CH515216A - Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptide - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptide
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von bisher unbekannten Polypeptiden bzw.



  Polypeptidderivaten der allgemeinen Formel (3 -Thio-2-X-propionyl)   -L-seryl-L-asparaginyl-L4eucyl      L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl- glycyl-L-lysyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-    L-glutamyl-L-leucyl-L-histidyl-L-lysyl-L-leucyl   L-glutaminyl-L-threonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-arginyl-    L-threonyl-L-asp araginyl-L-threonyl-glycyl-L-serylglycyl-L-threonyl-Y, worin X die Bedeutung -H,   -NH3,    R-CO-NH- (R= Alkyl, gegebenenfalls subst. Aralkyl, gegebenenfalls subst. Aryl) oder R'-O-CO-NH- (R' = Alkyl, Alkenyl, gegebenenfalls subst. Aralkyl, gegebenenfalls subst.



  Aryl, wobei der Rest R' nicht durch Trifluoressigsäure abspaltbar ist) und Y die Bedeutung L-Prolinamid oder L-Prolin-L-valinamid besitzt und in der die einzelnen Aminosäuren der obigen Sequenz durch andere, natürliche a-Aminosäuren oder deren Homologe ausgetauscht sein können, sofern die biologische Wirkung erhalten bleibt, ihren therapeutisch wirksamen Säureadditionssalzen und Schwermetallkomplexen.



   Hat   X - Jie Bedeutung      -NHv,    R-CO-NH- (R = Alkyl, gegebenenfalls subst. Aralkyl, gegebenenfalls subst. Aryl), oder R'-O-CO-NH- (R' = Alkyl, Alkenyl, gegebenenfalls subst. Aralkyl, gegebenenfalls subst.



  Aryl), so liegt die Aminosäure   (HS-CH-CHX-COOH)    in der L-Form vor.



   Beispielsweise kann R die Methyl-,   Athyl-,    Propyl-, tert.-Butylgruppe oder aber einen gegebenenfalls durch ein   Halogenatom,    eine niedere Alkoxy- oder die Nitrogruppe substituierten Phenyl- oder Benzylrest bedeuten.



   Beispielsweise kann R' die Propyl-, Allyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Chlorbenzyl-, p-Brombenzylgruppe, den p-Phenylazobenzyl- oder den p-(p'-Methoxy-phenylazobenzyl)rest bedeuten.



   In den Peptidsequenzen der obigen allgemeinen Formel können einzelne Aminosäuren durch andere, natürliche Aminosäuren oder deren Homologe ausgetauscht sein, sofern dadurch die biologische Wirkung im wesentlichen erhalten bleibt.



   Zum Beispiel kann in Stellung 2, 5, 13 und 29 L Seryl gegen L-Threonyl oder L-Alanyl, in Stellung 3 und 26 L-Asparaginyl gegen L-Aspartyl, L-Glutaminyl oder L-Glutamyl, in Stellung 6, 21, 25, 27 und 31 L-Threonyl gegen L-Seryl oder L-Alanyl, in Stellung 11 und 18 L-Lysyl gegen BOC-L-Lysyl, L-Ornithyl oder L-Arginyl, in Stellung 14 und 20 L-Glutaminyl gegen L-Glutamyl, L-Asparaginyl oder L-Aspartyl, in Stellung 15 L-Glutamyl gegen OTB-Glutamyl, L-Glutaminyl, L-Asparaginyl oder L-Aspartyl, in Stellung 19 L-Leucyl gegen L-Tyrosyl, in Stellung 22 L-Tyrosyl gegen L-Phenylalanyl und in Stellung 24 L-Arginyl gegen L-Ornithyl oder L-Lysyl ersetzt werden.



   Die bisher unbekannten Polypeptide bzw. Polypeptidderivate der allgemeinen Formel können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, indem man die zu ihrem Aufbau nötigen Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese unter Beibehaltung einer gegebenen falls in Stellung 1 vorhandenen R'-O-CO-Gruppe, worin R' obige Bedeutung hat, die Schutzgruppen abspaltet, die Mercaptogruppe nach Bildung der Sequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des endständigen Prolyl- bzw. Valylrestes in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls anschliessend die Säureadditionssalze herstellt, indem man die Polypeptide bzw.

  Polypeptidderivate der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.



  Die Einführung einer gegebenenfalls am Endprodukt am endständigen L-Hemicystin-Molekül gewünschten Schutzgruppe kann in einer beliebigen Stufe vor der letzten Stufe erfolgen. Die Umwandlung einer geschütz  ten Aminogruppe in eine freie Gruppe am L-Hemicystin-Molekül zur Erlangung einer am endständigen L-Hemicystin-Molekül nicht geschützten Verbindung erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.



   In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise durch Verwendung der Azide oder der aktivierten Ester, wobei die Aktivierung vorzugsweise mit N-Hydroxysuccinimid vorgenommen wird.



   Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz B wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyl   oxycarbonyl)-3,4,5,6-tetrachlorobenzoylgruppe    verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.



   Beim Aufbau der bisher unbekannten Polypeptide bzw. Polypeptidderivate hat sich für die Blockierung der y-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz D, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die   iSXthoxy-,    die tert. Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.



   Für die Blockierung der W-Aminogruppe des Lysinrestes, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C, kann eine Carbo-tert.-alkoxygruppe, vorzugsweise die Carbo-tert.-butoxygruppe verwendet werden.



   Als Mercaptoschutzgruppe in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen Es und E7 verwendet man vorzugsweise die Benzyl- oder Tritylgruppe.   tJblicher-    weise werden die zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzyl- bzw. Tritylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen sowie die Herstellung der S-S-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.



   Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptide bzw. Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.



   Die neuen Polypeptide bzw. Polypeptidderivate lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren. wie Essigsäure. Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure. Malonsäure, Bernsteinsäure. Maleinsäure, Fumarsäure. Weinsäure. Zitronensäure. Benzoesäure. Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure. Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure,   lIydroxyäthansul-    fonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure. Naphthalinsulfonsäure. Sulfanilsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure. Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren. wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure. Salpetersäure, Thiocyansäure. Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Die Polypeptide bzw.

  Polypeptidderivate der obigen Formel können durch Umsetzung mit Schwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt werden. Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige von   Zinks36    in Frage.



   Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Sie senken den Calciumplasmaspiegel und bewirken als Antagonisten des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die biologische Wirkung der neuen Verbindungen wurde an Ratten geprüft, wobei sich aufgrund der Senkung des Blut-Calciums ein Wert von 3000-5000 MRC-Einheiten/mg Peptid ergab.



   Die zu verabreichende Dosis hängt von der gewünschten Wirkung sowie von der Applikationsart ab.



  Im allgemeinen werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergewicht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grössere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal oder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger.



   Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des   Knochenstoffwechsels    erwünscht ist, z. B.



  Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie sind ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch,   posttraumatisch,    bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis und renal bedingte Osteodystrophie sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.



  Phosphat.



   Ein Vorteil der erfindungsgemässen Polypeptide bzw. Polypeptidderivate der allgemeinen Formel, worin X für R-CO-NH- (R   =    Alkyl, gegebenenfalls subst. Aralkyl, gegebenenfalls subst. Aryl) oder R'-O-CO-NH- (R' = Alkyl,   Alkyl,    gegebenenfalls subst. Aralkyl, gegebenenfalls subst. Aryl) steht, ist ihre Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen.

 

   Die neuen Verbindungen können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Die neuen Verbindungen können auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.



   Die neuen Verbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.



   Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl)
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester  
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt =   Äthoxy   
NO2 = Nitro    Ser    = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Tyr = L-Tyrosyl Arg = L-Arginyl Gln =   L-Glutaminyl    Glu =   Glutamyl    His = L-Histidyl Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Lys = L-Lysyl
Cys = L-Cysteinyl
Piv = Pivaloyl
MCP = ss-Mercaptopropionyl
OSu = N-Oxysuccinirnid
EOC =   Äthoxycarbonyl   
DCHA = Dicyclohexylamin
In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen,

   erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt 1.



   Die nachstehenden Tabellen beziehen sich auf die Synthese der folgenden Verbindungen:
Tabelle Verbindung
1 L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-
L-valyl-L-leucyl-glycyl-L-lysyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-L-glutamyl-    L-leucyl-L-histidyl-L-lySyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-threonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-   
L-arginyl-L-threonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-glycyl-L-seryl-glycyl-L-threonyl-
L-prolinamid
2 Pivaloyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-glycyl-L-lysyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-
L-glutamyl-L-leucyl-L-histidyl-L-lysyl-Leucyl-L-glutaminyl-L-threonyl-   
L-tyrosyl-L-prolyl-L-arginyl-L-threonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-glycyl-L-seryl- glycyl-L-threonyl-L-prolinamid   
3 

   Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-glycyl-L-lysyl-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-
L-glutamyl-L-leucyl-histidyl-L-lysyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-threonyl-L- tyrosyl
L-prolyl-L-arginyl-L-threonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-glycyl-L-seryl-glycyl-
L-threonyl-L-prolinamid
4 ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-glycyl-L-lysyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-
L-glutamyl-L-leucyl-L-histidyl-L-lysyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-threonyl-
L-tyrosyl-L-prolyl-L-arginyl-L-threonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-glycyl-    L-seryl-glycyl-L-threonyl-L-prolinamid   
5 L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-  <RTI  

    ID=3.9> 
L-valyl-L-leucyl-glycyl-L-lySyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-
L-leucyl-L-histidyl-L-lysyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-threonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-   
L-arginyl-L-threonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-glycyl-L-seryl-glycyl-L-threonyl-
L-prolinamid
6 L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-
L-valyl-Leucyl-glycyl-L-lysyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-    L-leucyl-Dhistidyl-L-lySyl-L-tyrosyl-L-glutaminyl-L-threonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-   
L-arginyl-L-threonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-glycyl-L-seryl-glycyl-L-threonyl-
L-prolinamid 7 L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-
L-valyl-L-leucyl-glycyl-L-lysyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-L-glutamyl-    L-leucyl-L-histidyl-L-lysyl-L-tyrosyl-L-glutaminyl-L-threonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-   

   
L-arginyl-L-threonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-glycyl-L-seryl-glycyl-L-threonyl-
L-prolinamid 8 Tabelle 8 enthält die allgemeine Formel der beanspruchten Verbindungen.  



   Teilsequenz A    L-Seryl-glycyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-S er-Gly-Thr-Pro-NH2)    a) L-Threonyl-L-prolinamid . hydrochlorid    (H-Thr-Pro-NH2.    HCl)
Man löst   bei 5    134 g   Z-Thr-NH-NH.    in 2 1   1n    Salzsäure und versetzt mit 0,55 1   1n    Natriumnitrit.



  Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g   H-Pro-NH2 - hydro-    chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kalciumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab.



  Man erhält   Z-Thr-Pro-NH-,;    Smp.   1480,      [a] D =-72     in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g   Z-Thr-Pro-NH,    in 2 1 Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den kristallinen Rückstand mit   Athylacetat    und erhält    H-Thr-Pro-NH3    - HCl; Smp.   2160,      [aJ      D0      -640    in 95   %    Essigsäure.



  b)   N-B enzyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester     (Z-Ser-Gly-OEt)
Man löst 14,5 g Benzyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft.



  Man kristallisiert das erhaltene Z-Ser-Gly-OEt aus Essigester um. Smp. 1030, [a]   =+30    in Dimethylformamid.



  c)   N-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid       (Z-Ser-Gly-NHNH)   
Man löst 19,4 g Z-Ser-Gly-OEt in 270 ml   Athyl-    alkohol, gibt 27 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2   Taee    bei Raumtemperatur stehen. Man filtriert die   krist'iiine.Masse    ab,- wäscht mit Methanol und trocknet.



  Man erhält   Z-Ser-Gly-NHNH2,    Smp.   1800,      [a] D0 =      + 2     in Dimethylformamid.



  d)   N-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-threonyl-   
L-prolinamid   (ZSer-Gly-Thr-Pro-NH)   
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4n Chlorwasserstofflösung in   Äthyl äther    gegeben und darin 11 g   Z-Ser-Gly-NHNHo    gelöst. Hierauf tropft man bei   -10     5.4 ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung 18 ml Triäthylamin bei und filtriert anschlie ssend. Gleichzeitig löst man 12 g   H-Thr-Pro-NH.2      HCl    in 100 ml Dimethylformamid, gibt 6.2 ml Triäthylamin zu, filtriert vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid ab und fügt zu dem Filtrat die obenerhaltene Dipeptidazid-Lösung hinzu.

  Man lässt 2 Stunden bei   0    stehen, dampft zur Trockne ab löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Methanol und 100 ml Wasser und lässt die erhaltene Lösung durch eine 100 ml Dowex-50-Säule   (H + -Form).    Man dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Essigester. Man erhält   Z-Ser-Gly-Thr-Pro-NHn    vom Smp. 1320 (mit Zersetzung), [a]   2D0 = 220    in Dimethylformamid.



  e)   L-Seryl-glycyl-L-threonyl-L-prolinamid       (H-Ser-Gly-Thr-Pro-N-)   
Man löst 22 g   Z-Ser-Gly-Thr-Pro-NH-    in einem Gemisch von 440 ml Methanol und 88 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkohle. Danach wird filtriert, zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält H-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 vom Smp. 950 (mit Zersetzung), [a]   2,0 = -270    in Dimethylformamid.



   Teilsequenz B tert.-Butyloxycarbonyl-L-arginyl-L-threonyl    L-asparaginyl-L-threonyl-glycinhydrazid (BO C-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2)    a)   N-Benzyloxyzarbonyl-L-asparaginyl-L-threonyl-    glycinäthylester (Z-Asn-Thr-Gly-OEt)
Man löst 43 g Z-Thr-Gly-OEt in 500 ml Dimethylformamid und hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle. Man filtriert, gibt 60 g Z-Asn-OCP zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, konzentriert auf etwa 250 ml, gibt Essigester zu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat und dampft zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Essigester gewaschen und getrocknet.



  Man erhält Z-Asn-Thr-Gly-OEt. Smp.   2250,      [a] r)     =   -40    in Dimethylformamid.



  b) N-Benzyloxycarbonyl-L-threonyl-L-asparaginyl
L-threonyl-glycinäthylester  (Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt)
Man löst 29 g Z-Asn-Thr-Gly-OEt in 700 ml Dimethylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle, filtriert und versetzt das Filtrat mit   Z-Thr-N2,    das aus 30 g   Z-Thr-NHNHs    hergestellt wurde [siehe Teilsequenz A a)]. Nach 12 Stunden bei   0     dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Wasser,   Äther    und Äthanol. Man erhält
Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt, Smp.   2300,    [a]   D0    =   -80    in Dimethylformamid.



  c) tert.-Butyloxycarbonyl-nitro-L-arginyl-L-threonyl
L-asparaginyl-L-threonyl-glycinäthylester    (BOC-Arg(NO2)-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt)   
Man löst 22 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt in 700 ml Dimethylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle und filtriert. Man löst 23 g   BOC-Arg(NO.,)-OH    in 500 ml Dimethylacetamid, gibt   12    ml Triäthylamin zu, kühlt auf   -100,    gibt 9,4 ml Chlorameisensäureisobutylester hinzu, lässt 10 Minuten reagieren und gibt die obenerhaltene Tetrapeptidlösung zu. Nach 30 Minuten bei 250 fügt man 100 ml Wasser hinzu, behandelt die erhaltene Lösung mit Amberlit-IRA-410 (OH-Form) bis zur negativen Chlorreaktion, filtriert und dampft zur Trockne ab. Man wäscht den Rückstand mit Chloroform, Essigester und Äther und trocknet. 

  Man erhält   BOC-Arg(NOs)-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt.    Smp.   X      100,      [a]      2r)      =-4    in Dimethylformamid.