CH651052A5

CH651052A5 - Verfahren zur herstellung einer karzinostatischen substanz und karzinostatische substanz.

Info

Publication number: CH651052A5
Application number: CH979/82A
Authority: CH
Inventors: Kenzo Tamai; Isamu Saikawa; Takashi Yasuda; Shohachi Murakami; Toyoo Maeda; Hisatsugu Tsuda; Hiroshi Sakai; Masatoshi Sugita; Yoshiko Yamamoto; Hisashi Minami; Takako Hori
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1981-02-19
Filing date: 1982-02-17
Publication date: 1985-08-30
Also published as: DE3205074A1; US4591558A; PT74455A; PT74455B; NO157426C; CA1184864A; NO157426B; BE892204A; DK151640B; AT381722B; DK151640C; NZ199771A; DK69282A; GB2093347A; FI820527L; NL8200640A; FI69096B; SE8201016L; IT1189224B; FR2499855A1

Description

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen und Zeichnungen weiter erläutert werden.

Fig. 1 zeigt eine mikroskopische Abbildung des in der vorliegenden Erfindung benutzten Fusobacterium nucleatum TF-031,

Fig. 2 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-210, erhalten nach Beispiel 1,

Fig. 3 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum von TF-210, Fig. 4 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-220, erhalten nach Beispiel 3,

Fig. 5 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-200,

Fig. 6 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-230, erhalten nach Beispiel 5,

Fig. 7 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-230,

Fig. 8 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-240, erhalten nach Beispiel 7,

Fig. 9 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-240,

Fig. 10 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-250, erhalten nach Beispiel 9,

Fig. 11 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-250,

Fig. 12 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-310, erhalten nach Beispiel 11,

Fig. 13 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-310,

Fig. 14 zeigt ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm der Substanz TF-310,

Fig. 15 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-320, erhalten nach Beispiel 12,

Fig. 16 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-320,

Fig. 17 zeigt ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm der Substanz TF-320,

Fig. 18 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-330, erhalten nach Beispiel 13,

Fig. 19 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-330,

Fig. 20 zeigt ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm der Substanz TF-330,

Fig. 21 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-330 (gereinigt), erhalten nach Beispiel 13,

Fig. 22 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-330,

Fig. 23 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-310 (gereinigt), erhalten nach Beispiel 18,

Fig. 24 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-310,

Fig. 25 zeigt ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm der Substanz TF-310,

Fig. 26 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-340, erhalten nach Beispiel 19,

Fig. 27 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-340,

Fig. 28 zeigt ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm der Substanz TF-340,

Fig. 29 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum der karzinostatischen Substanz TF-350, erhalten nach Beispiel 24,

Fig. 30 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum der Substanz TF-350,

Fig. 31 zeigt ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm der Substanz TF-350.

Beispiel 1

(1) In einem 10-Liter-Gärgefäss wurden 8 1 eines TF-e-Kulturmediums gegeben, das 17 g Trypticase Pepton, 10 g Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt, 7.5 g Natriumchlolrid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0.1 g Natriumsulfit und 0.5 g Natri-umthioglycolat pro Liter destilliertes Wasser enthielt. Das Kulturmedium wurde während 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 100 ml/min während 1 Std. durchgeleitet. In dieses Kulturmedium wurden 1 1 einer Vorkultur-Lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) eingeimpft, die hergestellt wurde durch Züchten in einem TF-e-KuIturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen wurden während drei Tagen bei 37 °C unter Rühren mit 30 U/min gezüchtet, wobei Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 65 ml/ min durchgeleitet wurde. Nachher wurden der Kultur 160 g Celite und 0 g Zellulosepulver beigefügt und die Mischung wurde gerührt und bei Unterdruck gefiltert, wodurch 7.8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Lösung erhalten wurden.

(2) Diesen 7.8 I der überstehenden Lösung wurden 117 ml konzentrierte Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach 11.7 I Äthanol beigegeben wurden, um eine 60%ige wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, die während 24 Stunden bei 4 °C stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantation entnommen und der übrigbleibende Teil wurde zentrifugiert (6 x 10-' U/min, 5 min) bei 4 °C, um die Fällung zu gewinnen. Diese Fällung wurde nacheinander mit 400 ml einer 60%igen wässrigen Äthanol-Lösung mit einem pH-Wert von 2.0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 3.9 g Pulver erhalten wurden.

(3) Das aus (2) erhaltene Pulver wurde in 25 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 7.5 bis 8.0 eingestellt, durch Beigabe einer 1 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung und nach Rühren während 30 min bei Zimmertemperatur wurden 1 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 4.0 einzustellen. Dann wurde während zwei Stunden mit Eiskühlung gerührt und die Mischung wurde zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 10

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ml Wasser mit einem pH-Wert von 4.0 gewaschen und durch Zentrifugieren (1 x 104 U/min, 10 min) wieder herausgetrennt. Das Waschwasser und die überstehende Lösung wurden vermengt und einer Behandlung unterworfen, die in Beispiel 9 beschrieben ist. Die Fällung wurde mit 10 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 1.5 g der karzinostatischen Substanz TF-210 erhalten wurden.

Diese Substanz TF-210 wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- bzw. UV-Absorptionsspektrum sind in den Figuren 2 und 3 dargestellt.

Beispiel 2

(1) In einem 10-Liter-Gärgefäss wurden 8 1 eines TF-d-Kulturmediums gegeben, das 17 g Trypticase Pepton, 20 g Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt, 7.5 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0.1 g Natriumsulfit und 0.5 g Natri-umthioglycolat pro Liter destilliertes Wasser enthielt. Das Kulturmedium wurde während 30 Minuten bei 120 "C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 100 ml/min während 1 Std. durchgeleitet. In dieses Kulturmedium wurden 1 1 einer Vorkultur-Lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) eingeimpft, die hergestellt wurde durch Züchten in einem TF-d-Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen wurden während drei Tagen bei 37 °C unter Rühren mit 30 U/min gezüchtet, wobei Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 65 ml/ min durchgeleitet wurde. Nachher wurden der Kultur 160 g Celite und 80 g Zellulosepulver beigefügt und die Mischung wurde gerührt und bei Unterdruck gefiltert, wodurch 7.8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Lösung erhalten wurden.

(2) Diesen 7.8 1 der überstehenden Lösung wurden 117 ml konzentrierte Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach 11.7 1 Äthanol beigegeben wurden, um eine 60%ige wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, die während 24 Stunden bei 4 °C stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantation entnommen und der übrigbleibende Teil wurde zentrifugiert (6 x 103 U/min, 5 min) bei 4 °C, um die Fällung zu gewinnen. Diese Fällung wurde nacheinander mit 400 ml einer 600/oigen wässrigen Äthanol-Lösung mit einem pH-Wert von 2.0,400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 4.5 g Pulver erhalten wurden.

(3) Dieses Pulver wurde der gleichen Behandlung wie in Beispiel 1 (3) unterworfen, wodurch 1.6 g der karzinostatischen Substanz TF-210 erhalten wurden.

Die derart erhaltene karzinostatische Substanz TF-210 wies die Eigenschaft gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 1.

Beispiel 3

(1) In einem 10-Liter-Gefäss wurden 8 1 eines TF-e-Kul-turmediums gegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie Beispiel 1 aufwies. Das Kulturmedium wurde während 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 100 ml/min während 1 Std. durchgeleitet. In dieses Kulturmedium wurden 1 1 einer Vorkultur-Lösung von Fusobacterium nucieatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) eingeimpft, die hergestellt wurde durch Züchten in einem TF-e-Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen wurden während fünf Tagen bei 37 CC unter Rühren mit 30 U/min gezüchtet, wobei Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 65 ml/min durchgeleitet wurde. Nachher wurden der Kultur 160 g Celite und 80 g Zellulosepulver beigefügt und die Mischung wurde gerührt und bei Unterdruck gefiltert, wodurch 7.8 I einer bakterienfreien, überstehenden Lösung erhalten wurden.

(2) Diesen 7.8 1 der überstehenden Lösung wurden 117 ml konzentrierte Salzsäure beigegeen, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach 11.7 1 Äthanol beigegeben wurden, um eine 60"uige wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, die während 24 Stunden bei 4 "C stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantation entnommen und der übrigbleibende Teil wurde zentrifugiert (6x 103 U/min, 5 min) bei 4 °C, um die Fällung zu gewinnen. Diese Fällung wurde nacheinander mit 400 ml einer 60%igen wässrigen Äthanol-Lösung mit einem pH-Wert von 2.0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 4.9 g Pulver erhalten wurden.

(3) Das aus (2) erhaltene Pulver wurde in 49 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 7.5 bis 8.0 eingestellt, durch Beigabe einer 1 N wässrigen Natriumhy-droxid-Lösung und nach Rühren während 30 min bei Zimmertemperatur wurden 1 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 6.0 einzustellen. Dann wurde während zwei Stunden mit Eiskühlung gerührt und die Mischung wurde zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 6.0 gewaschen und durch Zentrifugieren (1 x 104 U/min, 10 min) wieder herausgetrennt. Die Fällung wurde mit 10 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 1.8 g der karzinostatischen Substanz TF-220 erhalten wurden.

Diese Substanz TF-220 wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum sind in den Figuren 4 und 5 dargestellt.

Beispiel 4

(1) In einem 10-Liter-Gärgefäss wurden 8 1 eines TF-d-Kulturmediums gegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie Beispiel 2 aufwies. Das Kulturmedium wurde während 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 100 ml/min während 1 Std. durchgeleitet. In dieses Kulturmedium wurden 1 1 einer Vorkultur-Lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) eingeimpft, die hergestellt wurde durch Züchten in einem TF-d-Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen wurden während fünf Tagen bei 37 °C unter Rühren mit 30 U/min gezüchtet, wobei Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 65 ml/min durchgeleitet wurde. Nachher wurden der Kultur 160 g Celite und 80 g Zellulosepulver beigefügt und die Mischung wurde gerührt und bei Unterdruck gefiltert, wodurch 7.8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Lösung erhalten wurden.

(2) Diesen 7.8 1 der überstehenden Lösung wurden 117 ml konzentrierte Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach 11.7 1 Äthanol beigegeben wurden, um eine 60%ige wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, die während 24 Stunden bei 4 9C stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantation entnommen und der übrigbleibende Teil wurde zentrifugiert (6 x 103 U/min, 5 min) bei 4 °C, um die Fällung zu gewinnen. Diese Fällung wurde nacheinander mit 400 ml einer 60'!oigen wässrigen Äthanol-Lösung mit einem pH-Wert von 2.0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 5.07 g Pulver erhalten wurden.

(3) Das so erhaltene Pulver wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 (3) behandelt, wodurch 1.9 g der karzinostatischen Substanz TF-220 erhalten wurden.

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Diese Substanz weist die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Adsorptionsspektrum waren im wesentlich identisch mit denen gemäss Beispiel 3.

Beispiel 5

(1) In einem 10-Liter-Gärgefäss wurden 8 1 eines TF-e-Kulturmediums gegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie Beispiel 1 aufwies. Das Kulturmedium wurde während 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 100 ml/min während 1 Std. durchgeleitet. In dieses Kulturmedium wurden 1 1 einer Vorkultur-Lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) eingeimpft, die hergestellt wurde durch Züchten in einem TF-e-Kulturmedium mit dergleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen wurden während zwei Tagen bei 37 °C unter Rühren mit 30 U/min gezüchtet, wobei Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 65 ml/min durchgeleitet wurde. Nachher wurden der Kultur 160 g Celite und 80 g Zellulosepulver beigefügt und die Mischung wurde gerührt und bei Unterdruck gefiltert, wodurch 7.8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Lösung erhalten wurden.

(2) Diesen 7.8 1 der überstehenden Lösung wurden 117 ml konzentrierte Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach 11.7 1 Äthanol beigegeben wurden, um eine 600/uige wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, die während 24 Stunden bei 4 °C stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantation entnommen und der übrigbleibende Teil wurde zentrifugiert (6 x 103 U/min, 5 min) bei 4 CC, um die Fällung zu gewinnen. Diese Fällung wurde nacheinander mit 400 ml einer 60%igen wässrigen Äthanol-Lösung mit einem pH-Wert von 2.0, 400 ml Äthanol, 200 ml Ceton und 200 ml Diäthyläther gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 2.73 g Pulver erhalten wurden.

(3) Das aus (2) erhaltene Pulver wurde in 5 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 7.5 bis 8.0 eingestellt, durch Beigabe einer 1 N wässrigen Natriumhy-droxid-Lösung und nach Rühren während 30 min bei Zimmertemperatur wurden 1 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 6.0 einzustellen. Dann wurde während zwei Stunden mit Eiskühlung gerührt und die Mischung wurde zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 6.0 gewaschen und die Fällung zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min). Das Waschwas-ser und die überstehende Lösung wurden vereint, und diese Lösung, nach Einstellen auf einen pH-Wert von 4.0 durch Beigabe von 1 N Salzsäure, wurde bei einer Temperatur von nicht mehr als 5 °C während zwölf Stunden stehengelassen und anschliessend zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Diese Fällung wurde mit 15 ml Wasser mit einem pH-Wert von 4.0 gewaschen und die Fällung vom Waschwasser durch Zentrifugieren (1 x 104 U/min, 10 min) getrennt. Die Fällung wurde mit 10 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 0.58 g der karzinostatischen Substanz TF-230 erhalten wurden.

Diese Substanz TF-230 wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 6 und 7 dargestellt.

Beispiel 6

(1) In einem 10-Liter-Gärgefäss wurden 8 1 eines TF-d-Kulturmediums gegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie Beispiel 2 aufwies. Das Kulturmedium wurde während 30 Minuten bei 120 CC sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 100 ml/min während 1 Std. durchgeleitet. In dieses Kulturmedium wurden 1 1 einer Vorkultur-Lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) eingeimpft, die hergestellt wurde durch Züchten in einem TF-d-5 Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen wurden während zwei Tagen bei 37 °C unter Rühren mit 30 U/min gezüchtet, wobei Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 65 ml/min durchgeleitet wurde. Nachher wurden der Kultur 160 g Celite und 80 g Zellulosepulver io beigefügt und die Mischung wurde gerührt und bei Unterdruck gefiltert, wodurch 7.8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Lösung erhalten wurden.

(2) Diesen 7.8 1 der überstehenden Lösung wurden 117 ml konzentrierte Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0

15 einzustellen, wonach 11.7 1 Äthanol beigegeben wurden, um eine 60%ige wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, die während 24 Stunden bei 4 °C stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantation entnommen und der übrigbleibende Teil wurde zentrifugiert (6 x 103 U/min, 5 20 min) bei 4 °C, um die Fällung zu gewinnen. Diese Fällung wurde nacheinander mit 400 ml einer 60%igen wässrigen Äthanol-Lösung mit einem pH-Wert von 2.0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 3.15 g Pulver erhalten wur-25 den.

(3) Das so erhaltene Pulver wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 (3) behandelt, wodurch 0.8 g der karzinostatischen Substanz TF-230 erhalten wurden.

Diese Substanz weist die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 3o auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum waren im wesentlichen identisch mit denen gemäss Beispiel 5.

Beispiel 7

35 (1) In 25 ml Wasser wurden 3.9 g des wie in Beispiel 1 (1) und (2) erhaltenen Pulvers suspendiert. Durch Beigabe einer 1 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung wurde der pH-Wert der Suspension auf 7.5 bis 8.0 eingestellt und nach Rühren bei Raumtemperatur während 30 min wurde der pH-Wert auf 6.0 40 eingestellt durch Beigabe von 1 N Salzsäure. Nach Rühren während 2 Stunden unter Eiskühlung wurde die Suspension zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 6.0 gewaschen und vom 45 Waschwasser durch Zentrifugieren (1 x 104 U/min, 10 min) getrennt. Das Waschwasser und die überstehende Lösung wurden vereint und eine Behandlung gemäss weiter unten erklärten (2) unterworfen. Die Fällung wurde mit 10 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 1.06 so g der karzinostatischen Substanz TF-220 erhalten wurden.

Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, das IR- und UV-Absorptionsspektrum waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 3.

(2) Der vereinten Lösung, bestehend aus der überstehen-55 den Lösung und der Waschlösung, erhalten, gemäss (1) wurden 1 N Salzsäure beigemengt, um den pH-Wert auf 4.0 einzustellen und dann wurde diese Mischung während 12 Stunden bei nicht mehr als 5 °C stehengelassen. Dann wurde die Mischung zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Falbo lung von der überstehenden Lösung zu trennen. Diese Fällung wurde mit 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 4.0 gewaschen und zentrifugiert ( 1 x IO4 U/min, 10 min). Die Waschlösung wurde der überstehenden Lösung beigegeben und einer Behandlung gemäss (3) weiter unten unterworfen. 65 Die Fällung wurde mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 0.48 g der karzinostatischen Substanz TF-230 erhalten wurden. Diese wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und das IR- und UV-Absorptions

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spektrum waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 5.

(3) Der vereinten Lösung, bestehend aus der überstehenden Lösung und der Waschlösung, erhalten gemäss (2), wurden 1 N Salzsäure beigemengt, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach das Gemisch während 2 Stunden unter Eiskühlung stehengelassen wurde. Nachher wurde die Mischung zentrifugiert (6 x 103 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Diese Fällung wurde mit 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 gewaschen und die Fällung und die Waschlösung wurden zentrifugiert (6 x 103 U/min, 10 min). Die Waschlösung wurde mit der überstehenden Lösung vereint und diese Lösung wurde gemäss (4) von weiter unten behandelt. Die Fällung wurde mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 0.10 g der karzinostatischen Substanz TF-240 erhalten wurden.

Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das IR- und UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 8 und 9 dargestellt.

(4) Äthanol wurde dem Lösungsgemisch, bestehend aus der überstehenden Lösung und der Waschlösung von (3) beigemengt, um eine 80% wässrige Äthanollösung zu bilden, die während 12 Stunden, bei nicht mehr als 5 °C stehengelassen wurde. Die abgelagerte Substanz wurde durch Zentrifugieren (6 x 103 U/min, 10 min) entfernt, und der Niederschlag wurde mit 10 ml einer 80% wässrigen Äthanollösung und mit 10 ml eine Äthanollösung gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 2.08 g der karzinostatischen Substanz TF-250 erhalten wurden, deren Eigenschaften in Tabelle 2 dargestellt sind. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen gemäss Beispiel 9.

Beispiel 8

In 45 ml Wasser wurden 4.5 g des wie in Beispiel 2(1) und

(2) erhaltenen Pulvers suspendiert. Durch Beigabe einer 1 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung wurde der pH-Wert der Suspension auf 7.5 bis 8.0 eingestellt und nach Rühren bei Raumtemperatur während 30 min wurde der pH-Wert auf 4.0 eingestellt durch Beigabe von 1 N Salzsäure. Die Suspension wurde zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 4.0 gewaschen und vom Waschwasser durch Zentrifugieren (1 x 104 U/min, 10 min) getrennt. Diese Wasch- und überstehende Lösung wurden vereint und deren pH-Wert durch Hinzufügen von 1 N Salzsäure auf 2.0 eingestellt, wonach die Lösung unter Kühlung mit Eiswasser während 2 Stunden stehengelassen und dann zentrifugiert wurde (6x 103 U/min, 10 min). Die Fällung wurde mit 2 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 gewaschen, und die Fällung mit der Waschlösung wurden zentrifugiert (6 x 103 U/min, 10 min). Die erhaltene Fällung wurde mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 0.12 g der karzinostatischen Substanz TF-240 erhalten wurden, deren Eigenschaften in Tabelle 2 aufgezeichnet sind, wobei das IR- und UV-Absorptionsspek-trum im wesentlichen identisch mit denen gemäss Beispiel 7 waren.

Beispiel 9

( 1 ) Der vereinten Lösung, bestehend aus der überstehenden Lösung und der Waschlösung, erhalten gemäss Beispiel I

(3), wurden I N Salzsäure beigemengt, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach das Gemisch während 2 Stunden unter Eiskühlung stehengelassen wurde. Nachher wurde die Mischung zentrifugiert (6x 103 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Diese Fällung wurde mit 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 gewaschen und die Fällung und die Waschlösung wurden zentrifugiert (6 x 103 U/min, 10 min). Die Waschlösung wurde mit der überstehenden Lösung vereint und diese Lösung wurde gemäss (2) von weiter unten behandelt. Die Fällung wurde mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 0.11 g der karzinostatischen Substanz TF-240 erhalten wurden. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das IR- und UV-Absorptionsspektrum waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 7.

(2) Äthanol wurde dem Lösungsgemisch, bestehend aus der überstehenden Lösung und der Waschlösung von (1) beigemengt, um eine 80% wässrige Äthanollösung zu bilden, die während 12 Stunden, bei nicht mehr als 5 °C stehengelassen wurde. Die abgelagerte Substanz wurde durch Zentrifugieren (6 x 103 U/min, 10 min) entfernt, und der Niederschlag wurde mit 10 ml einer 80% wässrigen Äthanollösung und mit 10 ml eine Äthanollösung gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 2.1 g der karzinostatischen Substanz TF-250 erhalten wurden, deren Eigenschaften in Tabelle 2 dargestellt sind. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 10 und 11 dargestellt.

Beispiel 10

In 45 ml Wasser wurden 4.5 g des wie in Beispiel 2 (1) und (2) erhaltenen Pulvers suspendiert. Durch Beigabe einer 1 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung wurde der pH-Wert der Suspension auf 7.5 bis 8.0 eingestellt und nach Rühren bei Raumtemperatur während 30 min wurde der pH-Wert auf 2.0 eingestellt durch Beigabe von 1 N Salzsäure. Die Suspension wurde zentrifugiert (6 x 103 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 4.0 gewaschen und vom Waschwasser durch Zentrifugieren (6 x 103 U/min, 10 min) getrennt. Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und Äthanol beigegeben, um eine 80% wässrige Äthanollösung zu bilden. Diese Lösung wurde bei nicht mehr als 5 °C während 12 Stunden stehengelassen und zentrifugiert (6 x 103 U/min, 10 min), um einen Niederschlag zu erhalten. Der getrennte Niederschlag wurde mit 10 ml einer 80% wässrigen Äthanollösung und dann mit 10 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 2.68 g der karzinostatischen Substanz TF-250 erhalten wurden, deren Eigenschaften in Tabelle 2 aufgezeichnet sind. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum waren im wesentlichen mit denjenigen von Beispiel 9 identisch.

Beispiel 11

(1) 1.5 g der karzinostatischen Substanz TF-210, erhalten gemäss Beispiel I, wurden in 15 ml Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde 1 N einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Rühren beigemengt, um den pH-Wert auf 7.8 einzustellen. Dann wurde die Suspension auf 37 °C erhitzt und 15 mg Pronase E (Handelsname von Kaken Kagaku; 1 000 000 Tyrosin Einheiten/g) und mehrere Tropfen Toluol beigefügt. Unter Schütteln wurde die Mischung einer Enzym-Behandlung bei einem pH-Wert von 7.8 bis 8.0 bei 37-40 °C während 24 Stunden unterworfen. Nach dieser Behandlung wurde die Mischung zentrifugiert (4 000 000 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Dieser Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 8.0 beigefügt und die Mischung zentrifugiert (4,000 U/min, 10 min). Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und es wurde 1 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, woraufhin sich eine Fällung bildete. Diese Mischung wurde bei 5 CC während 12 Stunden stehengelassen und dann zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min). Der Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 zugefügt und die Mischung wurde zentrifugiert

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( I x IO4 U/min, 10 min), um die Fällung von der Waschlösung zu trennen. Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und Äthanol beigefügt, um eine 80% wässrige Äthanollösung zu bilden. Diese Lösung wurde während 2 Stunden unter Eiskühlung gerührt und zentrifugiert (4000 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml einer 80°/o wässrigen Äthanollösung und dann mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 327 mg der karzinostatischen Substanz TF-310-Fraktion erhalten wurden. Diese 327 mg wurden in 5 ml Wasser gelöst und durch Hinzufügen von 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die so vorbereitete Lösung wurde in eine Kolonne geleert, die mit 45 ml Amberlite IRA 400 (Marke von Rohm und Haas) gepackt und voreingestellt auf den OH-Typ mit 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung war. Anschliessend wurden 200 ml Wasser durch die Kolonne durchgelassen. Alle die Waschwässer wurden vereint und der pH-Wert auf 7.0 durch Hinzufügen von 1 N Salzsäure eingestellt. Diese Lösung wurde bei Unterdruck konzentriert und durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.3 jxm (Millipore: Handelsname der Japan Millipore Limited) gefiltert und schlussendlich gefriergetrocknet, wodurch 210 mg der gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-310 erhalten wurde. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und deren Saccharid-Gehalt lag im allgemeinen bei 20-60%, ausgedrückt in Glucose. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hoch-Ieistungs-FIüssigchromatogramm eines typischen Beispiels sind in den Fig. 12, 13 und 14 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser wurden 140 mg dieser oben erhaltenen Substanz TF-310 gelöst und auf einen lOOfachen Wert konzentriert, unter Benutzung eines Ultrafilters UK-50 (Handelsname für Ultrafilter Membranen von Toyo Roshi Kabus-hiki Kaisha, nominale Molekulargewichtskante: 50 000). Dieses Konzentrat wurde durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.2 um gefiltert und dann gefriergetrocknet, wodurch 88 mg der gereinigten, gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-310 erhalten wurden. Diese gereinigte Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und deren Saccharid-Gehalt lag im allgemeinen bei 16-30%, ausgedrückt in Glucose.

Beispiel 12

(1) In 10 ml Wasser wurden 1 g der karzinostatischen Substanz TF-220 suspendiert, die wie gemäss Beispiel 7(1) erhalten wurde. Diese Suspension wurde 1 N einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Rühren beigemengt, um den pH-Wert auf 7.8 einzustellen. Dann wurde die Suspension auf 37 °C erhitzt und 15 mg Pronase E (Handelsname von Kaken Kagaku: 1 000 000 Tyrosin Einheiten/g) und mehrere Tropfen Toluol beigefügt. Unter Schütteln wurde die Mischung einer Enzym-Behandlung bei einem pH-Wert von 7.8 bis 8.0 bsi 37-40 °C während 24 Stunden unterworfen. Nach dieser Behandlung wurde die Mischung zentrifugiert (4 000 000 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Dieser Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 8.0 beigefügt und die Mischung zentrifugiert (4 000 U/min, 10 min). Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und es wurde I N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, woraufhin sich eine Fällung bildete. Diese Mischung wurde bei 5 °C während 12 Stunden stehengelassen und dann zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min). Der Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 zugefügt und die Mischung wurde zentrifugiert (1 x IO4 U/min, 10 min), um die Fällung von der Waschlösung zu trennen. Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und Äthanol beigefügt, um eine 80% wässrige Äthanollösung zu bilden. Diese Lösung wurde während 2 Stunden unter Eiskühlung gerührt und zentrifugiert (4 000 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml einer 80% wässrigen Äthanollösung und dann mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 163 mg der karzinostatischen Substanz TF-320-Fraktion erhalten wurden. Diese 150 mg wurden in 5 ml Wasser gelöst und durch Hinzufügen von 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die so vorbereitete Lösung wurde in eine Kolonne geleert, die mit 25 ml Amberlite IRA 400 (Marke von Rohm und Haas) gepackt und voreingestellt auf den OH-Typ mit 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung war. Anschliessend wurden 100 ml Wasser durch die Kolonne durchgelassen. Alle die Waschwässer wurden vereint und der pH-Wert auf 7.0 durch Hinzufügen von 1 N Salzsäure eingestellt. Diese Lösung wurde bei Unterdruck konzentriert und durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.3 .um (Millipore-Handelsname der Japan Millipore Limited) gefiltert und schlussendlich gefriergetrocknet, wodurch 110 mg der gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-320 erhalten wurde. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und deren Saccharid-Gehalt lag im allgemeinen bei 20-60%, ausgedrückt in Glucose. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hoch-leitungs-Flüssigchromatogramm eines typischen Beispiels sind in den Fig. 15, 16 und 17 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser wurden 100 mg dieser obenerhaltenen Substanz TF-320 gelöst und auf einen lOOfachen Wert konzentriert, unter Benutzung eines Ultrafilters UK-50 (Handelsname für Ultrafilter Membranen von Toyo Roshi Kabushiki Kaisha, nominale Molekulargewichtskante: 50 000). Dieses Konzentrat wurde durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.2 um gefiltert und dann gefriergetrocknet, wodurch 72 mg der gereinigten, gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-320 erhalten wurden. Diese gereinigte Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und deren Saccharid-Gehalt lag im allgemeinen bei 16-30%, ausgedrückt in Glucose.

Beispiel 13

( 1 ) In 5 ml Wasser wurden 0.48 g der karzinostatischen Substanz TF-230 suspendiert, die wie gemäss Beispiel 7 (2) erhalten wurde. Diese Suspension wurde 1 N einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Rühren beigemengt, um den pH-Wert auf 7.8 einzustellen. Dann wurde die Suspension auf 37 °C erhitzt und 5.0 mg Pronase E (Handelsname von Kaken Kagaku: 1 000 000 Tyrosin Einheiten/g) und mehrere Tropfen Toluol beigefügt. Unter Schütteln wurde die Mischung einer Enzym-Behandlung bei einem pH-Wert von 7.8 bis 8.0 bei 37-40 °C während 24 Stunden unterworfen. Nach dieser Behandlung wurde die Mischung zentrifugiert (4 000 000 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Dieser Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 8.0 beigefügt und die Mischung zentrifugiert (4000 U/min, 10 min). Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und es wurde 1 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, woraufhin sich eine Fällung bildete. Diese Mischung wurde bei 5 °C während 12 Stunden stehengelassen und dann zentrifugiert ( 1 x IO4 U/min, 10 min). Der Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 zugefügt und die Mischung wurde zentrifugiert (I x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der Waschlösung zu trennen. Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und Äthanol beigefügt, um eine 80% wässrige Äthanollösung zu bilden. Diese Lösung wurde während 2 Stunden unter Eiskühlung gerührt und zentrifugiert (4000 U/min, 10 min), um die Fällung von der über5

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stehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml einer 80% wässrigen Äthanollösung und dann mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 100 mg der karzinostatischen Substanz TF-330-Fraktion erhalten wurden. Diese 100 mg wurden in 5 ml Wasser gelöst und durch Hinzufügen von 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die so vorbereitete Lösung wurde in eine Kolonne geleert, die mit 15 ml Amberlite IRA 400 (Marke von Rohm und Haas) gepackt und voreingestellt auf den OH-Typ mit 1 N wässriger Natriumhy-droxid-Lösung war. Anschliessend wurden 60 ml Wasser durch die Kolonne durchgelassen. Alle die Waschwässer wurden vereint und der pH-Wert auf 7.0 durch Hinzufügen von 1 N Salzsäure eingestellt. Diese Lösung wurde bei Unterdruck konzentriert und durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.3 um (Millipore: Handelsname der Japan Millipore Limited) gefiltert und schlussendlich gefriergetrocknet, wodurch 70 mg der gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-330 erhalten wurde. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und deren Saccharid-Gehalt lag im allgemeinen bei 20-60%, ausgedrückt in Glucose. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hoch-leistungs-Flüssigchromatogramm eines typischen Beispiels sind in den Fig. 18, 19 und 20 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser wurden 70 mg dieser obenerhaltenen Substanz TF-330 gelöst und auf einen lOOfachen Wert konzentriert, unter Benutzung eines Ultrafilters UK-50 (Handelsname für Ultrafilter Membranen von Toyo Roshi Kabushiki Kaisha, nominale Molekulargewichtskante: 50 000). Dieses Konzentrat wurde durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.2 um gefiltert und dann gefriergetrocknet, wodurch 49 mg der gereinigten, gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-330 erhalten wurden. Diese gereinigte Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und deren Saccharid-Gehalt lag im allgemeinen bei 16-30%, ausgedrückt in Glucose. Das IR- und UV-Absorp-tionsspektrum einer typischen TF-330-Substanz ist in den Fig. 21 und 22 dargestellt.

Beispiel 14

(1) In gleicher Weise wie in den Beispielen 2 (3), 7(1) oder 7 (2) wurden 4.5 g der Substanz, erhalten gemäss Beispiel 2 (1) und (2) behandelt, wodurch die karzinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 oder TF-230 erhalten wurden.

(2) Die karzinostatischen Substanzen der TF-210, TF-220 oder TF-230, erhalten gemäss (1), wurden in dergleichen Weise wie in den Beispielen 11 ( 1 ), 12(1) oder 13(1) behandelt, wodurch die gefriergetrockneten, karzinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 oder TF-330 in einer Menge von 220, 120 oder 75 mg erhalten wurden.

Die derart erhaltenen karzinostatischen Substanzen wiesen die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und die IR- und UV-Absorptionsspektren und Hochleistungs-Flüssigchroma-togramme sind im wesentlichen identisch mit denen der Beispiele 11, 12 und 13.

Beispiel 15

In der gleichen Weise wie in Beispiel 11 wurden 1.5 g der karzinostatischen Substanz TF-210 behandelt, die in Beispiel 1 erhalten wurde mit der Ausnahme, dass (a) 15 mg Trypsin (hergestellt bei Difco) anstelle von Pronase E benutzt wurde und das (b) eine 60% wässrige Äthanollösung hergestellt wurde, anstatt der 80% wässrigen Äthanollösung beim Sammeln der Fällung vom wasserlöslichen Anteil mit einem pH-Wert von 2 nach der Enzymbehandlung. Derart wurden 200 mg der gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-310 erhalten.

Auf ähnliche Weise wurden die folgenden gefriergetrockneten karzinostatischen Substanzen TF-320 und TF-330 erhalten. Die wie oben erhaltenen karzinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 wiesen die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und die IR- und UV-Absorptionsspek-tren und Hochleistungs-Flüssigchromatogramme waren im wesentlichen identisch mit denen der Beispiele 11,12 und 13

(1).

Beispiel 16

Die karzinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 oder TF-230, erhalten in Beispiel 1, Beispiel 7 (1) oder Beispiel 7

(2) wurden in der gleichen Weise wie in den Beispielen 11 (1), 12(1) oder 13(1) behandelt mit der Ausnahme, dass nach der Enzym-Behandlung eine 60% wässrige Äthanollösung verwendet wurde, anstatt eine 80% wässrige Äthanollösung; derart wurden die gefriergetrockneten karzinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 in Mengen von 190, 98 und 66 mg erhalten.

Die wie oben erhaltenen karzinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 wiesen die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und die IR- und UV-Absorptionsspektren und Hochleistungs-Flüssigchromatogramme waren im wesentlichen identisch mit denen der Beispiele 11,12 und 13(1).

Beispiel 17

Die karzinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 oder TF-230, erhalten in Beispiel 1, Beispiel 7(1) oder 7 (2) wurden in der gleichen Weise wie in den Beispielen 11 (1), 12(1) oder 13(1) behandelt mit der Ausnahme, dass nach der Enzym-Behandlung eine 60% wässrige Äthanollösung verwendet wurde, anstatt einer 80%, wodurch 192 mg, 102 mg oder 65 mg der gefriergetrockneten karzinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 oder TF-330 erhalten wurden.

Die wie oben erhaltenen karzinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 wiesen die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und die IR- und UV-Absorptionsspektren und Hochleistungs-Flüssigchromatogramme waren im wesentlichen identisch mit denen der Beispiele 11, 12 und 13 (1).

Beispiel 18

(1) In einem 90-Liter-Gärgefäss (MSJ-U2-Typ, hergestellt von Marubishi Rika Kenkyusho), wurde ein TF-f-Kulturme-dium eingesetzt, das erhalten wurde durch Beigabe zu 70 Liter destilliertes Wasser 1190 g Trypticase Pepton, 1050 g Herzinfusion, 210 g Hefeextrakt, 525 g Natriumchlorid, 840 g Glucose, 700 g Lactose, 7 g Natriumsulfit und 35 g Natrium-thioglycolat und 175 g Kalium-sekundäre Phosphate. Das Kulturmedium wurde bei 118° während 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 250 ml/min während 1 Std. durchgeleitet. In dieses Kulturmedium wurden 1 1 einer Vorkultur-Lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) eingeimpft, die hergestellt wurde durch Züchten in einem TF-f-Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen wurden während vier Tagen bei 33 °C unter Rühren mit 90 U/min gezüchtet, wobei Stickstoffgas mit einer Durchflussmenge von 250 ml/min durchgeleitet wurde. Nachher wurden der Kultur 10 g/1 Celite und 5 g/1 Zellulosepulver beigefügt und die Mischung wurde gerührt und bei Unterdruck gefiltert, wodurch 65 1 einer bakterienfreien, überstehenden Lösung erhalten wurden.

(2) Diesen 7.5 1 der überstehenden Lösung wurden 113 ml konzentrierte Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, wonach 11.41 Äthanol beigegeben wurden, um eine 60%ige wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, die während 24 Stunden bei 4 °C stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantation entnommen und der

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übrigbleibende Teil wurde zentrifugiert (4x 10-' U/min, 10 min) bei 4 JC\ um die Fällung zu gewinnen. Diese Fällung wurde nacheinander und in dieser Reihenfolge mit 200 ml Portionen einer 60%igen wässrigen Äthanol-Lösung mit einem pH-Wert von 2.0. einer 150-ml-Portion Äthanol, einer 150-ml-Portion Methanol und mit einer 150-ml-Portion Aceton gewaschen und gefriergetrocknet, wodurch 3.0 g Pulver erhalten wurden.

(3) Das aus (2) erhaltene Pulver wurde in 30 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 7.5 bis 8.0 eingestellt, durch Beigabe einer 4 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung und nach Rühren während 15 min bei Zimmertemperatur wurden 4 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 4.0 einzustellen. Dann wurde während zwei Stunden mit Eiskühlung gerührt und die Mischung wurde zentrifugiert (1 x IO4 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Zur getrennten Fällung wurden 6 ml Wasser zum Waschen hinzugefügt, wodurch eine Suspension gebildet wurde, zu der 4 N wässrige Natriumhydroxid-Lösung beigegeben wurden, um den pH-Wert auf 7.5 bis 8.0 einzustellen. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 15 min gerührt, woraufhin 4 N Salzsäure beigegeben wurden, um die Suspension auf einen pH-Wert von 4.0 zu bringen, woraufhin diese unter Eiskühlung während 2 Stunden stehengelassen wurde. Dann wurde die Suspension zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min) und die entstandene Fällung wurde mit 4 ml Wasser mit einem pH-Wert von 4.0 gewaschen und anschliessend zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), wodurch 6.2 g (Nassgewicht) einer Fällung (TF-210) erhalten wurden. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das 1R- und UV-Absorptionsspektrum waren im wesentlichen identisch mit denen von Beispiel 1.

(4) Die Fällung (6.2 g Nassgewicht), erhalten nach (3) wurde in 6 ml Wasser suspendiert. Dieser Suspension wurde unter Rühren eine gesättigte wässrige Ammoniumkarbonatlösung beigegeben, um den pH-Wert auf 7.8 einzustellen. Dann wurde die Suspension auf 37 °C erhitzt, und es wurden 21 mg Pronase E und einige Tropfen Toluol beigegeben. Diese Mischung wurde unter Schütteln einer Enzym-Behandlung bei einem pH-Wert von 7.8 bis 8.0 bei 37-40 °C während 24 Stunden unterworfen. Der pH-Wert dieser Mischung wurde auf 1.0 eingestellt, durch Beifügung von 4 N Salzsäure, wodurch eine Fällung entstand. Die Suspension wurde während 2 Stunden unter Eiskühlung stehengelassen und dann zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die überstehende Lösung zu gewinnen. Der überstehenden Lösung wurden 29 ml Äthanol beigegeben, um eine 60% wässrige Äthanol-Lösung zu bilden, wodurch eine Fällung gebildet wurde. Die Schlämmung wurde während 2 Stunden unter Eiskühlung stehengelassen und dann zentrifugiert (6x 10J U/min, 10 min), um die Fällung zu gewinnen. Die Fällung wurde mit 5 ml einer 60% wässrigen Äthanol-Lösung gewaschen, dann mit 10 ml Äthanol und 10 ml Aceton und dann luftgetrocknet, um 315 mg Rohkristalle der karzinostatischen Substanz TF-310 zu erhalten.

Diese Rohkristalle (315 mg) wurden in 30 ml Wasser gelöst und durch Beigabe von 4 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 8.0 gebracht. Diese Lösung wurde in eine mit 30 ml Dowex 1 x 104 (Handelsname der Dow Chemical) Cl-Typ gepackte Kolonne gefüllt.

Danach wurden 100 ml Wasser durch die Kolonne gelassen und alle Waschwässer wurden vereint auf einen pH-Wert von 6.5-7.0 eingestellt und durch ein Ultrafilter UK-50 gefiltert, woraufhin das Filtrat auf eine lOOx grössere Konzentration als die ursprüngliche konzentriert wurde. Dieses Konzentrat wurde durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.3 ,am gefiltert und gefriergetrocknet, wodurch 230

mg der gefriergetrockneten, gereinigten karzinostatischen Substanz TF-310 erhalten wurden.

Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf und deren Saccharid-Gehalt war im allgemeinen um 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose. Ein typisches IR- und UV-Absorptionsspektrum und Hochleistungs-Flüssigchromato-gramm sind in den Fig. 23, 24 und 25 dargestellt.

Beispiel 19

(1) In 10 ml Wasser wurden 0.9 g der karzinostatischen Substanz TF-240 suspendiert, die wie gemäss Beispiel 7 (3) erhalten wurde. Diese Suspension wurde 1 N einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Rühren beigemengt, um den pH-Wert auf 7.8 einzustellen. Dann wurde die Suspension auf 37 °C erhitzt und 9.0 mg Pronase E und mehrere Tropfen Toluol beigefügt. Unter Schütteln wurde die Mischung einer Enzym-Behandlung bei einem pH-Wert von 7.8 bis 8.0 bei 37-40 °C während 24 Stunden unterworfen. Nach dieser Behandlung wurde die Mischung zentrifugiert (4 000 000 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Dieser Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 8.0 beigefügt und die Mischung zentrifugiert (4000 U/min, 10 min). Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und es wurde 1 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, woraufhin sich eine Fällung bildete. Diese Mischung wurde bei 5 °C während 12 Stunden stehengelassen und dann zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min). Der Fällung wurden 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 zugefügt und die Mischung wurde zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der Waschlösung zu trennen. Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und Äthanol beigefügt, um eine 80% wässrige Äthanollösung zu bilden. Diese Lösung wurde während 2 Stunden unter Eiskühlung gerührt und zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml einer 80% wässrigen Äthanollösung und dann mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 170 mg der karzinostatischen Substanz TF-340-Fraktion erhalten wurden. Diese 150 mg wurden in 5 ml Wasser gelöst und durch Hinzufügen von 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die so vorbereitete Lösung wurde in eine Kolonne gegeben, die mit 25 ml Amberlite IRA 400 gepackt und voreingestellt auf den OH-Typ mit 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung war. Anschliessend wurden 100 ml Wasser durch die Kolonne durchgelassen. Alle die Waschwässer wurden vereint und der pH-Wert auf 7.0 durch Hinzufügen von 1 N Salzsäure eingestellt. Diese Lösung wurde bei Unterdruck konzentriert und durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.3 um gefiltert und schlussendlich gefriergetrocknet,

wodurch 110 mg der gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-340 erhalten wurde. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchroma-togramm waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 19.

Beispiel 20

In der gleichen Weise wie in Beispiel 19 wurden 0.9 g der karzinostatischen Substanz TF-240, erhalten gemäss Beispiel 8, behandelt und 115 mg gefriergetrockneter karzinostatischer Substanz TF-340 erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das IR- und UV-Absorptionsspektrum und Hochleistungs-Flüssigchromatogramm waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 19.

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Beispiel 21

In der gleichen Weise wie in Beispiel 19 wurden 0.9 g der karzinostatischen Substanz TF-240, erhalten gemäss Beispiel 7 (3), behandelt mit der Ausnahme, dass (a) die Enzym-Behandlung mit 9 mg Trypsin (hergestellt durch Difco} anstelle von Pronase E und (b), nach der Enzym-Behandlung, beim Gewinnen der Fällung vom wasserlöslichen Anteil mit einem pH-Wert on 2.0, eine 60% wässrige Äthanol-Lösung gebildet wurde, anstatt einer 80%igen. Derart wurden 105 mg gefriergetrockneter karzinostatischer Substanz TF-340 erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaft gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramin waren identisch mit denen von Beispiel 19.

Beispiel 22

Die karzinostatische Substanz TF-240, erhalten gemäss Beispiel 7 (3), wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 19 behandelt mit der Ausnahme, dass nach der Enzym-Behandlung, beim Gewinnen der Fällung vom wasserlöslichen Anteil mit einem pH-Wert von 2.0, eine 60% wässrige Äthanol-Lösung gebildet wurde, anstelle einer 80%igen. Derart wurden 101 mg gefriergetrockneter karzinostatischer Substanz TF-340 erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-FIiissigchromatogramm waren identisch mit denen von Beispiel 19.

Beispiel 23

Die nach Beispiel 7 (3) erhaltene karzinostatische Substanz TF-240 wurde der gleichen Enzym-Behandlung wie in Beispiel 19 unterworfen, nach welcher anstelle der Gewinnung der Fällung vom wasserlöslichen Anteil mit einem pH-Wert von 2.0 die Fällung gewonnen wurde, indem eine 40% Trichloressigsäure einer Trichloressigsäurekonzentration von 10% hinzugefügt wurde, und der wasserlösliche Anteil in eine 80% wässrige Äthanol-Lösung überführt wurde. Anschliessend wurde die gleiche Behandlung wie in Beispiel 19 durchgeführt und 99 mg einer gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-340 erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm waren identisch mit denen von Beispiel 19.

Beispiel 24

In 10 ml Wasser wurden 0.82 g der karzinostatischen Substanz TF-250 suspendiert, die wie gemäss Beispiel 7 (4) erhalten wurde. Dieser Suspension wurde 1 N einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Rühren beigemengt, um den pH-Wert auf 7.8 einzustellen. Dann wurde die Suspension auf 37 °C erhitzt und 8 mg Pronase E und mehrere Tropfen Toluol beigefügt. Unter Schütteln wurde die Mischung einer Enzym-Behandlung bei einem pH-Wert von 7.8 bis 8.0 bei 37-40 °C während 24 Stunden unterworfen. Nach dieser Behandlung wurde die Mischung zentrifugiert (4 000 000 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Dieser Fällung wurden 3 ml Wasser mit einem pH-Wert von 8.0 beigefügt und die Mischung zentrifugiert (4000 U/min, 10 min). Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurden vereint und es wurde 1 N Salzsäure beigegeben, um den pH-Wert auf 2.0 einzustellen, woraufhin sich eine Fällung bildete. Diese Mischung wurde bei 5 °C während 12 Stunden stehengelassen und dann zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min). Der Fällung wurden 5 ml Wasser mit einem pH-Wert von 2.0 zugefügt und die Mischung wurde zentrifugiert ( 1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der Waschlösung zu trennen. Die Waschlösung und die überstehende Lösung wurde vereint und Äthanol beigefügt, um eine

80% wässrige Äthanollösung zu bilden. Diese Lösung wurde während 2 Stunden unter Eiskühlung gerührt und zentrifugiert (1 x 104 U/min, 10 min), um die Fällung von der überstehenden Lösung zu trennen. Die Fällung wurde mit 5 ml einer 80% wässrigen Äthanollösung und dann mit 5 ml Äthanol gewaschen und bei Unterdruck getrocknet, wodurch 430 mg der karzinostatischen Substanz TF-350-Fraktion erhalten wurden. Diese 300 mg wurden in 5 ml Wasser gelöst und durch Hinzufügen von I N wässriger Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die so vorbereitete Lösung wurde in eine Kolonne gegeben, die mit 45 ml Amberlite IRA 400 gepackt und voreingestellt auf den OH-Typ mit 1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung war. Anschliessend wurden 200 ml Wasser durch die Kolonne durchgelassen. Alle die Waschwässer wurden vereint und der pH-Wert auf 7.0 durch Hinzufügen von 1 N Salzsäure eingestellt. Diese Lösung wurde bei Unterdruck konzentriert und durch ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0.3 um gefiltert und schlussendlich gefriergetrocknet,

wodurch 260 mg der gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-350 erhalten wurde. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchroma-togramm eines typischen Beispiels sind in den Fig. 29, 30 und 31 dargestellt.

Beispiel 25

In der gleichen Weise wie in Beispiel 24 wurden 0.85 g der gemäss Beispiel 9 erhaltenen karzinostatischen Substanz TF-250 einer Enzym-Behandlung unterworfen, durch die Benutzung von 8 mg Pronase E, um 265 mg einer gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-350 zu erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das IR- und UV-Absorptionsspektrum und Hochleistungs-Flüssigchromatogramm waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 24.

Beispiel 26

In der gleichen Weise wie in Beispiel 24 wurden 0.80 g der gemäss Beispiel 10 erhaltenen karzinostatischen Substanz TF-250 einer Enzym-Behandlung unterworfen, durch die Benutzung von 8 mg Pronase E, um 253 mg einer gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-350 zu erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das IR- und UV-Absorptionsspektrum und Hochleistungs-Flüssigchromatogramm waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 24.

Beispiel 27

In der gleichen Weise wie in Beispiel 24 wurden 0.85 g der karzinostatischen Substanz TF-250, erhalten gemäss Beispiel 7 (4), behandelt mit der Ausnahme, dass (a) die Enzym-Behandlung mit 8 mg Trypsin (hergestellt durch Difco) anstelle von Pronase E und (b), nach der Enzym-Behandlung, beim Gewinnen der Fällung vom wasserlöslichen Anteil mit einem pH-Wert von 2.0, eine 60% wässrige Äthanol-Lösung gebildet wurde, anstatt einer 80%igen. Derart wurden 247 mg gefriergetrockneter karzinostatischer Substanz TF-350 erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das IR- und UV-Absorptionsspektrum und Hochleistungs-Flüssigchromato-gramm waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 24.

Beispiel 28

0.85 g der karzinostatischen Substanz TF-250, erhalten gemäss Beispiel 7 (4), wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 24 behandelt mit der Ausnahme, dass nach der

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Enzym-Behandlung, beim Gewinnen der Fällung vom wasserlöslichen Anteil mit einem pH-Wert von 2.0, eine 60% wässrige Äthanollösung gebildet wurde, anstelle einer 80%igen. Derart wurden 242 mg gefriergetrockneter karzinostatischer Substanz TF-350 erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf, und das IR- und UV-Absorptionsspektrum und Hochleistungs-Flüssigchromato-gramm waren im wesentlichen identisch mit denjenigen von Beispiel 24.

Beispiel 29

0.8 g der karzinostatischen Substanz TF-250, erhalten gemäss Beispiel 7 (4) wurde der gleichen Enzym-Behandlung wie in Beispiel 24 unterworfen, nach welcher anstelle der Gewinnung der Fällung vom wasserlöslichen Anteil mit einem pH-Wert von 2.0 die Fällung gewonnen wurde, indem eine 40% Trichloressigsäure einer Trichloressigsäurekonzen-tration von 10% hinzugefügt wurde, und der wasserlösliche Anteil in eine 80% wässrige Äthanollösung überführt wurde. Anschliessend wurde die gleiche Behandlung wie in Beispiel 24 durchgeführt und 238 mg einer gefriergetrockneten karzinostatischen Substanz TF-350 erhalten. Diese Substanz wies die Eigenschaften gemäss Tabelle 2 auf. Das IR- und UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchroma-togramm waren im wesentlichen identisch mit denen von Beispiel 24.

Arzneimittel Beispiel 1

Eine verdünnte wässrige Natriumhydroxid-Lösung wurde zu 3 bis 4 mg Pulver der karzinostatischen Substanz TF-210 beigegeben, um eine Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 zu ergeben. Der wasserlösliche Anteil dieser Lösung wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 2

Eine verdünnte wässrige Natriumhydroxid-Lösung wurde zu 2 bis 3 mg Pulver der karzinostatischen Substanz TF-220 beigegeben, um eine Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 zu ergeben. Der wasserlösliche Anteil dieser Lösung wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 3

Eine verdünnte wässrige Natriumhydroxid-Lösung wurde zu 1 mg Pulver der karzinostatischen Substanz TF-230 beigegeben, um eine Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 zu ergeben. Der wasserlösliche Anteil dieser Lösung wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 4

Eine verdünnte wässrige Natriumhydroxid-Lösung wurde zu 1 mg Pulver der karzinostatischen Substanz TF-240 beigegeben, um eine Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 zu ergeben. Der wasserlösliche Anteil dieser Lösung wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5°«igen Lidocainlösung. einer 5"»igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 5

Eine verdünnte wässrige Natriumhydroxid-Lösung wurde zu 1 mg Pulver der karzinostatischen Substanz TF-250 beigegeben, um eine Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 zu ergeben. Der wasserlösliche Anteil dieser Lösung wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 6

Eine die karzinostatische Substanz TF-310-1 enthaltende wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wodurch ein die karzinostatische Substanz TF-310 enthaltendes Arzneimittel mit einer 0.5 oder 1 mg Einheit erhalten wurde. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 7

Eine die karzinostatische Substanz TF-310-2 enthaltende wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wodurch ein die karzinostatische Substanz TF-310 enthaltendes Arzneimittel mit einer 0.5 oder 1 mg Einheit erhalten wurde. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 8

Eine die karzinostatische Substanz TF-320 enthaltende wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wodurch ein die karzinostatische Substanz TF-320 enthaltendes Arzneimittel mit einer 0.5 oder 1 mg Einheit erhalten wurde. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 9

Eine die karzinostatische Substanz TF-330 enthaltende wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wodurch ein die karzinostatische Substanz TF-330 enthaltendes Arzneimittel mit einer 0.5 oder I mg Einheit erhalten wurde. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

Arzneimittel Beispiel 10

Eine die karzinostatische Substanz Tf-340 enthaltende wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wodurch ein die karzinostatische Substanz TF-340 enthaltendes Arzneimittel mit einer 0.5 oder 1 mg Einheit erhalten wurde. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufgelöst. die dann als Injektion verwendet werden kann.

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Arzneimittel Beispiel 11

Eine die karzinostatische Substanz TF-350 enthaltende wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 7.0 bis 7.5 wurde in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wodurch ein die karzinostatische Substanz TF-350 enthaltendes Arzneimittel'

mit einer 0.5 oder 1 mg Einheit erhalten wurde. Für die Benutzung wird der Inhalt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0.5"oigen Lidocainlösung, einer 5"oigen wässrigen Glucose-Lösung oder dergleichen aufge-5 löst, die dann als Injektion verwendet werden kann.

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16 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung der karzinostatischen TF-2-Substanz 210, 220, 230,240,250, 310,320, 330,340, 350,

indem die Substanz erzeugende zum Fusobacterium genus gehörende Bakterien gezüchtet werden, und die Substanz von der Kultur oder deren überstehenden Lösung gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die TF-2 erzeugenden, zum Fusobacterium genus gehörenden Bakterien gezüchtet werden, ein hydrophiles organisches Lösungsmittel der resultierenden überstehenden Lösung zugefügt wird, und die Substanz TF-2 von der sich ergebenden Fällung erhalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällung gesammelt und in Abhängigkeit des pH-Wertes fraktioniert wird, und die dadurch erhaltenen karzinostatischen Substanzen eingesammelt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung von TF-210 oderTF-230, dadurch gekennzeichnet, dass eine in Wasser unlösliche Fraktion bei einem pH-Wert von 3,5 bis 4,5 gesammelt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4 zur Herstellung von TF-210, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorgehen, bei welchem die Fällung in Abhängigkeit vom pH-Wert fraktioniert wird, ein Vorgehen ist, bei welchem Wasser hinzugefügt wird und der pH-Wert auf 3.5 bis 4.5 eingestellt, und der erhaltene wasserunlösliche Anteil gesammelt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung von TF-220, dadurch gekennzeichnet, dass ein in Wasser unlöslicher Anteil bei einem pH-Wert von 5.5 bis 6.5 gesammelt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung von TF-230, dadurch gekennzeichnet, dass ein in Wasser löslicher Anteil bei einem pH-Wert von 5.5 bis 6.5, der in Wasser unlöslich ist, bei einem pH-Wert von 3.5 bis 4.5 gesammelt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung von TF-240, dadurch gekennzeichnet, dass ein in Wasser löslicher Anteil bei einem pH-Wert von 3.5 bis 4.5, der in Wasser unlöslich ist, bei einem pH-Wert von 1.5 bis 2.5 gesammelt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung von TF-250, dadurch gekennzeichnet, dass ein in Wasser löslicher Anteil bei einem pH-Wert von 1.5 bis 2.5 gesammelt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die karzinostatische Substanz TF-2 einer deproteinisie-renden Behandlung unterworfen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällung einer deproteinisierenden Behandlung unterworfen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die deproteinisierende Behandlung eine Enzym-Behand-lung mit einem proteolytischen Enzym ist.
13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die karzinostatische Substanz einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym unterworfen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung von TF-310 oderTF-330, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion in Wasser unlöslich ist bei einem pH-Wert von 3.5 bis 4.5.
15. Verfahren nach Anspruch 14 zur Herstellung von TF-310, dadurch gekennzeichnet, dass der wasserunlösliche Anteil durch Beifügen von Wasser zur Fällung und durch Einstellen des pH-Wertes auf 3.5 bis 4.5 erhalten wird.
16. Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung von TF-320, dadurch gekennzeichnet, dass der einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym unterworfene karzinostatische Anteil ein in Wasser unlöslicher Anteil bei einem pH-Wert von 5.5 bis 6.5 ist.
17. Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung von TF-330, dadurch gekennzeichnet, dass der einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym unterworfene karzinostatische Anteil ein in Wasser löslicher Anteil bei einem pH-Wert von 5.5 bis 6.5 ist, der bei einem pH-Wert von 3.5 bis 4.5 wasserunlöslich ist.
18. Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung von TF-340, dadurch gekennzeichnet, dass der einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym unterworfene karzinostatische Anteil ein in Wasser löslicher Anteil bei einem pH-Wert von 3.5 bis 4.5 ist, der bei einem pH-Wert von 1.5 bis 2.5 wasserunlöslich ist.
19. Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung von TF-350, dadurch gekennzeichnet, dass der mit einem proteolytischen Enzym zu behandelnde Anteil in Wasser löslich ist bei einem pH-Wert von 1.5 bis 2.5.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das proteolytische Enzym ein Pronase oder Trypsin ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Sammeln der karzinostatischen Substanzanteile nach der Enzymbehandlung durchgeführt wird, indem die Anteile durch mindestens eine der pH-abhängigen Fraktionierungen, gesonderte Fällung vom hydrophilen organischen Lösungsmittel, einem Ultra-Filtra-tionsverfahren, eine Fraktionierung mit einem Ionenaustauscher und Sammeln der karzinostatischen Substanz-Fraktionen durchgeführt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Sammeln der karzinostatischen Substanzanteile nach der Enzymbehandlung durchgeführt wird durch Fraktionieren des wasserlöslichen Anteils nach der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym, Einstellen des pH-Wertes des wasserlöslichen Anteils auf 2.5 oder weniger, Beifügen des hydrophilen organischen Lösungsmittels zum so erhaltenen wasserlöslichen Anteil, Behandeln der entstandenen Fällung mit einem Ionenaustauscher und Sammeln des unadsor-bierten Anteils.
23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Sammeln des karzinostatischen Substanzanteils nach der Enzymbehandlung durchgeführt wird durch Fraktionieren des wasserlöslichen Teils nach der Enzymbehandlung in Abhängigkeit vom pH-Wert, Einstellen des pH-Wertes auf 2.5 oder weniger, Beifügen des hydrophilen organischen Lösungsmittels zum effektiven Teil des so erhaltenen wasserlöslichen Anteils, Behandeln der entstandenen Fällung mit einem Ionenaustauscher und Ultra-Filtration des unadsor-bierten Anteils.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 23,

dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile organische Lösungsmittel der überstehenden Lösung der auf einen pH-Wert von 1.5 bis 2.5 eingestellten Kultur beigefügt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 24,

dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile organische Lösungsmittel ein Alkohol ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 25,

dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile organische Lösungsmittel der überstehenden Lösung der Kultur beigefügt wird, bis die Konzentration des Lösungsmittels in der dadurch entstandenen Lösung 30 bis 80 Vol.-% beträgt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26,

dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, Vitaminquellen, Reduzierungsmittel und anorganische Salze oder anorganische Salze und Agar enthält.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26,

dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht

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Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28,

dadurch gekennzeichnet, dass das Züchten bei einer Temperatur von 30-42 °C während 1-5 Tagen in einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von 6.0 bis 8.5 durchgeführt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29,

dadurch gekennzeichnet, dass das Züchten bei einer Temperatur von 32 bis 37 °C während 1-4 Tagen in einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von 6.5 bis 7.5 durchgeführt wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30,

dadurch gekennzeichnet, dass das zum Fusobakterium genus gehörende Bakterium ein Fusobakterium nucleatum ist.
32. Verfahren nach Anspruch 4 zur Herstellung von TF-210, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion und Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit oder Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0 und dann auf 3.5 bis 4.5 eingestellt wird, und die gebildete Fällung gesammelt und gegebenenfalls die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird.
33. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung von TF-220, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0 und dann auf 5.5 bis 6.5 eingestellt wird, und die gebildete Fällung gesammelt und gegebenenfalls die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird.
34. Verfahren nach Anspruch 4 zur Herstellung von TF-230, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-0/o beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0 und dann auf 5.5 bis 6.5 eingestellt wird, die überstehende Lösung gesammelt, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 3.5 bis 4.5 eingestellt und die Fällung gesammelt wird, wobei die pH-abhängige Fraktionierung gegebenenfalls wiederholt wird.
35. Verfahren nach Anspruch 8 zur Herstellung von TF-240, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn- und Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-0/o beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0,

dann auf 3.5 bis 4.5 eingestellt wird, die überstehende Lösung herausgenommen und deren pH-Wert auf 1.5 bis 2.5 eingestellt wird, woraufhin die erhaltene Fällung gesammelt wird und, falls notwendig, die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird.
36. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von TF-250, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0,

dann auf 1.5 bis 2.5 eingestellt wird, die überstehende Lösung herausgenommen und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 20-80 Vol.-% beträgt und die so gebildete Fällung gesammelt wird.
37. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung von TF-310, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser diese Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0 dann auf 3.5 bis 4.5 eingestellt, und die gebildete Fällung gesammelt wird und gegebenenfalls die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird, Wasser der Fällung beigegeben und der pH-Wert auf 7-8 eingestellt wird, dann Pronase oderTrypsin beigegeben wird und die Mischung einer Enzymbehandlung

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bei 30-40 °C während 1-72 Stunden unterworfen wird, der pH-Wert der so behandelten Mischung auf 2.5 oder weniger eingestellt, und die überstehende Lösung getrennt wird, ein Alkohol dieser überstehenden Lösung beigegeben wird, so dass die Alkoholkonzentration in dieser Mischung 30-80 Vol.-% beträgt und die gebildete Fällung gesammelt wird oder, falls notwendig, die Fällung mit einem starken Anio-nenaustauscherharz behandelt wird und dessen unadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterworfen wird, dann durch ein Millipore-Filter gefiltert und gefriergetrocknet wird.
38. Verfahren nach Anspruch 16 zur Herstellung von TF-320, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol,-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0 dann auf 5.5 bis 6.5 eingestellt wird, und die gebildete Fällung gesammelt und gegebenenfalls die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird, Wasser der Fällung beigegeben und der pH-Wert auf 7-8 eingestellt wird, dann Pronase oderTrypsin beigegeben wird und die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30-40 °C während 1-72 Stunden unterworfen wird, der pH-Wert der so behandelten Mischung auf 2.5 oder weniger eingestellt, und die überstehende Lösung getrennt wird, ein Alkohol dieser überstehenden Lösung beigegeben wird, so dass die Alkoholkonzentration in dieser Mischung 30-80 Vol.-% beträgt und die gebildete Fällung gesammelt wird oder, falls notwendig, die Fällung mit einem starken Anio-nenaustauscherharz behandelt wird und dessen unadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterworfen wird, dann durch ein Millipore-Filter gefiltert und gefriergetrocknet wird.
39. Verfahren nach Anspruch 17 zur Herstellung von TF-330, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0 dann auf 5.5 bis 6.5 eingestellt wird, die überstehende Lösung gesammelt und auf einen pH-Wert von 3.5 bis 4.5 eingestellt wird, und die gebildete Fällung gesammelt und gegebenenfalls die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird, Wasser der Fällung beigegeben und der pH-Wert auf 7-8 eingestellt wird, dann Pronase oderTrypsin beigegeben und die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30-40 °C während 1-72 Stunden unterworfen wird, der pH-Wert der so behandelten Mischung auf 2.5 oder weniger eingestellt, und die überstehende Lösung getrennt wird, ein Alkohol dieser überstehenden Lösung beigegeben wird, so dass die Alkoholkonzentration in dieser Mischung 30-80 Vol.-"o beträgt und die gebildete Fällung gesammelt oder, falls notwendig, die Fällung mit einem starken Anionenaustausçherharz behandelt wird und dessen unadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterworfen, dann durch ein Millipore-Filter gefiltert und gefriergetrocknet wird.
40. Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung von TF-340, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0,

dann auf 3.5 bis 4.5 eingestellt wird, die überstehende Lösung gesammelt und auf einem pH-Wert von 1.5 bis 2.5 eingestellt wird, und die gebildete Fällung gesammeir und gegebenenfalls die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird, Wasser der Fällung beigegeben und der pH-Wert auf 7-8 eingestellt wird, dann Pronase oder Trypsin beigegeben und die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30-40 °C während 1-72 Stunden unterworfen wird, der pH-Wert der so behandelten Mischung auf 2.5 oder weniger eingestellt, und die überstehende Lösung getrennt wird, ein Alkohol dieser überstehenden Lösung beigegeben wird, so dass die Alkoholkonzentration in dieser Mischung 30-80 Vol.-% beträgt und die gebildete Fällung gesammelt oder, falls notwendig, die Fällung mit einem starken Anionenaustausçherharz behandelt wird und dessen unadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterworfen, dann durch ein Millipore-Filter gefiltert und gefriergetrocknet wird.
41. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von TF-350, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobakterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C während 1-5 Tagen gezüchtet wird in einem Kulturmedium, das Trypticase Pepton, eine Gehirn-Herz-Infusion oder Herzinfusion, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglycolat, diese acht Komponenten und Agar, die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton und L-Cystin oder die acht Komponenten, Phyton Pepton, Proteose Pepton, L-Cystin und Agar enthält; die überstehende Lösung der Kultur herausgenommen, der pH-Wert der überstehenden Lösung auf 1.5 bis 2.5 eingestellt und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in der entstehenden Lösung 50-70 Vol.-% beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und Wasser dieser Fällung beigegeben wird, der pH-Wert der Mischung auf 7.5 bis 8.0,

dann auf 1.5 bis 2.5 eingestellt wird, die überstehende Lösung herausgenommen und ein Alkohol beigegeben wird, so dass dessen Konzentration in, der entstehenden Lösung 20-80 Vol. -°/o beträgt, und die gebildete Fällung gesammelt und gegebenenfalls die pH-abhängige Fraktionierung wiederholt wird, Wasser der Fällung beigegeben und der pH-Wert auf 7-8 eingestellt wird, dann Pronase oder Trypsin beigegeben, und die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30-40 °C während 1-72 Stunden unterworfen wird, der pH-Wert der so behandelten Mischung auf 2.5 oder weniger eingestellt, und die überstehende Lösung getrennt wird, ein Alkohol dieser überstehenden Lösung beigegeben wird, so dass die Alkoholkonzentration in dieser Mischung 30-80 Vol.-% beträgt und

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die gebildete Fällung gesammelt oder, falls notwendig, die Fällung mit einem starken Anionenaustausçherharz behandelt wird und dessen unadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterworfen wird, dann durch ein Millipore-Filter gefiltert und gefriergetrocknet wird.
42. Karzinostatische Substanz TF-210 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Verbreitung des Ehrlich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor, Sarkom 180 und B-16 Melanom der Maus, und weist eine immunostimulierende Aktivität auf.

c) Es ist in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther unlöslich.

d) Es besitzt keinen klaren Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 160-235 °C.

e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm"1 auf.

f) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von 7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Absorptionsspitze in der Nähe von 248-265 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion.

h) Elementaranalyse-Werte C: 40-43% H:5-7% N: 9-10%.

i) Der Saccharid-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefel-säure-Verfahren beträgt 5-25 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's-Methode ist 20-50 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.
43. Karzinostatische Substanz TF-220 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Verbreitung des Ehrlich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor, Sarkom 180 und B-16-Meia-nom der Maus, und weist eine immunostimulierende Aktivität auf.

c) Es ist in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther unlöslich.

d) Es besitzt keinen klaren Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 160-240 °C.

e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm-' auf.

0 Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von 7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Absorptionsspitze der der Nähe von 248-266 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion.

h) Elementaranalyse-Werte C: 40-42% H:5-7% N: 7-9%.

i) Der Saccharid-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefel-säure-Verfahren ist 5-20 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's Methode ist 10 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.
44. Karzinostatische Substanz TF-230 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Verbreitung des Ehrlich-Aszites-

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Tumor, Ehrlich fester Tumor, Sarkom 180 und B-16-Mela-nom der Maus, und weist eine immunostimulierende Aktivität auf.

c) Es ist in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther unlöslich.

d) Es besitzt keinen klaren Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 185-225 °C.

e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm"1 auf.

0 Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von 7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Adsorptionsspitze der der Nähe von 249-264 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion.

h) Elementaranalyse-Werte C: 42-45% H:5-7% N: 10-11%.

i) Der Saccharid-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefel-säure-Verfahren ist 5-25 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's-Methode ist 30-60 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.
45. Karzinostatische Substanz TF-240 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Verbreitung des Ehrlich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor, Sarkom 180 und B-16-Meia-nom der Maus, und weist eine immunostimulierende Aktivität auf.

c) Es ist in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther unlöslich.

d) Es besitzt keinen klaren Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 200-215 °C.

e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3600-3200,2950-2920, 1680-1620, 1550-1520,

1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 und 820 cm -1 auf.

0 Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von 7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Absorptionsspitze der der Nähe von 250-265 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion.

h) Elementaranalyse-Werte C: 35-38% H:4-5% N: 12-14%.

i) Der Saccharid-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefel-säure-Verfahren ist 15-35 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's-Methode ist 20-30 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.
46. Karzinostatische Substanz TF-250 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Verbreitung des Ehrl ich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor, Sarkom 180 und B-16-Mela-nom der Maus, und weist eine immunostimulierende Aktivität auf.

c) Es ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther.

d) Es besitzt keinen klaren Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 165 bis 210°.

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e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150-1120, 1080-1020, 980 und 810 cm-1.

f) Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von 7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Absorptionsspitze der der Nähe von 248-269 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion.

h) Elementaranalvse-Werte C: 30-33% H:3-5% N: 3-5%,

i) Der Saccharid-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefelsäure-Verfahren ist 60-80 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's-Methode ist 5-20 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.
47. Karzinostatische Substanz TF-310, TF-320, TF-330 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Verbreitung des Ehrlich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor, Sarkom 180 und B-16-Mela-nom der Maus, und weist eine immunostimulierende Aktivität auf.

c) Es ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther.

d) Sie weist keinen klaren Schmelzpunkt auf, die Zersetzung beginnt bei ca. 180 ÖC und merklich nicht unter 195 °C.

e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3500-3300,2920,2850, 1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020, 970 und 820-800 cm~

f) Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von 7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Absorptionsspitze der der Nähe von 246-280 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion, jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion,

h) Elementaranalyse-Werte C: 38-47% H:5-7% N: 1-4%

i) Der Saccharid-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefelsäure-Verfahren ist 16-60 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's-Methode ist 10 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.
48. Karzinostatische Substanz TF-310, TF-320, TF-330 oder deren Salze, nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass der Saccharid-Gehalt, bestimmt durch das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, 16-30 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, beträgt.
49. Karzinostatische Substanz TF-310, TF-320, TF-330 oder deren Salze, nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass der Saccharid-Gehalt, bestimmt durch das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, 20-60 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, beträgt.
50. Karzinostatische Substanz TF-340 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Ausbreitung des Ehrlich-Aszites-Tumor von Mäusen und besitzt eine immunostimulierende Aktivität.

c) Es ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther.

d) Sie weist keinen klaren Schmelzpunkt auf, die Zerset-

5 zung beginnt bei ca. 140 °C und merklich bei 200 °C und darüber.

e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1640, 1580-1520,

10 1460-1440, 1410-1340, 1250-1220, 1120-1030, 970 und 835 cm-1.

f) Das Ultraviölettabsorptionsspektrum einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von 7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und

15 eine Absorptionsspitze der der Nähe von 250-265 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion, jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion.

20 h) Elementaranalyse-Werte C: 32-34% H:4-6% N: 3-5%.

i) Der Saccharid-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefel-säure-Verfahren ist 20-50 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose,

25 und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's-Methode ist 10 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.
51. Karzinostatische Substanz TF-350 oder deren Salz, mit folgenden Eigenschaften:

30 a) Gräuliches Weisslicht-Braunpulver.

b) Es verhindert die Ausbreitung des Ehrlich-Aszites-Tumor von Mäusen und besitzt eine immunostimulierende Aktivität.

c) Es ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol,

35 Äthanol, Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und
'. Diäthyläther.

d) Sie weist keinen klaren Schmelzpunkt auf, die Zersetzung beginnt bei ca. 110 °C und merklich bei 180 °C, und darüber.

40 e) Deren Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten durch ein KBr-Tablettenverfahren, weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100, 1080-1020,970 und 820-800 cm-'.

f) Das Ultravioleftabsorptionsspektrum einer wässrigen

45 Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei einem pH-Wert von

7.0 weist eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Absorptionsspitze in der Nähe von 245-264 nm auf.

g) Sie ist positiv bei der Molischen Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion,

50 Indol-Salzsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion, jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion.

h) Elementaranalyse-Werte C: 34-37% H:5-6% N: 1-2%.

i) Der Saccharide-Gehalt des wasserlöslichen Anteils bei

55 einem pH-Wert von 7, bestimmt durch ein Phenol-Schwefelsäure-Verfahren ist 80-95 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin's-Methode ist 10 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderalbuminserum.

60 52. Karzinostatisches Mittel, dadurch gekennzeichnet,

dass es eine karzinostatische Substanz TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-310, TF-320 oder TF-330, TF-340 oder TF-350 oder deren Salze nach einem der Ansprüche 42 bis 51 enthält.

65 53. Karzinostatisches Mittel nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass es die karzinostatische Substanz TF-310, TF-320 oder TF-330 oder deren Salze enthält.

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In den letzten Jahren wurde häufig für die Krebsbehandlung ein Heilmittel verwendet, welches die immunologischen Funktionen des Wirtes verstärkt und dadurch einen karzinostatischen Effekt hervorruft. Als Antitumormittel, die in solchen Heilmitteln verwendet werden, sind Komponenten bekannt, die von Organismen von verschiedenen Bakterien oder Kulturen von verschiedenen Bakterien oder Polysacchariden, erhalten aus Fruchtkörpern der Basidiomycetes oder deren gezüchteten Pilzkörpern gewonnen werden.

Die Erfinder haben die pharmakologischen Aktivitäten einer überstehenden Lösung untersucht, die erhalten wurde durch Züchten von Bakterien des Fusobakteriums genus und Entfernen der Organismen von der Kultur, wodurch gefunden wurde, dass eine spezifische Komponente aus der überstehenden Lösung eine karzinostatische Aktivität aufweist. Diese Komponente weist auch eine indirekte karzinostatische Aktivität auf, durch Erhöhung der vom Wirt vermittelten Antitumoraktivität oder durch die Immunität des Wirtes und durch Benützung der Hilfe durch die Immunität. Ausserdem weist diese Komponente eine sehr geringe Toxizität auf und kann auch durch Behandlung der Kultur erhalten werden.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Züchtung von Bakterien anzugeben, die zum Fusobakterium genus gehören, und dies unter anaerobischen Bedingungen, und neue TF-2-Substanzen zu gewinnen, die karzinostatische und immunostimulierende Aktivitäten aufweisen. Ein anderes Ziel liegt darin, solche TF-2-Substanzen und karzinostatische Mittel mit TF-2-Substanzen vorzusehen. Diese Ziele werden durch die in den Ansprüchen angegebene Verfahren, Substanz und Mittel mit solchen Substanzen erreicht.

Für diese Erfindung können solche Bakterien benutzt werden, die zum Fusobakterium genus gehören und dort werden beispielsweise die Fusobakterium nucleatum bevorzugt. Namentlich werden die Fusobakterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) und Zuchten, von denen angenommen wird, dass sie diese Eigenschaften aufweisen, insbesondere spontane Mutanten und künstlich veränderte Zuchten bevorzugt.

Der Stamm TF-031 wurde am 23. Mai 1980 in der American Type Culture Collection, 12301 Parlawn Drive, Rockville, Maryland 20852/USA hinterlegt und erhielt die Nummer ATCC 31647. Die bakteriologischen Eigenschaften des Fusobacterium nucleatum TF-031 sind die folgenden:

(I) Form

1 ) Form der Zellen : spindelförmig (Figur 1 )

2) Polymorphismus der Zellen: abwesend

3) Bewegungsfähigkeit: abwesend 5 4) Sporen: abwesend

5) Gramanfärbung: Gram negativ

6) Säurewiderstand: negativ

(II) Wachstumsbedingungen in einem Kulturmedium 1 ) TF-a Agarplatte und geneigtes Kulturmedium io Äussere Form: rund Grösse: ungefähr 1 mm Protuberanze: halbkugelförmige Form Struktur: Tautropfen ähnlich Oberfläche: glatt 15 Kanten: glatt

Farbe: milchig-gelbliches Weiss Durchsichtigkeit: opak 2) TF-a Flüssiges Kulturmedium Wachstumsgrad: kräftig 2o Trübungsgrad: coagulum Fällung: keine

Wachstum der Oberfläche: keine, kein Wachstum bis zu einer Tiefe von ungefähr 5 mm Gas: keines 25 (III) Physiologische Eigenschaften 1) Erzeugung von Hydrogensulfid:

2) Reduktion von Nitraten: —

2) Reduktion von Nitraten: —

3) Erzeugung von Buttersäure:

30 4) Erzeugung von Indol:

5) Urease: —

6) Catalase: —

7) Hydrolyse von Stärke: —

8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerobisch 35 9) Erzeugung von Ammoniak:

10) Erzeugung von Kohlenstoffdioxyd:

11) Wachstumsbereich: pH 5.0-8.5, Temperatur 30-45 °C

12) Gaserzeugung von Sacchariden: L-Arabinose (-), D-Xylose ( — ), D-Glucose ( — ), D-Mannose ( — ), D-Fructose

40( — ), D-Galactose ( — ), Malzzucker ( — ), Sucrose ( — ), Treha-lose ( - ), Sorbitol ( - ), Mannitol ( - ), Inositol ( - ), Glycerol ( — ), Stärke ( — )

Die neuen TF-2-Substanzen gemäss dieser Erfindung werden beispielsweise auf folgende Art hergestellt.

Kultur von TF-2 Substanz produzierenden Bakterien, die zu den Fusobacterium nucleatum gehören

Kultur oder deren Uberstehende Lösung Hydrophiles organisches Lösungsmittel )

Lösliche Fraktion €———— Trennung

Hasser

Fäl ^

ung pH-abhängige Fraktionierung

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Sammeln einer wasserunlöslichen Fraktion in der Nähe von pH 4 >TF-210

Sammeln einer wasserunlöslichen Fraktion in der Nähe von pH 6 >TF-220

Sammeln einer wasserlöslichen Fraktion in der Nähe von pH 6,

jedoch wasserunlöslich in der Nähe von pH 4 > TF-230

Sammeln einer wasserlöslichen Fraktion in der Nähe von pH 4,

jedoch wasserunlöslich in der Nähe von pH 2 >TF-240

Sammeln einer wasserlöslichen Fraktion in der Nähe von pH 2 >TF-250

TF-210 TF-220 TF-230 TF-240 TF-250

Lï _]_! I« | » U

TF-300 TF-3^0 TF-350

TF-310 TF-320 TF-330 * Deproteinisierung

Das weiter oben erläuterte Herstellungsverfahren wird wie folgt beschrieben:

1. Züchten der Bakterien

Die zum Fusobakterium genus gehörenden Bakterien werden nach einem herkömmlichen Verfahren zur Züchtung von anaeroben Bakterien gezüchtet. Das heisst, ein Kulturmedium mit einer Stickstoffquelle wie Rinderhirn-, Herzextrakte, verschiedene Peptone oder dergleichen; eine Vitaminquelle wie Hefeextrakt oder dergleichen; ein anorganisches Salz wie Natriumchlorid oder dergleichen; eine Kohlenstoffquelle wie Glucose, Lactose oder dergleichen; ein Reduziermittel wie L-Cystin, Natriumsulfit, Thioglycolat oder dergleichen wird auf einen pH-Wert von 6-8.5, vorzugsweise 6.5 bis 7.5 eingestellt und die Bakterien werden dem Kulturmedium eingeimpft, wonach eine Dauerzustandzüchtung unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42 °C, vorzugsweise 32 bis 37 °C während 1-5 Tagen, vorzugsweise 24 bis 96 Stunden ausgeführt wird. Insbesondere ist es wünschenswert, das in Tabelle 1 beschriebene Kulturemedium zu benutzen, das hernach als TF-Kulturmedium bezeichnet wird. Es ist jedoch nicht erforderlich, jedesmal als Kohlenstoffquelle die Gehirn-Herz-In-fusion, die ein Rindergehirn-, Herzextrakt ist, zu verwenden, man kann diese durch eine Herzinfusion ersetzen, die ein Rinder- oder Fischextrakt, ein maisgetränkter Sirup oder dergleichen sein kann. Unter den verschiedenen Peptonen sind das Proteose Pepton und Phyton Pepton nicht immer notwendig und das Trypticase Pepton kann durch ein Polypepton ersetzt werden. Falls Agar nicht benutzt wird, ist es wünschenswert, eine Rühr-Züchtung durchzuführen.

Falls Agar nicht benützt wird, ist es wünschenswert, eine Rührkultur durchzuführen.

Tabelle 1

Bestandteile des Kulturmediums (g/l)

TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f

Trypticase Pepton

17

17

17

17

17

17

Phyton-Pepton

3

3

1.5

-

-

-

Proteose-Pepton

10

5

5

-

-

-

Gehirn-Herz-Infusion

35
17.5

-

-

-

-

Herz-Infusion

-

-

25

20

10

15

Hefeextrakt

3

3

3

3

3

3

Natriumchlorid

7.5

7.5

7.5

7.5

7.5

7.5

Glucose

6

6

6

12

12

12

Lactose

5

5

5

10

10

10

L-Cystin

0.25

0.5

0.5

-

-

-

Natriumsulfit

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

Thioglycolat

0.5

0.5.

0.5

0.5

0.5

0.5

Agar

0 od.

0 od.

0 od.

0 od.

0 od.

0 od.

0.7

0.7

0.7

0.7

0.7

0.7
2. Sammeln einer überstehenden Lösung von der Kultur (Entfernen der Organismen)

20 Die Organismen werden von der erhaltenen Kultur entfernt, wodurch eine überstehende Lösung erhalten wird. Für die Entfernung der Organismen kann ein herkömmliches Verfahren verwendet werden, beispielsweise zentrifugieren und ein Filtrierverfahren unter Benutzung einer Filterhilfe wie die 25 sogenannte Hyflo-Super-Cel und insbesondere wird ein Zen-trifugierverfahren vorgezogen, das die beste Ausbeute ergibt.
3. Sammeln der karzinostatischen Substanz TF-2

(i)(a) Ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel wird der 3o überstehenden Lösung beigemengt und die gebildete Fällung gesammelt. In diesem Zeitpunkt wird die überstehende Lösung oder die Kultur vorzugsweise auf einen pH-Wert von 1.5 bis 7 eingestellt, vorzugsweise in der Nähe von 2 (1.5 bis 2.5). Das hydrophile, organische Lösungsmittel enthält, bei-35 spielsweise, Alkohole wie Äthanol, Methanol und dergleichen und Ketone wie Aceton und dergleichen, obwohl Alkohole, insbesondere Äthanol die besten Resultate erbringt. Das hydrophile, organische Lösungsmittel ist passenderweise beigemengt, derart, dass deren Konzentration 30 bis 80 Vol.-%, 4o insbesondere 50 bis 80 Vol.-% beträgt. Nach dem Beimengen des Lösungsmittels wird die Mischung bei einer niedrigen Temperatur, vorzugsweise bei ungefähr 5 °C für mehrere Stunden bis mehrere Tage stehengelassen, um die Bildung der Fällung zu vervollständigen.

45 Die derart gebildete Fällung wird durch ein herkömmliches Verfahren wie Dekantation, zentrifugieren, Filtration und dergleichen getrennt.

(b) Zu der getrennten Fällung wird Wasser hinzugegeben, im allgemeinen in einer Menge eines 5- bis 20fachen derjeni-50 gen der Fällung, woraufhin eine pH-abhängige Fraktionierung der Fällung durchgeführt wird. Insbesondere wird dieses Verfahren wie folgt durchgeführt:

(b-1) Die obenbeschriebene Mischung der Fällung und Wasser wird auf einen pH-Wert von 7.5 bis 8 eingestellt. 55 Nach dem Beseitigen, falls notwendig, des unlöslichen Anteils wird die Mischung auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 (3.5 bis 4.5) eingestellt. Die daraus entstehenden wasserunlöslichen und wasserlöslichen Anteile werden voneinander getrennt mittels eines herkömmlichen Verfahrens wie das 60 Zentrifugieren, Filtrieren oder dergleichen. Der derart erhalt-tene wasserunlösliche Anteil (TF-210) besitzt die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften.

(b-2) Getrennt wird der Fällung, die gemäss (a) erhalten wurde, Wasser zugefügt, im allgemeinen in einer Menge des b5 5- bis 20fachen der Fällung. Die Mischung wird auf einen pH-Wert von 7.5 bis 8 eingestellt. Nach dem Beseitigen, falls notwendig, des unlöslichen Anteils, wird die Mischung auf einen pH-Wert in der Nähe von 6 (5.5 bis 6.5) eingestellt. Die

9

651 052

dadurch entstandenen wasserunlöslichen und wasserlöslichen Anteile werden durch ein herkömmliches Verfahren wie zentrifugieren, filtrieren oder dergleichen voneinander getrennt. Der so erhaltene wasserunlösliche Anteil (TF-220) besitzt die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften.

(b-3) Der wasserlösliche Anteil, gemäss (b-2) getrennt, wird auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 (3.5 bis 4.5) eingestellt. Die Fällung und der wasserlösliche Anteil werden durch ein herkömmliches Verfahren wie zentrifugieren, filtrieren oder dergleichen voneinander getrennt. Die so erhaltene Fällung (TF-230) weist die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften auf.

(b-4) Der wasserlösliche Anteil, getrennt gemäss (b-1)

oder (b-3) wird auf einen pH-Wert in der Nähe von 2 (1.5 bis 2.5) eingestellt, wodurch eine Fällung entsteht. Diese Fällung wird von derem wasserlöslichen Anteil durch ein herkömmliches Verfahren wie zentrifugieren, filtrieren oder dergleichen getrennt. Die so erhaltene Fällung (TF-240) weist die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften auf.

(b-5) Zur gemäss (a) erhaltenen Fällung wird das 5- bis 20fache Wasser beigefügt und der pH-Wert der Mischung wird beispielsweise auf 7.5 bis 8 eingestellt. Dann wird der pH-Wert ferner in die Nähe von 2 (1.5 bis 2.5) eingestellt. Zum derart erhaltenen wasserlöslichen Anteil oder zum gemäss (b-4) getrennten wasserlöslichen Anteil wird, falls notwendig, nach Konzentration dieses wasserlöslichen Anteils auf einen Drittel bis einen Siebtel, ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel beigegeben, vorzugsweise ein Alkohol, derart, dass seine Konzentration 20 bis 80, vorzugsweise 20 bis 60 Gew.-n/o beträgt. Das Sammeln der dadurch entstandenen Fällung ergibt TF-250. Diese karzinostatische Substanz TF-250 weist die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften auf.

Die karzinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 und TF-250 können mehrmals der pH-abhängigen Fraktionierung unterworfen werden, um sie zu reinigen. Die derart erhaltenen karzinostatischen Substanzen können einzeln durch ein herkömmliches Verfahren zu pharmazeutisch annehmbaren Salzen wie Alkali-Metallsalze, beispielsweise Natriumsalze, Kaliumsalze oder dergleichen und Erdalkali-Metallsalze, beispielsweise Magnesiumsalze, Kalziumsalze und dergleichen umgewandelt werden.

(ii) Die gemäss (i) erhaltenen, eine karzinostatische Aktivität aufweisenden Fraktionen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 und Tf-250 werden je einer deproteinisierenden herkömmlichen Behandlung unterworfen, wodurch die Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320 und TF-330), TF-340 und TF-350 erhalten werden. Für diese herkömmlichen Deproteinisie-rungsverfahren wird ein Zersetzungsverfahren mit proteolytischen Enzymen vorgezogen. Falls eine solche Behandlung gewünscht wird, ist es genügend, dass jeder der Fraktionen mit karzinostatischer Aktivität, erhalten gemäss (i) in Wasser oder in einer Puffer-Lösung gelöst oder suspendiert wird und ein Protein-auflösendes Enzym beigegeben wird, wonach die Enzym-Behandlung in herkömmlicher Weise vorgenommen werden kann.

Als proteolytische Enzyme kommen Pronase, Papain, Trypsin, Chemotrypsin und dergleichen in Frage. Pronase und Trypsin werden bevorzugt. Vorzugsweise sollte die wäss-rige Lösung vor oder während der Enzym-Behandlung auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und gehalten werden. Zu diesem Zwecke können Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumhydrocarbonat und dergleichen verwendet werden. Um die Fäulnis des Reaktionsgemisches während der Enzym-Behandlung zu verhindern, ist es wünschenswert, eine kleine Menge eines organischen Lösungsmittels wie Chloroform, Toluol oder dergleichen beizugeben. Das Enzym wird gewöhnlicherweise in einer Menge von ungefähr 1 bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des festen Pulvers, beigegeben.

Die Enzymbehandlung wird gewöhnlicherweise bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C während 1 bis 72 Stunden, vorzugsweise 24 bis 48 Stunden durchgeführt. Sie kann auch durchgeführt werden durch zuerst Beigeben von beispielsweise ungefähr 1 Gew.-% eines Enzyms zu einem festen Pulver und Unterwerfung des festen Pulvers einer Enzym-Behandlung während 1 bis 24 Stunden und nachfolgendes Beimischen von ungefähr 1 Gew.-% des Enzyms für eine weitere Enzym-Behandlung.

Nach der obigen Enzym-Behandlung werden unlösliche Anteile, falls notwendig, durch ein Verfahren wie zentrifugieren, filtrieren oder dergleichen beseitigt, woraufhin vom so erhaltenen wasserlöslichen Anteil Fraktionen von karzinostatischen Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 erhalten werden. Derart kann TF-310 von TF-210, TF-320 von TF-220, TF-330 von TF-230, TF-340 von TF-240 und TF-350 von TF-250 erhalten werden. Die Isolierung der Fraktionen dieser TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 kann durch mindestens eine pH-abhängige Fraktionierung, getrennte Fällung von einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, Fraktionierung mit einem Ionen-Austauscher, Ultrafiltration und dergleichen durchgeführt werden. Alternativ können eine oder mehrere Operationen mehrere Male wiederholt werden. Insbesondere werden die karzinostatischen Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 erhalten, indem der pH-Wert des wasserlöslichen Anteils auf unter 2.5 eingestellt wird, wobei, falls notwendig, Trichloressigsäure beigefügt wird, die entstehende Fällung beseitigt und zum löslichen Anteil ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel wie ein Alkohol derart hinzugefügt wird, dass dessen Konzentration 30 bis 80, vorzugsweise 60 bis 80 Vol.-% beträgt, die entstehende Fällung gesammelt wird, die die Fraktion der gesuchten Substanz ist. Anschliessend wird, falls notwendig, diese Fällung mit einem starken, Anionen-Austauscherharz wie Dowex 1 (eingetragene Marke), Amberlite IRA-400 (eingetragene Marke) oder dergleichen behandelt, wobei diese Behandlung mehrmals wiederholt werden kann, um die unadsorbierten Fraktionen einzusammeln. Falls notwendig, werden diese Fraktionen einer Ultrafiltration unterworfen [z.B. Toyo-Ultrafilter UK-50 (nominale Molekulargewicht-Abschneidkante: 50 000) oder Toyo-Ultrafilter UK-200 (nominale Molekulargewicht-Abschneidkante: 200 000)] und anschliessend eine Behandlung wie Konzentration, Entsalzen, Trocknen oder Fällung von einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel oder dergleichen. Die derart erhaltenen karzinostatischen Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 haben die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften.

Diese karzinostatischen Substanzen können in pharmazeutisch annehmbare Salze mittels eines herkömmlichen Verfahrens umgewandelt werden. Insbesondere kann beispielsweise erwähnt werden, dass solche pharmazeutisch annehmbare Salze Alkali-Metallsalze wie Natriumsalze, Kaliumsalze und dergleichen und Erdalkali-Metallsalze wie Magnesiumsalze, Kaliumsalze und dergleichen sein können.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

651 052

10

Tabelle 2

Eigenschaften

Fraktion

Aussehen

Pharmakologische Wirkung

Löslichkeit

TF-210

Gräuliches

Diese Fraktion verhinderte die Verbreitung des

Unlöslich in Methanol, Äthanol,

Weisslicht

Ehrlich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor,

Aceton, Benzol, Chloroform,

braunes Pulver

Sarcom-180- und B-16-Melanom der Maus und

Äthylazetat, Diäthyläther

hatte eine immunostimulierende Aktivität

TF-220

dito dito dito

TF-230

dito dito dito

TF-240

dito dito dito

TF-250

dito dito

Löslich in Wasser und unlöslich in

Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol,

Chloroform, Äthylazetat, Diäthyläther

TF-300

dito

Diese Fraktion verhinderte die Verbreitung des dito

Ehrlich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor,

Sarcom-180- und B-16-Melanom der Maus und

hatte eine immunostimulierende Aktivität

TF-310

Gräuliches

Diese Fraktion verhinderte die Verbreitung des

Löslich in Wasser und unlöslich in

Weisslicht

Ehrlich-Aszites-Tumor, Ehrlich fester Tumor,

Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol,

braunes Pulver

Sarcom-180- und B-16-Melanom der Maus und

Chloroform, Äthylazetat, Diäthyläther

hatte eine immunostimulierende Aktivität

TF-320

dito

Diese Fraktion verhinderte die Verbreitung des dito

Ehrlich-Aszites-Tumor und Sarcom-180 der Maus

und wies eine immunostimulierende Aktivität auf.

TF-330

dito

Diese Fraktion verhinderte die Verbreitung des dito

Ehrlich-Aszites-Tumor der Maus und hatte eine

immunostimulierende Aktivität

TF-340

dito dito dito

TF-350

dito dito dito

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Eigenschaften

Fraktion

Zersetzungspunkt

Infrarot-Absorptionsspektrum

Elementaranalyse-Werte

(KBr-Methode) (cm-1)

C (%) H (%) N (%)

TF-210

TF-220

TF-230

TF-240

TF-250

TF-300

TF-310 TF-320 TF-330 TF-340

TF-350

Diese Fraktion zeigte keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzte sich bei 160 bis 235 °C

Diese Fraktion zeigte keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzte sich bei 160 bis 240 °C Diese Fraktion zeigte keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzte sich bei 185 bis 225 °C Diese Fraktion zeigte keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzte sich bei 200 bis 215 °C

Diese Fraktion zeigte keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzte sich bei 165 bis 210 °C

Diese Fraktion begann sich bei ungefähr 180 °C zu zersetzen und zersetzte sich merklich oberhalb

195 °C

dito dito dito

Diese Fraktion begann sich bei ungefähr 140 °C zu zersetzen und zersetzte sich merklich oberhalb 200 °C

Diese Fraktion begann sich bei ungefähr 110 °C zu zersetzen und zersetzte sich merklich oberhalb 180 °C

Das Spektrum weist Absorptionsbänder in der 40-43 5-7 Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620,

1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm-1 auf dito

9-10

dito

40-42 5-7 7-9

42-45 5-7 10-11

Dieses Spektrum weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3600-3200,2950-2920,

1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210,

1060,960 und 820 cm _ 1 auf Dieses Spektrum weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920,

1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210,

1150-1120, 1080-1020, 980 und 810 cm-' auf Dieses Spektrum weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3500-3300, 2920, 2850,

1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020,970 und 820-800 cm-' auf dito dito dito

Dieses Spektrum weist Absorptionsbänder in der Nähe von 3500-3300, 2920, 2850,

1660-1640, 1580-1520, 1460-1440, 1410-1340,

1250-12120, 1120-1030,970 und 835 cm-1 auf Dieses Spektrum weist Absorptionsbänder in 34-37 5-der Nähe von 3500-3300, 2920-2900,

1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100,

1080-1020,970 und 820-800 cm-' auf

35-38 4-5 12-14

30-33 3-5 3-5

38-47 5-7. 1-4

38-47

5-7

1-4

38-47

5-7

1-4

38-47

5-7

1-4

32-34

4-6

3-5

11

651 052

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Eigenschaften Farb-Reaktion

Fraktion

Ninhydrin-

Molisch-

PhenoI-H:S04-

Anthron-HiSOj-

Indol-HCl-

Lowry-Folin-

Reaktion

Reaktion

Reaktion

Reaktion

Reaktion

Reaktion

TF-210

+

+

+

+

+

TF-220

+

+

+

+

+

TF-230

+

+

+

+

+

TF-240

+

+

+

+

+

TF-250

+

+

+

+

+

TF-300

—

+

+

+

+

+

TF-310

—

+

+

+

+

+

TF-320

—

+

+

+

+

+

TF-330

—

+

+

+

+

+

TF-340

-

+

+

+

+

+

TF-350

—

+

+

+

+

+

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Eigenschaften

Fraktion UV-Absorptionsspektrum (wässrige Saccharid-Inhalt in Glucose Proteingehalt in Rinder-Albuminserum

Lösung mit pH-Wert 7.0) ausgedrückt, gemessen mit dem ausgedrückt, gemessen mit dem kmax(nm) Phenol-HiSOi-Verfahren (%) Lowry-Folin-Verfahren (%)

TF-210

An der Absorptionskante und in der Nähe von 248-265 nm *
ca.

5-ca. 25
ca. 20-ca. 50

TF-220

An der Absorptionskante und in der Nähe von 248-266 nm *
ca.

5-ca. 20

5 ca. 10

TF-230

An der Absorptionskante und in der Nähe von 249-264 nm ca.

5-ca. 25
ca. 30-ca. 60

TF-240

An der Absorptionskante und in der Nähe von 250-265 nm ca.

15-ca. 35
ca. 20-ca. 30

TF-250

An der Absorptionskante und in der Nähe von 248-269 nm ca.

60-ca. 80
ca. 5-ca. 20

TF-300

An der Absorptionskante und in der Nähe von 246-280 nm ca.

16-ca. 60

S ca. 10

TF-310

dito ca.

16-ca. 60

^ ca. 10

TF-320

dito ca.

16-ca. 60

g ca. 10

TF-330

An der Absorptionskante und in der Nähe von 246-280 nm ca.

16-ca. 60

^ ca. 10

TF-340

An der Absorptionskante und in der Nähe von 250-265 nm ca.

20-ca. 50

:S ca. 10

TF-350

An der Absorptionskante und in der Nähe von 245-264 nm ca.

80-ca. 95

2= ca. 10

Anmerkung: * Die Messungen wurden an wasserlöslichen Fraktionen durchgeführt

Die pharmakologischen Aktivitäten der Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 werden weiter unten beschrieben. In den folgenden pharmakologischen Versuchen wurde die Versuchssubstanz TF-210 in Beispiel 1, TF-220 in Beispiel 3, TF-230 in Beispiel 5, TF-240 in Beispiel 7, TF-250 in Beispiel 9, TF-310-1 in Beispiel 11 (1), TF-310-2 in Beispiel 18, TF-320 in Beispiel 12, TF-330 in Beispiel 13, TF-340 in Beispiel 19, TF-350 in Beispiel 24 und TF-300 in den Beispielen 11 bis 18 erhalten.

1. Immunostimulierende Aktivität

Drei Mäuse der ICR-Rasse (weiblich, 6 Wochen alt) wurden für jede Gruppe verwendet. Jede der Testsubstanzen wurde in einer physiologischen Salzlösung gelöst und 0.2 ml jeder sich daraus ergebenden Lösung wurde den Mäusen intraperitonal eingegeben. 24 Stunden nach der Eingabe wurden 0.2 ml einer Kohlenstoffsuspension, vorbereitet durch Mixen von 1 ml-Pelikan-Tusche 17 Schwarz (hergestellt durch

50 die Firma Günther Wagner) mit 2 ml einer physiologischen Salzlösung mit 3 Gew.-% Gelatine, intravenös in den Schwanz eingespritzt und nach 1,5, 10 und 15 Minuten wurden 0.02 ml Blut dem Kreislauf entnommen, wobei eine mit Heparin beschichtete «Hematocrit»-Kapillare benutzt wurde und

55 unmittelbar mit 1.6 ml einer 0.1 Gew.-%igen, wässrigen Natri-umcarbonatlösung verdünnt und hämolisiert. Diese Lösung wurde bei 675 nm kolorimetriert und der phagozytotische Index (K-Wert) wurde mit einer Gleichung von Halpern et al, ermittelt.

60 Den Mäusen der Kontrollgruppe wurden 0.2 ml einer physiologischen Salzlösung eingegeben.

K_ log Co-log C t-to

65

wobei Co = Kohlenstoffpulvergehalt im Blut beim Zeitpunkt to und C = Kohlenstoffpulvergehalt im Blut beim Zeitpunkt t. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bis 5 dargestellt.

651 052

12

Tabelle 3

Tabelle 5

Substanz

Dosierung mittlerer K-Wert

(mg/kg)

TF-210

3

0.1155 ±0.0273

6

0.1198 ±0.0231

TF-220

1.5

0.1087 ±0.0346

3

0.1292 ±0.0289

TF-230

5

0.1028 ±0.0175

10

0.1194 ±0.0334

TF-240

5

0.1109 ±0.0250

10

0.1127 ±0.0496

TF-250

5

0.0865 ±0.0131

10

0.1120 ±0.0329

Kontrolle

-

0.0348 ±0.0037

Tabelle 4

Substanz

Dosierung mittlerer K-Wert

(mg/kg)

*TF-310-1

0.1

0.0580 ±0.0088

1

0.0776 ±0.0168

TF-320

0.1

0.0468 ±0.0123

1

0.0715 ±0.0040

TF-330

0.1

0.0601 ±0.0098

1

0.0965 ±0.0102

Kontrolle

-

0.0295 ±0.0007

Substanz

Dosierung (mg/ kg)

mittlerer K-Wert

TF-340*

TF-350

Kontrolle

5 10 5

10

0.1292 + 0.0229 0.1001 ±0.0295 0.0817 + 0.0002 0.1453 + 0.0229 0.0408 ±0.0016

Anmerkung: * Dieser Versuch wurde mit einer Gruppe von vier Mäusen durchgeführt.

Anmerkung: * Dieser Versuch wurde mit einer Gruppe von vier Mäusen durchgeführt.

I5 2. Karzinostatische Aktivität (i) Antitumor-Aktivität gegen Ehrlich-Aszites-Tumor

Ehrlich-Aszites-Tumor-Zellen wurden intraperitonal in Mäuse der ICR-Rasse (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1 x 105 Zellen pro Maus eingeimpft. Nacheinan-20 der wurde jede Testsubstanz in einer physiologischen Salzlösung gelöst und 0.2 ml jeder dieser Lösungen wurde intraperitonal ein Mal täglich den Mäusen während sieben aufeinander folgenden Tagen injiziert, beginnend vom ersten Tag nach der Einimpfung der Tumor-Zellen. Den Kontrollgruppen 25 wurden 0.2 ml einer physiologischen Salzlösung in der gleichen Weise wie oben eingegeben. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 6 und 7 gezeigt.

uberlebenstage der Mäuse in einer Gruppe,

welcher die Testsubstanz eingegeben wurde

Überlebenstage der Mäuse in der Kontrollgruppe

T/C =

x 100- ("o)

Tabelle 6

Substanz Dosierung mittlere

(mg/kg x die Anzahl der Überlebenstage Verabreichungen) (Tag)

T/C

(%)

Verhältnis der Überlebenden für 30 Tage

Verhältnis der ganzen Behandlung

TF-210

0.7x7

>27.2 ±5.7

>161

8/10

7/10

3.5x7

>26.8 ±4.9

>159

7/10

6/10

TF-220

0.3x7

>22.8 ±6.1

>135

2/8

1/8

1.5x7

>29.1 ±2.3

> 173

7/8

5/8

TF-230

1x7

>29.9 ±0.3

>177

7/8

7/8

5x7

>28.3 ±4.6

>168

7/8

7/8

TF-240

1x7

>23.2 ±5.6

>138

3/8

2/8

5x7

>24.5 ±7.5

>146

5/8

5/8

TF-250

1x7

>20.3 ±6.4

>121

2/8

2/8

5x7

>26.6 ±5.5

>158

5/8

5/8

Kontrolle

-
16.8 ±2.6

100

0/8

0/8

Tabelle 7

Substanz Dosierung mittlere T/C Verhältnis der Verhältnis

(mg/kg x die Anzahl der Überlebenstage (%) Überlebenden für der ganzen Behandlung

Verabreichungen) (Tag) 30 Tage

TF-310-1

0.1 x7

>27.9 ±4.5

>166

4/8

4/8

1 x7

>28.6 ±2.3

>170

6/8

6/8

TF-320

0.5x7

>29.0 ±2.6

>172

7/8

7/8

1x7

>28.1+4.9

>167

7/8

7/8

TF-330

0.5x7

>29.8 ±0.6

>177

7/8

7/8

1x7

>29.6 ±0.9

>176

7/8

7/8

TF-340

1x7

>28.3 ±4.5

>168

7/8

5/8

5x7

>24.0 ±9.4

> 143

5/8

5/8

TF-350

1x7
19.6 ±4.1

117

0/8

0/8

5x7

>30.0 + 0.0

>179

8/8

8/8

Kontrolle

-
16.8 ±2.3

100

0/8

0/8

13

651 052

(ii) Antitumor-Aktivität gegen Sarcom-1 S0-Zellen

(a) Sarcom-180-ZeIlen wurden intraperitonal Mäusen der ICR-Rasse (weiblich, 6 Wochen alt) einer Menge von 1 x 105 Zellen pro Maus transplantiert. Nacheinander wurde jeder der Testsubstanzen in einer physiologischen Salzlösung gelöst und 0.2 ml jeder dieser Lösungen wurde intraperitonal den

Mäusen ein Mal täglich während sieben aufeinander folgenden Tagen vom ersten Tag nach der Transplantation der Kar-zinom-Zellen an gerechnet, verabreicht. Der Kontrollgruppe wurden 0.2 ml einer physiologischen Salzlösung in der glei-5 chen Art wie oben verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst.

Tabelle 8

Substanz Dosierung mittlere T/C Verhältnis der Verhältnis

(mg/kg x die Anzahl der Überlebenstage (%) Überlebenden für der ganzen Behandlung

Verabreichungen) (Tag) 30 Tage

TF-210

3.5x7

>27.2 ±5.6

>183

4/5

4/5

7x7

>30.0 + 0.0

>203

5/5

5/5

TF-220

0.3x7

>26.3 + 6.0

> 177

2/5

2/5

1.5x7

>30.0 ±0.0

>203

5/5

5/5

TF-230

1x7

>29.2 ±1.6

>197

4/5

4/5

5x7

>24.8 ±9.9

>168

3/5

2/5

TF-240

1x7

>21.4 ±7.3

>145

2/5

1/5

5x7

>30.0 ±0.0

>203

5/5

5/5

TF-250

1x7

>29.0 ±2.0

>196

4/5

4/5

5x7

>28.4±3.2

> 192

4/5

2/5

Kontrolle

-
14.8 + 2.3

100

0/5

0/5

(b) Sarcom-180-Zellen wurden (Mäusen weiblich, 6 Wochen alt) subkutan beim Vorderbeingelenk Mäusen der ICR-Rasse in einer Menge von 1x10" Zellen pro Maus transplantiert. Nacheinander wurde jede der Testsubstanzen in einer physiologischen Salzlösung oder einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung gelöst und 0.2 ml jeder dieser Lösungen wurde intravenös oder intramuskulär ein Mal täglich während sieben aufeinander folgenden Tagen vom Tag der Transplantation an gerechnet, den Mäusen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurden 0.2 ml einer 5%igen wässrigen Glucose-3o Lösung oder einer physiologischen Salzlösung in der gleichen Weise wie oben verabreicht. Die Resultate sind in Tabelle 8-(2) dargestellt.

Tabelle 8-(2)

Substanz Route Dosis Flüssigkeit, in welcher die Tumorgewicht (g) T/C (%)

(mg/kg x die Anzahl der Substanz gelöst wurde Verabreichungen

TF-310-1

iv

0.1 x7

Physiologische Salzlösung

0.29 ±0.15

20

im

0.1 x 7

dito

0.86 ±0.10

60

Kontrolle

-

-

dito

1.45 ±0.31

100

TF-320

iv

0.1 x 7

dito

1.54 ±0.77

31

im

0.1 x7

dito

3.50 ±0.45

71

iv

0.1 x7

5 %wässrige Glucoselösung

1.67 + 0.58

34

im

0.1 x7

dito

2.38 ±0.42

48

Kontrolle

-

-

dito

4.94 ±2.42

100

TF-310-2

iv

0.001 x 7

dito

2.67 ±0.20

51

0.005 x 7

dito

2.39 ±0.56

46

0.010x7

dito

2.33 ±0.26

44

0.050x7

dito

1.31+0.26

25

0.100x7

dito

1.05 + 0.21

20

Kontrolle

-

dito

5.24 ±0.49

100

TF-310-2

im

0.1 x 7

5% wässrige Glucoselösung

1.68 ±0.30

36

Kontrolle

-

dito

4.68 ±0.57

100

Die obigen Daten für TF-310-1 zeigen die Ergebnisse am siebten Tag nach der Transplantation der Sarcom-180-Zellen. Die Daten für TF-320 und TF-310-2 zeigen die Ergebnisse am vierzehnten Tag nach der Transplantation der Sarcom-180-Zellen.

(iii) Antitumor-Aktivität gegen Ehrlich fester Tumor

Ehrlich-Tumor-Zellen wurden (Mäusen weiblich, 6 Wochen alt) subkutan beim Vorderbeingelenk Mäusen der ICR-Rasse in einer Menge von 4x10" Zellen pro Maus transplantiert. Dann wurde jede Testsubstanz in einer physiologischen Salzlösung oder in einer 5%igen wässrigen Glucose-b5 Lösung gelöst und 0.2 ml jeder dieser entstehenden Lösungen wurde intraperitonal den Mäusen ein Mal täglich während sieben aufeinander folgenden Tagen beginnend vom Tag der Transplantation an gerechnet, verabreicht oder ein Mal jeden

651 052

zweiten Tag während zehn Tagen vom 10. Tag nach der Transplantation an gerechnet. Den Kontrollgruppen wurden 0.2 ml einer physiologischen Salzlösung oder einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung in dergleichen Art wie oben verabreicht. Das Gewicht von jedem Tumor wurde bestimmt. Die Bestimmung des Gewichtes des Tumors wurde durchgeführt, indem der grösste Durchmesser (a mm) und der kleinste Durchmesser (b mm) mittels eines Greifzirkels gemessen und durch Einsetzen der Werte für a und b in folgender Gleichung:

Gewicht des Tumors = ax^ (mg)

2

ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9-(l) und 9-(2) dargestellt.

14

Tabelle 10

Substanz Dosierung Mittleres Tumor- T/C ("o)

(mg/kg x die gewicht

Anzahl der -(g)

5 Verabreichungen)

TF-210

7x7

3.07 ±0.7

64

TF-220

1.5x7

3.92 ±2.29

82

3x7

3.69 ±0.81

77

TF-230

5x7

3.21 ±0.64

67

10x7

3.71 ±1.08

77

TF-240

5x7

3.78+1.26

79

10x7

4.00+1.36

84

TF-250

5x7

2.97 + 0.73

62

10x7

2.75 ±0.67

58

Kontrolle

-

4.76 ±0.68

100

TF-310-1

3x7

2.53 ±1.61

63

Kontrolle

-

4.00 ±0.85

100

Tabelle 9-(l)

Substanz

Dosierung (mg/kg x die Anzahl der Verabreichungen)

Verabreichungstag

Tag 14* Tumorgewicht (g)

T/C (%)

TF-210

3.5x7

Tag 1,2,3,

1.96 ±0.7

29

7x7

4, 5, 6, 7

2.62 ±1.9

38

TF-220

3x7

4.30 ±2.1

62

6x7

2.89 ± 1.2

42

TF-230

10x7

2.63 ± 1.22

38

20x7

2.04 ±0.66

29

TF-240

10x7

4.07 ±0.75

59

20x7

4.02 ± 1.66

59

TF-250

10x7

3.10± 1.01

46

20x7

3.19 ± 1.26

47

Kontrolle

-

6.82± 1.14

100

TF-310-1

1x5

Tag 8, 10,

4.78 ±2.01

55

Kontrolle

-

12, 14, 16

8.70 ±2.03

100

Anmerkung: TF-210 und TF-250 wurden benutzt, nachdem sie in einer physiologischen Salzlösung gelöst wurden. TF-310-1 wurde in einer 5% wässrigen Glucoselösung benutzt. *, ** Der Tag, an dem das Gewicht des Tumors gemessen wurde.

(iv) Antitumor-Aktivität gegen B-16 Melanom-Zellen

(a) B-16-Melanom-Zellen wurden (Mäusen männlich, 7 Wochen alt) subkutan beim Vorderbeingelenk Mäusen der BDFi-Rasse in einer Menge von 1x10" Zellen pro Maus transplantiert. Nacheinander wurde jede der Testsubstanzen in einer physiologischen Salzlösung gelöst und 0.2 ml jeder dieser Lösungen wurde intraperitonal den Mäusen ein Mal täglich während sieben aufeinander folgenden Tagen vom Tage nach der Transplantation an gerechnet, verabreicht. Den Kontrollgruppen wurden 0.2 ml einer physiologischen Salzlösung in der gleichen Weise wie oben verabreicht. Die Gewichte der Tumore wurden am 17. oder 23. Tag nach der Transplantation der Tumor-Zellen bestimmt. Das Bestimmungsverfahren war das gleiche wie in (iii). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt.

20 Anmerkung: Die mittleren Tumorgewichte für TF-210 bis TF-250 wurden am 17. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen bestimmt. Das mittlere Tumorgewicht für TF-310-1 wurde am 23. Tag nach der Transplantation er Tumorzellen bestimmt.

25

(b) B-I6-Melanom-Zellen wurden (Mäusen männlich, 6 Wochen alt) subkutan beim Vorderbeingelenk Mäusen der BDFi-Rasse in einer Menge von 1 x 106 Zellen pro Maus transplantiert. Dann wurde die Testsubstanz in einer 5%igen 30 wässrigen Glucose-Lösung gelöst und 0.2 ml dieser Lösung wurde gleichzeitig intratumural und intraperitonal ein Mal jeden zweiten Tag während 12 Tagen vom 13. Tag nach der Transplantation der Tumor-Zellen, verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde 0.2 ml einer 5%igen wässrigen Glucose-Lösung 35 in der gleichen Art wie oben verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10-(2) dargestellt.

Tabelle 10-(2)

40 Substanz Dosierung Route Tumor- T/C (%)

(mg/kg x Anzahl gewicht der (g)

Verabreichungen)

TF-310-2

1.0x6

it

2.92 ±0.23

50

45

5.0x6

it

4.08 ±0.72

70
10.0x6

it

3.26 ±0.26

56

0.5x6

it + ip 4.31 +0.24

74

1.0 x 6

it + ip 1.92 ±0.38

33

50 Kontrolle

-

5.83 ±0.80

100

Das Tumor-Gewicht wurde am 23. Tag gemessen.

(3) Akute Toxizität 55 LDso-Werte für Mäuse (ICR-Rasse, weiblich, 6 Wochen alt, intravenöse Verabreichung) werden in Tabelle 12 gezeigt.

Tabelle 12

Substanz f, O

LDso (mg/kg)

TF-210

>100

TF-220

>200

TF-230

>100

TF-240

>200

65 TF-250

>200

TF-300

> 10

TF-340

>200

TF-350

>200

15

651 052

Wie aus den vorgehend beschriebenen pharmakologischen Versuchen hervorgeht, sind die TF-2-Substanzen gemäss dieser Erfindung nützlich als karzinostatische Mittel und es kann erwartet werden, dass sie gegenüber verschiedenen Krebskrankheiten aktiv sein können, insbesondere gegenüber festen Krebsformen. Alle TF-2-Substanzen gemäss dieser Erfindung weisen vorzügliche Eigenschaften auf.

Die erfindungsgemässen TF-2-Substanzen können in verschiedenen pharmazeutischen Formen benutzt werden, beispielsweise als einnehmbare Heilmittel, Injektionen, Supposi-torien oder dergleichen, wobei die Injektion vorgezogen wird. Falls sie als einnehmbare Mittel benutzt werden, können diese Mittel verschiedene Arzneimittelträger enthalten und können als Kapseln, Tabletten, Pulver oder Granula geformt sein. Falls sie als Injektionen verwendet werden, kann eine solche Injektion als subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion verabreicht werden und die Substanzen können in der Form einer Suspension, einer Lösung oder als Pulver, das in einer Salzlösung oder in einer Glucose enthaltenden Lösung oder in einem Lokalanästhesie-Mittel gelöst wird, verwendet werden.

Die Dosierung der TF-2-Substanzen (TF-210, 220, 230, 240,250,300 (310,320,330), 340 und 350) wird gemäss dem Zustand des Patienten gewählt, wobei es im Allgemeinen wünschenswert ist, dass dem Patient eine Dosis von 0.005 bis 50 mg/kg ein Mal täglich oder mehrmals täglich verabreicht wird.