    de ses  solutions aqueuses impures, y compris les mi  lieux nutritifs dans lesquels elle est produite,  qui est commode, économique et fournit des  rendements satisfaisants en antibiotique, soit  sous forme amorphe, soit sous forme cristal  lisée.  



  Le procédé selon l'invention est caractérisé  en ce qu'on précipite la     cyclosérine    à partir  d'une solution aqueuse impure de     celle-ci    sous  forme d'un sel     métallique    insoluble, on sépare  de la couche     surnageante    le sel précipité de       cyclosérine,    on met le sel de     cyclosérine,    inso  luble dans l'eau, en suspension dans l'eau,

   on  précipite l'ion métal du sel     insoluble    de     cyclo-          sérine    sous forme d'un sel insoluble dans l'eau  et on     recueille    la     cyclosérine    à partir de sa  solution aqueuse purifiée résultante.  



  Pour mettre en     aeuvre    l'invention, on opère  avantageusement comme suit  On filtre en premier lieu la solution aqueuse  impure de     cylosérine    et on la décolore avec  du charbon animal activé. On adsorbe ensuite  l'antibiotique à partir de la solution aqueuse  sur une résine     échangeuse    d'anions fortement  basique sous forme hydroxyde.

   Des résines       échangeuses    d'anions fortement basiques que  l'on peut utiliser comprennent les produits  marque       Dowex    1   et       Dowex    2   qui sont      tous deux fabriqués par la Société Dow     Chemi-          cal    Company     (Midland,    Michigan) et les pro  duits marque       Amberlite   <I>XE-75  ,</I>       Amberlite     <I>XE-98</I>      ,          Amberlite    IRA-400      ,          Amberlite          IRA-410         ,

      qui sont fabriqués par     Rohm      &      Haas    Company, à Philadelphie (Pennsylva  nie).  



  Après l'adsorption de l'antibiotique sur une  résine     échangeuse    d'anions fortement basique,  on procède ensuite à     l'élution    de l'antibiotique  en     utilisant    une solution aqueuse d'une matière  dont l'anion est capable de déplacer la     cyclo-          sérine    de la résine, cet anion étant autre  que<I>OH.</I>  



  Des matières     d'élution    appropriées com  prennent des     sulfates,    des chlorures, des acé  tates, des     formiates,    des phosphates, des ci  trates, des     oxalates,    etc., solubles dans l'eau,  ainsi que l'acide     sulfurique,    l'acide chlor  hydrique, l'acide acétique, l'acide formique,  l'acide phosphorique, l'acide citrique, l'acide       oxalique,    etc.  



  Après     l'élution    de l'antibiotique à partir de  la résine     échangeuse    d'anions, on décolore le  produit     d'élution    avec du charbon activé, si  cela est nécessaire et, ensuite, on précipite  l'antibiotique à partir de la solution aqueuse  sous forme d'un sel métallique insoluble.

   Pour  mettre en     oeuvre    cette phase du procédé, on  ajoute à la solution aqueuse de     cyclosérine    un  sel soluble dans l'eau d'un métal qui forme un  sel insoluble avec l'antibiotique, ce qui précipite  le sel métallique de la     cyclosérine.    Avant l'ad  dition du sel métallique à la solution de     cyclo-          sérine,    on règle le<I>pH</I> de la solution de     cyclo-          sérine    à une valeur comprise entre environ 5,5  et 9,

  0 et on règle à nouveau le<I>pH</I> à une valeur  comprise dans cette gamme après l'addition du  sel     métallique.    On préfère     utiliser    un<I>pH</I> de 6,5.  Lorsque le<I>pH</I> est inférieur à 5,5, il se forme  très peu du sel métallique insoluble de la     cyclo-          sérine,    tandis qu'à un<I>pH</I> supérieur à 9,0, il  se forme des quantités excessives d'hydroxyde       métallique    lors de l'addition du sel de métal  soluble dans l'eau à la solution aqueuse de la       cyclosérine.    Des métaux que l'on a trouvé for  mer des sels insolubles avec la     cyclosérine     sont :

   l'argent, le cuivre, le mercure, le zinc,    le plomb, l'aluminium et le cobalt et, en consé  quence, on peut ajouter des sels solubles dans  l'eau de ces métaux à une solution aqueuse  de     cyclosérine,    et l'antibiotique précipite alors  sous forme d'un sel du métal utilisé. Des sels  solubles dans l'eau des divers métaux mention  nés ci-dessus sont : le nitrate d'argent, le  chlorure cuprique, le sulfate de cuivre, l'acétate  mercurique, le nitrate de zinc, le     sulfate    de  zinc, l'acétate de plomb, le nitrate de plomb,  le chlorure d'aluminium, le nitrate de cobalt,  le chlorure de cobalt, le sulfate de cobalt, etc.  



  Bien entendu, il y a des cas où l'on peut  précipiter l'antibiotique sous forme d'un sel  insoluble d'un métal à partir d'un milieu nutri  tif clarifié sans qu'il soit nécessaire de l'adsor  ber préalablement sur une résine     échangeuse     d'anions et de l'en extraire par     élution.    On  filtre alors le milieu nutritif dans lequel l'anti  biotique est produit, on clarifie ce milieu  en utilisant du charbon activé, dont on forme  une suspension dans le milieu nutritif filtré et  que l'on filtre ensuite pour le séparer de ce  milieu afin d'obtenir une solution aqueuse par  tiellement purifiée de l'antibiotique.

   '  Après la précipitation de la     cyclosérine    et  la séparation du sel métallique insoluble de la  couche surnageante, on met le sel métallique  insoluble en suspension dans l'eau et on y  ajoute une matière susceptible de précipiter  l'ion métal sous forme d'un sel insoluble, ce  qui libère la     cyclosérine    qui entre en solution  dans l'eau présente. Par exemple, si l'on a  précipité la     cyclosérine    sous forme du sel d'ar  gent, on peut mettre le sel d'argent de     cyclo-          sérine    en suspension dans de l'eau et y ajouter  de l'acide chlorhydrique.

   L'argent précipite  sous forme de chlorure d'argent, tandis que  la     cyclosérine    entre en solution aqueuse sous  forme d'acide     libre.    Si l'on a utilisé assez  d'acide chlorhydrique, on peut convertir la       cyclosérine    en son chlorhydrate en même temps  que l'argent précipite sous forme de chlorure  d'argent. De manière analogue, on peut utiliser  l'acide sulfhydrique, l'argent précipitant alors  sous forme de     sulfure    d'argent et la     cyclosérine     entrant en solution dans l'eau présente.

   Une  combinaison d'agents de précipitation des mé-      taux peut être utilisée, c'est-à-dire que l'on peut  utiliser à la fois l'acide chlorhydrique et l'acide  sulfhydrique pour assurer une extraction com  plète de l'argent. Si l'on met le sel de cuivre  insoluble de la     cyclosérine    en suspension dans  de l'eau et que l'on ajoute de l'acide sulf  hydrique, le cuivre précipite sous forme de  sulfure de cuivre et la     cyclosérine    entre en  solution dans l'eau présente. De façon similaire,  le mercure peut être précipité sous forme de  sulfure.  



  Après élimination de l'ion métal utilisé au  cours de la formation du sel métallique inso  luble de l'antibiotique, on décolore de pré  férence la solution aqueuse de l'antibiotique,  puis on la sèche par congélation sous vide pour  obtenir une préparation amorphe de pureté très  élevée. La forme amorphe est appropriée pour  la plupart des utilisations de l'antibiotique.  



  On peut faire cristalliser la     cyclosérine    à  partir d'une solution aqueuse au lieu de l'ob  tenir sous forme amorphe. On cristallise la  matière en ajoutant un solvant miscible à l'eau  à une solution aqueuse purifiée de l'antibio  tique, l'antibiotique étant insoluble ou faible  ment soluble seulement dans le solvant miscible  à l'eau. Des solvants miscibles à l'eau appro  priés que l'on peut utiliser pour cristalliser la       cyclosérine    à partir d'une solution aqueuse  comprennent l'acétone, le méthanol, le     dioxane,     etc.    Les exemples suivants illustrent la présente  invention.  



  <I>Exemple 1</I>  On filtre 288 litres d'un milieu nutritif dans  lequel la     cyclosérine    a été produite et qui  contient 4,8 unités de     cyclosérine    par     cm3    et  on les fait passer dans une colonne contenant  10 litres de       Dowex-2    5> (résine     échangeuse     d'anions fortement basique) sous la forme  <I>OH-,</I> avec un débit de 1200     cm3    par minute.

    On lave ensuite la colonne avec de l'eau et  on sépare la     cyclosérine    de la résine par     élution     avec de l'acide sulfurique 0,2 N avec un débit  de 1200     cm3    par minute, le produit     d'élution     étant     recueilli    en dix-huit fractions de 2     litres.     On règle ensuite le<I>pH</I> des fractions du produit       d'élution    à environ 7,0, après quoi on mélange  1 % en poids de charbon décolorant avec les  fractions du produit     d'élution,    puis on l'en  sépare par filtration.

   On ajoute ensuite, au  produit     d'élution    décoloré, 0,5 mg de nitrate  d'argent par unité d'activité antibiotique du  produit     d'élution,    le<I>pH</I> étant maintenu à 6,5  avec de la soude caustique. Un sel cristallisé  d'argent de la     cyclosérine    précipite à partir  du produit     d'élution    et on le filtre, on le lave  avec de l'acétone et on le sèche sous vide.  Le tableau suivant mentionne les résultats ob  tenus pour neuf des fractions de produit     d'élu-          tion    mentionnées ci-dessus.

    
EMI0003.0026     
  
    <I>Tableau</I>
<tb>  Produit <SEP> Produit <SEP> Filtrat
<tb>  d'élution <SEP> d'élution <SEP> Activité <SEP> décoloré <SEP> Activité <SEP> Grammes <SEP> Produit <SEP> Activité
<tb>  No <SEP> vol/cm' <SEP> unités/cm' <SEP> vol/cm' <SEP> unités/cm' <SEP> AgNO@ <SEP> grammes <SEP> unités/mg
<tb>  10 <SEP> 2260 <SEP> 15 <SEP> 2400 <SEP> 12 <SEP> 22,6 <SEP> 12,8 <SEP> 1,92
<tb>  11 <SEP> 2280 <SEP> 27 <SEP> - <SEP> 21 <SEP> 24,0 <SEP> 24,4 <SEP> 1,23
<tb>  12 <SEP> 2180 <SEP> 34 <SEP> 2340 <SEP> 31 <SEP> 35,0 <SEP> 33,9 <SEP> 1,80
<tb>  13 <SEP> 2020 <SEP> 47 <SEP> 2120 <SEP> - <SEP> 43,4 <SEP> 29,7 <SEP> 2,12
<tb>  14 <SEP> 2220 <SEP> 55 <SEP> 2400 <SEP> - <SEP> 53,3 <SEP> 38,2 <SEP> 2,5
<tb>  15 <SEP> 2160 <SEP> 32 <SEP> 2465 <SEP> 28 <SEP> 36,7 <SEP> 29,4 <SEP> 2,4
<tb>  16 <SEP> 2130 <SEP> 25 <SEP> 2370 <SEP> 20 <SEP> 28,8 <SEP> 24,4 <SEP> 2,

  0
<tb>  17 <SEP> 2050 <SEP> 17 <SEP> 2220 <SEP> 13 <SEP> 22,6 <SEP> 21,8 <SEP> 1,18
<tb>  18 <SEP> 1960 <SEP> 11 <SEP> 2100 <SEP> 8 <SEP> 12,7 <SEP> 10,4 <SEP> 0         On mélange une portion de 10 g du dérivé       cristallisé    d'argent provenant du produit     d'élu-          tion    No 14 du tableau ci-dessus, avec 60<I>ce</I>  d'eau et à     ce    mélange on ajoute 89 ce d'acide       chlorhydrique    0,5165 N. Le chlorure d'argent  précipite à     partir    de la solution et on l'en  enlève par filtration. On sèche la solution res  tante par congélation sous vide et on obtient  4,4 g de     cyclosérine    solide et amorphe titrant  5,15 unités/mg.  



  Dans 7,5 ce d'eau, on dissout une portion  de 1 g de la     cyclosérine    amorphe obtenue  comme décrit ci-dessus et on ajoute 5<I>ce</I>  d'acétone à cette solution. La     cyclosérine    cris  tallisée précipite à partir de la solution, après  quoi on ajoute 5 ce supplémentaires d'acétone  pour assurer une     cristallisation    complète. On       filtre    les     cristaux    pour les séparer de la solu  tion et on lave avec de l'acétone, ce qui donne  0,6177g de     cristaux    séchés à l'air titrant  4,32 unités/mg et contenant 14 % d'humidité.

    Quand on a chassé l'humidité par dessiccation,  la matière titre 5,02     unités/mg.       <I>Exemple 2</I>    On mélange une portion de 102     cms    d'un  milieu nutritif contenant 5 unités par ce de       cyclosérine    avec 4 % de charbon activé, on  agite le mélange et on le filtre. On ajoute  170 mg de nitrate d'argent au filtrat et le sel  d'argent de la     cyclosérine    précipite sous la       forme    de petits cristaux blancs.

   On filtre les  cristaux et on les sèche pour obtenir 160 mg  de sel d'argent     cristallisé    de la     cyclosérine.     Ensuite, on met le sel d'argent     cristallisé    de  la     cyclosérine    en suspension dans 10 ce d'eau  et on ajoute 1,47 ce d'acide chlorhydrique  0,505 N. Le chlorure d'argent précipite à par  tir de la solution et on l'en     extrait    par centri  fugation. On traite la solution restante avec du  charbon activé et on la sèche par .congélation  sous vide pour obtenir du chlorhydrate de       cyclosérine    titrant 4,85 unités/mg.

      <I>Exemple 3</I>    On mélange une solution aqueuse de  100 ce de     cyclosérine    contenant 8 unités  de     cyclosérine    par ce, avec 4,89 g de sulfate    de cuivre, et on règle le<B><I>pu</I></B> à 6,7 à l'aide  de soude caustique.     Il    se forme un précipité  du sel de cuivre de la     cyclosérine    et on le  filtre, on le lave avec de l'acétone et on le  sèche pour obtenir 3,92 g du sel de cuivre  de la     cyclosérine    titrant 1,88 unité/mg.

   On met  une     portion    de 1 g du sel de cuivre de la     cyclo-          sérine    en suspension dans 20 ce d'eau et on  fait passer de l'acide     sulfhydrique,    bulle par  bulle, dans la suspension pendant 5 minutes.  Du sulfure de cuivre insoluble précipite à par  tir de la solution et on le sépare par filtration,  le filtrat étant séché par congélation sous vide,  ce qui donne 0,457 g de     cyclosérine    titrant  3,3 unités par mg.

Claims

REVENDICATION Procédé de purification de la cyclosérine, caractérisé en ce qu'on précipite la cyclosérine à partir d'une solution aqueuse impure de celle-ci sous forme d'un sel métallique inso luble, on sépare de la couche surnageante le sel précipité de cyclosérine, on met le sel de cyclosérine, insoluble dans l'eau, en suspension dans l'eau, on précipite l'ion métal du sel insoluble de cyclosérine sous forme d'un sel insoluble dans l'eau et on recueille la cyclo- sérine à partir de sa solution aqueuse purifiée résultante.

SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on ajoute, à une solution aqueuse impure de la cyclosérine dont le p" est compris entre 5,5 et 9,0, un sel soluble dans l'eau d'un métal capable de former un sel de cyclosérine insoluble dans l'eau, on sépare de la couche surnageante le sel métal lique précipité de cyclosérine, on forme une suspension dans de l'eau du sel métallique in soluble dans l'eau de cyclosérine,

on ajoute à la suspension un acide dont l'anion est capable de former un sel insoluble dans l'eau avec le cation métal du sel métallique insoluble dans l'eau de la cyclosérine, on sépare le sel métal lique précipité insoluble dans l'eau et on extrait la cyclosérine de sa solution aqueuse purifiée. 2.

Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on adsorbe de la cyclosérine à partir de sa solution aqueuse impure sur une résine échangeuse d'anions fortement ba sique sous formeOH-, on élue la cyclosérine à partir de la résine avec un anion autre que OH-, on précipite la cyclosérine sous forme d'un sel métallique insoluble à partir du produit aqueux d'élution, on sépare de la couche sur- nageante le sel métallique précipité de cyclo- sérine,

on met le sel métallique insoluble dans l'eau en suspension dans de l'eau, on fait pré cipiter l'ion métal du sel insoluble de la cyclo- sérine sous forme d'un sel insoluble dans l'eau et on recueille la cyclosérine à partir de sa solution aqueuse purifiée résultante. 3.

Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 2, caractérisé en ce qu'on ajoute au produit aqueux d'élution obtenu, qui est à unpH compris entre 5,5 et 9,0, un sel soluble dans l'eau d'un métal capable de for mer un sel insoluble dans l'eau de cyclosérine, on sépare de la couche surnageante le sel mé tallique précipité insoluble dans l'eau de cyclo- sérine, on met le sel métallique insoluble dans l'eau en suspension dans l'eau,

on fait préci piter l'ion métal du sel métallique insoluble dans l'eau de cyclosérine sous forme d'un sel insoluble dans l'eau et on recueille la cyclo- sérine à partir de sa solution purifiée aqueuse résultante. 4.

Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on ajoute du nitrate d'argent à une solution aqueuse impure de cyclosérine, qui est à un prl compris entre 5,5 et 9,0, on sépare de la couche surnageante le sel d'argent précipité de cyclosérine, on met le sel d'argent de cyclosérine en suspension dans l'eau, on ajoute de l'acide chlorhydrique à la suspension, on élimine de la solution le chlorure d'argent précipité et on recueille la cyclosérine purifiée à partir de sa solution aqueuse purifiée résul tante. 5.

Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé en ce que la solution aqueuse impure de cyclosérine présente unpH de 6,5 environ et qu'on ajoute un solvant organique miscible à l'eau, qui n'est pas sol vant vis-à-vis de la cyclosérine, à la solution aqueuse purifiée de cyclosérine, après quoi on recueille les cristaux de cyclosérine qui se forment. 6.

Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on ajoute un sel de cuivre so luble dans l'eau à une solution impure aqueuse de la cyclosérine dont lepH est compris entre 5,5 et 9,0, on sépare le sel de. cuivre précipité de cyclosérine de la couche surnageante, on met le sel de cuivre de cyclosérine en suspen sion dans l'eau, on ajoute du sulfure d'hydro gène à la suspension, on élimine le sulfure de cuivre précipité de la solution et on recueille la cyclosérine à partir de sa solution aqueuse purifiée résultante. 7.

Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on absorbe de la cyclosérine à partir de sa solution aqueuse impure sur une résine échangeuse d'anions fortement basique sous formeOH-, on élue la cyclosérine à partir de la résine avec un anion autre que OH-, on ajoute un sel d'argent soluble dans l'eau à la solution aqueuse d'élution de cyclo- sérine qui est à unpH compris entre 5,5 et 9,0, on sépare le sel d'argent précipité de cyclo- sérine de la couche surnageante,

on met le sel d'argent de cyclosérine en suspension dans l'eau, on ajoute de l'acide chlorhydrique à la suspension, on élimine de la solution le chlo rure d'argent précipité et on recueille la cyclo- sérine de sa solution aqueuse purifiée résul tante. 8.

Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 7, caractérisé en ce que la solution de cyclosérine est à unpH d'envi ron 6,5 et, qu'après élimination du chlorure d'argent précipité, on ajoute à la solution aqueuse purifiée de cyclosérine un solvant organique miscible avec l'eau qui n'est pas capable de dissoudre la cyclosérine et on re cueille la cyclosérine cristalline qui se forme. 9.

Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on ajoute un sel soluble dans l'eau d'un métal capable de former un sel insoluble dans l'eau de cyclosérine à une solu tion aqueuse impure de cyclosérine à un prl compris entre 5,5 et 9,0, on sépare de la couche surnageante le sel métallique précipité de cyclosérine, on met le sel métallique inso luble dans l'eau de cyclosérine en suspension dans de l'eau,

on ajoute à la suspension un acide dont l'anion est capable de former un sel insoluble dans l'eau avec le cation métal du sel métallique insoluble dans l'eau de cyclo- sérine, on élimine de la solution restante de cyclosérine le sel métallique précipité insoluble dans l'eau et on sèche par congélation sous vide la solution aqueuse purifiée de cyclosérine pour obtenir de la cyclosérine amorphe solide.