CH649783A5

CH649783A5 - Procede pour la production de prolactine humaine.

Info

Publication number: CH649783A5
Application number: CH5373/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-08-22
Filing date: 1981-08-20
Publication date: 1985-06-14
Also published as: IT8149117A0; GB2085891B; KR830005867A; IT1143224B; JPS5739795A; JPS5756876B2; FR2488804A1; GB2085891A; FR2488804B1; KR860000896B1

Description

La présente invention concerne un procédé pour la production de prolactine humaine qui consiste à faire multiplier des cellules humaines.

La prolactine humaine est une hormone secrétée par les cellules des adénomes acidophiles de l'hypophyse antérieure, qui stimule le développement de la glande mammaire, de la prostate et des vésicules séminales. Aucun procédé de production en masse de la prolactine humaine n'a été mis au point à ce jour.

Le titulaire a étudié des procédés pour la production en masse de prolactine humaine peu coûteuse. Ses efforts ont débouché sur la découverte inattendue que des cellules humaines, obtenues par multiplication de cellules humaines capables de produire la prolactine humaine, avec emploi d'un animal à sang chaud, on une capacité de production de la prolactine humaine de beaucoup supérieure à celle des cultures de tissu in vitro : une production de prolactine humaine par cellule 2 à 50 fois supérieure.

Le procédé mentionné au début est donc caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1.

Le procédé de l'invention permet une production accrue de prolactine humaine, ne nécessite pas ou bien moins de milieu nutritif contenant un sérum coûteux pour la multiplication des cellules, et rend l'entretien du milieu de culture pendant la multiplication cellulaire bien plus facile que dans le cas d'une culture de tissu in vitro. En particulier, on peut multiplier facilement toutes les cellules humaines capables de produire de la prolactine humaine, en utilisant le liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par transplantation de ces cellules dans l'organisme de l'animal ou mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion conçue pour recevoir le liquide nutritif de l'organisme, l'animal étant alimenté de façon ordinaire. Egalement, le procédé est caractérisé par une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, ainsi que par un accroissement de la production de prolactine humaine par cellule.

En ce qui concerne les cellules pouvant être utilisées dans l'invention, on peut employer toute cellule produisant de la prolactine humaine et se multipliant facilement dans l'organisme d'un animal à sang chaud. Par exemple, on peut'utiliser selon l'invention des cellules humaines produisant naturellement de la prolactine humaine, telles que les cellules acidophiles de l'hypophyse antérieure de l'homme, les cellules transformées par le virus EB ou par irradiation par les rayons X, et celle d'un adénome acidophile de l'hypophyse d'un sujet humain; des cellules de carcinome du poumon, produisant de la prolactine humaine ectopique, et des lignées cellulaires établies des cellules ci-dessus. Egalement l'emploi de lignées lympho-blastoïdes humaines établies, faciles à entretenir, dans lesquelles on a introduit des gènes commandant la production de la prolactine humaine, selon des techniques de recombinaison génétique utilisant des enzymes telles que l'ADN-ligase, la nucléase et l'ADN-polymé-rase ou par fusion cellulaire avec des agents tels que le polyéthylène-glycol ou le virus Sendai, provoque une multiplication cellulaire remarquablement supérieure, lorsque ces cellules sont transplantées dans l'organisme d'un animal à sang chaud; la production de la prolactine humaine, par cellule, est supérieure d'environ 2 à 10 fois ou plus. De plus, comme la transplantation des lignées lymphoblastoï-des humaines précitées provoque la formation de tumeurs massives, et que ces tumeurs sont difficilement contaminées par les cellules de l'animal hôte et se désagrègent facilement, les cellules lymphoblas-toïdes humaines vivantes multipliées peuvent être facilement récoltées.

En ce qui concerne les animaux pouvant être utilisés dans l'invention, on peut employer tout animal dans l'organisme duquel les cellules se multiplient. Par exemple, on peut employer, de façon avantageuse, des volailles telles que poussin ou pigeon, ou des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme une telle transplantation cellulaire provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal nouveau-né ou très jeune ou à un stade le plus précoce possible, par exemple sous forme d'œuf, d'embryon ou de fœtus, est souhaitable. Pour réduire la réaction immunitaire, on peut, avant la transplantation cellulaire, traiter l'animal par irradiation avec des rayons X ou des rayons y à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immuno-suppresseur préparé selon un procédé classique. Comme les souris nues utilisées comme animaux à sang chaud présentent une réaction immunitaire plus faible, même lorsqu'elles sont adultes, on peut de façon pratique leur transplanter des cellules humaines établies, pour qu'elles se multiplient rapidement dans leur organisme sans qu'un tel prétraitement soit nécessaire.

On peut effectuer une multiplication cellulaire stabilisée et accroître la production de prolactine humaine par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'animaux à sang chaud différents; par exemple, on peut tout d'abord implanter les cellules humaines au hamster, pour qu'elles s'y multiplient, puis les réimplanter à la souris nue. De plus, on peut effectuer la transplantation répétée avec des animaux appartenant à la même classe ou à la même division ainsi qu'à la même espèce ou au même genre.

On peut implanter les cellules humaines à un site quelconque de l'animal, du moment qu'elles s'y multiplient: par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoïde, ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

En plus de la transplantation directe des cellules dans l'organisme d'un animal, pour multiplier des lignées de cellules humaines établies classiques, capables de produire de la prolactine humaine, on peut utiliser le liquide nutritif de l'organisme d'un animal, par introduction dans l'organisme de cet animal, par exemple par voie intrapéritonéale, d'une chambre de diffusion classique de forme et de taille diverses, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10" 7 à 10 ~5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre de diffusion

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par les cellules de l'animal hôte et permettant au liquide nutritif de l'organisme de l'animal d'alimenter les cellules. De plus, la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour pouvoir être placée par exemple sur l'animal hôte et permettre la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre de diffusion, ainsi que l'observation de la suspension cellulaire dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales transparentes placées sur une ou plusieurs parois de la chambre; la chambre est remplaçable et échangeable par une chambre neuve; on accroît ainsi la multiplication des cellules au cours de la vie de l'animal et également la production de cellules par animal sans avoir à sacrifier celui-ci. De plus, lorsqu'on utilise une telle chambre de diffusion, comme on peut facilement récolter les cellules humaines multipliées et qu'il ne se produit pas de réaction immunitaire, par suite de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et les cellules de l'animal hôte, on peut utiliser, selon l'invention, un animal à sang chaud quelconque, sans aucun traitement préalable pour réduire la réaction immunitaire.

On peut alimenter facilement, de façon classique, l'animal auquel on implante les cellules humaines, même après la transplantation des cellules, et aucun soin particulier n'est nécessaire.

La multiplication maximale des cellules est obtenue environ 1 à 20 semaines après la transplantation cellulaire. Lorsque la lignée de cellules humaines établies que l'on implante à l'animal est une lignée de cellules tumorales, humaines, ou de cellules lymphoblastoïdes humaines, on atteint la multiplication maximale des cellules 1 à 5 semaines après la transplantation par suite de leur vitesse de multiplication extrêmement élevée.

Le nombre de cellules humaines obtenues par hôte peut être compris entre environ IO7 et 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre de cellules humaines transplantées dans l'organisme de l'animal s'accroît d'un facteur d'environ 102 à 107 ou plus, ce qui est supérieur d'environ 101 à 106 fois ou plus aux nombres obtenus par la méthode de culture tissulaire in vitro avec un milieu nutritif; les cellules peuvent donc être utilisées de façon appropriée pour la production de prolactine humaine.

En ce qui concerne le procédé d'induction de la prolactine humaine, on peut utiliser un procédé quelconque, pourvu que les cellules humaines obtenues selon le procédé indiqué plus haut libèrent de la prolactine humaine. Par exemple, les cellules humaines obtenues par multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et récoltées dans ce liquide, ou par extraction de la tumeur massive formée sous la peau et récoltées après désintégration de cette tumeur, sont mises en suspension à une concentration d'environ 104 à 108 cellules/ml, dans un milieu nutritif maintenu à une température d'environ 20 à 40°C, puis soumises à l'action d'un inducteur de prolactine à cette température, pendant environ 1 à 50 h pour induire la production de prolactine humaine.

Les inducteurs de prolactine que l'on préfère sont des composés organiques tels que la réserpine, la phénothiazine ou la chlorproma-zine; des hormones telles que la TRH (thyrotropin releasing hormone) et les œstrogènes; des aminoacides tels que la lysine, l'arginine et la cystéine; et des sels minéraux comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, ou le sulfate de magnésium. Dans ce cas, d'autres hormones, telles que l'hormone somatotrope humaine (hGH), peuvent être produites simultanément selon l'invention.

On peut facilement recueillir la prolactine humaine ainsi obtenue selon des techniques de purification et de séparation utilisant des opérations classiques, notamment relargage, dialyse, filtration, cen-trifugation, concentration ou/et lyophilisation. Si on désire une préparation de prolactine humaine plus purifiée, on peut l'obtenir à l'état de pureté maximale par combinaison des techniques précitées avec d'autres opérations classiques, telles qu'adsorption et désorp-tion avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.

La préparation de prolactine humaine ainsi obtenue est identique du point de vue immunologique à la préparation de prolactine humaine standard NIH; on peut donc, de façon avantageuse, utiliser la préparation seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents pour l'administration par injection, par voie externe ou interne, pour la préparation et le traitement de maladies humaines telles que l'hypogalactie et pour un but de diagnostic.

Dans la présente description, on détermine la production de prolactine humaine par une méthode radio-immunologique, décrite par P. Hang et coll., «Proc. Nat. Acad. Sci. USA», vol. 68, pp. 1902-1906 (1971) et on l'exprime en poids par millilitre de suspension cellulaire, relativement à la préparation de prolactine humaine standard NIH. On détermine la production simultanée de hGH par la méthode radio-immunologique, comme décrit par S.M. Glick et coll., «Nature», vol. 199, p. 784 (1963), et on l'exprime en poids relativement à la préparation d'hormone'somatotrope humaine standard NIH.

Plusieurs modes non limitatifs de réalisation de l'invention sont décrits ci-après.

Exemple 1 :

On implante par voie sous-cutanée à des souris nues adultes, que l'on alimente ensuite de façon habituelle pendant trois semaines, des cellules humaines d'adénome acidophile désagrégé, obtenues par hachage, après extraction d'un patient atteint d'adénome acidophile de l'hypophyse. On extrait les tumeurs massives obtenues, formées sous la peau et pesant chacune environ 10 g, et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée, physiologique, contenant de la trypsine. Après avoir lavé les cellules avec du milieu 199 de Earle sans glucose (pH 7,2), additionné de 10% en volume de sérum fœtal de veau, on remet les cellules en suspension, pour obtenir une concentration d'environ 105 cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu ayant une concentration de 30 mmol en L-arginine comme inducteur de la prolactine, puis on incube à 37° C pendant 6 h pour induire la production de prolactine humaine. Ensuite, on traite les cellules par des ultrasons et on détermine la prolactine humaine dans le surnageant. La production de prolactine humaine est d'environ 600 ng/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de hGH est d'environ 500 ng/ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus avec l'inducteur de prolactine les cellules témoins, obtenues par culture m vitro des cellules humaines d'adénome acidophile, dans du milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% en volume de sérum fœtal de veau et incubation à 37° C. La production de prolactine humaine n'est que d'environ 100 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 2:

On met ensemble en suspension des cellules humaines d'adénome acidophile désagrégé, obtenues par hachage, après extraction d'un patient atteint d'adénome acidophile de l'hypophyse, avec des cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de lignée Namalwa,

dans un récipient avec une solution salée de concentration 140 mmol en NaCI, 1 mmol en KCl, 1 mmol en NaH2P04 et 2 mmol en CaCl2, pour obtenir des concentrations de chaque type cellulaire d'environ 103 cellules/ml. On mélange la suspension cellulaire glacée avec une préparation de la même solution salée, contenant du virus Sendai préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets; on transfère dans une étuve à 37° C environ 5 min après le mélange, et on agite dans l'étuve pendant environ 30 min, pour obtenir la fusion cellulaire, avec introduction de la capacité de production de la prolactine humaine des cellules humaines d'adénome acidophile dans la lignée de cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines. Après clonage, à la manière classique, de la souche de cellules d'hybridome capable de produire de la prolactine humaine, on implante cette souche par voie intrapéritonéale à des souris nues adultes, que l'on alimente de façon habituelle pendant 5 semaines. On extrait les tumeurs massives produites, pesant environ 15 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 1, pour induire la production de prolactine humaine, mais on remplace la L-arginine 30 mmol par environ 10 ng de TRH et qu'on incube à 37° C. La production de prolactine humaine est d'environ 3300 ng/ml de suspension cellulaire.

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On effectue une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de l'hybride de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine Namalwa et exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur de prolactine. La production de prolactine humaine n'est que d'environ 200 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 3:

Après injection d'antisérum préparé avec un lapin, selon un procédé classique, à des hamsters nouveau-nés pour réduire leur réaction immunitaire éventuelle à la transplantation de cellules, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL, à laquelle on a conféré la capacité de produire la prolactine humaine des cellules humaines d'adénome acidophile, comme dans l'exemple 2; les hamsters sont ensuite alimentés de façon habituelle, pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives sous-cutanées obtenues, pesant environ 10 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 1, pour induire la production de prolactine humaine; cette production est d'environ 1800 ng/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de hGH est d'environ 2000 ng/ml de suspension cellulaire.

Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est effectuée par culture in vitro de l'hybride de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL, et exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur de prolactine. La production de prolactine humaine n'est que d'environ 200 ng/ml de suspension.

Exemple 4:

Par voie intraveineuse, on implante à des rats nouveau-nés une lignée lymphoblastoïde leucémique humaine Namalwa, à laquelle on a conféré la capacité de produire la prolactine cellulaire humaine des cellules humaines d'adénome acidophile, comme dans l'exemple 2; puis on alimente les rats de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives produites, pesant environ 40 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 2 pour induire la production de prolactine humaine; cette production est d'environ 2700 ng/ml de suspension cellulaire.

Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est effectuée par culture in vitro de l'hybride de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine Namalwa, et exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur de prolactine. La production dé prolactine humaine n'est alors que d'environ 100 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 5:

On irradie des souris adultes avec environ 400 rems de rayons X pour réduire leur réaction immunitaire, et on leur implante, par voie sous-cutanée, des cellules humaines d'adénome acidophile obtenues comme dans l'exemple 1 ; puis on alimente les souris de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives sous-

cutanées produites, pesant environ 15 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 2, pour induire la production de prolactine humaine; cette production est d'environ 800 ng/ml de suspension cellulaire.

Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est conduite par culture in vitro des cellules humaines d'adénome acidophile et exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur de prolactine. La production de prolactine humaine n'est alors que d'environ 200 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 6:

On met en suspension dans de la solution salée, physiologique, des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL, auxquelles on a conféré la capacité de produire de la prolactine humaine des cellules humaines d'adénome acidophile, comme dans l'exemple 3 ; les cellules sont ensuite transférées dans une chambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, d'un volume intérieur d'environ 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5 jim de diamètre; on insère la chambre dans le péritoine d'un rat adulte. Après avoir alimenté le rat pendant 4 semaines de façon habituelle, on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre est d'environ 2 x 109 cellules/ml, ce qui est supérieur d'environ 103 fois ou plus à ce qu'on obtient par culture in vitro avec un incubateur à dioxyde de carbone. On traite les cellules ainsi obtenues comme dans l'exemple 1, pour induire la production de prolactine humaine: celle-ci est d'environ 1900 ng/ml de suspension cellulaire. La production simultanée d'hGH est d'environ 2200 ng/ml de suspension cellulaire.

Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est réalisée par culture in vitro de cellules hybrides de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL, puis exposition des cellules multipliées à l'action d'un inducteur de prolactine. La production de prolactine humaine n'est que d'environ 200 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 7:

Dans la cavité allantoïde d'œufs embryonnés, que l'on a préincubés à 37° C pendant 5 d, on implante des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL, auxquelles on a conféré la capacité de produire la prolactine humaine des cellules humaines d'adénome acidophile, comme dans l'exemple 3. Après incubation des œufs à cette température pendant encore une semaine, on recueille les cellules humaines multipliées. On traite les cellules comme dans l'exemple 2, pour induire la production de prolactine humaine; cette production est d'environ 1700 ng/ml de suspension cellulaire.

Dans une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de cellules hybrides de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL, et exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur de prolactine, on obtient seulement environ 200 ng de prolactine humaine par millilitre de suspension cellulaire.

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1. Procédé pour produire de la prolactine humaine, qui consiste à faire multiplier des cellules humaines capables de produire de la prolactine humaine et exposer les cellules multipliées à l'action d'un inducteur de prolactine pour induire la production de prolactine humaine, caractérisé en ce que la multiplication a lieu par transplantation dans l'organisme d'un animal à sang chaud ou dans un dispositif permettant d'alimenter ces cellules en liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules humaines sont des cellules acidophiles, intactes, de l'hypophyse antérieure, de telles cellules transformées par le virus EB ou par irradiation par les rayons X, des cellules humaines d'adénome acido-phile de l'hypophyse, des cellules de carcinome du poumon ou des lignées cellulaires établies de telles cellules.

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REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules humaines sont des cellules hybrides, obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastoïde humaine, et d'une des cellules humaines décrites dans la revendication 2.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inducteur de prolactine est la réserpine, la phénothiazine, la chlorpromazine, une hormone du type thyrotropin releasing hormone, TRH, les œstrogènes, un aminoacide, notamment lysine, arginine ou/et cystéine, un sel minéral, en particulier chlorures de sodium, potassium ou calcium, sulfate de magnésium, ou plusieurs de telles substances.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poussin ou pigeon, ou un mammifère, notamment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue.