CH652745A5

CH652745A5 - Procede pour la production d'hormone adrenocorticotrope humaine.

Info

Publication number: CH652745A5
Application number: CH7889/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-12-13
Filing date: 1981-12-10
Publication date: 1985-11-29
Also published as: IT8149852A1; GB2091741B; FR2495938B1; FR2495938A1; JPS5799526A; KR860001591B1; JPS6045850B2; IT8149852A0; GB2091741A; IT1195331B; KR830007090A

Description

La présente invention concerne un procédé pour la production d'hormone adrénocorticotrope humaine, hACTH.

Cette hormone, désignée aussi par l'abréviation hACTH, est une hormone sécrétée par le lobe antérieur de l'hypophyse, qui stimule la synthèse des hormones stéroïdes et la sécrétion de l'insuline humaine.

Le titulaire a étudié des procédés pour la production en masse de l'hACTH. Ces efforts ont conduit à la découverte inattendue que des cellules lymphoblastoïdes humaines capables de produire cette hormone conviennent à la production massive de l'hACTH, en raison des valeurs très élevées de leur vitesse de multiplication et de leur production d'hACTH par cellule.

Le procédé mentionné au début est donc caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendications 1.

Le procédé selon l'invention, en plus d'une production accrue d'hACTH, ne nécessite pas ou nécessite bien moins de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire; il rend l'entretien de l'équilibre du milieu du culture, pendant la multiplication cellulaire, bien plus facile que dans le cas des cultures de tissu in vitro. En particulier, on peut faire se multiplier facilement toute cellule lymphoblastoïde humaine capable de produire de l'hACTH, en utilisant un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par transplantation des cellules dans l'organisme de l'animal ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion classique conçue pour recevoir le liquide nutritif de l'organisme, l'animal étant nourri de façon habituelle. En outre, le procédé donne en plus une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, avec une production accrue d'hACTH par cellule.

L'invention concerne en plus un procédé selon le préambule de la revendication 5, ledit procédé étant caractérisé par la partie caractérisante de cette revendication.

En ce qui concerne les cellules lymphoblastoïdes humaines utilisables, on peut prendre des cellules lymphoblastoïdes quelconques, pourvu qu'elles produisent de l'hACTH et qu'elles se multiplient dans l'organisme de l'animal à sang chaud. Les cellules lymphoblastoïdes humaines que l'on préfère sont celles dans lesquelles on a introduit les sites génétiques, commandant la production d'hACTH, des cellules humaines capables de produire cette hormone, par exemple des cellules produisant naturellement de l'hACTH, telles que celles du lobe antérieur de l'hypophyse, des cellules de tumeur hypophysaire ou de l'adénome chromophobe, ou d'autres cellules humaines qui produisent de l'hACTH ectopique, telles que les cellules de carcinome du pancréas atteignant les îlots de Langerhans, ou de cellules de carcinome pulmonaire. L'introduction peut se faire par fusion cellulaire utilisant du polyéthylèneglycol ou le virus Sendaï, ou bien selon une technique de recombinaison génétique avec de l'ADN-ligase, une nucléase et l'ADN-polymérase, ou par des cellules lymphoblastoïdes humaines produisant de l'hACTH ectopique.

Comme l'emploi des cellules lymphoblastoïdes humaines provoque la formation d'une tumeur massive facile à désagréger lorsqu'on transplante les cellules dans l'organisme d'un animal à sang chaud et que la tumeur massive est difficilement contaminée par les cellules de l'animal hôte, les cellules lymphoblastoïdes humaines vivantes multipliées peuvent être facilement récoltées.

En tant qu'animaux à sang chaud, on peut utiliser tout animal dans la mesure où les cellules lymphoblastoïdes humaines se développent dans son organisme. Par exemple, on peut employer avantageusement des volatiles, tels que poulet ou pigeon, et des mammifères, tels que chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme la transplantation des cellules lymphoblastoïdes humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal nouveau-né ou très jeune, de préférence au stade le plus précoce possible, par exemple d'oeuf, d'embryon ou de fœtus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'animal avant la transplantation cellulaire par irradiation avec des rayons X ou y à raison d'environ 200 à 600 rems ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, lorsqu'on l'utilise comme animal à sang chaud, présente une réaction immunitaire plus faible même à l'état adulte, on peut de façon pratique lui transplanter toutes lignées lymphoblastoïdes humaines, pourvu qu'elles se multiplient rapidement, sans qu'un prétraitement soit nécessaire.

On peut effectuer la multiplication cellulaire stabilisée et l'accroissement de la production d'hACTH par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'animaux à sang chaud différents; on peut atteindre les objectifs visés en implantant tout d'abord les cellules lymphoblastoïdes humaines à des hamsters, pour qu'elles se multiplient, puis en les réimplantant à des souris nues. On peut effectuer la transplantation répétée avec des animaux de la même classe ou du même groupe ou de la même espèce ou du même genre.

On peut implanter les cellules lymphoblastoïdes humaines en un site quelconque de l'animal à la seule condition qu'elles s'y multiplient: par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoïque ou par voies intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

En dehors de la transplantation cellulaire directe dans l'organisme d'un animal, on peut faire se multiplier des lignées lympho-

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blastoïdes humaines classiques quelconques capables de produire de l'hACTH, en utilisant le liquide nutritif fourni par l'organisme d'un animal à sang chaud, par inclusion, par exemple par voie intrapéri-tonêale, dans l'organisme de l'animal d'une chambre de diffusion classique de forme et de taille appropriées munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10~ à 10~ m de diamètre empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal hôte. Comme la chambre de diffusion peut, si nécessaire, être conçue pour pouvoir être placée par exemple sur le corps de l'animal hôte et permettre la circulation du liquide de l'animal dans la chambre, l'observation de la suspension cellulaire contenue dans la chambre par une ou par plusieurs fenêtres latérales transparentes dont sont munies une ou plusieurs parois de la chambre et le remplacement et l'échange avec une chambre neuve, la production cellulaire par hôte peut être accrue pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit aucunement nécessaire de sacrifier celui-ci. De plus, lorsqu'on utilise une telle chambre de diffusion, comme il ne se produit pas de réaction immunitaire grâce à l'absence de contact direct des cellules humaines avec les cellules de l'animal hôte, on peut employer divers animaux à sang chaud comme hôtes, sans effectuer un prétraitement pour réduire leurs réactions immunitaires, et on peut récolter facilement les cellules lymphoblastoïdes humaines multipliées.

On peut facilement nourrir l'animal hôte, auquel on a implanté les cellules lymphoblastoïdes humaines à la manière habituelle,

même après la transplantation cellulaire, et aucun soin particulier n'est nécessaire.

La multiplication des cellules atteint généralement un maximum en 1 à 20 semaines après la transplantation cellulaire. Le nombre des cellules lymphoblastoïdes humaines obtenues par hôte peut être compris entre environ IO7 et 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre des cellules lymphoblastoïdes humaines implantées dans l'organisme de l'animal s'accroît d'environ 102 à 107 fois ou plus ou d'environ 10 a 106 fois ou plus par rapport à ce que l'on obtient par la méthode de culture tissulaire in vitro avec un milieu nutritif; donc, les cellules lymphoblastoïdes humaines conviennent à la production d'hACTH.

Pour l'induction de l'hACTH, on peut utiliser tout procédé dans lequel les cellules lymphoblastoïdes humaines obtenues libèrent cette hormone. Par exemple, on met en suspension les cellules lymphoblastoïdes humaines obtenues par la multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et par la récolte dans ce liquide d'ascite, ou par l'extraction de la tumeur massive formée sous la peau, et par la récolte après désagrégation de la tumeur massive, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 104 à 10s cellules/ml dans un milieu nutritif préchauffé à une température d'environ 20 à 40° C; puis on les soumet à l'action d'un inducteur d'hormone adrénocorticotrope à cette température, pendant environ 1 à 50 h, pour induire la production de cette hormone.

Comme inducteurs utiles d'hormone adrénocorticotrope, on peut employer tout inducteur capable d'induire la libération de cette hormone par les cellules lymphoblastoïdes humaines. Les inducteurs d'hormone adrénocorticotrope que l'on préfère sont la Vasopressine, le méthylnitrate d'atropine, l'insuline, le glucagon, une endotoxine bactérienne, la serotonine et le propanolol.

Le titulaire a découvert qu'après l'induction de l'hACTH une forte quantité d'hormone humaine stimulante de mêlanocyte, désignée ci-après par l'abréviation hMSH, et de lipotropine humaine hLPH, est produite simultanément.

On peut facilement recueillir l'hACTH, l'hMSH et l'hLPH selon des techniques de purification et de séparation utilisant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifuga-tion, concentration et lyophilisation. Si une préparation plus purifiée est souhaitable, on peut l'obtenir en combinant les techniques précitées à d'autres opérations classiques, telles qu'adsorption et désorp-tion avec échange ionique, filtration sur gel, Chromatographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.

La préparation d'hACTH ainsi obtenue peut être utilisée de façon avantageuse isolément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents pour l'administration par injection, par voie externe, par voie interne ou dans un but de diagnostic dans la prévention et le traitement de maladies humaines, telles que l'insuffisance hypophysäre.

Dans la présente description, la production d'hACTH est déterminée selon une méthode radio-immunologique, comme décrit par S. Matsukura et coll. dans «J. Lab. Clin. Med.», vol. 77, pp.490-500 (1971); elle est exprimée en poids par millilitre de suspension cellulaire.

Egalement les productions d'hMSH et d'hLPH sont déterminées par une méthode radio-immunologique, comme décrit par K. Abe et coll. dans «J. Clin. Invest.», vol. 46, pp. 1906-1916 (1967). On détermine tout d'abord la quantité totale des hormones avec un standard de ß-MSH humaine, puis on calcule le rapport pondéral des hormones à partir des quantités de ß-MSH et de ß-LPH humaines, isolées par filtration sur gel.

Des modes de réalisation de l'invention sont décrits ci-après.

Exemple 1:

On met en suspension ensemble des cellules humaines de carcinome pulmonaire obtenues par extraction à un malade atteint de carcinome pulmonaire, suivie de hachage, et des cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de la lignée Namalwa dans un récipient avec une solution salée 140 mmol en NaCl, 54 mmol en KCl, 1 mmol en NaH2P04 et 2 mmol en CaCl2, pour obtenir des concentrations de chaque type cellulaire d'environ 101 cellules/ml. On mélange la suspension cellulaire glacée avec une préparation fraîche de la même solution salée contenant du virus Sendaï préalablement inactivê par irradiation par les ultraviolets; le tout est placé dans une étuve à 37° C pour 5 min, après le mélange, puis agité pendant 30 min pour effectuer la fusion cellulaire; la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines de carcinome pulmonaire est ainsi introduite dans la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine. Après clonage, par un procédé classique, de la souche de cellules d'hybridome capable de produire de l'hACTH, on implante cette souche à des souris nues adultes que l'on alimente ensuite de façon habituelle pendant 5 semaines. On extrait les tumeurs massives formées sous la peau, pesant chacune environ 15 g, et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée physiologique contenant de la trypsine. Après lavage des cellules avec le milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% en volume de sérum de veau fœtal, on remet les cellules en suspension, à une concentration d'environ 10° cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu contenant 0,1 (ig de glucagon/ml comme inducteur, puis on incube 35° C pendant 20 h pour induire la production des hormones. Ensuite, on soumet les cellules à un traitement par les ultrasons et on détermine l'hACTH, l'hMSH et l'hLPH dans le surnageant.

La production d'hACTH est de 250 ng/ml de suspension cellulaire, celle de l'hMSH de 580 jig/ml et celle de l'hLPH de 40 ng/ml.

Des cellules témoins sont obtenues par implantation de cellules humaines de carcinome pulmonaire à des souris nues adultes, par alimentation des animaux de façon habituelle pendant 5 semaines, par extraction des tumeurs massives formées sous la peau et pesant environ 5 g chacune et par désagrégation de ces tumeurs. Ces cellules témoins obtenues sont traitées comme ci-dessus pour induire la production d'hormones. La production d'hACTH n'est alors que de 600 ng/ml de suspension cellulaire, celle de l'hMSH de 1,2 |xg/ml et celle de l'hLPH de 350 ng/ml.

Exemple 2:

Comme dans l'exemple 1, on effectue la fusion de cellules humaines d'adénome chromophobe, obtenues par extraction à un malade atteint d'adénome chromophobe de l'hypophyse et par hachage,

avec des cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de la lignée JBL pour introduire la capacité de production de l'hACTH

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des cellules humaines d'adénome chromophobe dans la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine. Après clonage, par un procédé classique, de la souche de cellules d'hybridome capables de produire de l'hACTH, on implante ces cellules d'hybridome par voie sous-cutanée à des hamsters nouveau-nés, auxquels on a préalablement injecté un antisérum préparé sur le lapin pour réduire leurs réactions immunitaires; on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune, on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée physiologique contenant de la collagénase. Après lavage des cellules avec du milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,2) additionné de 5% en volume de sérum humain, on remet les cellules en suspension, à une concentration d'environ 10s cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu contenant 3 |iU de vasopressine/ml comme inducteur; on incube à 37° C pendant 15 h pour induire la production des hormones. La production déterminée comme dans l'exemple 1 est pour l'hACTH de 380 ng/ml de suspension cellulaire, pour l'hMSH de 740 ng/ml et pour l'hLPH de 510 fj.g/ml.

On traite de façon semblable, pour induire la production d'hormones, les cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines d'adénome chromophobe à des hamsters nouveau-nés, par alimentation des animaux de façon habituelle pendant 3 semaines, par extraction des tumeurs massives formées sous la peau et pesant environ 3 g chacune et par désagrégation de ces tumeurs. La production d'hACTH par millilitre n'est que de 750 ng/ml, celle de l'hMSH de 560 ng et celle de l'hLPH de 430 ng.

Exemple 3:

On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés des cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de la lignée Ball-1, auxquelles on a conféré la capacité de production de l'hACTH de cellules humaines de carcinome humain, comme dans l'exemple 1 ; on alimente les rats de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait et désagrège les tumeurs massives formées pesant environ 30 g chacune. Après lavage avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sérum de veau fœtal, on remet les cellules en suspension, à une concentration d'environ 107 cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu 6 mmol en sérotonine (inducteur), puis on incube à 30° C pendant environ 40 d. La production d'hACTH est de 730 )ig/ml de suspension cellulaire et celle de l'hMSH de 940 |ig/ml.

On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation de cellules humaines de carcinome pulmonaire à des rats nouveau-nés, par alimentation des animaux de façon habituelle pendant 4 semaines, par extraction des tumeurs massives formées pesant environ 5 g chacune et par désagrégation de ces tumeurs. La production d'hACTH n'est alors que de 650 ng/ml de suspension cellulaire et celle de l'hMSH de 1,8 |o.g/ml.

Exemple 4:

Après avoir irradié des souris adultes avec un équivalent de dose de rayons X d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on implante aux animaux par voie sous-cutanée des cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de lignée Nall-1, auxquelles on a conféré la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines d'adénome chromophobe, comme dans l'exemple 2, et on les alimente de façon habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune sont extraites et désagrégées. On traite les cellules comme dans l'exemple 2 pour induire la production d'hormone. La production d'hACTH est de 480 ng/ml de suspension cellulaire et celle de l'hLPH de 350 ng/ml.

On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines d'adénome chromophobe à la souris. L'alimentation des animaux a lieu de façon habituelle pendant 3 semaines, après quoi on procède à l'extraction des tumeurs massives formées pesant environ 5 g chacune et à la désagrégation de ces tumeurs. La production d'hACTH n'est que de 520 ng/ml de suspension cellulaire, celle de l'hLPH est de 790 ng/ml.

Exemple 5:

On met en suspension, dans une solution salée physiologique, des cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de la lignée Tall-1, auxquelles on a conféré la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines de carcinome pulmonaire, de la même façon que dans l'exemple 1 ; la solution est introduite dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique de volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5 nm. Après inclusion de la chambre dans le péritoine d'un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines, puis on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre obtenues dans l'opération ci-dessus est d'environ 7 x 108 cellules/ml, ce qui est environ au moins 102 fois supérieur à ce que l'on obtient par culture in vitro avec un incubateur à C02. On traite les cellules humaines ainsi obtenues comme dans l'exemple 3 pour induire la formation d'hormones. La production d'hACTH est de 280 ng/ml de suspension cellulaire, celle de l'hMSH de 770 ng/ml et celle de l'hLPH de 160 ng/ml.

On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par mise en suspension de cellules humaines de carcinome pulmonaire dans une solution salée physiologique, par transfert de la suspension cellulaire obtenue dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique ayant un volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5 nm, par inclusion de la chambre dans le péritoine d'un rat adulte, par alimentation de l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines et par récolte des cellules humaines multipliées, soit environ 107 cellules/ml. La production d'hACTH n'est que de 480 ng/ml de suspension cellulaire, celle de l'hMSH de 2,3 ng/mlet celle de l'hLPH de 250 ng/ml.

Exemple 6:

On implante dans les cavités allantoïques d'œufs embryonnés préincubés à 37° C pendant 5 d des cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de la lignée JBL, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines de carcinome pulmonaire. Après incubation des œufs à cette température pendant encore 1 semaine, on recueille les cellules lymphoblastoïdes humaines multipliées. On traite ces cellules comme dans l'exemple 2 pour induire la production d'hACTH. La production d'hACTH est de 520 ng/ml de suspension cellulaire.

Dans une expérience témoin, où l'on implante les cellules humaines de carcinome pulmonaire dans les cavités allantoïques d'œufs embryonnés, on n'observe pas de multiplication cellulaire.

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1. Procédé pour la production de l'hormone adrénocorticotrope humaine, hACTH, caractérisé en ce qu'il consiste à faire se multiplier des cellules lymphoblastoïdes humaines, capables de produire cette hormone, dans un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par transplantation de ces cellules dans l'organisme lui-même de l'animal, ou dans un dispositif recevant le liquide nutritif de cet animal, et à laisser ensuite les cellules multipliées libérer l'hormone.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hormone produite est accompagnée de l'hormone stimulante de méla-nocyte, hMSH, et/ou de lipotropine, hLPH.

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REVENDICATIONS

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on induit la libération d'hACTH dans les cellules lymphoblastoïdes humaines multipliées au moyen d'une ou de plusieurs substances: Vasopressine, méthylnitrate d'atropine, insuline, glucagon, une endotoxine bactérienne, sérotonine, propanolol.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est: poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue.

5. Procédé de préparation des cellules lymphoblastoïdes humaines utilisées dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules lymphoblastoïdes humaines sont des cellules d'hybridome que l'on obtient par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules humaines capables de produire l'hACTH.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules humaines d'adénome chromophobe.

7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdites cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules humaines de carcinome pulmonaire.

8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite lignée lymphoblastoïde est une lignée lymphoblastoïde leucémique humaine.

9. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la lignée lymphoblastoïde humaine est une des lignées Namalwa, Ball-1, Tall-1, Nall-1 etJBL.