CH649784A5

CH649784A5 - Procede pour la production de gonadotrophine chorionique humaine.

Info

Publication number: CH649784A5
Application number: CH5374/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-08-23
Filing date: 1981-08-20
Publication date: 1985-06-14
Also published as: JPS586475B2; IT1143225B; KR830005863A; US4383036A; GB2085890B; FR2488805B1; KR860000898B1; GB2085890A; FR2488805A1; JPS5739797A; IT8149118A0

Description

La présente invention concerne un procédé selon le préambule de la revendication 1 pour la production de gonadotrophine chorionique humaine, désignée ci-après après par l'abréviation hCG.

L'hCG est une hormone sécrétée par les cellules syncytiotrophoblastiques humaines des villosités choriales qui stimule la sécrétion d'androgènes et de progestérone.

Bien qu'on connaisse un procédé pour la production d'hCG utilisant une culture de tissu [A.S. Rabson et coll., «J. Nati. Cancer Inst.», vol. 50, pp. 669-674 (1973)], ce procédé ne permet pas la production en masse d'hCG peu coûteuse, par suite de sa très faible multiplication cellulaire et de sa faible production d'hCG par cellule.

Le titulaire a étudié des procédés pour la production en masse d'hCG. Ces effort sont débouché sur la découverte inattendue que les cellules lymphoblastoïdes humaines capables de produire l'hCG se multiplient rapidement et ont une production d'hCG par cellule grandement plus élevée, et que ces cellules conviennent donc pour la production d'hCG.

Le procédé mentionné au début est donc caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1.

Le procédé de l'invention permet une production accrue d'hCG, ne nécessite pas, ou bien moins, de milieu nutritif contenant un sérum coûteux, pour la multiplication des cellules; il rend l'entretien du milieu de culture, pendant la multiplication cellulaire, bien plus facile que dans le cas d'une culture de tissu in vitro. En particulier, on peut multiplier facilement toutes les cellules lymphoblastoïdes humaines capables de produire de l'hCG, en utilisant le liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par transplantation de ces cellules dans l'organisme de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion conçue pour recevoir le liquide nutritif d'un tel organisme, l'animal étant alimenté de façon ordinaire. Egalement, le procédé est caractérisé par une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, la production d'hCG par cellule étant accrue.

En ce qui concerne les cellules lymphoblastoïdes humaines pouvant être utilisées dans l'invention, on peut employer toutes les cellules lymphoblastoïdes humaines, pourvu qu'elles produisent de l'hCG et se multiplient dans l'organisme d'un animal à sang chaud. Par exemple, des cellules lymphoblastoïdes humaines, dans lesquelles les gènes commandant la production d'hCG des cellules syncytiotrophoblastiques humaines des villosités choriales, des cellules humaines de chorioépithéliome ou des cellules humaines d'adénome chromophobe de l'hypophyse, qui produisent naturellement de l'hCG, ou des cellules humaines de carcinome du poumon qui produisent de l'hCG ectopique, ont été introduits grâce à une fusion cellulaire utilisant le polyéthylèneglycol ou le virus Sendai ou une technique de recombinaison génétique utilisant l'ADN-ligase, la nu-cléase et l'ADN-polymérase, ou des cellules lymphoblastoïdes humaines capables de produire de l'hCG ectopique. Comme la transplantation des cellules lymphoblastoïdes humaines précitées dans l'organisme d'un animal provoque la formation de tumeurs massives se désagrégeant facilement, et que ces tumeurs sont difficilement contaminées par les cellules de l'animal hôte, on peut facilement récolter les cellules lymphoblastoïdes humaines vivantes multipliées.

En ce qui concerne les animaux utilisables dans l'invention, on peut prendre tout animal, pourvu que les cellules se multiplient dans son organisme. Par exemple on peut utiliser avantageusement, selon l'invention, des volailles telles que poussin ou pigeon, ou des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme une telle transplantation cellulaire provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal nouveau-né ou très jeune ou à un stade le plus précoce possible, par exemple sous forme d'oeuf, de fœtus ou d'embryon, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut, avant la transplantation cellulaire, traiter l'animal par irradiation aux rayons X ou y, à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immuno-suppresseur préparé selon un procédé classique. Comme les souris nues utilisées comme animaux à sang chaud présentent une réaction immunitaire plus faible même lorsqu'elles sont adultes, on peut de façon pratique leur implanter des cellules lymphoblastoïdes humaines quelconques, pour qu'elles se multiplient rapidement dans leur organisme, sans qu'un tel prétraitement soit nécessaire.

On peut effectuer une multiplication cellulaire stabilisée et accroître la production d'hCG par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'animaux à sang chaud différents; par exemple, on peut tout d'abord implanter les cellules lymphoblastoïdes humaines au hamster, pour qu'elles s'y multiplient, puis les réimplanter à la souris nue. De plus, on peut effectuer la transplantation répétée avec des animaux appartenant à la même classe ou à la même division ainsi qu'à la même espèce ou au même genre.

On peut implanter les cellules lymphoblastoïdes humaines en un site quelconque de l'animal, où elles se multiplient: par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoïde ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

En dehors de la transplantation directe des cellules lymphoblastoïdes humaines dans l'organisme d'un animal, pour multiplier des lignées lymphoblastoïdes humaines classiques quelconques capables de produire de l'hCG, il est possible d'employer le liquide nutritif de l'organisme d'un animal par introduction dans l'organisme de cet animal, par exemple par voie intrapéritonéale, d'une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10~7 à 10"5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'animal

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hôte, et permettant au liquide nutritif de l'organisme de l'animal d'alimenter les cellules. De plus, la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, de façon à pouvoir être placée par exemple sur l'animal hôte et permettre la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre de diffusion, ainsi que l'observation de la suspension cellulaire dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales transparentes, placées sur une ou plusieurs parois de la chambre; de préférence, cette chambre est remplaçable et échangeable par une chambre neuve; on accroît ainsi la multiplication des cellules au cours de la vie de l'animal, sans avoir à sacrifier celui-ci. Lorsqu'on utilise une telle chambre de diffusion, comme on peut facilement récolter les cellules lymphoblastoïdes humaines multipliées et qu'il ne se produit pas de réaction immunitaire par suite de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et les cellules de l'animal hôte, on peut employer, comme animal hôte selon l'invention, un animal à sang chaud quelconque, sans aucun traitement préalable pour réduire la réaction immunitaire.

On peut alimenter facilement, de façon classique, l'animal hôte auquel sont implantées les cellules lymphoblastoïdes humaines,

même après la transplantation des cellules, et aucun soin particulier n'est nécessaire.

On obtient la multiplication maximale des cellules en environ 1 à 20 semaines et généralement 1 à 5 semaines après la transplantation cellulaire.

Le nombre des cellules lymphoblastoïdes humaines obtenues par hôte peut être compris entre environ IO7 et 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre des cellules lymphoblastoïdes humaines implantées dans l'organisme de l'animal s'accroît d'un facteur d'environ 102 à 107 ou plus, ce qui est supérieur d'environ 101 à 106 ou plus à ce qu'on obtient selon la méthode de culture tissulaire in vitro avec un milieu nutritif; les cellules peuvent donc être utilisées de façon appropriée pour la production d'hCG.

En ce qui concerne le procédé selon lequel on laisse les cellules humaines libérer l'hCG, on peut utiliser un procédé quelconque pourvu qu'il permette la libération d'hCG par les cellules lymphoblastoïdes humaines obtenues selon le mode opératoire précité. Par exemple, les cellules lymphoblastoïdes humaines obtenues par multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et récoltées dans ce liquide, ou par extraction de la tumeur massive formée sous la peau, et récoltées après désintégration de cette tumeur massive, sont mises en suspension à une concentration d'environ 104 à 108 cellules/ml dans un milieu nutritif maintenu à une température d'environ 20 à 40e C; elles sont ensuite incubées à cette température pendant encore 1 à 50 h pour produire l'hCG. L'incubation des cellules en présence d'un ou de plusieurs constituants d'un groupe composé d'amino-acides, tels que leucine, lysine, arginine ou cystéine; de sels minéraux, tels que chlorures de sodium, de potassium ou calcium, et sulfate de magnésium; des hormones, telles que le LHRH (luteini-zing hormone - releasing hormone), fait accroître encore la production d'hCG.

On peut recueillir facilement l'hCG ainsi obtenue selon des techniques de purification et de séparation comprenant des opérations classiques telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration ou/et lyophilisation. Si on désire une préparation d'hCG plus purifiée, on peut obtenir une préparation d'hCG de pureté maximale par combinaison des techniques précitées avec d'autres opérations classiques, notamment adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique ou/et électrophorèse.

La préparation d'hCG ainsi obtenue peut être utilisée de façon avantageuse seule ou en combinaison avec un ou plusieurs autres agents pour l'administration par injection, par voie externe ou interne, pour la prévention et le traitement de maladies humaines et pour un but de diagnostic.

La production d'hCG dans le milieu de culture a été déterminée selon une méthode radio-immunologique, comme décrit par A.R. Midgley, Jr„ «Endocrinology», vol. 79, pp. 10-18 (1966) et exprimée en unités internationales (UI).

Plusieurs modes de réalisation de l'invention, non limitatifs, sont décrits ci-après.

Exemple 1 :

On met en suspension, dans un récipient, des cellules humaines d'un chorioépithéliome désagrégé obtenues par extraction à un patient atteint de chorioépithéliome et hachage, et des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine Namalwa, avec une solution salée de concentration 140 mmol en NaCl, 54 mmol en KCl, 1 mmol en NaH2P04 et 2 mmol en CaCl2, pour obtenir des concentrations de chaque type cellulaire d'environ 10+ cellules/ml. On mélange la suspension cellulaire, glacée, avec une préparation de la même solution salée, contenant du virus Sendai préalablement inactivé par irradiation aux ultraviolets; on transfère dans une ètuve à 37° C environ 5 min après le mélange et on agite dans l'étuve pendant 30 min, pour obtenir la fusion cellulaire avec introduction de la capacité de production d'hCG des cellules humaines de chorioépithéliome dans la lignée de cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines. Après clonage selon le procédé classique de la souche de cellules d'hybridome capables de produire de l'hCG, on implante la souche de cellules d'hybridome par voie intrapéritonéale, à des souris nues adultes, que l'on alimente de façon habituelle pendant 5 semaines. On extrait les tumeurs massives produites, pesant -environ 15 g chacune, et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée physiologique contenant de la tryp-sine. Après lavage des cellules avec le milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% en volume de sérum de veau fœtal, on remet les cellules en suspension, pour obtenir une concentration d'environ 106 cellules/ml dans une préparation fraîche du même milieu ayant une concentration en L-arginine de 30 mmol, puis on incube à 35' C pendant 20 h pour produire de l'hCG. Ensuite, on soumet les cellules à un traitement par les ultrasons, et l'on détermine l'hCG dans le surnageant. La production d'hCG est d'environ 230 Ul/ml de suspension cellulaire.

Pour produire de l'hCG, on traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantatin des cellules humaines de chorioépithéliome à des souris nues, alimentation des animaux pendant 5 semaines, extraction des tumeurs massives produites, pesant chacune environ 15 g, et désagrégation de ces tumeurs. La production d'hCG n'est que d'environ 20 Ul/ml de suspension cellulaire.

Exemple 2:

Comme dans l'exemple 1, on effectue la fusion de cellules humaine d'adénome chromophobe désagrégé obtenues par extraction d'un patient atteint d'adénome chromophobe de l'hypophyse et hachage, avec la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL, ce qui introduit la capacité de production de l'hCG des cellules humaines d'adénome chromophobe dans la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine. Après clonage par le procédé classique de la souche de cellules d'hybridome capable de produire de l'hCG, on implante la souche de cellules d'hybridome, par voie sous-cutnaée, à des hamsters nouveau-nés auxquels on a préalablement injecté, pour réduire leur réaction immunitaire, un antisérum préparé à partir du lapin selon le procédé classique; on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives, formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune, et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée, physiologique, contenant de la collagénase. Après lavage des cellules avec le milieu essentiel minimal de Eagle (Ph 7,2) additionné de 5% en volume de sérum humain, on remet les cellules en suspension pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 10s cellules/ml dans une préparation fraîche du même milieu de concentration 20 mmol en L-lysine et 10 mmol en sulfate de magnésium, et on incube à 37° C pendant 15 h, pour produire de l'hCG. La production d'hCG est d'environ 450 Ul/ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus, pour produire de l'hCG, des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines d'adénome chromophobe à des hamsters nouveau-nés, alimentation des animaux de

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façon habituelle pendant 3 semaines, extraction des tumeurs massives formées sous la peau, pesant environ 3 g chacune, et désagrégation des tumeurs. La production d'hCG n'est que d'environ 15 Ul/ml de suspension cellulaire.

Exemple 3:

On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine BALL-1, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produire de l'hCG des cellules humaines de chorioépithéliome; les animaux sont alimentés de façon habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives produites, extraites, pèsent environ 30 g chacune; on les désagrège. Les cellules lymphoblastoïdes humaines obtenues sont lavées avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sérum de veau fœtal; on les met en suspension, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 107 cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu ayant une concentration en L-arginine de 30 mmol; on incube à 30°C pendant environ 40 h, pour produire de l'hCG. La production d'hCG est d'environ 870 Ul/ml de suspension cellulaire.

Pour produire de l'hCG, on traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines de chorioépithéliome à des rats nouveau-nés, alimentation des animaux de façon habituelle pendant 4 semaines, extraction des tumeurs massives produites, pesant environ 5 g chacune, et désagrégation des tumeurs. La production d'hCG n'est que d'environ 30 Ul/ml de suspension cellulaire.

Exemple 4:

Après avoir irradié avec les rayons X des souris adultes à raison d'environ 400 rems pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, des cellules de lignées lymphoblastoïde leucémique humaine NALL-1 auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de produire de l'hCG des cellules humaines d'adénome chromophobe, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives formées sous la peau, pesant environ 15 g chacune; on les désagrège et on les traite comme dans l'exemple 2 pour produire de l'hCG. La production d'hCG est d'environ 520 Ul/ml de suspension cellulaire.

Pour produire de l'hCG, on traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation à la souris de cellules humaines d'adénome chromophobe, alimentation des animaux de façon habituelle, pendant trois semaines, extraction des tumeurs massives produites, pesant environ 5 g chacune, et désagrégation des tumeurs massives. La production d'hCG n'est que d'environ 20 Ul/ml de suspension cellulaire.

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Exemple 5:

Des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine TALL-1 auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produire l'hCG des cellules humaines de chorioépithéliome io sont mises en suspension dans une solution salée physiologique. Les cellules sont ensuite transférées dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique de volume intérieur d'environ 10 ml, munie d'une membrane filtrante aux pores d'environ 0,5 um de diamètre. On insère la chambre dans le péritoine d'un rat adulte. On 15 alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines et on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre est d'environ 7 x 108 cellules/ml, ce qui est supérieur d'environ 102 fois ou plus à ce qu'on obtient par culture in vitro avec un incubateur à dioxyde de carbone. On traite les cellules ainsi obtenues comme dans 20 l'exemple 3, pour produire de l'hCG. Cette production est d'environ 750 Ul/ml de suspension cellulaire.

On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par mise en suspension des cellules humaine de chorioépithéliome dans la chambre de diffusion, implantation de la chambre dans le péritoine 25 d'un rat adulte et alimentation de l'animal pendant 4 semaines (la densité des cellules obtenues est d'environ 107 cellules/ml). La production d'hCG n'est que d'environ 20 Ul/ml de suspension cellulaire.

3Q Exemple 6:

On implante dans la cavité allantoïde d'œufs embryonnés, que l'on a préincubés à 37° C pendant 5 d, des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produire de l'hCG des cellu-35 les syncytiotrophoblastiques humaines des villosités choriales. Après incubation des œufs à cette température, pendant encore 1 semaine, on recueille les cellules lymphoblastoïdes humaines multipliées. On traite les cellules comme dans l'exemple 1 pour produire de l'hCG. La production d'hCG est d'environ 210 Ul/ml de suspension cellu-40 laire. Dans une expérience témoin, où on implante de façon semblable dans les cavités allantoïdes d'œufs embryonnés des cellules syncytiotrophoblastiques humaines de villosités choriales, on n'observe pas de multiplication cellulaire.

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Claims

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1. Procédé pour produire de la gonadotrophine chorionique, hCG, qui consiste à multiplier des cellules humaines capables de produire de l'hCG, caractérisé en ce que les cellules sont de la lignée lymphoblastoïde, et leur multiplication est effectuée par leur transplantation dans l'organisme d'un animal à sang chaud ou dans un dispositif dans lequel elles sont alimentées en liquide nutritif par l'organisme d'un animal à sang chaud, et que l'on laisse les cellules lymphoblastoïdes humaines multipliées libérer de l'hCG.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules lymphoblastoïdes humaines sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastoïde humaine et de cellules humaines capables de produire de l'hCG.

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REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la fusion de ladite lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules syncytiotrophoblastiques humaines de villosités choriales.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la fusion de ladite lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules humaines de chorioépithéliome.

5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la fusion de ladite lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules humaines d'adénome chromophobe de l'hypophyse.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poussin ou pigeon, ou un mammifère, notamment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on laisse les cellules lymphoblastoïdes humaines multipliées libérer de l'hCG en présence d'un ou de plusieurs constituants, en particulier des aminoacides, notamment leucine, lysine, arginine ou cystéine; des sels minéraux, particulièrement chlorures de sodium, potassium ou calcium, ou sulfate de magnésium, et des hormones, notamment la LHRH, luteinizing hormone - releasing hormone.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les cellules lymphoblastoïdes humaines sont obtenues par fusion cellulaire avec emploi du virus Sendai ou de polyéthylèneglycol.