CH650797A5 - Procede microbiologique de production de narasine. - Google Patents

Description

Cette invention concerne un nouveau procédé microbiologique de préparation de l'antibiotique dit narasine.

La narasine est un antibiotique de type polyéther connu, actif contre les bactéries Gram positives, les bactéries anaérobies, les champignons, et utilisable comme agent anticoccidien et comme agent permettant d'augmenter l'utilisation des aliments chez les ruminants. Sa préparation par fermentation de Streptomyces aureofa-eiens NRRL 5758 ou Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 a préalablement été décrite dans le brevet des E.U.A. N" 4038384 [voir également Berg et al. dans «Journal of Antibiotics», 31,1-6 (1978)].

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de l'antibiotique dit narasine par culture d'une nouvelle souche récemment découverte, appelée ici Streptomyces lyclicus DeBoer et al., NRRL 12034 (ou un de ses mutants ou variants producteurs de narasine) dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle de narasine par ledit organisme dans ledit milieu de culture et, éventuellement, isolement de ladite narasine à partir du milieu de culture.

L'invention concerne en outre le nouveau micro-organisme Streptomyces lyclicus DeBoer et al., NRRL 12034, et des milieux de culture contenant ce micro-organisme sous forme biologiquement pure, à titre de moyen pour la mise en œuvre dudit procédé.

Le nouveau micro-organisme utilisé selon l'invention pour la production de l'antibiotique dit narasine est une culture biologiquement pure obtenue à partir d'un échantillon de sol recueilli près du fleuve Surinam, au Surinam, et le numéro A-39861.3 a été attribué à la culture dans un but d'identification.

La culture A-39861.3 est classée comme une souche de Streptomyces lydicus DeBoer et al., en se fondant sur une culture simultanée de Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces endus, Streptomyces platensis et Streptomyces lydicus en utilisant les procédés et les milieux recommandés par Shirling et Gottlieb («Methods of Cha-racterization of Streptomyces species», in «Intern. Bull, of Systema-tic Bacteriol.», 16,313-340 (1966)], ainsi que certains essais supplémentaires. D'après les caractéristiques obtenues, Streptomyces lydicus a été choisi comme étant l'espèce la plus apparentée. Les principales différences entre la culture A-39861.3 et la culture type de S. lydicus se trouvent dans le diagramme d'utilisation du carbone, un niveau plus élevé de tolérance à NaCl que présente S. lydicus, et la production d'un mycélium aérien blanc par la culture A-39861.3 sur plusieurs milieux.

Les noms des couleurs ont été attribués selon la méthode ISCC-NBS (K. L. Kelly et D. B. Judd, «The ISCC-NBS Methods of Desi-gnating Colors and a Dictionary of Color Names», U.S. Department of Commerce, circ. 553, 1955, Washington, D.C.). Les chiffres entre parenthèses se réfèrent à la série de couleurs de Tresner et Backus (H. D. Tresner et E. J. Backus, «System of Color Wheels for StreptomyceteTaxonomy», in «Appi. Microbiol.», Il, 335-338 (1956)]. Les désignations tab des couleurs sont soulignées. Les indications de couleur selon Maerz et Paul [A. Maerz et M. R. Paul, «Dictionary of Color», McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N. Y. ( 1950)] sont indiquées entre crochets.

Les sucres des parois cellulaires ont été déterminés en utilisant une modification du mode opératoire de M. P. Lechavalier [«Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes Into Genera», travail financé par le Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology (Dr. Thomas G. Pridham, Convenor.) et effectué à l'Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick. N. J. (1971)]. Les isomères de l'acide diaminopimélique ont été déterminés en utilisant le procédé de Becker et al., «Appi. Microbiol.», 11, 421-423 (1964). Toutes les plaques sont lues après 13 d à 30° C, à moins d'indication contraire.

Caractérisation de la souche productrice de narasine Morphologie

Un examen au microscope électronique montre que les spores sont lisses. Les sporophores sont spirales, les spirales étant ouvertes et pas très serrées. Des spirales de deux à trois tours sont courantes. On observe parfois une boucle ou un crochet. Les spores sont ovales à légèrement cylindriques et mesurent en moyenne 1,365 x 1,69 (im, avec un intervalle de 1,3 à 1,95 x 1,3 à 2,6 |a.m.

Tableau I

Caractéristiques de culture sur divers milieux

Milieu

Caractéristiques

Gélose de farine d'avoine et de pâte de tomate

Croissance abondante, envers du milieu jaune-brun [14F6J à noir [8C8J vers le centre de l'ino-culum. Mycélium aérien abondant. Gris (GY) 3fe gris brunâtre clair à 4ig brun grisâtre clair. Pas de pigment soluble. Hygroscopique.

Gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt (milieu ISP N°2)

Culture abndante, envers brun clair [I3F8], Bon mycélium aérien. Blanc (W) b blanc; pas de pigment soluble.

Gélose de farine d'avoine (milieu ISP N" 3)

Culture abondante, envers olive grisâtre clair [13H4], Mycélium aérien abondant (GX) 3fe gris brunâtre clair. Pigment soluble verdâtre. Zones hygroscopiques noires près de la bordure de l'inoculum.

Gélose d'amidon et de sels minéraux (milieu ISP N° 4)

Culture abondante, envers dans la culture plus jeune de brun à brun-jaune (7 d) devenant gris foncé [8A9] à noir [8A8] en 14 d. Bon mycélium aérien (GY) d gris clair. Hygroscopique.

Gélose de glycérol et d'asparagine (milieu ISP N° 5)

Croissance abondante, envers brun moyen [14J7]. Bon mycélium aérien et spores (W) b blanches. Pigment soluble brun léger.

Gélose d'Emerson

Croissance abondante, envers brun-jaune fort [1318]. Mycélium aérien abondant et spores (W) b blanches. Pas de pigment soluble.

Gélose modifiée de Bennett

Bonne croissance, envers orange brunâtre [12B9]; mycélium aérien rare ou absent; quand il est présent (GY) 2dc gris jaunâtre. Pas de pigment soluble.

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Tableau (suite)

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Milieu

Caractéristiques

Gélose de solution de Czapek

Croissance très médiocre, pas de mycélium aérien ni de spores. Pas d'attribution de couleur.

Gélose nutritive

Bonne croissance, envers jaune pâle [11C2], Ni mycélium aérien ni spores; pas de pigment soluble.

Gélose de maltate de calcium

Bonne croissance, envers olive grisâtre clair [14B2]; pas de mycélium aérien ni de spores. Pigment soluble brun léger.

Gélose de glycérol et de glycine

Bonne croissance, envers olive moyen [15L6]. Bon mycélium aérien et spores (GY) 2dc gris jaunâtre. Pas de pigment soluble.

Gélose d'extrait de levure et de tryp-tone

Croissance médiocre, ni mycélium aérien ni spores. Pas d'attribution de couleur.

Gélosine de tyro-sine

Bonne croissance, envers brun jaunâtre clair [13H7]. Bon mycélium aérien et spores (Y) 2db à 2ft> jaune pâle. Pigment soluble brun léger.

Gélose de glucose et d'asparagine

Bonne croissance, envers brun jaunâtre clair [13H7]. Bon mycélium aérien et spores (GY) 2dc jaune grisâtre. Pas de pigment soluble.

On étudie des propriétés physiologiques sélectionnées de l'organisme selon des modes opératoires classiques. Les propriétés observées et les caractéristiques trouvées sont données dans le tableau II.

Tableau II

Propriétés physiologiques de A-39861.3

Production de pigments de type mélanoïde sur:

1. Cultures inclinées de fer/extrait de levure/peptone

2. Cultures inclinées sur gélose de tyrosine

3. Bouillon d'extrait de levure et de tryptone

Pas de pigment de type mélanoïde Pas de pigment de type mélanoïde Pas de pigment de type mélanoïde

Réduction des nitrates Liquéfaction de la gélatine Morceaux de pommes de terre

Morceaux de carotte Hydrolyse de l'amidon Lait écrémé

Positive

La gélatine est liquéfiée à 60% en 14 d Bonne croissance végétative jaune-brun; pas de mycélium aérien; la couleur du morceau de pomme de terre n'est pas changée Pas de croissance Amidon hydrolysé Lait peptonisé

Exigences en température

On utilise des cultures inclinées sur gélose de milieu ISP N° 2, et gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt.

On fait incuber les cultures inclinées à 20, 25, 30, 37, 43 et 49 C.

Pas de croissance à 20 ou 49°C. Croissance optimale 25-37r,C. Une certaine croissance à 43°C.

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Tableau (suite)

Tolérance à NaCl

On utilise de la gélose de milieu ISP N° 2, de la gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt. On ajoute NaCl à des taux de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 et 12%. Une gélose de milieu ISP N° 2 sans NaCl ajouté sert de témoin.

Le micro-organisme tolère des niveaux de 1 à 3%. A des taux supérieurs à 3%, on n'observe pas de croissance.

Réaction à des changements du pH On utilise une gélose de milieu ISP N° 2 et une gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt. On ajuste le pH de la gélose à des taux de 5,0, 6,0, 7,0, 8,0,10,0 et 11,5 après passage à l'autoclave pour la stérilisation.

Croissance et sporulation abondante de pH 5,0 à pH 8,0. A pH 10,0, la culture se fait sous forme de colonies isolées avec un mycélium aérien rare. A pH 11,5, pas de croissance.

On détermine l'utilisation du carbone en utilisant le milieu de base de Pridham et Gottlieb auquel on ajoute les sources de carbone jusqu'à une concentration finale de 1,0%, selon la description de Shirling et Gottlieb, supra. Les sources de carbone sont stérilisées avant d'être ajoutées au milieu de base. On lit les plaques après 5, 9 et 16 d d'incubation à 30 C, les lectures finales étant seules indiquées.

Les résultats des essais d'utilisation du carbone effectués avec la culture A-39861.3 sont indiqués dans le tableau III.

Essai

Résultat observé

Isomères de l'acide diaminopimélique

Sucres de diagnostic détectés isomère LL glucose, ribose

Une comparaison du diagramme d'utilisation du carbone de la 25 souche A-39861.3 et de Streptomyces lydicus est donnée dans le tableau IV.

Tableau III Utilisation du carbone

Substrat: Sources de carbone ajoutées au milieu de base de Pridham et Gottlieb

Réaction de A-39861.3 au bout de 16 d

D-Glucose*

+ +

D-Xylose**

+

L-Arabinose*

+ +

L-Rhamnose*

+ -b

D-Fructose*

+ +

D-Galactose

-1- +

Raffinose*

—

D-Mannitol*

—

i-Inositol*

+

Salicine

+

Saccharose*

+

Cellobiose

+ +

D-Maltose

+ +

Mélibiose

—

Mélézitose

±

Amidon soluble

+ +

Tréhalose

+ +

Turanose

+

* Sources de carbone de l'International Streptomyces Project

(Shirling et Gottlieb, supra)

Résultats: ++ = utilisation positive forte + = utilisation positive ± = utilisation douteuse — = utilisation négative

35

Etudes des parois cellulaires

En utilisant des parois entières hydrolysées de l'organisme, on détermine la présence de certains sucres importants pour des raisons 65 de diagnostic. On utilise les parois cellulaires isolées pour déterminer les isomères de l'acide diaminopimélique. Les résultats de ces études sur parois cellulaires sont indiqués ci-dessous.

Tableau IV

Schéma d'utilisation du carbone par A-39861.3 et Streptomyces lydicus

Source de carbone

A-39861.3

S. lydicus

D-Glucose

+ +

+ +

L-Arabinose

+ +

+ +

D-Xylose

+ +

+

i-Inositol

+ +

+ +

D-Mannitol

—

+ +

L-Rhamnose

+ +

—

Raffinose

+ +

D-Mannitol

+ +

Salicine

:

+

Saccharose

+

+ +

Cellobiose

_1_

+

D-Maltose

++

+ +

Mélézitose

±

+ +

Amidon soluble

++

+ +

Trehalose

++

+ +

+ +' = utilisation positive forte

+ = utilisation positive

+ = utilisation douteuse

— = utilisation négative

Les similitudes et les différences entre A-39861.3 et Streptomyces lydicus sont données dans le tableau V.

( Tableau en page suivante )

Les propriétés morphologiques et physiologiques de ces deux souches sont en bon accord, sauf pour les différences de réduction des nitrates indiquées dans le tableau V. Les autres espèces apparentées diffèrent de la culture A-39861.3 comme suit:

1. Streptomyces hygroscopicus et Streptomyces endus produisent des spores grumeleuses alors que l'ornementation des spores de la culture A-39861.3 est lisse.

2. Streptomyces platensis diffère de A-39861.3 par la production d'un mycélium végétatif brun-orange à brun-rouge sur certains

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Tableau V

Similitudes et différences entre A-39861.3 et S. lydicus

Essai, caractéristique, etc.

A-39861.3

S. lydicus

Morphologie des sporophores spiralés spiralés

Ornementation des spores lisse lisse

Pigment de type mélanoïde négatif négatif

Mycélium aérien*

principalement gris-blanc sur

certains milieux gris

Liquéfaction de la gélatine

+

+

Lait écrémé*

peptonisé

hydrolysé

Réduction des nitrates*

+

-

Tolérance à NaCl*

3%

8%

Isomère de l'acide diaminopi-

mélique isomère LL

isomère LL

* Dénote des différences milieux. En outre, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces endus et Streptomyces platensis sont extrêmement hygroscopiques, alors que le caractère hygroscopique de Streptomyces lydicus n'est pas aussi prononcé. 25

L'organisme Streptomyces lydicus DeBoer et al. producteur de narasine a été déposé et fait partie de la collection de culture de Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, où il est disponible au public sous le numéro NRRL 12034, depuis le 17 sep- 30 tembre 1979.

Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les caractéristiques de la culture productrice de narasine de Streptomyces lydicus DeBoer et al., NRRL 12034, sont sujettes à variation. Par exemple, des mutants (spontanés ou induits), des transconjugants et des re- 35 combinants (comprenant de l'ADN recombinant sur des plasmides) de la souche NRRL 12034, ou dérivés de cette souche, qui produisent l'antibiotique narasine, peuvent être utilisés dans cette invention.

Un certain nombre de milieux différents peuvent être utilisés 40 pour produire la narasine avec Streptomyces lydicus DeBoer et al., NRRL 12034. Ces milieux doivent contenir des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux. Les sources de carbone appropriées comprennent le glucose, l'amidon et la dextrine. Des sources d'azote appropriées comprennent la peptone, la caséine hy- 45 drolysée par une enzyme, la farine de graine de coton et la peptone de viande.

Les oligo-éléments nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme peuvent se trouver comme impuretés dans d'autres constituants des milieux, en quantités suffisantes pour satis- 50 faire les besoins de croissance et les besoins biosynthétiques de l'organisme. Cependant, il peut être intéressant d'incorporer dans le milieu de culture d'autres sels minéraux nutritifs solubies pouvant fournir les ions sodium, potassium, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, phosphate, sulfate, nitrate, etc. 55

11 peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (c'est-à-dire 0,2 ml/1) d'un agent antimoussant comme du propylèneglycol dans les milieux de fermentation à grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes.

Pour la production de quantités substantielles de narasine en uti- M lisant NRRL 12034, on utilise la fermentation aérobie en immersion dans des réservoirs. On peut cependant obtenir de petites quantités de narasine par culture sur flacon agité. Pour la fermentation en réservoir, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume de milieu de m culture par la forme spore, des fragments mycéliens ou une pastille lyophilisée de l'organisme pour obtenir une culture fraîche en croissance active de l'organisme. On transfère ensuite l'inoculum végétatif dans un réservoir plus grand où, après un temps d'incubation approprié, la narasine antibiotique est obtenue avec un rendement optimal.

Le pH du milieu de fermentation non inoculé varie avec le milieu utilisé pour la production, mais le pH de tous les milieux de fermentation est compris entre environ 6,5 et environ 7,5.

L'organisme producteur de narasine peut être cultivé sur un large intervalle de température d'environ 25 à environ 37 C. Il semble que la production optimale de narasine avec NRRL 12034 se produise à une température d'environ 30 C.

Comme il est courant dans les procédés de culture en immersion aérobie, de l'air stérile est dispersé dans le milieu de culture. Pour une croissance efficace de l'organisme, le volume d'air utilisé dans la production en réservoir est compris entre environ 0,25 et environ 1,0 volume d'air par volume de milieu de culture par minute (v/v/min). Un débit optimal dans un récipient de 10 1 est d'environ 0,5 v/v/min, l'agitation étant fournie par des appareils d'agitation classiques tournant à environ 600 tr/min.

La production de la narasine peut être contrôlée pendant la fermentation soit par diffusion sur gélose, soit par des procédés turbidi-mêtriques. Les organismes d'essai que l'on peut utiliser comprennent Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis et Micrococcus luteus.

Une activité antibiotique est généralement présente après environ 40 h et reste présente pendant au moins 2 d ou plus pendant la période de fermentation. La production antibiotique maximale se produit à un temps de fermentation d'environ 2 à environ 4 d.

La narasine peut être recueillie du milieu de fermentation par des procédés connus dans le domaine et décrits dans le brevet des E.U.A. N" 4038384.

Le nouvel organisme producteur de narasine Streptomyces lydicus DeBoer et al., NRRL 12034, produit de bonnes quantités du facteur A de la narasine ainsi que de faibles quantités du facteur D de la narasine. Les composés peuvent être obtenus, si on le désire, comme antibiotiques séparés par purification plus poussée du complexe, par exemple par des techniques de Chromatographie sur colonne. Elles sont décrites dans le brevet des E.U.A. N" 4038384 dont la description est incorporée ici par voie de référence et fait partie de la présente demande de brevet.

Pour illustrer plus complètement le fonctionnement de l'invention, en utilisant divers milieux de fermentation, on donne les exemples suivants. Cependant, le domaine de l'invention n'est pas limité par les exemples.

Exemple l

On préparc un milieu que l'on utilise pour la culture sur gélose inclinée de Streptomyces lydicus DeBoer et al., NRRL 12034:

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.6

Ingrédient Quantité (gjl)

Dextrine de pomme de terre 10,0

Caséine hydrolysée par une enzyme1 2,0

Extrait de bœuf 1,0

Extrait de levure 1,0

Gélose 2,0

Solution minérale de Czapek 2,0 ml/1

Eau désionisée q.s.p. 1 1

1 N-Z-Amine A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tennessee, U.S.A.).

On prépare la solution minérale de Czapek à partir des ingrédients suivants:

Ingrédient Quantité (gli00 ml)

KCl 10,0

MgS04-7H20 10,0

FeS04-7H20 0,2

Eau désionisée q.s.p. 100 ml

On inocule des spores de Streptomyces lydicus DeBoer et al., NRRL 12034, sur une gélose inclinée nutritive préparée à partir des ingrédients précédents et l'on fait incuber la culture ainsi inoculée pendant environ 7 d à une température d'environ 30' C. Puis on recouvre la culture mûre d'eau et on la gratte avec un instrument stérile pour libérer les spores et le mycélium. On utilise 1 ml de la suspension de spore résultante pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité (g/l)

Dextrose

15,0

Farine de soja

15,0

Liqueur de macération de maïs

5,0

CaC03

2,0

NaCl

5,0

Solution minérale de Czapek

2,0 ml/I

Eau désionisée q.s.p. 1,01

On fait incuber l'inoculum végétatif dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à large embouchure à environ 30" C pendant environ 48 h sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr/min. On utilise ce milieu incubé pour inoculer de petits appareils de fermentation (l'inoculum représentant environ 1 % du volume du milieu) ou pour inoculer des flacons de second stade pour la production d'un plus grand volume de mycélium.

On place des parties aliquotes de 200 ml du milieu de production dans des flacons Erlenmeyer de 1,0 1 et on les stérilise à 121° C pendant environ 30 min. Après refroidissement, on inocule les flacons avec un inoculum à 5% de l'inoculum végétatif. On fait incuber la culture sur un agitateur alternatif à 108 coups/min avec une course de 5 cm. Le pH du milieu de fermentation au bout de 72 h est environ 8,0. On effectue la fermentation à 30" C.

Exemple 2:

On produit de la narasine en utilisant un milieu de production stérile ayant la composition suivante:

Ingrédient Quantité (gjl)

Agent antimoussant siliconé1 0,2

Glucose 10,0

Mélasse 20,0

Peptone 5,0

CaC03 2,0

Eau désionisée q.s.p. 9,0 1 1 Dow-Corning Antifoam A.

On inocule ce milieu de production ayant un pH de 6,7 avec 2,0% d'inoculum provenant du milieu de second stade obtenu comme décrit dans l'exemple 1. On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 101 pendant environ 3 d à une température d'environ 30' C. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à un taux de 0,5 v/v/min et on l'agite avec des agitateurs classiques à environ 400 tr/min.

Exemple 3:

On produit de la narasine selon le mode opératoire de l'exemple 2, mais en utilisant un milieu de production stérile ayant la composition suivante:

Ingrédient Quantité (gjl)

Agent antimoussant silicone1 0,2

Glucose 25,0

Amidon de maïs 10,0

Peptone de viande liquide 10,0

Caséine hydrolysée par une enzyme2 4,0

Mélasse noire 5,0

MgS04-H20 0,5

CaC03 2,0

Solution minérale de Czapek 2,0 ml/1

Eau désionisée q.s.p. 91

' Dow-Corning Antifoam A.

2 N-Z-Amine A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tennessee, U.S.A.).

On inocule ce milieu de production ayant un pH de 6,5 avec 2,0% d'inoculum et on laisse fermenter dans un réservoir de fermentation de 101 pendant environ 4 d à une température d'environ 30 C. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à raison de 0,5 v/v/min et on l'agite avec un agitateur classique à environ 600 tr/min.

Exemple 4:

On produit de la narasine selon le mode opératoire de l'exemple 2, mais en utilisant un milieu de production stérile ayant la composition suivante:

Ingrédient Quantité (gli)

Agent antimoussant siliconé1 0,2

Dextrine de tapioca 30,0

Caséine hydrolysée par une enzyme2 10,0

Solution minérale de Czapek 2,0 ml/1

Eau désionisée q.s.p. 91

1 Dow-Corning Antifoam A.

2 N-Z-Amine A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tennessee, U.S.A.).

On ajuste le pH du milieu de production, qui est initialement de 6,4, à 7,1 avec environ 3 ml d'hydroxyde de potassium aqueux 10N avant stérilisation, puis on l'inocule avec 2% d'inoculum. On laisse le milieu fermenter dans un réservoir de fermentation de 101 pendant environ 3 d à une température d'environ 30e C. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à un taux de 0,5 v/v/min et on l'agite avec un agitateur classique à environ 600 tr/min.

Exemple 5

Isolement et purification

On filtre 10 I de bouillon de fermentation en utilisant un adjuvant de filtration (adjuvant de filtration Hyflo Supercel, terre de diatomées produite par Johns-Manville Corp.) et on lave le gâteau de filtration avec de l'eau. On combine le filtrat de bouillon avec l'eau de lavage et on extrait deux fois avec des portions de 4,5 1 d'acétate d'éthyle. On réunit les extraits d'acétate d'éthyle et on les concentre sous vide pour obtenir un résidu huileux. On dissout le résidu dans 100 ml d'acétone et on ajoute 100 ml d'eau. On ajuste le pH de la

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solution à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique aqueux IN et on agite la solution pendant environ 1 h à la température ambiante. On filtre les cristaux qui se forment et on les lave avec de l'eau froide. On recristallise les cristaux en les dissolvant dans 50 ml d'acétone, en ajoutant 50 ml d'eau et en laissant le mélange reposer pendant une nuit à la température ambiante. On filtre les cristaux qui se forment, on les lave avec de l'eau froide et on les sèche sous vide et l'on obtient 100 mg de cristaux blancs. On montre que les cristaux sont identiques à la narasine par RMN, IR, UV et spectre de masse et par 5 Chromatographie sur couche mince combinée à un bioautographe.

Claims (4)

1. 650 797

   2

   REVENDICATIONS

   1. Procédé de production de la narasine antibiotique, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Streptomyces lyclicus DeBoer et al., NRRL 12034, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobies en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique par ledit organisme dans ledit milieu de culture.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire de séparation de la narasine du milieu de culture.
3. 3. Narasine obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 ou 2.
4. 4. Micro-organisme Streptomyces lydiens DeBoer et al., NRRL 12034, en tant que moyen pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1.