CH642680A5

CH642680A5 - DNA transfer vector, process for its preparation and its use

Info

Publication number: CH642680A5
Application number: CH581078A
Authority: CH
Inventors: William J Rutter; Howard Michael Goodman; John Mitchell Chirgwin; Axel Ullrich; Raymond Louis Pictet; Peter Horst Seeburg; John Shine
Original assignee: Univ California
Priority date: 1977-05-27
Filing date: 1978-05-26
Publication date: 1984-04-30
Also published as: IL54790A0; IL54790A; LU79714A1; AR225404A1; AU521903B2; PL207176A1; IT7823930A0; NZ187300A; SE8305327L; FI781675A7; FR2392033A1; SE8305329D0; SE455794B; JPH0659218B2; SE8305329L; PL140200B1; DE2858357C2; SE7806086L; GB1565190A; FR2392033B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen DNS-Transfer-Vektor, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält. Diese neuen DNS-Transfer-Vektoren können beispielsweise eine Nucleotidsequenz aufweisen, welche den genetischen Code für ein spezifisches Protein, beispielsweise Insulin oder Wachstumshormon enthält.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen DNS-Trans-fer-Vektors und dessen Verwendung zur Herstellung von genetisch veränderten Mikroorganismen.

Bei der Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz enthält, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein aufweist, wird zunächst diese spezifische Nucleotidsequenz isoliert und es erfolgt dann die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz. Wenn man den erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektor in einen Mikroorganismus als Wirt transferiert, dann erfolgt in diesem die Replikation der DNS.

Es werden in der Folge insbesondere Arbeitsverfahren zur Isolierung von Insulin-Gen und Wachstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikro-biellen Wirt und ihre anschliessende Charakterisierung behandelt.

Ein bevorzugter erfindungsgemässer DNS-Transfer-Vektor ist ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist. Diese Plasmide können verwendet werden, um genetisch modifizierte Mikroorganismen herzustellen, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung die spezifische Nucleotidsequenz aus dem höheren Organismus enthalten. Bevorzugte Mikroorganismen zu deren Modifizierung die erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektoren eingesetzt werden, sind Bakterien.

In der vorliegenden Beschreibung werden die folgenden Symbole und Abkürzungen verwendet.

DNS = Desoxyribonukleinsäure RNS = Ribonukleinsäure cDNS = komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz)

mRNS = messenger-RNS

tRNS = transfer-RNS

dATP = Deoxyadenosintriphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = Deoxycytidintriphosphat

A = Adenin

T = Thymin

G = Guanin

C = Cytosin

Tris = 2-Amino-2-hydroxy-ethyl-l,3-propandiol EDTA = Ethylendiamin-tetraessigsäure ATP = Adenosintriphosphat TTP = Thymidintriphosphat

Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information. Es ist bekannt, dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt. Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt. Schliesslich dient die Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.

Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist.

Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder mehrerer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Trilett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.

Genetischer Code

Phenylalanin (Phe) « Leucin (Leu) Isoleucin (Ile) Methionin (Met) Valin (Val)

Serin (Ser) so Prolin (Pro) Threonin (Thr) Alanin (Ala) Tyrosin (Tyr) Terminationssignal 55 Terminationssignal

TTK

XTY

ATM

ATG

GTL

ORS

CCL

ACL

GCL

TAK

TAJ

TGA

Histidin (His) CAK

Glutamin (Gin) CAJ Asparagin (Asn) AAK Lysin (Lys) AAJ

Asparaginsäure (Asp) GAK Glutaminsäure (Glu) CAJ Cystein (Cys) TGK

Tryptophan (Try) TGG Arginin (Arg) WGZ

Glyin (Gly) GGL

Schlüssel: Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Tri-nucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder 60 Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden:

A = Adenin G = Guanin C = Cytosin 65 T = Thymin X = T oder C, falls Y = A oder G X = C, falls Y = CoderT Y = A, G, C oder T, falls X = C

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Y = A oder G, falls X = T W = C oder A, falls Z = A oder G W = C, falls Z = C oder T Z = A, G, C oder T, falls W = C Z = A oder G, falls W = A QR = TC, falls S = A, G, C oder T QR = AG, falls S = T oder C S = A, G, C oder T, falls QR = TC S = T oder C, falls QR = AG J = A oder G K = T oder C L = A, T, C oder G M = A, C oder T

Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription. In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose anstelle der Desoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als mes-senger-RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle.

In der Zelle dient die mRNS als Matrize in einem komplexen Vorgang, an dem zahlreiche Enzyme und Organellen innerhalb der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer Aminosäuresequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.

Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung des Insulins.

Der direkte Vorläufer des Insulins ist ein Polypeptid, das Proinsulin, das die beiden Insulinketten A und B über ein weiteres Peptid C gebunden enthält, vergleiche Steiner, D.F. Cunningham, D., Spigelman, L. und Aten, B., Science 157, 697 (1967). Kürzlich wurde berichtet, dass das erste Translationsprodukt von Insulin-mRNS nicht Proinsulin selbst, sondern ein Pre-proinsulin ist, das mehr als 20 weitere Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins enthält, vergleiche Cahn, S.J. Keim, P. und Steiner, D.F., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73,1964 (1976), und Lomedico, P.T. und Saunders, G.F. Nucl. Acids Res. 3,381 (1976). Die Struktur des Pre-proinsul-inmoleküls kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden : NH2-(Pre-peptid)-B-Kette-(C-Peptid)-A-Kette-COOH.

Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in den Zellen höherer Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hierzu gehören zum Beispiel das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon, an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für technische, medizinische oder Forschungszwecke. Häufig ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organismus zu gewinnen, insbesondere bei Proteinen menschlichen Ursprungs. Es besteht daher ein Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen ausserhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden. In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhalten. Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig. Häufig ist es auch schwierig, einen gezüchteten Zellstamm mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften zu erhalten.

Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definierten Medien gezüchtet werden. Die Fermentationstechnologie ist bereits hochentwik-kelt und gut steuerbar. Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Ausserdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen.

Es wäre daher sehr erwünscht, den Transfer eines Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus, der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen. Auf diese Weise könnte das Protein unter gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten werden. Es ist auch möglich, dass die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten. Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz, die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genau bekannter genetischer Struktur eröffnet ausserdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit zu untersuchen, wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird. Ferner können isolierte Gene verändert werden, so dass sie Proteinvarianten mit anderen therapeutischen oder funktionellen Eigenschaften codieren.

Überraschenderweise zeigte es sich, dass die angestrebten Ziele durch einen DNs-Transfer-Vektor erreicht werden können, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält. Derartige DNS-Transfer-Vektoren können verwendet werden, um einen Mikroorganismus so zu modifizieren, dass er diese Sequenz enthält.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein DNS-Transfer-Vektor, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält, die durch Transkription an einem Gen eines höheren Organismus entstanden ist.

Bevorzugte erfindungsgemässe DNS-Transfer-Vektoren sind diejenigen, welche eine Nucleotidsequenz aufweisen, welche die A-Kette, bzw. die B-Kette des menschlichen Insulins codiert.

Andere bevorzugte erfindungsgemässe DNS-Transfer-Vektoren sind diejenigen, welche in ihrer Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus aufweisen, das Wachstumshormon codiert und zwar insbesondere eine solche Aminosäuresequenz, die menschliches Wachstumshormon codiert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektors, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) Zellen isoliert, welche mRNS enthalten, die das erwünschte Protein codieren b) die mRNS aus den Zellen extrahiert, wobei ein RNase-Inhibitor anwesend ist, der eine durch RNase hervorgerufene Zersetzung der mRNS verhindert, oder in Abwesenheit eines derartigen RNase-Inhibitors extrahiert c) eine mRNS isoliert, die im wesentlichen frei von Proteinen, DNS und anderen RNS ist,

d) eine doppelsträngige cDNS synthetisiert, in welcher eil Strang eine Nucleotidsequenz aufweist, die komplementär zu derjenigen der mRNS ist und man dabei eine cDNS herstellt, die eine Nucleotidsequenz aufweist, welche das erwünschte Protein codiert

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e) einen DNS-Transfer-Vektor zur Verfügung stellt, der geeignete reaktive Enden aufweist, die in der Lage sind, miteinander verbunden zu werden oder mit der doppelsträngigen DNS verbunden zu werden und f) den DNS-Transfer-Vektor mit der doppelsträngigen cDNS verbindet, welche eine Nucleotidsequenz aufweist, die das erwünschte Protein in einer durch eine DNS-Ligase katalysierten Reaktion codiert, wobei man einen DNS-Transfer-Vektor erhält, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz aufweist, die das erwünschte Protein codiert.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektors, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält, die durch Transkription an einen Gen des höheren Organismus entstanden ist, um einen Mikroorganismus so zu modifizieren, dass er diese Sequenz enthält.

In der Folge werden die bisherigen Kenntnisse über Enzym-katalysierte Reaktionen erläutert:

Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligo-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nicht-covalente Bindung des Oligodeoxynucleotid-Primers an das 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Deoxynucleotide, entsprechend der Basenpaarungsregel, an das 3'-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RNS und einen komplementären DNS-Einzelstrang. Die Reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarna-delförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H. und Leder, P., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 69,1408 (1972) und Efstratiadis, A., Kafatos, F.C. Maxam, A.F. und Maniatis, T. Cell. 7,279 (1976).

Restrictions-endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppelsträngiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Strangs gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt. Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Erkennungsstelle (Spaltstelle) der Restrictions-endonuclease bezeichnet. Restrictions-endonucleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nucleotidsequenz und die Erkennungsstellen wurden ermittelt. Einige Restrictions-endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch ein-strängige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplemen-tär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden. Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsi-ven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterologe DNS-Sequenzen mit anderen, ähnlich erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen; vergleiche Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem. 4,123 (1976). Die Erkennungsstellen sind relativ rar, jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restrictions-endo-nucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppelsträngiger Oligo-nucleotide mit den Sequenzen der Erkennungsstellen. Somit kann praktisch jedes DNS-Segment an ein anderes Segment gekoppelt werden, indem man einfach das entsprechende Restrictions-oligo-nucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restrictions-endonuclease unterwirft, wobei man die erforderlichen kohäsiven Enden erhält; vergleiche Heynecker, H.L. Shine, J. Goodman, H.M. Boyer, H.W. Rosenberg, J., Dickerson, R.E. Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. und Riggs, A.D., Nature 263,748 (1976), und Scheller. R.H. Dickerson, R.E. Boyer, H.W. Riggs, A.D. und Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

Sl-Endonuclease ist ein Enzym, das zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen einsträngiger DNS oder einsträngi-ger Zwischenstücke in sonst doppelsträngiger DNS befähigt ist; vergleiche Vogt, V.M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).

DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNS-Segmenten mit einem 5'-Phosphat bzw. einem 3'-Hydroxyl bewirkt, die zum Beispiel von zwei DNS-Fragmenten gebildet werden, die durch kohäsive Enden zusammengehalten werden. Die normale Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, ein-strängige Zwischenstücke in einem sonst doppelsträngigen DNS-Molekül zu verbinden. Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren, wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden covalent gebunden sind; vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H., und Khorana, H.G., Proc. Nati. Acad. Sei., USA 67, 1468 (1970).

Alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das Phosphatesterbindungen, einschliesslich der 5'-terminalen Phosphatgruppen in DNS hydrolysiert.

Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments in einen DNS-Vektor, zum Beispiel ein Plasmid. Als Plasmid bezeichnet man jede autonom DNS-replizierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann. Ein Plasmid ist mit den Chromosomen der Wirtszelle nicht genetisch verbunden. Plasmid-Desoxyribonu-kleinsäuren sind doppelsträngige Ringmoleküle, im allgemeinen mit Molekulargewichten von der Grössenordnung einiger Millionen, obgleich bei einigen das Molekulargewicht grösser als 108 ist. Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar. Die Plasmid-DNS lässt sich im allgemeinen von der DNS der Wirtszelle aufgrund des grossen Grössenunterschiedes abtrennen. Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit der Teilung der Wirtszelle replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der Wachstumsbedingungen vom Experimentator beeinflusst werden. Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstlichem Weg ein DNS-Segment in das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertes Plasmid mit vergrösserter Molekülgrösse entsteht, ohne dass seine Fähigkeit zur Replikation oder Expression beliebiger Gene des Plasmids wesentlich beeinträchtigt würde. Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur Übertragung eines DNS-Segments in eine neue Wirtszelle. Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektionsgründen brauchbar sein können, zum Beispiel Gene der Arzneimittelresistenz.

Zur Illustrierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Ratteninsulin-Gen im einzelnen beschrieben. Das Insulin wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der Sicht der Grundlagenforschung. Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von Insulin-Gen aus anderen Organismen, einschlieslich Menschen, übertragen werden.

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Insulin wurde 1922 zum ersten Mal isoliert. Bekanntlich wird dieses Hormon heute zur Behandlung von Diabetes verwendet. Zwar liefern die Schlachthäuser Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen als Insulinquelle, doch entwickelt sich eine Verknappung des Hormons, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Ausserdem entwickeln einige Diabetiker eine allergische Reaktion gegen Rinder- und Schweineinsulin. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in den weltweiten Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äusserst erwünscht. Die Herstellung von menschlichem Insulin in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht weden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur Einführung des Insulin-Gens in Bakterien vorlag. Die vorliegende Erfindung stellt eine derartige Technik bereit.

Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man zum Beispiel ein modifiziertes Insulin herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer insulinähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Insulins kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden. Ähnliche Betrachtungen gelten für den Fall der Wachtumshormone.

Die Befähigung zum Transfer des genetsichen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus wie zum Beispiel ein Bakterium, eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung derartiger Proteine. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder dem Ersatz solcher Proteine durch Proteine, welche von Mikroorganismen erzeugt wurden, die durch die Verwendung von erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektoren modifiziert wurden. Die so produzierten Proteine können dort eingesetzt werden, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde.

Ferner ist es möglich, eine Symbiose zwischen Mikroorganismen, die durch den erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektor modifiziert wurden und Menschen mit chronischen oder akuten Mangelkrankheiten aufzubauen. Zu diesem Zwecke können diese genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen.

Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen DNS-Vektors erfolgt also die Isolierung einer spezifischen, genetische Information enthaltende Nucleotidsequenz und die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz. Bei der Verwendung des erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektors wird dann dieser in einen Wirts-Mikroorganismus transferiert und so dieser Mikroorganismus in der erwünschten Weise modifiziert.

Das erfindungsgemässe Verfahren und die erfindungsgemässe Verwendung werden nun am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen näher erläutert, die in einem Mikroorganismus, und zwar in ein Bakterium transferiert werden.

Anhand dieser speziellen Beispiele wird die Herstellung von DNS-Transfer-Vektoren erläutert, die in ihrer Nucleotidsequenz eine Untersequenz des Gens für Ratten Pre-proinsu-lin, bzw. des Gens für Ratten-Wachstumshormon, bzw. des Gens für menschliches Wachstumshormon aufweisen.

Nach den hier erläuterten Arbeitsweisen kann davon ausgegangen werden, dass diese Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus, wie zum Beispiel eines Wirbeltiers, auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist. Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschliesslich zum Beispiel der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschliesslich Säugetiere, wobei zu letzteren Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören. Unter einem Mikroorganismus versteht man jeden mikroskopischen lebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und zum Beispiel aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliesslich Hefen, bestehen kann. Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivi-tät unterdrückt wird. Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von Reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegenwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Strangs erforderlichen vier Deoxynucleosid-triphösphate erfolgt. Das Produkt dieser ersten Reaktion mit Reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidse-quenz, die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit Reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-tri-phosphate inkubiert. Das resultierende Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet. Die resultierende doppelsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man an beiden Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungs- bzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-endonuclease behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.

Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-endonuclease wird mit diesem Enzym behandelt, um den Polynucleotidstrang zu spalten und selbstkomplementäre einsträngige Nucleotidsequenzen an den 5'-Enden zu erzeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet. Die wir vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenart von DNS-Ligase zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Bildung eines lebensfähigen, geschlossenen Rings aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird. Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht. Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal wie zum Beispiel Arzneimittel-Resistenz. Reine Bakterienstämme, die das rekombinierte Plasmid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend reisoliert. Auf diese Weise können grosse Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, woraus man die spezifische cDNS-Sequenz durch endonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren und die erfindungsgemässe Verwendung sind auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschliesslich dem Menschen, und deren Transfer in einen

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Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Wert und zur mikrobiologischen Synthese solcher Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde die Insulin codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert. Auf gleiche Weise wurde die für Ratten-Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz isoliert, transferiert und in Bakterien repliziert. Die Methode ist auf den Transfer einer aus menschlichem Zellmaterial isolierten Nucleotidsequenz, zum Beispiel für menschliches Insulin und Wachstumshormon oder andere Polypeptidhor-mone anwendbar.

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz das für den Transfer in einen Mikroorganismus verwendbar ist, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.

Die das erfindungsgemässe Verfahren ausmachenden Stufen können in drei allgemeine Kategorien unterteilt werden:

1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus

Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert: die DNs des zugrunde liegenden Organismus selbst, und eine RNS-Übersetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die USA vorgeschrieben, dass menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vergleiche US-Federal Register, Bd. 41, Nr. 131, 7.7.1967, S. 27902-27943. Jedes Verfahren mit tatsächlicher Brauchbarkeit zur Herstellung von menschlichem Protein, wie zum Beispiel das vorliegende Verfahren, arbeitet daher vorzugsweise mit der Isolierung der spezifischen mRNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert. Auf diese Weise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tatsache dass in hochdifferenzierten Organismen wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Funktion hauptsächlich in der Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegen. In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der Isolierung angewandte Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.

In den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig Verfahren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfasst daher zwei Hauptstufen: die Absonderung der Zellen vom Bindegewebe, und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen andern im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäss vorgesehenen Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar. So wird zum Beispiel die Isolierung von Langer-hans'schen Inseln aus Bauchspeicheldrüsen, die zur Isolierung von Insulin codierender mRNS geeignet sind, beschrieben.

Insulin produzierende Zellen können auch aus anderen Quellen stammen, zum Beispiel aus der Bauchspeicheldrüse von Kälberföten und aus gezüchteten Insel-Tumorzellen. Die Isolierung reiner Inselzellen ist in diesen Fällen wesentlich einfacher, insbesondere bei Verwendung reiner Zelikulturen. In diesen Fällen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der Inselzellen nicht erforderlich, doch bleibt das genannte Verfahren wegen seiner allgemeinen Anwendbarkeit von Vorteil.

Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann zum Beispiel die Behandlung mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz. Bei der Isolierung von Wachstumshormon-mRNS von Ratten wird durch Behandlung gezüchteter Hypophysenzellen mit Thyroidhormon und Glucocorticoiden der Anteil an Wachstumshormon-mRNS auf synergistische Weise beträchtlich erhöht.

2. Extraktion der mRNS

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS ist ein einsträngiges Polynucleotid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodie-sterbindung in der Sequenz würde daher das gesamte Molekül für den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbreitet, aktiv und aussergewöhnlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien. Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar. Die überraschende Wirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Inselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.

Beim Aufreissen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien RNS angewandt werden, setzt man erfindungsgemäss eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chaotropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein. Die gemeinsame Wirkung dieser Mittel wird am Beispiel ihrer Verwendung bei der Isolierung von praktisch unverletzter mRNS aus isolierten Langerhans'schen Inseln aus Ratten-Pankreas beschrieben.

Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wässrigen Medien und ihrer Verfügbarkeit. Geeignete chaotrope Kationen sind zum Beispiel das Guanidinium-, Carbamoylguanidinium-, Guanylguanidi-nium-, Lithiumion und dergleichen. Geeignete chaotrope Anionen sind zum Beispiel das Jodid, Perchlorat, Thio-cyanat-, Diiodsalicylation und dergleichen. Die Wirksamkeit von Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist zum Beispiel Lithium-diiodsalicylat ein stärkeres

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Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0,1 M, ausserdem ist es relativ teuer. Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt im Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und in wässrigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa 5-molaren Lösungen.

Thiolverbindungen wie das ß-Merkaptoethanol spalten bekanntlich intramolekulare Disulfidbindungen in Proteinen mittels einer Thiol-Disulfid-Austauschreaktion. Zahlreiche Thiolverbindungen sind in dieser Richtung wirksam, zum Beispiel ß-Merkaptoethanol, Dithiothreit, Cystein, Propanol-dimerkaptan und dergleichen. Eine wesentliche Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in grossem Überschuss über die intramolekularen Disulfide vorliegen muss, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. ß-Merkaptoethanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt.

Bei der Inhibierung der RNase während der RNS-Extrak-tion aus Zellen oder Geweben ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner Konzentration abhängig. Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration. Der Erfolg des erfindungsgemässen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion beruht vermutlich auf der raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmass der Denaturierung. Dies erklärt möglicherweise die Überlegenheit des Guanidiniumthion-cyanats gegenüber dem Hydrochlorid, trotz der Tatsache,

dass das Hydrochlorid als Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zur vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird. Andererseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von der Konzentration des Denaturierungsmittels in Bezug auf die Schwellenkonzentration, erhöht von der fünften zur zehnten Potenz; vergleiche Tanford, C.A. Adv. Prot. Chem. 23,121 (1968). Diese Beziehung ergibt qualitativ, dass ein nur schwach stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumhydrochlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein Vielfaches schneller denaturieren kann. Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denaturierung und mRNS-Konservierung während deren Extraktion aus den Zellen war zum Zeitpunkt der Erfindung offenbar noch nicht erkannt. Die obigen Erwägungen führen dahin, dass das bevorzugte Denaturierungsmittel ein solches wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt. Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiumdiiodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein stärkeres Denaturierungsmittel ist, da die Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubt. Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugung von Guanidiniumthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochlorid, da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsmittel ist.

Die Verwendung eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsmittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese Weise das RNase-Molekül vollständig entfaltet wird. Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturie-rungsprozesses, indem sie eine schnelle Renaturierung verhindert, die eintreten kann, falls die intramolekularen Disulfidbindungen intakt bleiben. Ferner wird jede, im mRNS-Prä-parat zurückbleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Denaturierungsmittel und Thiol. Disulfidbindungen spaltende Mittel mit Thiolgruppen sind bei jeder Konzentration in gewissem Ausmass wirksam, doch wird im allgemeinen ein grosser Überschuss an Thiolgruppen gegenüber den intramolekularen Disulfidbindungen bevorzugt, damit die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Disulfidspaltung abläuft. Andererseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelriechend und unangenehm bei hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so dass für die Praxis eine obere Konzentrationsgrenze entsteht. Beim ß-Merkaptoethanol erwiesen sich Konzentration im Bereich von 0,05 M bis 1,0 M als wirksam, und Konzentrationen von 0,2 M werden bei der Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Rattenpankreas als optimal betrachtet.

Der pH-Wert des Mediums während der mRNS-Extrak-tion aus den Zellen kann im Bereich von pH 5,0 bis 8,0 liegen.

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die RNS aus der Masse aus Zellprotein und DNS abgesondert. Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die sämtlich geeignet sind. Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Ethanol, bei dem die RNS selektiv ausfällt. Bevorzugt wird erfindungsgemäss die Ausfällstufe umgangen und das Homogenatis direkt auf eine 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die sich in einem Zentrifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf Zentrifugierung erfolgt; vergleiche die Beschreibung von Gli-sin, V., Crkvenjakov, R., und Byus, C., Biochemistry 13, 2633 (1974). Diese Methode wird bevorzugt, da sie stetig eine für RNase ungünstige Umgebung aufrecht erhält, so dass man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt.

Die obigen Verfahren führen zur Reinigung der gesamten RNS aus dem Zellhomogenisat. Nur ein Teil dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS. Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, dass in den Zellen höherer Organismen mRNS nach der Transcription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadenylsäure. Derartige mRNS mit daran gebudnenen Poly-A-Sequenzen kann selektiv isoliert werden durch Chromatographieren an Säulen mit Cellulose, an die Oligo-thymidylat gebunden ist, siehe Aviv, H. und Leder, P. loc. cit. Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind. Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig ihres Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher Weise ausgeführt werden.

Unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel bei der Verwendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, dass obige Stufe der RNase-Inhibierung nicht erforderlich ist. In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung der RNase-Aktivität ausreichen.

3. Bildung der cDNS

Fig. 1 ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufen des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion Reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werden könnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Strangs aufgrund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist. Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei man die mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosidtriphosphate als Vorläufer des DNS-Strangs einsetzt. Zweckmässig wird eines der Deo-xynucleosid-triphosphate in a-Stelhing mit 32P markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum Beispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu können; vergleiche Efstratiadis, A. et al., loc. cit. Wie aus der Zeichnung ersichtlich, erhält man als Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase eine doppelsträngige Haarnadelform mit nicht-covalenter Bin5

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dung zwischen dem RNS-Strang und dem DNS-Strang.

Das Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Zweckmässig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an «Sephadex G-100» (Hersteller Pharmacia Inc. Uppsala, Schweden) und Ausfällung mit Ethanol.

Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die RNS-Matrize entfernt werden. Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt. Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch pH-Einstellung leicht gesteuert werden kann.

Nach der alkalischen Hydrolyse und anschliessenden Neutralisierung kann die mit 32P markierte cDNS durch Ausfällung mit Ethanol konzentriert werden, falls dies erwünscht ist.

Die Synthese einer doppelsträngigen haarnadelförmigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, zum Beispiel mit DNS-Polymerase oder Reverser Transcriptase. Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschliesslich der Verwendung eines in a-Stel-lung mit 32P markierten Nucleosid-triphosphats. Die Reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, zum Beispiel aus Vogel-Myeloblastosisvirus (das Virus ist erhältlich von der Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es gemäss einem Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).

Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reaktionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmässig Phenolextraktion, Chromatographieren an «Sephatex G-100» und Ausfällung mit Ethanol zur Reinigung des DNS-Produkts und Befreiung von verunreinigendem Protein verwenden.

Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppelsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die Enden komplementärer Stränge verbindet, entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfügung, die eine spezifische hydrolytische Spaltung ein-strängiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die Sl-Nuclease aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart, Indiana, bezogen werden). Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Ethanol erfolgen wie vorstehend beschrieben. Die Verwendung von Reverser Transcriptase und Sl-Nuclease bei Synthesen doppelsträngiger cDNS-Übertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis, A. et al., loc. cit. beschrieben.

Gegebenenfalls kann man den Anteil an cDNS-Molekü-len mit stumpfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynu-cleosid-triphosphate. Die Kombination von Exonuclease-und Polymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender 3'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervorstehender 5'-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüpfungsreaktionen sichergestellt.

Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, dass geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-endonuclease aufweisen. Die Wahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgründe in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-endonuclease ausgewählt, und diese Wahl basiert wiederum auf der Wahl des DNS-Vektors, mit dem die cDNS zu rekombinieren ist. Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-endonuclease anspricht. Das Plasmid pMB-9 besitzt zum Beispiel eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind III. Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H.O. und Wilcox, K.W., J. Mol. Biol. 51, 379 (1970) gereinigt. Das Enzym Hae III aus Hemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middleton, J.H., Edgell, M.H. und Hutchinson III, C.A. J. Virol. 10,42 (1972) gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet.

Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppel-strangs. Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in Fig. 1 dargestellte Sequenz, vergleiche Heyneker, H.L., et al. und Scheller, R.H., et al., loc. cit. Verschiedene solcher synthetischen Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so dass man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endonucleasen ansprechen.

Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem Weg erfolgen. Das Verfahren der Wahl ist eine Reaktion, die als «Verknüpfung stumpfer Enden» bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet, A., et al., Biochemi-stry 12, 5045 (1973) gereinigt worden war. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc. cit. beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem grossen molaren Über-schuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind III-Erkennungssequenz an jedem Ende. Die Behandlung des Reaktionsproduks mit Hind III-Endonuclease führt zur Spaltung an der Erkennungsstelle und Bildung einsträngi-ger selbst-komplementärer 5'-Enden, siehe Fig. 1.

Verwendung von erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektoren zur Modifizierung von Mikroorganismen

Im Prinzip können eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS zur Neukombination mit den erfindungsgemässen DNS-Transfer-Vektoren verwendet werden, die nach dem oben erläuterten Verfahren hergestellt wurden. Die Grundvoraussetzungen für die Modifizierung von Mikroorganismenzellen bestehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Zelle des Mikroorganismus befähigt sein muss, seine Replikation in dieser Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdem eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health. Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Komitee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren-und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht. Geeignete Transfer-Vektoren, deren Verwendung heute genehmigt ist, sind verschiedene Derivate von Bakteriophagen X (vgl. zum Beispiel Blattner, F.R., Williams, B.G., Biechi, A.E., Denniston-Thompson, K, Faber, H.E., Furlong, L.A., Grunwald, DJ., Kiefer, D.O., Moore, D.D.,

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Schümm, J.W., Sheldon, E.L. und Smithies, O., Science 196, 161 [1977]) und Derivate des Plasmids col El (vgl. zum Beispiel Rodriguez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer, H.W. und Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on Mole-cular Mechanisms In The Control of Gene Expression, D.P. 5 Nierlich, W.J., Rutter, C.F., Fox. Eds. [Academic Press, NY, 1976] S. 471-477). Plasmide aus col El sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Grössenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter "> Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirtszelle zu veranlassen, dass 15 sie hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung. Zu den geeigneten Derivaten von col El gehören die Plasmide pMB-9, die das Gen für Tetracyclinresistenz tragen, 20 und pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 und pBR-322, die ausser dem Tetracyclinresistenzgen ein Gen für Ampicillinre-sistenz besitzen. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmässige Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da 25 Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col El verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresitenz-Gen eine Hind III-Erkennungs- 30 stelle besass.

Wie beim Plasmid, kann auch die Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde. Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X- 35 1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind; vergleiche Curtiss, III, R., Ann. Rev. Microbiol., 30, 507 (1976). E. coli RR-1 kann verwendet werden, wenn P3-Einrichtungen vorhanden 40 sind. Wie im Fall der Plasmide, sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, einschliesslich Protisten und anderer Bakterien, zum Beispiel Hefen.

Rekombinierte Plasmide werden erhalten, indem man mit Restriktions-Endonuclease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Frag-ment zirkulieren. Die anschliessend transformierten Zellen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss Stand der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt.

Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewandt. Hierbei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5'-terminaIen Phosphatgruppen von den mit der Endonu-clease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis 10+4 herab.

Das erfindungsgemässe Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die durch DNS-Ligase katalysierte Reaktion stattfindet zwischen einer 5'-Phospaht-DNS-Endgruppe und einer 3'-Hydroxyl-DNS-Endgruppe. Wird die terminale 5'-Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein. Ist doppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt:

Fall

Tabelle 1 ReaktionsteilLnehmer

Ligase-Produkt

II

III

-OH

H„0 P0-

5*

O?O3H2+ 2 3HO-

3'

-OH -OH

H,0-P-0-0H-

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■OH -OH

HOHO-

3» 5»

O-P-O

—O-P-0 ±2H2°

3' 5f

O-P-O

—OH HO

-+H2°

keine Reaktion

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In Tabelle 1 wird die doppelsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wiedergegeben, wobei die 5'- und 3'-Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen. Im Fall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden reaktionsfähigen Endgruppen vor, mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden. Im Fall II besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eine terminale 5'-Phosphatgruppe mit dem Ergebnis, dass eine einsträngige covalente Bindung erfolgt, während im andern Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nicht-covalent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden. Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5'-Phosphatgruppe, so dass keine Bindungsreaktion eintreten kann.

Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhütn ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5'-Phospahtgruppen anwenden, die die DNS nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse.

Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstituieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstituiert werden. Das Enzym DNS-Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. und Khorana, H.G., Proc. Nati., Sci USA 67,1468 (1970).

Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coli erhaltene Ligase verwenden, vergleiche Modrich, P. und Lehman, I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

Die Rekonstituierung der Originalsequenz aus durch Restriktions-Endonuclease erhaltenen Unterfragmente wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution in falscher Sequenz verhütet. Dies geschieht durch Behandlung des cDNS-Fragments homogener Länge der gewünschten Sequenz mit einem Mittel, das die 5'-termi-nalen Phosphatgruppen der cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phospaht-gruppe können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eine 5'-Phosphatgruppe besitzen.

Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsreaktion, nämlich die Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, das heisst hinten-an-vorn, statt vorn-an-hinten. Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisierung und Cyclisierung werden nicht verhindert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.

Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde' Ratteninsulin codierende cDNS isoliert und mit einem Plasmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur

Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zellen gewonnene neukombinierte Plasmid-DNS enthielt s ein inseriertes DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukombinationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurden mit Hind III- oder HSU I-Endonu-clease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz io wurde nach der Methode von Maxam, A.M. und Gilbert, W., Proc. Nati. Acad. Sei USA, 74, 560 (1977) ermittelt. Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte Codierungsreaktion für Ratten-Proinsulin I und 13 von 23 Aminosäuren der Prepep-15 tid-Sequenz. Eine Zusammenstellung der Nucleotidsequenz dieser Region wird nachstehend dargestellt.

Auf ähnliche Weise wurde Wachstumshormon von Ratten codierende cDNS isoliert, mit einem Plasmid rekombiniert und in E. coli transferiert. Nach ausgiebiger Replikation in E. 20 coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 nucleotiden Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorläuferpeptids und einen Teil der 5'-untranslatierten Region enthielten.

Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf 25 die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte, oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, 30 werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten. Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den 35 Transfer von Ratten-Insulingen in E. coli. In den Beispielen werden ferner rekombinierte Plasmide charakterisiert, die Teile von Ratten-Insulingen, Ratten-Wachstumshormongen, menschlichem Insulingen und menschlichem Wachstumshormongen enthalten, sowie die die genannten Gene enthalten-40 den neuen Mikroorganismen.

Beispiel 1

Zur Herstellung von gereinigten Ratten-Inselzellen wird die Bauchspeicheldrüse einer anästhetisierten Ratte mit 45 Hankscher Salzlösung infundiert durch rückläufige Infusion in den Pankreasgang. Die Hanksche Salzlösung ist eine bekannte und handelsübliche Standardlösung. Dann wird die Bauchspeicheldrüse entfernt, in Hankscher Lösung von 0°C zerkleinert und mit Kollagenase und Trypsin-Inhibitor ver-50 daut. Sämtliche Verfahren erfolgen bei 0 bis 4°C, falls nichts anderes angegeben. Die Bedingungen bei der Verdauung sind äusserst kritisch. Zwei zerkleinerte Bauchspeicheldrüsen in 8 ml Gesamtvolumen Hankscher Lösung werden in ein 30-ml-Glasrohr gefüllt. Alle Glasteile waren mit Silikon (Handelsbe-55 Zeichnung Siliclad, Hersteller Clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey) behandelt worden. Das Inkubationsgemisch enthielt 12 mg Kollagenase, ein aus Clostridium histolyticum erhaltenes Enzym (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Mandl, I., Mackeman, e« J.D. und Howes, E.L., J. Clin. Invest. 32,1323 (1943) - Typ CLS IV, Hersteller Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey) und 1 mg Sojabohnentrypsin-Inhibi-tor, Hersteller Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C während 25 Min. unter 65 Schütteln mit 90 Bewegungen pro Minute. Ständige Beobachtung war erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kollage-nase-Verdauung in optimalem Ausmass verlief. Bei zu kurzer Inkubation waren die Inselzellen unvollständig freigesetzt,

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bei zu langer Inkubation beginnt ihre Zersetzung. Nach der Inkubation wurde das Glasrohr 1 Min. bei 200 x G zentrifu-giert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Kuchen wurde mit Hankscher Lösung gewaschen, dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Nach dem letzten Zentri-fugieren wurde der Kuchen in 15 ml des Handelsprodukts Ficoll (Hersteller Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Schweden) mit der Dichte 1,085 suspendiert. Eine Schicht von 8 ml Ficoll der Dichte 1,080 wurde zugegeben und eine Schicht aus 5 ml Ficoll der Dichte 1,060, dann wurde das Glasrohr in einem schwingenden Becherrotor 5 Min. bei 500 x G und dann 5 Min. bei 2000 x G zentrifugiert. Die Aci-nar-Zellen blieben am Boden, die Inselzellen stiegen im Gradienten auf und bildeten eine Schicht zwischen den beiden Oberschichten. Die Inselzellschicht enthielt verunreinigende Ganglionzellen, Lymphknoten und Bindegewebe. Grosse Verunreinigungsfragmente wurden vom Schichtmaterial entfernt. Der Rest des Präparates wurde unter dem Mikroskop von Hand von sichtbaren Verunreinigungen mittels einer Mikropipette befreit. Das Zellpräparat wurde dann in Hankscher Lösung verdünnt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde äbdekantiert und der Zellkuchen wurde in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert.

Die von 200 Ratten zusammengefassten Inselzellen wurden in 4-molarer Guanidiniumthiocyanatlösung (Handelsbezeichnung Tridom, Hersteller: Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs) die 1-molar an ß-Merkaptoethanol und auf pH 5,0 gepuffert war, bei 4°C homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 mMol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, überschichtet und 18 Std. bei 37 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 15°C zentrifugiert. Dabei wandert die RNS zum Boden des Zentrifugierröhrchens.

Polyadenylierte RNS wurde durch Chromatographieren des RNS-Gesamtpräparates an OIigo(dT)-Zellulose nach dem Verfahren von Aviv, H., und Leder, P. loc. cit. isoliert.

Zur Transcription der gesamten polyadenylierten RNS aus den Langerhansschen Inseln von Ratten in cDNS wurde Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus (erhalten von Life Science Inc., St. Petersburg, Florida) verwendet. Die Reaktionen wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, mit 9 mM MgCk, 30 mM NaCl, 20 mM ß-Merkaptoethanol, 1 mM von jeweils 3 nicht-radioaktiven Deoxyribonucleosid-tri-phosphaten, 250 (iM des vierten, in a-Stellung mit 32P markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 50-200 Curie/Mol, 20 |ig/ml 01igo-dT12_i8 (Hersteller Collaborative Research, Waltham, Massachusetts), 100 ug/ml polyadenylierter RNS und 200 Einheiten/ml Reverser Transcriptase ausgeführt. Das Gemisch wurde 15 Min. bei 45 °C inkubiert. Nach Zusatz von EDTA-NA2 bis 25 mM wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, dann wurde die wässrige Phase an einer mit Sephadex G-100 gefüllten Säule von 0,3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe in 10 mM Tris-HCl, pH 9,0,100 mM NaCl, 2 mM EDTA chromatographiert. Die eluierte Nucleinsäure wurde nach Zusatz von Ammoniumacetat (pH 6,0 bis 0,25 M) mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifu-giert, der Kuchen wurde in 50 jil frisch zubereiteter 0,1-mola-rer Natriumhydroxidlösung gelöst und 20 Min. bei 70 °C inkubiert, um die RNS zu hydrolysieren. Das Gemisch wurde mit 1-molarer Natriumacetatlösung, pH 4,5, neutralisiert und das 32P-cDNS-Produkt wurde mit Ethanol ausgefällt und erneut in Wasser gelöst. Proben einsträngiger cDNS wurden auf nativem Polyacrylamid-Gel nach der Methode von Ding-man, C.W., und Peacock, A.C., Biochemistry 7,659 (1968) analysiert. Die Gele wurden getrocknet und die 32P-DNS wurde durch Autoradiographie unter Verwendung eines Kodak No-Screen NS-2T-Films (Hersteller: Eastman Kodak

Corp., Rochester, New York) ermittelt. Die cDNS war heterodispers, wie aus der Elektrophorese ersichtlich. Sie enthielt mindestens eine Haupt-cDNS von etwa 450 Nucleotiden (Vergleich mit bekannten Standards).

Beispiel 2

Die gemäss Beispiel 1 erhaltene einsträngige cDNS wurde mit Reverser Transcriptase behandelt, um den komplementären Strang herzustellen. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,3,9 mM MgCLî, 10 mM Dithiothreit, 50 mM von jeweils drei nicht-éiarkierten Deoxyribonucleosid-triphosphaten, 1 mM eines in a-Stellung mit 32P markierten Nucleosidtriphosphats mit der spezifischen Wirkung 1-10 Curie/Millimol, 50 fxg/ml cDNS und 220 Einheiten/ml Reverse Transcriptase. Das Reaktionsgemisch wurde 120 Min. bei 45 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA-Na2 bis 25 mM abgestoppt, dann wurde mit Phenol extrahiert, an Sephadex G-100 chromatographiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine Probe des Reaktionsprodukts von 500 bis 1000 cpm wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Es wurde eine heterodisperse Bande mit Zentrum um 450 Nucleotide Länge beobachtet, beim Vergleich mit Standardproben. Proben der DNS-Reaktionsprodukte der Beispiele 1 und 2 wurden gesondert mit überschüssiger Restriktions-Endonuclease Hae III behandelt und durch Gel-Elektrophorese analysiert. Beide Produkte wurden durch die Endonuclease gespalten, so dass zwei Banden der Radioaktivität bei der Gel-Elektrophorese beobachtet wurden. Die aus der Spaltung der doppelsträngigen cDNS resultierenden Banden repräsentierten Spaltungsprodukte von im wesentlichen gleicher Kettenlänge wie bei der Spaltung der einsträngigen cDNS.

Beispiel 3

Das doppelsträngige Reaktionsprodukt von Beispiel 2 wurde in einer Konzentration von 2-5 (ig/ml mit 30 Einheiten Sl-Nuclease mit einer Aktivität von 1200 Einheiten/ml (Hersteller: Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) in 0,03 M Natri-umacetat, pH 4,6,0,3 M Natriumchlorid, 4,5 mM ZnCh 30 Min. bei 22 °C inkubiert und weitere 15 Min. bei 10 °C. Mit dem Zusatz von Tris-base bis 0,1 M Endkonzentration, EDTA bis 25 mM und E. coli-tRNS (hergestellt nach der Methode von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, Herausg. S.P. Colowick und N.O. Kaplan, Bd. 12A, S. 588 [1967]) bis 40 (ig/ml wurde die Verdauung gestoppt. Nach der Extraktion des Reaktionsgemisch mit Phenol und Chromatographieren an Sephadex G-100 wurde die eluierte 32P-cDNS mit Ethanol ausgefällt. Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden, die zur Verknüpfung der stumpfen Enden an chemisch synthetisierte Decanucleotide erforderlich waren. Hind III-Decamere wurden nach dem Verfahren von Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. und Itakura, K. Science 196,177 (1977) hergestellt. Die Verknüpfung der Hind III-Decamere mit der cDNS erfolgte durch Inkubieren bei 14 °C in 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCh, 1 mM ATP, 10 mM Dithiothreit, mit 3 mM Hind III-Decamere mit 105 cpm/pMol und T4 DNS-Ligase, etwa 500 Einheiten/Milliliter, während 1 Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Min. auf 65 °C erwärmt, um die Ligase zu inaktivieren. Dann wurden KCl bis 50 mM Endkonzentration, ß-Merkaptoethanol bis 1 mM Endkonzentration und EDTA bis 0,1 mM Endkonzentration vor der Verdauung mit 150 Einheiten/ml zugegeben, die während 2 Std. bei 37 °C ausgeführt wurde. Hind III- und Hae III-Endonuclease sind handelsübliche Präparate, erhältlich bei New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts. Das Reaktionsprodukt wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Dabei wurde ein Peak

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

642 680

14

beobachtet, der einer Sequenz von etwa 450 Nucleotiden entsprach, ausserdem wurden Fragmente der abgespaltenen Hind III-Decamere beobachtet.

Beispiel 4

Plasmid pMB-9-DNS (Herstellung: S. Rodrigues, R.L., Boliver, F., Goodman, H.M., Boyer, H.W. und Betlach, M., ICN-UCLA Symposium on Molecular und Cellular Biology, D.P. Wierlich, W.J. Rutter und C.F. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976), S. 471-477) wurde an der Hind III-Erkennungsstelle mit Hsu I-Endonuclease gespalten, dann mit alkalischer Phosphatase (Typ BAPF, Worthington Bio-chemical Corp., Freehold, New Jersey) behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0,1 Ein-heit/Mikrogramm DNS vorhanden, das Reaktionsgemisch wurde in 25 mM Tris-HCl für pH 8 30 Min. bei 25 °C inkubiert, dann erfolgt Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde die mit Phosphatase behandelte Plasmid-DNS zu cDNS zugegeben, die zu Hind III kohäsive Enden besass, und zwar in einem Molverhältnis von 3 Mol Plasmid zu 1 Mol cDNS. Das Gemisch wurde in 66 mM Tris, pH 7,6,6,6 mM MgCh, 10 mM Dithiothreit und 1 mM ATP 1 Std. bei 14°C in Gegenwart von 50 Einheiten/ml T4 DNS-Ligase inkubiert.

Dann wurde das Reaktionsgemisch direkt zu einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen zugegeben, die wie folgt zur Transformation vorbereitet waren: die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von etwa 2 x 108 Zellen/ml in 50 ml Medium gezüchtet, das 10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 Natriumchlorid, 2 mM NaOH, 100 |ig/ml Diaminopi-melinsäure und 40 ug/ml Thymin enthielt und 37 °C zeigte. Die Zellen wurden durch fünfminütiges Zentrifugieren unter 5000 x G bei 5 °C gesammelt, in 20 ml kalter 10-millimolarer Natriumchloridlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in 20 ml Transformationspuffer suspendiert, der 75 mM CaCh, 140 mM NaCl und 10 mM Tris pH 7,5 enthielt, und 5 Min. in Eis stehengelassen. Dann wurden die Zellen zentrifugiert und erneut in 0,5 ml Transformationspuffer suspendiert. Die Transformation erfolgte durch Vermischen von 100 ni der Zellsuspension mit 50 ul rekombinierter DNS (1 ^ig/ml). Das Gemisch wurde 15 Min. bei 0°C inkubiert, dann 4 Min. bei 25 °C und 30 Min. bei 0°C behandelt. Sodann wurden die Zellen zum Wachstum unter ausgewählten Bedingungen auf Agar-Platten übertragen.

Das Aussuchen der rekombinierten Plasmide erfolgte mit

5 Mikrogramm/ml Tetracyclin bei Transformation mit dem Hind III-Produkt. Es wurde eine als pAU-1 bezeichnete Neukombination isoliert. Rohe Plasmid-Präparate mit 2-5 [ig DNS (isoliert aus pAU-1) wurden mit überschüssiger Hsu I-5 Endonuclease behandelt. Dann wurden 10 mM EDTA-Na2 und 10% (Gewicht/Volumen) Rohrzucker zugesetzt und das Gemisch wurde an 8% Polyacrylamid-Gel zerlegt. Die DNS wurde in einer Stellung entsprechend etwa 410 Basenpaare Länge gefunden. In einem ähnlichen Versuch wurde als ,u Transfer-Vektor das Plasmid pBR-322 verwendet. Sämtliche Bedingungen blieben wie beschrieben, lediglich die letzte Selektion der rekombinierten Klone erfolgte auf 20 (ig/ml Ampicillin enthaltenden Platten.

15 Beispiel 5

Nach der Eluierung aus dem Gel wurde DNS markiert durch Inkubation mit y-32P-ATP und dem Enzym Polynucleo-tidkinase unter den von Maxam und Gilbert loc. cit. beschriebenen Bedingungen. Das Enzym katalysiert die Übertragung 20 einer radioaktiven Phosphatgruppe von y-32P-ATP auf die 5'-Enden der DNS. Das Enzym war aus E. coli nach der Methode von Panet, A., et al, Biochemistry 12, 5045 (1973) erhalten worden. Die so markierte DNS wurde mit Hae III-Endonuclease nach der Vorschrift von Beispiel 2 gespalten, 25 und zwei markierte Fragmente von etwa 265 bzw. 135 Basenpaaren wurden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen an einem Polyacrylamid-Gel voneinander getrennt. Die isolierten Fragmente wurden spezifischen Spaltungsreaktionen unterworfen, dann erfolgte die Sequenzanalyse nach 30 der Methode von Maxam und Gilbert, loc. cit. Die Sequenz der folgenden Tabelle 2 bezieht sich auf eine Zusammenstellung der Ergebnisse dieser Versuchsreihen und ähnlicher Versuchsreihen mit cDNS und Plasmid-Vektoren aus col El wie pMB-9 und pBR-322. Am 5'-Ende ist eine Sequenz von schät-35 zungsweise 50 bis 120 Nucleotiden Länge unbestimmt und das Poly-dA-Segment am 3'-Ende ist von verschiedener Länge. Diese Sequenz entspricht dem derzeitigen Wissensstand, wobei selbstverständlich weitere Untersuchungen zusätzliche Details eröffnen oder die Notwendigkeit zu 40 geringfügiger Revision einiger Bereiche mit sich bringen können. Die entsprechende Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I beginnt mit der mit 1 bezeichneten Triplett-Stellung und endet mit der mit 86 bezeichneten Triplett-Stellung. Einige Ungewissheit verbleibt im Hinblick auf die in gestri-45 chelter Linie unterstrichene Sequenz:

Tabelle 2

^/unbestimmt? ccc CTC CTC GTC CÏC ÏGG GAC ccc MG CCT CCT CAG CCT TTT GTC MA CA0 CAC CTT TGT

10

20

30

GGT CCT CAC CTG GTG GAG GCT CTG TAC CTG GTG TGT GGG GAA CGT GOT TTC TTC TAC ACA CCC AAC TCC CGT CGT

40

50

GAA GTG GAG GAC CCG CAA GTG CCA CAA CTG GAG CTC GCT GGA GGC CCG GAG GCC GGG GAT CTT CAG ACC TCG GCA

60

70

80

CTG GAG GTT GCC CCG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAT CAG TGC TGC ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAA CTG GAG 86

AAC TAC TGC AAC TGA GTTÇAATCAATTCCCGATCCACCCCTCTGCAATGAATAAAGCCTTTGAATGACC-poly A

mit gestrichelter Linie unterstrichen = Bereiche vorhandener Unsicherheit

15

642 680

Beispiel 6

Eine menschliches Insulin codierende Nucleotidsequenz wird nach der Vorschrift der Beispiele 1 bis 4 isoliert, gereinigt und in ein Plasmid inseriert, wobei man von menschlichem Pankreasgewebe ausgeht, das einer geeigneten Quelle entstammt, zum Beispiel einem gespendeten Pankreas oder einem frischen Leichnam oder einem menschlichen Insulinoma. Ein Mikroorganismus wird im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4 erzeugt, mit einer die A- und B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Nucleotidse-5 quenz. Die bekannte Aminosäuresequenz der A-Kette lautet:

1 10

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-20

Tyr-Cys-Asn

Die Aminosäuresequenz der Kette B lautet:

1 10 ■

Phe-Val-Asn-Glu-f3is-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala—Leu-Tyr-Leu-Val-

20 30

Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Bys-Thr

Die Aminosäuresequenzen werden ausgehend vom Ende mit freier Aminogruppe beziffert, vergleiche Smith, L.F., Diabetes 21, (Erg. 2), 458 (1972).

Beispiel 7 25

Bei Genen nicht-menschlichen Ursprungs erfordern die US-Sicherheitsbestimmungen nicht die Isolierung einer cDNS so hoher Reinheit wie bei menschlicher cDNS. Es ist daher möglich, die das gesamte Ratten-Wachstumshormon-Strukturgen enthaltende cDNS zu isolieren, indem man elek- 30 trophoretisch abgetrennte DNS der erwarteten Länge von etwa 800 Basenpaaren (entsprechend der bekannten Aminosäurelänge des Wachstumshormons) isoliert. Als Quelle für Ratten-Wachstumshormon-mRNS wurden gezüchtete Hypophysenzellen von Ratten (sub-Klon des Zellstamms GH-1, zu 35 beziehen bei der American Type Culture Collection) verwendet, vergleiche Tashjian, A.H., et. al., Endochrinology 82,342 (1968). Werden diese Zellen unter normalen Bedingungen gezüchtet, so macht die Wachstumshormon-mRNS nur 1 bis 3% der gesamten Poly-A-enthaltenden RNS aus. Die Menge 40 an Wachstumshormon-mRNS wurde jedoch über die Menge anderer mRNS in der Zelle erhöht durch die synergistische Einwirkung von Thyroidhormonen und Glucocorticoiden. Die RNS wurde aus 5 x 108-Zellen gewonnen, die in einer Suspensionskultur gezüchtet und zur Produktion von Wachs- 45 tumshormon disponiert wurden durch Zusatz von 1 mM Dexamethason und 10 mM L-Triiodthyronin zum Medium 4 Tage vor dem Sammeln der Zellen. Die polyadenylierte RNS wurde aus der cytoplasmischen Membranfraktion der gezüchteten Zellen isoliert, siehe dazu Martial, J.A., Baxter, J.D., so Goodman, H.M. und Seeburg, P.H., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74,1816 (1977), und Bancroft, F.C., Wu„ G. und Zubay, G., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70,3646 (1973). Die mRNS wurden dann im wesentlichen nach der Vorschrift der Beispiele 1,2 und 3 weiter gereinigt und in doppelsträngige 55 cDNS transcribiert. Nach der Fraktionierung der Gel-Elektrophorese wurde eine schwache aber deutliche Bande entsprechend einer DNS mit etwa 800 Basenpaaren Länge beobachtet.

Die Behandlung der gesamten, durch Transcription aus 60 der mRNS der gezüchteten Hypophysenzellen erhaltene cDNS mit Hhal-Endonuclease ergab zwei DNS-Hauptfrag-mente (nach elektrophoretischer Trennung) entsprechend etwa 320 Nucleotiden (Fragment A) und 240 Nucleotiden (Fragment B). Die Nucleotidsequenzanalyse der Fragmente A 65 und B gemäss der Vorschrift von Beispiel 5 ergab, dass diese Fragmente tatsächlich Portionen der codierenden Region für Ratten-Wachstumshormon waren, und zwar auf der Basis der bekannten Aminosäuresequenz für Ratten-Wachstumshormon und durch Vergleich mit anderen bekannten Wachstumshormonsequenzen; vergleiche Wallis, M. und Davies, R.V.N., Growt Hormone And Related Peptides (Herausg. Copecile, A. und Muller, E.E.), S. 1-14 (Elsevier, New York, 1976), und Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Erg. 2, S. 120-121 (National Biomedicai Research Foundation, Washington, D.C., 1976). Wird die doppelsträngige cDNS mit 800 Basenpaaren nach der vorstehend beschriebenen elektrophoretischen Isolierung analog mit Hhal-Endonuclease behandelt, so erhält man unter den Hauptspaltprodukten zwei Fragmente, die in der Länge den Fragmenten A und B entsprechen.

Da die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren nicht unter Rückgriff auf die Behandlung mit Restriktions-Endonuclease gereinigt wurde, musste die DNS zwecks Entfernung ungepaarter einsträngiger Enden behandelt werden. In der Praxis entfernt man diese ungepaarten Enden vor der elektrophoretischen Trennung in 25 p.160 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCh, 10 mM ß-Merkaptoethanol, 1 mM ATP und 200 |iM von jedem der Nucleotide dATP,

dTTP, dGTP und dCTP. Das Gemisch wurde mit einer Einheit E. coli DNS-Polymerase I bei 10 °C 10 Min. inkubiert, um alle hervortretenden 3'-Enden zu entfernen und alle hervortretenden 5'-Enden aufzufüllen. DNS-Polymerase I ist ein handelsübliches Produkt (Boehringer-Mannheim Biochemi-cals, Indianapolis, Indiana).

An die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren wurden chemisch synthetisierte Hind III-Binde-glieder nach der Vorschrift von Beispiel 3 addiert. Das Plasmid pBR-322 mit einem Ampicillin-Resistenzgen und einer einzigen Hind Ill-Stelle im Tetracyclin-Resistenzgen wurde mit Hind III-Endonuclease und alkalischer Phosphatase nach der Vorschrift von Beispiel 4 vorbehandelt. Das so behandelte Plasmid wurde mit der Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit den 800 Basenpaaren in einer DNS-Ligase-Reaktion gemäss Beispiel 3 kombiniert. Das Gemisch zur Ligase-Reaktion wurde zur Transformierung einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen, die gemäss Beispiel 3 behandelt worden waren, verwendet. Die rekombinierten Kolonien wurden aufgrund ihres Wachstums auf Ampicillin enthaltende Nährplatten und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 (ig/ml Tetracyclin ausgesondert. 10 derartiger Kolonien wurden erhalten, die das Plasmid mit einer Insertion von etwa 800 Basenpaaren enthielten. Die Freisetzung erfolgte durch Hind Iii-Spaltung.

Die Ratten-Wachstumshormon-DNS (RGH-DNS) mit 800 Basenpaaren wurde in präparativen Mengen aus dem rekombinierten Klon pRGH-1 isoliert und die Nucleotidse-

642 680

16

quenz wurde wie in Beispiel 5 beschrieben ermittelt. Die Nucleotidsequenz umfasste Teile der 5'-untranslatierten Region des Ratten-Wachstumshormons und eine Sequenz von 26 Aminosäuren, die im Proteinvorläufer des Wachstumshormons vor der Sekretion gefunden wird. Die aus der Gen-Sequenz gefolgerte mRNS-Sequenz zeigt folgende Tabelle 3. Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt gut überein (mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8) mit der Teilsequenz des Ratten-Wachstumshormons gemäss Wallis und Davies, loc. cit., die die Reste 1-43,65-69, 108-113,133-143 und 150-190 aufweist.

Tabelle 3

DNS-Nucleotidsequenz eines Stranges, der die gesamte Ratten-Wachstumshormon codierende Sequenz enthält. Die entsprechenden Aminosäuren werden zusammen mit ihrer Stellungsnummer in Bezug auf das Amino-Ende aufgeführt. Negativ bezifferte Aminosäuren entsprechen der Sequenz von Pro-Wachstumshormon. Die entsprechende mRNS-Sequenz ist die gleiche, lediglich wird in der mRNS T durch U ersetzt:

10

Tabelle 3

51 GTCGACAGATCACTGAGTGGCG

Met Ala Ala ATG CCT CCA

Trp Pro Gill Glu Ala Gly Ala leu Pro Ala Met Pro Leu Ser TGG CCT CAA GAC GCT GGT CCT TTA CCT GCC ATG CCC TTC TCC

Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Glu Arg Ala Tyr Ile Pro CCT CCT GAC ACC TAC AAA CAG TTC CAG CCT CCC TAC ATT CCC

60

Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro Thr Gly Lys Glu Glu Ala Gin TCA CAG ACC ATC CCA GCC CCC ACC GGC AAG GAG GAG GCC CAG

Ser Trp Leu Gly Pro Val Gin Phe Leu Ser Arg Ile Phe Thr TCA TGG CTG CCG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGG ATC TTT ACC

120'

Asp Leu Clu Clu Gly Ile Gin Ala Leu Met Gin Glu Leu Clu CAC CTG CAA CAC GCC ATC CAG GCT CTG ATG CAC GAG CTG GAA

Phe Asp Ala Asn Met Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn TTT CAC CCC AAC ATG CGC AGC GAT GAC GCT CTG CTC AAA AAC

180

Tyr Leu Are Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Al.a.Glu Ser Ser TAC CTG CCC GTC ATG AAC TGT CGC CGC TTT CCG GAA AGC ACC

Asp Ser Cln CAC TCT CAU

Scr Leu Phe ACT CUC TTT

1,0

Glu Gly Gin CAG 'GGA CAG

Cln Arg Thr GAG AGA ACT

100

Asn Ser Leu AAC AGC CTC

Asp Gly Ser GAC GGC AGC

160

Tyr Gly Leu TAT GGG CTC

Thr Pro Trp Leu Leu Thr Phe Ser Leu Leu Cys Leu Leu ACT CCC TCCi CTC CTC ACC TTC AGC CTG CTC TCC CTG CTG

20

Ala Asn Ala Val Leu Arg Ala Gin Iiis Lt-u Iiis Gin Leu CCC AAT GCT CTG CTC CCA CCC CAG CAC CTG CAC CAC CTG

Arg Tyr Ser Ile Gin Asn Ala Gin Ala Ala Phe Cys Phe CGC TAT TL'C ATT CAG AAT CCC CAG CCT CCT ITC TCC TTC

80

Asp Met Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gin GAC ATC GAA TTC CTf CGC TTC TCG CTC CTG CTC ATC CAG

Met Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys ATC TTT GGT ACC TCG GAC CGC GTC TAT CAG AAA CTC AAG

UiO .

Pro Arg Ile Gly Cln Ile Leu Lys Gin Thr Tyr Asp Lys CCC CGT ATT CCG CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAT CAC AAC

Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr CTC TCC TGC TIC AAG AAG CAC CTC CAC AAG GCA GAC ACC

Cys Ala Phe TGT GCT TTC

TAC GCACACACTGGTGTCTCTGCCGCACTCCCCCGTTACCCCCCTGTACT CTGGCAACTGCCACCCCTACACTTTGTCCTAATAAAATTAATGATGCATCATATC poly(A) 31

Beispiel 8

Die Isolierung von menschlicher Wachstumshormon-mRNS erfolgt im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 7, lediglich ist das biologische Ausgangsmaterial menschliches Hypophysentumorgewebe. Fünf benigne Hypophysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren, und von denen jeder 0,4 bis 1,4 g wog, wurden in 4-moIarer Gunidiniumthiocyanat-Lösung, die an Merkaptoethanol 1-molar und auf pH 5,0 gepuffert worden war, bei 4°C aufgetaut und homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 mmol Ethylen-diamintetraessigsäure enthielt, aufgeschichtet und 18 Std. bei 37 000 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beckmann-Ultrazentrifuge bei 15°C zentrifugiert. Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenrohres. Die weitere Reinigung mit einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose-Gra-dientensedimentation erfolgte wie in den Beispielen 1,2 und 3. Etwa 10% der so isolierten RNS codierten Wachstumshormon, wie abzuschätzen war aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers in Niederschlagsmaterial aus Antiwachstumshormon in einem zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimen; vergleiche Roberts, B.E. und 45 Patterson, B.M., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70,2330 (1973). Die Herstellung der cDNS von menschlichem Wachstumshormon erfolgt im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben. Die cDNS wird durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, und das zu einer etwa 800 Nucleotiden Länge entsprechenden so Stellung wandernde Material wird zur Klonierung ausgewählt. Diese Fraktion wird mit DNS-Polymerase I, wie in Beispiel 6 beschrieben, behandelt, dann erfolgt End-Addition der Hind III-Bindeglieder. Die cDNS wird dann mit dem mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pBR-322 und 55 DNS-Ligase rekombiniert. Mit der rekombineirten DNS wird E. coli X-1776 transformiert und ein die Wachstumshormon-DNS enthaltender Stamm wird ausgewählt. Dieser Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet, die DNS wird daraus isoliert und ihre Nucleotidsequenz wird bestimmt. Die klo-60 nierte Wachstumshormon-DNS enthält die die gesamte Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons codierenden Nucleotide. Die ersten 23 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons sind

ELN-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-10 20

Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-.

17

642 680

Die restliche Sequenz zeigt die Tabelle 4:

Tabelle 4

Nucleotidsequenz eines Stranges von menschlicher Wachstumshormon-DNS. Die Zahlen beziehen sich auf die

Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons, beginnend am Amino-Ende. Die DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für menschliches Wachstumshormon, lediglich ersetzt in der mRNS U das T.

Tabelle 4

24 34 40 43

Ala Plie Asp Tlir Tyr Gin Glu Plie GÌu Glu Ala Tyr Ile Pro tys «lu Cln Lys Tyr Ser Plm I.cu Cln Asn Pro Cln .

5' C CCC TTT CAC ACC TAC CAC GAG TTT CAA CAA CCC TAT ATC CCA AAC CAA CAC AAG TAT TCA ITC CTC CAC AAC CCC CAC

60

Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Tlir Pro Ser Asn Asg Glu Glu Tlir Gin Gin Lys Ser Asn Leu Clu Leu Leu ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC ACC CAG CAA ACA CAA CAO AAA TCC AAC CTA CAC CTC CTC

80 100

Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gin Ser Trp Lau Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Aan Leu Vai'Tyr CCC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TCG CTC RAG CCC CTC CAG TTC CTC ACC ACT CTC TTC CCC AAC AAC CTC CTG TAC

120

Cly Ala Ser 'Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Clu Clu Cly Ile Gin Thr Leu Met Cly Arg Leu Glu Asp GCC CCC TCT CAC AGC AAC GTC TAT CAC CTC CTA AAG GAC CTA CAG CAA GCC ATC CAA ACC CTC ATG CCC ACG CTC CAA CAC

140

Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin Ile Phe Lys Gin Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Aan Ser Iiis Asn Hls Asp Ala Leu Leu CCC ACC CCC CCC ACT GGG CAC ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG ITC GAC ACA AAC TCA CAC AAC CAT CAC GCA CTA CTC

160 180

Lys Asn Tyr Gly Leu AAC AAC TAC CCG CTG

180

Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile V.ìl Gin Cys Arg Ser CTC TAC TCC ITC AGG AAC CAC ATG CAC AAC CTC GAG ACA TTC CTC CGC ATC CTG CAI! TCC CCC TCT

191

Val Clu Gly Ser Cys Gly Phe

CTC CAG CGC ACC TCT CGC TTC TAC CTCCCCGCCTGCCATCCCTCTCACCCCTCCCCAGTCCCTCTCCTCCCC

Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird es erstmalig möglich, eine für ein spezifisches regulatorisches Protein eines höheren Organismus, wie zum Beispiel eines Wirbeltiers, codierende Nucleotidsequenz zu isolieren, ferner kann der Transfer der darin enthaltenen genetischen Information in einem Mikroorganismus ausgeführt werden, in welchem die unbegrenzte Replikation möglich ist. Das offenbarte Verfahren kann auf die Isolierung und Reinigung des menschlichen Insulingens und seinen Transfer in einen Mikroorganismus angewandt werden. Ebenso kann menschliches Wachstumshormongen und können andere Proteingene isoliert, transferiert und in einem Mikroorganismus repliziert werden. Offenbart werden einige neue rekombinierte Plasmide, die in ihrer Nucleotidsequenz eine Struktur aufweisen, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus erhalten wurde. Offenbart werden neue Mikroorganismen,

die abgewandelt sind, so dass sie eine Nucleotidsequenz enthalten, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus entstanden ist. Die Beispiele illustrieren die *5 Erfindung am Transfer von Ratten-Gen für Proinsulin I in einen Stamm von Escherichia coli und am Transfer von Ratten-Gen für Wachstumshormon an einem Stamm von E. coli. Die Sequenz des Hauptstücks des transferierten Gens wurde in jedem Fall ermittelt, wobei festgestellt wurde, dass sie die 5o gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I bzw. Ratten-Wachstumshormon codiert.

Der hier beschriebene Mikroorganismus wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31392 hinterlegt. Weiterhin wurde das Plasmid enthaltende Ratten-Insulingen, das 55 unabhängig auf andere Mikroorganismen-Stämme übertragen werden kann, unter der Hinterlegungsnummer 40003 bei der ATCC hinterlegt.

1 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE 2. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 1, gekennzeich-

1. DNS-Transfer-Vektor, der in seiner Nucleotidsequenz net durch eine Nucleotidsequenz, die die A-Kette des eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren menschlichen Insulins codiert und besteht aus Organismus enthält, die durch Transkription an einem Gen des höheren Organismus entstanden ist. 5

5' GGL.ATM_GTL GAJ,CAJ TGK TGK_ACL OR S ATM, TGK QR,?S17

1 2 3 4 5 6 7 8 9 9 10 11

X13TYi3TAK14GAJ15X16TY16GAJ17AAK18TAK19TGK20AAK21 3'

worin A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycy- A, G, C oder T, falls QR„ = TC, und T oder C, falls QRn =

tosyl, T = Thymidyl, J = A oder G, K = T oder C, L = A, AG und die tiefgestellten Ziffern n die Aminosäurestellung

TC oder G, M = A, C oder T, Xn = T oder C, falls Yn = A 15 im menschlichen Insulin, dem die Nucleotidsequenz nach oder G und C, falls Yn = C oder T, Yn = A, G, C oder T, falls dem genetischen Code entspricht, bedeuten, wobei die Ami-

Xn = C und A oder G, falls X„ = T, Wn = C oder A, falls Zn nosäurestellungen vom Amino-Ende beziffert sind.

= G oder A, und C, falls Zn = C oder T, Zn = A, G, C oder 3. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 2, gekennzeich-

T, falls Wn = C, und A oder G, falls Wn = A, QRn = TC, net durch eine weitere Nucleotidsequenz, die die B-Kette von falls Sn = A, G, C oder T, und AG, falls S„ = T oder C, Sn = 2" menschlichem Insulin codiert und besteht aus

5'—-TTK1GTL2AAK3GAJ4CAK5X6TY6TGK7GGLgQRgSgCAlCioX11TY11GTL12

GAJ13GCLUX15TY15TAK16XL7TY17GTL18TGK19GGL2QGAJ21W22GZ22GGL23 IIK24TIK25TAK26ACI-27CCL28AAJ29ACL30 —3 '
4. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 3, dadurch 30 5. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für die A- und B-Ketten von gekennzeichnet, dass das Gen des höheren Organismus menschlichem Insulin codierenden Nucleotidsequenzen Wachstumshormon codiert.

durch eine Nucleotidsequenz (NaNbNc)j innerhalb der Teilse- 6. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 5, gekennzeich-

quenz 5'—ACL30 (NaNbNc)jGCLi 3' verknüpft sind, net durch eine die Aminosäuresequenz von menschlichem wobei Na, Nb und Nc A, T, G oder C bedeuten können und j 35 Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz, die besteht eine beliebige ganze Zahl von 0 bis 100 darstellt, vorausge- aus setzt, dass NaNbNc weder TAJ noch TGA bedeutet.

5 * -TTK1CCL2ACL3A,m4CCL5X6TY6QR7S7W8GZ8X9TY9TTK10GAK11AAX12GCL13ATGX15TY15 ^16^Zi6GC^il7C^i8^19GZi9^20^20^'^21^^22^23'^23

CCL24TTK25CAK26ACL27TAK23CAJ7gCAJ30TTK3ICAJ32CAJ33ACL34TAK35ATN36 CCL37AAJ33CAJ3gCAJ40AAJA1TAK42QR43S43TTK44XA5TY45CAJ46AAKA7CCL4aCAJ49

ACL50^R5lS51X52TY52TCK53TTK5A^R55S55GAJ56^R57S57A™58CCL59ACL60CCL61^R62S62

AAK63W64GZ64GAJ65CAJ66ACL67CAJ63CAJ69AAJ70C*R7lS71AAK72X73TY73GAJ74X75TY75X76TY7 W77CZ77A™78QR79S79X80TYS0X81TY31X82TY82A™83CAJ84QR85S35TGCX87TY87GAJ83

CCL89CTL9OCAJ91TTK92X93TY93W94GZ94^R95S95GTL96rTIC97GCL9SAAK99AAKl00XioiTY101 CTL102TAK103GGL104GCLI05QR106S 106GAKio7QR108S 108AäK109GTL1 10TAKi 1 lCAKi 12 X113TY113X114TY114AAJ115GAK'116X117TY117CAJ118GAJ119GGL120A™121CAJ122ACL123

X124TYi24ATGGGL126WI27GZl27X123TY12SGAJ129GAK130GGL13lQR132SL32CCL133

W134GZ134ACL135GGL136CAJ137A™138TTK139AAJ140CAJ1A1ACL142T'UC143QR144S1A4

AAJ145TTK146GAK1A7ACL148'UK149QR150S150CAK151AAK152CAK153GAK154GCL155X156TY156

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x157Tïl57AJU15SAA1C159TAKl60CGL16lX162Tï162X163Tï163'rAK164TCK165rrK166H167GZ167

AAJ168GAK169AIGCAK171AAJ172CTI'173GAJi74ACL175ITK176X177Tï177W178GZl78A™179 GTL1S0CAJI81TGK182H183GZ183I3R184SX84GTI-ÌS5GAJ186GGI-187Q!118SS183TCK189GGLI90TIK191

worin A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycy- >» tosyl, T = Thymidyl, J = A oder G, K = T oder C, L = A, TC oder G, M = A, C oder T, Xn = T oder C, falls Yn = A oder G, und C, falls Yn = C oder T, Yn = A, G, C oder T,

falls Xn = C, und A oder G, falls Xn = T, Wn = C oder A,

falls Z„ = G oder A, und C, falls Zn = C oder T, Zn = A, G, 15 C oder T, falls Wn = C, und A oder G, falls Wn = A, QR„ = TC, falls Sn = A, G, C oder T, und AG, falls Sn = T oder C, Sn = A, G, C oder T, falls QRn = TC, und T oder C, falls QRn = AG und die tiefgestellten Ziffern n die Aminosäurestellung im menschlichen Wachstumshormon, dem die Nucleotidse- 20 quenz nach dem genetischen Code entspricht, bezeichnen,

wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-Ende beziffert werden.
7. Verfahren zur Herstellung des DNS-Transfer-Vektors, gemäss Anspruch 1, der in seiner Nucleotidsequenz'eine 25 Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Zellen isoliert, welche mRNS enthalten, die das erwünschte Protein codieren b) die mRNS aus den Zellen extrahiert, wobei ein RNase- 30 Inhibitor anwesend ist, der eine durch RNase hervorgerufene Zersetzung der -mRNS verhindert, oder in Abwesenheit eines derartigen RNase-Inhibitors extrahiert c) eine mRNS isoliert, die im wesentlichen frei von Proteinen, DNS und anderen RNS ist, 35

d) eine doppelsträngige cDNS synthetisiert, in welcher ein Strang eine Nucleotidsequenz aufweist, die komplementär zu derjenigen der -mRNS ist und man dabei eine cDNS herstellt, die eine Nucleotidsequenz aufweist, welche das erwünschte Protein codiert 40

e) einen DNS-Transfer-Vektor zur Verfügung stellt, der geeignete reaktive Enden aufweist, die in der Lage sind, miteinander verbunden zu werden oder mit der doppelsträngigen DNS verbunden zu werden und f) den DNS-Transfer-Vektor mit der doppelsträngigen 45 cDNS verbindet, welche eine Nucleotidsequenz aufweist, die das erwünschte Protein in einer durch eine DNS-Ligase katalysierten Reaktion codiert, wobei man einen DNS-Transfer-Vektor erhält, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz aufweist, die das erwünschte Protein codiert. 50
8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man einen DNS-Transfer-Vektor herstellt, in welchem die Nucleotidsequenz eine Untersequenz aufweist, welche Insulin codiert, indem man a) aus der Bauchspeicheldrüse eines Insulin produzieren- 55 den Organismus Inselzellen isoliert, welche Insulin codierende mRNS enthalten,

b) aus den Inselzellen die mRNS in Gegenwart von RNase-Inhibitor extrahiert, so dass der RNase-Abbau der mRNS verhindert wird, 60

c) die vonProtein, DNS und anderer RNS im wesentlichen freie mRNS isoliert,

d) eine doppelsträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz aufweist, wobei man eine cDNS mit Insulin codierender 65 Nucleotidsequenz erhält,

e) einen DNS-Transfer-Vektor mit reaktionsfähigen Enden, die miteinander oder mit doppelsträngiger cDNS verbunden werden können, bereitstellt, und f) den DNS-Transfer-Vektor und die doppelsträngige cDNS mit der Insulin codierenden Nucleotidsequenz miteinander verbindet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe (b) einen RNase-Inhibitor einsetzt, der ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähige Enden besitzenden DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, dass man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens vorbehandelt, das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist, und DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine Verbindung zwischen den reaktionsfähigen Enden herstellende Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten reaktionsfähigen Enden, die in der Ligase-katalysierten Reaktion nicht miteinander verbunden werden.
11. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man einen DNS-Transfer-Vektor herstellt, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz aufweist, welche Wachstumshormon codiert, indem man a) Hypophysenzellen, die Wachstumshormon codierende mRNS enthalten, isoliert,

b) die mRNS aus den Hypophysenzellen extrahiert in Gegenwart eines RNase-Inhibitors, wodurch der RNase-Abbau der mRNS verhindert wird,

c) die von Protein, DNS und anderer RNS im wesentlichen freie mRNS isoliert,

d) eine doppelsträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz besitzt, wobei man eine cDNS mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz erhält,

e) einen DNS-Transfer-Vektor bereitstellt, der zur Bindung miteinander oder mit doppelsträngiger cDNS befähigte reaktionsfähige Enden besitzt, und f) den DNS-Transfer-Vektor mit der doppelsträngigen cDNS mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz verbindet.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man einen RNase-Inhibitor verwendet, der ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähige Enden besitzenden DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, dass man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens behandelt, das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist, und die DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine Verbindung zwischen den Enden herstellende

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Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten Enden, die in der Ligase-katalysierten Reaktion nicht miteinander verbunden werden.
14. Verwendung des DNS-Transfer-Vektors gemäss Anspruch 1, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält, die durch Transkription an einen Gen des höheren Organismus entstanden ist, um einen Mikroorganismus so zu modifizieren, dass er diese Sequenz enthält.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man einen DNS-Transfer-Vektor verwendet, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens aufweist, das Insulin codiert, um einen Mikroorganismus herzustellen, der eine Nucleotidsequenz enthält, die Insulin codiert, indem man einen Mikroorganismus mit diesem mit der cDNS verbundenen DNS-Transfer-Vektor vermischt.
16. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man einen DNS-Transfer-Vektor verwendet, der in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz mit der Struktur eines Gens aufweist, das Wachstumshormon codiert, um einen Mikroorganismus herzustellen, der eine Nucleotidsequenz aufweist, die Wachstumshormon codiert, indem man einen Mikroorganismus mit dem mit der cDNS verbundenen DNS-Transfer-Vektor vermischt.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-16, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete DNS-Transfer-Vektor ein Plasmid ist und dass man als zu modifizierenden Mikroorganismus ein Bakterium einsetzt.