CH653344A5 - Zwischenprodukte fuer die herstellung eines vitamin d(3)-derivates. - Google Patents

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CH653344A5
CH653344A5 CH1658/85A CH165885A CH653344A5 CH 653344 A5 CH653344 A5 CH 653344A5 CH 1658/85 A CH1658/85 A CH 1658/85A CH 165885 A CH165885 A CH 165885A CH 653344 A5 CH653344 A5 CH 653344A5
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Hector F Deluca
Heinrich K Schnoes
Joseph L Napoli
Mary A Fivizzani
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Wisconsin Alumni Res Found
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Description

Die Erfindung betrifft la,3ß-Dihydroxy-27-nor-cholest- ferol; 3 715 374, gerichtet auf 24,25-Dihydroxy-cholecalciferol;
-5,7-dien-on, la,3ß-Dihydroxy-27-nor-cholest-5-en-25-on sowie 3 739 991, gerichtet auf 25,26-Dihydroxy-cholecalciferol;
deren Acylate, die Zwischenprodukte für die Herstellung neuer :o 3 786 062, gerichtet auf 22-Dehydro-25-hydroxycholecalci-
Verbindungen mit Vitamin D-artiger Wirksamkeit sind. ferol; 3 847 955, gerichtet auf 1,24,25-Trihydroxycholecalci-
Vitamin D3 ist ein wohlbekanntes Mittel zur Steuerung der ferol; 3 906 014, gerichtet auf 3-Desoxy-la-hydroxycholecalci-
Calcium- und Phosphor-Homöostase. Es ist bekannt, dass diese ferol; 3 069 321, gerichtet auf die Herstellung von verschiede-
Verbindung beim normalen Tier oder Menschen den intestina- nen Seitenketten-fluorierten Vitamin D3-Derivaten und Seiten-
len Calciumtransport und die Knochen-Calcium-Mobilisierung 15 ketten-fluorierten Dihydrotrachysterin3-Analogen und US-PS
stimuliert und wirksam bei der Verhinderung von Rachitis ist. 4 199 577 gerichtet auf la,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-
Es ist nunmehr auch wohlbekannt, dass das Vitamin D3, um dien.
wirksam zu sein, in vivo in seine hydroxylierten Formen umge- Es wurde nunmehr ein neues Derivat von Vitamin D3 gewandelt werden muss. Beispielsweise wird das Vitamin zuerst in funden, das eine ausgezeichnete Vitamin D-artige Wirksam-der Leber unter Bildung von 25-Hydroxyvitamin D3 hydroxy- 20 keit aufweist und das daher als Ersatz für Vitamin D3 in sei-liert und wird in der Niere weiter hydroxyliert unter Bildung nen verschiedenen bekannten Anwendungen dienen kann und von la,25-Dihydroxyvitamin D3 oder 24,25-Dihydroxyvitamin geeignet ist für die Behandlung verschiedener Erkrankungen D3. Die la-hydroxylierte Form des Vitamins wird im allgemei- wie Osteomalacie, Osteodystrophie und Hypoparathyroidis-nen als die physiologisch aktive oder hormonelle Form des Vi- mus.
tamins und als verantwortlich dafür angesehen, was als Vitamin 25 Die erfindungsgemässen Verbindungen können nach folgen-
D-artige Wirksamkeiten bezeichnet wird, wie die gesteigerte in- dem Reaktionsschema hergestellt werden. Sie sind nützliche testinale Absorption von Calcium und Phosphat, die Mobilisie- Zwischenprodukte für die Herstellung von la-Hydroxy-25-
rung von Knochenmineral und die Zurückhaltung von Calcium -keto-27-norcholecalciferol, einer ebenfalls neuen Verbindung in den Nieren. mit Vitamin D3-artiger Aktivität.
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Das vorherige Schema umfasst die Umwandlung von 27--Norcholest-5-en-25-on (Struktur 1, R = H), das in der US-PS 4 145 346 beschrieben ist (wobei die US-PS 4 105 660 das entsprechende 5,7-Dien beschreibt), in das entsprechende 25-Ketal-derivat (2). Ein 3-Acylderivat von 27-Nor-cholest-5-en-25-on (z.B.) Struktur 1 mit R = Acetyl oder Benzoyl) ist auch ein geeignetes Ausgangsmaterial für diese Reaktionsstufe, wobei die Acylgruppe durch Hydrolyse in Base nach der Bildung des 25-Ketals entfernt wird. Das Ketal 2 wird einer Dehydrierung unterzogen unter Bildung des Trienons 3, das mit H2O2 in Base epoxydiert wird unter Bildung des la,2a-Epoxy-4,6-dien-3-on--derivats (4). Die Reduktion des letzteren in Metall/Ammoniak-Lösungen [Barton et al., J. Am. Chem. Soc., 95, 2748 (1973)] ergibt 25,25-Äthylendioxy-27-nor-cholest-5-en-la,3ß-diol, von dem die Ketalschutzgruppe durch Hydrolyse unter sauren Bedingungen entfernt wird, unter Bildung von 27-Nor-5-cho-lesten-la,3ß-diol-25-on (Verbindung 5, mit R = H). Die anschliessende Acylierung dieses Zwischenprodukts (Acetylieren, Benzoylieren, usw.) ergibt das 1,3-Diacylderivat (Verbindung 5, worin R = Acyl), das umgewandelt wird in das 5,7--Dienderivat (6, R = Acyl) nach verschiedenen bekannten Verfahren, z.B. der Methode von Hunziker und Müllner [Helv. Chim. Acta, 61, 70 (1958)] oder über die 7-Keto- und 7-Tosyl-hydrozon-Zwischenprodukte [Onisko et al., Bioorganic Chem., 6, 203 (1977)]. Falls gewünscht, können die Acylgruppen in dieser Stufe entfernt werden durch milde Basenhydrolyse (z.B. 10%ige alkoholische KOH) unter Bildung des entsprechenden 1,3-Dihydroxyderivats. Die Ultraviolettbestrahlung einer Lösung des 5,7-Diens 6 (R = Acyl) ergibt das 27-Nor-25~keto-la--hydroxy-Prävitamin D3-diacylat, das zu dem entsprechenden Vitamin D3-Analogen isomerisiert wird durch Erwärmen und nach Entfernung der Acylgruppen durch milde basische Hydrolyse das gewünschte 27-Nor-25-keto-la-hydroxy-vitamin D3 (Verbindung 7) ergibt.
In den folgenden Ausführungen beziehen sich die Nummern, die die speziellen Produkte identifizieren, auf die in dem vorstehenden Verfahrensschema derart numerierten Verbindungen.
a) Herstellung der Ausgangsverbindungen
25,25-Äthylendioxy-27-nor-cholest-5-en-3ß-ol
Eine Lösung von 3ß-Hxdroxy-27-nor-cholest-5-en-25-on-3--acetat (1, R = Acetyl) (1,0 g, 2,33 mMol) und p-Toluolsulfon-säure (100 mg), gelöst in trockenem Benzol (150 ml) enthaltend Äthylenglykol (18 ml) wurde langsam über 8,5 Stunden destilliert. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) (20% Ace-ton/Hexan) zeigte einen Produktfleck (Rf 0,55) und kein verbliebenes Ausgangsmaterial. Die Reaktion wurde gekühlt und Benzol und Wasser wurden zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde mit zusätzlichem Benzol extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden zweimal mit Wasser und einmal mit Salzlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde entfernt unter Bildung von 25,25-Äthylen-dioxy-27-norcholest-5-en-3ß-ol-3-acetat: NMR (270 MHz) 8 0,67 (s, I8-CH3) 0,93 (d, J = CH3, 21-CH3), 1,01 (s, 19-CH3), 1,28 (s, 26-CH3), 2,03 (Acetat-CH3), 2,91 (Äthylenketal), 4,52 (breites m, 3a-H), 5,27 (m, 6-H).
Das Produkt wurde in Äther (5 ml) und 1 m KOH/Metha-nol (4 ml) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden stehengelassen. TLC (20% Aceton/Hexan) zeigte das Reaktionsprodukt (Rf 0,23). Äther und Wasser wurden zugesetzt und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Äther extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden zweimal mit Wasser und einmal mit Salzlösung gewaschen und über K2C03 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde aus Äther umkristallisiert unter Bildung von 25,25--Äthylendioxy-27-norcholest-5-en-3ß-ol, Verbindung (2),
(0,7 g): Fp. 135- 136°C. Weitere 270 mg von (2), die nur einen Fleck bei der TLC-Analyse zeigten, wurden aus den Mutterlaugen gewonnen: NMR (270 MHz), 0,67 (s, I8-CH3), 0,93 (d, J = 6,2 H3, 2I-CH3), 1,01 (s, I9-CH3), 1,31 (s, 26-CH3), 3,93 (Äthylenketal), 3,52 (breites m, 3a-H), 5,35 (m, 6-H).
b) Herstellung der Ausgangsverbindungen
25,25-Äthylendioxy-27-nor-cholesta-l,4,6-trien-3,25-dion (3)
Ein Gemisch von (2) (0,046 g, 0,11 mMol) und 2,3-DichIor--5,6-dicyano-l,4-benzochinon (0,08 g, 0,35 mMol) in Dioxan (1 ml) wurde 22 Stunden unter Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und filtriert. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde durch eine neutrale Aluminiumoxidsäule (0,5 X 7 cm) filtriert, eluiert mit Methylenchlorid. Das erhaltene Material wurde an einer preäparativen Platte chromatografiert, die mit 15% Aceton/Hexan, zweimal entwickelt wurde, unter Bildung von zwei Produkten.
Das Produkt vom Rf 0,21 war die gewünschte Verbindung (3) (10 mg): NMR (60 MHz) 0,78 (s, I8-CH3), 0,93 (d, J = 6 Hz, 2I-CH3), 1,18 (s, I9-CH3), 1,30 (s, 26-CH3), 3,93 (Äthylenketal), 5,90, 6,05, 6,22 (drei m, Trienprotonen); 6,98 (d, J = 10 Hz, Trienprotonen).
Das Produkt vom Rf 0,15 wurde identifiziert als 27- Nor--cholest-l,4,6-trien-3,25-dion (9,3 mg); NMR (60 MHz) 0,78 (s, I8-CH3), 0,93 (d, J = 6 Hz, 2I-CH3), 1,18 (s, 19-CH3), 2,1 (s, 26-CI13), 5,90, 6,03, 6,22 (drei Multipletts, Trienprotonen), 6,95 (d, J = 10 Hz, Trien H).
c) Herstellung der Ausgangsverbindungen
25,25-Äthylendioxy-la,2a-oxido-27-nor-cholest-4,6-dien-
-3,25-dion (4)
Zu einer Lösung von 3 (0,14 g, 0,33 mMol) in Methanol (5 ml) und Benzol (4 ml) wurden 10% methanolische NaOH (0,04 ml) und 30% H2O2 (0,24 ml) gefügt. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf —5°C gekühlt und auf Eis gegossen. Das nach dem Extrahieren der wässrigen Phase mit Methylenchlorid erhaltenene Material wurde an einer präparativen Schicht chromatografiert, die dreimal mit 30% Aceton/Hexan entwickelt wurde, unter Bildung von 0,09 g des la,2a-Epoxids 4 (Rf 0,66): UV (Hexan Xmax 279, 288 nm (Schulter); NMR (60 MHz) Ô 0,78 (s, I8-CH3), 0,93 (d, J = Hz, 21 CH3), 1,14 (s, I9-CH3), 1,25 (s, 26-Ch3), 3,87 (Äthylenketal), 3,35 (dd, J = 4,5 Hz, 2 Hz, Epoxy H), 3,52 (d, J = 4,5 Hz, Epoxy H), 5,54 (d, J = 1,8 Hz), 5,97 (s).
Beispiel 1
la,3ß-Dihydroxy-27-norcholest-5-en-25-on-l,3-diacetat (5, R = Acetyl).
Zu einer Lösung von Na (0,1 g) in destilliertem flüssigem NH3 (7 ml) bei —33°C, wurde in einer Portion die Verbindung 4 (0,09 g, 0,2 mMol) in THF (7 ml) gefügt. Nach 5 Minuten wurde NH4CI (0,07 g) in kleinen Portionen während 0,75 Stunden zugesetzt. Das NH3 wurde verdampft und durch Äther ersetzt. Die ätherische Phase wurde mit Wasser, 1 n HCl, Wasser, Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SC>4). Der nach dem Verdampfen des Äthers erhaltene Rückstand wurde an einer präparativen Schicht chromatografiert, die zweimal mit 30% Aceton/Hexan entwickelt wurde, unter Bildung von 25,25-Äthylen-dioxy-27-norcholest-5-en-la,3ß-diol (0,0125 g, Rf 0,22): NMR (270 MHz), 5 0,68 (s, I8-CH3), 0,95 (d, J = 6,9 Hz, 2I-CH3), 1,03 (s, I9-CH3), 1,31 (s, 26-CH3), 3,85 (m, lß-H), 3,93 (Äthylenketal), 3,97 (Septett, J = 5,4 Hz, 3a-H), 5,58 (m, 6-H).
Eine Lösung dieses Produktes (12,5 mg, 0,0028 mMol) und
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eine fcatalytische Menge von p-Toluolsulfonsäure in Äthanol (2 ml) wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt. Die TLC (50% Aceton/Hexan, entwickelt dreimal) zeigte nur einen Fleck, Rf 0,55. Das Äthanol wurde entfernt und Methylenchlorid wurde zugesetzt. Die organische Phase wurde mit verdünntem NaHCC>3 und Wasser gewaschen und verdampft unter Bildung von 5 (R = Wasserstoff): NHR (270 MHz) S 0,68 (s, I8-CH3), 0,94 (d, J = 6,6 Hz, 21-Ch3), 1,04 (s, 19-CH3), 2,13 (s, 26-CH3), 3,85 (m, la-H), (m, 3a-H), 5,60 (m, 6-H); Massenspektrum m/e (relative Intensität, berechnete Masse) 402,3151 (M+, 0,50, berechnet für C26H42O3, 402,3134), 387,2898 (M+-CH3, 0,07, 387,2899), 384,3042 (M+-H20, 1,00, 384,3082), 366,2922 (M+-2 x H20, 0,18, 366,2922), 289,2169 (M+-Seitenkette, 0,13, 289,2167), 271, 2061 (M+-H20-Seiten-kette), 0,13, 271,2061), 253,1957 (M+-2 x H20-Seitenkette, 0,13, 253, 1957).
Eine Lösung des Diolprodukts in Pyridin (0,5 ml) und Essigsäureanhydrid (0,5 ml) wurde unter N2 während 2,5 Stunden auf 90°C erwärmt. Die Reaktion wurde mit kaltem Wasser und K2CO3 abgeschreckt. Das Produkt wurde mit Et2Û extrahiert. Die organische Phase wurde mit 1 n HCl, verdünntem NaHCC>3, Wasser und Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SC>4). Durch Verdampfen des Äthers erhielt man 12,4 mg 5 (R = Acetyl), das bei der TLC (50% Aceton/Hexan, Rf 0,65) homogen war.
Beispiel 2
la,3ß-Dihydroxy-27-nor-cholest-5,7-dien-25-on-la,3ß--diacetat (6) (R = Acetyl).
Zu 5 (R = Acetyl) (12,4 mg, 0,025 mMol und NaHC03 (14 mg) in Hexan (0,5 ml) wurde l,3-Dibrom-5,5-dimethylhy-dantoin (3,9 mg, 0,013 mMol) gefügt. Nach 20 Minuten Erwärmen bei 80°C unter Nz wurde das Reaktionsgemisch gekühlt und filtriert. Das Hexan wurde verdampft und der Rückstand wurde in trockenem Xylol (0,5 ml) und 2,4,6-Trimethylpyridin (50 um) gelöst und unter Rückfluss unter N2 90 Minuten erwärmt. Das gekühlte Reaktionsgemisch wurde mit Benzol verdünnt und mit 1 n HCl, verdünntem NaHCC>3, Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde zur Trockene verdampft und der erhaltene Rückstand wurde in Dioxan (0,5 ml), enthaltend p-Toluolsulfonsäure (1,5 mg) gelöst und 40 Minuten unter Nj bei 70° erwärmt. Das nach dem Aufarbeiten erhaltene Material wurde durch TLC, entwickelt zweimal mit 10% Aceton/Hexan gereinigt unter Bildung des Dien-Diacetats 6 (R = Acetyl) (2,9 mg, Rf 0,29); UV (EtOH) 293, 281, 271, 262 nm; Massenspektrum m/e (relative Intensität) 484 (M+, 0,01), 424 (M+-AcOH, 0,08), 364 (M+-2 x AcOH, 1,00), 549 (M+-2 x AcOH-CH3, 0,05), 251 (M+-2 x AcOH-Seitenkette, 0,10), 118 (0,84).
Herstellung von la-Hydroxy-27-nor-25-ketovitamin D3 (7)
Eine Lösung von 6 (R = Acetyl) in 20% EtOH/Benzol (150 ml) unter N2 bei 0°C wurde 20 Minuten in einem Quarzreak-tionsgefäss mit einer 125-W-Hanovia-8A36-Lampe, ausgerüstet mit einem Corex-Filter, bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und das gewonnene la-Hydroxy-25-keto-27-nor-prävitamin-D3-l,3-diacetat wurde in Heptan gelöst und unter N2 bei 85 °C während 4 Stunden erwärmt unter Bildung von l-a-Hydroxy-25-keto-27-norvitamin-D3-l,3-diacetat. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde in Äther (0,5 ml) und 0,1 m KOH/MeOH (0,5 ml) gelöst und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde entfernt und Äther und Wasser wurden zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen. Das Vitaminanaloge 7 wurde durch Hoch-druck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) (0,6 x 25 cm mi-
kroteilchenförmige Siliziumdioxidgelsäule) gereinigt, entwickelt mit 6% 2-Propanol/Hexan. Die Verbindung 7 eluierte von 151 bis 158 ml. Eine analytische Probe war homogen bei erneuter Injektion in HPLC: UV (Äthanol) X.max 265, Xmjn 228 nm, XmaxAmin 1,7; Massenspektrum m/e (relative Intensität) 400,2973 (M+, 0,10 berechnet für C24H40O3, 400,2977), 382,2868 (M+-H20, 0,51, 382,2872), 364,2798 (M+-2xH20, 0,39, 364,2766), 269,1913 (M+-H20-Seitenkette, 0,66, 269,1905), 251,1792 (M+-2 x H20-Seitenkette, 0,12, 215,1800), 152,0828 (0,36, C9Hn 02, 152,0837), 134,0735 (1,00, C9Hi0O, 134,0732).
Herstellung von 25-Keto-27-norvitamin D3 (Verbindung 8)
Zu einer Lösung von 25-Keto-27-norcholesterin (2,0 g) in 5,0 ml Pyridin wurde 1,0 ml Essigsäureanhydrid gefügt und das Gemisch wurde 4 Stunden auf 50° erwärmt. Das Gemisch wurde anschliessend auf gebrochenes Eis gegossen, feste K2CO3 wurde zugesetzt und das wässrige Gemisch wurde mit Äther extrahiert. Die Ätherphasen wurden mit 1 n HCl-Lösung, verdünnter NaHC03-Lösung und anschliessend mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Nach dem Verdampfen des Ätherlösungsmittels wurde der Rückstand an Siliziumdioxidgel (4,5 x 4 cm Säule) chromatografiert, eluiert mit 600 ml 30% Äthylacetat in Hexan, unter Bildung von 1,8 g des 3-Acetatprodukts (Verbindung 1, worin R = Acetyl). Zu 250 mg 25-Keto-27-norcholesterin-3-acetat (1), R = Acetyl, gelöst in 8,5 ml Hexan und 5,5 ml Benzol wurden festes NaHC03 (285 mg) und 115 mg (l,3-Dibrom-5,5-dime-thylhydantoin gefügt. Nach der Erwärmen des Gemischs unter N2 während 20 Minuten bei 80°C wurde es filtriert und der Rückstand wurde gut mit trockenem Benzol gespült. Die gesamte Filtratlösung wurde verdampft und der Rückstand wurde in 8,5 ml trockenem Xylol aufgenommen, zu dem 2,5 ml s-Collidin gefügt wurden. Dieses Gemisch wurde 1,5 Stunden unter N2 unter Rückfluss gehalten, anschliessend gekühlt, mit Wasser verdünnt und mit Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden gewaschen (1 n HCl, verdünntes NaHCCb, H2O und Salzlösung) und getrocknet (Na2SC>4), anschliessend filtriert und das Lösungsmittel wurde verdampft.
Der Rückstand wurde in 8 ml Dioxan gelöst, 35 mg p-Toluolsulfonsäure wurden anschliessend zugesetzt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 70° erwärmt. Wasser wurde zugesetzt und das Produkt wurde mit Äther extrahiert. Die Ätherphasen wurden gewaschen (verdünntes NaHCC>3, H2O und Salzlösung), über Na2SC>4 getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde verdampft.
Zu dem Rückstand in 5 ml Äther, wurden 3 ml 5% KOH in Methanol zugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Nach dem Zusatz von Wasser wurde das Gemisch mit Äther extrahiert, die Extrakte wurden gewaschen (H2O und Salzlösung), getrocknet (Na2S04) und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand ergab nach der Chro-matografie an Siliziumdioxidgelplatten (0,75 mm dick), entwickelt mit 25% Äthylacetat in Chlororform, 88 mg des gewünschten Produkts, 25-Keto-27-nor-7-dehydrocholesterin. Dieses 5,7-Dienprodukt, gelöst in Äther (150 ml) wurde unter N2 5 Minuten bei 0° bestrahlt unter Verwendung einer Hanau-Lampe mit Vycor-Filter. Das Lösungsmittel wurde anschliessend verdampft und der Rückstand wurde an Siliziumdioxidgel-Dünnschichtplatten chromatografiert, zweimal entwickelt mit 25% Äthylacetat/CHC13, unter Bildung des Prävitaminprodukts (25-Keto-27-nor-prävitamin D3).
Dieses Produkt, gelöst in 2 ml CCI4, wurde 3,5 Stunden unter N2 bei 80° erwärmt, um die Isomerisierung zu bewirken. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhielt man 25-Keto-27--nor-vitamin D3 (Verbindung 8).
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Herstellung von 6-Methoxy-25-keto-27-nor-3,5-cyclovitamin D3 (Verbindung 9, Z = Me)
Eine Lösung von 20 mg 25-Ketovitamin 8 in 0,25 ml trockenem Pyridin wurde mit 40 mg Toluolsulfonylchlorid behandelt. Nach 90 Stunden bei 5° wurden Eisschnitzel und 10% NaHC03-Lösung zugesetzt und das Gemisch wurde in Äther extrahiert. Die Ätherphasen wurden gewaschen (1 n HCl, verdünntes NaHCC>3, Wasser, Salzlösung) und über MgSCU getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das 3-tosylierte Produkt (20 mg) in 2 ml trockenem Methanol und 0,3 ml trockenem Benzol gelöst, 100 mg NaHC03 wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 20 Stunden auf 55° erwärmt.
Nach dem Zusatz von H20 wurde das Gemisch mit Äther extrahiert, die Ätherextrakte wurden gewaschen (H2O und Salzlösung), getrocknet (MgSOî) und verdampft unter Bildung von 20 mg des gewünschten 3,5-Cyclovitaminprodukts 9 (Z = Methyl).
Herstellung von la-Hydroxy-6-methoxy-25-keto-27-nor-3,5--cyclovitamin D3 (10, Z = Me).
Zu 1,9 mg Se02 in 0,7 ml trockenem CH2CI2 bei 0° wurden 10 p.1 90% t-Butylhydroxyperoxid gefügt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 0° gerührt. Zu diesem Gemisch wurden 20 mg Cyclovitaminprodukt 9 (Z = Me) in 0,7 ml CH2CI2 tropfenweise gefügt und die Reaktion konnte in 12 Minuten bei Raumtemperatur verlaufen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von gesättigter NaCHC>3-Lösung abgeschreckt und das Gemisch wurde mit CI12CI2 extrahiert. Die organischen Extrakte wurden gewaschen (verdünntes NaHCC>3, Wasser, Salzlösung), getrocknet (MgSC>4) und das Produkt wurde durch Dünnschichtchro-matografie (Siliziumdioxidgel, 40% Äthylacetat/Hexan) gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 5 mg la-Hydroxycyclo-vitaminprodukt 10 (Z = Methyl), das durch sein Massenspektrum und Protonen-NMR-Spektrum charakterisiert wurde.
Die Behandlung der Verbindung 10 (1 mg) mit Essigsäureanhydrid (0,1 ml) in Pyridin (0,1 ml) bei 55° während 1,5 Stunden ergab das entsprechende la-Acetoxyderivat. In gleicher Weise wird das la-Benzoat hergestellt durch Reaktion von 10 mit Benzoylchlorid (in Pyridin bei Raumtemperatur während 3 Stunden).
Herstellung von /a-Hydroxy-25-keto-27-norvitamin D3 (Verbindung 7)
Das la-Hydroxy-6-methoxy-25-keto-27-nor-3,5-cyclovita-min-D3-Produkt (10 mg) wurde in 0,5 ml Eisessig aufgenommen und 15 Minuten bei 55° erwärmt. Gebrochenes Eis und ausreichend NaHCC>3 zur Neutralisation des Reaktionsgemischs wurden anschliessend zugesetzt und das Gemisch wurde mit Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden gewaschen (verdünntes NaHCC>3, H2O, Salzlösung), getrocknet (MgSO<0 und verdampft. Der Rückstand, der hauptsächlich das gewünschte 1 a-Hydroxy-25-keto-27-norvitamin-D3-3-acetatprodukt (Verbindung 11, R = Acetyl) und das entsprechende 5,6-trans-Isomere enthielt, wurde anschliessend chromatografiert (Hoch-druckflüssigkeitschromatografie unter Verwendung einer 0,62 x 25 cm Säule von Zorbax-SIL und 2,5% 2-Propanol in Hexan als Eluierlösungsmittel; Zorbax-SIL ist ein mikroteil-chenförmiges Siliziumdioxidgelpräparat, ein Produkt der Dupont und Co., Wilmington, Del.). Das gewünschte cis-Vitamin-produkt 11 (R = Acetyl) eluierte bei 103 ml und nach dem einmaligen Recyclisieren wurde es in reiner Form (3,4 mg) erhalten und durch sein Protonen-NMR-Spektrum charakterisiert. Das entsprechende 5,6-trans-Isomere, la-Hydroxy-25-keto-5,6--trans-norvitamin-D3-3-acetat, eluierte bei 112 ml und wurde in reiner Form gewonnen.
Das so erhaltene 3-Acetatprodukt 11 (R = Acetyl) wurde in einer Lösung von Äther (0,5 ml) und 0,1 m KOH/MeOH (0,1 ml) hydrolisiert. Die Hydrolyse war nach 1 Stunde bei Raumtemperatur vollständig, worauf Wasser zugesetzt wurde und das Gemisch mit Äther extrahiert wurde. Die Extrakte wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über MgSCU getrocknet und das Lösungsmittel wurde verdampft unter Bildung von 2,9- mg la-Hydroxy-25-keto-27-norvitamin D3 (Verbindung 7), das Ultraviolett-, kernmagnetische Resonanz- und Massenspektren zeigte, die genau mit der Struktur in Einklang standen und mit den Daten übereinstimmten, die für das gleiche Produkt, vorstehend in Beispiel 6 dokumentiert, erhalten wurden.
Die Identifizierungshydrolyse des 3-Acetatderivats des 5,6--trans-Produkts ergab das la-Hydroxy-25-keto-5,6-trans-27--norvitamin D3 [UV: X,max 273 nm; Massenspektrum m/e 400 (M+), 152, 134],
Biologische Aktivität
Männliche Säuglingsratten (Holtzman Co., Madison, Wis.) wurden in hängende Drahtkäfige eingesetzt und ad libitum mit einer Niedrigcalcium-, Vitamin-D-Mangel-Diät, wie von Suda et al. [J. Nutr. 100, 1049 (1970)] beschrieben, während 2 bis 3 Wochen vor ihrer Verwendung in den folgenden Versuchen, gefüttert.
Intestinaler Calciumtransport
Die Ratten wurden in sechs Gruppen von jeweils sechs Tieren aufgeteilt und jeder wurde eine einzige Dosis der Testverbindungen, gelöst in 0,05 ml 95% Äthanol, durch intrajuguläre Injektionen, verabreicht. Die verabreichten Mengen sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Die Gruppe 1, die Kontrollgruppe, erhielt nur das Lösungsmittel-Vehikel (0,05 ml 95% Äthanol). 24 Stunden nach der Injektion der Verbindung wurden die Ratten durch Köpfen getötet und ihre Duodena wurden zur Messung der Aktivität des Calciuntransports nach den Techniken von Martin und DeLuca [Am. J. Physiol. 216, 1351 (1969)] verwendet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Gruppe verabreichte
4SCA serosal/45CA mucosal
Verbindung
(Mittel ± SEM)
1
EtOH.
2,1 ± 0,2
2
12,5 ng l,25-(OH)2D3a
4,6 ± 0,2
3
0,5 ng Verbindung 7b
2,3 ± 0,2
4
2,5 ng Verbindung 7
3,2 ± 0,3
5
12,5 ng Verbindung 7
3,2 ± 0,4
6
25 |ig Verbindung 7
3,7 ± 0,3
a l,25-(OH)2D3 = la,25-Dihydroxyvitamin D3 b Verbindung 7 = la-Hydroxy-25-keto-27-norvitamin D3
Knochencalciummobilisierung
(Erhöhung der Serum-Calciumkonzentration)
Ratten, die wie vorstehend gefüttert wurden, wurden in Gruppen von jeweils sechs Tieren aufgeteilt, denen 0,05 ml 95% Äthanol (die Kontrollgruppen) oder verschiedene Mengen der Test Verbindungen (wie in der nachstehenden Tabelle angegeben), gelöst in 0,05 ml 95% Äthanol durch intrajuguläre Injektion verabreicht wurden. Die Materialien wurden in einzelnen Dosierungen 6 oder 24 Stunden vor der Tötung verabreicht. Die Ratten wurden durch Köpfen nach den angegebenen Zeiten getötet, ihr Blut wurde gesammelt und zur Erzielung des Serums zentrifugiert. Ein aliquoter Teil des Serums (0,1 ml)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
653 344
6
wurde mit 1,9 ml einer 0,1% Lanthanchloridlösung vermischt und die Calciumkonzentration im Serum (als ein Anzeichen für die Freisetzung von Knochencalcium als Reaktion auf die Testverbindung) wurde mit einem Atomabsorptions-Spektrophoto-meter (Perkin Elmer Model HO-214 gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
verabreichte Verbindung
Serum Ca+ + (mg/100 ml)
6 Stunden Mittel ± SEM
24 Stunden Mittel ± SEM
EtOH (Kontrolle)
4,2
±
0,1
3,7 ±
0,2
12,5 ng l,25-(OH)2D3a
4,5
±
0,2
4,7 ±
0,2
0,500 jag Verbindung 7b
4,5
±
0,1
3,6 ±
0,1
2,5 (xg Verbindung 7
5,2
±
0,1
3,9 ±
0,2
12,5 p.g Verbindung 7
5,3
±
0,2
4,3 ±
0,2
25 Hg Verbindung 7
5,2
±
0,1
4,4 ±
0,3
a 1,25-(IH)2D3 = la,25-Dihydroxyvitamin D3 b Verbindung 7 = la-Hydroxy-25-keto-27-norvitamin D3
Aus den vorstehenden Daten ist ersichtlich, dass la-Hy-droxy-25-keto-27-norvitamin D3 (Verbindung 7) eine ausgeprägte Vitamin D-artige Wirksamkeit entwickelt. Besonders bemerkenswert in diesem Zusammenhang ist der rasche Einsatz der Wirkung (vergleiche die 6-Stunden-Zeitpunkte der vorstehenden
Tabelle), im Vergleich mit dem von l,25-(OH)2D3, den raschest wirksamen bisher bekannten Vitamin-D3-Derivat.
Abgesehen von seiner Verwendbarkeit als biologisch aktives Analoges von Vitamin D3 ist die erfindungsgemässe Verbindung 5 auch nützlich als synthetisches Zwischenprodukt für die Herstellung anderer gewünschter Vitamin-D-Verbindungen. Beispielsweise führt die Behandlung dieser la-Hydroxy-25-keto-Vitaminverbindung mit einem Methyl-Grignard-Reagens (z.B. CH3MgBr oder CHîMgl) oder einem Methyllithiumreagens, 10 zum la,25-Dihydroxyvitamin D3, dem wirksamsten bekannten Metaboliten von Vitamin D3. Das 25-Ketoderivat kann so als Ausgangsmaterial für eine einfache und geradlinige Herstellung dieses hocherwünschten Metaboliten dienen. Noch bedeutsamer kann das 25-Ketonderivat als Ausgangsmaterial für die Synthe-u se von l,25-(OH)2D3 in hochradioaktiver Form dienen. So ergibt die Behandlung des Ketons mit tritiiertem Methyl-Gri-gnard- oder Methyllithium-Reagens direkt das (26,27-3H)-l,25--(OH)2D3 und mit geeigneten 14C-markierten Reagentien ergibt die gleiche Reaktion das (26,27-I4C)-l,25-(OH)2D3. Nach dieser 20 Methode kann radiomarkiertes 1,25-(OH)2D3 mit äusserst hoher spezifischer Wirksamkeit in einer einfachen leicht durchzuführenden Reaktionsstufe hergestellt werden (z.B. kann (26,27--3H)-l,25-(OH)2D3 mit spezifischer Wirksamkeit von 80 Ci/mMol hergestellt werden). In gleicher Weise wird das 25 Trideutero- oder 13C-markierte l,25-(OH)2D3 leicht hergestellt durch Behandeln des Ketons (7) mit den in geeigneter Weise isotopisch markierten Grignard- oder Alkyllithium-Reagentien, die leicht hergestellt werden nach bekannten Methoden aus den handelsüblichen isotipisch markierten Methylhalogeniden (z.B. 30 C2H3I, l3CH3I, usw.).
v

Claims (2)

653 344 2 PATENTANSPRÜCHE Stand der Technik
1. la,3ß-Dihydroxy-27-nor-cholest-5,7-dien-25-on und Acy- Hinweise auf verschiedene Vitamin-D-Derivate finden sich late davon. in der Patentliteratur und anderer Literatur. Vergleiche bei-
2. la,3ß-Dihydroxy-27-nor-cholest-5-en-25-on und Acylate spielsweise die US-Patentschriften 3 565 924, gerichtet auf davon. 5 25-Hydroxycholecalciferol; 3 697 559, gerichtet auf 1,25-Dihy-
droxy-cholecalciferol; 3 741 996, gerichtet auf la-Hydroxy-
cholecalciferol; 3 907 843, gerichtet auf la-Hydroxyergocalci-
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