CH661745A5

CH661745A5 - Application d'un procede a la production de suppresseur de reponse immunitaire humain.

Info

Publication number: CH661745A5
Application number: CH805/83A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1982-02-12
Filing date: 1983-02-14
Publication date: 1987-08-14
Also published as: KR840003419A; GB2118560A; JPS58138395A; GB8303870D0; GB2118560B; FR2521588A1; IT8347689A0; FR2521588B1; JPH0214038B2; IT1167074B; KR900005860B1

Description

La présente invention concerne une application d'un procédé de production d'une substance biologiquement active, en particulier de Suppresseur de Réponse Immunitaire Humain, ci-après désigné en abrégé par SRIH, dont l'utilisation en pharmacologie s'avère prometteuse.

SRIH désigne un Suppresseur de Réponse Immunitaire Humain provenant de cellules humaines viables. Ainsi qu'il est décrit par Cari Waltenbaugh dans «Biology of the Lymphokines», pp. 422-427 (1979), publié par Academic Press, Inc. (New York), le Suppresseur de Réponse Immunitaire (SRI) est une substance protéinique trouvée dans le fluide corporel, qui inhibe la réponse immunitaire non spécifique des espèces, indépendamment du type d'antigène. On a donc pensé que SRI serait un agent prophylactique ou thérapeutique contre l'hypersensibilité, par exemple l'allergie, le choc anaphylactique ou l'hyper-auto-immunisation, ainsi que contre le rejet lors de transplantations de tissus ou d'organes. Bien que la non-spécificité vis-à-vis des espèces de SRI suggère la possibilité d'utiliser des SRI d'origines non humaines, pour le traitement de maladies de l'homme, le SRIH provenant de cellules humaines viables s'avère sûr et excellent en raison de son moindre pouvoir antigénique. Cependant, il n'existe pas à ce jour de production à l'échelle industrielle de SRIH permettant la prévention ou le traitement des maladies de l'homme.

La présente invention permet de remédier à cet inconvénient de l'art antérieur et d'obtenir, à l'échelle industrielle et à faible coût, des cellules humaines capables de produire du SRIH à titre élevé, grâce à un procédé efficace de multiplication de ces cellules, et avec un rendement plus élevé de SRIH par cellule, éventuellement par hybridation cellulaire.

L'invention concerne donc l'application du procédé qui consiste à transplanter des cellules humaines dans un animal à sang chaud ou dans un dispositif dans lequel circule le fluide nutritif corporel d'un animal à sang chaud et à laisser ces cellules se multiplier in vivo dans l'animal ou dans le dispositif. Il est caractérisé en ce que, pour produire le SRIH, les cellules humaines sont des cellules capables de 5 produire du SRIH, et en ce que l'on laisse les cellules multipliées libérer ce facteur par leur culture in vivo dans un milieu nutritif, éventuellement en présence d'un inducteur de SRIH.

De préférence, ce procédé consiste à transplanter des cellules humaines, capables de produire du SRIH dans un animal à sang io chaud, à nourrir cet animal, afin que les cellules humaines puissent utiliser son fluide corporel nutritif pour leur multiplication, à extraire et à désagréger la tumeur résultante qui se forme chez l'animal pour obtenir les cellules humaines multipliées, à cultiver ces cellules in vitro dans un milieu nutritif en présence éventuellement d'un in-15 ducteur de SRIH, pendant une durée suffisante pour accumuler une quantité sensible de SRIH, et à récolter ce dernier accumulé dans la culture. On peut également placer une suspension de cellules humaines, capables de produire du SRIH, dans une chambre de diffusion de type classique, conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif 20 d'un animal à sang chaud, placer sur ou inclure dans cet animal ladite chambre, nourrir l'animal afin de permettre aux cellules humaines d'utiliser son fluide corporel pour leur multiplication, recueillir dans la chambre les cellules humaines multipliées, les cultiver in vitro, éventuellement en présence d'un inducteur de SRIH 25 pendant une durée suffisante, pour accumuler une quantité sensible de SRIH, puis récolter le SRIH accumulé dans la culture.

On constate que la production de SRIH est bien supérieure si l'on utilise des cellules humaines, obtenues par multiplication in vivo à l'aide d'un animal à sang chaud des cellules humaines capables de 30 produire SRIH, au lieu d'employer les mêmes cellules multipliées in vitro. Contrairement aux procédés classiques de culture de tissus in vitro, le procédé utilisant le mode opératoire in vivo ne nécessite que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux et rend plus facile le maintien du milieu de culture pendant la multiplication 35 cellulaire, tout en produisant du SRIH à un titre beaucoup plus élevé.

En outre, le procédé diffère des procédés classiques de multiplication cellulaire in vitro par les caractéristiques suivantes: multiplication cellulaire beaucoup plus stable et rapide, production cellulaire 40 supérieure et production bien supérieure de SRIH par cellule.

Les cellules humaines, utilisées selon l'invention, sont des cellules qui produisent une quantité sensible de SRIH et qui sont capables de se multiplier dans un animal à sang chaud, lorsqu'on les y transplante: conviennent par exemple des cellules humaines normales, 45 comme celles du sang périphérique, de la rate et des amygdales; des cellules obtenues par transformation de cellules humaines normales à l'aide de radiations ou de virus carcinogènes; des cellules humaines provenant de tumeurs ou d'abcès tonsillaire, de carcinome du foie ou du poumon, de tumeur de la rate, ainsi que des lignées de cellules so établies des cellules humaines ci-dessus. On peut utiliser, conformément à l'invention, des lignées de cellules humaines connues, comme Ad-L, HL-4, L 84-Ly, NPC-501, et HB-7, ainsi qu'il est décrit dans «The Tissue Culture», vol. 6, pp. 527-546 (1980). Un taux de multiplication cellulaire très supérieur peut être atteint par l'utilisation, à 55 la place des cellules humaines décrites plus haut, d'une lignée de lymphoblastoïdes humains, qui peut beaucoup plus facilement être soumise à un repiquage et dans laquelle peuvent être introduits des gènes humains codant la production de SRIH, au moyen d'une technique de fusion cellulaire utilisant du polyéthylène glycol ou du virus 60 de Sendaï, ou par une technique de recombinaison génétique utilisant de la nucléase, ligase et ADN polymérase.

On a ainsi une production plus élevée de SRIH par cellule, notamment environ 2 à 10 fois supérieure à celle que l'on obtient lors de l'utilisation des cellules normales ou tumorales, décrites plus 65 haut.

La transplantation de ces lignées de lymphoblastoïdes humains dans un animal conduit à la formation de tumeurs qui ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal. De plus, leur post-

extraction et désagrégation est très facile, et la récolte des cellules humaines viables peut s'effectuer aisément. A ces fins conviennent des lignées connues de lymphoblastoïdes humains, de la leucémie ou du lymphome, par exemple Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 et JBL.

Comme animaux à sang chaud, utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut prendre tout animal, pourvu que les lignées cellulaires se développent dans son organisme. Par exemple on peut utiliser des volailles comme poulets et pigeons, ou des mammifères tels que chien, chat, singe, porc, cheval, lapin, vache, cobaye, rat nu, hamster, souris ou souris nue.

Comme la transplantation des cellules humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal très jeune, nouveau-né ou au stade le plus précoce possible, par exemple d'œuf, d'embryon ou de fœtus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'animal, avant la transplantation cellulaire, par irradiation avec des rayons X ou y à raison d'environ 200 à 600 rems ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppresseur. Comme la souris nue ou le rat nu utilisé comme animal hôte présente une réaction immunitaire plus faible, même à l'état adulte, on peut de façon pratique lui transplanter des lignées cellulaires humaines établies, pour qu'elles se multiplient rapidement, sans qu'un prétraitement soit nécessaire.

On peut effectuer la multiplication cellulaire stabilisée et l'accroissement de la production de SRIH par transplantation répétée avec une combinaison de différents animaux à sang chaud; par exemple on peut atteindre les objectifs visés en implantant d'abord les cellules humaines à des hamsters, puis en réimplantant les cellules ainsi multipliées à des souris nues. Dans ce cas la transplantation répétée peut avoir lieu avec des animaux à sang chaud de la même classe ou du même groupe, de la même espèce ou du même genre.

On peut implanter les cellules humaines en un site quelconque de l'animal, pourvu qu'elles s'y multiplient; par exemple on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoïque, par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

Au lieu de transplanter dans l'animal des cellules humaines, on peut faire facilement se multiplier l'une des cellules humaines décrites précédemment, en la plaçant dans une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10~7 à 10-5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal hôte et permettant l'apport du liquide nutritif de l'organisme de l'animal aux cellules humaines. Cette chambre est incluse, par exemple par voie intrapéritonéale,

dans l'animal; on laisse les cellules humaines s'y multiplier en utilisant le fluide corporel nutritif fourni par l'animal. En outre, la chambre de diffusion peut être conçue pour être placée par exemple sur l'animal, de telle manière que le fluide nutritif de l'organisme et la solution nutritive puissent circuler librement dans la chambre. De cette manière, on peut observer la culture dans la chambre, pendant la multiplication cellulaire, par une ou plusieurs fenêtres latérales transparentes, prévues sur les parois de la chambre, et/ou on peut remplacer cette chambre par une chambre neuve, à la fois pour poursuivre la multiplication cellulaire pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier celui-ci, et pour augmenter encore plus la production cellulaire par animal. De plus, par l'utilisation d'une telle chambre de diffusion, l'absence de contact direct des cellules humaines transplantées avec les cellules de l'animal hôte a pour résultat de ne pas provoquer de réaction immunitaire, si bien que l'on peut employer divers animaux à sang chaud, comme hôtes, sans avoir à effectuer un prétraitement pour réduire leurs réactions immunitaires, et l'on peut recueillir facilement les cellules humaines multipliées, viables.

On peut alimenter l'animal hôte de façon classique même après la transplantation cellulaire, et aucun soin particulier n'est nécessaire.

La multiplication des cellules atteint généralement un maximum 1 à 20 semaines après la transplantation. Lorsque les cellules humai-

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nés, transplantées à l'animal hôte, sont d'origine tumorale ou lym-phoblastoïde, on peut obtenir leur multiplication maximale 1 à 5 semaines après la transplantation.

Le nombre de cellules humaines ainsi obtenues par hôte est d'en-5 viron 101 à 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre de cellules humaines, transplantées à l'animal, s'accroît d'environ 102 à107 fois ou plus: cela représente environ 10 à 106 fois plus par rapport à ce que l'on obtient par la méthode de multiplication du milieu nutritif in vitro. Les cellules humaines obtenues peuvent donc être avanta-io geusement utilisées pour la production de SRIH.

La génération cellulaire des cellules humaines, ainsi multipliées, peut être réglée en soumettant ces cellules à une culture tissulaire in vitro de 1 à 4 jours, avant de les soumettre au stade d'introduction décrit ci-après.

15 Conformément à l'invention, on peut utiliser pour produire SRIH tout procédé permettant d'induire cette production dans les cellules humaines multipliées; par exemple on met en suspension dans un milieu nutritif préchauffé entre 20 et 40; C environ des cellules humaines, obtenues par multiplication en suspension dans le 20 liquide d'ascite et par récolte dans ce liquide, ou par extraction d'une tumeur massive, formée sous la peau, puis par récolte après désagrégation de la tumeur, pour obtenir une concentration d'environ 104 à 108 cellules/ml; on met ensuite à incuber à la même température pour produire du SRIH. Les cellules humaines peuvent alors 25 être exposées à l'action d'un inducteur, afin d'augmenter encore la production de SRI.

Conviennent comme inducteurs ceux qui suscitent la production de SRIH par les cellules humaines multipliées dans le corps d'un animal à sang chaud; on peut utiliser, par exemple, des mitogènes 30 comme phytohémoagglutinine, concanavaline A, lipopolysaccha-ride, endotoxine, Polysaccharide, bactérie, virus, acide nucléique, ou un mitogène végétal («pokeweed»).

Le milieu de culture peut également, pendant la production de SRIH, être additionné avec un agent de stabilisation du SRIH 35 formé, qui augmente encore la production de celui-ci.

On peut facilement recueillir SRIH, à partir de la culture, par des techniques de purification et de séparation utilisant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et/ou lyophilisation. Si l'on désire une préparation 40 plus purifiée, on peut y arriver en combinant les opérations précitées avec une ou plusieurs autres, telles qu'adsorption et désorption, avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et/ou électrophorèse.

SRIH selon l'invention peut être avantageusement utilisé isolé-45 ment ou en combinaison avec un ou plusieurs agents comme vitamine, hormone, agent carcinostatique, par administration par voie interne ou injection, pour la prévention ou le traitement de maladies humaines.

Dans la présente invention, les titres de SRIH sont déterminés 50 par le procédé mentionné par Robelt R. Rieh et Carl W. Pierce dans «Journal of Immunology», vol. 112, pp. 1360-1368 (1974), avec de légères modifications, et sont exprimés en la quantité qui supprime la réponse des cellules formant des plaques; des portions de 1 ml d'une suspension cellulaire contenant 1 x 107 cellules de rate prove-55 nant de souris C 57BL/6 sont placées dans des boîtes de Pétri et sont additionnées chacune avec des portions de 0,1 ml de préparation de SRIH d'une série de dilutions. Les mélanges dans les boîtes de Pétri sont mis à incuber pendant un certain temps, puis on compte les plaques formées au cours de cette incubation. Le titre en SRIH cor-60 respond à la dilution pour laquelle on obtient une réduction de plaques de 50%.

Plusieurs modes de réalisation de l'invention sont décrits ci-après, qui toutefois n'en limitent pas la portée.

65 Exemple 1

On transplante par voie sous-cutanée chez des souris nues, adultes, une lignée adénoïde humaine Ad-L, et les animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 semaines. Cette transplanta

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tion cellulaire et l'alimentation poursuivie des animaux aboutissent à la formation de tumeurs massives sous-cutanées de 12 g chacune environ, qui sont ensuite extraites, hachées et désagrégées par mise en suspension dans une solution physiologique renfermant de la trypsine.

Les cellules humaines sont ensuite lavées avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum (pH 7,2) et mises en suspension dans du milieu frais de composition identique, de manière à avoir une concentration de l'ordre de 1 x 106 cellules/ml. A cette suspension cellulaire, on ajoute de la concanavaline A à raison de 1 (J-g/ml, et l'on fait incuber ce mélange à 37° C pendant 20 heures, afin d'induire la production de SRIH. La culture est centrifugée à 8000 tours/minute pendant 30 minutes et le titre en SRIH de la partie surnageante est déterminé comme décrit plus haut. La production est de l'ordre de 2400 unités/0,1 ml de culture.

L'expérimentation témoin se déroule comme suit: la lignée adénoïde humaine Ad-L est cultivée in vitro dans du milieu de Eagle (pH 7,2), additionné de 1 % en volume/volume de sérum fœtal de veau et 20% en volume/volume d'extrait de viande, en vue de sa multiplication, puis on traite comme plus haut pour induire la production de SRIH. Cette production dans la culture résultante n'est que de 90 unités/0,1 ml environ.

Exemple 2

On met en suspension ensemble des cellules de tumeur désagrégée de rate humaine, obtenues par extraction et hachage de tissu tumoral provenant d'un patient, et une lignée lymphoblastoïde, humaine, Namalwa, dans une solution salée contenant 140 mM NaCl, 54 mM KCl, 1 mM en NaH2P04 et 2 mM CaCl2, pour obtenir une concentration de chaque type de cellules d'environ 1000 cellules/ml. On ajoute à la suspension cellulaire, en refroidissant par de la glace, une préparation fraîche de la solution salée de même composition, contenant du virus Sendaï préalablement inactivé par irradiation aux ultraviolets; on transfère dans une étuve à 37° C au bout de 5 minutes après le mélange et on agite pendant 30 minutes pour effectuer la fusion cellulaire et introduire la capacité de production de SRIH des cellules humaines de la tumeur splénique dans les cellules de Namalwa.

Les cellules de Namalwa hybrides résultantes sont alors transplantées par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes que l'on nourrit de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, formées intrapéritonéalement et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire du SRIH, à ceci près que la concanavaline A est remplacée par environ 10 |ig/ml de phytohémagglutinine.

La production de SRIH est de l'ordre de 12 800 unités/0,1 ml de culture.

Le témoin dans lequel les cellules hybridées sont cultivées in vitro pour leur multiplication, puis traitées comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH, ne donne qu'environ 400 unités de SRIH par 0,1 ml de culture.

Exemple 3

Après avoir injecté à des hamsters nouveau-nés un antisérum préparé à partir du lapin, selon un procédé classique, pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux par voie sous-cutanée des cellules de la lignée lymphoblastoïde, humaine hybridée, JBL auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production du SRIH, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant environ 18 g chacune; les cellules sont traitées comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH, à ceci près que le milieu RPMI 1640, exempt de sérum, est remplacé par du milieu de Eagle (pH 7,2) additionné de 20% en volume/volume d'extrait de viande.

La production de SRIH est de l'ordre de 8500 unités/0,1 ml de culture.

Le témoin, dans lequel les cellules hybridées JBL sont cultivées in vitro pour leur multiplication, puis sont traitées comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH, ne donne qu'environ 240 unités de SRIH/0,1 ml de culture.

Exemple 4

On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés une lignée de lymphoblastoïdes hybrides, humains, BALL-1, auxquels on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de SRIH, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives résultantes, pesant environ 35 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 2 pour produire du SRIH.

La production de SRIH est de l'ordre de 9400 unités/0,1 ml de culture.

Le témoin dans lequel les cellules BALL-1 hybridées sont cultivées in vitro pour leur multiplication, puis traitées comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH, ne donne qu'environ 350 unités/de SRIH par 0,1 ml de culture.

Exemple 5

Après avoir irradié des rats adultes avec un équivalent de dose de rayons y d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on implante aux animaux par voie sous-cutanée une lignée de cellules provenant de nodosités lymphatiques humaines, HL-4, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines.

Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 3 pour induire la production de SRIH. Cette production est de l'ordre de 3600 unités/0,1 ml de culture.

Le témoin pour lequel la lignée cellulaire humaine est cultivée in vitro pour sa multiplication, puis est abandonnée pour laisser le SRIH se libérer, ne donne qu'environ 30 unités de SRIH/0,1 ml de culture.

Exemple 6

Une lignée de lymphoblastoïdes humains, Ad-L, est mise en suspension dans du sérum physiologique, dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique, ayant un volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membrane filtrante dont les pores ont environ 0,5 |xm de diamètre. Après inclusion intrapéritonéale de la chambre à un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines, puis on retire la chambre et on recueille les cellules humaines. La densité des cellules humaines dans la chambre atteint jusqu'à environ 109 cellules/ml, ce qui est environ 100 fois supérieur à ce que l'on obtient par culture de tissu in vitro, avec un incubateur à C02.

Les cellules humaines sont traitées comme dans l'exemple 3 pour induire la production de SRIH, qui est d'environ 4200 unités/0,1 ml de culture.

Exemple 7

On implante dans les cavités allantoïques d'œufs embryonnés, préincubés à 37° C pendant 5 jours, une lignée de lymphoblastoïdes humains, hybrides, BALL-1, auxquels on a conféré comme dans l'exemple 4 la capacité de production de SRIH. Après incubation des œufs à cette température pendant encore une semaine, on récolte les cellules humaines multipliées et on les traite comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH. Cette production est de l'ordre de 3200 unités/0,1 ml de culture.

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1. Application du procédé qui consiste à transplanter des cellules humaines dans un animal à sang chaud ou dans un dispositif dans lequel circule le fluide nutritif corporel d'un animal à sang chaud et à laisser ces cellules s'y multiplier, caractérisée en ce que, pour produire le Suppresseur de Réponse Immunitaire Humain (SRIH), les cellules choisies sont des cellules humaines capables de produire le SRIH, et en ce que l'on laisse les cellules multipliées libérer ce facteur par leur culture in vitro dans un milieu nutritif.

2. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines, capables de produire du SRIH, sont des cellules normales, provenant de préférence du sang périphérique, de la rate ou de l'amygdale, ou des cellules normales transformées.

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REVENDICATIONS

3. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines capables de produire le SRIH sont des cellules provenant de tumeurs ou d'abcès tonsillaire ou splénique, ou de carcinome du foie ou du poumon.

4. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines sont des cellules hybrides, auxquelles on a conféré l'aptitude à produire le SRIH.

5. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines sont des cellules hybrides de lymphoblastoïdes humains avec une des cellules selon la revendication 3.

6. Application selon la revendication 5, caractérisée en ce que les cellules lymphoblastoïdes humaines sont des cellules de la lignée de Namalwa, de BALL-1, de NALL-1, de TALL-1 ou de JBL.

7. Application selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les cellules multipliées sont soumises à l'action d'un inducteur de SRIH, pour favoriser la production de celui-ci.

8. Application selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'inducteur est un mitogène, un virus ou un acide nucléique.