CH507914A

CH507914A - Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids

Info

Publication number: CH507914A
Application number: CH150869A
Authority: CH
Inventors: Stephan Dr Guttmann; Janos Dr Pless; Sandrin Edmond; Willems Hans
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1969-01-31
Filing date: 1969-01-31
Publication date: 1971-05-31
Also published as: ATA88370A; HU163157B

Description


  
 



  Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannten Polypeptids der Formel
EMI1.1     


<tb>  <SEP> II <SEP>    3    <SEP> 4 <SEP>    3    <SEP> 6 <SEP>    1. <SEP>       9    <SEP> 9 <SEP>    10    <SEP> 
<tb> H-Cys-Ser-Asn- <SEP> Leu <SEP> - <SEP> Ser-Thr-Cys-Val- <SEP> Leu-Ser 
11 12 13 14   13    16   1    18 19   29      21      Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr - H is-Arg-   
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NHJ, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditions   salzc    und Schwermetallkomplexe.



   Das bisher unbekannte Polypeptid kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten   Methoden    hergestellt werden, wobei die
Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten   IQeihenfolge    einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige
Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeklicher Reihenfolge miteinander kondensiert. wobert nicht. an der...

  Reaktion teilnehnrende frcie funktioneiR Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthgese die Mercaptogruppen nach Bil dung der Aminosäurcteilsequenz 1 bis 7 und vor Ein bau der cine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des ter minalen Prolyirestes in die Amidgruppe überführt.

  Bei der Verknüpfung von Peptideinheiten sind Methoden zu verwendcn. bei   dcnen    Racemisierung nicht auftritt oder   gering      gehalten    werden kann, vorzugsweise die    Azid-    oder die aktivierte Ester-Methode, wobei zur    Aktivierung    vorzugsweise   N- lfydroxysuccinimid    Vcrwendung findet,   Üblicherweise    werden die beim Aufbau von Cystein-haltigen Peptiden zum Schutz der SH-Grup    pen    verwendeten   Bcnzylreste    am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem   Ammoniak    abgespalten.



   Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen und die Herstellung der (Cys)S S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.



   Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blockierung der   ^y-Carboxygruppe,    beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert. Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die   Athoxy-,    die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.



   Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histi   dinreses    in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch   können    auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo - tert.-butoxy-, die Carbo - tert. - amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe, verwendet werden,
Für die Blockierung der   #-Aminogruppe    des Lysinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz D kann eine   tert.-Alkoxy-carbonylgruppe.    vorzugsweise die tcrt.-Butoxy-carbonylgruppe. verwendet werden.



   Das   neue    Polypeptid   lässt    sich auch in Form seiner Salz gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit   orgarlischen    Säuren, wie Essigsäure, Propion   saure,    Glykolsäure,   Milchsäure,    Brenztraubensäure,   Malonsäure,    Bernsteinsäure.   Maleinsäure,      Fumarsäure,    Weinsäure, Zitronensäure. Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder   o-Acetoxybenzoesäure.   



  Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hvdroxväthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsaure,   Naphthaiinsuifonsäurc,    Sulfanilsäure   sowic    polyniere   Säuren,    wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure,   Polyphloretinphosphat    oder   Garboxymethyl-    cellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z.B. Salzsäure oder Bronrwasserstoffsäure. Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwe   folsäure    und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetall  komplexe kommen z. B. diejenigen vom Zinks in Frage.



   Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach   vorherier    Bildung kleinerer Peptidein   heitcn    miteinander verknüpft werden.



   Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Cal   ciunibilanz    im Knochen bewirkt. Die biologische Prüfung des bisher unbekannten Polypeptids ergab eine Wirksamkeit von 500   212    100 MRC-Einheiten/mg Peptid.



   Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des   Plasmaealeiumspiegels    erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.



   Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist. z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B.   postklimakterisch,    posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie. Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.



  Phosphat.



   Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden.



  Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke. Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline. Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.



   Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in Form von Depotpräparaten verabreicht werden.



   Die neue Verbindung und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.



   Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z   =    Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB   -    tert.-Butyloxy
ONP   =    p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OSu = N-Hydroxysuccinimid
OMe   ==    Methoxy
OEt = Athoxy
NO2   =    Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Lys   @    L-Lysyl
Thr       L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl    Phc    = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly   =    Glycyl
Met - L-Methionyl
Cys L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen. 

   die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle   Tenlperaturangaben    in Celsiusgraden.  



   Teilsequenz A
L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid  (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei -5  134   °      Z-Thr-NH-NH,    in 2 Liter
In Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Athylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g   H-Pro-NH2 Hydro-    chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über   Nacht    bei 250 stehen.

  Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in   Äthylacetat    gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen   Calciumcarbonatiösung    gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Athylacetat und kühlt ab.



  Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 148 ,   [&alpha;]20D=    -72  in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro   NH-    in 2 Liter Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man   abfiltriert,    verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Athylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2.HCl; Smp. 216 ,    [&alpha;]20D 20D = 640 in 95 'Y Essigsäure. Dieses wird in 500 ml    Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g   Z-Glu(OTB)-OCP    und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 20  stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther.

  Man erhält Z-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2, Smp. 65  (Zers.),   [&alpha;]20D=-18     in Di methylformamid.



   Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Li   tcr    Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der   Rückstand    mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp.



     650    (Zers.),   [&alpha;]    20D =   280    in Dimethylformamid.



   Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0  gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH,   8      g    N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit   Athylacetat    versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im VAkuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthylacer.Alan.erhält.Z-Phe-Gly-Pro-Glu-(OTB) Thr-Pro-NH2. Smp. 120  (Zers.),   [&alpha;]20D    = -66  in Dinrethvlformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.

  Man   gibt    30   g      Palladiumkohle    (10%) zu und   hydriert    bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert,   dampft    das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan.   Man    erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 153   [&alpha;]20D=    -79  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz B
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl
L-methionyl-glycin  (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L'Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid  (H-Met-Gly-OEt.HCl)    Man    löst   h5      g    BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf -10 , gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutyiester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30 g   Glycin-ithylester    in   200    ml Chloroform hinzu und lässt bei 20'' eine Stunde reagieren.   Man    extrahiert mit 0,5n Ammoniumhydroxid, dann mit 0,2n Schwefelsäure, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt cin.

  Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Gly-OEt; Smp. 49 ,   [&alpha;]    20D= -19  in Äthanol.   Man    löst es in 750 ml 4n   HCl/Sithanol,    lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Ge   wichtskonstanz.    Man erhält das   H-Met-Gly-OEt. HCl    in Form eines Öles.



  b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester  (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst   12,5    g N-tert.-Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g   Glycin-äthylester    in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft.



  Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl;   [&alpha;]20D    = -3  in Dimethylformamid.



  c) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid  (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Athylalkohol, gibt 48,6 ml Hydrazinhydrat hinzu und   lässt    2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Äthyläther-Gemisch (1: 3). Man erhält   BOC-Ser-Gly-NHNH2,    Smp.   1570,      [&alpha;]20D    = -5  in Dimethylformamid.



  d) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl
L-methionyl-glycin-äthylester  (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethyiformamid werden 25 ml einer   4n-Clilorwasserstofflösung    in Äthyläther   gegeben    und darin bei -10  11 g   BOC-Ser-Gly-NHNH.    gelöst. Anschliessend tropft man bei   -10       5,4    ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g H-Met-Gly-OEt HCl in 100 ml Dimethylforrnamid und 6.2 ml Triäthylamin bei. Es   wird    3 Stunden bei Kaumtemperatur gerührt,   nach ' 2 Stunden filtriert und eingedampft.

  Den Rück-    stand löst   man    in Chloroform. wäscht nacheinander mit verdünnter   Ammoniak    und Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC Ser-Gly-Met-Gly-OEt.   [&alpha;]20D=-14     in Dimethyiformamid.

 

  e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl
L-methionyl-glycin  (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan. gibt 75 ml In Natronlauge zu, rührt 1 Stunde   bei      25,    behandelt mit 150 ml   L)owex-50    (H -Form), Ültriert.   dampft    das Filtrat ein und kristallisiert den   Rückstand    aus Essigestert Diäther. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 87  (Zers.),   [&alpha;]    20D =   --17 - in Dimethylformamid.     



   Teilsequenz C
Na,Nimid.-Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalaninhydrazid - HCl  (Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2.HCI) a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe- HCI werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden   ist. Man    filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.



   67,6 g Z-Arg(NO2)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2   ;      H-Phe-OMe    versetzt. Danach wird auf   -20     abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem   Umschütteln    wäh   rcnd    4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit in Natronlauge, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und   gesättigter    Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylesterphase wird vollständig eingedampft.

  Nach Umkristallisieren aus Essigester Petroläther erhält man Z-Arg(NO2)-Phe-OMe; Smp.



  131-133 ,   [&alpha;]20D=      -7    in Methanol,   40    in Dimethylformamid.



  b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe -0,5 H2O.1,2 HBr    20    g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40%ige   Bromwasserstoffsäure    in Eisessig zugesetzt. Danach   ist    man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei   20    stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser   gelöst    und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus   Methanol/Äther    umkristallisiert. Smp.   165-167     mit Zers.,   [&alpha;]    20D=   180    in   Methanol,      .    140 in Dimethylformamid.



  c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe.-0,5H2O .1,2 HBr werden in   100    ml Wasser gelöst, hierauf   erwärmt    und   anschliessend    abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf   ptf    9 gestellt. Die   Chloreformphase    wird noch einmal mit Wasser gewa   schcn,    anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dcm Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH,   T    g N-Hydroxysuccinimid in 200 ml   Aceronitril    und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -20  abgekühlt und mit einer Lösung von   21.1    g   Dicyclohexyicarbodiimid    in 70 ml Acetonitril versetzt.

  Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren   Stunden      im    Eiskasten   stehengelassen.    Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert   und    das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen:   10 @ige    Kaliumcarbonatlösung (pH ¯ 10), Wasser, gesätrigte Kochsalzlösung, Wasser, gesifttigte-Kochsalzlösung.   Schwefelsäure    (pH 3), Wasser. Kochsalzlösung. Die über Natriumsuifat getrocknete Essigsäure äthylester-Phase wird voilständig eingedampft. wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit  Äther gefällt.

  Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)
Arg(NO2)-Phe-OMe (amorpher Schaum),   [&alpha;]20D=    -8  in Methanol, -8  in Dimethylformamid.



   d)   I{-llis-Arg-Phe-OMe    .4 4 HCI    25    g   Z-His(Z)-Arg(NO.')-Phe-OMe    werden in
800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10   a    10 % Palla dium auf Aktivkohle in 200 ml in Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer
2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der   Katalysator    abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit
5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach   51/2    Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 % der theoretischen
Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei    H-His-Arg-Phe-OMe    .4 4 HCI in Form eines amorphen
Schaumes erhalten wird.



     c)    Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe    HCI   
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe.4 HCl werden in
100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid    gelöst. Bei etwa - 5  wird bis pH 9 Triäthylamin    zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g
Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von
Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rück stand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von   wenig ion    Salzsäure auf pH 4 gestellt.



   Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zwei mal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit   Ather    versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei
Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe.HCl erhalten wird.



   f) Trt-His (Trt)-Arg-Phe-NH-NH2.HCl
17 g   Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe    HCl werden in    200    ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in
Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die
Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.   Hicrauf    wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt)
Arg-Phe-NH-NH2.HCl;   [&alpha;] 18D = -9     in Dimethylform amid.



   Teilsequenz D    @-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-   
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl
L-tyrosinmethylester  (H-Lys(BOC)-Asn-Letl-Astl-Asn-Tyr-OMe) a) Z-Asn-Tyr-OMe
Man löst 89 g Z-Asn-OCP und 31 g H-Tyr-OMe iil   500      1011    Dimethylformamid, lässt über   Nacht    bei Zim mertemperatur stehen und fällt aus in   Äther.    filtriert ab   und      wäscht      Illit    Diäthyläther. Man löst in Dimethylformamid und   fällt    aus in Wasser, filtriert   ab.    wäscht    nit      Wasser    nach und trocknet.   Man    erhält die unter at angeführte Verbindung. 

  Smp. 199.   [&alpha;]    20D = - 6
Dimethylformamid.  



  b) H-Asn-Tyr-OMe HC1
Man löst 31 g Z-Asn-Tyr-OMe in 500 ml Dioxan und 85 ml in Salzsäure, hydriert bei 250 C in Gegen   wart    ines Palladiumkatalysators, filtriert ab, dampft das Filtrat cin, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet. Man erhält die unter b) angeführte Ver   bindung, [&alpha;]20D =    + 290 in Dimethylformamid.



  c) Z-Asn-Asn-Tyr-OMe
Man löst 34,6 g H-Asn-Tyr-OMe.HCl und 57 g Z-Asn-OCP in 500 ml Dimethylformamid, gibt 6 ml Eisessig und nachher 14 ml Triäthylamin zu. Man lässt 2 Tage bei 250 stehen und fällt in Diäthyläther aus.



  Man löst in Dimethylformamid, fällt in Wasser aus, filtriert ab und wäscht mit Wasser nach. Man erhält die unter c) angeführte Verbindung, Smp.   2200,      [&alpha;] 20 D    =   -4     in Dimethylformamid.



  d) H-Asn-Asn-Tyr-OMe.CH3COOH
Man löst 42 g Z-Asn-Asn-Tyr-OMe in 750 ml Dimethylformamid und gibt 80 ml in Essigsäure zu.



  Man hydriert bei 250 C in Gegenwart eines Palladiumkatalysators, filtriert ab und dampft das Filtrat ein.



  Der Rückstand wird in heissem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält die unter d) angeführte Verbindung, Smp. 168 ,   [&alpha;]20D    -   60    in Dimethylformamid.



  e) Z-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe
Man löst 40 g Z-Leu-OCP und 33 g H-Asn-Asn Tyr-OMe. CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid.



  lässt 2 Tage bei 250 stehen und fällt in Diäthyläther aus.   Man    löst in Dimethylformamid. fällt mit Wasser aus, filtriert ab und wäscht mit Wasser nach. Man erhält die unter e) angeführte Verbindung, Smp.   2410,      [a] 20D = 150 in Dimethylformamid.   



  f) H-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe
Man löst 34 g Z-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in 500 ml eines Gemisches von Dimethylformamid/Wasser   (8 2)    und hydriert in Gegenwart eines Palladiumkatalysators bei   200.    Man filtriert ab und dampft das Filtrat ein.



  Der Rückstand wird in heissem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält die unter f) angeführte Verbindung, Smp. 175 ,   [&alpha;]    20D = -16  in Dimethylformamid.



  g) Z-Asn Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe
Man   l. 5    g Z-ASn-OCP und 26.5 g H-Leu-Asn Asu-Tyr-OMe in 500 ml Dimethylformamid,   lässt    2   Tage    bei 25    stehen.    tropft in Diäthyläther ein. filtriert ab,   wäscht    mit Diäthyläther nach und trocknet.



     Man    löst in Dimethylformamid,   fällt    mit Wasser aus, filtricrt ab und   wäscht    mit Wasser nach. Man erhält   dic      unter    g) angeführte Verbindung.   Smp.255 , [&alpha;]20D =      -1R'    in Dimethylformamid.



  h) H-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe. CH3COOH    Man    löst   32.g    g Z-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in   7      Liter    Dimethy6lformamid, hydriert bei   20"    in Gegenwart   cincs    Palladiumkatalystaors und fügrt 60 ml In Essigsäure zu. Dic   Lösung    wird filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in heissem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält die unter h) angeführte Verbindung, Smp. 210 ,   [&alpha;] 20D    = -19  in Dimethylformamid.



   i) Z-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe
Man löst 12,6 g Z-Lys(BOC)-OCP und 11 g H-Asn
Lcu-Asn-Asn-Tyr-OMe CH3COOH in 500 ml Di methylformamid, lässt 2 Tage bei   250    stehen, tropft in    Ather    ein, filtriert   ab.    wäscht mit   Ather    nach und trocknet. Man löst in Dimethylformamid, fällt mit Was ser aus. filtriert ab und wäscht mit Wasser nach.   Man    erhält die unter i) angeführte Verbindung, Smp.   2420,     = -20  in Dimethylformamid.



  j) H-Lys(BOC)-Asn-Lcu-Asn-Asn-Tyr-OMe
Man löst 11 g   Z-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-    OMc in 300 ml Dimethylformamid und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und das Produkt in Diäthyläther ausgefällt. Man wäscht mit Diäthyläther nach und erhält Teilsequenz D; Smp.   2210,      [aj    20 D =  -26  in Dimethyiformamid.



   Teilsequenz E
N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosinyl
L-tryptophanyl-hydrazid  (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NHNH2) a) H-Tyr-Trp-OMe
Man löst 85 g Z-Tyr(Z)-Trp-OMe in einem Gemisch von 1000   ml    DioxaniWasser   (8 : 2)    mit 145 ml in Salz säure und hydriert in Gegenwart eines   Palladiumkataly-    sators bis zum konstanten Ende der Wasserstoffauf nahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung eingedampft und mit 500 ml Wasser versetzt.



  Die wässrige Phase wird mit Essigester gewaschen und mit festem Kaliumhydrogencarbonat alkalisch gestellt.



  Nach wiederholter Extraktion mit Äther und Eindampfen erhält man H-Tyr-Trp-OMe, Smp. S50,   [ql    20 D =
2  in Dimethylformamid.



   b) Trt-Ser-Ala-OMe
Man löst 60 g   H-A!a-OMe       HCI    und 130 g Trt-Ser OH in einem Gemisch von 1400 ml AcetonitrilvDi- methylformamid   (1:I)    und gibt 60 ml Triäthylamin zu. Nach Versetzen mit 52 g N-Hydroxysuccinimid wird die Lösung auf   0     abgekühlt und mit 97 g Dicyclo hexylcarbodiimid 5 Stunden geschüttelt. Nach Filtration wird die Lösung eingedampft, mit Essigester versetzt und mit verdünnter Essigsäure und Kaliumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen, Eindamp fen und Behandeln mit   Ather    erhält man Trt-Ser-Ala
OMe, Smp.   146,      [rt}'b'0    = -56  in Dimethylformamid.



   c)   Trt-Ser-Ala-NHNH.   



   Man löst 82   e    Trt-Ser-Ala-OMe in 800 ml Methanol auf und versetzt mit 80   ml      Hydrazinhydrat.    Nach    24stündiecm    Stehenlassen bei   20     wird eingedampft und der Rückstand mit Äther und. Wasser gewaschen.

 

     Man erhält Trt Ser Ala NHNH2, Smp. 126 , [&alpha;]20D =       38'    in Dimethylformamid.



   cD Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-OMe
30 g   Trt-Scr-Ala-NHNH-    werden in 170 ml Di methylformamid gelöst. auf -20  abgekühlt und mit
100 ml 2n Salzsäure in Dioxan versetzt. Nach Zugabe von   8.5    ml tert.-Butylnitrit wird weitere 10   Minuten    bei -20  gerührt und mit einer Dimethylformamid lösung, enthaltend 31 g H-Tyr-Trp-OMe.HCl und
50 ml Triäthylamin, vereinigt. Nach 2stündigem Schüt teln wird die Lösung verdampft und der Rückstand in  
Essigester aufgenommen. Nach Auswaschen mit ver dünnter Essigsäure, Ammoniak, Trocknen über Na triumsulfat und Eindampfen erhält man Trt-Ser-Ala
Tyr-Trp-OMe, Smp. 143 ,   [&alpha;]20D=      l    160 in Dimethyl formamid.



   e)   Trt-Ser-A la-Tyr-Trp-NHNH.   



   Man löst 30 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-OMe in 300 ml
Methanol und versetzt mit 30 ml Hydrazinhydrat. Man lässt die Lösung 24 Stunden bei 200 stehen und dampft ein. Der Rückstand wird mit   Ather    und Wasser behan delt. Das erhaltene Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NHNH2 hat einen Smp. von 196 ,   [&alpha;]20D    = + 10  in Dimethyl formamid.



   Teilsequenz Fl
L=Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin  (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe   HBr   
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val
Leu-OMe HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9   ml    Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit ver dünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus
Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys  (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp.   1600,      [&alpha;]20D    = -28  in Di methylformamid. das man in 210   ml    einer   40 eigen   
Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.

  Man lässt
1 Stunde bei   25-    stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl  äther um. Man erhält   H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.    HBr,
Smp. 168 ,   [&alpha;]20D    = -14  in Dimethylformamid.



   b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr
Man löst 20 g   Z-Thr-NHNH,    in 350   ml    Dimethyl formamid. kühlt auf   -20,    gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch
10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val
Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0  geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser. wäscht die organische
Phase mit verdünnter Salzsäure. trocknet über Natrium    stilfat,    dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus
Essigester um. Man erhält   Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-       OMe; Smp. 208-:. [&alpha;]20D = -27  in Dimethylformamid.   



   Mar   ist    20   g    von dem oben erhaltenen Tetra peptid   @,@200    ml eines Gemisches von Trifluoressig  äure asigester (1:1) auf. leitet während 1 Stunde bei ()   cincn    Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft   anschliessend    cin und kristallisiert den Rück stand aus Methanol   Diäthvläther    um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. 1.3 HBr; Smp. 202 ,    [&alpha;] 20D = -10  in Dimethylformamid.   



   c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH
Man löst 372 g H-Tbr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe
1.3 HBr in 1800 ml Methanol. gibt 900 ml 2n Natron lauge zu. lässt 1 Stunde bei   25    stehen. gibt 240   mi       Eisessig    zu und lässt 2 Stunden bei 0  stehen. Man    filtricrt dic      ausgeschiedene    kristalline   Massc    ab.   wäscht       dicse      zucrst      mit 1 n      Essigsäure,    anschliessend mit Wasser und trocknet bei 50' im Hochvakuum. Man erhält das    H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH; Smp.219. [&alpha;]20D = -53     in In Ammoniak.



   Teilsequenz F2 tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid    (B OC-Cys(Bzl) -Ser-Asn-Lcu-Ser-NH-NHo)    a) H-Asn-Leu-Ser-OMe.-HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe.HCl und 53 g    BOC-Asn-ONP    in 400 ml Dimethylformamid auf. gibt    22    ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei   25D    stehen.



   dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu
Ser-OMe, Smp. 190 ,   [&alpha;]20D = -24     in Dimethylform amid, das man in 500 ml einer 4n-Lösung von Salz    säurc    in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei   253    stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält
H-Asn-Leu-Ser-OMe. HCl; Smp. 180 ,   [&alpha;]20D    = -23  in Dimethylformamid.



   b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Di methylformamid, kühlt auf -20 , gibt 200 ml einer
2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend
20 ml tert.-Butyinitrit zu. Nach 10 Minuten   bei 200    werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu
Ser-OMe HC1 hinzugefügt, danach 16 Stunden bei   0    gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diächyläther umkristallisiert. Man erhält
BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 135 ,   [&alpha;] 20D =    -22  in Dimethylformamid. das man in 420 ml einer 4n
Salzsäurelösung in   Methanol    löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristalli siert aus   MethanollEssigsäureäthylester    um.

  Man erhält
H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl, Smp. 155  (Zers.), c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst   18,5    g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI und 18 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethyl formamid a uf, gibt 10 ml Wasser, 3.5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25  stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus
Methanol um. Man erhält 25.1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser
Asn-Leu-Ser-OMe. Smp.   182,      [&alpha;]20D    =   -17-:    in Di methylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in
200 ml Dimethylformamid löst.

  Man gibt 200 ml
Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat   zu.      Iässt    16 Stun den bei   30'    stehen. fällt mit Diäthyläther, wäscht den
Niederschlag mit   DiäthylätheriMethanol    (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu
Ser-NHNH2, Smp. 224 ,   [&alpha;]20D    = -13  in Dimethyl formamid.

 

   Teilsequenz F tert. -Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucin (BOC-Cys-Scr-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH)
Man löst 18.4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser amid, kühlt auf -20, gibt 40 ml ciner 2n-Lösung von
Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.- Butylnitrit zu
Nach 10 Minuten bei-20  gibt man noch 28 ml Tri  äthylamin und 16.2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OK  (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 25
Danach wird fütriert. die Lösung eingedampft und de
Rückstand mit la Essigsäure durchgewaschen. Ma erhält BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)   Val-Leu-OH, Smp. 217 ,   [&alpha;] 20D    -17  in Dimethylformamid.



   Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung, wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit In Essigsäure und Aceton durch.



  Nach Trocknen erhält man
EMI7.1     


<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser 
EMI7.2     


<tb> Thr-Cys-Val-Leu-OH,
<tb>  Smp. 248  (Zers.),   [&alpha;]20D   = -41  in Dimethylformamid/Wasser (3 :1).



   Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren in Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und Iyophilisiert.
EMI7.3     


<tb>



  Man <SEP> erhält <SEP>    BOC    <SEP> - <SEP> Cys <SEP> - <SEP> Ser <SEP> - <SEP> Asn <SEP> - <SEP> Leu-Ser-Thr-C <SEP> ys-Val  Leu-OH; Smp. 2380 (Zers.),   [&alpha;]20D    = -18  in Dimethylformamid/Wasser (3:1).



   Teilsequenz ABC
L-Histidyl-L-Arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl glycly-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl    L-prolinamid    Triacetat  (H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid.Hydrochlorid  (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2.HCl)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12   g    H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro- NH2 (Teilsequenz A) und 2,1 g N-Hydroxysuccinimid in 50   ml      Dimethylformamid    und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 00, gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt 16 Stunden bei 0  stehen.

  Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyläther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält   BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-    Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 121  (Zers.),   [&alpha;20D =    -47  in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst.



  Man rührt während   7    Stunden bei   25 ,    dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyl äther. Man erhält H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NH. HCl [Smp. 130  (Zers.),   [&alpha;]20D    = -48  in Dimethylformamid].



  b) L-Histidyl-L-arginyl.L-phenylalanyl-L-seryl glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phcnylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid Triacetat  (H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3 (CH2COOH)
Man löst   9,9      g      Trt-His(Trt)-Ar-Phc-NHNI-I    (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20, gibt 15   ml    Dioxan/HCl 2n und anschliessend    I.16      ml    tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 20  gibt   28      ml    Triäthylamin und 10.0 g H-Ser-Gly-Met-Gly- Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.HCl zu, rührt 4 Stunden bei   0 ,    filtriert und dampft zur Trockne cin.

  Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/ Methanol   (8 : 2)    auf. wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur   Ncutralität,    trocknet über Natriumsulfat. konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält
Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 [Smp. 168  (Zers.),   [&alpha;]    20D = -43  in Dimethylformamid], das man in 500 ml   EssigsäurejWasser      (8 : 2)    löst.

  Man erwärmt während 20 Minuten bei   90 ,    dampft    In,    wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über   KOH-Spänen.    Man erhält
H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3 CH3COOH, Smp. 180  (Zers.),   [&alpha;]20D    = -66  in Essigsäure.



   Teilsequenz DE
N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-e-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl
L   -asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl       L-nsparaglllyl-L-tyrosinhydrazid     (Tre-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-NHNH2) a) N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-a-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl    L-asparaginyl-L-tyrosylmethylester     (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-OMe)
Man löst 4,3 g   Trt-Ser-A!a-Tyr-Trp-NTINHa      in    50   ml    Dimethylformamid.

   darin bei -20 C 8,2 ml einer   2,3n-Chlorwasserstofflösung    in Dioxan.   Anschlie-    ssend tropft man bei   -20     1,3 ml tert-Eutylnitrit/   Dioxan-(l :1)-Lösung    zu,   tugt    zuerst 3,5 ml Triäthyl- anlin und dann 4,5 g   H-LysiBOC) -Asn-leu-Asn-Asn-    Tyr-ONle in 200 ml Dimethylformamid zu. Es wird 3   Stunden    bei Raumtemperatur   gerülirt    und   anschlie-    ssend filtriert. Das Filtrat wird eingedampft und der   Rückstand    mit Essigester pulverisiert. Nach Filtration und Waschen mit Essigester und Wasser erhält man
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-OMe, Smp. 240  (Zers.),   [&alpha;]20D    = -2  in Dimethylformamid.



  b) N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto    phanyl-e-tert.-butyloxycarbonyl-l-lysyl   
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl    L-asparaginyl-L-tyrosinhydrazid     (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-NHNH2)
Man löst 6 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-LysiBOC)-Asn Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in 60 ml Dimethylformamid.

 

  gibt 6 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen.   Anschliessend    dampft man die Lösung ab und   verreibt    den Rückstand mit Wasser, wäscht mit Wasser und Äther nach. Man erhält    Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp- Lys <  B OC)-Asn-Leu-
Nsn-Asn-Tyr-NHNH.', Samp.244 , [&alpha;

  ;]20D = -9  in Dimethyiformamid   
Teitsequenz ABCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tyrptophanyl    . -tert.-hutyloxycarbony l-L -lysyI-L-asparazinyl-   
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-tyrosyl
L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl  glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid.Diacetat  (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.2AcOH) a) Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly
Phe-G   ly-Pro-Glu-Thr-Pro      -NH..   



   Man löst   I 05      ,Y    Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)- Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-NHNH2 in 200 ml Dimethyl   formamid,    kühlt auf   -20    ab und setzt eine Salzsäure- lösung in Dioxan zu.   AnschlieBend    tropft man 1 ml tert.-Butylnitrit zu und vercinigt mit einer Lösung, dic 10,5 g
H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly    Pro-Glu-Thr-pro-NH2    und 15 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid   enthält.    Nach   '2    Stunden wird die   Lösung    mit ether   gefällt,    mit Chloroform und Wasser nachgewaschen.



  Man erhält
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly
Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, Smp. 242 ,   [&alpha;]20D =    -43  in Dimethylformamid.



  b) H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.2AcOH
Man löst 15 g
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met
Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 in 500   m!    80 % iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei   40     stehen.   Nacil    Eindampfen und Behandeln mit ether erhält man
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met
Glv-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.2AcOH.



  Smp. 238 ,   [&alpha;]20D    = -23  in Essigsäure.



      Beispiel 1    tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl
L'hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl
L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-a-tert. butyloxycarbenyl-L-lysyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl
L-tyrosyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenyl alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl    L-prolinamid zu Acetat L-prolinamid. Acetat. Trihydrat Trihydrat   
EMI8.1     

  <SEP> I
<tb> (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu 
Ser-Ala-Tyr-Trp-Lyt(BOC)-Asn-Leu-Asn
Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Giy-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. Acetat.

  Trihydrat)
Man löst 1.0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1.5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dievelohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 25, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und   Diäthvlcither    und   trocknet.    Man erhält BOC-Cys-Scr
EMI8.2     


<tb> Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-O-Su. <SEP> Smp. <SEP>    ^49',    <SEP> das
<tb>  man in 10 ml   DimethviFormamid    löst. Zu dieser Lösung gibt man 3.1 g   Tricosapcptid-Diacetat    (Teilsequenz ASCDE)   und    1,2 g   N-Hydroxysuccinimid    und rührt 16 Stunden bei 25 . Man dampft zur Trockne ein, wäscht dcn Rückstand mit Diäthyläther,   Chloroform    und Aceton.

  So erhält man das rohe, geschützte Dotria   contapeptid,    das man in 50 ml eines Gemisches von ChlorformMethanol/Wasser   (70 :30: 5)    löst: Man schichtet die erhaltene Lösung auf eine Kieselgelsäule (5   @    100 cm). die mit dem obengenannten Gemisch   äeIuilibriert    wurde.   ESie    Elution wird mit einer steigenden Konzentration von Methanol durchgeführt.

  Die vereinigten Fraktionen. die das reine Peptid enthaiten, werden abgedampft, anschliessend mit Diäthyläther gewaschen   und    über Kaliumhydroxid im Hochvakuum   getrocknet.    Man erhält
EMI8.3     


<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu 
Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met
NH2.CH1CO2H.3H2O, Smp. 240  (Zers.),   [&alpha;]20D    = -40  in Essigsäure 1n/ Methanol (2 : 1).



   Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydolyse (6n. 16 Std.) : Ala1,1, Arg1.0, Asn3.0, $Cys/21.6, Glu1.2, Gly3.0, His1.1, Leu2.0, Lys1.0, Met1,0, Phe2.0, Pro2.1, Ser3.8, Thr1.0, Tyr1.9, Val0.9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).



   Beispiel 2
L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl
L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-tyrosyl
L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid. Hexaacetat.Decahydrat
EMI8.4     


<tb> (H-Cvs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cvs-Val-Leu  Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Len-Asn-Asn-Tyr His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2. Hexaacetat. Decahydrat) Man löst 3.3 2
EMI8.5     


<tb>  <SEP> I
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Lou-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> 
Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu
Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly
Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. Acetat.

  Trihydrat unter stickstoffatmpsphäre in 100 ml Trifluoressigsäure,   Iä.St      15    Minuten bei   90¯    stehen und dampft zur Trockne ein. Man   ltist    in   31)0    ml 0,2n   lEssiasäure.    behandelt mit   70    ml Amberlit-IRA-410   (Acetat),      Iyophilisicrt.    wäscht mit Diäthvläther und   troclvncx    über   Kaliumhvdroxid      im      Hochvaku¯nI.      ;Man    erhält
H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ma-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asu-Asn
Tyr-Mis-arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. 6 CH2CO2H.

 

   10   H2O@    Smp. 220 (Zers.),   [&alpha;]20D    -42 in in Essigsäure.



     A    miposäurezusa m   mensctzun (      nach      S; iure      hvd    rolysa cou. 10 sod.),   A@a1.1,    Aig1.1, Asn3.9,   Oys@z;6.    Cou1.2, Gly3.0, HIs1.1, Lys1.1, Lcu2.9, Met1.0, Phe2.0, Pro2.1, Ser5.1 Thr1.2, Tyr2.0, Val0.9 (Trp 1.0 durch Spektrophotometrie).

Claims

PATENTANSPRÜCHE

r. Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids der Formel EMI9.1 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser 21 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-asn-Tyr-His-Arg 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Gl u-Thr-Pro NH2 und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden,

zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Aminosäureteilsequenz 1 bis 7 und vor- Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert, die Carbox,,yl- gruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls anschliessend die Säuren additionssalze herstellt, indem man das Polypeptid der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

11. Verwendung des nach Patentanspruch I hergestellten Polypeptids der Formel EMI9.2 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2 zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet. dass man das Polypeptid der obigen Formel durch Umsetzung mit Schwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptids nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aus EMI9.3 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser <tb> BOC 11 12 13 1 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg- 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2 die Schutzgruppen abspaltet.

2. Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptids nach Patentanspruch r, dadurch gekennzeichnet, dass man EMI9.4 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH <tb> 10 11 12 13 nach vorheriger Aktivierung mit H-Ser-Ala-Tyr-Trp- BOC 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Lys - Asn - Leu -Asu-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly- 25 26 27 28 29 30 31 32 Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 kondensiert und aus der so erhaltenen Verbindung der Formel EMI9.5 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32 <tb> EMI9.6 22 23 24 22 26 27 28 29 30 31 32 Phe - Ser - Gly - Met -

Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro- NH2 die Schutzgruppen abspaltet.